Структура и функции протимозина альфа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ЕВСТАФЬЕВА АЛЕКСАНДРА ГЕОРГИЕВНА

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.ВЛомоносова

Научный консультант: доктор химических наук, профессор А. Б. Вартапетян

Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корреспондент РАН, профессор Габибов Александр Габибович

доктор химических наук, профессор Лаврик Ольга Ивановна

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, профессор Тер-Аванссян Михаил Давидович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится 31 октября 2006 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, ГСП-2, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ

Автореферат разослан ^(У сентября 2006 г.

Ж™

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одна из актуальных и наиболее сложных проблем молекулярной биологии во времена геномики и протеомики - поиск новых функций и определение механизмов функционирования белков в клетках. Успешное завершение секвенирования генома человека привело к тому, что прочитаны практически все гены, становится известной структура большинства их белковых продуктов. Но даже если о структуре белка известно все или почти все, часто бывает очень непросто понять, что этот белок делает в клетке, особенно если учесть тот факт, что большинство белков выполняют в клетке не одну, а несколько функций. Чтобы понять, как работает живая система в целом, необходимо разобраться в сложной взаимосвязи этих функций.

Протимозин альфа (ПроТа) - это мультикопийный ядерный белок млекопитающих, состоящий из 109-110 аминокислотных остатков, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков (naturally unfolded proteins). Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах в жизни и смерти клеток. Структурно-функциональное исследование протимозина альфа актуально как в связи с необходимостью разработки методов изучения механизмов функционирования белков, так и вследствие того, что функции ПроТа сами по себе имеют существенное значение для протекания весьма важных клеточных процессов, таких как деление, опухолевая трансформация, апогггоз, защита от окислительного стресса.

Несмотря на то, что ПроТа является жизненно важным белком, механизм его действия до сих пор не ясен. Впервые ПроТа выделили как предшественника тимусного гормона тимозина al, иммуностимулирующего пептида, состоящего из 28 N-концевых аминокислотных остатков ПроТа. Выяснилось, что и сам ПроТа обладает иммуностимулирующими свойствами, его относили к гормонам, обеспечивающим нормальное функционирование иммунной системы млекопитающих. Позднее появились основания сомневаться в гормональной природе этого белка. ПроТа оказался ядерным белком и многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об его участии в пролиферации клеток. Он ускоряет клеточное деление, клетки с повышенным содержанием ПроТа приобретают фенотип трансформированных клеток. Снижение уровня ПроТа приводит к остановке деления клеток. Таким образом, изучение механизмов функционирования ПроТа актуально для понимания закономерностей клеточного деления.

Активация экспрессии гена ПроТа обнаружена в клетках многих раковых опухолей, в частности рака толстой кишки, тонкой кишки, печени, легких и молочной железы. Было показано, что суперпродукция ПроТа не только влияет на пролиферацию, но и позволяет клеткам расти в среде с пониженным содержанием сыворотки от vitro, приводит к отсутствию

контактного торможения и росту не прикрепленных к подложке клеток. Следовательно, ПроТа обладает свойствами, аналогичными свойствам онкобелков, и исследование механизмов его функционирования актуально для создания новых антираковых препаратов.

Регуляция экспрессии генов является фундаментальной научной проблемой, от решения которой зависит возможность влиять на важнейшие биологические процессы на уровне клетки и всего организма. Показано, что за счет своего центрального домена, состоящего из протяженных блоков дикарбоновых аминокислот, ПроТа взаимодействует с гистонами, в частности с гистоном HI, и способен индуцировать структурные перестройки хроматина. Кроме того, обнаружен еще ряд взаимодействующих с ПроТа белков: репрессор рецептора эстрогенов REA, коактиватор транскрипции СВР и гистоновая ацетилтрансфераза рЗОО, транскрипционный фактор STAT3, ядерный антиген вируса Эппггейна-Барр EBNA3C, белок Rev вируса иммунодефицита человека типа 1, онкобелок SET. Перечисление взаимодействия свидетельствуют о вероятном участии ПроТа в регуляции экспрессии генов, например, посредством структурной перестройки хроматина, модуляции активности транскрипционных факторов, а также возможного участия в процессе ядерно-цитоплазматического транспорта.

В процессе выполнения данной работы мы показали, что ПроТа гидролизуется каспазой-3 в апоптотических клетках и это приводит к инактивации его сигнала ядерной локализации. Кроме того, высокий уровень ПроТа защищает клетки человека от апоптоза. Программируемая клеточная смерть (апоптоз) является фундаментальным процессом, позволяющим многоклеточным организмам избавляться от избыточных и поврежденных (в том числе, раковых) клеток. Кроме того, мы обнаружили, что ПроТа за счет взаимодействия его центрального домена с ингибитором транскрипционного фактора Nr£2 принимает участие в ответе клеток на окислительный стресс, способствуя активации экспрессии защитных генов. Это свидетельствует о несомненной актуальности систематического структурно-функционального исследования ПроТа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов функционирования ядерного многофункционального белка млекопитающих Про'Га, определение взаимосвязи между струюурными элементами этого белка и его функциональными активностями.

Для достижения поставленной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Оптимизация эктопической экспрессии ПроТа человека в бактериальных клетках и в культуре клеток человека. Создание бактериальных и дрожжевых штаммов-продуцентов ПроТа человека, его производных и мутантов.

2. Разработка эффективных методов выделения ПроТа человека из бактериальных, дрожжевых и человеческих клеток. Исследование рекомбинангного белка: пост-

трансляционной модификации, биологической активности, антигенных и металл-связывающих свойств. .

3. Получение моноклональных антител к разным эпигопам ПроТа. Определение антигенной специфичности полученных антител. Разработка системы иммуноферментного анализа на основе этих антител.

4. Разработка системы селекции функционально значимых мутаций в ПроТа. Поиск функционально важных доменов этого белка. В связи с обнаружением предполагаемого двухчастного N1^, изучение ядерно-цитоплазматического транспорта ПроТа и его делеционных мутантов в клетках дрожжей и человека.

5. Разработка системы подавления экспрессии гена ПроТа в культуре клеток человека методом интерференции РНК.

6. Исследование фрагментации, внутриклеточной локализации и защитного действия ПроТа в апоптотических клетках.

7. Поиск молекулярных партнеров ПроТа с помошью дрожжевой двухгибридной системы. Исследование возможности и специфичности взаимодействия ПроТа с найденным белком Кеар!. Анализ биологической значимости этого взаимодействия.

8. Создание и экспериментальная проверка модели участия ПроТа в ответе клетки на окислительный стресс.

Научная новизна и практическая ценность работы. Обнаружена способность ПроТа человека, продуцируемого в клетках дрожжей ХзгссНаготусев сегеушае, ингибировать клеточное деление. На основе этого феномена разработана система селекции функционально значимых мутаций в ПроТа. С помощью таких мутаций идентифицирован двухчастный сигнал ядерной локализации (N1,5) в ПроТа.

Показано, что протимозин альфа является природным субстратом каспаз. Он гидролизуется каспазой-3 в апоптотических клетках человека в трех местах. Расщепление по мажорному сайту приводит к инактивации сигнала ядерной локализации ПроТа и изменению его субклеточной локализации: из ядерного белок становится ядерно-цитоплазматическим. Более того, протимозин альфа (или его фрагменты) экспонируются на поверхности апоптотических (но не нормальных) клеток. Суперпродукция протимозина альфа и ряда его мутантов с ядерной или ядерно-цигоплазматической локализацией в клетках НеЬа ингибирует активацию каспаз и защищает клетки от апоптоза.

Найден белок, взаимодействующий с протимозином альфа. Им оказался Кеар1, репрессор транскрипционного фактора №12, ответственного за индукцию генов клеточного ответа на окислительный стресс. Установлено, что Кеар! не заякорен в цитоплазме за счет взаимодействия с актиновыми элементами цитоскелета, как считалось ранее, а является белком-

челноком, постоянно мигрирующим между ядром и цитоплазмой. Предложена и подтверждена экспериментально модель участия ПроТа в регуляции ответа клетки на окислительный стресс, согласно которой ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса Nrf2-Keapl.

Показано, что суперэкспрессия протимозина альфа дикого типа (но не мутанта с нарушенной способностью взаимодействовать с Keapl) приводит к усилению экспрессии генов ответа на окислительный стресс, а снижение концентрации протимозина в клетке с помощью интерференции РНК - к ее подавлению.

Созданы бактериальные и дрожжевые штаммы-продуценты протимозина альфа человека и ряда его мутантов. Разработан эффективный метод выделения этого белка из бактериальных и дрожжевых клеток. Получены препараты высокоочшценного ПроТа, обладающие иммуностимулирующей активностью. Получены высокоспецифичные моноклональные антитела к двум разным эпитопам ПроТа, пригодные для иммуноблоттинга, иммунопреципитации, иммуноферментного и гистохимического анализа. Данные антитела переданы для дальнейших испытаний в МНИОИ им. П.А. Герцена, Институт рака университета Теннесси (США), Медицинский факультет университета Вандербилт (США), Национальный институт здоровья (США).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на двустороннем российско-французском симпозиуме по физико-химическим основам жизни (Конкарно, Франция, 1992), российско-американском симпозиуме «Геном человека» (С.-Петербург, 1992), втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на приглашенной лекции в Институте Молекулярной Генетики им. Макса Планка (Берлин, Германия, 1999), на 48-ой конференции Американского общества масс-спектрометрии (Лонг Бич, США, 2000), на научных семинарах Юго-западного университета штата Техас (Даллас, США, 2003), на III съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на Научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва 2004), на Ученом совете НИИФХБ им. АЛ.Белозерского МГУ (Москва, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных статей. Список публикаций приведен в конце автореферата. Работа выполнена в 1990-2005 годах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 263 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 9 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему: «Протимозин альфа. Методы, используемые для изучения механизмов его функционирования», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (311 ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТИМОЗИН АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА: ПРОДУКЦИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ, ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА

Для структурно-функциональных исследований ПроТа человека и его возможного применения в медицине, а также для получения высоко-специфичных антител к этому белку, необходимо иметь препаративные количества ПроТа человека. Наиболее надежным способом достижения этой цели было создание бактериального штамма-продуцента ПроТа человека и разработка эффективного метода выделения этого белка из бактериальных клеток. Следует подчеркнуть, что ПроТа - это достаточно маленький белок с весьма необычными свойствами (рис. 1), поэтому присоединение к нему какого-либо тэга, позволяющего выделить белок с помощью аффинной хроматографии, было нежелательно.

Т \У

Р V Е Е О

Ас-5РААУРТ5 5Е'° 1ТТКРЬКЕКК20ЕУУЕЕАЕЫОК3('РАРАКО Тимозин а1

в в

КАМЕ40ЕМаЕС}ЕАОНЕ5<,УРЕЕЕЕЕООЕ60ЕЕЕЕЕЕЕОРО70ЕЕЕР

в Е Я А

в Р Е Р Е Е80 АББАТСКЛ-А А90 ЕРРЕРРРУР Т100 К К <} Кт Р Е Р Р

Рис. 1. Первичная структура ПроТа человека. И-концевой 28-членный пептид, представляющий собой тимозин а1, подчеркнут. Мутации, полученные в данной работе, указаны над аминокислотной последовательностью ПроТа дикого типа. Два блока основных аминокислотных остатков в С-концевой части ПроТа, представляющих собой двухчастный N1.5, выделены.

1.1. Оптимизация продукции ПроТа человека в клетках сой

Для продукции ПроТа, идентичного нативному человеческому белку, и оптимизации эффективности его синтеза в бактериальных клетках, кДНК, соответствующая белок-кодирующей части ПроТа человека (ранее полученная А. Б. Вартапетяном), была встроена в вектор рЕТЗс (Novagen) под контроль промотора и участка связывания рибосом гена 10 бактериофага Т7. Затем фрагмент ДНК между последовательностью Шайн-Дальгарно и инициаторным кодоном ПроТа был делегирован разными способами так, что получался набор клонов, в которых расстояние между последовательностью Шайн-Дальгарно и инициаторным кодоном ПроТа варьировало от 0 до 16 нуклеотидных остатков (табл. 1). Полученными

плазмидами трансформировали клетки Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), содержащие в хромосоме ген РНК-полимеразы фага Т7, и анализировали количество продуцируемого ПроТа. Для этого был разработан простой и быстрый метод выделения ПроТа из клеток Е.соН, основанный на уникальной способности этого белка оставаться в водной фазе при фенольной экстракции вследствие его экстраординарной гидрофильности. Наибольшее количество ПроТа (20-30% от суммарного клеточного белка) синтезировалось с тех плазмид, в которых расстояние между последовательностью Шайн-Дальгарно и инициаторным кодоном ПроТа составило 6,9 или 10 нуклеотидных остатков (табл. 1). Одна из перечисленных плазмид (рНР12) была использована для дальнейшей работы.

Таблица 1. Зависимость эффективности синтеза ПроТа от структуры участка связывания рибосом.

Плазмида1 Участок связывания рибосом2 Расстояние между Относительная

ЙЭ и инициаторным эффективность

кодоном (нукл. ост) трансляции (%)

pHPOl AAGGAG ATATACATAGATCCCC ATO ТСА 16 <1

pUPOS AAGGAG АТАТАСАССС ATG ТСА... 10 100

рНР07 AAGGAG АТАТАСССС ATG ТСА... 9 50-100

рНР12 AAGGAG АТАТАС ATG ТСА... 6 100

рНРЮ AAGGAG АТ ATG ТСА... 2 2-4

pHPll AAGGAG ATG ТСА... 0 <1

'ПроТа выделяли из клеток, трансформированных соответствующей плазмидой, и анализировали электрофорезом в ПААГ.

последовательность Шайн-Дальгарно (5Э) и инициаторный кодон подчеркнуты.

и. Разработка метода выделения биологически активного рекомбинавтного ПроТа из бактериальных клеток

Для выделения из бактериальных клеток рекомбинантного ПроТа человека был разработан метод, основанный на уникальном свойстве этого белка оставаться в водной фазе при фенольной экстракции. Условия лизиса клеток и фенольной депротеинезации были подобраны так, что это позволило отделить ПроТа не только от остальных клеточных белков, но и от РНК и полисахаридов, загрязняющих препараты, полученные описанным ранее способом.

На первом этапе с помощью двух фенольных экстракций ПроТа отделяется от клеточных белков, ДНК и высокополимерных РНК (препарат содержит только прнмесь тРНК, сравните дорожки 2 и 1 на рис. 2а). На втором этапе при дополнительной фенольной экстракции в условиях повышенной ионной силы ПроТа перераспределяется в органическую (фенольную) фазу, в то время как примеси РНК (и полисахаридов) остаются в водной фазе (дорожки 3 и 4 на рис. 2а). Далее, ПроТа осаждается этанолом из фенольной фазы, растворяется в воде и экстрагируется н-буганолом для отделения связавшегося с ним додецилсульфата натрия (ДСН) из лизисного буфера. При этом получается электрофоретически чистый ПроТа человека, не содержащий примесей других белков (рис. 2 б) и нуклеиновых кислот (дорожка 3 на рис. 2а).

При необходимости дополнительной очистки от следовых количеств ДСН этот препарат фракционировали ионообменной хроматографией на ОЕАЕ-целлюлозе. Выход ПроТа при использовании данного метода оказался на 20-40% выше, чем при использовании метода, описанного ранее.

а

165.23s ГНК-ч

1

6

За РНК -»

тРНК-» ¡6 ' Про !«

ГЧ f^J О Оч О. "О (Л

-ПроТ'С*

6000

8000

10000

Tf ОО

J

12000 m/z

Рис. 2. Очистка рекомбинантногоПроТа. (а) 1, ПроТа выделенный по методике, описанной ранее. 2-4, выделение ПроТа по методике, разработанной в данной работе; препараты до (2) и после (3,4) стадии фенольной экстракции при высокой ионной силе (3 - фенольная фаза, 4 - водная фаза). Препараты из эквивалентного количества клеток были осаждены этанолом, растворены в воде и фракционированы электрофорезом в денатурирующем 8% полиакриламидном геле (ПААГ). Гель окрашивали метиленовым синим. Положения ПроТа и клеточных РНК указаны стрелками, (б) Очищенный ПроТа анализировали с помощью электрофореза в 17% ДСН-ПААГ и окрашивали красителем Кумасси R-250. Положение ПроТа указано стрелкой, (в) Определение молекулярной массы рекомбинантного ПроТа с помощью масс-спектрометрии (MALDI-MS). Приведены отношения массы к заряду (m/z) для одно- и двухзарядных ионов.

Известно, что ПроТа в клетках высших эукариот содержит на N-конце остаток ацетилсерина, который образуется пост-трансляционно путем отщепления N-концевого остатка метионина и ацетшшрования остатка ссрина. Как было показано методом масс-спектрометрии (MALD1-MS), выделенный из бактериальных клеток рекомбинантный ПроТа также не содержал N-концевого остатка метионина, и существенная часть этого белка была ацетилирована по N-концевому остатку серина Измеренные отношения массы к заряду двойного пика, соответствующего рекомбинантному ПроТа, хорошо совпадали с рассчитанными величинами для содержащего свободный N-концевой остаток серина ПроТа (m/z = 11943.7) и его ацетилированного по этому остатку производного (m/z = 11985.7). Измеренные m/z оказались равны 11944.4 и 11985.4 для однозарядного иона и 5972.6 и 5993.7 для двухзарядного иона (рис. 2 в). Аналогичные результаты были получены для N-концевых фрагментов ПроТа (1—99) и (1-69), например, в случае ПроТа (1-99), m/z =10754.4 и 10796.5 для однозарядного иона, m/z = 5377.7 и 5398.8 для двухзарядного иона. Разница примерно в 42 Дальтона соответствует

разнице молекулярных масс ацетамидной группы и аминогруппы. Подобного рода двойные пики на масс-спектрах не наблюдались для фрагментов ПроТа, не содержащих N-конца ПроТа. Таким образом, пост-трансляционная модификация N-конца ПроТа, характерная для эукариотических клеток, частично происходит и в клетках E.coli.

Полученный нами рекомбинантный ПроТа человека оказался активным в ряде иммунологических тестов, выполненных в лаборатории В.М.Абрамова (Институт иммунологии, г. Любучаны, Московская область). Он стимулировал индуцированную митогеном пролиферацию мышиных тимоцитов, усиливал адгезивные свойства и фагоцитарную активность макрофагов.

Итак, для суперпродукции ПроТа был использован экспрессионный вектор, содержащий самый сильный из промоторов, работающих в бактериальных клетках. Кроме того, трансляция соответствующей мРНК была усилена за счет расположения протяженной последовательности Шайн-Дальгарно на оптимальном расстоянии от инициаторного кодона. Таким образом был достигнут высокий уровень продукции биологически активного ПроТа. Преимущества данной конструкции были использованы для суперпродукции не только ПроТа дикого типа, но и ряда его мутантов, в частности, ПроТа D(99)N, с мутированным сайтом каспазного расщепления (см. раздел 3), ПроТа E(44,50)G, утратившего способность взаимодействовать с белком Keapl (см. раздел 4), укороченного ПроТа (1-99), имитирующего продукт каспазного гидролиза этого белка, а также составных белков npoTa(I-99)-EGFP-(His)e, использованного в качестве антигена для получения моноклональных антител, специфичных к N-концевому участку ПроТа, и npoTa-(His)6-TAT TP, содержащего трансдуцирующий пептид (TP) белка TAT вируса иммунодефицита человека HIV-1.

Для выделения первых трех мутантных белков оказалось возможным использовать основанную на фенольной экстракции методику, разработанную для ПроТа дикого типа. Четвертый, составной белок npoTa(l-99)-EGFP-(His)6 утерял свойство оставаться в водной фазе в процессе фенольной депротеинезации, поэтому для его выделения использовали аффинную хроматографию на Ni-NTA агарозе. Для очистки npoTa-(His)e-TAT TP оптимальной оказалась комбинация методов фенольной экстракции и аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Для продукции и выделения других делеционных мутантов ПроТа, содержащих гексагистидиновый и GST тэги, были использованы стандартные методы.

U. Получение ПроТа-специфичных моноклональных антител

Вследствие маленького размера и экстраординарной гидрофильное™ ПроТа, высокоспецифичные моноклональные антитела к этому белку до настоящей работы отсутствовали. Для их получения в качестве иммуногенов мы использовали полноразмерный

рекомбинантный ПроТа сам по себе, сшитый с помощью глутарового альдегида с бычьим сывороточным альбумином или с гемоцианином, а также продуцированный в клетках E.coli химерный ПроТа, содержащий на N-конце зеленый флуоресцирующий белок (EGFP) и гексагисгидиновый тэг. Из четырех перечисленных иммуногенов первые три оказались не эффективными. Высокий титр антител к ПроТа детектировали с помощью иммуноферментного анализа в сыворотке мышей, иммунизированных химерным белком EGFP-ПроТа. Из сплиноцитов такой мыши были получены гибридомы, которые тестировали на продукцию антител к ПроТа с помощью иммуноферментного анализа и далее характеризовали с помощью иммуноблотинга, используя различные фрагменты ПроТа, слитые с глутатион-8-трансферазой (GST) (табл. 2). Был получен ряд клонов, узнающих эпитопы внутри фрагмента ПроТа(32-89) и один из них, 4F4, был использован для дальнейшей работы.

