Мутационный анализ ядерного белка протимозина а человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

^ А

Московский государственный университет

<ч. имени М. В. Ломоносова

г\. \

Химический факультет

На правах рукописи УДК 547. 963. 32

РУБЦОВ Юрий Петрович

Мутационный анализ ядерного белка протнмозияа а человека

02. 00. 10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Вартапетян А. Б.

доктор химических наук, профессор Лузиков В. Н.

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Тер-Аванесян М. Д.

Центр "Биоинженерия" РАН.

Защита состоится 23 декабря 1997 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053. 03. 47. по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 21 ноября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук1

мирнова И. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протимозин а - это небольшой (-13 кДа) мультикопийный ядерный белок млекопитающих. К настоящему времени получено множество данных, указывающих на участие протимозина а в процессах деления клеток млекопитающих. Так, например, уровень синтеза протимозина а коррелирует с пролиферативным статусом клеток. Протимозин а -жизненно важный белок, так как остановка его синтеза ведет к прекращению деления клеток. Тем не менее, точная функция протимозина а и механизм его действия неизвестны. Первичная структура протимозина а очень необычна: примерно половина всех аминокислотных остатков, образующих этот белок, являются остатками дикарбоновых аминокислот. В состав протимозина а не входят остатки ароматических и серусодержащих аминокислот, белок практически не содержит больших гидрофобных аминокислотных остатков. Эти особенности протимозина а приводят к тому, что а растворе он практически не образует элементов вторичной и третичной структуры.

Как может функционировать белок с такими необычными свойствами, какие структурные элементы, определяющие внутриклеточную локализацию и свойства протимозина а, существуют в его молекуле - вот вопросы, на которые предстояло найти ответы в настоящей работе.

Цель работы. Целью данной работы была идентификация функционально важных участков в белке протимозине а человека с использованием простой и удобной модельной эукариотической системы - клеток дрожжей БассИаготусез сегеу^ягае.

Научная новизна и практическая ценность. В диссертационной работе проведена идентификация функционально важных участков в молекуле ядерного белка протимозина а человека, которые отвечают за подавление этим белком деления клеток дрожжей БассИаготусех сегемЬ1ае. Доказано, что С-концевой фрагмент протимозина а содержит двухчастный сигнал ядерной локализации (МЬБ), обеспечивающий активный транспорт протимозина а в ядро (аминокислотные остатки 87-104). Мутации в этом участке белка делают протимозин а человека неспособным накапливаться в ядре и, вследствие этого, подавлять деление клеток дрожжей.

Обнаружено, что сразу вслед за N1.8 (или перекрываясь с ним) в молекуле протимозина а расположена еще одна функционально важная детерминанта. Точечная мутация ТЬг(105)А1а практически

полностью инактивирует белок, не нарушая при этом ядерного импорта протимозина а.

Помимо этого, из генома человека выделены и охарактеризованы пять новых безынтронных генов протимозина а.

Публикации и апробации работы. По теме диссертации опубликованы пять научных работ. Результаты исследований докладывались на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997) и на 13-м Французско-Российском симпозиуме "Структура и регуляция эукариотических генов" (Монпелье, 1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр. машинописного текста, содержит рисунков, таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему "Импорт белков в ядро", обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящей работе для идентификации участков последовательности протимозина а человека (далее ПроТа), важных для проявления белком своих функций, была использована простая эукариотическая система - почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevlsiae. Такой подход представляется оправданным. Действительно, существует большое сходство в ключевых процессах, протекающих в клетках дрожжей и в клетках млекопитающих, что позволяет успешно изучать функции белков высших эукариот в данной простой системе. Однако работать с клетками дрожжей гораздо проще, поскольку для этого организма имеются хорошо разработаны молекулярно-биологические и генетические методы исследования.

1. Идентификация мутантных форм протимозина а человека, неспособных ингибировать рост клеток дрожжей

Эксперименты по продукции человеческого ПроТа в клетках дрожжей S. cerevisiae, проведенные в нашей лаборатории, показали, что полноразмерный белок ингибирует деление клеток дрожжей. Это обстоятельство послужило основой для создания системы селекции in vivo мутантов ПроТа с измененными свойствами белка. В самом деле, если экспрессировать набор кДНК ПроТа, содержащих всевозможные мутации, в клетках дрожжей, то колонии будут

