Роль ядерно-цитоплазматического транспорта белка Кеар1 в регуляции ответа клетки на окислительный стресс тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ именн М.В. Ломоносова

□ОЗОБЗОБВ

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ 0 1 МАР 2007

На правах рукописи

ФИЛОНОВ Григорий Сергеевич

РОЛЬ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКА Кеар1 В РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА КЛЕТКИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2007

003053055

Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Вартапетян Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Карпов Вадим Львович

кандидат химических наук Шакулов Виталий Рустэмович

Ведущая организация: Цешр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится 27 февраля 2007 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 26 января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В процессе жизнедеятельности эукариотической клетки в цитоплазме и ядре могут появляться активные формы кислорода и азота, способные повреждать важнейшие клеточные макромолекулы и в итоге приводить к гибели клетки. Подобное крайне неблагоприятное состояние называется окислительным стрессом. Оно может быть вызвано как проникновением в клетку извне ксенобиотиков и оксидантов, так и естественными сбоями в механизмах клеточного метаболизма. Окислительный стресс является причиной целого ряда серьезных заболеваний: атеросклероза, нейродегенеративных заболеваний, рака.

Для защиты от окислительного стресса клетка выработала сложный механизм, заключающийся в активации транскрипции ряда генов, кодирующих анти-оксиданты и ферменты метаболизма ксенобиотиков. Ключевую роль в процессе активации экспрессии этих генов играет транскрипционный фактор №12, активность которого в основном регулируется его белком-репрессором Кеар1.

Несмотря на интенсивное изучение данной системы, ряд принципиальных вопросов на настоящее время остается без ответа. В связи с этим исследование молекулярных механизмов защиты эукариотической клетки от окислительного стресса является актуальной научной задачей.

Цель работы. Целью данной работы было изучение роли ядерно-цитоплазматического транспорта белка Кеар1 в функционировании системы защиты эукариотической клетки от окислительного стресса.

Научная новизна и практическая ценность. В процессе исследования впервые продемонстрировано, что ключевые белки ответа клетки на окислительный стресс, транскрипционный фактор №12 и его репрессор Кеар1, являются белками-челноками, т.е. постоянно перемещаются между ядром и цитоплазмой. Кажущаяся цитоплазматическая локализация обоих белков в отсутствие стресса отражает динамическое равновесие между процессами импорта и экспорта, где последний осуществляется быстрее. Более того, показано, что транспорт Кеар1 и №12 в цитоплазму осуществляется за счет обнаруженного нами классического лейцин-богатого сигнала экспорта из ядра в составе репрессора. Дальнейшие исследования продемонстрировали, что белок Кеар1, лишенный способности покидать ядро, не только позволяет накапливаться в ядре фактору №£2, но и превращается из репрессора в активатор транскрипции №й-зависимого репортер-ного гена. Этот эффект обусловлен участием репрессора Кеар1 в составе комплекса белков, активирующих №12-зависимую транскрипцию.

На основании полученных данных предложена новая модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы две научные статьи и двое тезисов на международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 2005». Основные результаты работы представ-

1

лены на международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 2005».

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 115страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему «Регуляция №12-зависимой транскрипции генов», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

До недавнего времени общепринятая модель регуляции активности транскрипционного фактора Nrf2 выглядела следующим образом. В нормальных условиях Nr£2 удерживается в цитоплазме за счет взаимодействия с акгин-связывающим белком Keapl, который, являясь также компонентом убиквигин-лигазного комплекса, постоянно отправляет Nrf2 на деградацию посредством 26S протеасомы. Таким образом, происходит пространственное разобщение транскрипционного фактора и его генов-мишеней и поддержание количества Nrf2 на низком базальном уровне. В условиях окислительного стресса происходит активация ряда киназных путей, приводящая в том числе к фосфорилирова-нию Nrf2, а также модификация цистеиновых остатков Keapl. В результате комплекс Nr£2-Keapl дестабилизируется, транскрипционный фактор избегает деградации и получает возможность переместиться в ядро. Там Nrf2 активирует экспрессию подконтрольных ему генов, присоединяясь к специфической последовательности в их промоторной области, называемой ARE. Однако недостатками подобной модели было, в частности, то, что она не объясняла, каким образом осуществляется базальная транскрипция №£2-зависимых генов и за счет чего происходит терминация ответа клетки на окислительный стресс.

Keapl способен перераспределяться в ядро

Мы исследовали внутриклеточную локализацию эндогенного белка Keapl в клетках человека линий HeLa и HepG2. Наблюдения, проводимые при помощи моноклональных антител к Keapl и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, продемонстрировали, что эндогенный репрессор действительно является исключительно цитоплазматическим белком (рис. 1 А,В).

Самые простые предположения в данном случае следующие - белок не имеет сигналов импорта в ядро или, более того, он постоянно связан с актином. Однако существует и другая возможность: белок является челноком, т.е. постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой, причем экспорт осуществляется быстрее импорта. При этом он может содержать как сигнал импорта в ядро, так и сигнал экспорта из него (NES - Nuclear Export Signal).

Для проверки челночных свойств эндогенного Kcapl исследуемые клетки были обработаны специфическим ингибитором ядерного экспорта лептомици-ном Б (Leptomycm В, LMB).

Данная обработка действительно вызвала перераспределение Keapl из цитоплазмы в ядро, что свидетельствовало о том, что рспрессор на самом деле является челноком (рис.1Б,Г)-

HeU

HepG2

+ШВ

Рис.]. Локализации эндогенного белка Keapl в клетках линии HepG2 (А н Б) к UeLs (В н Г) до н после обработки LMB. Испан.зокяны моио-кл опальные антитела 2Н5 к белку Keapl.

Также была исследована внутриклеточная локализация сконструированного нами ранее химерного белка EGFP-Keap] WT (репрессор дикого типа).

Изучение локализации целевого белка методом флуоресцентной микроскопии в живых м зафиксированных клетках линии HeLa продемонстрировало, что, как и в случае эндогенного репрсссора, химерный белок выявляется преимущественно в цитоплазме (рнс.2А,Б). При обработке LMB белок EGFP-Keap 1 tie рераспре деля лея в ядро (рис.2В).

Рис.2. Внутриклеточная локализации белка KeaplWT, соединенною с репортер-иым белком EGFP, до (А) и после (В) обработки клеток линии LMB. Б - визуализация ядер клеток и эксперименте А красителем Hoecbst3342. Здесь и далее используются клетки линии HeLa,

На основании описанных выше результатов можно было сделать два вывода:

- Keapl способен активно накапливаться в ядре;

Keapl быстро экспортируется из ядра и, по-видимому, содержит лейцин-богатый NES, поскольку LMB блокирует экспорт белков, содержащих именно такой сигнал экспорта из ядра. Однако существует вероятность того, что репрессор транспортируется из ядра в комплексе с другим белком, несущим такой сигнал.

Следующим шагом была проверка гипотезы о наличии в Keapl сигнала экспорта из ядра. Для этого необходимо было продемонстрировать, что Keapl содержит последовательность, которая необходима и достаточна для экспорта из ядра.

Идентификация сигнала ядерного экспорта белка Keapl

Сначала была проведен анализ аминокислотной последовательности белка Keapl человека. Классический лейцин-богатый сигнал экспорта из ядра, охарактеризованный для целого ряда белков, имеет следующий общий вид:

V I где X - это любая аминокислота; жирным выделены остатки LX^LXL аминокислот, наиболее важные для функционирования всего сигнала. Мутации по этим положениям полностью прекращают ядерный экспорт.

В белке Keapl была найдена последовательность, находящаяся в N-концевой половине и похожая на классический сигнал экспорта из ядра: 301LVKIFEELTL310.

Для грубого картирования местоположения NES мы сначала выяснили локализацию в клетках N- и С-концевых половин (остатки 1-321 и 307-624, соответственно) белка Keapl, слитых с EGFP, в нормальных условиях и после обработки клеток LMB.

Как видно из приведенных микрофотографий (рис.3), локализация этих химерных белков сильно различается: N-концевая половина является цитоплаз-матической и перераспределяется в ядро в ответ на действие LMB, С-концевая половина в обоих случаях оставалась преимущественно ядерной. Это позволяет предположить, что искомый сигнал/сигналы экспорта расположены только во фрагменте 1-321, сигнал/сигналы же ядерной локализации находятся в С-концевой и, возможно, N-концевой половине белка. Для более точного картирования участка NES белка Keapl были созданы делеционные мутанты 285-321, 307-332 и 1-307. Их локализацию в клетках в нормальных условиях и после обработки LMB также установили по флуоресценции их химерных белков с EGFP.

4

LMB

1-321

LMB

1-307

307-624

307-332

Рис_3. Локализации в клетки соединенны! с EGFP делецнонны! H точечного мутантов белка Keapl до и после обработки LMB.

Как видно из рисунка 3, исключенным из ядра остается только фрагмент 285-321, он же отвечает на действие LMB, перераспределяясь в ядро; в то же время, остальные делеционные мутанты более или менее равномерно распределены по клетке. Интересно, что фрагмент 1-307, который короче мутанта 1-321 всего на 14 аминокислотных остатков и С-конец которого содержит лишь часть предполагаемого сигнала экспорта, также не был исключен из ядра. Схематическое представление используемых мутантов белка Кеар1и их поведение в клетках, обработанных LMB, показано на рисунке 4.