Так как не было получено ни одного клона, продуцирующего антитела к N-концу ПроТа, был сконструирован альтернативный химерный белок для иммунизации, содержащий свободный N-концевой фрагмент ПроТа. Он состоял из фрагмента ПроТа(1-99), содержащего EGFP и гексагисгидиновый тэг на С-конце. Гибридомы, полученные и проанализированные по аналогичной схеме, продуцировали антитела, узнающие эпитопы внутри фрагмента ПроТа(1-31). Два клона (2F11 и 7D11) со слегка различной специфичностью (см. табл. 2) были отобраны для дальнейшей работы.

Таблица 2. Картирование эпитопов ПроТа, узнаваемых моноклональными антителами 4F4, 2F11 и 7D11.

Рекомбинантный Взаимодействие Рекомбинантный Взаимодействие Взаимодействие

белок с 4F4 белок с 2F11 с 7D11

GST-npoTa(l-109) + GFP-npoTa(l-109) + +

GST-ripoTa(l-31) - GFP-ripoTa(32-109) - -

GST-ripoTa(32-89) + GFP-ripoTa( 15-109) - +

GST-ripoTa(82—109) GFP-ПроТа Д( 14—81) _

GST-ripoTa(32-Sl) _ GFP-ПроТа Д(32-&1) + +

GST-IIpoTa(52-109) +

GST-IIpoTa(52-81) GST-IlpoTa( 1-31) + +

GST-ripoTa(52-89) +

Полученные моноклональные антитела оказались высокоспецифичны к ПроТа. Так, клоны 4Р4 и 2Р11 не взаимодействовали с паратимозином, ближайшим структурным аналогом ПроТа. Было показано, что данные антитела можно использовать для иммуноблотгинга, иммунопреципитации, иммуноферментного и гистохимического анализа.

U. Исследование металл-связывающих свойств протимоэина альфа

Результаты исследования связывания ПроТа с ионообменной смолой Chelex 100, заряженной ионами двухвалентных металлов Са2+, Mg2+, Ni2+, Со2+, Zn2+ и Cu2+, показали, что ПроТа специфично связывает ионы Zn2+ и неспецифично связывает ионы Си2+. Для определения параметров связывания ПроТа с ионами Zn2+ был применен метод равновесного диализа. Две буферные системы были выбраны дня этих экспериментов: с низкой ионной силой (20 мМ HEPES, рН 6.8) и с высокой ионной силой (20 мМ HEPES, рН 6.8, 100 мМ NaCl). В условиях низкой ионной силы ПроТа связывал ионы Zn2+очень эффективно (13 ионов Zn2+Ha молекулу ПроТа, Kd=40 мкМ), в условиях высокой ионной силы менее эффективно (три иона Zn2+Ha молекулу ПроТа, Кв=230мкМ). Итак, ПроТа содержит много мест связывания ионов Zn2+, которые могут различаться по аффинности.

В нашей лаборатории Н.В.Чичковой с сотр. изучалось взаимодействие ПроТа с белком Rev вируса иммунодефицита человека HIV-1 и было показано, что это взаимодействие стимулируют ионы Zn2+(50 мкМ) и Са2+(100 мкМ), но не Mg2+. Этот результат заставил нас исследовать связывание ПроТа с ионами Са2+ методом равновесного диализа. В условиях низкой ионной силы этим методом были выявлены Са2+-связывающие свойства ПроТа, которые были слабее его гп2+-связывающих свойств по нескольким критериям: числу связанных ионов (10 для Са2+ вместо 13 для Zn2+), величине Ко (примерно 135 мкм для Са2+ вместо 40 мкм для Zn2+), устойчивости к 100 мМ NaCl (связанным с ПроТа оставался один ион Са2+ вместо трех ионов Zn2+).

Итак, ПроТа является Zn2+- и Са2+-связывающим белком. Хотя наличие достаточно большого числа мест связывания затрудняет их характеристику, наиболее вероятно, что остатки дикарбоновых аминокислот вносят основной вклад во взаимодействие с ионами металлов. В молекуле ПроТа, помимо протяженного «кислого» домена, расположенного в центральной части молекулы (аминокислотные остатки 50-82, 80% дикарбоновых аминокислот), есть ряд дополнительных более коротких «кислых» участков (например, 24ЕЕАЕ27, "EDDEDDDVD99, 106DEDD109), вклад которых может объяснить наличие такого большого числа мест связывания ионов Zn2* и Са2+.

Имеет ли взаимодействие ПроТа с ионами Zn2+ и Са2+ значение для его биологической функции? Для ответа на этот вопрос, исследовали влияние вышеупомянутых ионов на взаимодействие ПроТа с некоторыми его белковыми партнерами. Оказалось, что ионы Zn2+ и Са2+ не влияют на взаимодействие ПроТа с гистоном HI, но стимулируют взаимодействие ПроТа с белком Keapl (ингибитором транскрипционного фактора Nrf2, см. раздел 4) и цитохромом с (важнейшим медиатором апоптоза, см. раздел 3.5).

Следовательно, механизм взаимодействия ПроТа с гистоном HI отличается от механизма его взаимодействия с белками Rev, Keapl и цитохром с. Известно, что за взаимодействие с гистоном HI ответственен центральный домен ПроТа. Взаимодействие очень кислого центрального домена ПроТа (более 80% дикарбоновых аминокислот) с обладающим сильными основными свойствами гистоном HI определяется, в основном, ионными взаимодействиями, и вследствие этого, мало специфично. В противоположность этому, связывание ПроТа с белком Keapl весьма специфично, так как разрушается вследствие точечных мутаций (см. раздел 4). Мы предполагаем, что влияние ионов двухвалентных металлов на связывание ПроТа с его белковыми партнерами свидетельствует о взаимодействиях более специфичных, чем исключительно ионные.

2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

Мы экспрессировали ген ПроТа человека также в клетках Saccharomyces cerevisiae. Дрожжевые клетки имеют ряд преимуществ перед бактериальными: продуцируемые в них эукариотические белки не содержат токсинов и подвергаются более адекватным посттрансляционным модификациям. Кроме того, имелись основания полагать, что в Saccharomyces cerevisiae существует структурный аналог ПроТа. Мы надеялись, что ПроТа человека, продуцируемый в клетках дрожжей, будет тем или иным образом интерферировать со своим дрожжевым аналогом, что позволит узнать больше о механизме функционирования этого белка.

2.1. Экспрессии гена ПроТа человека в клетках Saccharomyces cerevisiae.

кДНК ПроТа человека встраивали в дрожжевой экспрессионный вектор pYeDP 1/8-2 под контроль сильного индуцибелыюго GAL10-CYC1 промотора. В качестве альтернативных вариантов в тот же самый вектор была встроена кДНК ПроТа, слитая двумя различными способами с IRES элементом вируса энцефаломиокардита (ВЭМК), способным обеспечивать эффективную внутреннюю инициацию трансляции в клетках высших эукариот (рис. 3).

Плазмида pYeHTl:

pYe ЕМС-НТ3.4:

Экспрессионная кассета

Pgalio-cyci ТроТа

Pgalio-cyci IRES

Эффективность синтеза ПроТа 100%

«1 %

Ряс. 3. Эффективность экпрессии гена ПроТа человека в клетках Saccharomyces cerevisiae. Pgalio-cyci - составной дрожжевой промотор, IRES - сайг внутренней инициации трансляции ВЭМК.

При выращивании трансформированных полученными плазмидами клеток Saccharomyces cerevisiae в присутствии индуктора транскрипции галактозы, ПроТсс человека эффективно синтезировался только в присутствии плазмиды, не кодирующей IRES элемента, хотя уровень ПроТа-специфичных мРНК к клетках, трансформированных плазмидами с IRES-элементом и без него, был примерно одинаковым. Таким образом, было показано, что IRES элемент ВЭМК не функционирует в клетках Saccharomyces cerevisiae. Этот вывод удалось обосновать вследствие обнаруженной нами способности ПроТа служить чувствительным репортером в дрожжевых клетках. Действительно, он мог быть быстро и эффективно очищен от других белков дрожжевых клеток методом фенольной экстракции, аналогичным разработанному нами методу выделения этого белка из клеток E.coli. Чувствительность анализа многократно усиливалась посредством введения в очищенный препарат радиоактивной метки.

Эффективность продукции ПроТа человека в клетках Saccharomyces cerevisiae оказалась примерно на порядок ниже, чем в клетках E.co!i, поэтому для получения препаративных количеств этого белка мы в дальнейшем использовали клетки E.coli. Однако, как и ожидалось, поведение дрожжевых клеток, продуцирующих ПроТа человека, отличалось от поведения контрольных клеток, трансформированных пустым вектором. Продукция ПроТа человека блокировала деление дрожжевых клеток (рис. 4). Этот эффект был достаточно специфичным, так как деление клеток восстановилось посредством точечного или делеционного мутагенеза ПроТа. Так, продукция ПроТа Д(101-109) с делецией девяти С-концевых аминокислотных остатков не влияла на деление дрожжевых клеток. Такие мутации практически не меняли физико-химических свойств белка и его внутриклеточной концентрации. Феномен ингнбирования деления дрожжевых клеток в дальнейшем позволил нам создать эффективную систему скрининга мутаций, затрагивающих функционально значимые домены ПроТа.

2Л. Идентификация функционально значимых мутаций в ПроТа

Метод случайного мутагенеза часто позволяет идентифицировать функционально важные участки белков, если разработана удачная система скрининга мутаций, приводящих к инактивации данного белка. Нами была разработана система селекции /я vivo функционально значимых мутаций в ПроТа, основанная на способности ПроТа человека, продуцируемого в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ингибировать клеточное деление.

Селекцию функционально значимых мутантов ПроТа проводили следующим образом. В кДНК ПроТа вносили случайные мутации с помощью ПЦР в присутствии ионов Мп2+. Затем смесь мутантных кДНК встраивали в тот же самый дрожжевой экспрессионный вектор. При выращивании трансформированных клеток в присутствии индуктора транскрипции размножались и образовывали колонии только те клетки, в которых синтезировался ПроТа с

инактивированными мутациями функциями. Если мутации не затронули функционально важные домены ПроТа, то его продукция подавляла деление дрожжевых клеток, и они не образовывали колоний. Из клеток выросших колоний выделяли плазмидную ДНК и секвенировали. В части клонов кДНК ПроТа содержала несколько мутаций одновременно (табл. 3). В ряде случаев мутации удалось "разнести" по разным кДНК с помощью субклонирования.

Таблица 3. Полученные мутанты ПроТа

Плазмида Первичные мутанты N Мутанты, подвергнутые анализу

pYeMPl SIP, ИIV, K14W, K17E, A38V, E55G, 1 S1P, Il IV, K14W, K17E

D93G, K101R, K104E 2 K14E, E24G

3 E44G.E50G

pYeMP 2 K14E, E24G, E80G, E91G, E94G, K101E 4 T105A

5 SIT

pYeMP 3 E44G, E50G, T105A 6 K87E

pYeMP 4 SIT, N39D, K87E 7 E80G

pYeMP 22 E80G, K101R 8 K101R

Левая колонка: первичные мутанты ПроТа, полученные в результате скрининга в клетках дрожжей. Правая колонка: мутанты ПроТа с одной или несколькими аминокислотными заменами, полученные с помощью субклонирования из первичных мутантов.-

Каждой плазмидой, содержащей кДНК ПроТа с одной (или несколькими) мутациями, снова трансформировали клетки S. cerevisiae и изучали кривые роста этих клеток. В то время как в отсутствие индуктора транскрипции все клоны росли одинаково хорошо (не показано), параметры роста клеток в присутствии галактозы сильно различались (рис. 4). При этом уровень продукции разных мутантов ПроТа в индуцированных клетках, по данным гель-электрофореза, оказался примерно одинаковым.

Эта система позволила обнаружить ряд функционально значимых участков в ПроТа, а также получить набор весьма полезных точечных мутаций, инактивирующих этот белок. Оказалось, что в аминокислотной последовательности ПроТа можно выделить ряд доменов (см. рис. 1). Все мутации, которые попали в N-концевой фрагмент, соответствующий тимозину al, (S(l)P, S(1)T, I(11)V, K(14)W, K(17)E, E(24)G) никак не влияли на способность ПроТа подавлять рост дрожжевых клеток. Эффект мутаций в С-концевой области К(87)Е и Т(105)А оказался максимальным, мутации E(80)G и K(101)R снимали ингибирующий эффект частично. Изучение этих мутантов привело к идентификации двухчастного NLS в ПроТа (см. раздел 2.3). Двойная мутация в центральном районе ПроТа E(44,50)G также частично снимала ингибирование. Роль этой мутации удалось прояснить в опытах по изучению взаимодействия ПроТа с одним из его молекулярных партнеров (см. раздел 4).

время роста (часы)

Рис. 4. Кривые роста дрожжевых клеток, продуцирующих соответствующие мутанты ПроТа человека.

23. Обнаружение двухчастного 1ЧЬв в ПроТа

На основе анализа первичной структуры С-концевого домена ПроТа и идентификации инактивирующих этот белок мутаций возникло предположение, что два блока основных аминокислот (КЯ88 и КК<ЗК1<М) в ПроТа могут составлять так называемый двухчастный сигнал ядерной локализации (ЫЬБ). Чтобы проверить эту гипотезу, в клетках дрожжей продуцировали химерные белки, состоящие из зеленого флуоресцирующего белка (СИР) и ПроТа дикого типа или его мутантов по упомянутым выше основным аминокислотным остаткам, и изучали внутриклеточную локализацию химерных белков с помощью флуоресцентной микроскопии. Оказалось, что каждая из мутаций - К.87Е или К101Я, приводит к изменению внутриклеточной локализации ПроТа - из ядерного он становится ядсрно-цитоплазматическим, т.е. теряет способность активно транспортироваться в ядро. Таким же образом меняет свою внутриклеточную локализацию вРР-ПроТа А(101-109), в котором делегированы девять С-концевых аминокислотных остатков ПроТа, содержащих второй блок основных аминокислот

кксгк104

Учитывая, что дрожжи являются гетерологичной системой для ПроТа человека, те же самые опыты повторили в гомологичной системе — в клетках человека. С этой целью химерные белки продуцировали в клетках эмбриональной почки человека НЕК293, и полностью воспроизвели результаты, полученные в клетках дрожжей. Таким образом, блоки основных аминокислот К1188 и КК<ЗК104 необходимы для ядерной локализации ПроТа. Чтобы проверить тот факт, что наличие этих блоков достаточно для ядерной локализации белка, в клетках НЕК293 продуцировали химерный белок вГР-ПроТа (82-109), содержащий короткий фрагмент ПроТа, в состав которого входят оба блока, КЯ88 и ККС2К104. Химерный белок

16

оказался полностью ядерным. На основании полученных данных (табл. 4) был сделан вывод о том, что N1^ ПроТа локализован на участке с 82 по 109 аминокислотный остаток и состоит из двух частей.

Таблица 4. Анализ ЫЬБ протимозина а

ПроТа Подавление роста Внутриклеточная

дрожжевых клеток1 локализация2

Дикий тип + Ядерная

К(87)Е - Ядерно-цитоплазматическая

К(101)Я +/- Ядерно-цитоплазматическая

Т(105)А - Ядерная

Д(101-109) - Ядерно-цитоплазматическая

N1.5(82-109) но Ядерная

'Знаки (+) и (-) — способность/неспособность ПроТа человека ингибировать рост дрожжевых клеток; (но - не определена).

2В правой колонке указана локализация в клетках НЕК293 соответствующего белка, присоединенного к С-концу ОКР.

Таким образом, снятие ингибирующего воздействия ПроТа человека на деление дрожжевых клеток, видимо, объясняется тем, что процесс, ответственный за ингибирование, происходит в ядре, а мутации К.87Е и К101Я в С-концевом домене ПроТа инактивируют его N1,8, и белок перераспределяется из ядра в цитоплазму. Однако этот механизм верен не для всех С-концевых мутаций. Так, ПроТа с мутацией Т105А остается в ядре, но перестает влиять на деление дрожжевых клеток. Следовательно, был обнаружен еще один функционально значимый участок в ПроТа, функция которого до сих пор не ясна.

3. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА В АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

Основными исполнителями программируемой клеточной смерти (апоптоза) служат каспазы - цистеиновые протеиназы, которые активируются при апоптозе и расщепляют достаточно ограниченный набор ключевых белков клетки (1-3%) в специфических участках после остатков аспарагиновой кислоты. ПроТа - чрезвычайно кислый белок, содержащий 19 остатков аспарагиновой кислоты, причем на его С-конце расположено несколько аминокислотных мотивов БххО (см. рис. 1) - консенсусных сайтов узнавания каспазами второй группы, в которую входят основные исполнительные каспазы клетки. Кроме того, ПроТа - это ключевой белок, необходимый для деления клетки. Таким образом, ПроТа мог рассматриваться как возможный кандидат на роль природного каспазного субстрата.

3.1. Фрагментация ПроТа в апоптотических клетках.

С целью проверки, не является ли ПроТа природным каспазным субстратом, была проанализирована целостность ПроТа в клетках HeLa, в которых апоптоз индуцировали самыми разными способами: обработкой цисплатнном, ставроспорином, фактором некроза опухолей (ФИО) в сочетании с эметином, а также с помощью УФ-облучения и абортивной полиовирусной инфекции. Для идентификации продуктов каспазного гидролиза ПроТа был разработан метод быстрого выделения ПроТа и его фрагментов из клеток HeLa, основанный на способности этого белка перераспределяться в водную фазу при фенольной экстракции.

Оказалось, что в апоптотических (но не в нормальных клетках) появляется более короткий фрагмент ПроТа, электрофоретическая подвижность которого близка подвижности маркерного белка ПроТа (1-100), а количество примерно пропорционально доле апоптотических клеток (рис. 5а). Процент апоптотических клеток в препарате оценивали по таким характерным морфологическим признакам, как конденсация хроматина, фрагментация ядер и блеббинг цитоплазматической мембраны.

Фрагментация ПроТа была заметна уже через 2 ч после индукции апоптоза, т.е. она происходит на ранней стадии программируемой клеточной смерти. С помощью масс-спектрометрического анализа (MALDI-MS) укороченного белка и его триптических пептидов было показано, что ПроТа расщепляется после остатка D99 в аминокислотной последовательности DDVD99 (рис. ба).

3.2. Расщепление ПроТа каспазами-З и -7 in vitro

Участок расщепления ПроТа в апоптотических клетках (DDVD") соответствует принятой консенсусной последовательности DxxD сайтов узнавания каспазами второй группы, в которую входят каспазы-3 и -7. Который именно фермент отвечает за описанный выше гидролиз, определяли, обрабатывая рекомбинангный ПроТа каждой из этих каспаз. Оказалось, что каспаза-7 расщепляет ПроТа в одном месте — после D99. Каспазный ингибитор широкого профиля zVAD-lmk (фторметилкетон карбобензокси-валил-аланил-аспарагиновой кислоты) предотвращал это расщепление. Аналогичный эффект оказывала мутация D(99)N в рекомбинантном белке (рис. 5 6).

В то же время продуктов гидролиза ПроТа каспазой-3 оказалось несколько. При усилении жесткости обработки каспазой-3 на полиакриламидном геле последовательно выявлялись три полосы: а, Ь и с (рис. 5 в), которые, по данным масс-спекгрометрии, соответствовали фрагментам (1-99), (7-99) и (32-99) ПроТа. Прединкубация каспазы-3 с ее специфическим ингибитором zDEVD-fmk предотвращала образование всех трех продуктов гидролиза, что свидетельствует об их специфичности. Полученные данные согласуются с присутствием в молекуле ПроТа трех участков гидролиза каспазой-3: одного главного - после DDVDW, и двух минорных - после AAVD6 и NGRD31.

