Экспрессия гена протимозина а человека вдрожжах Saccharomyces cerevisiae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

-' ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.963.32

ПАВЛОВ Николай Александрович

Экспрессия гена протимозина а человека в дрожжах 8асс1ки-отусе$ сетехтае

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Вартапетян А. Б.

кандидат химических наук Евстафьева А. Г.

доктор химических наук Лузиков В.Н.

доктор биологических наук Аграновский А. А.

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия » РАН.

Защита состоится 2 В октября 1997 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 24 сентября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протимозин а - это небольшой (12 кДа) высококонсервативный белок, имеющий необычную структуру неупорядоченного клубка и, по-видимому, играющий важную роль в процессах клеточной жизнедеятельности. Протимозин а является ядерным белком. Многочисленные данные свидетельствуют об участии этого белка в пролиферации клеток. Так, клетки с нарушенным синтезом гтротимозгага а приостанавливают свое деление до тех пор, пока его продукция не восстанавливается. В то же время, транскрипция гена протимозина а, а также синтез самого белка наиболее интенсивны в активно делящихся клетках.

Несмотря на пристальный интерес к протимозину а, на сегодняшний день не существует достоверных данных относительно его функции и механизма действия. Во многом это связано со сложностью экспериментальной работы с клетками млекопитающих, являющихся до настоящего времени единственной биологической системой, в которой изучался протимозин а.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение свойств протимозина а человека при его синтезе в простой и удобной модельной эукариотической системе: в клетках дрожжей Яасскаготусск

Научная новизна и практическая ценность работы. В диссертационной работе показано, что протимозин а человека, продуцируемый в клетках дрожжей Saccha.rom.yces сеге\ч$1ае, подавляет их деление. Он делает это, вмешиваясь в процессы, происходящие в клеточном ядре. Экспериментально продемонстрировано, что 9 С-концевых аминокислотных остатков этого белка содержат сигнал ядерной локализации. Удаление этого участка белка приводит к неспособности протимозина а человека транспортироваться в ядро и подавлять деление дрожжевых клеток.

В работе также исследовано влияние, которое этот белок оказывает на транскрипцию в клетках дрожжей Басскаготусея ссгех'тае. Полученные при этом результаты позволяют сделать следующие выводы:

1) Протимозин а в свободном состоянии не оказывает заметного влияния на транскрипцию с дрожжевого репортерного промотора.

2) Протимозин а человека, слитый с ДНК-связывающим доменом активатора транскрипции Оа14, подавляет транскрипцию репортерного гена в клетках дрожжей Басскаготусев сеге\>1з1ае, при этом не препятствуя узнаванию регуляторного сигнала промотора.

Показано, что при разделении протимозина а и ДНК-связывающего домена Са14 белковым спейсером протимозин а перестает ингибировать работу активатора. Этот результат практически значим, поскольку делает возможным проводить поиск молекулярных партнеров протимозина а с помощью двугибридной системы.

Публикации и апробации работы. По теме диссертации опубликованы четыре печатные работы. Результаты исследований докладывались на I Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению «Белковая инженерия» (Москва, 1994), на II съезде биохимического общества российской академии наук (Москва, 1997), на 13-м Французско-Российском симпозиуме «Структура и регуляция эукариотических генов» (Монпелье, 1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 12О стр. машинописного текста, содержит рисунков, ¿. таблициДиссертация состоит из введения, обзора литературы на тему «Молекулярная биология протимозина а», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К настоящему времени накопилось много данных, указывающих на участие протимозина а в процессах деления клеток млекопитающих. Однако, несмотря на обилие информации, остается неясным, каковы именно функция и механизм действия протимозина а. Такое положение вещей во многом объясняется сложностью экспериментальной работы с клетками млекопитающих.

Пожалуй, наиболее перспективной в плане возможностей молекулярно-биологического эксперимента . эукариотической системой являются почкующиеся дрожжи 8асс1шготусех сегычлчае. Одной из важных

особенностей данного одноклеточного организма является большое сходство ключевых процессов, протекающих в его клетках и в клетках млекопитающих, что делает возможным изучение функций белков млекопитающих, продуцируемых в этой простой системе. Ранее в нашей лаборатории из клеток S. cerevisiae был выделен белок, чья триптическая пептидная карта оказалась весьма похожей на триптическую карту протимозина а высших эукариот. Это позволило предположить, что в дрожжах существует аналог протимозина а. Поскольку соответствующий ген пока не был обнаружен, в настоящей работе был использован альтернативный подход: исследование свойств протимозина а человека (в дальнейшем ЧпТа) при его продукции в клетках S. cerevisiae.