образовывать только те клоны, которые синтезируют ПроТа, потерявший вследствие мутаций способность подавлять деление дрожжевых клеток. Для продукции мутантного ПроТа в клетках дрожжей белок-кодирующие части кДНК ПроТа, содержащие различные мутации, были встроены в дрожжевой челночный вектор рУеБР 1/8-2 под контроль сильного регулируемого дрожжевого промотора САЫ0-СУС1. Таким образом, транскрипцию генов ПроТа можно включить путем выращивания клеток, трансформированных соответствующими плазмидами, на среде, содержащей индуктор транскрипции - галактозу. Это приведет к продукции в клетках дрожжей ПроТа, содержащего различные мутации. Соответственно, если мутация (или мутации) попала в участок молекулы белка, который не важен для угнетения клеточного деления, то белок остается активным. При этом клетки, продуцирующие такой активный ПроТа, не смогут делиться при культивировании их на среде с галактозой. Если же мутация, попав в функционально важный участок ПроТа, инактивировала белок, то клетки, продуцирующие его, будут нормально делиться и образуют на твердой среде колонии. Секвенировав мутантные гены ПроТа из отобранных таким образом клонов, можно получить информацию о положении и характере мутаций з ПроТа, устраняющих его негативное влияние на деление клеток дрожжей, а, следовательно, и о расположении функционально важных участков в молекуле этого белка. Принцип данного полхода схематически изображен на рис. 1. кДНК ПроТа

ПЦР

Мутации кДНК

1) Дотирование 8 челночныйвягтор

2) Трансформация клеток дрожжей ПроТа

дикого тита

Мутация

инициировала ПроТа сеизеирование

—* кДНК ПроТа

Мутации не попали в важный участок

Чашка с глюкозой Чашка с галактозой

(ПроТане синтезируется) (ПроТа синтезируется)

Рис. 1. Схема получения и отбора мутантных кДНК ПроТа.

Сложность описанного подхода, однако, состоит в следующем. Анализ первичной структуры ПроТа не позволяет выявить аминокислотные остатки, которые нужно было бы мутировать в первую очередь. Поэтому в данной работе был избран путь введения статистических мутаций в кДНК ПроТа (распределенных случайным образом, что не требует никакой исходной информации о структуре и свойствах белка). Статистические мутации в кДНК ПроТа удобнее всего вводить с помощью ПЦР в условиях пониженной точности амплификации 7а<7-полимеразой. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду рНТ15, которая представляет собой вектор pUC19 со встроенной по сайту Smal кДНК ПроТа дикого типа. Праймерами служили олигонуклеотиды, комплементарные участкам последовательности плазмиды pUC19, фланкирующим полилинкер (рис. 2). В результате ПЦР был получен набор фрагментов ДНК длиной около 430 п.н., которые после обработки рестриктазами были встроены в дрожжевой экспрессионный челночный вектор pYeDP 1/8-2 под контроль сильного регулируемого дрожжевого промотора GAL 10-CYCI.

(~350 пл.)

Рис. 2. Схема получения набора мутантных кДНК ПроТа с помощью ПЦР.

Отбор клонов, продуцирующих инактивированный ПроТа, проводили следующим образом. Клетки штамма 2805 5. сегеушае, трансформировать^ смесью плазмид, сначала выращивали на твердой среде, содержащей глюкозу (Рис. 1). Транскрипция генов ПроТа при этом подавлена и вырастают клоны, содержащие как ген ПроТа дикого типа, так и мутантные гены. Образовавшиеся колонии трансформантов переносили на среду с индуктором транскрипции - галактозой. При этом клоны, продуцирующие ПроТа, в котором мутации затронули важные для биологической активности в клетках дрожжей аминокислотные остатки, сохраняют способность расти. Клоны, в которых ПроТа, несмотря на мутации,

ВамiHI

жДНК ПраТа с мушсютос (~43И к. и.)

SlimHl + üoRl

ВатН I

сохранил способность блокировать деление клеток дрожжей, перестают расти и на среде с - индуктором не образуют колоний. Выросшие клоны дрожжей дополнительно проверяли на способность продуцировать полноразмерный ПроТа. В результате проведенного анализа были выявлены 5 дрожжевых клонов. ПроТа, который продуцируют эти клоны неактивен, так как клетки, синтезируя большие количества мутантного ПроТа, сохраняют, тем не менее, способность расти в его присутствии.

Положение и характер аминокислотных замен, нарушающих способность ПроТа блокровать деление клеток дрожжей, определяли путем секвенирования соответствующих кДНК. Выяснилось, что полученные мутанты ПроТа содержат от 2 до 9 аминокислотных замен (табл. 1). При этом количество нуклеотидных замен составляло от 5 до 11 на каждый ген.