18

апоптоз (%) <5 90 50 >90 60 90

■ ПроТа

б

zVAD-fmk каспаза-7

+

+ +

ПроТа дикий тип D(99)N

апоптотические клетки

„EGFP-ПроТа (1-109) I- EGFP-ПроТа (1 -99)

■*— EGFP-ПроТа (1-31)

— EGF'P-llpoTa (1-6)

Рис. 5. Фрагментация ПроТа и его мутантов каспазами in vivo и in vitro, а - Расщепление ПроТа в апоптотических клетках HeLa. ПроТа выделен из контрольных клеток (HeLa) и клеток, в которых апоптоз индуцировали различными стимулами (указаны сверху). В двух правых дорожках в качестве маркеров нанесены рекомбинантные ПроТа и его фрагмент (1-100). Количество апоптотических клеток (%) в каждой клеточной культуре указан снизу. б - Гидролиз рекомбинантного ПроТа (1—3) и его мутанта D(99)N (4, 5) каспазой-7 in vitro. Обработку каспазой-7 проводили в присутствии каспазного ингибитора zVAD-fmk (3) или без него (2, 5). в - Гидролиз рекомбинантного ПроТа (/) увеличивающимися концентрациями каспазы-3 (2—5) in vitro. Полосы а, Ь и с соответствуют продуктам расщепления ПроТа каспазой-3. а—в - 8%-ные денатурирующие полиакриламидные гели, окрашенные метиленовым синим, г — Фрагментация EGFP-ПроТа и его мутантов в апоптотических клетках HeLa. Лизаты клеток HeLa, продуцирующих ПроТа дикого типа или его точечные мутанты D(6)N, D(31)N и D(99)N, присоединенные к С-концу EGFP, не обработанные (/) или обработанные ФИО и эметином (2-5), фракционировали в 12%-ном денатурирующем полиакриламидном геле и анализировали посредством иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к EGFP. Полоса, возможно соответствующая продукту гидролиза ПроТа после D69, отмечена звездочкой.

а

5000

ЭООО

m/z

Рис. 6. Идентификация продуктов каспазного гидролиза ПроТа методом масс-спекгрометрии (MALDI-MS). а. Фрагмент ПроТа, выделенный из апоптотических клеток HeLa. б. Анализ временной зависимости гидролиза ПроТа каспазой-3 in vitro (1.5 мкг субстрата, 0.15 мкг фермента, объем реакционной смеси б мкл).

Чтобы удостовериться в правильности этого заключения и проверить возможность потери каких-то фрагментов ПроТа в процессе очистки, смесь продуктов гидролиза этого белка каспазой-3 без предварительной очистки в геле анализировали методом масс-спектрометрии (рис. 6 б). Оказалось, что уже через 3 мин после добавления каспазы вследствие расщепления пеггтидной связи после аминокислотных остатков D99 и D69 образуются фрагменты (1-99) и

(1-69). При дальнейшей инкубации наблюдался гидролиз ПроТа после D6 и D31, и через 3 ч накапливались фрагменты (1-99), (7-99) и (32-99). Интересно, что фрагмент (1-69) можно было наблюдать только на начальной стадии гидролиза, затем он практически исчезал из реакционной смеси. Этот факт можно объяснить тем, что фрагменты (1-99), (7-99) и (32-99), в отличие от полноразмерного ПроТа, расщепляются после D69 с весьма низкой эффективностью, а фрагмент (1-69), напротив, эффективно расщепляется каспазой-3 после DS1.

3 J. Участки каспазного гидролиза ПроТа in vivo

Единственный продукт каспазного гидролиза ПроТа, который удавалось выделить из алоптотических клеток - это фрагмент (1-99). Более короткие фрагменты (7-99) и (32-99), накапливающиеся при обработке ПроТа каспазой-3 in vitro, в алоптотических клетках не обнаружены. Это может объясняться двумя причинами: либо более короткие фрагменты ПроТа представляют собой нестабильные интермедиаты, которые подвергаются дальнейшей деградации in vivo, либо расщепление ПроТа каспазой-3 после D6 и D31 - это артефакт системы in vitro.

Которая из двух причин имеет место, т.е. происходит ли расщепление ПроТа в алоптотических клетках после D6 и DV? Чтобы ответить на этот вопрос, был поставлен следующий опыт. Исходили из того, что если из клеток человека не удается выделить фрагменты каспазного гидролиза ПроТа (7-99) и (32-99) вследствие их вероятной нестабильности, то можно попробовать выявить дополняющие их фрагменты (1-6) и (1-31). Такую возможность обеспечило присоединение репортерного белка EGFP к N-концу ПроТа.

В клетках HeLa продуцировали химерный белок EGFP-ПроТа и индуцировали в них апоптоз обработкой ФИО и эметином. Фрагментацию химерного белка анализировали посредством иммуноблотинга с помощью антител к EGFP. Оказалось, что в алоптотических (но не нормальных) клетках образуется характерный набор фрагментов ПроТа, слитых с EGFP (рис. 5 г). Логично было предположить, что эти полосы соответствуют ожидаемым фрагментам химерного белка EGFP-ПроТа (1-6), (1-31) и (1-99). Правильность этого предположения проверяли, заменяя в каждом из предполагаемых участков расщепления каспазой-3 остаток аспарагиновой кислоты на остаток аспарагина (мутации D6N, D3 IN и D99N). Как видно из рис. 5 г, каждая из мутаций привела к исчезновению соответствующей полосы из набора продуктов гидролиза химерного белка. Таким образом доказано, что в алоптотических клетках in vivo каспазы расщепляют ПроТа после D6 и D3'. Следует отметить, что среди продуктов гидролиза EGFP-ПроТа, кроме трех перечисленных полос, наблюдалась еще одна слабая полоса, похожая по электрофоретической подвижности на фрагмент EGFP-ПроТа (1-69). Это говорит о том, что расщепление ПроТа после D69, возможно, происходит и in vivo.

Вклад каспазы-3 в фрагментацию ПроТа in vivo оценили, проведя аналогичные опыты на клетках MCF-7 рака молочной железы человека, в которых активность каспазы-3 отсутствует. Оказалось, что фрагментации химерного белка EGFP-ПроТа при обработке клеток MCF-7 ФИО и эметином не происходит, несмотря на то, что такая обработка индуцирует процессинг прокаспазы-7. Когда же в клетках MCF-7 продуцировали интактную прокаспазу-3, то в апоптотических клетках снова появлялся характерный набор продуктов гидролиза EGFP-ПроТа. Мутирование остатков D6, D31 и D99 приводило к исчезновению соответствующих полос.

Из приведенных опытов следует вывод о том, что за фрагментацию ПроТа в апоптотических клетках in vivo ответственна, в основном, каспаза-3.

3.4. Изменение внутриклеточной локализации ПроТа в апоптотических клетках

В апоптотических клетках гидролиз ПроТа происходит прежде всего по главному участку DDVD59, расположенному в спейсерном районе двухчастного NLS. В результате этой реакции белок теряет десять С-концевых аминокислотных остатков, содержащих блок KKQK104, необходимый для его накопления в ядре. Таким образом, следствием каспазного расщепления ПроТа должно быть перераспределение этого белка из клеточного ядра в цитоплазму.

Для проверки этой гипотезы изучали внутриклеточную локализацию укороченного белка ПроТа (1-99), моделирующего продукт каспазного гидролиза ПроТа по главному участку. С этой целью в клетках HeLa продуцировали химерный белок EGFP-npoTa(l-99) и анализировали его внутриклеточную локализацию с помощью флуоресцентной микроскопии. Как и следовало ожидать, EGFP-npoTa(l-99) потерял способность накапливаться в ядре и был равномерно распределен между ядром и цитоплазмой, в то время как EGFP-ПроТа дикого типа находился только в ядре (рис. 7а).

Перераспределение эндогенного ПроТа из ядра в цитоплазму в апоптотических клетках было доказано с использованием высокоспецифичных моноклональных антител к этому белку, полученных нами ранее (раздел 1.2). Апоптоз индуцировали в клетках Нер2 обработкой ФИО и эметином для предотвращения синтеза ПроТа de novo. С помощью флуоресцентной микроскопии фиксированных пермеабилизованных клеток показано, что в нормальных клетках ПроТа находится исключительно в ядре (рис. 76), за исключением митотической клетки (показана стрелкой). В апоптотических клетках происходило "перетекание" этого белка в цитоплазму, заметное уже через 2 ч после индукции апоптоза. Следовательно, каспазный гидролиз ПроТа в апоптотических клетках коррелирует с перераспределением этого белка из ядра в цитоплазму.

а 1К»ПЧ1роТ« CGFP-IJpoTa(l-99>

^ Псрмеабнлмтованныс клетки ß Некермсаиилнаованиие клетки нормальные апоптоггнчсскнс нормальные апоптотнческнс

Рис. 7. Изменение внутриклеточной локализации ПроТа при апоптозе. а — Субклеточная локализация ПроТа и его фрагмента (1-99), соединенных с EGFP. Клетки HeLa трансфицировали экспрессионными плазмидами и изучали с использованием флуоресцентной микроскопии, б, в — Изменение внутриклеточной локализации эндогенного ПроТа в клетках Нер2, обработанных ФИО и эметином. Клетки фиксировали 4%-ным формальдегидом и затем либо пермеабилизовали 0.2%-ным Тритоном Х-100 (б) для изучения внутриклеточной локализации ПроТа, либо не пермеабилизовали («) для выявления эпитопов ПроТа на клеточной поверхности. Верхний ряд: клетки окрашены красителем Hoechst 33342. Нижний ряд: те же самые поля, окрашенные моноклональными антителами 2F11 к ПроТа и вторичными антителами, коньюгированными с СуЗ. Стрелка указывает на митотическую клетку.

Ранее в ряде работ обсуждался вопрос о внеклеточной функции ПроТа-специфичных пептидов, хотя данные о путях их образования и секреции отсутствовали. Поэтому, чтобы выяснить роль фрагментации ПроТа каспазами и его "вытекания" из ядра при апоптозе в гипотетической эксгернализации этого белка, с помощью моноклональных антител и флуоресцентной микроскопии изучали появление эпитопов эндогенного ПроТа на поверхности нормальных и апоптотических клеток. При этом наблюдали интенсивное окрашивание поверхности апоптотических (но не нормальных) непермеабилизованных клеток Нер2 и HeLa (рис. 7в). Появление на поверхности апоптотических клеток эпитопов ПроТа было белок-специфичным, так как антитела к контрольным эндогенным белкам глицеральдегид-З'-фосфат-

дегидрогеназе и р-актину, а также к эктопически продуцируемым цитоплазматическим белкам Ев ИР и Кеар1 (1-139), с поверхностью апоптотических клеток не взаимодействовали. На основании этих опытов можно предполагать существование специфических механизмов транспорта ПроТа на поверхность апоптотических клеток.

Возникает вопрос, какое биологическое значение могут иметь каспазная фрагментация ПроТа и его экспонирование на поверхности апоптотических клеток? В организме апоптотические клетки опознаются и быстро поглощаются макрофагами. Учитывая данные об иммуностимулирующей активности ПроТа и его пептидов и их способность активировать макрофаги, мы предполагаем, что экспонирование какого-то фрагмента ПроТа или его комплекса с другими белками на поверхности апоптотической клетки служит сигналом для ее узнавания и поглощения макрофагами.

3.5. Суперпродукция ПроТа и его мутантов защищает клетки от аноптоза

Фрагментация ПроТа при апопгозе может означать, что инактивация этого белка необходима для реализации апоптотической программы клетки, т.е. ПроТа может обладать анти апоптотической активностью. Для проверки этого предположения требовалось проанализировать, каким образом суперпродукция ПроТа и его мутантов с разной субклеточной локализацией влияет на апоптоз в клетках человека

— тРНК

— ГЪоТа

— ПроТа(1-99)

Рис. 8. Эктопическая продукция ПроТа дикого типа (3) и его мутантов (1-99) (4), К87Е (5) и Р99М (6) в клетках НеЬа. (1) - не трансфицированные клетки, (2) — клетки, трансфицированные вектором. Частично очищенные препараты ПроТа фракционировали электрофорезом в 8% ПААГ и окрашивали метиленовым синим.

Суперпродукции ПроТа и его мутантов в человеческих клетках была достигнута с помощью улучшения контекста инициаторного кодона путем превращения Т в А в позиции +4 и использования вектора рсОЫА4/Ш$МахА (Ьмйт^еп), содержащего сильный цитомегаловирусный промотор и энхансер трансляции. Все дополнительные транслируемые последовательности вектора, содержащие тэги и линкерные участки, были удалены, при этом продуцировался ПроТа, идентичный нативному белку. Клетки трансфицировали полученными плазмидами, ответственными за продукцию ПроТа дикого типа и его мутантов Б(99)М, устойчивого к С-концевому каспазному расщеплению; К(87)Е, с частично инактивированным N1^; и ПроТа (1-99), имитирующего основной продукт каспазного гидролиза. Два первых

1 2 3 4 5 6

белка были исключительно ядерными, остальные - ядерно-цитоплазматическими. Уровень продукции всех эктопических белков примерно в 10 раз превышал уровень эндогенного ПроТа (рис. 8).

Чувствительность трансфицированных клеток к апоптозу, индуцированному ФНО и эметином, оценивали по двум критериям: по активации клеточных каспаз, измеряемой степенью окрашивания клеток флуоресцентно меченым ингибитором каспаз FITC-VAD-fmk (FITC - флуоресцеинизотиоцианагг), и по конденсации хроматина, визуализированной с помощью специфичного к ДНК красителя Hoechst 33342. С использованием проточной цитометрии контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором, через 0, 3 и б ч после индукции апоптоза показано последовательное возрастание каспазной активности. Оказалось, что эктопическая продукция ПроТа дикого типа и его мутантов приводит к значительному снижению степени активации каспаз в апоптотических клетках. Этот эффект ярче всего проявлялся через 6 ч (рис. 9 а-д). Так, основная субпопуляция клеток, представленная пиком с высокой флуоресценцией (интервал МЗ), переставала доминировать в трансфицированных клетках, продуцирующих ПроТа дикого типа и его мутанты. Уменьшение этого пика коррелировало с возрастанием пика с низкой флуоресценцией (интервал М2), соответствующего более низкой степени активации каспаз.

Такой же эффект наблюдали и при использовании другого независимого метода -анализа прокрашенных красителем Hoechst 33342 клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Через 6 ч после индукции апоптоза оценивали долю апоптотических клеток по содержанию клеток с конденсированным хроматином. Оказалось, что эктопическая экспрессия ПроТа и его мутантов значительно снижает долю клеток с конденсированным хроматином в индуцированных ФНО и эметином клетках HeLa (рис, 9 е).

Наблюдаемые в рассмотренных выше опытах антиалоптотические свойства ПроТа хорошо согласуются с данными группы Ш. Ванга, указывающими на то, что этот белок негативно регулирует активацию каспаз путем ингибирования образования апоптосомы. Апоптосома - это сложный шгто плазматический комплекс, в состав которого входят семь субъединиц белка Apaf-1 (Apoptotic protease-activating factor 1), связанных с важнейшим медиатором апоптоза - цитохромом с. Под действием апоптотических стимулов цитохром с мигрирует из митохондрий в цитоплазму и вместе с dATP индуцирует образование апоптосомы. Апоптосома связывает инициаторную прокаспазу-9 и индуцирует ее активацию; активная каспаза-9 запускает протеазный каскад, активируя исполнительные каспазы клетки.

Рис. 9. ПроТа защищает клетки от апоптоза. Клетки HeLa, еуперпродуцирующие ПроТа дикого типа, укороченный ПроТа (1-99) и мутанты D(99)N и К(87)Е, а также контрольные клетки, трансфицированные пустым вектором, обработаны ФНО и эметином, а-д - Активация каспаз через 3 ч (сплошная линия) и 6 ч (пунктир) после индукции апоптоза. Клетки обрабатывали FITC-VAD-fmk и анализировали посредством проточной цитометрии (FL1 -флуоресценция FITC). Нормальными считали клетки из интервала флуоресценции М1, в который попадало 90% неиндуцированных клеток (точечная линия соответствует контрольным клеткам, необработанным ФНО и эметином). Границу между флуоресценцией клеток с низкой и высокой степенью активации каспаз М2/МЗ устанавливали так, чтобы разделить два перекрывающихся пика из 6 ч образцов. В каждом случае анализировали не менее 104 клеток. е - Конденсация хроматина в клетках HeLa, котрансфицированных теми же плазмидами, что и в а-д, и pEGFP-Cl (Clontech). Через 6 ч после индукции апоптоза клетки окрашивали Hoechst 33342 и определяли с помощью флуоресцентной микроскопии содержание EGFP-положительных клеток с конденсированным хроматином. Приведены средние значения из четырех независимых трансфекций.

Однако возникало противоречие: ПроТа - это ядерный белок, а апоптосома образуется в цитоплазме клетки. Наши данные о каспазном расщеплении ПроТа и перераспределении укороченного белка в цитоплазму снимают такое противоречие. В связи с этим особенно интересен неожиданный результат - мутанты ПроТа, утратившие способность накапливаться в ядре, проявляют не менее (а может быть даже более) сильные антиапопготические свойства,

чем белок дикого типа (рис. 9). Одно из возможных объяснений такого факта состоит в том, что мутанты ПроТа, локализованные в цитоплазме, более эффективно ингибируют образование апоптосомы. Механизм этого явления неизвестен. Однако, недавно мы показали, что ПроТа (1-99), имитирующий главный продукт каспазного расщепления этого белка, способен взаимодействовать с цитохромом с in vitro. Взаимодействие цитохрома с, мигрировавшего из митохондрий в цитоплазму, с укороченным ПроТа, вытекшим из ядра в цитоплазму, может быть одним из механизмов, с помощью которого ПроТа ингибирует образование апоптосомы и защищает клетки от апоптоза.

4. РОЛЬ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА В ЗАЩИТЕ КЛЕТОК ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Один из немногих общих подходов к изучению механизмов функционирования белков состоит в обнаружении их "молекулярных партнеров" с помощью дрожжевой двухгибридной системы. Идентификация новых белков, взаимодействующих с изучаемым белком, может пролить свет на его совершенно новую функцию.

4.1. Поиск молекулярных партнеров ПроТа с помощью дрожжевой двухгибридной системы

Дрожжевая двухгибрндная система основана на том, что большинство эукариотических активаторов транскрипции состоит из двух автономных доменов: ДНК-связывающего (DB) и активирующего (AD). Суть метода состоит в следующем. Если мы хотим тестировать взаимодействие двух белков X и Y, то нужно продуцировать в дрожжевых клетках с соответствующих плазмид два химерных белка: белок X, соединенный с ДНК-связывающим белком (DB-X, «наживка»), и белок Y, соединенный с активирующим транскрипцию доменом (AD-Y, «добыча»). Каждый из этих составных белков по отдельности не способен активировать транскрипцию репортерного гена, в предпромоторной области которого расположен участок связывания данного ДНК-связывающего белка (UAS). Поэтому, если белки X и Y не взаимодействуют, то репортерный ген не экспрессируется. При взаимодействии же белков X и Y образуется работоспособный активатор транскрипции и активируется экспрессия репортерного гена.

В этой системе можно проводить поиск новых белков Yi, которые способны связываться с интересующим нас белком X. Для этого AD должен быть соединен с библиотекой белков SYi, а в качестве репортера следует использовать ген, с помощью которого можно осуществлять позитивную селекцию. Выживать и образовывать колонии должны только те клетки, в которых экспрессируются Yi, взаимодействующие с белком X.

Гай!

ГарП

пю

и

1 1ас2 I

иЛБ

илз

Дрожжевая двухгибридная система использована для поиска белков человека, взаимодействующих с ПроТа. С этой целью проведен скрининг клонотек кДНК головного и костного мозга человека, встроенных в полилинкер дрожжевого экспрессионного вектора вслед за нуклеотидной последовательностью, кодирующей активирующий домен дрожжевого активатора транскрипции (5в14 (ЛВсн). В качестве "наживки" использовали полноразмерный ПроТа, соединенный с бактериальным ДНК-связывающим белком ЬехА. Клетки 5. сегеутае, в которых репортерные гены 1ас2, ШЯЗ и ЦЯЛЗ находятся под контролем ЬехА-связывающих последовательностей, а хромосомные гены Я/53 и С/ЯАЗ инактивированы, котрансформировали плазмидами, кодирующими "наживку" ЬехА-ПроТа и клонотеку белков АРсам-ЕУ; . Клетки отбирали по способности расти в отсутствие гистидина и урацила, а дополнительный скрининг выросших клонов проводили с помощью анализа р-галактозидазной активности. Скрининг примерно 107 трансформантов позволил отобрать четыре позитивных клона. Выделенные из них библиотечные плазмиды кодировали потенциальных кандидатов на роль взаимодействующих с ПроТа белков, так как при повторной трансформации в дрожжевые клетки были способны активировать транскрипцию репортерных генов только в присутствии плазмиды, кодирующей ЬехА- ПроТа, но не ЬехА сам по себе, или ЬехА, соединенный с рядом контрольных белков. Оказалось, что все четыре выделенные из них плазмиды клонотеки кодируют С-концевые фрагменты белка Кеар1 (К1АА0132) - ингибитора фактора транскрипции №0, роль которого состоит в активации генов ответа клетки на окислительный стресс. После этого амплифицировали кДНК Кеар1 и с помощью двухгибридной системы показали, что и полноразмерный Кеар1 эффективно связывается с ПроТа.