Мы предполагали, что ЧпТа, продуцируемый в клетках дрожжей, будет тем или иным образом интерферировать со своим дрожжевым аналогом, что, в свою очередь, позволит изучать клеточную функцию этого необычного белка.

В настоящей работе выявлено и изучено ингибирующее влияние ЧпТа на рост культуры дрожжевых клеток, связь такого влияния и ядерной локализации белка. Также fia примере модельного дрожжевого промотора исследована способность ЧпТа оказывать влияние на транскрипцию в клетках дрожжей.

1. Протм.мозин а человека, продуцируемый в дрожжевых клетках, ингибирует их рост.

Наблюдая за изменениями фенотипа клеток, продуцирующих экзогенный

белок, можно попытаться судить о природе тех клеточных процессов, в которых он участвует. Однако существует опасность, что рекомбинантный белок окажется вредным для клеток и фенотип таких клеток окажется летальным. Решением проблемы является использование для синтеза изучаемого белка регулируемого промотора. Именно такая тактика была выбрана при исследовании экспрессии гена ЧпТа в клетках дрожжей.

В нашей лаборатории на основе дрожжевого челночного вектора pYeDPl/8-2 была получена илазмида рУеНТ1, в которой под контролем регулируемого дрожжевого GAL10-CYC1 промотора находится кДНК ЧпТа. Было показано, что в присутствии индуктора транскрипции, галактозы,

дрожжевые клетки, трансформированные этой плазмидой, синтезируют ЧпТа.

В данной работе было исследовано влияние протимозина а на динамику роста культуры таких клеток. На рисунке 1 представлена зависимость оптической плотности Dioo культуры клеток штамма S. cerevisiae 2805/pYeHTl от времени, прошедшего после индукции синтеза протимозина а.

1*1

Рисунок 1. Кривые роста культур дрожжевых клеток штамма 2805 в присутствии галактозы. 1, 2, 3 и 4- клетки, трансформированные плазмидами рУеНТ! (кодирует ЧпТа), рУеНТЗ (направляет синтез мРНК протимозина а с нарушенным кодоном инициации трансляции), рУеБР 1/8-2 (вектор без вставки) и рУеНТХУК (кодирует ЧпТа, укороченный с С-конца), соответственно.

Выяснилось, что деление клеток, продуцирующих ЧпТа (рисунок 1, кривая 1), сильно подавлено по сравнению с делением контрольных клеток, трансформированных вектором без вставки (кривая 3). Клетки,

продуцирующие ЧпТа, долгое время не растут вовсе, и лишь после 96-часовой задержки наблюдается некоторое увеличение титра клеточной культуры. Ингибирование роста обусловлено синтезом рекомбинантного белка, а не его мРНК, поскольку клетки, несущие плазмиду рУеНТЗ, которая отличается от рУеНТ1 делецией А в инициаторном АТО-кодоне кДНК ЧпТа и, следовательно, не способна направлять синтез ЧпТа, сохраняют способность к нормальному делению (рисунок 1, кривая 2).

Клетки, которые преодолевают блок деления на поздних стадиях инкубации клеточной культуры в присутствии индуктора - это, по-видимому, те немногие, которые тем или иным способом утратили возможность синтезировать ЧпТа. Это было показано с помощью выделения ЧпТа из таких клеток и контрольных клеток 2805/рУеНТ1, выращенных на среде без индуктора и лишь после этого проиндуцированных. Оказалось, что, в отличие от контрольных клеток, клетки, выросшие на среде с галактозой, не содержат детектируемых количеств ЧпТа. Как происходит потеря способности синтеза белка? На рисунке 2 приведен радиоавтограф блог-гибридизации по Саузерну суммарной дрожжевой ДИК. выделенной из клеток сеге\'Ыае штамма 2805, содержащих плазмиду рУеНТ1 либо рУеИТЗ, с зондом '"Р-кДНК ЧпТа. После индукции количество к ДНК ЧпТа в клетках, продуцирующих Чп'Га (рис 2, дорожка 3), значительно уменьшается по сравнению с клетками, которые синтезируют РНК, соответствующую ЧпТа, но не сам белок (рис 2, дорожка 4). Возможно, что происходит либо уменьшение копийности плазмиды рУеНТ1, либо обусловленное рекомбинационными процессами удаление того ее участка, который содержит кДПК ЧпТа. Такие процессы описаны в литературе; в частности, при продукции в дрожжевых клетках гистона Н1 морского ежа происходила утрата способности синтезировать экзогенный белок в клетках, сохранивших способность к делению (МПоэЬеу а1., 1984).