Таким образом, NES белка Keapl, по-видимому, находится в участке 285321. Для непосредственной проверки предположения, что искомый сигнал - это последовательность с 301-го по 310-й аминокислотный остаток, был создан полноразмерный белок Keapl с двумя точечными мутациями по двум наиболее важным для функционирования NES аминокислотам (замена L308 и L310 на аланины). Локализацию полученного мутантного белка (KcaplNESmut) определяли также по флуоресценции слитого с ним EGFP (рис.3).

Как видно, мутант перестал быть исключительно цитоплазматическим и перераспределился в ядро даже в отсутствие LMB, Картина его локализации кардинально отличалась от распределения в клетках Keapi дикого типа (рис.2А) и имела явное сходство с распределением белка дикого типа в клетках, обработанных LMB (рис.2В).

Полученные результаты позволяют утверждать, что искомый с и шал ядерного экспорта расположен именно на участке с 301-й по 310-ю аминокислоту.

KeapIWT

1-321

307-624

285-321

307-332

1-307

179

322

Шменение локалщации под действием LMB

824

+

285 321

СИ 307 332

«=0

179 307

btbjpoz

1

KeaplNESmut С

179

322

Kelch повторы

1 BTBJPOZ

624

Рис.4. Схематическое представление белка Keapl дикого типа (KeapIWT) и его мутантов и их поведение в клетках, обработанных LMB. Все белки продуцировали в виде химерных конструкций, содержащих на 14-конце последовательность EGFP. BTB/POZ и Kelch повторы—домены белка Keapl, ** обозначает мутации в составе NES белка Keapl.

Проверка шпактности в трансфицированных клетках всех упоминавшихся выше делеционных и точечных мутантов была проведена при помощи иммуноб-лоттинга соответствующих клеточных лизатов. Результаты подтвердили продукцию в клетках всех используемых нами химерных белков (рис.5).

ЛЬ- ль ..О-лу м- ¿л- м 113 7 кДа ^ ^ Ч- к N "!> *Ъ <о

80.9 кДа ^ Рис.5. Иммуноблоттинг лизатов клеток линии

НеЬа, продуцирующих химерные белки 63.8 кДа в® чЩтт,. ЕСГР, соединенные с целым КеарЮТ или с

его делеционными и точечным мутантами. Последний трек - эктопический ЕСРГ (кон-

49.5 кДа_

троль). Слева указаны молекулярные веса белков-маркеров. Для детекции использова-37.4 кДа ^ Щт _ ны моноклоеальные антитела к ЕвИР.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что Кеар1 содержит короткую лейцин-богатую последовательность, необходимую для экспорта всего белка из ядра и достаточную для удерживания в цитоплазме химер-

6

ного белка EGFP за счет ковалентно связанного с ним пептида из 36 аминокислотных остатков, соответствующего участку белка Keapl 285-321. Кроме того, можно сделать вывод, что Keapl является белком-челноком и, возможно, содержит сигнал импорта в ядро,

NrC также постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой

Поскольку основной функцией белка Keapl является репрессия фактора Nrf2, то возник вопрос: каким образом обнаруженные нами челночные свойства Keapl алия ют на свойства и локализацию Nrf2? Закономерной являлась гипотеза о том, что Nrf2 в комплексе с Keapl в нормальных условиях постоянно перемещается в ядро и из него, а не конститутивно находится в цитоплазме.

Для проверки подобного предположения было решено изучить совместную локализацию в клетках линии HeLa белков KeaplWT и Nrf2WT (в нормальных условиях и в присутствии LMB), а также белков KeaplNESmut и Nrf2WT (здесь и далее Nrf2WT - это эктопический фактор дикого типа, Nrf2 - эндогенный белок). Клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими KeaplWT в Nrf2WT. Детекцию синтезируемых белков осуществляли при помощи антител и сканирующей конфокальной микроскопии.

При сверхэкспрессии в клетке одного только Nri2 белок преимущественно локализовался в ядре (рис.бА), а при добавлении его репреееора Keapl оба белка обнаруживались в цитоплазме, что согласуется с известными данными (рис.7, верхний ряд).

Рис.6. А - локализация в клетка! эктопическою NrfîWT. Б - фазовый контраст. Использованы ноли клон ал ьные антитела к NrO (НЗОО).

Далее к клеткам, синтезирующим оба белка, был добавлен LMB. При этом локализация белков изменилась с цитоплазм этической на ядерную (рис.7, средний ряд).

Поскольку LMB является ингибитором экспорта большой группы белков и способен серьезно изменять физиологическое состояние клетки, то более точным экспериментом является совместная продукция в клетках KeaplNESmut и Nrf2WT. И в этом случае (рис.7, нижний ряд) Nrf2WT изменил свою локализацию с цитоплазматической на ядерную.

3HTH-Nrf2 анти-Кеар! Hoachst33342

Nrf2WT+ Keapl WT

Nrf2WT+ Keapl WT+LMI

Nrf2WT+

s

в

и * HW 1®

Рис.7. Локализация в клетках эктопических белков !ЧгП1ЛТ и Ке-«р1\\Т при их совместной экспрессии в нормальных условиях и в клетках, обработанных 1МВ, а также локализация ХгП1ЛТ и Кеар1>'Е8гаи1 при их совместной продукции. Справа привезена визуализация ядер клеток красителем ЫоесЬзШ42. Использованы нолнклоняльные антитела к Хг12 (II300) и моноклопальные антитела к Кеар! (2Н5).

Синтез полноразмерных белков ЫгОШТ, Кеар 1 ЮТ и Кеар1МЕ8пщ1 в трансфицированных клетках также подтвержден при помощи и м м уноблоттин га соответствующих лизатов (рис.8).

А)

f J~ Б)

98 кДа

Рис.8. И мм у ноблоттин г лизатов клеток линии 64 кДа — ЦеЬа, трансфицирован-

ных плаз мндами, кодирующими ГЧгГ2\УТ (панель А) и еля-ТНкяяии, кодирующими Кеяр! УУТ к КсярШЕБтМ (пянель Б). Первый трек в обоих случаях - контрольный лизат, содержащий только эктопический ЕСРР. Слева указаны молекулярные веса бел ко в-маркеров. Для детекции использованы полнкло-нальные антитела к Р)г(2 (А) и к Кеар! (Б).

Таким образом, можно было сделать следующие выводы:

1 ) Nrf2 также постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой;

2) Для активного экспорта Nrf2 из ядра необходим интактный NES белка Keapî.

Отсюда следует, что именно репрессор Keapl экспортирует Nrf2 из ядра и, по-видимому, шаттлирует комплекс двух белков.

Выявление роли сигналя экспорта белка Кеар1 в механизме регуляции Г^гП-зависимой экспрессии генов

Поскольку Кеар1 и ЫгО, согласно нашим данным, являются белками-челноками и всегда в небольшом количестве присутствуют в ядре, закономерен

вопрос: каким образом накопление этих двух белков в ядре, вызванное мутацией сигнала экспорта из ядра репрессора Keapl, скажется на экспрессии Nrf2-зависимых генов?

Для ответа на поставленный вопрос был выбран метод с использованием репортерной конструкции. Для измерения активности фактора Nrf2 мы внедряли в клетки плазмиду, содержащую кДНК фермента люциферазы под контролем ARE гена NQOl (хиноноксидоредуктазы) человека. Таким образом, активность фермента, измеряемая в лизатах по его хемшпоминесцентной реакции с субстратом, отражала степень активации самого фактора. Для нормирования результатов, полученных в различных экспериментах, в клетках дополнительно синтезировался фермент Р-галактозидаза, уровень транскрипции которого не зависел от наличия Nrf2.

Клетки линии HeLa были трансфицированы плазмидами, кодирующими белки в следующих сочетаниях:

A) только репортерные белки (люцифераза и 3-галакгозидаза) - этот эксперимент являлся отрицательным контролем и определял базальный уровень люциферазной активности;

Б) репортерные белки и Nrf2WT- положительный контроль, свидетельствующий о том, что наша система зависит от Nrf2;

B) репортерные белки, Nrf2WT и KeaplWT - контроль на функциональную активность Keapl дикого типа.

Г) Наибольший интерес представляла трансфекция плазмидами, кодирующими репортерные белки, Nr£2WT и KeaplNESmut.

Результаты эксперимента приведены в виде диаграммы (рис.9А).

Как и следовало ожидать, добавление Nr£2WT в систему значительно усиливало ARE-зависимую экспрессию репортера, а присутствие Keapl WT снижало ее почти до базального уровня. Это означало, что наша система дает вполне адекватную картину влияния синтеза в клетках Keapl WT и Nrf2WT на Независимую экспрессию генов, и мы праве делать выводы о влиянии на нее же мутантного белка Keapl. Результаты эксперимента (Г) оказались довольно неожиданными: KeaplNESmut не только не понижал активность репортера, но повышал ее в два и более раза в разных экспериментах на двух линиях клеток.

Таким образом, мутации в сигнале экспорта белка Keapl влияют на его свойства, что выражается в изменении его репрессирующей активности по отношению к №£2-зависимой экспрессии генов на прямо противоположную.