Таблица 1. Мутантные формы ПроТа, полученные в данной работе

Первичные мутанты* Проанализированные мутанты**

1. S1P, Ii IV, K14W, К17Е, A38V, E5SG, D93G, KiOIR, К104Е 2. К14Е, E24G, E80G, E9!G, E94G, К101Е 3. E44G, E50G, T105A 4. SIT, N39D, K87E 5. E80G, K.10IR !. SIP, ИIV, K14W, KI7E 2. К14Е, E24G 3. E44G, E50G 4. 'Г 105А 5. SIT 6. К.87Е 7. E80G 8. К101R

Примечания.

* Аминокислотные замены, содержащиеся в мутантах ПроТа, выявленных в

результате отбора в клетках дрожжей.

•"Одиночные и двойные мутанты ПроТа, полученные путем реконструкции кДНК первичных мутантов.

Для того чтобы понять, какие именно аминокислотные замены в идентифицированных мутантных формах ПроТа отвечают за инактивацию белка в клетках дрожжей, необходимо было получить кДНК, кодирующие белки с меньшим числом мутаций и оценить влияние таких белков на деление клеток дрожжей. В кДНК ПроТа содержатся уникальные сайты узнавания рестриктаз АсуI и Ос1еI, положение которых показано на рис. 3. Использование этих внутренних сайтов позволило объединить фрагменты мутантных кДНК ПроТа и фрагменты кДНК, кодирующей белок дикого типа, и получить таким образом гибридные гены, кодирующие белки с меньшим числом аминокислотных замен. Схематично

использованный подход представлен на рис. 3, который иллюстрирует получение кДНК, кодирующих ПроТа с одиночными заменами SIT и К87Е, из кДНК ПроТа дикого типа и кДНК тройного мутанта (SIT, N39D, К.87Е).

Продукция ПроТа Арест деления в дрожжах клеток дрожжей

pGSLU-crei Я™"1 Af?1 Тройной ' .11. .,' »...iiy + -

мутант s1*! h"d К§1Е

Мутант S*T

I

Мутант к"Е 1 ■-' 1 1 " 1 -1— +

Рис. 3. Схема получения точечных мутантов ПроТа и их активность в клетках дрожжей. (Участки кДНК ПроТа, содержащие мутации, заштрихованы. Незаштрихованные участки соответствуют фрагментам кДНК ПроТа дикого типа.)

По аналогичной схеме были получены также кДНК ПроТа, кодирующие белки с одиночными и двойными аминокислотными заменами, а также с множественными мутациями в N-концевой части (SIP, 111V, K14W, К17Е) (см. табл. 1, правая колонка). Мы убедились в том, что полученные мутантные формы ПроТа синтезируются в клетках дрожжей в количествах, соизмеримых с количеством ПроТа дикого типа (рис. 4).

Для количественной оценки влияния отдельных мутаций на активность ПроТа в клетках дрожжей была изучена динамика роста в жидкой среде штаммов, продуцирующих ПроТа с различными мутациями. На среде с глюкозой, когда ген ПроТа не экспрессировался, все типы клеток вырастали одинаково хорошо. В присутствии индуктора транскрипции гена ПроТа - галактозы -картина была принципиально иной (рис. 5). Как и ожидалось, продукция ПроТа дикого типа приводила к сильному подавлению клеточного деления в отличие от клеток, не синтезирующих данный белок. Все мутанты ПроТа, содержащие аминокислотные замены в N-концевой части молекулы, вели себя подобно белку дикого типа, то есть сильно ингибировали деление клеток дрожжей (рис. 5). Мутации, расположенные в С-концевой части молекулы ПроТа, напротив, значительно снижали фенотипический эффект, вызванный продукцией белка. Так, например, одиночные мутации К87Е и Т105А, подобно делеции девяти С-концевых аминокислот, практически полностью инактивировали белок. Клетки дрожжей,

12345678 9

Рис. 4. Электрофоретический анализ частично очищенных мутантных форм ГТроТа, выделенных из клеток дрожжей. Положение ПроТа и тРНК отмечено стрелками. 1 - ПроТа дикого типа; 2 - мутант E80G; 3 - мутант K101R; 4 - мутант E80G, K101R; 5 - мутант Д( 101-109); 6 - мутант К87Е; 7 - мутант E44G, E50G; 8 - мутант Т105А; 9 - мутант SIP, IIIV, K14W, К17Е. 8% ПААГ окрашен метиленовым синим.