4.2. Идентификация участков ПроТа и Кеяр1, ответственных за взаимодействие

Участок ПроТа, отвечающий за связывание Кеар1, определяли с помощью серии делеционных мутантов ПроТа и анализа их способности взаимодействывать с Кеар1 в двухгибридной системе (рис. 10 а). Оказалось, что короткий фрагмент из центральной части ПроТа (аминокислотные остатки 32—52) необходим и достаточен для этого взаимодействия.

Интересно, что из коллекции функционально значимых мутантов ПроТа, получение которых описано в разделе 2.2, один мутант, Е(44, 50)0 содержал двойную мутацию именно в этом фрагменте. Эта двойная мутация приводила к исчезновению взаимодействия ПроТа-Кеар1 по критериям двухгибридной системы, что свидетельствовало о специфичности взаимодействия и дало возможность иметь хороший контроль в последующих опытах.

взаимодействие С1 с Кеар 1

ПроТсс > ^ +.

Л(6-31)ПроТа сь ........... 1 +

(1-52)ПроТа | — +

(53-109) ПроТа (32-52)ПроТа (1-31) ПроТа с ПроТаЕ(44, Б0)С I

б

тт

Взаимодействие с ПроТа

Keapl ,......lBTBra;l_h i г з i« 'ТП^ +

Кеар1 (50-624) ^1атв^>ог1 ИИ*»>4'»>в1 + Keapl (308-624) I < I а »I * »I et +

Ю4

303

Keapl (1-303)

GG(1)Keapl ' Д,

GG(1-3)Keap1 J,

GG(3-6)Keap1 j/*4 '"L -

GG(1-5)Keap1 J1'1

GG(2-6)Keap1 »Ji*l$|4'g|'L

Рис.10. Анализ взаимодействия Keapl и ПроТа в дрожжевой двухгибридной системе.

а. Идентификация участка ПроТа, взаимодействующего с Keapl (закрашен черным). + и -, уровень ß-галакгозидазной активности более 300 и менее 10 единиц, соответственно.

б. Интакгный Kelch домен Keapl, состоящий из шести диглициновых повторов (GG), необходим для связывания ПроТа. GG повторы пронумерованы с 1 по 6. BTB/POZ, BTB/POZ домен Keapl.

Участок Keapl, который взаимодействует с ПроТа, определяли с помощью набора делеционных мутантов Keapl и изучения их взаимодействия с ПроТа в дрожжевой двухгибридной системе (рис. 10 б). Оказалась, что для взаимодействия необходима вся С-концевая половина белка Keapl (аминокислотные остатки 304—624), содержащая шесть так называемых Kelch-повторов (диглициновых повторов), образующих третичную структуру, называемую p-пропеллером. Деления хотя бы одного из Kelch-повторов разрушала это взаимодействие, что предполагает необходимость интактной структуры p-пропеллера для взаимодействия с ПроТа.

Таким образом, в дрожжевой двухгибридной системе удалось найти белок Keapl, взаимодействующий с ПроТа, а также идентифицировать участки белков, ответственные за это взаимодействие. Полученные данные позволяют говорить о специфичности найденного взаимодействия, но требуют подтверждения с помощью других независимых методов. Для применения альтернативных методов исследования белок-белковых взаимодействий нам понадобились антитела, специфичные к Keapl.

43. Получение моноклональных антител, специфичных к Keapl

Для получения антител к Keapl в качестве иммуногенов использовали продуцированные в клетках E.coli рекомбинантный N-концевой фрагмент Keapl (аминокислотные остатки 1-139), а также С-концевой фрагмент Keapl (аминокислотные остатки 308-624), содержащие на N-конце гексагистидиновый тэг (His)«. Для получения поликлональных антител иммунизировали кроликов, а для получения моноклональных антител - мышей. Высокий титр антител к Keapl детектировали с помошью иммуноферментного анализа в сыворотках животных, иммунизированных обоими химерными белками.

Из сплиноцитов иммунизированных мышей были получены гибридомы, которые тестировали на продукцию антител к Keapl с помощью иммуноферментного анализа и далее характеризовали с помощью иммуноблотинга, используя (His)6-Keapl(l-139) и фрагмент Keapl(308-624), слитый с глутатион-8-трансферазой (GST-Keapl(308-624)). Был получен ряд клонов, узнающих эпитопы внутри фрагмента Кеар1(1-139) и один из них, 2Е4, был использован для дальнейшей работы. Было показано, что данные антитела можно использовать для иммуноблотгинга, иммунопреципитации и гистохимического анализа. Кроме того, был получен ряд клонов, узнающих эпитопы внутри фрагмента Keapl(308-624), и один из них, 2Н5, был использован для дальнейшей работы. Было показано, что данные антитела можно использовать для иммунопреципитации и гистохимического анализа, но они не работают в иммуноблотгинге, так как не узнают денатурированный Keapl.

Поликлокальные антитела выделяли из сывороток иммунизированных кроликов с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных рекомбинантных белках (His)6-Keapl(l-139) и GST-Keap 1(308-624).

4.4. Взаимодействие ПроТа-Кеар1 in vitro

Идентификация взаимодействующего белка в дрожжевой двухгибридной системе делает его лишь возможным кандидатом на роль молекулярного партнера интересующего нас белка Для доказательства партнерства необходим еще ряд тестов: проверка взаимодействия белков в гомологичной клеточной системе с использованием их коиммунопрещшитации из клеточных лизатов, проверка взаимодействия очищенных белков in vitro, а самое главное - поиск свидетельств биологической значимости этого взаимодействия.

Чтобы выяснить, может ли ПроТа взаимодействовать с Keapl в клетках человека, лизаты клеток HeLa и HepG2, в которых экспрессировали эктопический Keapl, обрабатывали моноклональными антителами к ПроТа, образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбировали на А-белок сефарозу и анализировали с помощью иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела к Keapl. Оказалось, что эктопический Keapl ко-преципитирует с эндогенным ПроТа (Рис. 11а). Аналогичный опыт продемонстрировал, что эндогенный Keapl также ко-преципитирует с ПроТа, причем это было показано в двух клеточных линиях с использованием двух типов поликлональных антител к Keapl (к его N- и С-концевым частям). Следовательно, взаимодействие ПроТа и Keapl может происходить в гомологичной клеточной системе.

Подтверждали правильность этого заключения и проверяли специфичность взаимодействия в опытах по связыванию эндогенного Keapl из лизатов клеток HeLa и HepG2, которые проводили с рекомбинангным ПроТа и его мутантом E(44,S0)G, иммобилизованными на BrCN-акгивированной сефарозе. Оказалось, что эндогенный Keapl хорошо связывался с ПроТа дикого типа, в то время как его связывание с мутантом оказалось незначительным (рис. 116). Это подтвердило данные о специфичности взаимодействия ПроТа-Кеар1, полученные с помощью двухгибридной системы.

Изучение связывания очищенных рекомбинантных белков in vitro дает возможность определить, взаимодействуют ли они непосредственно или через "мостик", представляющий собой "посторонний" компонент из клеточного лизата С этой целью Keapl, полученный в виде составного белка с zz-доменом (z - это IgG-связывающий домен А-белка стафилококка), иммобилизовали на IgG-сефарозе. Для удобства количественного измерения связывания к N-концу ПроТа присоединяли короткий пептид, содержащий участок узнавания протеинкиназой А, что позволило пометить этот белок 32Р. Оказалось, что меченый ПроТа дикого типа хорошо связывается с иммобилизованным zz-Keapl, но практически не связывается с

иммобилизованным гг-доменом. Опыт по конкурентному связыванию меченого и холодного рекомбинантного ПроТа без присоединенных дополнительных пептидов показал, что это связывание специфично к аминокислотной последовательности ПроТа. Более того, мутант Е(44,50)0 потерял способность взаимодействовать с Кеар! (рис. 11 в).

а

Иммунопрсцмигтация

Г

О

I

а «3

а-

а

1 2 J Ьлот: анти-Кеар!

0

о*

1

sr

в

с С

анти-Кеар! (308-624) анти-Кеар1 (1-139)

в

80

70

(2 60 8.

С 50

¿г40

130 I 20

l ПроТа днюго типа ГТП ПроТа E(44,«tf)G

♦Zn**

♦Ms2*

Ряс. 11. Keapl взаимодействует с ПроТа в лизатах клеток человека (а, б) и in vitro (в), а — Коиммунопреципитация эктопически продуцируемого Keapl с ПроТа в лизатах клеток HeLa. Преципитацию проводили с помощью моноклональных антител к ПроТа 2F11 (]) или контрольных IgG мыши (2). 3 — суммарный клеточный лизат. Keapl выявляли иммуноблотингом, используя поликлональные антитела к Keapl. б - Связывание эндогенного Keapl из лизатов клеток HeLa с иммобилизованным на сефарозе ПроТа дикого типа (2) и его мутанта E(44,50)G (5). I — Связывание с контрольной ссфарозой без ПроТа. Keapl выявляли иммуноблотингом, используя поликлональные антитела к С- и N-концевым фрагментам Keapl. в — Взаимодействие рекомбинантных ПроТа и Keapl in vitro. zz-Keapl или zz (где z - это IgG-связывающий домен белка А стафилококка), иммобилизованные на IgG-сефарозе, инкубировали с меченным 32Р ПроТа (белые столбики) или его мутантом E(44,50)G (заштрихованные столбики) в присутствии указанных ионов металлов (100 мкМ). После отмывания несвязавшегося [32Р]ПроТа измеряли радиоактивность каждого образца сефарозы.

Ранее мы установили, что ПроТа - это Zn2+- и Са2+-, но не Mg2+- связывающий белок, поэтому оценивали влияние двухвалентных катионов на связывание с Keapl. Оказалось, что в присутствии 100 мкМ Zn2+ или Са2+ (но не Mg2+) связывание ПроТа с Keapl значительно усиливается (рис. 11 в). В присутствии Mg2* ПроТа связывается с Keapl так же, как и в отсутствие двухвалентных катионов.

Таким образом, ПроТа прямо и специфично взаимодействует с Keapl. Двухвалентные катионы, связывающиеся с ПроТа, значительно усиливают это взаимодействие.

4.5. Модель регулирования клеточного ответа на окислительный стресс

Остановимся более подробно на данных о функционировании системы №(2-Кеар1. В клетках животных защита от окислительного стресса и действия электрофнльньгх соединений

осуществляется путем активации генов, кодирующих ферменты детоксикации и антиоксиданты, например, глутатион-5-трансферазу, КАО(Р)Н-хинококсиредуктазу-1, у-глугамилцистеин-синтетазу, гемоксигеназу-1 (НО-1). Координированная индукция этих генов обеспечивается связыванием транскрипционного фактора Nrf2 (в виде гетеродимера с малыми Maf-белками) с регуляторным участком ДНК, называемым ARE (antioxidant response element). Nr£2 регулирует как базальную, так и индуцированную транскрипцию ARE-зависимых генов.

Регуляция транскрипции осуществляется в результате взаимодействия Nrf2 с его ингибитором Keapl. Keapl локализован в цитоплазме клетки, там же, где в отсутствие окислительного стресса находится и Nrf2. Так как Keapl оказался гомологом актин-связывающего белка Kelch дрозофилы, предполагали, чгго в отсутствие окислительного стресса его ингибирующее действие связано с закреплением Nrß в цитоплазме в результате одновременного взаимодействия с Nrf2 и с октановыми элементами цитоскелета Показано также, что взаимодействие с Keapl способствует убиквитинилированию Nr£2 и его последующей протеасомной деградации.

При индукции окислительного стресса Nr£2 переходит из цтоплазмы в ядро, где связывается с ДНК. При этом происходит диссоциация его комплекса с Keapl. Согласно # существовавшей до настоящего времени модели, после диссоциации этого комплекса в цитоплазме Nrf2 поступает в ядро, связывается с ДНК и активирует транскрипцию ARE-зависимых генов.

4.6. Как ПроТа может встретиться с Keapl в клетке?

Результаты опытов in vivo и in vitro свидетельствуют о том, что с высокой вероятностью Keapl — истинный молекулярный партнер ПроТа. Однако существовало одно серьезное препятствие для такого вывода - ПроТа и Keapl локализованы в различных компартментах клетки. ПроТа - это ядерный белок, тогда как Keapl находится в цитоплазме и исключен из ядра Такая локализация Keapl согласуется с приписываемой ему ролью якоря, который удерживает транскрипционный фактор Nrf2 в неактивном состоянии в цитоплазме.

Keapl может быть молекулярным партнером ПроТа в том случае, если он иногда бывает в ядре, т.е. если он функционирует как "белок-челнок", мигрирующий между ядром и цитоплазмой. Такие челночные белки обычно содержат NLS и NES (сигнал экспорта из ядра). Если NES сильнее, чем NLS, то локализация такого белка кажется цитоплазматической, так как большую часть времени он проводит в цитоплазме. Но если подавить экспорт из ядра, то белок начинает накапливаться в клеточном ядре. Чтобы проверить, не происходит ли этого с Keapl, определили локализацию Keapl в клетках HeLa и HepG2 до и после их обработки лептомицином В (LMB), специфическим ингибитором экспорта из ядра белков, содержащих лейцин-богатый NES. С этой целью с помощью флуоресцентной микроскопии изучали

внутриклеточную локализацию составного белка EGFP-Keapl, используя внутреннюю флуоресценцию EGFP, а также локализацию эктопического и эндогенного Keapl с помощью полученных ранее моноклональных антител к этому белку (см. раздел 4.3). В отсутствие LMB как эндогенный, так и эктопические Keapl и EGFP-Keapl находятся в основном в цитоплазме. При добавлении LMB все три белка в значительной степени перераспределялись из цитоплазмы в ядро (рис. 12).

Эти данные свидетельствуют о том, что Keapl — это белок-челнок, мигрирующий между ядром и цитоплазмой и, вероятно, содержащий NLS и лейцин-богатый NES. Такое поведение Keapl подтверждает гипотезу о том, что этот белок - молекулярный партнер ПроТа. Кроме того, это позволяет предположить существование альтернативного механизма работы системы Nrf2-Keapl, основанного на том, что Keapl в комплексе с Nrf2 постоянно мигрирует между ядром и цитоплазмой, а при окислительном стрессе в клеточном ядре комплекс разрушается, что приводит к активации Nrf2 и запуску ARE-зависимой транскрипции.

Рис. 12. LMB индуцирует транслокацию в ядра клеток HeLa как эктопически продуцируемых Keapl (а) и EGFP-Keapl (б), так и эндогенного Keapl (в). Приведены флуоресцентные микрофотографии, полученные с помощью конфокальной микроскопии. Клетки верхнего ряда (а и в) окрашены специфичными к Keapl моноклональными антителами 2Н5 и коньюгированными с FITC вторыми антителами, б - Флуоресценция EGFP. Нижний ряд: те же самые поля, окрашенные Hoechst 33342.

Предложенная челночная модель имеет ряд преимуществ перед принятой в настоящее время моделью заякоривания комплекса Nrf2-Keapl в цитоплазме. Во-первых, мигрирующий между ядром и цитоплазмой комплекс Nrf2-Keapl чувствителен к окислительному стрессу в обоих компартментах клетки. Во-вторых, периодическое появление Nrf2 в ядре (даже в комплексе с Keapl) объясняет базальный уровень транскрипции ARE-зависимых генов в отсутствие окислительного стресса. И, наконец, челночное перемещение Keapl обеспечивает

механизм терминации индуцированной экспрессии генов защиты клетки от окислительного стресса путем связывания и выведения из ядра Ь!г(2 после окончания действия агента, вызвавшего стресс.

4.7. ПроТа конкурирует с КгО за связывание с Кеар1

Мы показали, что ПроТа взаимодействует с той же самой частью Кеар1, что и №£2 - с С-концевой половиной белка, содержащей шесть Ке1сЬ-повторов, образующих структуру р-пропеллера. Логично предположить, что ПроТа и №С могут конкурировать друг с другом за связывание с Кеар1. Чтобы проверить эту гипотезу, изучали диссоциацию комплекса, который образуется в результате связывания [эгР] ПроТа с иммобилизованным на ^О-сефарозе гг-Кеар1 при добавлении рекомбинантного №£2. Оказалось, что добавление №(2 приводит к эффективной диссоциации ПроТа из комплекса с Кеар1 (рис. 13а). В отсутствие Ыг£2 диссоциация этого комплекса проходила значительно медленнее.

время, мин

6 Связанный

со смолой Диссоциированный

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 13. ПроТа конкурирует с Nrf2 за взаимодействие с Keapl in vitro, а — Комплекс рекомбинантного zz-Keapl с [32Р]ПроТа, иммобилизованный на IgO-сефарозе, инкубировали с рекомбинантным NrC (прерывистая линия) или буферным раствором (сплошная линия). Через указанные промежутки времени измеряли радиоактивность сефарозы. б - Комплекс рекомбинантного zz-Keapl с Nrf2, иммобилизованный на IgG-сефарозе, инкубировали 1 ч с рекомбинантным ПроТа (2, 5), его мутантом Е(44,50)0 (5, б), а также с буферным раствором (7, 4). Количество Nrf2, оставшегося связанным с сефарозой (7-3) и диссоциированного {4-6), определяли иммуноблотингом с помощью поликлональных антител к Nrf2. 7 — Маркер Nr£2.

В другом опыте диссоциацию комплекса №Е с иммобилизованным на ^С-сефарозе тг-Кеар1 проводили в присутствии избытка рекомбинантного ПроТа. Количество элюированного и связанного со смолой №Е определяли с помощью иммуноблотинга со специфичными к №£2 антителами. Оказалось, что №£2 диссоциирует из комплекса с Кеар1 при добавлении ПроТа дикого типа, но не его мутанта Е(44, 50)0 (рис. 13 6). При этом следует отметить, что, несмотря на большой молярный избыток, ПроТа способен вытеснить №£2 только частично.

4.8. ПроТа влияет на №£2-зависимую генную экспрессию

Приведенные выше опыты проясняют возможный механизм участия ПроТа в функционировании системы №£2-Кеар1. Мы предполагаем, что < ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса МгЕ2-Кеар1. Показано, что ПроТа и №£2 могут конкурировать друг с другом за связывание с Кеар 1. Более того, ПроТа вытесняет №£2 из комплекса с Кеар1, но для этого необходим его большой избыток. Известно, что концентрация ПроТа в клеточном ядре на несколько порядков выше, чем концентрация регуляторных белков Ыг£2 и Кеар1. В соответствии с предложенной нами моделью, ограниченная диссоциация оказавшегося в клеточном ядре комплекса №£2-Кеар1 избытком ПроТа ответственна за базальный уровень АЯЕ-зависимой транскрипции. Индукция окислительного стресса приводит к дестабилизации комплекса №£2-Кеар1. Вопрос о том, каков молекулярный механизм ослабления взаимодействия №£2-Кеар1 при окислительном стрессе, не вполне ясен. Ряд авторов считает, что за это отвечает фосфорилирование №£2, в других работах эту роль приписывают модификации цисгеиновых остатков Кеар1. В любом случае, согласно нашей модели, окислительный стресс усиливает диссоциацию комплекса ПроТа, увеличивает концентрацию свободного N112, способного связяться с ДНК, и усиливает экспрессию АКБ-зависимых генов.

Приведенная модель позволила сделать предсказания, которые могли быть подвергнуты экспериментальной проверке. В частности, изменение внутриклеточной концентрации ПроТа должно приводить к аналогичному изменению уровня экспрессии АКБ-зависимых генов. С целью проверки данного предсказания для повышения внутриклеточной концентрации ПроТа использовали эктопическую экспрессию ПроТа в клетках НеЬа, а для ее снижения -интерференцию РНК. АКБ-зависимым репортером служил ген эндогенной НО-1, экспрессия которого, как известно, регулируется №£2.

, В первом случае суммарную РНК из клеток НеЬа, суперпродуцирующих ПроТа дикого типа или мутант Е(44,50)С, или трансфицированных вектором (контрольные клетки), анализировали с помощью блот-гибридизации РНК, используя зонды, специфичные к генам НО-1 и р-актина. Суперпродукция ПроТа приводила к параллельному возрастанию уровня

36

мРНК НО-1 как в нормальных клетках, так и в клетках, обработанных индуктором окислительного стресса диэтилмалеатом (рис. 14). На уровень контрольной мРНК р-актина суперпродукция ПроТа не влияла. Существенно, что мутантный ПроТа Е(44, 50)0, который потерял способность связываться с Кеар1 и вытеснять №12 из комплекса №£2-Кеар1, также не влиял на экспрессию гена//<9-7.

а

. я

5

й I

1 5

5 гГ

е %

ё S

»—тРНК »—ПроТа

► НО-1 мРНК • actin мРНК

б

il I 4

i*

2

a ь

a

1

с

"г ?