Для оценки функционирования KeaplNESmut в условиях окислительного стресса клетки HepG2, трансфицированные соответствующими плазмидами, были обработаны типичным индуктором - трет-бутилгидрохиноном (tBHQ)

(рис.9Б). Данная обработка привела к увеличению репортерной активности (по сравнению с экспериментом -1ВН<2) в опытах А, Б и В и практически не повлияла на уровень транскрипции в случае синтеза в клетках КеарШЕБтШ (Г).

Это могло означать, что условия окислительного стресса не влияют на активирующие свойства белка Кеар! с нарушенным сигналом экспорта из ядра.

Рнс.9. Влияние продукции белков Кеяр1\¥Т и КеарШЕ$ш|Н на ХгП-завнснмую активность реяортерного гена (А) в клепках линии НеЬа в нормальных условиях, (В) в клетках липни НерС2 в нормальный условиях (-ШНО) и в условиях окислительного стресса (обработки 100 мкМ ШН(}).

I [родукция в трансфицированных клетках линий НеЬа и НерС2 интактных белков Кеар] дикого типа и Кеар! с точечными мутациями в сигнале экспорта из ядра была подтверждена иммуноблоттингом соответствующих клеточных ли-затов (рис.10).

А Б В Г Рис.10. Иммуноблоттинт л пито в клеток линии 80.9 кДа_ НеЬ», продуцирующих белки в сочетаниях А - Г

(стр.9). Слева от ¡реков указаны молекулярные 63.8 кДа ■ веса бел ко в-маркеров. Для детекции иснольто-

ваны нолнклональиые антитела к Кеар!.

Таким образом, на основании данных экспериментов с использованием репортерлых конструкций можно сделать вывод, что неспособность к экспорту из ядра белка Кеар1 сильно изменяет его свойства и противоположным образом, по сравнению с белком дикого типа, влияет на Ыг(2-зависимую экспрессию генов, причем эта активация происходит как в присутствии, так и в отсутствие окислительного стресса.

Активирующее свойства белка Кеар1МК8т1Н обусловлены его взаимодействием с 1Чгй

Обнаруженный нами феномен активации транскрипции АКБ-зависимых генов белком КеарШЕЗтш был достаточно необычен, и поэтому дальнейшие усилия были сосредоточены на его исследовании. В первую очередь было решено убедиться в том, что этот эффект обусловлен именно взаимодействием рс-прсссора с №(2 и опосредуется именно через него, а не через какие-либо иные клеточные механизмы.

Мы сконструировали ллазмиду, кодирующую делеционный мутант №Й (>№ОеНа), в котором отсутствовал тетрапептид в N-концевой части ("ЕТОЕ6* в белке человека). Как было показано ранее, у такого мутантного транскрипционного фактора нарушено взаимодействие с реп рессорой Кеар1.

В первую очередь мы исследовали внутриклеточное распределение полученного нами мутантного Г\1гГ2 сначала в отсутствие репрессорз Кеар1, а затем при совместной с ним экспрессии. Мы убедились, что полученный мутантный белок избегает репрессии Кеар1 дикого типа, т.е. даже в его присутствии локализуется в ядре {рис.11, средний ряд). То же наблюдалось и в остальных случаях: ЫгООеНа, как и фактор дикого типа, был исключен из цитоплазмы при синтезе в клетках как совместно с Кеар1>ГЕ5гщЦ (рис.11, нижний ряд), так и в отсутствие репрессора (рис.11, верхний ряд). Во вссх случаях местоположение белков в клетке определялось при помощи флуоресцентной микроскопии фиксированных и окрашенных антителами образцов.

N г^ОеНа

МгГ20еЦа+ КезрЦЛГГ

№20вНв+ Кеар-ШЕЭтЫ

знти-МгГС

анти-Кеар1

ш

V ■а. I

• в в

Рис.11, Локализация в клетках экгоииче-ского белка "*гТ21>с1(а, синтезированного отдельно и в присутствии Кеар]\УТ и к"сар1 \ESmut. Использованы полнклопальные антитела к (ГООО) и монокдональ-иые антитела к Кеар! (2Н5).

Наличие в клетках интактаого МгйВеИа было подтверждено электрофоре-тическим разделением лизатов трансфицированных клеток с последующим им-муноблоттингом (рис.12).

98 кДа

Л

^ -jV п® Рис. 12. Иммулоблогтннг люатов клеток линии Нс1л, <£> ф ф с и irrejH рующ и х EGFT (контроль}, Nrf2WT, NrfZ Delta. ^^^^ Слева от треков указан молекулярный вес белка-маркера. л in | Дли детекции использованы ноли кл о нал ь юле антитела к Nrf2.

Чтобы ответить на вопрос, необходимо ли связывание транскрипционного фактора и КеарШЕЗгпШ для осуществления последним трансактивирующих функций, мы поставили трансфекции клеток линии НеЬа плазмидами, кодирующими следующие белки:

A) только репортерные белки (люцифер аза и Д-гзлактозидаза);

Б) репортерные белки и Nrf2WT;

B) репортерные белки и ЫгОБека;

Г) репортерные белки, ЫгПи'Т и Кеар 1 \\'Т;

Д) репортерные белки, МгОРека и Кеар 1 \УТ;

Е) репортерные белки, Nгf2WT и Кеар1ЫЕЗти(;

Ж) репортерные белки, N гНОе^а и Ксар1ИЕЗти1-

Рис. 13. Активность peno ртериого гена в клетках линии SeLa, продудирующш белки Keapl и NrfZ (оба как дикого типа, так и мутанты) в различных сочетаниях.

Как видно из диаграммы (рис.13), Nrf2Delta транскрипционно активен (столбец В), избегает KeaplWT-опосредованной репрессии: репортерная активность люциферазного гена высокая и при совместной экспрессии обоих белков (столбец Д), Очень важным результатом оказалось то, что совместное присутствие в клетках Nrf2Delta и KeaplNESmut (столбец Ж) не приводит к активации транскрипции репортер ноге» гена, наблюдаемой в эксперименте Е. Иными словами, для осуществления своих активирующих способностей репрессору, му-тантному tío сигналу экспорта из ядра, необходимо взаимодействовать с транскрипционным фактором.

Таким образом, можно утверждать, что KeaplNESmut является активатором ARE-зависимой транскрипции ре портерного гена именно опосредованно через взаимодействие с фактором Nrf2.

KeaplNESmut не вызывает увеличение количества Nrf2 в клетке

Каким образом KeaplNESmut может влиять на Nri2 и вызывать подобный активирующий эффект? Возможно как минимум два объяснения: либо увеличивается количество фактора Nrft, либо изменяются его функциональные свойства, к примеру, его способность взаимодействовать с ARE. В первую очередь мы исследовали при помощи электрофореза и последующего иммуноблоттинга содержание Nrf2 в лизатах клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими в различных сочетаниях белки Nrf2 и Keapl (оба как дикого типа, так и мутанты). Контролем служила продукция белка EGFP, которая не зависела от Nrf2.

98 кДз

anrn-Nrf2

Рис. 14. Иммуноблогашг л Hi »то в клею к линии HeLa, снитезирующш Keapl (дикий тип и мутант) и Nrf2 (дикий тип и мутант) в различны* сочетании!. Слева от треков указаны молекулярные веса белков-маркеров. Дли детекции использованы поликло-иальные антитела к Nrf2 и Keapl и моноклональные антитела к EGFP.

Как видно из рисунка 14, Keapl WT уменьшает количество Nrf2WT за счет деградации. Этого не происходит в случае Nrf2Delta, неспособного взаимодействовать с репрессором. Важным наблюдением оказалось то, что количество Nrf2 дикого типа в присутствии KeaplNESmut практически не возрастает (или даже чуть меньше) по сравнению с количеством Nrf2WT, синтезируемого в клетках без репрсссора, и с количеством Nrf2Delta во всех случаях. Таким образом, активирующее действие мутантной по сигналу экспорта из ядра формы репрессора Keapl не является результатом увеличения количества фактора Nrf2,

Keapl в присутствии NrD взаимодействует с ARE in vitro

Если исследуемый нами эффект обусловлен не увеличением общего количества Nrf2WT в клетках, то логичным кажется предположение о том, что

KeaplNESmut, взаимодействуя с Nrf2 и находясь с ним, вследствие своей мутации, в ядре, каким-то образом усиливает активирующие способности транскрипционного фактора.

Мы высказали предположение, что Keapl может входить в состав транскрипционного комплекса с участием Nrfi. Для его проверки было решено обратиться сначала к методу EMSA (electrophoretic mobility shift assay - изучение сдвигов электрофоретической подвижности), который позволяет обнаружить взаимодействие между белками и фрагментами ДНК in vitro.

Б качестве радиоактивномеченного зонда был выбран короткий двух цепочечный фрагмент ДНК (120 п.н.), содержащий ARE гена NQOl человека который до этого был использован нами для создания ре портерных конструкций на основе гена люциферазы.

Инкубирование зонда с лизатом клеток линии HeLa, трансфицированных >Jrf2-кодирующей плазмидой, приводило к образованию комплекса Nrf2-ARE и появлению характерной полосы в геле (рис.15А). В качестве контроля был использован лизат нетрасфицированных клеток линии HeLa. Также дополнительным контролем являлось добавление в реакционную смесь избытка немеченого (т.н. «холодного») ДНК-зонда. В условиях такого эксперимента полоса, соответствующая комплексу ARE-Nrf2, исчезала (рис Л 5 А).