Для изучения влияния количества ЧпТа, продуцируемого в дрожжевых клетках, на их деление, был выбран штамм 51. сегехча'ше Т334, в котором силу ОАЬ10-СУС 1 промотора можно ступенчато регулировать. Активность ОАЫО-СУС1 промотора в данных клетках тем больше, чем выше концентрация галактозы в культуральной среде. Соответственно, в таких клетках количество

5

А Б

12 12

Рисунок 2. Блот-гибридизация суммарной дрожжевой ДНК. А- клетки, выросшие на среде без индуктора, Б- с индуктором. Дорожки 1 и 2 соогветствуют клеткам, трансформированным плазмидами рУеНТ1 и рУеНТЗ, соответственно. Зонд. - 32Р-кДНК ЧпТа.

ЧпТа увеличивается при увеличении концентрации галактозы, что было прямо показано путем выделения рекомбинантного белка. На рисунке 3 приведены кривые роста клеток штамма Т334, трансформированного плазмидой рУеНТ 1, культивируемых при различных концентрациях галактозы. Как видно из рисунка, при уменьшении активности промотора ингибирующее влияние ЧпТа ослабевает. Таким образом, способность ЧпТа к угнетению роста дрожжевых клеток является дозо-зависимой.

Погибают ли клетки, продуцирующие ЧпТа? Для ответа на этот вопрос был поставлен следующий эксперимент. Клетки £ сегеушае штамма 8КУ594, несущие в себе плазмиду рУеНТ1, в течение 4 дней инкубировались в среде, содержащей галактозу. За это время не происходило заметного увеличения клеточной плотности. Часть клеток была отобрана, отмыта от индуктора и

Рисунок 3. Кривые роста дрожжевых клеток штамма Т334, трансформированных плазмидой рУеНТ1. Кривые 1, 2 и 3 соответствуют клеткам, культивируемым в среде с 2%, 0,2% и 0,06% содержанием галактозы,

4- клеткам, растущим в среде без индуктора.

перенесена на чашку, содержащую в качестве источника углерода глюкозу вместо галактозы. В таких условиях (когда САЫ0-СУС1 промотор выключен и ЧпТсх не синтезируется), клетки начали интенсивно делиться, что привело к образованию колоний. В качестве контроля на такую же чашку было посеяно равное количество клеток, культивируемых в отсутстие индуктора. Количество колоний (то есть количество жизнеспособных клеток) оказалось одинаковым по порядку величины в обоих случаях. В дальнейшем клетки,

выросшие на чашке, культивировались в глюкозо-содержащей среде до плотности Deoo 1 о.е./мл. После индукции галактозой из них был выделен протимозин а. Это доказывает, что выросшие на среде без индуктора клетки не дефектны в способности продуцировать ЧпТа. Следовательно, при синтезе в дрожжевой клетке ЧпТа не вызывает ее гибели, а лишь останавливает ее деление.

По нашему предположению, блокирование деления дрожжевых клеток связано с природной функцией протимозина а. В таком случае возникает очевидный вопрос: где именно в клетке протимозин а может осуществлять свою функцию, a также в каких клеточных процессах он принимает участие? Исходя из этого и строится логика дальнейших исследований.

2. Протимозин а человека, лишенный 9 С-концевых аминокислотных остатков, теряет способность подавлять деление дрожжевых клеток.

Тот факт, что протимозин а млекопитающих является ядерным белком, дает основания ожидать, что и продуцируемый в дрожжевых клетках, этот белок может иметь ядерную локализацию. Возможно, что и нарушение деления клеток, синтезирующих ЧпТа, объясняется его вмешательством именно в ядерные процессы дрожжевой клетки. Ядерные белки, как правило, содержат цис-элемент, называемый сигналом ядерной локализации (NLS), обеспечивающий активный транспорт этих белков в клеточное ядро. Из литературных данных известно, что NLS ЧпТа находится на С-концевой половине молекулы, и что протимозин а млекопитающих, лишенный 22 С-концевых аминокислотных остатков., перестает транспортироваться в ядро при его микроинъекции в ооциты X. laevis (Watts et al., 1989). Вблизи С-конца ЧпТа (аминокислотные остатки 101-104) находится аминокислотная последовательность KKQK

(рисунок 4), напоминающая NLS Т антигена вируса SV40. В ряде работ было высказано предположение, что именно эта последовательность отвечает за транспорт протимозина а в ядро, однако доказано это не было. Мы предполагали, что если это

действительно так, то ЧпТа с делецией С-концевой области не должен поступать в ядро, его воздействие на ядерные процессы будет блокировано, и, если наша гипотеза правильна, деление дрожжевых клеток не должно быть нарушено.