ч

с

,1 2 3,,4 5 6,

- Диэтилмалсаг + Диэтилмалсат

- Диэтилмалсат + Диэтилмалсат

Рис. 14. Суперпродукция ПроТа усиливает транскрипцию гена НО-1.

а. Клетки НеЬа, трансфицированные пустым вектором (/, 4), суперпродуцирующие ПроТа (2, 5) или его мутант МПроТа Е(44,50)0 (3, б), анализировали методом блот-гибридизации РНК, используя зонды, специфичные к мРНК НО-1 (№Г2-зависимая транскрипция) и р-актина (МгП-нсзависимая транскрипция). Количества мРНК НО-1 в каждом образце нормировали на количество мРНК р-актина. (1-3) — Нормальные клетки; (4-6) - клетки, обработанные 100 мкМ диэтилмалеатом в течение 22 ч. б. Средние значения и стандартные отклонения рассчитаны на основании четырех независимых трансфекций

Итак, в согласии с предложенной моделью, суперпродукция ПроТа стимулировала транскрипцию Nrf2-зависимого гена, причем этот эффект, судя по опыту с мутантным ПроТа, опосредован взаимодействием ПроТа с Keapl. В целях дальнейшей проверки предложенной модели использовали подход, дополняющий опыты по суперпродукции ПроТа, основанный на снижении его клеточного уровня посредством интерференции РНК.

Суть метода интерференции РНК состоит в селективной деградации мРНК гена-мишени при введении в клетку коротких двухцепочечных РНК, нуклеотидная последовательность которых идентична фрагменту гена-мишени. Такие РНК, называемые короткими интерферирующими РНК (siRNA, short interfering RNA), можно получить химическим синтезом и ввести в клетку или экспрессировать с соответствующей плазмиды шпилечную РНК-предшественник, при процессинге которой клеточными нуклеазами образуется соответствующая siRNA.

а

-, ваш

IН1 промотор | I

6

плазмида —Ч^р5иРЕЯ-ПроТа(90-110)

5'-<ЗАТСССС I 1ч-мер "I Исаадада Ьнти 19-меЗ | 111 ЮвААА-З'

ЗМЭООЕД™ 1^-мер] аадЦс^с* Г 19-мер IАААААССТТТТССА-5'

Г™1

транскрипция I |

т-гг

предшеетвенни »¡¡кпд ^¡¡{^ д

б 19-ыср- бЧЗАСАСеССССиССиААССС-З'

; ШНА РгоТо 1кВа

асКп

сазразе-З Мгюпв Ж

мРНК ПроТа мРНК актина мРНК НО-1

си

г* Й'Ч £.0,8 (2 0.6 о со

<

с 0.4 Г71

¥ 0.2

«

Щ 0.2

Рис. 15. Снижение уровня экспрессии гена ПроТа в клетке методом интерференции РНК. а. Схема получения 8|1ША; б. Последовательность-мишень (19-мер), использованная в данной работе, в. Снижение внутриклеточной концентрации ПроТа с помощью интерференции РНК. Клетки НеЬа, трансфицированные плазмидой, кодирующей пустой вектор (1), или 5¡ЯМА (2), анализировали на содержание ПроТа (верхняя панель). Параллельно анализировали уровень четырех контрольных белков в клеточных лизатах с помощью иммуноблотинга с антителами к 1кВа, р-актину, каспазе-3 и гистону Н1. г. ПроТа - специфичная интерференция РНК приводит к подавлению экспрессии гена НО-1. Клетки НеЬа трансфицировали плазмидой, кодирующей пустой вектор (1), или 5ПУЧА (2), анализировали методом блот-гибридизации РНК с зондами, специфичными к мРНК ПроТа, НО-1 и р-актина. д. Приведены вычисленные по результатам четырех независимых трансфекций средние значения количества мРНК ПроТа и НО-1, нормированные на количество мРНК р-актина.

Генетический "нокдаун" ПроТа был осуществлен с помощью экспрессионной плазмиды, направляющей образование 81КЫА, специфичных к участку (90-110) мРНК ПроТа (рис. 15 а, б). Трансфекция клеток НеЬа этой плазмидой приводила к существенному снижению внутриклеточной концентрации ПроТа, что показано электрофоретическим анализом частично очищенных препаратов ПроТа (рис. 15 в, верхняя панель) и подтверждено иммуноферментным анализом клеточных лизатов с использованием моноклональных антител к двум разным

эпитопам ПроТа. При этом внутриклеточная концентрация ряда других эндогенных белков не менялась, что свидетельствует о специфичности наблюдаемого эффекта (рис. 15 в).

Как показано с помощью блот-гибридизации РНК, экспрессия ПроТа-специфичной бИША также приводит к заметному снижению уровня мРНК ПроТа (по сравнению с клетками, трансфицированными вектором), но не влияет на уровень мРНК р-актина. Чтобы определить, как сказывается снижение уровня ПроТа в клетке на Мг<2^-зависимой экспрессии генов, тот же самый РНК-блот гибридизовали с зондом, специфичным к гену НО-1. Оказалось, что в клетках, экспрессирукяцих ПроТа-специфичную 51!ША, снижается уровень мРНК НО-1 (рис. 15 г, д).

Рис.16. Модель участия ПроТа в ответе клетки на окислительный стресс. ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса Мг£2-Кеар1, который постоянно мигрирует между ядром и цитоплазмой. Ограниченная диссоциация оказавшегося в клеточном ядре комплекса №£2-Кеар1 избытком ПроТа ответственна за базальный уровень АЯЕ-зависимой транскрипции. При окислительном стрессе происходит дестабилизация этого комплекса, усиление его диссоциации ПроТа, увеличение концентрации свободного №£2, способного связаться с ДНК, и возрастание экспрессии АЯБ-зависимых генов.

Таким образом, с помощью суперпродукции ПроТа и интерференции РНК мы показали, что №£2-зависимая экспрессия генов коррелирует с внутриклеточным уровнем ПроТа. Т. е. предсказания, сделанные на основании новой модели функционирования системы ЫгО-Кеар1, выдержали экспериментальную проверку. Это подтверждает правильность предложенной модели (рис. 16) и позволяет сделать вывод о новой функции ПроТа - участии в защите клеток от окислительного стресса.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу выразить глубокую благодарность моим коллегам, которые принимали участие в данной работе.

Эту работу инициировал А.Б.Вартапетян, и без его постоянной идеологической и практической поддержки она вряд ли могла бы состояться. Систему изучения взаимодействия рекомбинантных белков in vitro разработала Н.В.Чичкова. На разных этапах основная тяжесть эксперимента легла на плечи дипломников и аспирантов нашей лаборатории А.Белецкого, Н.Павлова, Т.Фатеевой, И.Абаевой, К.Логинова, МКасаикиной, особенно велик вклад Ю.Рубцова и Р.Карапетяна.

Иммунологическое тестирование рекомбинантного ПроТа было проведено в лаборатории В.М.Абрамова (Институт иммунологии, г. Любучаны, Московская область). Масс-спектрометрические исследования были проведены совместно с Маркусом Калкумом (MaxPlanck Institute of Molecular Genetics, Берлин, Германия). Ведущую роль в получении моноклональных антител сыграла Е.А.Сухачева (ИБХ РАН).

В лаборатории В.И.Агола мы получили бесценный опыт работы с клетками млекопитающих и исследования апоптоза; часть экспериментов по апоптозу была проведена совместно с Г.А.Беловым (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова, РАМН), а опыты с использованием метода проточной цитометрии были проведены Г.А.Беловым в лаборатории Р.Петерсона (Стокгольмское отделение Людвиговского института рака, Швеция).

Работа по изучению взаимодействия ПроТа с цитохромом с была проведена совместно с сотрудниками В.П.Скулачева.

Также не могу не выразить искреннюю признательность И.Н.Шатскому, моему первому учителю в области молекулярной биологии, научившему меня работать экспериментально, и А.А.Богданову, создавшему в нашем отделе творческую атмосферу, в которой всегда хотелось заниматься наукой.

ВЫВОДЫ

1. Созданы системы эффективной экспрессии ПроТа человека, его точечных и делеционных мутантов, а также содержащих ПроТа составных белков, в клетках бактерий, дрожжей и культуре клеток человека Разработаны методы выделения и очистки этих белков. Получены препараты высокоочшценного ПроТа, обладающие иммуностимулирующей активностью. Получены высокоспецифичные моноклональные антитела к двум разным эпитопам ПроТа, пригодные для иммуноблотинга, иммунопреципитации, иммуноферментного и гистохимического анализа Показано, что ПроТа является Zn2+ и Са2+-связывающим белком.

2. Обнаружено, что продукция ПроТа человека в клетках ЯассИаготусез сегеУ111ае приводит к ингибированию клеточного деления. На основе этого феномена создана система селекции функционально значимых мутаций в протимозиие альфа, ряд таких мутаций идентифицирован и охарактеризован. С их помощью показано, что сигнал ядерной локализации ПроТа состоит из двух блоков положительно заряженных аминокислот КЕ83 и КК<2К1М, разделенных спейсером.

3. Показано, что протимозин альфа является природным субстратом каспаз. Он гидролизуется в апоптотических клетках человека в трех местах: мажорное расщепление происходит после остатка О99 в аминокислотной последовательности ООУО99, а два минорных - после последовательностей АА\Т>6 и К01Ш31. За это ответственна, в основном, каспаза-3.

4. Расщепление каспазой-3 по мажорному сайту после остатка О99 приводит к инактивации сигнала ядерной локализации ПроТа и изменению его субклеточной локализации: из ядерного белок становится ядерно-цитоплазматическим. Кроме того, ПроТа (или его фрагменты) экспонируются на поверхности апоптотических (но не нормальных) клеток.

5. Суперпродукция протимозина альфа и ряда его мутантов с ядерной или ядерно-цитоплазматической локализацией в клетках НеЬа ингибирует активацию каспаз и защищает клетки от апоптоза.

6. Обнаружен белок, взаимодействующий с протимозином альфа. Им оказался Кеар1, репрессор транскрипционного фактора МЖ, ответственного за индукцию генов клеточного ответа на окислительный стресс. ПроТа взаимодействует с Кеар1 прямо и специфично. Избыток ПроТа способен вытеснять №С из комплекса с Кеар1.

7. Показано, что Кеар! не заякорен в цитоплазме благодаря взаимодействию с актиновыми элементами цитоскелета, как считали ранее, а является белком-челноком, постоянно мигрирующим между ядром и цитоплазмой. В связи с этим предложена модель участия ПроТа в регуляции ответа клетки на окислительный стресс, согласно которой ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса №12-Кеар!. При окислительном стрессе происходит дестабилизация комплекса, усиление его диссоциации протимозином а, увеличение концентрации свободного способного связаться с ДНК, и возрастание экспрессии АКБ-зависимых генов.

• 8. Суперэкспрессия протимозина альфа дикого типа (но не мутанта с нарушенной способностью взаимодействовать с Кеар1) приводит к усилению, а снижение концентрации протимозина в клетке с помощью интерференции РНК - к подавлению экспрессии гена гемоксигеназы-1. Эти данные подтверждают предложенную модель ответа клетки на окислительный стресс.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1 Borovjagin А.V., Evstafieva A.G., Ugarova T.Yu., Shatsky I.N. A factor that specifically binds to the 5'-untranslatcd region of encephalomyocarditis virus RNA. // FEBS Lett., 1990, v. 261, p .237-240.

2. Evstafieva A.G., Ugarova T.Y., Chernov B.K., and Shatsky I.N. A complex RNA sequence determines the internal initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation. //Nucl. Acids Res., 1991, v. 19, p. 665-671.

3. Vartapetian A.B., Chichkova N.V., Lyakhov I.G., Makarova T.N., Evstafieva A.G.,

Bogdanov A.A. Segments of Escherichia coli genome similar to the exons of human prothymosin alpha gene. //FEBS Lett., 1992, v.313, p. 95-97.

4. Evstafieva AG, Beletsky AV, Borovjagin AV, Bogdanov AA. Internal ribosome entry site of

encephalomyocarditis virus RNA is unable to direct translation in Saccharomyces cerevisiae. // FEBS Lett, 1993, v. 335, p. 273-276.

5. Barteneva N.S., Evstafieva A.G., Gorelov V.N., Wenzel B.E. Identification and sequencing of a

plasmid (pYV96)-encoded gene product of Yersinia enterocolitica recognized by antibodies in sera of patients with autoimmune thyroid disease. //Ann. NY Acad. Sei., 1994, v.730, p.345-347.

6. Pavlov N.A., Evstafieva A.G., Rubtsov Y.P., and Vartapetian A.B. Human prothymosin alpha

inhibits division of yeast Saccharomyces cerevisiae cells, while its mutant lacking nuclear localization signal does not.// FEBS Lett, 1995, v. 366, p. 43-45.

8. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B., Vasilenko A. V., Abramov V.M., and Bogdanov A.A. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha.// Eur. J. Biochem., 1995, v. 231, p. 639-643.

8. Rubtsov Y.P., Zolotukhin A.S., Vorobjev I.A., Chichkova N.V., Pavlov N.A., Karger E.M., Evstafieva A.G., Felber B.K., and Vartapetian A.B. Mutational analysis of human prothymosin alpha reveals a bipartite nuclear localization signal. //FEBS Lett., 1997, v. 413, p. 135-141.

9. Rossi F, Evstafieva A.G., Pedrali-Noy G, Gallina A, Milanesi G. HsN3 proteasomal subunit as a target for human immunodeficiency virus type 1 Nef protein. //Virology, 1997, v. 237, p. 3345.

10. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.l., Vartapetian A.B. Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. // FEBS Lett, 2000, v. 467, p. 150-154.

11. Chichkova, N.V., Evstafieva, A.G., Lyakhov, I.G., Tsvetkov, A.S., Smirnova, T.A., Karapetian, R.N., Karger, E.M., and Vartapetian, A.B. Divalent metal cation binding properties of human prothymosin aM Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, p. 4745-4752.

12. Belov G.A., Evstafieva A.G., Rubtsov Y.P., Mikitas O.V., Vartapetian A.B., Agol V.l. Early alteration of nucleocytoplasmic traffic induced by some RNA viruses. // Virology, 2000, v. 275, p. 244-248.

13. Бабкина О.В., Евстафьева А.Г., Чичкова Н.В., Вартапетян А.Б., Мюллер С., Баскунов В.Б., Петраускене О.В., Кочетков С.Н., Громова Е.С. Рекомбинантные компоненты системы рестрикции-модификации EcoRII. Способность эндонуклеазы рестрикции взаимодействовать с ДНК-РНК дуплексами. // Молекулярная биология, 2000, т. 34, вып. 6, с. 1065-1073.

14. Sukhacheva Е.А., Evstafieva A.G., Fateeva T.V., Shakulov V.R., Efimova N. A., Karapetian R.N., Rubtsov Y.P., Vartapetian A.B. Sensing prothymosin alpha origin, mutations and conformation with monoclonal antibodies. //J. Immunol. Methods., 2002, v. 266, p.185-196.

15. Kalmykova A.I., Shevelyov Y.Y., Potesskaya O.O., Dobritsa A.A., Evstafieva A.G., Boldyreff В., Issinger O.G., Gvozdev V.A. CK2(beta)tes gene encodes a testis-specific isoform of the regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster. // Eur. J. Biochem., 2002, v. 269, p.1418-1427.

16. Evstafieva A.G, Belov G.A, Rubtsov Y.P, Kalkum M, Joseph B, Chichkova N.V, Sukhacheva E.A, Bogdanov A.A, Pettersson R.F, Agol V.I, Vartapetian A.B. Apoptosis-related fragmentation, translocation, and properties of human prothymosin alpha. // Exp. Cell Res., 2003, v. 284, p. 209-221

17. Markova O.V, Evstafieva A.G, Mansurova S.E, Moussine S.S, Palamarchuk L. A, Pereverzev M.O, Vartapetian A.B, Skulachev V.P. Cytochrome с is transformed from anti- to pro-oxidant when interacting with truncated oncoprotein prothymosin alpha. // Biochim. Biophys. Acta., v. 1557, p. 109-117.

18. Romanova L.I., Belov G.A., Lidsky P.V., Tolskaya EA., Kolesnikova M.S., Evstafieva A.G., Vartapetian A.B., Egger D, Bienz K, Agol V.I. Variability in apoptotic response to poliovirus infection. //Virology, 2005, v. 331, p. 292-306.

19. Karapetian R.N., Evstafieva A.G., Abaeva I.S., ChichkovaN.V., Filonov G.S., Rubtsov Y.P., Sukhacheva E.A., Melnikov S.V., Schneider U, Wanker E.E., Vartapetian A.B. Nuclear oncoprotein prothymosin alpha is a partner of Keapl: implications for expression of oxidative stress-protecting genes. //Mo!. Cell. Biol., 2005, v. 25, p. 1089-1099.

20. Евстафьева А. Г., Карапетян P. H., Рубцов Ю. П., Филонов Г. С., Абаева И. С., Фатеева Т. В., Мельников С. В., Чичкова Н. В., Вартапетян А. Б. Новые функции известного белка; участие протимозина альфа в защите клеток от апогггоза и окислительного стресса. // Молекулярная биология, 2005, т. 39, вып. 5, с. 729-745.

Подписано в печать 18.09.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 3.0 пл. Тираж ЮОэкз. Заказ № 532 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ Ю

ГЛАВА 1. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ ЕГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ обзор литературы)

1.1. СТРУКТУРА ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА

1.1.1. Первичная структура ПроТа

1.1.2. ПроТа как природный неструктурированный белок

1.1.3. Пост-трансляционные химические модификации ПроТа

1.2. ГЕН ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ

1.2.1. Гены и псевдогепы ПроТа

1.2.2. Регуляция экспрессии гена прогимозипа а

1.2.2.1. Е-бокс и регуляция белком Мус

1.2.2.2. Роль фактора А Р

1.2.2.3. Потенциальная регуляция фактором Е2Р

1.2.2.4. Эстрогеновыйрецептор и фактор 8Р-!