линии HeLa, содержащих PírCVVT, в присутствии и отсутствие антител к Nrf2. Первый трек — контроль (клетки синтаирутот только EGFP). Последний трек - контроль специфичности антител (прсиммункня сыворотка кролика).

Дополнительным доказательством того, что обнаруженная нами полоса соответствует комплексу Nrf2-ARE, служат эксперименты с добавлением поли-клокалькых антител на Nrf2 (НЗОО и C2Q). В этих условиях исследуемая нами полоса, наблюдаемая в данном месте, исчезла либо сместилась на старт (по сравнению с контролем - преиммунной сыворотки кролика) (рис. ¡5Б)

Аналогичным образом мы исследовали свойства Nrf2Delta и комбинаций белков Keapl и Nrí2 (оба как дикого типа так и мутанты) (рис. 16).

Рис.15. А) К MS А люатов клеток линии HeLa, содержании NrtlWT, в присутствия н о-иугст-внн «голодного» зонда. Первый трек - контроль (эктопические белки в клетках не синтезируют-

ся).

Б) EMSA лнмтов клеток

ЩЛ Я ММ

^ ^ Рис.16. A) EMSA листов

клеток линии HeLa, транс-фицнровднных плаэмнда-мн, кодирующими белки

i 1 El Л

1234567 123

EGFP (контроль), Nrf2WT, Nrf2Delta, KeaplWT и Ке-aplNESmut в разных соче-2 1 тяниях. К) EMSA лиздтов клеток линии HeLa, проду-

цирующих EGFP (ковтродь), Nrf2WT и KeaplWT.

Как видно из рисунка (А, треки 2 и 3), как Nrf2WT, так и Nrf2Delta образовывали комплекс с ARE. В присутствии Kcapl (как дикого типа, так и мутанта) мы детектировали образование комплекса с замедленной электрофоретической подвижностью - вероятно, Keapl-Nrf2-ARE (треки 4 и 6). Существенно, что в присутствии Nrf2Delta, неспособного к взаимодействию с репрессором, этот «тройной» комплекс не образуется (треки 5 и 7). Отдельно было проверено то, что KeaplWT, экспрессированный в клетках в отсутствие Nrf2, не способен образовывать комплекс с ARE (рис.16Б, трек 3).

Необходимо также отметить, что при совместном синтезе Nrf2WT и KeapíNESmut наблюдаются две полосы, соответствующие как комплексу двух белков и ДНК, так и комплексу Nrf2-ARE. Предположительно, это обусловлено большим, по сравнению с Nrf2WT в присутствии KeaplWT, количеством транскрипционного фактора в клетках: в этих условиях наряду с Nrf2, связанным с Keapl, в ядре присутствует и свободная форма фактора. Также возможен вариант, что мутантный репрессор слабее связывается с Nrf2, либо с Nrf2 в составе транскрипционного комплекса.

Чтобы дополнительно удостовериться в том, что полоса меньшей подвижности, возникшая в присутствии репрессора Keapl, действительно обусловлена комплексом Keapl с Nrf2 и ДНК, обратились к методу Super Shift. Были использованы моноклональные антитела к Keapl; 2Е4 - к N-концевой половине белка и 2Н5 - к С-конце вой, а также поликлон ал ьные антитела к Nrf2 (H300 и С20). В ходе эксперимента было обнаружено, что антитела 2Н5 вызывают дополнительное смещение исследуемой полосы, а антитела 2Е4 приводят к ее исчезновению, по-видимому, за счет диссоциации комплекса белков от ДНК (рис. ПА). Антитела к Nrf2 вызывали исчезновение полосы (рис.17Б), причем в данном эксперименте мы не наблюдали образование высокомолекулярных комплексов, детектируемых на старте трека (см. рис. 15). Контрольные антитела ЗА9 к ре комби нант-ному EGFP, присутствующему в клеточных лизатах, или цреиммунная сыворотка кролика не приводят к подобным изменениям.

Рис. 17, A) EMSA лнзятов клеток линии HeL», синтезирующих EGFP (контроль) н белки KeapIWT и Nrí2WT в присутствии антител к Keapl и к EGFP (контроль). Б) EMS А лип-то в клеток линии lid л, продуцирующих белки Nrf2WT и KcaplWT в при-

сутствии пренммунной сыворотки кролика (контроль) и антител к NrQ.

Все эти факты напрямую указывают на то, что исследуемая нами полоса действительно соответствует комплексу белков Keapl, Nrf2 и ДНК-зонда.

Таким образом, транскрипционный фактор Nrf2 способен взаимодействовать in vitro с ARE-содержащим ДНК дуплексом в комплексе с репрессороы Keapl,

Keapl входит в комплекс быков, взаимодействующих с промоторыой обля-

Для проверки полученных результатов in vivo мы детектировали белок Keapl, связанный с хроматином (в присутствии Nr(2), в живых клетках с помощью метода ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation - иммунопрсципитация хроматина).

Эксперимент проводили следующим образом. Существующие in vivo ДНК-белковые комплексы фиксировали, обрабатывая клетки формальдегидом. После удаления оставшегося реагента клетки лизировали, хроматин фрагменти-ровали ультразвуком, и потенциальные ДНК-белковые комплексы осаждали антителами к Nrf2 и к Keapl. Затем сшивку между белками и ДНК разрушали, и наличие ARE в иммунопреципитатах проверяли при помощи ПЦР с использованием ARE-специфичных праймеров. В данной случае использовались прайм еры к области, содержащей уже описанную выше последовательность ARE гена

Мы поставили иммунопреципитацию хроматина на лизатах клеток линии НеЬа, трансфицированных плазмидами, кодирующими Кеар 1 и'Т и ЫгШУТ (А), КеарШЕЭтЩ и ЫгИи'Т (Б), а также КеарШТ и №СОе11а (В, контрольный эксперимент). В качестве антител использовали: поликлональные антитела на Nгf2 (НЗОО), моноклон ал ьные антитела на Кеар! (2Е4, к М-конце вой половине белка). В качестве контроля были использованы поликлональные антитела к актину и

стью гена NQOI

NQOl.

моноклональные антитела к EGFP (ЗА9), который присутствует в клетках в качестве контроля трансфекции. Кроме того, в каждом эксперименте был т.н. input, т.е. раствор всех фрагментов клеточного хроматина, который являлся положительным контролем. Результаты электрофореза продуктов ПЦР представлены на рисунке 18 (А,Б,В),

y//ZZ

А)

Б)

В)

Nrf2WT* KeapiWT

Nrf2WT+ KeaplNESmut

Nrf2Deila+ KeapiWT

Рис. 18. Анализ белков, входящих и состав транскрипционного комплекса с ARE, методом СЫР. Электрофорез в ягярозном геле продуктов ПЦР на растворах ДНК, полученных после нммунонреципитаний антителами к NrO, Keapl, EGFP и актину (два последних белка - контрольные), Первый трек (input) - положительный контроль.

Как видно из рисунка, Nrf2 в ходит в состав транскрипционного комплекса с ARE, что вполне естественно. Контроли наблюдаются в виде совсем слабых полос либо не видны совсем. Важным результатом стало то, что полосы, получаемые при помощи антител на Keapl, по интенсивности соизмеримы с сигналом от антител на Nrf2. Это говорит о том, что в условиях данного эксперимента мы детектировали присутствие репрсссора Keapl на хроматине. Необходимо также отметить, что полоса, наблюдаемая при использовании антител к Keapl в случае синтеза мутантного репрессора, ярче, нежели при экспрессии Keapl дикого типа. Скорее всего это обусловлено преимущественно ядерной локализацией Nrf2WT и KeaplNESmut. Не исключено также, что этот эффект обусловлен и большим содержанием транскрипционного фактора в клетках, синтезирующих KeaplNESmut и Nrf2WT, по сравнению с клетками, продуцирующими белки дикого типа (см. рис.14). В случае продуцирования в клетках Nrf2Delta полоса, наблюдаемая при использовании антител к Keapl, исчезает (рис. 19В). Это свидетельствует о том, что связывание Keapl с хроматином обусловлено взаимодействием репрессора с фактором Nrf2.

Таким образом, и эксперименты, проведенные in vivo, подтверждают предположение о том, что Keap i способен, посредством Nrf2, взаимодействовать с ARE-содержащим хроматином.

Новая модель рефляции ответа клетки на окислительный стресс

Мы показали, что в нормальных условиях белки ЫгО и Кеар! постоянно перемещаются между ядром и цитоплазмой, причем Кеар1 обладает лейцин-богатым сигналом экспорта из ядра, активность которого необходима для актив-

ного экспорта обоих белков. Кроме того, Keapl способен взаимодействовать, посредством Nrf2, с ARE-содержащей ДНК как in vivo, так и in vitro, и в составе белкового комплекса усиливать транскрипцию подконтрольных Nrf2 генов в том случае, когда оба белка (Keapl и Nrf2) не способны покидать ядро.