продуцирующие такие мутантные формы ПроТа, по способности к делению лишь незначительно уступали клеткам, которые не синтезировали белка (рис. 5). Каждая из мутаций E80G или K101R

оа

600 12 11 10 9 8 7 б 5 4 3 2 1

-•--ПроТа дикого типа -о--мутаит S1P + 111V+K14W+K17E

и мутант SIT -.--мутант E80G+K101R

и мутант KS7E -х—мутант T105A -а--мутант ES0C -ж--мутант K101R -д--мутант E44G+E50G -v—мутант Д(101-109) -▼--нет ПроТа(вектор без вставки)

10 20 30 40 50 60 70

Время роста (час)

Рис. 5. Динамика роста клеток дрожжей, продуцирующих различные формы ПроТа.

снижала активность ПроТа приблизительно вдвое, тогда как мутантный белок, содержащий сразу обе эти замены, практически не угнетал деления клеток. Белок с мутациями Е44С, Е500 был инактивирован по сравнению с ПроТа дикого типа на 50%.

7

Результаты данного анализа суммированы на рис. 6. Как видно, инактивирующие ПроТа мутации сгруппированы в С-концевой половине молекулы.

2. Протнмозин а человека имеет двухчастный сигнал ядерной локализации

Как можно представить себе механизм инактивации ПроТа, вызванной внесением мутаций? На рис. 6 видно, что некоторые из С-концевых мутаций находятся в области предполагаемого ЫЬБ ПроТа (принято считать, что за импорт ПроТа в ядро отвечает блок из остатков лизина |0,ККС)К104 ) и могли бы, теоретически, нарушить импорт данного белка в ядро и, вследствие этого, препятствовать его ингибирующему действию на рост клеток дрожжей. С подобным объяснением не согласуется эффект мутации К87Е, которая

31Р К14Е

Рис. 6. Влияние мутаций в ПроТа на способность этого белка ингибировать деление клеток дрожжей. По оси У показана степень инактивации мутантных форм ПроТа (по сравнению с белком дикого типа). Заштрихованные прямоугольники показывают влияние на свойства белка сразу двух мутаций - Е44СН-Е500 и Е80СН-К10111.

практически полностью инактивирует белок, но удалена от предполагаемого N1,5 ПроТа. Сравнительный анализ С:концевой последовательности ПроТа и N1,5 различных ядерных белков показал, что фрагмент ПроТа, включающий остатки с 87 по 104, очень похож на канонический двухчастный N1-5 нуклеоплазмина (рис. 7). В последовательности ПроТа короткий блок КЯ, состоящий из остатков положительно заряженных аминокислот (остатки 87-88), отделен спейсером из 12 аминокислотных остатков от второго

Е К А

т т т

ПроТа дикого типа: 87KRAAEDDEDDDVDTKKQKT105 N1,5 нуклеоплазмина: 155КР? - спейсерный участок - КККК1_0172

(10 аминокислотных остатков)

Рис. 7. Сравнение последовательности С-концевой части Про Га с N1.8 нуклеоплазмина. Остатки положительно заряженных аминокислот, важных для функционирования ЬГЬБ нуклеоплазмина, и соответствующие им остатки ПроТа выделены жирным шрифтом. ПроТа-инактивирующие мутации отмечены стрелками.

основного блока КК(5К (остатки 101-104), который принято рассматривать как возможный ПроТа. Спейсерный участок не содержит остатков больших гидрофобных аминокислот, то есть данный фрагмент ПроТа теоретически удовлетворяет структурным критериям для двухчастного N1.5. Весьма существенно, что инактивирующие ПроТа мутации попадают в обе части предполагаемого двухчастного N1.5.

Для того, чтобы проверить предположение о влиянии инактивирующих мутаций на импорт ПроТа в ядро и идентифицировать N1.5 этого белка, необходимо определить внутриклеточную локализацию ПроТа дикого типа и его мутантов. С этой целью были сконструированы гибридные гены, кодирующие различные формы ПроТа, слитые с репортерным белком вРР (зеленым флуоресцирующим белком). Схематическое изображение данных конструкций представлено на рис. 8. Полученными плазмидами трансфицировали клег-" человека линии 293 и определяли внутриклеточную локализации слитых белков вРР-ПроТа методом флуоресцентной микроскопии (рис. 9).

вИР в свободном виде был равномерно распределен между ядром и цитоплазмой, в то время как слитый белок вРР-ПроТа дикого типа был локализован исключительно в ядре (рис. 9А). Этот

Рсмуш

рСЕР-С2

рСГР-С2/чЛроТа

рСЕР-С2/К87Е

рСЕР-С2/К10№

рСЕР-С2/Д(101-109)

рОКР-С2Ш.5

СГР

ПроТа

Блоки основных аминокислот

^ I

.Мутацш

Мутадня

Рис. 8. Схема конструкций, которые были использованы для продукции слитых белков ОРР-ПроТа.