1.2.2.5. Опухолевый супрессорр

1.2.2.6. Онкобелок Е6 вируса папилломы человека

1.3. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА

1.4. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА, КЛЕТОЧНОЕ ДЕЛЕНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА

1.4.1. Корреляция уровня ПроТа с пролиферативным статусом клетки

1.4.2. ПроТа и клеточный цикл

1.4.3. Корреляция уровня мРНК ПроТа с экспрессией с-тус

1.4.4. Прямые доказательства участия ПроТа в процессах, связанных с делением клеток

1.4.5. ПроТа и клеточная днфферепцнровка

1.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИРОТИМОЗИНА АЛЬФА С ГИСТОНОМ HI. ВЛИЯНИЕ НА СТРУКТУРУ ХРОМАТИНА

1.6. ПОИСК НОВЫХ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ. ДРОЖЖЕВАЯ ДВУХГИБРИДНАЯ СИСТЕМА

1.6.1. Что такое дрожжевая двухгпбрндпая система

1.6.2. Преимущества дрожжевой двухгпбрндпой системы

1.6.3. Недостатки двухгпбрндпой системы и методы их преодоления

1.6.4. Поиск новых белок-белковых взаимодействий с помощью дрожжевой двухгпбрндпой системы

1.7. ПОИСК НОВЫХ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С УЧАСТИЕМ ПРОТИМОЗИИА АЛЬФА

1.7.1. Взаимодействие ПроТа с репрессором эстрогенового рецептора REA

1.7.2. Взаимодействие ПроТа с белком EBNA3C вируса Эпштейиа-Барр п гпстоиовымн ацетплтрансферазамп рЗОО/СВР

1.7.2.1. Взаимодействие ПроТа с белком EBNA3C вируса Эпштейна-Барр

1.7.2.2. Взаимодействие ПроТа с гистоповыми ацетилтрансферазами

1.7.2.3. Функциональная значимость взаимодействий ПроТа /СВР и

ПроТа/рЗОО / EBNA3C

1.7.3. Взаимодействие ПроТа с транскрипционным фактором STAT в ответ па действие ннтерферопа

1.7.4. Взаимодействие ПроТа с опкобелком SET

1.7.5. Другие белок-белковые взаимодействия с участием ПроТа

1.7.6. Заключительные замечания

1.8. МЕТОД ИНТЕРФЕРЕНЦИИ РНК И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ

ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИЙ БЕЛКОВ

1.8.1. Механизм ннтерфсрспцнп РНК

1.8.2. Особеппост.терференцин РНК в клетках млекопитающих

1.8.3. Системы практического осуществления нптерферепцип РНК в клетках высших эукарпот

1.9. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА И АПОПТОЗ

1.10. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА И ОПУХОЛЕВАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

1.10.1. Протнмозпн а - предполагаемый опкобелок

1.10.2. Протпмознп а активирует экспрессию р53-завнсимых генов

ГЛАВА II. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА обсуждение результатов)

II.1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТИМОЗИН АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА: ПРОДУКЦИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ, ВЫДЕЛЕНИЕ,

СВОЙСТВА

11.1.1. Оптимизация продукции ПроТа человека в клетках E.coli

11.1.2. Разработка метода выделения биологически активного рекомбннаптиого ПроТа из бактериальных клеток

11.1.3. Получение ПроТа-сиецнфпчпых моноклоиальпых антител, их свойства и антигенная специфичность

11.1.4. Исследование металл-связывающпх свойств ПроТа 110 II. 1.4.1. ПроТа связывается с ионообменной смолой, заряженной двухвалентными катионами 110 II. 1.4.2. Анализ взаимодействия ПроТа с ионами Zn2+ и Са2+ методом равновесного диализа 111 II. 1.4.3. Влияние ионов металлов на взаимодействие ПроТа с другими белками

II.2. СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ЭКСПРЕСИИ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

Н.2.1. Эктопическая экспрессия ПроТа человека в клетках Saccharomyces cerevisiae

11.2.2. Возможность использования ПроТа в качестве репортера в клетках Saccharomyces cerevisiae

11.2.3. Идентификация функционально значимых мутаций в ПроТа

11.2.4. Обнаружение двухчастного NLS в ПроТа

ИЗ. ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ПРОТИМОЗИПА АЛЬФА В

КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

11.3.1. Оптимизации эктопической экспрессии ПроТа в клетках IleLa

11.3.2. Снижение внутриклеточной концентрации ПроТа методом интерференции РНК

11.3.2.1. Подбор оптимального фрагмента-мишени для ПроТа-специфической интерференции РНК

113.2.2. Создание интерференционных плазмид и введение их в клетки Не La

113.2.3. Снижение уровня мРНКПроТа в клетках HeLa, экспрессирующих siRNA, и исследование специфичности этого эффекта

113.2.4. Снижения уровня ПроТа в клетках HeLa, экспрессирующих siRNA, и исследование специфичности этого эффекта

113.2.5. Сравнение эффективности siRNA к разным фрагментам- мишеням на мРНК ПроТа, транскрибируемых с HI и U6 промоторов

11.4. ПРОТИМОЗИН АЛЬФА В АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

11.4.1. Фрагментация ПроТа в анонтотических клетках

11.4.2. Гидролиз ПроТа каспазами-3 и -7 ш viíro

11.4.3. Участки каспазпого гидролиза ПроТа in vivo

11.4.4. Изменение внутриклеточной локализации ПроТа в апоитотических клетках

11.4.5. Суперпродукцня ПроТа и его мутантов защищает клетки от анонтоза

11.5. ПОИСК БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ПРОТИМОЗИНОМ АЛЬФА, С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕВОЙ ДВУХГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ 165 II.5.1. Принцип работы дрожжевой двухгнбридной системы

11.5.2. Дрожжевая двухгибридная система на основе LexA

11.5.3. ПроТа человека не является автоактиватором транскрипции

11.5.4. Скрининг библиотек кДНК с помощью дрожжевой двухгибридной системы

11.5.5. Определение участков белков, ответственных за взаимодействие ПроТа и Keapl

11.5.6. Получение моноклональных антител к Keapl

11.5.7. Взаимодействие ПроТа-Keapl in vitro

II.6. РОЛЬ ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА В ЗАЩИТЕ КЛЕТОК ОТ

ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

11.6.1. Модель регуляции клеточного ответа на окислительный стресс

11.6.2. Как ПроТа может встретиться с Keapl в клетке?

11.6.3. ПроТа конкурирует с Nrf2 за связывание с Keapl

11.6.4. ПроТа влияет на 1ЧгО-зависимую генную экспрессию

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. ВЫВОДЫ

Одна из актуальных и наиболее сложных проблем молекулярной биологии во времена геномики и протеомики - поиск новых функций и определение механизмов функционирования белков в клетках. Успешное завершение секвеиировапия генома человека привело к тому, что прочитаны практически все гены, становится известной структура большинства их белковых продуктов. Но даже если о структуре белка известно все или почти все, часто бывает очень непросто понять, что этот белок делает в клетке, особенно если учесть тот факт, что большинство белков выполняют в клетке не одну, а несколько функций. Чтобы понять, как работает живая система в целом, необходимо разобраться в сложной взаимосвязи этих функций.

Протимозин альфа (ПроТа) - это мультикопийный ядерный белок млекопитающих, состоящий из 109-110 аминокислотных остатков, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков (naturally unfolded proteins). Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах в жизни и смерти клеток. Структурно-функциональное исследование протимозина альфа актуально, как в связи с необходимостью разработки методов изучения механизмов функционирования белков, так и вследствие того, что функции ПроТа сами по себе имеют существенное значение для протекания весьма важных клеточных процессов, таких как деление, опухолевая трансформация, апоптоз, защита от окислительного стресса.

Несмотря на то, что ПроТа является жизненно важным белком, механизм его действия до сих пор не ясен. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об его участии в пролиферации клеток. Он ускоряет клеточное деление, клетки с повышенным содержанием ПроТа приобретают фенотип трансформированных клеток. Снижение уровня ПроТа приводит к остановке деления клеток. Таким образом, изучение механизмов функционирования ПроТа актуально для понимания закономерностей клеточного деления.

Активация экспрессии гена ПроТа обнаружена в клетках многих раковых опухолей, в частности рака толстой кишки, тонкой кишки, печени, легких и молочной железы. Было показано, что суперпродукция ПроТа не только влияет на пролиферацию, но и позволяет клеткам расти в среде с пониженным содержанием сыворотки, приводит к отсутствию контактного торможения и росту не прикрепленных к подложке клеток. Следовательно, ПроТа обладает свойствами, аналогичными свойствам онкобелков, а исследование механизмов его функционирования актуально для создания новых антираковых препаратов.

Регуляция экспрессии генов является фундаментальной научной проблемой, от решения которой зависит возможность влиять на важнейшие биологические процессы на уровне клетки и всего организма. Показано, что ПроТа взаимодействует с гистонами, в частности с гистоном HI, и способен индуцировать структурные перестройки хроматина. Кроме того, обнаружен еще ряд взаимодействующих с ПроТа белков: репрессор рецептора эстрогенов REA, коактиватор транскрипции СВР и гистоновая ацетилтрапсфераза рЗОО, транскрипционный фактор STAT3, ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр EBNA3C, белок Rev вируса иммунодефицита человека типа 1, онкобелок SET. Перечисленные взаимодействия свидетельствуют о вероятном участии ПроТа в регуляции экспрессии генов, например, посредством структурной перестройки хроматина, модуляции активности транскрипционных факторов, а также возможного участия в процессе ядерно-цитоплазматического транспорта.

В процессе выполнения данной работы мы показали, что ПроТа гидролизуется каспазой-3 в апоптотических клетках и это приводит к инактивации его сигнала ядерной локализации. Кроме того, высокий уровень ПроТа защищает клетки человека от апоптоза. Программируемая клеточная смерть (апоптоз) является фундаментальным процессом, позволяющим многоклеточным организмам избавляться от избыточных и поврежденных (в том числе, раковых) клеток. Кроме того, мы обнаружили, что ПроТа за счет взаимодействия с ингибитором транскрипционного фактора Nrf2 принимает участие в ответе клеток на окислительный стресс, способствуя активации экспрессии защитных генов. Это свидетельствует о несомненной актуальности систематического структурно-функционального исследования ПроТа.

Целыо настоящей работы явилось изучение механизмов функционирования ядерного многофункционального белка млекопитающих ПроТа, определение взаимосвязи между структурными элементами этого белка и его функциональными активностями.

IV. выводы

1. Созданы системы эффективной экспрессии ПроТа человека, его точечных и делеционных мутантов, а также содержащих ПроТа составных белков, в клетках бактерий, дрожжей и культуре клеток человека. Разработаны методы выделения и очистки этих белков. Получены препараты высокоочищенного ПроТа, обладающие иммуностимулирующей активностью. Получены высокоспецифичные моноклональные антитела к двум разным эпитопам ПроТа, пригодные для иммуноблотиига, иммунопреципитации, иммуноферментного и гистохимического анализа. Показано, что ПроТа является Хп2+ и Са2+-связывающим белком.

2. Обнаружено, что продукция ПроТа человека в клетках Басскаготусез сегеугягае приводит к ингибированию клеточного деления. На основе этого феномена создана система селекции функционально значимых мутаций в протимозине альфа, ряд таких мутаций идентифицирован и охарактеризован. С их помощью показано, что сигнал ядерной локализации ПроТа состоит из двух блоков положительно заряженных аминокислот КЯ88 и ККОК104, разделенных спейсером.

3. Показано, что протимозин альфа является природным субстратом каспаз. Он гидролизуется в апоптотических клетках человека в трех местах: мажорное

99 расщепление происходит после остатка Э в аминокислотнои последовательности ООУО , а два минорных - после последовательностей ААУБ и Ш1Ш31. За это ответственна, в основном, каспаза-3.

4. Расщепление каспазой-3 по мажорному сайту после остатка О99 приводит к инактивации сигнала ядерной локализации ПроТа и изменению его субклеточной локализации: из ядерного белок становится ядерно-цитоплазматическим. Кроме того, ПроТа (или его фрагменты) экспонируются на поверхности апоптотических (но не нормальных) клеток.

5. Суперпродукция протимозина альфа и ряда его мутантов с ядерной или ядерно-цитоплазматической локализацией в клетках НеЬа ингибирует активацию каспаз и защищает клетки от апоптоза.

6. Обнаружен белок, взаимодействующий с протимозииом альфа. Им оказался Кеар1, репрессор транскрипционного фактора ответственного за индукцию генов клеточного ответа на окислительный стресс. ПроТа взаимодействует с Кеар1 прямо и специфично. Избыток ПроТа способен вытеснять из комплекса с Кеар1.

7. Показано, что Кеар1 не заякорен в цитоплазме благодаря взаимодействию с актиновыми элементами цитоскелета, как считали ранее, а является белком-челноком, постоянно мигрирующим между ядром и цитоплазмой. В связи с этим предложена модель участия ПроТа в регуляции ответа клетки на окислительный стресс, согласно которой ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса Мг£2-Кеар1. При окислительном стрессе происходит дестабилизация комплекса, усиление его диссоциации протимозином а, увеличение концентрации свободного №£2, способного связаться с ДНК, и возрастание экспрессии А11Е-зависимых генов.

8. Суперэкспрессия протимозина альфа дикого типа (но не мутанта с нарушенной способностью взаимодействовать с Кеар1) приводит к усилению, а снижение концентрации протимозина в клетке с помощью интерференции РНК - к подавлению экспрессии гена гемоксигеназы-1. Эти данные подтверждают предложенную модель ответа клетки на окислительный стресс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПроТа - мультифункциональный белок. Как уже упоминалось выше, отсутствие жесткой глобулярной структуры природных неструктурированных белков может служить значительным функциональным преимуществом, так как высокая пластичность позволяет им эффективно взаимодействовать с многочисленными разнородными партнерами. Структурные переходы, индуцированные в таких белках при связывании со специфическими партнерами, могут служить механизмом регуляции различных клеточных процессов.

Когда мы начинали эту работу (1990 г.), основной функцией ПроТа считалась иммуностимуляторная. Не было данных о его взаимодействии с другими белками и ионами металлов. Не было получено точечных мутантов ПроТа, влияющих на его функционирование. Не было высоко-специфичных моноклональных антител к этому белку. Не был идентифицирован двухчастный сигнал ядерной локализации ПроТа. Не было данных о фрагментации этого белка в апоптотических клетках, об изменении его внутриклеточной локализации при апоптозе, а также о роли ПроТа в защите клеток от апоптоза и о его функциях онкобелка. Не было также данных о связи ПроТа с защитой клетки от окислительного стресса.

В сложившуюся в настоящее время картину многочисленных функциональных активностей ПроТа внесли свой вклад как наши работы, так и работы наших коллег, цитированные в настоящем обзоре. Многочисленность этих работ и полученные в них интересные результаты свидетельствует о важности и актуальности структурно-функционального исследования протимозина альфа.

ГЛАВА II. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПРОТИМОЗИНА а (обсуждение результатов)

Целью настоящей работы явилось изучение механизмов функционирования ядерного многофункционального белка млекопитающих ПроТа, определение взаимосвязи между структурными элементами этого белка и его функциональными активностями.

Для достижения поставленной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Оптимизация эктопической экспрессии ПроТа человека в бактериальных клетках и в культуре клеток человека. Создание бактериальных и дрожжевых штаммов-продуцентов ПроТа человека, его производных и мутантов.

2. Разработка эффективных методов выделения ПроТа человека из бактериальных, дрожжевых и человеческих клеток. Исследование рекомбинантного белка: посттрансляционной модификации, биологической активности, антигенных и металл-связывающих свойств.

3. Получение моноклональные антител к разным эпитопам ПроТа. Определение антигенной специфичности полученных антител. Разработка системы иммунофермеитного анализа на основе этих антител.

4. Разработка системы селекции функционально значимых мутаций в ПроТа. Поиск функционально важных доменов этого белка. В связи с обнаружением предполагаемого двухчастного ЫГД изучение ядерно-цитоплазматического транспорта ПроТа и его делеционных мутантов в клетках дрожжей и человека.

5. Разработка системы подавления экспрессии гена ПроТа в культуре клеток человека методом интерференции РНК.

6. Исследование фрагментации, внутриклеточной локализации и защитного действия ПроТа в апоптотических клетках.

7. Поиск молекулярных партнеров ПроТа с помощью дрожжевой двухгибридной системы. Исследование возможности и специфичности взаимодействия ПроТа с найденным белком Кеар1. Анализ биологической значимости этого взаимодействия.

8. Создание и экспериментальная проверка модели участия ПроТа в ответе клетки на окислительный стресс.

11.1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТИМОЗИН АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА: ПРОДУКЦИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ, ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА

ПроТа человека - мультикопийный ядерный белок, маленький (12.6 кДа), гидрофильный и очень кислый (р1 = 3.5) (рис. 11.1). Для структурно-функциональных исследований ПроТа и его возможного применения в медицине, а также для получения высоко-специфичных антител к этому белку, необходимо было иметь доступный источник препаративных количеств ПроТа человека, его мутантов и производных, состоящих из разнородных структурных доменов. Наиболее надежным способом достижения перечисленных целей стало создание бактериальных штаммов-продуцентов ПроТа человека и его производных и разработка эффективного метода выделения этого белка из бактериальных клеток. Следует подчеркнуть, что эта задача оказалась не совсем тривиальной. ПроТа - достаточно маленький белок с весьма необычными свойствами, поэтому для ряда стоящих перед нами целей присоединение к нему какого-либо тэга, позволяющего выделить белок с помощью аффинной хроматографии, было нежелательно.

Ас-БР А А УРТБ БЕ10 I Т Т К О ЬК Е К К20 Е V V Е Е А ЕЫ О Я30Р А Р АЫ в Тимозин а1

ЫАЫЕ40ЕЫОЕдЕАРЫЕ50УРЕЕЕЕЕООЕ60ЕЕЕЕЕЕЕОРО70ЕЕЕР ОРЕРЕЕ80АЕ8АТОК11А А90 ЕРРЕРРРУР Т100 КК(}КТРЕР Р109

Рис. Н.1. Первичная структура ПроТа человека. Ы-концевой 28-членный пептид, представляющий собой тимозин а1, подчеркнут.

Н.1.1. Оптимизация продукции ПроТа человека в клетках Е.соИ

Для продукции ПроТа и оптимизации эффективности его синтеза в бактериальных клетках, кДНК, соответствующая белок-кодирующей части ПроТа человека (ранее полученная А. Б. Вартапетяном), была встроена в вектор рЕТЗс (Коуа£еп) под контроль промотора и участка связывания рибосом гена 10 бактериофага Т7. Полученная таким образом плазмида кодировала ПроТа, содержащий на Ы-копце 11-членный пептид продукта гена 10 бактериофага Т7. Для получения ПроТа, идентичного нативному человеческому белку, было решено удалить фрагмент ДНК, кодирующий чужеродный довесок, получив при этом разные варианты стыковки последовательности Шайн

99

Дальгарно (БО) и инициаторного кодона ПроТа с целью экспериментального подбора оптимального рибосом-связывающего участка. Как известно, для инициации трансляции оптимальным является расстояние между последовательностью 80 и инициаторным кодоном в 5-7-9 нуклеотидных остатков [270], однако на эффективность этого процесса может влиять вовлеченность участка связывания рибосомы во вторичные и третичные взаимодействия с другими районами мРНК, плохо предсказуемая теоретически, несмотря на обилие программ анализа вторичной структуры РНК.

Для осуществления данного плана фрагмент ДНК между последовательностью БО и инициаторным кодоном ПроТа был вырезан с помощью эндонуклеаз рестрикции и удален, а образовавшиеся липкие концы экспрессионной плазмиды были либо достроены с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.соИ, либо затуплены обработкой нуклеазой с разной степенью жесткости. При их лигировании получился набор вариантов (клонов), в которых расстояние между последовательностью БО и инициаторным кодоном ПроТа варьировало от 0 до 16 нуклеотидных остатков (табл. И.1).

1. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 1008-1111.

2. Pineiro A., Cordero O.J., Nogueira M. 2000. Fifteen years of prothymosin alpha: contradictory past and new horizons. Peptides. 21,1433.

3. Vartapetian A.B., Uversky V.N. 2003. Prothymosin alpha: a simple yet mysterious protein. In: Protein structures: kaleidoscope of structural properties andfunctions. India, Research Signpost.

4. Haritos A.A., Blacher R., Stein S., Caldarella J., Horecker B.L. Primary structure of rat thymus prothymosin alpha. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 343-346.

5. Pan L.X., Haritos A.A., Wideman J., Komiyama T., Chang M., Stein S., Salvin S.B., Horecker B.L. Human prothymosin alpha: amino acid sequence and immunologic properties.//Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 250. P. 197-201.

6. Goodall G.J., Dominguez F., Horecker B.L. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 8926-8928.

7. Eschenfeldt W.H., Berger S.L. The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83.P. 9403-9407.

8. Frangou-Lazaridis M., Clinton M., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin alpha and parathymosin: amino acid sequences deduced from the cloned rat spleen cDNAs.// Arch Biochem Biophys. 1988. V. 263. P. 305-310.

9. Economou M., Seferiadis K., Frangou-Lazaridis M., Horecker B.L., Tsolas O. Isolation and partial characterization of prothymosin alpha from porcine tissues.//

10. FEBS Lett. 1988. V.20. P.342-346.

11. Panneerselvam C., Wellner D., Horecker B.L. The amino acid sequence of bovine thymus prothymosin alpha. //Arch. Biochem. Biophys. 1988 .V. 265. P. 454-457.

12. Clinton M, Frangou-Lazaridis M, Panneerselvam C, Horecker BL. The sequence of human parathymosin deduced from a cloned human kidney cDNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 158. P. 855-862.

13. Frillingos S., Frangou-Lazaridis M., Seferiadis K., Hulmes JD., Pan Y.C., Tsolas O. Isolation and partial sequence of goat spleen prothymosin alpha. // Mol. Cell. Biochem. 1991. V. 108. P. 85-94.

14. Eschenfeldt W.H., Manrow R.E., Krug M.S., Berger S.L. Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family. Evidence against export of the gene products.//J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7546-7555.

15. Manrow R.E., Berger S.L. GAG triplets as splice acceptors of last resort. An unusual form of alternative splicing in prothymosin alpha pre-mRNA. // J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 281-288.

16. Aniello F., Branno M., De Rienzo G., Ferrara D., Palmiero C., Minucci S. First evidence of prothymosin alpha in a non-mammalian vertebrate and its involvement in the spermatogenesis of the frog Rana esculenta.// Mech. Dev. 2002. V. 110. P. 213-217.

17. Makarova T., Grebenshikov N., Egorov C., Vartapetian A., Bogdanov A. Prothymosin alpha is an evolutionary conserved protein covalently linked to a small RNA. // FEBS Lett. 1989. V. 257. P. 247-250.

18. Trumbore M.W., Manrow R.E., Berger S.L. Prothymosin alpha is not found in yeast. Protein Expr. Purif. 1998. V. 13. P. 383-388.

19. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Forster K., Maurer H.R., Muller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J., Damaschun G. Prothymosin alpha: a biologically active protein with random coil conformation.//Biochemistry. 1995. V.34. P. 3211-3218.

20. Uversky V.N., Gillespie J.R., Fink A.L. Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? // Proteins. 2000. V. 41. P. 415-427.

21. Haritos A.A., Yialouris P.P., Heimer E.P., Felix A.M., Hannappel E., Rosemeyer MA. Evidence for the monomeric nature of thymosins. // FEBS Lett. 1989. V. 244. P. 287290.