Подобные факты позволяют по-новому взглянуть на систему ответа клетки на окислительный стресс и предложить более адекватную модель регуляции активности фактора Nrf2. В первую очередь необходимо понять, чем подобные челночные свойства описываемых двух белков лучше, чем их конститутивное заякоривание в цитоплазме, предлагаемое в качестве основной модели до недавнего времени. Иными словами, каков биологический смысл обнаруженных нами явлений? Подобная система регуляции представляется более целесообразной, поскольку позволяет осуществлять быстрый ответ на появление в клетке индукторов окислительного стресса. Действительно, постоянно перемещаясь между ядром и цитоплазмой, белковый комплекс отслеживает ситуацию в обоих ком-партментах. Кроме того, появляющееся постоянно в ядре небольшое количество Nrf2, с одной стороны, достаточно для поддержания необходимого базального уровня транскрипции подконтрольных ему генов, а, с другой стороны, способно в необходимый момент остаться в ядре для осуществления активации в ответ на индукторы окислительного стресса. Необычным оказывается факт, что репрес-сор, основная роль которого заключается в выведении транскрипционного фактора из ядра и тем самым разобщение его с генами-мишенями, также способен являться и активатором транскрипции этих генов. Биологическую роль подобного явления еще предстоит выяснить, возможно, это позволяет осуществлять более эффективную активацию базальной транскрипции подконтрольных генов.

Суммируя полученные результаты и известные данные, можно предложить следующую модель регуляции экспрессии генов ответа на окислительный стресс (рис.19). В нормальных условиях Keapl и Nrf2 постоянно перемещаются между ядром и цитоплазмой, что позволяет поддерживать уровень Nrí2 в ядре на низком базальном уровне, необходимом для минимальной экспрессии подконтрольных ему генов. В ядре Keapl выполняет двоякую функцию: взаимодействуя с Nrf2 в составе транскрипционного комплекса, активирует экспрессию генов и одновременно выводит фактор в цитоплазму за счет своего сигнала ядерного экспорта. В цитоплазме Nrf2 постоянно подвергается Keapl -опосредованной деградации, что поддерживает количество фактора на низком уровне. В условиях окислительного стресса взаимодействие между Nrf2 и Keapl ослабевает, фактор избегает Keapl-зависимой деградации и накапливается в ядре, где запускает транскрипцию ARE-зависимых генов в полном объеме. Вероятно, в ядре комплекс Keapl-Nrf2 с ослабленным взаимодействием распадается под действием третьего белка, протимозина а (РгоТа), который способен специфично взаимодействовать с Keapl. При исчезновении факторов, вызывающих окислительный стресс, способность Keapl взаимодействовать с Nrf2 восстанав-

ливается, и фактор выводится из ядра в цитоплазму, где и деградирует до низкого базального уровня. Возможно, что здесь Кеар! играет дополнительную роль, диссоциируя №Т2 от хроматина, и отражение именно этого процесса мы наблюдали в экспериментах ЕМ5А и СЫР. Таким образом, предложенная нами гипотеза способна объяснить и механизм терминации ответа клетки на окислительный стресс.

д £ Индукторы

Деградация

окислительного стресса

Б а зальная транскрипция

ин __ч

Индуцируемая транскрипция

Рис.19. Упрошенная модель регуляции активности фактора 1ЧгП в нормальных условиях (А) я в условиях окислительного стресса (Б) с учетом открытых нами челночных свойств N70 н Кеар1.

выводы

1) Keapl является белком-челноком, содержащим классический лейцин-богатый сигнал экспорта из ядра.

2) Транскрипционный фактор Nrf2 мигрирует между ядром и цитоплазмой, и его экспорт из ядра опосредован репрессором Кеар 1.

3) Keapl с мутацией в сигнале экспорта из ядра, взаимодействуя с Nrf2, является активатором, а не репрессором №£2-зависимой экспрессии генов.

4) Белок Keapl может входить в состав транскрипционного комплекса, образуемого фактором Nrf2 с ARE.

5) Предложена новая модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) R.N. Karapetian, A.G. Evstafieva, I.S. Abaeva, N.V. Chichkova, G.S. Filonov, Y.P. Rubtsov, E.A. Sukhacheva, S.V. Melnikov, U. Schneider, E.E. Wanker, and A.B. Vartapetian. Nuclear oncoprotein Prothymosin alpha is a partner of Keapl: implications for expression of oxidative stress-protecting genes. Molecular and Cellular Biology, 2005,25(3), p. 1089-1099.

2) Евстафьева А.Г., Карапетян P.H., Рубцов Ю.П., Филонов Г.С., Абаева И.С., Фатеева Т.В., Мельников С.В., Чичкова Н.В. и Вартапетян А.Б. Новые функции известного белка: участие протимозина альфа в защите клеток от апоп-тоза и окислительного стресса. Молекулярная биология, 2005, т. 39, вып. 5, с. 729- 745.

3) Мельников С.В. и Филонов Г.С. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков Nrf2 и Keapl в регуляции ответа клетки на окислительный стресс. Материалы ХП международной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция "Биоинженерия и биоинформатика", 2005, том II, с. 48-49.

4) Mel'nikov S.V., Filonov G.S. Keapl is a shuttling protein and its nuclear export contributes to negative regulation of Nrf2. Материалы XII международной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция "Химия", 2005, т. I, с. 206.

Подписано в печать 16.01.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 594 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Список условных обозначений

Введение

1. Регуляция №£2-зависимой транскрипции генов (обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Nr£2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс

1.3. Способы регуляции фактора Nrf

1.4. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков, краткий обзор

В процессе эволюции живые организмы разделились на два основных типа: прокариотические и эукариотические. Особенностью эукариотических клеток стало наличие ядра - отделенного от цитоплазмы мембраной компар-тмента, основной функцией которого стало хранение генетической информации. В связи с этим системы обслуживания ДНК и перевода генетического кода в аминокислотную последовательность значительно усложнились.

Поскольку для синтеза белка необходимо перевести мРНК из ядра в цитоплазму, а, с другой стороны, для осуществления процессов репликации и транскрипции нужно обеспечить наличие в ядре необходимых белков, то ядерная мембрана должна быть проницаема. Таким образом, возникла целая система ядерно-цитоплазматического транспорта, основной функцией которой стал перенос необходимых макромолекул через особые образования -ядерные поры.

Возникновение системы ядерно-цитоплазматического транспорта позволило создать очень гибкий механизм регуляции транскрипции различных генов, поскольку добавило еще один способ контроля активности транскрипционных факторов. Действительно, теперь транскрипционный фактор, находящийся в цитоплазме, остается неактивным до тех пор, пока не получит возможность перейти в ядро. С другой стороны его ядерная транслокация является более быстрым процессом, чем синтез фактора, начиная со стадии транскрипции или трансляции. Таким образом, пространственное разделение транскрипционного фактора и его генов-мишеней является очень частым способом его репрессии в условиях, когда активность фактора не требуется. И напротив, в условиях (часто неблагоприятных), когда транскрипция генов необходима, для осуществления ответа достаточно перевести фактор в ядро.

Поскольку подобный механизм является удобным для эукариотической клетки, то неудивительно, что на настоящее время известно довольно много различных транскрипционных факторов, регулируемых таким образом.

В данной работе описывается контроль активности транскрипционного фактора Nr£2 именно посредством ядерно-цитоплазматического транспорта. Nr£2 является ключевым белком ответа клетки в процессе очень опасного состояния - окислительного стресса, поэтому данное исследование является актуальным и позволяет по-новому взглянуть на способы защиты эукариотиче-ского организма от вредного действия окружающей среды.

1. РЕГУЛЯЦИЯ NRF2-3ABHCHMOfi ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ обзор литературы)

1.1. Введение

В процессе жизнедеятельности эукариотической клетки в цитоплазме и в ядре могут появляться активные формы кислорода и азота, способные повреждать важнейшие клеточные макромолекулы и в итоге приводить к гибели клетки. Подобное крайне неблагоприятное состояние называется окислительным стрессом. Оно может быть вызвано как проникновением в клетку извне ксенобиотиков и оксидантов, так и естественными сбоями в механизмах клеточного метаболизма. На уровне целого организма подобное состояние также вызывается действием ионизирующей радиации, облучения ультрафиолетом, в ходе фагоцитоза и воспалительных процессов [1]. Окислительный стресс является причиной целого ряда серьезных заболеваний: атеросклероз, нейродегенеративные заболевания, рак [1-4]. В связи с этим исследование молекулярных механизмов поведения эукариотической клетки в состоянии окислительного стресса является актуальной научной задачей.

Для защиты клетка выработала сложный механизм, включающий в себя первую и вторую фазу ответа на окислительный стресс [5]. Если попавшее в цитозоль соединение гидрофобно, то именно в процессе первой фазы ответа осуществляется его перевод в водорастворимую форму ферментами группы цитохрома Р450. Однако получаемые в итоге соединения часто ядовиты (в основном именно они и вызывают появление активных форм кислорода), поэтому требуется дополнительная модификация (как правило, конъюгация с гидрофильными молекулами, например с глутатионом) для безопасного вывода образовавшихся продуктов из клетки [6]. Эта стадия осуществляется белками т.н. второй фазы ответа клетки на окислительный стресс. Если же соединение, проникшее в клетку, уже водорастворимо, то оно сразу подвергается действию ферментов второй фазы ответа.