АНПВ1

Рис. 9. Локализация гибридных белков ОРР-ПроТа в клетках человека линии 293 методом флуоресцентной микроскопии. А - ПроТа дикого типа; В - мутант Д(101-109); С - мутант К87Е; О - мутант К101Я; Е - С-концевой пептид ПроТа (аминокислотные остатки 82-109).

результат показывает, что ОБР не нарушает способности ПроТа импортироваться в ядро. В отличие от белка дикого типа, ни один из мутантов ПроТа не обеспечивал полностью ядерной локализации в клетке (рис. 9В, С и О). Мутации К87Е и КЮП^ приводили к тому, что слитый с СРР ПроТа, обнаруживался не только в ядре, но и в цитоплазме, хотя ядро, как это видно на рис. 9С и О, флуоресцирует в большинстве клеток ярче, чем цитоплазма. Этот результат согласуется с данными о том, что одиночные мутации в блоках положительно заряженных аминокислот, образующих двухчастные N1.5, лишь частично нарушают их функционирование. Соответственно, делеция 9 С-концевых аминокислотных остатков ПроТа приводит к исключению белка из ядра (рис. 9В), что свидетельствует о полном прекращении импорта белка в ядро вследствие удаления блока остатков лизина.

Таким образом, одиночные мутации К87Е и К101Я, а также делеция 9 С-концевых аминокислот нарушают транспорт ПроТа в ядро клеток человека. Этот результат означает, что для эффективного импорта ПроТа в ядро необходим не только интактный блок С-концевых лизинов (остатки 101-104), которому приписывалась роль МЬБ, но и второй основной блок, включающий остаток Ьуз87. Сравнение С-концевых последовательностей человеческого и крысиного ПроТа показывает, что в спейсерной области, разделяющей эти два блока, допустимы аминокислотные замены. Другими словами, N1^ ПроТа является более протяженным, чем было принято считать, и состоит из двух блоков положительно заряженных аминокислот, раздеденых толерантным к мутациям спейсерным участком. Для идентификации функционального ЫЬБ в последовательности белка требуется доказать, что он не только необходим для импорта в ядро, но и достаточен для накопления в ядре слитого с ним в норме цитоплазматического белка. Чтобы показать, что С-концевой фрагмент ПроТа (аминокислотные остатки 82-109), включающий оба блока положительно заряженных аминокислот, достаточен для импорта белка в ядро, мы слили его с йРР и определили внутриклеточную локализацию полученного белка. На рис. 9Е отчетливо видно, что химерный белок присутствует только в ядре человеческих клеток. Следовательно, С-концевой фрагмент ПроТа, включающий аминокислотные остатки 82-109, не только необходим, но и достаточен для эффективного импорта СИР в ядро, то есть является функциональным М^Б ПроТа.

3. Протимозин а содержит дополнительную функциональную детерминанту, не связанную с импортом этого белка в ядро

Полученные результаты показывают, что способность ПроТа блокировать деление клеток дрожжей коррелирует с его способностью накапливаться в ядре. Для более строгого доказательства выявленной закономерности была определена внутриклеточная локализация ПроТа дикого типа, мутантов ПроТа (К87Е, K101R, Д( 101-109), Т105А) и С-концевого NLS-содержащего пептида (остатки 82-109), слитых с белком GFP, в клетках штамма 2805 5. cerevisiae. С этой целью ген GFP и соответствующие гены ПроТа были встроены в дрожжевой челночный вектор pYeDP 1/8-2. Интактность химерных белков, синтезируемых в клетках дрожжей, была подтверждена их анализом методом гель-электрофореза.