22. Cordero O.J., Sarandeses C.S., Lopez JL., Nogueira M. On the anomalous behaviour on gel-filtration and SDS-electrophoresis of prothymosin-alpha. // Biochem. Int. 1992. V. 28. P. 1117-1124.

23. Uversky V.N. Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. // Protein. Sci. 2002. V. 11. P. 739-756.

24. Uversky V.N. What does it mean to be natively unfolded? // Eur J Biochem. 2002. V. 269. P. 2-12.

25. Uversky V.N., Gillespie J.R., Millett I.S., Khodyakova A.V., Vasilenko R.N., Vasiliev A.M., Rodionov I.L., Kozlovskaya G.D., Dolgikh D.A., Fink A.L., Doniach S.,

26. Permyakov E.A., Abramov V.M. Zn(2+)-mediated structure formation and compaction of the "natively unfolded" human prothymosin alpha. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 267. P. 663-668.

27. Pavlov N.A., Cherny D.I., Heim G., Jovin T.M., Subramaniam V. Amyloid fibrils from the mammalian protein prothymosin alpha. // FEBS Lett. 2002 . V. 517. P. 37-40.

28. Abiko T., Sekino H. Synthesis of an immunologically active fragment analog of prothymosin alpha with enhanced enzymatic stability.//Chem Pharm Bull (Tokyo). 1991. V. 39. P. 752-756.

29. Bachmair A, Finley D, Varshavsky A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. // Science. 1986. V. 234. p. 179-186.

30. Sburlati A.R., De La Rosa A., Batey D.W., Kurys G.L., Manrow R.E., Pannell L.K., Martin B.M., Sheeley D.M, Berger SL. Phosphorylation of human and bovine prothymosin alpha in vivo.// Biochemistry. 1993. V.32. P.4587-4596.

31. Wang R.H., Tao L., Trumbore M.W., Berger S.L. Turnover of the acyl phosphates of human and murine prothymosin alpha in vivo. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 2640526412.

32. Trumbore M.W., Wang R.H., Enkemann S.A., Berger S.L. Prothymosin alpha in vivo contains phosphorylated glutamic acid residues.//! Biol. Chem. 1997. V.272. P. 2639426404.

33. Tao L., Wang R.H., Enkemann S.A., Trumbore M.W., Berger S.L. Metabolic regulation of protein-bound glutamyl phosphates: insights into the function of prothymosin alpha. // J. Cell. Physiol. 1999. V. 178. P. 154-163.

34. Barcia M.G., Castro J.M., Jullien C.D., Gonzalez C.G., Freire M. Prothymosin alpha is phosphorylated by casein kinase-2 .// FEBS Lett. 1992. V. 312. P. 152-156.

35. Barcia M.G., Castro J.M., Jullien C.D., Freire M. Prothymosin alpha is phosphorylated in proliferating stimulated cells.// J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 4704-4708.

36. Perez-Estevez A., Diaz-Jullien C., Covelo G., Salgueiro M.T., Freire M. A 180-kDa protein kinase seems to be responsible for the phosphorylation of prothymosin alpha observed in proliferating cells. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 10506-10513.

37. Perez-Estevez A., Freire J., Sarandeses C., Covelo G., Diaz-Jullien C., Freire M. Properties of the protein kinase that phosphorylates prothymosin alpha. // Mol. Cell Biochem. 2000. V. 208. P. 111-118.

38. Vartapetian A.B., Makarova T.N., Koonin E.V., Agol V.I., Bogdanov A.A. Small cytoplasmic RNA from mouse cells covalently linked to a protein. // FEBS Lett. 1988. V. 232. P. 35-38.

39. Vartapetian A., Lukashev D., Lyakhov I., Belyaeva A., Chichkova N., Bogdanov A. Mammalian prothymosin alpha links to tRNA in Escherichia coli cells. // RNA. 1997. V. 3.P. 1173-1181.

40. Lukashev D.E., Chichkova N.V., Vartapetian A.B. Multiple tRNA attachment sites in prothymosin alpha. // FEBS Lett. 1999. V. 451. P. 118-124.

41. Manrow R.E., Leone A., Krug M.S., Eschenfeldt W.H., Berger S.L. The human prothymosin alpha gene family contains several processed pseudogenes lacking deleterious lesions.// Genomics. 1992. V. 13. P. 319-331.

42. Rubtsov Yu.P., Vartapetian A.B. New intronless members of human prothymosin alpha genes. Mol Biol (Mosk). 1995. V. 29. P. 1320-1325.

43. Eilers M., Schirm S., Bishop J.M. The MYC protein activates transcription of the alpha-prothymosin gene.//EMBO J. 1991. V. 10. P. 133-141.

44. Vareli K., Frangou-Lazaridis M., Tsolas O. Prothymosin alpha mRNA levels vary with c-myc expression during tissue proliferation, viral infection and heat shock. // FEBS Lett. 1995. V. 371. P. 337-340

45. Davis A.C., Wims M., Spotts G.D., Hann S.R., Bradley A. A null c-myc mutation causes lethality before 10.5 days of gestation in homozygotes and reduced fertility in heterozygous female mice.// Genes Dev. 1993. V. 7. P. 671-682.

46. Kelly K., Cochran B.H., Stiles C.D., Leder P. Cell-specific regulation of the c-myc gene by lymphocyte mitogens and platelet-derived growth factor. // .Cell. 1983. V. 35. P. 603610.

47. Keath E.J., Caimi P.G., Cole M.D. Fibroblast lines expressing activated c-myc oncogenes are tumorigenic in nude mice and syngeneic animals. // Cell. 1984. V. 39. P. 339-348.

48. Landschulz W.H., Johnson P.F., McKnight S.L. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. // Science. 1988. V. 240. P. 1759-1764.

49. Blackwood E.M., Eisenman R.N. Max: a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence-specific DNA-binding complex with Myc. // Science. 1991. V. 251. P. 12111217.

50. Blackwell T.K., Kretzner L., Blackwood E.M., Eisenman R.N., Weintraub H. Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein. // Science. 1990. V. 250. P. 1149-1151.

51. Kerkhoff E., Bister K., Klempnauer K.H. Sequence-specific DNA binding by Myc proteins. //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V. 88. P. 4323-4327.

52. Amin C., Wagner A.J., Hay N. Sequence-specific transcriptional activation by Myc and repression by Max. // Mol. Cell. Biol. 1993. V.13. P. 383-390.

53. Amati B., Dalton S., Brooks M.W., Littlewood T.D., Evan G.I., Land H. Transcriptional activation by the human c-Myc oncoprotein in yeast requires interaction with Max. // Nature. 1992. V. 359. P. 423-426.

54. Gaubatz S., Meichle A., Eilers M. An E-box element localized in the first intron mediates regulation of the prothymosin alpha gene by c-myc. // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 3853-3862.

55. Tavtigian S.V., Zabludoff S.D., Wold B.J. Cloning of mid-Gl serum response genes and identification of a subject regulated by conditional myc expression.// Mol. Biol. Cell. 1994. V. .P. 375-388.

56. Mol P.C., Wang R.H., Batey D.W., Lee L.A., Dang C.V., Berger S.L. Do products of the myc proto-oncogene play a role in transcriptional regulation of the prothymosin alpha gene? // Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P.6999-7009.

57. Desbarats L., Gaubatz S., Eilers M. Discrimination between different E-box-binding proteins at an endogenous target gene of c-myc. // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 447-460.

58. Gaubatz S., Imhof A., Dosch R., Werner O., Mitcel P., Buettner R., Eilers M. Transcriptional activation by Myc is under negative control by the transcription factor AP-2. //EMBOJ. 1995. V. 14. P. 1508-1519.

59. Wagner A.J., Meyers C., Laimins L.A., Hay N. c-Myc induces the expression and activity of ornithine decarboxylase. // Cell Growth Differ. 1993. V. 4. P. 879-883.

60. Vareli K., Tsolas O., Frangou-Lazaridis M. Regulation of prothymosin alpha during the cell cycle.// Eur J Biochem. 1996. V. 238. P. 799-806.

61. Nevins J.R. E2F: a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoproteins. // Science. 1992. V. 258. P. 424-429.

62. Attwooll C., Lazzerini Denchi E., Helin K. The E2F family: specific functions and overlapping interests. // EMBO J. 2004. V. 23. P. 4709-4716.

63. Gamier M., Di Lorenzo D., Albertini A., Maggi A. Identification of estrogen-responsive genes in neuroblastoma SK-ER3 cells. // J Neurosci. 1997. V. 17. P. 4591-4599.

64. Martini P.G., Katzenellenbogen B.S. Modulation of estrogen receptor activity by selective coregulators.// J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 85. P. 117-122.

65. Zhao R., Gish K., Murphy M., Yin Y., Notterman D., Hoffman W.H., Tom E., Mack D.H., Levine A.J. Analysis of p53-regulated gene expression patterns using oligonucleotide arrays.//Genes Dev. 2000. V. 14. P. 981-993.

66. Копнин Б.П. Молекулярные механизмы канцерогенеза. «Энциклопедия клинической онкологии» под ред. М.М.Давыдова, Изд. РЛС, Москва, 2004, с. 3453.

67. Johnson R.A., Ince Т.А., Scotto K.W. Transcriptional repression by p53 through direct binding to a novel DNA element. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 27716-27720.

68. Касаикина M.B. Исследование возможности применения протимозина альфа в качестве прогностического маркера при онкологических заболеваниях. Дипломная работа. Химический факультет МГУ. Москва 2005. с. 53, 92-93.

69. Kinoshita Т., Shirasawa Н., Shino Y., Moriya Н., Desbarats L., Eilers M., Simizu В. Transactivation of prothymosin alpha and c-myc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein. //Virology. 1997. V. 232. P. 53-61.

70. Scheffner M„ Wemess B.A., Huibregtse J.M., Levine A.J., Howley P.M. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. // Cell. 1990. V. 63. p. 1129-1136.

71. Tsitsiloni O.E., Yialouris P.P., Sekeri-Pataryas K., Haritos A.A. Prothymosin alpha is not a nuclear polypeptide .// Experientia. 1989. V. 45. P. 332-334.

72. Gomez-Marquez J., Segade F. Prothymosin alpha is a nuclear protein. // FEBS Lett. 1988. V. 226. P. 217-19.

73. Watts J.D., Cary P.D., Crane-Robinson C. Prothymosin alpha is a nuclear protein. // FEBS Lett. 1989. V. 245. P. 17-20.

74. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P., Crane-Robinson C. Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins. //Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. P. 643-651.

75. Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence. //Cell. 1991. V. 64. P. 615-623.

76. Palvimo J., Linnala-Kankkunen A. Identification of a low-Mr acidic nuclear protein as prothymosin alpha. //FEBS Lett. 1990. V. 277. P. 257-260.

77. Clinton M., Graeve L., el-Dorry H., Rodriguez-Boulan E., Horecker B.L. Evidence for nuclear targeting of prothymosin and parathymosin synthesized in situ. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V. 88. P. 6608-6612.

78. Manrow R.E., Sburlati A.R., Hanover J.A., Berger S.L. Nuclear targeting of prothymosin alpha. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 3916-3924.

79. Nigg E.A. Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. //Nature. 1997. V.386. P. 779-787.

80. Enkemann S.A., Ward R.D., Berger S.L. Mobility within the nucleus and neighboring cytosol is a key feature of prothymosin-alpha. // J Histochem. Cytochem. 2000. V. 48. P. 1341-1355.

81. Castro J.M., Barcia M.G. Localization of prothymosin alpha in the nucleus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 224. P. 140-146.

82. Gallego R., Roson E., Garcia-Caballero T., Fraga M., Forteza J., Dominguez F. Beiras A. Prothymosin alpha expression in lymph nodes and tonsils: an optical and ultrastructural study. // Acta. Anat. (Basel). 1992. V.143. P. 219-222.

83. Wang J., Shiels C., Sasieni P., Wu P.J., Islam S.A., Freemont P.S., Sheer D. Promyelocytic leukemia nuclear bodies associate with transcriptionally active genomic regions. //J. Cell. Biol. 2004. V. 164. P. 515-526.

84. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C., Horecker B.L. Prothymosin alpha and parathymosin: mRNA and polypeptide levels in rodent tissues. // Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 269. P.256-263.

85. Frillingos S., Tsolas 0. Age- and sex-related differences in the content of prothymosin alpha in rat tissues. // Experientia. 1992. V. 48. P. 236-239.

86. Roson E., Garcia-Caballero G., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Cellular distribution of prothymosin alpha and parathymosin in rat thymus and spleen. // J. Histochem. Cytochem. 1990. V. 38. P. 1889-1894.

87. Roson E., Gallego R., Garcia-Caballero T., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Prothymosin alpha expression is associated to cell division in rat testis. // Histochemistry. 1990. V. 94. P. 597-599.

88. Garcia-Caballero T., Dominguez F., Roson E., Gallego R., Zalvide J., Forteza J., Beiras A. Distribution of prothymosin alpha in rat and human adrenal cortex. // Anat. Rec. 1994. V. 239. P. 88-94.

89. Gomez-Marquez J., Segade F., Dosil M., Pichel J.G., Bustelo X.R., Freire M. The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 8451-8454.

90. Dosil M., Freire M., Gomez-Marquez J. Tissue-specific and differential expression of prothymosin alpha gene during rat development. // FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 373-376.

91. Bustelo X.R., Otero A., Gomez-Marquez J., Freire M. Expression of the rat prothymosin alpha during T-Lymphocyte proliferation and liver regeneration. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 1443-1447.

92. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J., Jessup J.M., Steele G.D.Jr., Chen L.B. Prothymosin alpha mRNA expression correlates with that of c-myc in human colon cancer.// Oncogene. 1993. V.8. P. 2821-2826.

93. Magdalena C., Dominguez F., Loidi L., Puente J.L. Tumour prothymosin alpha content, a potential prognostic marker for primary breast cancer. //.Br. J. Cancer. 2000. V. 82. P. 584-590.

94. Mitani M., Kuwabara Y., Kawamura H., Sato A., Hattori K., Fujii Y. Significance of plasma thymosin alphal measurements in gastric cancer patients. // World J. Surg. //2000. V. 24. P. 455-458.

95. Wu C.G., Habib N.A., Mitry R.R., Reitsma P.H., van Deventer S.J., Chamuleau R.A. Overexpression of hepatic prothymosin alpha, a novel marker for human hepatocellular carcinoma. // Br. J. Cancer. 1997. V. 76. P. 1199-1204.

96. Sasaki H., Nonaka M., Fujii Y., Yamakawa Y., Fukai I., Kiriyama M., Sasaki M. Expression of the Prothymosin a as a Prognostic Factor in Lung Cancer // Surg. Today.2001. V. 31. P. 936-938.

97. Szabo P., Ehleiter D., Whittington E., Weksler M.E. Prothymosin alpha expression occurs during G1 in proliferating B or T lymphocytes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. v. 185. P. 953-959.

98. Zalvide J.B., Cancio E., Alvarez C.V., Regueiro B.J., Dominguez F. Prothymosin alpha mRNA levels are invariant throughout the cell cycle. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 8692-8695.

99. Dean M., Levine R.A., Campisi J. c-myc regulation during retinoic acid-induced differentiation of F9 cells is posttranscriptional and associated with growth arrest. // Mol. Cell Biol. 1986. V. 6. P. 518-524.

100. Dosil M., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. Differentiation-linked expression of prothymosin alpha gene in human myeloid leukemic cells. // Exp. Cell Res. 1993. V. 204. P. 94-101.

101. Smith M.R., al-Katib A., Mohammad R., Silverman A., Szabo P., Khilnani S., Kohler W., Nath R., Mutchnick M.G. Prothymosin alpha gene expression correlates with proliferation, not differentiation, of HL-60 cells. // Blood. 1993. V. 82. P. 1127-1132.

102. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V. 88. P. 253-257.

103. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells. // Cell Death Differ. 1999.V. 6. P.3-5.

104. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Buceta M., Vidal A., Domínguez F., Gomez-Marquez J. Overcxpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells. // Biochem. J. 1998. V. 331. P. 753-761.

105. Thoma F., Koller T., Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. // J. Cell. Biol. 1979. V. 83. P. 403-427.

106. Lemon B., Tjian R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. // Genes. Dev. 2000. V. 14. P. 2551-2569.

107. Zlatanova J., Caiafa P., Van Holde K. Linker histone binding and displacement: versatile mechanism for transcriptional regulation. // FASEB J. 2000. V. 14. P. 16971704.

108. Hill D.A., Imbalzano A.N. Human SWI/SNF nucleosome remodeling activity is partially inhibited by linker histone HI. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 11649-11656.

109. Papamarcaki T., Tsolas O. Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro. // FEBS Lett. 1994. V. 345. P. 71-75.

110. Diaz-Jullien C., Perez-Estevez A., Covelo G., Freire M. Prothymosin alpha binds histones in vitro and shows activity in nucleosome assembly assay. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1296. P. 219-227.

111. Fields S., Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. // Nature. 1989. V. 340. P. 245-247.

112. Chien C.T., Bartel P.L., Sterglautz R., Fields S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 9578-9582.

113. Finley J.R., Brent R. In: Interaction trap cloning with yeast. 1995. Hames, Glover, eds Oxford Univ. Press. P. 169-203.

114. Keegan L., Gill G., Ptashne M. Separation of DNA binding from the transcriptionactivating function of a eukaryotic regulatory protein. // Science. 1986. V. 231. P. 699.

115. Hope I. A., Struhl K. Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activatorprotein, GCN4 of yeast. // Cell. 1986. V. 46. P. 885.

116. Brent R., Ptashne M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNAspecificity of a prokaryotic repressor. // Cell. 1985. V. 43. P. 729.

117. Fields S., Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-proteininteractions. // Trends Genet. 1994. V. 10. P. 286-292.

118. Ma J., Ptashne M. A new class of yeast transcriptional activators. // Cell. 1987. V. 51. P.113-119.

119. Sadowski I., Ma J., Triezenberg S., Ptashne M. GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator. // Nature. 1988. V. 335. P. 563.

120. Chasman D.I., Leatherwood J., Carey M., Ptashne M., Kornberg R.D. Activation of yeast polymerase II transcription by herpesvirus VP 16 and GAL4 derivatives in vitro. // Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 4776-4779.

121. ProQuest two-hybrid system. Instruction manual. GIBCO BRL Products.

122. Yocum R.R., Hanley S., West R.J., Ptashne M. Use of lacZ fusions to delimit regulatory elements of the inducible divergent GAL 1-GAL 10 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Il Mol. Cell Biol. 1984. V. 4. P. 1985-1998.

123. Guarente L., Ptashne M. Fusion of Escherichia coli lacZ to the cytochrome c gene of Saccharomyces cerevisiae. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 2199-2203.

124. Finley Jr.R.L., Brent R. Interaction mating reveals binary and ternary connections between Drosophila cell cycle regulators. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 12980-12984.

125. Yeast protocols handbook, CLONTECH laboratories.

126. Finkel T. Detection and modulation in vivo of helix-loop-helix protein-protein interactions. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 5-8.

127. Beranger F., Aresta S., Jean de Gunzburg, Camonis J. Getting more from the two-hybrid system: N-terminal fusions to LexA are efficient and sensitive baits for two-hybrid studies. // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 2035-2036.

128. Osborne M.A., Stephen D., Kochan J.P. The yeast tribrid system genetic detection of trans-phosphorylated ITAM-SH2-interactions. //Biotechnology. 1995. V. 13.

129. Hengen P.N. False positives from the yeast two-hybrid system. // Trends Biol. Sci. 1997. V. 22. P. 33-34.

130. James P., Halladay J., Craig E.A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. // Genetics. 1996. V. 144. P. 1425-1436.

131. Leanna C.A., Hannink M. The reverse two-hybrid system: a genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions. // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3341-3347.

132. Vidal M., Brachmann R.K., Fattaey A., Harlow E., Boeke J.D. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 10315-10320.

133. Serebriiskii I., Khazak V., Golemis E.A. A two-hybrid dual bait system to discriminate specifity of protein interactions. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 17080-17087.

134. Aroncheim A., Zandi E., Hennemann H., Elledge S.J., Karin M. Isolation of an AP-1 repressor by a novel method for detecting protein-protein interactions. // Mol. Cell. Biol., 1997. V.17. P. 3094-3102.

135. Zhang J., Lautar S. A yeast three-hybrid method to clone ternary protein complex components. // Analytical Biochem. 1996. V. 242. P. 68-72.

136. Ozenberger B.A., Young K.H. Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. // Mol. Endocrin. 1995. V. 9. P. 1321-1329.

137. Putz U., Skehel P., Kuhl D. A tri-hybrid system for the analisys and detection of RNA-protein interactions. //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4838-4040.

138. Gamier M., Di Lorenzo D., Albertini A., Maggi A. Identification of estrogen-responsive genes in neuroblastoma SK-ER3 cells. // J. Neurosci. 1997. V. 17. P. 45914599.