Основным регуляторным белком второй фазы ответа клетки на окислительный стресс является транскрипционный фактор Nr£2, под контролем которого находятся все гены, кодирующие детоксифицирующие ферменты [7]. Механизмы регуляции фактора Nr£2 и являются предметом обсуждения настоящего обзора.

1.2. Nrf2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс

Nrf2 - белок семейства CNC bzip

Nrf2 - это белок длиной 581 аминокислотный остаток и массой 66 кДа (электрофоретическая подвижность у него аномальна и соответствует белку размером около 110 кДа). Nrf2 относится к семейству транскрипционных факторов с доменом CNC (cap'n'collar) и с участком т.н. основной лейциновой молнии (bzip - basic zipper). Этот белок был впервые обнаружен при поиске транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторными областями глобинового и других эритроидных генов, и назван по сходству с основным регулятором этого локуса - NF-E2 (Nrf2 - NF-E2 related factor 2) [8, 9]. В отличие от NF-E2, распространенного только в гематопоэтических клетках

10], Nrf2 встречается во всех клетках организма, что уже в самом начале исследования его свойств позволяло предположить его важные функции. Кроме Nrf2 к семейству CNC bzip транскрипционных факторов относятся белки Nrfl и Nrf3, свойства которых будут затронуты далее.

Nr£2 взаимодействует со специфической областью ДНК в промоторных областях генов, кодирующие белки ответа клетки на окислительный стресс, называемой ARE (antioxidant response element, участок ответа на оксиданты)

11], или EpRE (electrophile response element, участок ответа на электрофилы)

12]. Свое название данные последовательности получили вследствие того, что репортерные конструкции под их контролем активировались под действием оксидантов или электрофилов. Общий вид последовательности ARE:

А

5'T—ANN— С G

TGA—NNNGC Т

3' (Л/С означает, что в этом положении может находиться либо аденин, либо цитозин, коровый участок выделен скобками) [13].

Последовательность в промоторной области гена гемоксигеназы человека и крысы исторически была названа StRE (stress response element, участок ответа на стресс), поскольку в данном случае репортерная конструкция отвечала также на действие гема и форболовых эфиров [14].

На настоящее время последовательность ARE найдена в промоторных областях генов глутатион-Б-трансферазы (GST) [15-18], хиноноксидоредукта-зы (NQ01) [19, 20], гемоксигеназы (НО-1) [14, 21], гамма-глутамилцистеинсинтетазы (yGCS) [22] и т.п. (табл. 1-1).

Таблица 1-1. Последовательности ARE, найденные в различных генах. Прописными буквами обозначены нуклеотиды, входящие в коровый участок.

Ген Последовательность ARE

GSTA2 крысы 5'taatggTGACAAAGCaact3'

GSTA1 мыши 5 'taatggTGAC AAAGC aact3'

GSTP крысы 5'tcactaTGATTC AGCaact31

NQ01 крысы 5 'tcacagTGACTTGGCaaaa3'

NQ01 человека 5'tcacagTGACTCAGCagaa3'

Для взаимодействия с ДНК фактору Nrf2, как и всем белкам его семейства, необходимо гетеродимеризоваться с другими белками, обладающими доменом bzip, а именно с белками семейства малых Maf (MafF, К и G), а также с ATF4 и c-Jun. Подробнее данное взаимодействие будет рассмотрено ниже.

Сравнение первичной структуры Nrf2 и его гомолога из организма курицы, белка ЕСН, позволило выделить несколько консервативных областей, названных доменами Nehl-6 (Nr£2-ECH homology) (рис.1-1) [23]. Участок Nehl содержит уже упоминаемые выше домены CNC и bzip, участвующие в гете-родимеризации и связывании с ДНК [8]. Фрагменты Neh3, Neh4 и Neh5 являются независимыми доменами и отвечают за активацию транскрипции. Исходя из результатов, полученных при помощи дрожжевой двугибридной системы, фрагмент Neh3 взаимодействует с белком CHD6 (хромо-АТФаза/геликаза ДНК-связывающий белок) [24]. Neh4 и Neh5 кооперативного взаимодействуют с ферментом ацетилтрансферазой (СВР - CRFB binding protein), вызывая тем самым деконденсацию хроматина и привлекая далее все необходимые транскрипционные факторы [24, 25]. Neh6 необходим для репрессор-независимой деградации транскрипционного фактора, о чем подробнее будет рассказано далее [26]. Также отдельного рассмотрения требует и N-концевой домен Neh2, отвечающий за взаимодействие Nrf2 с белком-репрессором Keapl [23].

Активация транскрипции eh3

Взаимодействие Деградация ДНКс репрессором, связывающий деградация домен

Рис. 1-1. Схематическое представление доменов фактора Nrf2.

Nrf2 - ключевой фактор ответа клетки на окислительный стресс Исследования по сверхпродукции Nrf2 в клеточных линиях подтвердили его роль основного активатора транскрипции генов второй фазы ответа клетки на окислительный стресс. В его присутствии увеличивались количество как детоксифицирующих ферментов (и их РНК соответственно), так и активность репортерных генов, находящихся под контролем ARE [11, 27].

Непосредственный окислительно-восстановительный потенциал в клетках мышей, как дикого типа, так и с нокаутированным геном nrj2 был измерен при помощи двух методов (real-time electron paramagnetic resonance imaging и spin probe kinetic analysis): результаты продемонстрировали, что присутствие Nrf2 снижает уровень активных форм кислорода in vivo [28].

Дополнительным подтверждением особой роли фактора Nrf2 в ответе клетки на окислительный стресс стали исследования фенотипа мышей с нокаутированным геном nrf2. В подобных организмах существенно уменынилась как базальная, так и индуцируемая активность генов защитных белков (GST, NQOl, НО-1, yGCS). Кроме того, мутантные мыши оказались очень чувствительны к условиям окислительного стресса (действие ацетаминофена, бутилированного гидрокситолуола, выхлопов дизельного двигателя, сигаретного дыма и т.п.) [29-32], в их организмах в подобных условиях образуется большее, по сравнению с мышами дикого типа, количество аддуктов ДНК, чаще встречаются злокачественные новообразования [30, 33-35]. Стоит отметить, что перспективное терапевтическое средство олтипраз, активирующее транскрипцию генов белков ответа клетки на окислительный стресс, оказалось неэффективно в клетках с нарушенным синтезом фактора Nrf2 [35]. Многочисленные исследования показывают, что клетки, непродуцирующие Nrf2, чаще вступают в апоптоз под действием различных индукторов окислительного стресса (оксид азота, пероксид водорода, действие ультрафиолета и т.п.) [36-40]. Сверхэкспрессия же Nrf2 в клетках, напротив, уменьшает количество апоптотических клеток, образовавшихся под действием Fas лиганда [41].

Процесс хронического воспаления, считающийся одной из причин раковых заболеваний, также зависит от присутствия в клетках Nrf2. В мышах с нарушениями в его гене это состояние проходит очень остро, а внутриклеточный и иммунный ответы на него развиваются медленнее по сравнению с организмами дикого типа [42].

Несмотря на то, что мыши с разрушенным геном nrf2 развиваются нормально в лабораторных условиях, женские особи живут меньше, чем мыши дикого типа, и в их организмах развивается серьезное аутоиммунное заболевание, что указывает на Nrf2 как на один из белков, контролирующих подобные процессы [43,44].

Таким образом, все накопленные на настоящее время данные позволяют утверждать, что именно Nrf2 является ключевым регулятором активности генов ферментов II фазы ответа клетки на окислительный стресс. Его присутствие в клетке жизненно необходимо для нормального функционирования организма в неблагоприятных окружающих условиях.

Что касается других членов семейства CNC bzip, то Nrfl участвует в регуляции базальной активности ряда генов второй фазы ответа на окислительный стресс (гены, кодирующие GST-P и GST-Ms, yGSC), но не сильно влияет на индуцируемую транскрипцию этих генов [45-47]. Клетки с нокаутированным геном nrfl также оказались чувствительны к условиям окислительного стресса, в них падал уровень глутатиона и возрастало количество реакционно-способных форм кислорода [45]. Репортерные конструкции под контролем ARE отвечали на сверхэкспрессию Nrfl, однако в гораздо меньшей степени, чем на появление в клетках Nrf2 [48]. Изучение локализации фактора показало, что Nrfl находится в эндоплазматическом ретикулуме за счет присутствия на N-конце белка трансмембранного домена. Индуктор стресса в эндоплазматическом ретикулуме (туникамицин) вызывает перелокализацию фактора в ядро, демонстрируя его активное участие в процессе ответа клетки на подобный стресс [49]. NrO в свою очередь также не участвует в активации ARE-зависимой транскрипции, а в некоторых условиях ингибирует ее, что подробнее будет рассмотрено ниже [50,51].

Гены-мишени Nrf2

Каков же спектр генов, активируемых фактором Nrf2? Для ответа на поставленный вопрос ряд научных коллективов использовал технологию ДНК микрочипов, сравнивая профили экспрессии генов в клетках мышей дикого типа и с нокаутированным геном nrfl в нормальных условиях и после обработки индукторами окислительного стресса.

В ходе экспериментов были использованы клетки легких, печени, пищеварительного тракта, нервной системы [52-57]. В качестве индукторов использовались D3T (ЗН-1,2-дитиол-3-тион), сульфорафан, трет-бутилгидрохинон, условия гипероксии.