Внутриклеточную локализацию слитых белков GFP-ПроТа, синтезируемых в клетках дрожжей, определяли методом флуоресцентной микроскопии. В свободном виде GFP, как и в человеческих клетках, был равномерно распределен по всей клетке. Слитый белок GFP-ПроТа дикого типа детектировался только в ядре (рис. 10А), тогда как мутации в каждом из основных блоков идентифицированного NLS ПроТа приводили к появлению гибридного белка и в цитоплазме дрожжевых клеток (рис. 10В, С и D). Наиболее выраженный переход флуоресценции из ядра в цитоплазму был отмечен у мутанта К87Е ПроТа (рис. ЮС), тогда как мутанты K101R и Д( 101-109) были ядерно-цитоплазматическими, с преимущественно ядерной локализацией в большинстве клеток (рис. 10В, D). К нашему удивлению, GFP, слитый с С-концевым пептидом ПроТа (остатки 82-109), был равномерно распределен между ядром и цитоплазмой клеток дрожжей (рис. 10Е), в отличие от его исключительно ядерной локализации в клетках человека (рис. 9Е). Данное наблюдение было неожиданным поскольку считается, что механизмы импорта белков в ядро в клетках дрожжей и млекопитающих чрезвычайно похожи. Таким образом, NLS ПроТа является необходимым, но недостаточным для импорта в ядро в клетках дрожжей. В то же время, полноразмерный ПроТа, слитый с GFP, является чисто ядерным в клетках дрожжей, что указывает на существование в аминокислотной последовательности белка дополнительных сигналов, которые отвечают за эффективный импорт ПроТа в ядро клеток дрожжей.

Рис. 10. Локализация гибридных белков GFP-ПроТа в клетках штамма 2805 S. cerevisiae методом флуоресцентной микроскопии*. А - ПроТа дикого типа; В - мутант Д(101-109); С - мутант К.87Е; D -мутант K101R; Е - С-концевой пептид ПроТа (аминокислотные

остатки 82-109); F - Мутант Т105А._

*Аптор признателен А. С. Золотухину и И. А. Воробьеву за помощь в проведении флуоресцентно-микроскопического анализа клеток человека и дрожжей, соответственно.

Таблица 2. Анализ N1.8 ПроТа

Белок Амннокнслотная последовательность Интибироеание Внутриклеточная

деления локализация**

дрожжей*

N15 -1551ЧК-спейсерныйучастсж-ККлКпо— яд

нуклеоплазмина (10 аминокнслотых остатков)

ПроТа человека -АЕЗАТСКИААЕООЕОООУОТККОКТОЕООпсон + яд

82 87 101 109

К87Е _ ** * * * *£* *********** * ******** * ЯД > ЦИТ.

Т105А ^************************'р+*** —

+/- ЯД(Д>

К101И _******************** р* *******

ЯД 2 ЦИТ.

Д(10Ы09) _******************** -

ЦИТ.ТОЯДгиИГ.СД)

N1.5(82-109) **************************** н. о.

ЯД(Ч),ЯД = ИИГ.(Д)

Примечание.

Сравнение аминокислотной последовательности ПроТа (остатки 81-109) с последовательностью двухчастного N1.8 нуклеоплазмина. Остатки лизина и аргинина, важные для функционирования ЫЬБ нуклеоплазмина, и соответствующие им остатки аминокислот ПроТа выделены жирным шрифтом. Ниже приведены соответствующие последовательности исследованных мутантов ПроТа; (*) - остатки аминокислот, идентичные аминокислотной последовательности белка дикого типа; аминокислотные замены показаны соответствующими однобуквенными символами.

* (+) - подавление деления клеток дрожжей, (-) - неспособность белка ингибировать деление, (н.о.) - влияние пептида на деление клеток дрожжей не определялось.

** Внутриклеточная локализация слитых белков ОРР-ПроТа. (ЯД.) - ядерная локализация, (ЦИТ.) - цитоплазматическая локализация; (ч) - локализация в клетках человека, (д) - локализация в клетках дрожжей.

Полученные результаты суммированы в табл. 2. Они свидетельствуют о том, что мутации К87Е, К10111 и Д(101-109), инактивирующие ПроТа, нарушают импорт данного белка в ядро не только человеческих, но и дрожжевых клеток и позволяют заключить, что для проявления ингибирующего действия на деление клеток дрожжей ПроТа должен эффективно накапливаться в ядре.

Как было показано выше, еще одна точечная мутация в ПроТа, а именно, аминокислотная замена Т105А, практически полностью устраняет способность этого белка подавлять деление клеток дрожжей. Эта мутация расположена сразу за протяженным положительно заряженным блоком из остатков лизина (остатки 101-

104), входящим в состав ЫЬБ (табл. 2)._ По аналогии мутациями

К87Е и К101 Я, нарушающими импорт ПроТа в ядро в клетках человека и дрожжей, мы предполагали, что данная одиночная замена также влияет на функционирование двухчастного ЫТБ этого белка. Однако определение локализации вРР, слитого с Т105А мутантом ПроТа, в клетках дрожжей методом флуоресцентной микроскопии показало, что этот белок является полностью ядерным (рис. ЮР). Таким образом, инактивация ПроТа в этом случае не связана с нарушением импорта белка в ядро. Следовательно, остаток ТЬг! 05 входит в функционально важный участок белка, который ' может непосредственно отвечать за способность ПроТа подавлять деление клеток дрожжей. Этот участок расположен вблизи МБ или даже перекрывается с ним.