139. Cotter M.A, Robertson E.S. Modulation of histone acetyltransferase activity through interaction of epstein-barr nuclear antigen 3C with prothymosin alpha. // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 5722-5735.

140. Канцерогенез. Под ред. Заридзе Д.Г. Москва. Научный мир. 2000. С. 193-200.

141. Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C., Tsolas 0., Papamarcaki T. Prothymosin alpha interacts with the CREB-binding protein and potentiates transcription. // EMBO Rep.2002. V.3. p. 361-366.

142. Goodman R.H., Smolik S. CBP/p300 in cell growth, transformation, and development. //Genes. Dev. 2000. V. 14. P. 1553-1577

143. Hartzog G.A., Winston F. Nucleosomes and transcription: recent lessons from genetics. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 192-198.

144. Freedman S.J., Sun Z.Y., Poy F., Kung A.L., Livingston D.M., Wagner G., Eck M.J. Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxia-inducible factor-1 alpha. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 5367-5372.

145. Knight J.S., Lan K., Subramanian C., Robertson E.S. Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C recruits histone deacetylase activity and associates with the corepressors mSin3A and NCoR in human B-cell lines. // J. Virol. 2003. V. 77. P. 4261-4272.

146. Yang C.H., Murti A., Pfeffer L.M. STAT3 complements defects in an interferon-resistant cell line: evidence for an essential role for STAT3 in interferon signaling and biological activities. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 5568-5572.

147. Vinkemeier U. Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit. // J. Cell. Biol. 2004. V. 167. P. 197-201.

148. Ma J., Zhang T., Novotny-Diermayr V., Tan A.L., Cao X. A novel sequence in the coiled-coil domain of Stat3 essential for its nuclear translocation. // J. Biol. Chem.2003. V. 278. P. 29252-29260.

149. Seo S.B., McNamara P., Heo S., Turner A., Lane W.S., Chakravarti D. Regulation of histone acetylation and transcription by INHAT, a human cellular complex containing the set oncoprotein. // Cell. 2001. V. 104. P. 119-130.

150. Kubota S., Adachi Y., Copeland T.D., Oroszlan S. Binding of human prothymosin alpha to the leucine-motif/activation domains of HTLV-I Rex and HIV-1 Rev. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 233. P. 48-54.

151. Chichkova N.V., Evstafieva A.G., Lyakhov I.G., Tsvetkov A.S., Smirnova T.A., Karapetian R.N., Karger E.M., Vartapetian A.B. Divalent metal cation binding properties of human prothymosin alpha. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 47454752.

152. Freire J., Covelo G., Sarandeses C., Diaz-Jullien C., Freire M. Identification of nuclear-import and cell-cycle regulatory proteins that bind to prothymosin alpha. // Biochem. Cell. Biol. 2001. V. 79. P. 123-131.

153. Gururaja T.L., Li W., Payan D.G., Anderson D.C. Utility of peptide-protein affinity complexes in proteomics: identification of interaction partners of a tumor suppressor peptide. // J Pept. Res. 2003. V. 61. P. 163-176.

154. Malicet C., Giroux V., Vasseur S., Dagorn J.C., Neira J.L., Iovanna J.L Regulation of apoptosis by the p8/prothymosin alpha complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P.2671-2676.

155. Malicet C., Dagorn J.C., Neira J.L., Iovanna J.L. p8 and prothymosin alpha: unity is strength. // Cell Cycle. 2006. V. 5. P. 829-30.

156. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. // Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

157. Tabara H., Sarkissian M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A., Mello C.C. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. // Cell. 1999. V. 99. P. 123-132.

158. Bertrand J.R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A., Malvy C. Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 296. P. 1000-1004.

159. Miyagishi M., Hayashi M., Taira K. Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2003. V. 13. P. 1-7.

160. Vickers T.A., Koo S., Bennett C.F., Crooke S.T., Dean N.M., Baker B.F. Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. A comparative analysis. //J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 7108-7118.

161. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., and Martienssen R.A. Regulation of heterochromatie silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. // Science. 2002. V. 297. P. 1833-1837.

162. Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. // Science. 2004. V. 303. P. 1336.

163. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S„ Grewal S.I., Moazed D. RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex. // Science. 2004. V. 303. P. 672-678.

164. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis mechanism, and function. // Cell. 2004. V. 116. P. 281-297.

165. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. // Nature. 2001. V. 409. P. 363-366.

166. Knight S.W., Bass B. L. A role for the RNase III enzyme DCR-1 in RNA interference and germ line development in Caenorhabditis elegans. // Science. 2001. V. 293. P. 2269-2271.

167. Lee Y.S., Nakahara K., Pham J.W., Kim K., He Z., Sontheimer E.J., Carthew R.W. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. // Cell. 2004. V. 117. P. 69-81.

168. Kolb F.A., Zhang H., Jaronczyk K., Tahbaz N., Hobman T.C., Filipowicz W. Human Dicer: Purification, Properties, and Interaction with PAZ PIWI Domain Proteins. // Methods Enzymol. 2005. V. 392. P. 316-336.

169. Myers J.W., Jones J.T., Meyer T., Ferrell J.E. Recombinant Dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing. //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 324-328.

170. Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. // Cell. 2000. V. 101. P. 25-33.

171. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 188-200.

172. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. // Nature. 2000. V. 404. P. 293 296.

173. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kobayashi R., Hannon G.J. Argonaute 2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. // Science. 2001. V. 293. P. 1146-1150.

174. Caudy A.A., Hannon G.J. Induction and biochemical purification of RNA-induced silencing complex from Drosophila S2 cells. // Methods Mol. Biol. 2004. V. 265. P. 5972.

175. Schwarz D.S, Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P.D. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. // Cell. 2003. V.l 15. P. 199-208

176. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S.D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. // Cell. 2003. V.l 15. P. 209-216.

177. Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 6877-6888.

178. Rand T.A., Ginalski K., Grishin N.V., Wang X. Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 14385-14389.

179. Rivas F.V., Tolia N.H., Song J.J., Aragon J.P., Liu J., Hannon G.J., Joshua-Tor L. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V.12.P. 340-349.

180. Rand T.A., Petersen S., Du F., Wang X. Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation. // Cell. 2005. V. 123. P. 621-629.

181. Grishok A., Tabara H., Mello C.C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. // Science. 2000. V. 287. P. 2494-2497.

182. Winston N. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. // Science. 2002. V. 295. P. 2456-2459.

183. Cogoni C., Macino G. Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase. //Nature. 1999. V. 99. P. 166-169.

184. Dalmay T., Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. // Cell. 2000. V. 101. P. 543-553.

185. Smardon A., Spoerke J.M., Stacey S.C., Klein M.E., Mackin N., Maine E.M. EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans. // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 169-178.

186. Schwarz D.S., Hutvagner G., Haley B. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. // Mol. Cell. 2002. V. 10. P. 537-548.

187. Stein P., Svoboda P., Anger M., Schultz R.M. RNAi: mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase. // RNA. 2003. V. 9. P. 187-192.

188. Samuel C.E. Antiviral actions of interferon. Interferon-regulated cellular proteins and their surprisingly selective antiviral activities. // Virology. 1991. V. 183. P. 1-11.

189. Staeheli P. Interferon-induced proteins and the antiviral state. // Adv. Virus Res. 1990. V. 38. P. 147-200.

190. Thomis D.C., Samuel C.E. Mechanism of interferon action: evidence for intermolecular autophosphorylation and autoactivation of the interferon-induced, RNA-dependent protein kinase PKR. // J Virol. 1993. V. 67, P. 7695-7700.

191. Samuel C.E. (1993) The eIF-2 alpha protein kinases, regulators of translation in eukaryotes from yeasts to humans. J. Biol. Chem., 268, 7603-7606.

192. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. (1979) Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2,5-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells. J. Biol. Chem., 254,10180-10183.

193. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. (1992) Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol. Cell Biol., 12, 52385248.

194. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. (2001) Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 9742-9747.

195. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W, Yalcin A., Weber K„ Tuschl T. (2001b) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411, 494-498.

196. Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. (2004) Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA, 10, 12-18.

197. Sledz C.A., Holko M., Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R. (2003) Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat. Cell Biol., 5, 834-839.

198. Bridge A.J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A.L., Iggo R. (2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat. Genet., 34, 263-264.

199. Semizarov D., Frost L., Sarthy A., Kroeger P., Halbert D.N., Fesik S.W. (2003) Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 6347-6352.

200. Chiu Y.L., Rana T.M. (2002) siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis. RNA, 9,1034-1048.

201. Elbashir S.M., Harborth J., Weber K., Tuschl T. (2002) Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods, 26,199-213.

202. Donze O., Picard D. (2002) RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase Nucleic Acids Res., 30, 46.

203. Yu J.Y., DeRuiter S.L., Turner D.L. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 6047-6052.

204. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science, 296, 550- 553.

205. Paul C.P., Good P.D., Winer I., Engelke D.R. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol., 205,505-508.

206. Baer M., Nilsen T.W., Costigan C., Altman S. (1990) Structure and transcription of a human gene for HI RNA, the RNA component of human RNase P. Nucleic Acids Res., 18,97-103.

207. Brow D.A., Guthrie C. (1990) Transcription of a yeast U6 snRNA gene requires a polymerase III promoter element in a novel position. Genes Dev., 4, 1345-1356.

208. Kawasaki H., Taira K. (2003) Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res., 31, 700-707.

209. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Shank P.R., Ramratnam B. (2003) Promoter choice affects the potency of HIV-1 specific RNA interference. Nucleic Acids Res., 31, 5033-5038.

210. Liu CM, Liu DP, Dong WJ, Liang CC. Retrovirus vector-mediated stable gene silencing in human cell. // Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 16;313(3):716-20

211. Negre D, Cosset FL Vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIV). Biochimie. 2002 Nov;84(l 1):1161-71.

212. An DS, Xie Y, Mao SH, Morizono K, Kung SK, Chen IS. Efficient lentiviral vectors for short hairpin RNA delivery into human cells. // Hum Gene Ther. 2003 Aug 10;14(12):1207-12.

213. Nishitsuji H, Ikeda T, Miyoshi H, Ohashi T, Kannagi M, Masuda T Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells.

214. Microbes Infect. 2004 Jan;6(l):76-85.

215. Gupta S, Schoer RA, Egan JE, Hannon GJ, Mittal V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Feb17;101 (7): 1927-32.

216. Amar L, Desclaux M, Faucon-Biguet N, Mallet J, Vogel R. Control of small inhibitory RNA levels and RNA interference by doxycycline induced activation of a minimal RNA polymerase III promoter. // Nucleic Acids Res. 2006 Mar 6;34(5):e37.

217. Ventura A, Meissner A, Dillon CP, McManus M, Sharp PA, Van Parijs L, Jaenisch R, Jacks T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.

218. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jul 13;101(28): 10380-5.

219. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I., Vartapetian A.B. Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. // FEBS Lett. 2000. V. 467. P. 150-154.

220. Enkemann S.A., Wang R.H., Trumbore M.W., Berger S.L. Functional discontinuities in prothymosin alpha caused by caspase cleavage in apoptotic cells. // J. Cell. Physiol. 2000. V. 182. P. 256-268.

221. Jiang X., Kim H.E., Shu H., Zhao Y., Zhang H., Kofron J., Donnelly J., Burns D., Ng SC, Rosenberg S., Wang X. Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway. // Science. 2003. V. 299. P. 223-226.

222. Nicholson D.W., Thornberry N.A. Apoptosis. Life and death decisions. // Science. 2003. V. 299. P. 214-215.

223. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. //Cell. 1997. V. 90. P. 405-413.

224. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. // Cell. 1997. V. 91. P. 479-489.

225. Acehan D., Jiang X., Morgan D.G., Heuser J.E., Wang X., Akey C.W. Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. // Mol. Cell. 2002. V. 9. P. 423-432.

226. Chakravarti D., Hong R. SET-ting the stage for life and death. // Cell. 2003. V. 112. P. 589-591.

227. Fan Z., Beresford P.J., Oh D.Y., Zhang D., Lieberman J. Tumor suppressor NM23-HI is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediatcd apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor. // Cell. 2003. V. 112. P. 659-672.

228. Seo S.B., McNamara P., Heo S., Turner A., Lane W.S., Chakravarti D. Regulation of histone acetylation and transcription by INHAT, a human cellular complex containing the set oncoprotein. // Cell. 2001. V. 104. P. 119-130.

229. Letsas K.P, Frangou-Lazaridis M. Surfing on prothymosin alpha proliferation and anti-apoptotic properties. //Neoplasma. 2006. V. 53. P.92-96.

230. Letsas K.P., Frangou-Lazaridis M., Skyrlas A., Tsatsoulis A., Malamou-Mitsi V. Transcription factor-mediated proliferation and apoptosis in benign and malignant thyroid lesions. // Pathol. Int. 2005. V. 55. P. 694-702.

231. Kluck RM, Bossy-Wetzel E, Green DR, Newmeyer DD. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. // Science. 1997. V. 275. P.1132-1136.

232. Lai A., Kawai T., Yang X., Mazan-Mamczarz K., Gorospe M. Antiapoptotic function of RNA-binding protein HuR effected through prothymosin alpha. // EMBO J. 2005. V. 24. P.1852-1862.

233. Piacentini M., Evangelisti C., Mastroberardino P.G., Nardacci R., Kroemer G. Does prothymosin-alpha act as molecular switch between apoptosis and autophagy? // Cell Death Differ. 2003. V. 10. P. 937-939.

234. Iannicola C., Moreno S., Oliverio S., Nardacci R., Ciofi-Luzzatto A., Piacentini M. Early alterations in gene expression and cell morphology in a mouse model of Huntington's disease. // J Neurochem. 2000. V. 75. P. 830-839.

235. Orre R.S., Cotter M.A., Subramanian C., Robertson E.S. Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro.// J. Biol. Chem. 2000, V. 17. P. 1794-1799.

236. Sasaki II., Sato Y., Kondo S., Fukai I., Kiriyama M., Yamakawa Y., Fujii Y. Expression of the prothymosin alpha mRNA correlated with that of N-myc in neuroblastoma. // Cancer Lett. 2001. V. 168. P. 191-195.

237. Li K.J, Shiau A.L, Chiou Y.Y, Yo Y.T, Wu C.L. Prothymosin a overexpression induces polycystic kidney disease. // Kidney Int. 2005. V. 67. P. 1710-1722.

238. Allison S.J., Milner J. Remodelling chromatin on a global scale: a novel protective function of p53. // Carcinogenesis. 2004. V. 25. P. 1551-15577.

239. Roninson I.B. Oncogenic functions of tumour suppressor p21(Wafl/Cipl/Sdil): association with cell senescence and tumour-promoting activities of stromal fibroblasts. //Cancer Lett. 2002. V. 179. P. 1-14.

240. Gartel A.L., Tyner A.L. The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in apoptosis. // Mol. Cancer Ther. 2002. V. 1. P. 639-649.

241. Chen H., Bjerknes M., Kumar R., Jay E. Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgamo sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli mRNAs. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4953-4957.

242. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. Human prothymosin alpha: purification of a highly acidic nuclear protein by means of a phenol extraction. // Protein Expr. Purif. 1990. V. l.P. 184-190.

243. Wu J., Chang S., Gong X., Liu D., Ma Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1760. P. 1241-1247.

244. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B., Vasilenko A.V., Abramov V.M., Bogdanov A.A. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 231. P. 639-643.

245. Chakrabarti P. Interaction of metal ions with carboxylic and carboxamide groups in protein structures. // Protein Eng. 1990. V. 4. P. 49-56.

246. Brand I.A., Heinickel A., Kratzin H., Soling H.D. Properties of a 19-kDa Zn2+-binding protein and sequence of the Zn2+-binding domains. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 177. P. 561-568.

247. Cullin C., Pompon D. Synthesis of functional mouse cytochromes P-450 PI and chimeric P-450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. // Gene. 1988. V. 65. P. 203-217.

248. Evstafieva A.G., Ugarova T.Y., Chernov B.K., Shatsky I.N. A complex RNA sequence determines the internal initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation. Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 665-671.

249. Evstafieva A.G., Beletsky A.V., Borovjagin A.V., Bogdanov A.A. Internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus RNA is unable to direct translation in Saccharomyces cerevisiae. // FEBS Lett. 1993. V. 335. P. 273-276.

250. Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. // Cell. 1986. V. 44. P. 283-292.

251. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 326-330.

252. Doench J.G., Petersen C.P., Sharp P.A. siRNAs can function as miRNAs. // Genes & Dev. 2003. V. 17. P. 438-442.

253. Fischer U., Janicke R.U., Schulze-Osthoff K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. // Cell Death Differ. 2003. V. 10. P. 76-100.

254. Piatt N., da Silva R.P., Gordon S. Recognizing death: the phagocytosis of apoptotic cells. // Trends Cell. Biol. 1998. V. 8. P. 365-372.

255. Asada M., Yamada T., Ichijo H., Delia D., Miyazono K., Fukumuro K., Mizutani S. Apoptosis inhibitory activity of cytoplasmic p21(Cipl/WAFl) in monocytic differentiation. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 1223-1234.

256. Li F., Ackermann E.J., Bennett C.F., Rothermel A.L., Plescia J., Tognin S., Villa A., Marchisio P.C., Altieri D.C. Pleiotropic cell-division defects and apoptosis induced by interference with survivin function. //Nat. Cell. Biol. 1999. V. LP. 461-466.

257. Rossi F., Evstafieva A., Pedrali-Noy G., Gallina A., Milanesi G. HsN3 proteasomal subunit as a target for human immunodeficiency virus type 1 Nef protein. // Virology. 1997. V. 237. P. 33-45.

258. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii T., Igarashi K., Engel J.D., Yamamoto M. Keapl repress nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain.// Genes & Develop. 1999. V. 13. P. 76-86.

259. Ishii T., Itoh K., Takahashi S., Sato H., Yanagawa T., Katoh Y., Bannai S., Yamamoto M. Transcription factor Nrf2 coordinataly regulates a groop of oxidative stress-inducible genes in macrophages. //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 16023-16029.

260. Adams J., Kelso R., Cooley L. The kelch repeat superfamily of proteins: propellers of cell function. // Trends in Cell Biol. 2000. V. 10. P. 17-24.

261. Beamer L.J., Li X., Bottoms C.A., Hannink M. Conserved solvent and side-chain interactions in the 1.35 Angstrom structure of the Kelch domain of Keapl. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2005. V. 61. P. 1335-1342.

262. Hayes J.D., McMahon M. Molecular basis for the contribution of the antioxidant response element to cancer chemoprevention. // Cancer Lett. 2001. V. 174. P. 103-113.

263. Rushmore T.N., Morton M.R., Pickett C.B. The antioxidant responsive element. Activation by oxidative stress and identification of the DNA consensus sequence required for functional activity. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 11632-11639.

264. Xue F. And Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. // Cell. 1993. V. 72. P. 681-693.

265. Kang M.L., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G., Yamamoto M. Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator ofcytoprotectivc phase 2 genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 20462051.

266. Zhang D.D., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keapl-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 8137-8151.

267. Kobayashi M, Yamamoto M Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keapl pathway of antioxidant gene regulation. // Antioxid Redox Signal. 2005. V. 7. P. 385394.

268. Huang H.C., Nguyen T., Pickett C.B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 42769-42774.

269. Cullinan S.B., Zhang D.D., Hannink M., Arvisais E., Kaufman R.J., Diehl J.L. Nrf2 is a direct PERK substrate and effector of PERK-dependent cell survival. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 7198-7209.

270. Alam J., Stewart D., Touchard C., Boinapally S., Choi A.M., Cook J.L. Nrf2, a Cap'n'Collar transcription factor, regulates induction of the geme oxygenase-1 gene. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 26071-26078.

271. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

272. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984.

273. Harlow Е., Lane D. Coupling peptides to carrier proteins using glutaraldehyde. In: Antibodies. A Laboratory Manual. Harlow E., Lane D. (Eds.) 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. P. 78.

274. Fries J., Getrost H. Organic Reagents for Trace Analysis. Ed. Merk. Darmstadt. Germany. 1977. P. 412-413.

275. Hoffmann P.R., deCathelineau A.M., Ogden C.A., Leverrier Y., Bratton D.L., Daleke D.L., Ridley A.J., Fadok V.A., Henson P.M. Phosphatidylserine (PS) induces PS receptor-mediated macropinocytosis and promotes clearance of apoptotic cells.

276. J. Cell. Biol. 2001. V. 155. P. 649-659.

277. Dial R., Sun Z.Y., Freedman S.J. Three conformational states of the p300 CHI domain define its functional properties. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 9937-9945.1. БЛАГОДАРНОСТИ

278. Я хочу выразить глубокую благодарность моим коллегам, которые принимали участие в данной работе.

279. Работа по изучению взаимодействия ПроТа с цитохромом с была проведена совместно с сотрудниками В.П.Скулачева.