В результате гены, активирующиеся только в клетках nrf2+/+ мышей, можно разделить на следующие группы:

- ферменты метаболизма ксенобиотиков. Среди них NQOl, GST, UDP гликозилтрансфераза, эпоксидгидролаза-1, альдегид-оксидаза-1 и другие;

- антиоксиданты (НО-1, тиоредоксин, катал аз а-1, глутатионредуктаза-1, транскетолаза и др.);

- белки системы деградации (различные субъеденицы 26S протеасомы, убиквитин 2 и др.);

- шапероны (Hsp, 86 кДа 1, 2 белка из подсемейства В гомологов Hsp 40 и др.);

- факторы белкового транспорта (Ran, Sec 23а, Sec 61 и др.);

- сигнальные молекулы (митоген-активируемая протеинкиназа-10 и др.);

- транскрипционные факторы и регуляторы (Maf G и др.);

- факторы процессинга РНК и трансляции (фактор сплайсинга 10, белок RNPA1 и др.).

Как и ожидалось, значительная часть 1\Н2-зависимых генов кодирует ферменты метаболизма ксенобиотиков и антиоксиданты. Также важную роль в процессе ответа клетки на окислительный стресс играют шапероны и белки системы деградации, поскольку в процессе стресса в цитоплазме могут накапливаться поврежденные или неправильно свернутые белки [52-57]. Кроме генов, активирующихся во всех типах клеток, существуют и тканеспецифичные. Так, в нейронах Nrf2 регулирует транскрипцию генов, кодирующих белки метаболизма кальция [57]. Кроме того, Nrf2 регулирует транскрипцию генов, контролирующих ферменты воспалительного ответа клеток легкого в процессе сепсиса [52]. В nrf2m/~ тканях оказалась нарушена экспрессия генов системы врожденного иммунитета (белки узнавания пептидогликанов, воспалительные цитокины, хемокины и др.).

Результаты этих экспериментов, проверенные в ряде случаев также методом RT-PCR, подтвердили предыдущие выводы, что главная категория генов, подверженных регуляции транскрипционным фактором Nrf2, кодирует ферменты детоксификации ксенобиотиков и антиоксиданты. В ряде случаев показано, что промоторная область этих генов содержит несколько функциональных последовательностей ARE, т.е. активация осуществляется непосредственно путем присоединения Nrf2. Остальные гены, экспрессируемые только в nrf2+/+ организмах, предположительно содержат эту последовательность, однако не исключено, что активация их транскрипции осуществляется

14 нако не исключено, что активация их транскрипции осуществляется другими клеточными механизмами.

Нельзя не отметить, что наряду с активацией транскрипции в клетках, обработанных D3T, наблюдалась и репрессия ряда генов [53]. Так, среди белков, уровень мРНК которых в клетках мышей дикого типа понижен, по сравнению с nrf2'f' организмами, оказались несколько изозимов цитохрома Р450, карбоновые ангидразы 3 и 14 и некоторые белки, относящиеся к системе биосинтеза и метаболизма холестерина и липидов. Возможно, снижение активности этих белков способствует преодолению клеткой состояния окислительного стресса.

Приведенные выше данные о необходимости фактора Nr£2 для эффективного преодоления условий окислительного стресса, вызываемого различными индукторами в разных типах клеток, позволили высказать предположение о ключевой роли этого фактора в механизме защиты на уровне целого организма. Похоже, что транскрипционный фактор Nr£2 является универсальным регулятором системы ответа на окислительный стресс различных типов клеток организма, причем активируются не только классические, ARE-зависимые, но и необходимые в данных условиях тканеспецифичные гены [58].

В большинстве описанных тканях и клеточных линиях уровень экспрессии самого гена nrf2 не изменяется под действием индукторов окислительного стресса, однако в кератиноцитах промоторная область его гена содержит 2 функциональные последовательности ARE [59]. Экспрессия репортерного гена под контролем участка из промоторной области гена nrf2 усиливается под действием D3T. В условиях данного эксперимента взаимодействие Nrf2 и фрагмента из его промоторной области было продемонстрировано как in vivo, так и in vivo. Исходя из этих данных ген nrf2 в данной системе предположительно является саморегулируемым, т.е. его активность на каком-то этапе ответа клетки на стресс может контролироваться самим фактором Nrf2 [59].

выводы

1) Keapl является белком-челноком, содержащим классический лейцин-богатый сигнал экспорта из ядра.

2) Транскрипционный фактор Nrf2 мигрирует между ядром и цитоплазмой, и его экспорт из ядра опосредован репрессором Keapl.

3) Keapl с мутацией в сигнале экспорта из ядра, взаимодействуя с Nrf2, является активатором, а не репрессором №Т2-зависимой экспрессии генов.

4) Белок Keapl может входить в состав транскрипционного комплекса, образуемого фактором Nrf2 с ARE.

5) Предложена новая модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс.

1.5. Заключение

Изложенные данные литературы позволяют утверждать, что изучение механизмов регуляции ответа клетки на окислительный стресс является актуальной темой, привлекающей внимание множества научных групп. Исследование данной проблемы ведется быстрыми темпами, появляющиеся в зарубежной печати публикации постоянно уточняют уже имеющиеся данные и постепенно открывают новые факты, тем не менее, до недавнего времени оставались вопросы, на которые не было ответа. Каким образом осуществляется базальная транскрипция генов, подконтрольных Nrf2, за счет чего дезактивируется транскрипционный фактор в условиях возвращения клетки в нормальное состояние? Существовавшая модель не давала адекватный ответ на поставленные вопросы. В связи с этим, изучение свойств белков Nr£2 и Keapl с совершенно новой для них стороны, а именно в свете их постоянного ядерно-цитоплазматического транспорта, являлось задачей, решению которой и посвящена настоящая работа.

2. РОЛЬ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКА Keapl В РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА КЛЕТКИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ

СТРЕСС (результаты и обсуждение)

2.1. Keapl способен перераспределяться в ядро

Исследование началось в то время, когда Keapl было принято считать цитоплазматическим белком, который связан с актином и за счет этого удерживает Nr£2 в цитоплазме. Однако в нашей лаборатории в ходе поиска при помощи метода дрожжевой двугибридной системы партнеров ядерного белка человека протимозина а был найден Keapl [131]. Опыты по прямому связыванию рекомбинантных Keapl и протимозина а и их мутантов подтверждают, что это взаимодействие высокоспецифично. Поскольку протимозин а является исключительно ядерным белком, то в нашей лаборатории возникло предположение о том, что Keapl может на короткое время появляться в ядре, и его наблюдаемая цитоплазматическая локализация свидетельствует лишь о равновесном распределении белка в клетке.

Для проверки этого предположения было решено более подробно исследовать внутриклеточную локализацию белка Keapl.

В первую очередь была исследована локализация эндогенного белка Keapl в клетках линии HeLa (карцинома шейки матки человека) и HepG2 (трансформированные гепатоциты человека). Окрашивание зафиксированных параформальдегидом клеток проводилось первичными моноклональными антителами к Keapl, а затем вторичными, конъюгированными с хромофором. Наблюдения, проводимые при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, продемонстрировали, что эндогенный репрессор действительно является исключительно цитоплазматическим белком, (рис.2-1 А,В). Самые простые предположения в данном случае, - белок не имеет сигналов импорта в ядро (Nuclear Localization Signal - NLS) или, более того, он постоянно связан с актином. Однако существует и другая возможность: белок является челноком. т.е. постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой, причем экспорт осуществляется быстрее импорта. При этом он может содержать как сигнал импорта в ядро, так и сигнал экспорта из него (NES - Nuclear Export Signal).

Для проверки челночных свойств эндогенного Keapl исследуемые клетки были обработаны специфическим ингибитором ядерного экспорта лепто-мицином Б (Leptomycin В, LMB) (рис.2-2).

W • ■ fl о* г, t *

1MB + - +

Рис.2-1, Локализация эндогенного белка Keapl в клетках линии HepG2 (А и Б) и HeLa (В и Г) до и после обработки LMB. Использованы моноклональные антитела 2Н5 к белку Keapl.

Из литературы известно, что действие на клетки наномолярных количеств LMB специфически ингибирует фактор ядерного экспорта CRM1 за счет взаимодействия с остатком цистеина в его центральной консервативной области, прекращая таким образом активный транспорт из ядра многих белков-челноков. Более того, известно, что именно CRM1 связывается со специфической аминокислотной последовательностью транспортируемых белков, известной как лейцин-богатый сигнал ядерного экспорта [138].

О ОН о^ о

Рис.2-2. Структурная формула лептомнцина Б.

Обработка исследуемых клеток i.MB действительно вызвала перераспределение R'eap 1 из цитоплазмы в ядро, что свидетельствовало о том, что ре-прессор на самом деле является челноком (рис.2-1Б.Г). Во всех описанных выше случаях исследования локализации эндогенного белка существовала вероятность того, что наблюдаемая флуоресценция отвечает не только местоположению Keapl, но и локализации других клеточных компонентов, обладающих сродством к используемым антителам. Для доказательства того, что антитела специфично окрашивают эндогенный белок, к клеткам в процессе окрашивания был добавлен рекомбинантный химерный белок GST-Keapl(308-624 а.о.), который должен был конкурировать за антитела с эндогенным белком, находящимся в зафиксированных клетках, и тем самым ослаблять свечение хромофора. Так и получилось (рис.2-3), что подтвердило специфичность окрашивания Кеар) данными антителами.