Подводя итог, следует подчеркнуть, что в настоящей работе удалось идентифицировать два типа мутаций, устраняющих ингибирующее влияние ПроТа на деление клеток дрожжей. Мутации первого типа связаны с нарушением импорта белка в ядро, а музации второго гипа затрагивают ингибирующую активность белка, не отражаясь на его внутриклеточной локализации.

4. Новые бсзыптроннме гены протнмозниа а

В геноме человека идентифицирован уникальный функциональный интронированный ген ПроТа, а также несколько безынтронных генов, транскрипты которых обнаружить не удалось. Анализ нуклеотидной последовательности безынтронных представителей семейства генов ПроТа показал, что они, гем не менее, содержат набор регуляторных элементов, способных, в принципе, обеспечить их транскрипцию и трансляцию соответствующих транскриптов.

В данной работе была предпринята попытка понят!,, ограничивается ли семейство генов ПроТа уже обнаруженными членами. В случае идентификации новых генов ПроТа представлялось интересным выяснить, не попадают ли аминокислотные замены, содержащиеся в их гипотетических белковых продуктах, в те области, которые, как было показано, являются функционально важными для ПроТа.

Мы сосредоточились на анализе безынтронных генов ПроТа. Для выделения таких генов из суммарной ДНК человека, был

использован подход с применением ПЦР и праймеров, соответствующих участкам кДНК ПроТа, кодирующим И- и С-концевые участки этого белка. С помощью ПЦР на геномной ДНК человека был получен набор фрагментов ДНК длиной около 330 п.н. Интронированный ген ПроТа, размер которого превышает 5 т.п.н., в данных условиях не амплифицировался.

Полученные фрагменты ДНК были клонированы и для пяти произвольно отобранных клонов была определена полная нуклеотидная последовательность амплифицированных фрагментов. Оказалось, что нам удалось идентифицировать пять новых безынтронных генов ПроТа. Об этом свидетельствовала высокая гомология (более 90% идентичности) нуклеотидных последовательностей выделенных генов с к ДНК ПроТа. В то же время, все они достоверно отличались друг от друга и от безынтронных генов ПроТа, первичная структура которых была установлена ранее.

Анализ суммарной РНК из клеток печени человека с помощью обратной транскрипции и ПЦР выявил присутствие транскриптов, соответствующих только интронированному гену ПроТа, но не безынтронным генам. Этот результат может означать, что либо безынтронные гены являются процессированными псевдогенами, либо их транскрипция крайне низка или тканеспецифична. Если эти гены все-таки активны, то что можно сказать о внутриклеточной локализации их гипотетических продуктов?

Исходя из нуклеотидных последовательностей обнаруженных генов, была выведена аминокислотная последовательность белков, которые они могли бы кодировать (рис. 11). Гипотетический белковый продукт только одного гена - рУШ - может иметь длину 109 аминокислотных остатков, совпадающую с размером единственного известного ПроТа, хотя и отличается от последнего шестью аминокислотными заменами. Продукты двух других генов, рУШ и рУШ, незначительно отличаются по длине от полноразмерного ПроТа, так как содержат инсерции или делеции триплетов. Гипотетические белковые продукты генов рУШ и рУШ подверглись наиболее драматическим изменениям. Сдвиг рамки считывания в результате, соответственно, инсерции и делеции одного нуклеотида в этих генах привел к преждевременной терминации трансляции. Вследствие этого продукты рУУ1 и рУШ

могут иметь -- длину 50 и 72 аминокислотных остатков, соответственно (рис. 11).

. Из трех гипотетических полноразмерных белков, кодируемых идентифицированными генами, два содержат аминокислотные замены, попадающие в область \:1_Б ПроТа. В продукте гена рУЪ'2 мутация К101<3 расположена во втором основном блоке, образующем ЫЬБ, а в продукте гена рУШ мутации затрагивают сразу оба блока основных аминокислот в С-концевой области белка (Я88(5, К101 Я). Следовательно, если бы гены рУ1Л-4 экспрессировались в клетках человека, то белки, кодируемые ими, не были бы ядерными.