А ВЬ

Рис.2-3, Окрашивание эндогенного Keapl в клетках линии HeLa антителами 2Н5 в присутствии GST (А. контроль) и GST-Keap 1(308-624} (Б). Оба поля сняты в одинаковых условиях, при добавлении рекомбинантного репрессора свечение хромофора ослабевает.

Также была исследована локализация сконструированных нами химерных белков EGFP-Keapl.

EGFP является биологически инертным и, как правило, не влияет на свойства слитых с ним белков. Кроме того, он не содержит каких-либо сигнальных последовательностей, что делает его удобным маркером для изучения локализации и транспорта в клетке соединенных с ним белков. Также использование химерных конструкций на основе GFP позволяет нам наблюдать локализацию белков непосредственно в живых клетках. Сохранение белком

Keapl-GFP функциональных свойств репрессора Nrf2-зависимой экспрессии генов описано в литературе [23].

В качестве векторов для экспрессии химерных белков были использованы плазмиды pEGFP-Cl, -С2 и -СЗ, отличающиеся только открытой рамкой считывания полилинкера. Общая схема синтеза химерных белков в эукарио-тических клетках приведена на рисунке 2-4. am ы I (ДНКЕОРР ~

I Кезр1

И «ГО дммииоммых и — SV40 poly А точечные чутлнюв I

Транскрипция и трансляция

Keapl и

Рис.2-4. Схематическое изображение участка плач миды. кодирующего химерный белок EGFP-Keapl, с необходимыми регуляторными элементами.

Изучение локализации методом флуоресцентной микроскопии в живых и зафиксированных клетках на следующий день после трансфекции продемонстрировало, что, как и в случае эндогенного репрессора, химерный белок находится преимущественно в цитоплазме (рис.2-5А). При обработке LMB химерный белок EGFP-K.eapl также перераспределялся в ядро (рис.2-5В).

Рис.2-5. А и В - локализация в клетках химерного белка EGFP, соединенного с KeaptWT, в последнем случае трансфицированные клетки обработаны LMB. Б - окрашивание ядер клеток в эксперименте А красителем Hoechst3342. Здесь и далее локализация наблюдается в клетках линии 1 leLa.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

На основании всех описанных выше результатов можно было сделать два вывода:

Keapl способен активно накапливаться в ядре, поскольку масса EGFP-KeaplWT (порядка 100 кДа) заведомо превышала верхний предел размера белков для прохода через ядерную пору без участия активного транспорта (40-60 кДа), и возможность пассивной диффузии этого полипептида в ядро была исключена;

Keapl быстро экспортируется из ядра и, по-видимому, содержит лейцин-богатый NES, поскольку LMB блокирует экспорт белков, содержащих именно такой сигнал экспорта из ядра. Однако существует вероятность того, что он транспортируется из ядра в комплексе с другим белком, несущим такой сигнал.

Следующим шагом была проверка гипотезы о наличии в Keapl сигнала экспорта из ядра. Для этого необходимо было продемонстрировать, что Keapl содержит короткую лейцин-богатую последовательность, которая: а) необходима для экспорта из ядра; б) достаточна для него.

2.2. Идентификация сигнала ядерного экспорта белка Keapl

Сначала был проведен анализ аминокислотной последовательности белка Keapl человека. Классический сигнал экспорта из ядра, охарактеризованный для целого ряда белков, имеет следующий общий вид: v i lxwlx2lxl

F где X - это любая аминокислота; жирным выделены остатки аминокислот, наиболее важные для функционирования всего сигнала, -мутации по этим положениям полностью прекращают ядерный экспорт [139].

В белке Keapl (рис.2-6), который довольно богат гидрофобными участками, были найдены две последовательности, похожие на классический сигнал экспорта из ядра. Они находились в N-концевой половине, причем участок с 301-го по 310-й остаток имел наибольшее сходство с лейцин-богатым мотивом. В таблице 2-1 приведены эти последовательность в сравнении с уже охарактеризованными сигналами ядерного экспорта других белков.

1 mqpdprpsga gaccrflplq sqcpegagda vmyastecka evtpsqhgnr tfsytledht

61 kqafgimnel rlsqqlcdvt Iqvkyqdapa aqfmahkwl assspvfkam ftnglreqgm

121 ewsiegihp kvmerliefa ytasismgek cvlhvmngav myqidswra csdflvqqld

181 psnaigianf aeqigcvelh qrareyiymh fgevakqeef fnlshcqlvt lisrddlnvr

241 cesevfhaci nwvkydceqr rfyvqallra vrchsltpnf lqmqlqkcei lqsdsrckdy

301 Ivkifeel308tl310 hkptqvmp 318

319 cr apkvgrliyt aGGyfrqsls yleaynpsdg twirl adlqv 360

361 prsglagcw ggllvavGGr nnspdgntds saldcynpmt nqwspcapms vp 412

412 rnrigvgv idghivavGG shgcihhnsv eiyeperdew hlvapmlt 458

459 rr igvgvavlnr llvavGGfdg tnrlnsaecx ypernewrmi tamnti 506

507 rsga gvcvlhnciv aaGGvdgqdq lnsveiydve tetwtfVapm 550

551 khrrsalpit vhqgrivvlG Gvdghtflds vecydpdtdt ws 591

592 evtmitsg rsgvgvavtm epcrkqidqq nctc 624

Рис.2-6. Аминокислотная последовательность белка Keapl человека. Жирными буквами обозначены участки, исследуемые или упоминаемые в настоящей работе. Предполагаемые области диглициновых повторов выделены в отдельные строки (остатки 319-591), аминокислотные остатки, консервативные среди Kelch повторов других белков, подчеркнуты.

1. Berlett, B.S. and E.R. Stadtman, Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem, 1997.272(33): p. 20313-6.

2. Jacobson, M.D., Reactive oxygen species and programmed cell death. Trends Bio-chem Sci, 1996.21(3): p. 83-6.

3. Cerutti, P.A., Prooxidant states and tumor promotion. Science, 1985. 227(4685): p. 375-81.

4. Ames, B.N., M.K. Shigenaga and T.M. Hagen, Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(17): p. 7915-22.

5. Holtzclaw, W.D., A.T. Dinkova-Kostova and P. Talalay, Protection against elec-trophile and oxidative stress by induction of phase 2 genes: the quest for the elusive sensor that responds to inducers. Adv Enzyme Regul, 2004.44: p. 335-67.

6. Hayes, J.D. and L.I. McLellan, Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic Res, 1999.31(4): p. 273-300.

7. Itoh, К., K. Igarashi, N. Hayashi, M. Nishizawa and M. Yamamoto, Cloning and characterization of a novel erythroid cell-derived CNC family transcription factor heterodimerizing with the small Maffamily proteins. Mol Cell Biol, 1995. 15(8): p. 4184-93.

8. Venugopal, R. and A.K. Jaiswal, Nrfl and Nrf2 positively and c-Fos and Fral negatively regulate the human antioxidant response element-mediated expression of NAD(P)H:quinone oxidoreductasel gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(25): p. 14960-5.

9. Nguyen, Т., H.C. Huang and C.B. Pickett, Transcriptional regulation of the antioxidant response element. Activation by Nrf2 and repression by MafK. J Biol Chem, 2000.275(20): p. 15466-73.

10. Wasserman, W.W. and W.E. Fahl, Functional antioxidant responsive elements. Proc Natl Acad Sci USA, 1997.94(10): p. 5361-6.

11. Friling, R.S., A. Bensimon, Y. Tichauer and V. Daniel, Xenobiotic-inducible expression of murine glutathione S-transferase Ya submit gene is controlled by an electrophile-responsive element. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(16): p. 625862.

12. Reinhart, J. and W.R. Pearson, The structure of two murine class-mu glutathione transferase genes coordinately induced by butylated hydroxyanisole. Arch Biochem Biophys, 1993. 303(2): p. 383-93.

13. Li, Y. and A.K. Jaiswal, Regulation of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene. Role of API binding site contained within human antioxidant response element. J Biol Chem, 1992.267(21): p. 15097-104.

14. Mulcahy, R.T. and J.J. Gipp, Identification of a putative antioxidant response element in the 5'-flanking region of the human gamma-glutamylcysteine synthetase heavy submit gene. Biochem Biophys Res Commun, 1995.209(1): p. 227-33.

15. Itoh, K., N. Wakabayashi, Y. Katoh, T. Ishii, K. Igarashi, J.D. Engel and M. Ya-mamoto, Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Ntf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes Dev, 1999. 13(1): p. 76-86.

16. Nioi, P., T. Nguyen, P.J. Sherratt and C.B. Pickett, The carboxy-terminal Neh3 domain of Nif2 is required for transcriptional activation. Mol Cell Biol, 2005. 25(24): p. 10895-906.

17. Katoh, Y., K. Itoh, E. Yoshida, M. Miyagishi, A. Fukamizu and M. Yamamoto, Two domains ofNrf2 cooperatively bind СВР, a CREB binding protein, and syner-gistically activate transcription. Genes Cells, 2001. 6(10): p. 857-68.