10 20 30

ПроТа 3 0 А А V Р Т г Э Е I т Т К 0 ь к Е К к Е V V Е Е А Е N я

рут т э э Е I т т Е 0 ь в Е К к Е V V г А А £ N б а

рП2 т> 5 в Е I т т К э ь к с К к Е V V г г д г N С а

г';":; т 3 3 3 I г А к 0 3 Е к к Е V 7 к С А К. N 3

О I и т 3 3 ; 7 т К 0 3 к Е к Л Е У 7 Е ~ А г N з ч

РУЗЕ 3 2 : 7 т к С к к Л у £ Е А [I Я

4 С 0

"¡роТа 3 Л р А N 3 ^ А ь; £ и 3 £ -2 А 3 N Е V С £ £ Е г, з

ои 1 3 А Л N з N А г 3 Г,' р 0 к к 3 г м ;<

\>п? 3 .Л р Л N Л А 3 ¡г г: с £ р ■с А 0 N Е 0 Е Н; 3 Е 3 3

3 А р Л. "] .А £ 2 к с Е 0 А 0 м 0 К 7 £ 3 .3 т

с / ; 3 А. А. - - - - е £ N 3 з Е А. II Е £ ^

о у г 5 3 А г \ 3 А N к N с 3 0 А 3 И Е 7 3 £ 7 1Г 13 3

то 30

ИрсТа 3 з 3 3 3 Е 3 3 3 3 з 3 3 с 3 3 3 0 - Е - - - А Е 3 А Т 3 К

р и ¿. 3 з 3 г £ 3 - ^ 3 з 3 Е 3 о 3 3 3 3 Е Е - - - А 3 3 А Г 3 К

рТОЗ Е Е Е £ Е Е Е 3 0 в Е г Е 0 с Р Е 0 Е Е Э Е Е А Е Э А Т С К

рУЦ4 Е Е Е £ Е Е Е в Е с Е Е Е в я к

рУи5 Е Е Е А Г Е Е Е Е с э й Е Е Е 0 с 0 Е Е - - - А Е Ь Д I С К

ТрсТа Г< , Л 0 3 ^ ^ Т к к к л 3 3

оУГ12 Я А А Е О Е 0 0 0 V Т 0 к 0

ргиЗ А А с- 3 0 Е 3 3 3 7 'Г я к ^

р I1 и 5 й А А Е 0 0 з э 3 3 7' Л к 3 <

Рис. П. Сравнение аминокислотных последовательностей

гипотетических белковых продуктов безынтронных генов с

последовательностью ПроТа, кодируемого интронированным геном. Стрелки - последовательности, соответствующие праймерам. (-) - делеции.

выводы

1. Разработана система селекции in vivo мутантов протимозина а с измененными свойствами белка. С помощью этой системы идентифицирован ряд точечных мутантов протимозина а человека, утративших способность подавлять деление клеток дрожжей.

2. В С-концевой области протимозина а человека идентифицирован двухчастный сигнал ядерной локализации, обеспечивающий направленный транспорт белка в ядро в клетках человека.

3. Мутации, нарушающие сигнал ядерной локализации протимозина а,, препятствуют активному транспорту белка в ядро клеток дрожжей и ингибированию деления клеток дрожжей протимозином а человека.

4. В аминокислотной последовательности протимозина а человека идентифицирована функционально важная детерминанта, расположенная вблизи сигнала ядерной локализации белка. Мутация в этой области инактивирует протимозин ос, не нарушая его транспорта в ядро.

5. Амплифицированы, клонированы и секвенированы пять новых безынтронных представителей семейства генов протимозина а человека.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Рубцов ЕО. П., Вартапетян А. Б. (1995) Новые безынтронные члены семейства генов протимозина ос человека. Молекулярная биология 29,1320-1325.

2. Pavlov N., Evstafieva A., Rubtsov Y., Vartapetian A. (1995) Human prothymosin a inhibits division of yeast Saccharomyces cerevisiae cells, while its mutant lacking nuclear [ocaiization signal does not. FEBS Lett. 366,43-45.

3. Rubtsov Y., Vartapetian A. (1996) Lysine-87 is a functionally important residue in human prothymosin a. FEBS Lett. 397,215-218.

4. Rubtsov Y. P., Zolotukhin A. S., Vorobjev I. A., Chichkova N. V., Pavlov N. A., Karger E. M., Evstafieva A. G., Felber В. K., Vartapetian A. B. (1997) Mutational analysis of human prothymosin a reveals a bipartite nuclear localization signal. FEBS Lett. 413, 135-141.

5. Рубцов Ю. П., Воробьев И. А., Золотухин А. С., Чичкова Н. В., Павлов H. А., Каргер Е. М., Евстафьева А. Г., Вартапетян А. Б. Идентификация сигнала ядерной локализации белка протимозина а. II съезд биохимического общества РАН (тезисы). Москва, 1997 г., ч. I, стр. 132-133.