1 25

АсБ И А А V О т 3 Э Е I Т Т К О Ь К Е К К Е V V Е Е

26 50

А Е N б к О А Р А N с N А N Е Е N в Е 0 Е А Э N Е

51 75

V Б Е Е Е Е Е в С Е Е Е Е Е Е Е Е в V в Е Е Е Ю й

76 100

Б Е 0 Е Е А Е Б А Т в К Л А А Е О Б Е 0 Б О V Б т

101 109

к к 0 К Т О Е О И

Рисунок 4. Аминокислотная последовательность протимозина а человека. Жирным шрифтом выделен предполагаемый КЬБ.

Плазмнда, позволяющая продуцировать в дрожжевых клетках укороченный с С-конца ЧпТа. была получена по следующей схеме. Фрагмент ДНК, соответствующей ЧпТа без 9 С-концевых аминокислотных остатков, был получен методом ГЩР (рисунок 5). Для этого в качестве праймеров использовались 20-членный олигонуклеотид, соответствующий Х-концевой части ЧпТа, и 21-членный олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 288-303 смысловой цепи кДНК ЧпТа и несущий на -конце последовательность, комплементарную стоп-кодону илв. В качестве матрицы использовалась содержащая кДНК ЧпТа плазмида рНТ15 (Бл^аПеуа й а1.. 1995). Продукт ПЦР длиной 306 нуклеотидных остатков был встроен в плазмиду р11С19 по сайту рестриктазы Бт<А. В результате была получена плазмида рКНТ31.

Структура кДНК укороченного ЧпТа была подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Далее малый фрагмент ВатШКрп! плазмиды рКНТ31, содержащий укороченную кДНК ЧпТа, был переклонирован в дрожжевой

челночный вектор рУеОР 1/8-2. В итоге была получена плазмида рУеНТ\УК. Плазмидой рУеНТ\УК были трансформированы клетки 5. сегЫъ'ше штамма

кднк пта

к к к

АДСААССАСАДС,

ш

пцн

ЧАС

303

Рисунок 5. Сайт-специфический мутагенез кДНК ЧпТа с помощью метода ПЦР.

2805. Из таких клеток, проиндуцированных галактозой при клеточной плотности 2x107 кл/мл, бьш выделен укороченный ЧпТа, отличающийся от полноразмерного белка электрофоретической подвижностью в ПААГ (рисунок 6). Количество укороченного ЧпТа, нарабатываемое в дрожжевой клетке, сравнимо с количеством ЧпТа дикого типа и составляет приблизительно 1 мкг на 107 клеток.

Как видно из рисунка 1, клетки, в присутствии индуктора продуцирующие укороченный вариант протимозина а (кривая 4), не проявляют заметного замедления роста по сравнению с контрольными, содержащими вектор без вставки ( кривая 3). Таким образом, как мы и ожидали, удаление 9 С-концевых аминокислотных остатков ЧпТа привело к восстановлению нормального роста продуцирующих его дрожжевых клеток. Это говорит о специфичности эффекта подавления роста культуры дрожжевых клеток ЧпТа. Действительно, делеция С-концевой области ЧпТа не изменяет существенно его аминокислотного состава. Следовательно, ингибирование деления клеток

нельзя объяснить тем, что что большой избыток сильнокислого белка токсичен для клетки. ""

1 2 3

Рисунок 6. Электрофоре гический анализ частично очищенного ЧпТа, выделенного из дрожжевых клеток, содержащих нлазмиды pYeHTl (1 дорожка) и pYeHTWK (2 дорожка), после их индукции. Па 3 дорожку нанесен препарат рекомбинангного проти.мозина ex. выделенного из клеток Е. culi. Электрофорез проводился в 8 % 11ААГ, содержащем 7 М мочевину. Гель окрашивали метиленовым синим.

Для того, чтобы выяснить, где в дрожжевых клетках накапливаются полноразмерный и укороченный варианты ЧпТа, мы решили прибегнуть к новейшему методу определения локализации белков. Метод основан на применении в качестве репортера GFP- зеленого флуоресцирующего белка из медузы Aequorca victoria. GFP характеризует спектр возбуждения флуоресценции с максимумами при 395 нм и 475 нм и спектр испускания с максимумом при 508 нм. Этот белок замечателен тем, что для своего функционирования он не требует никаких кофакторов и способен флуоресцировать при синтезе в самых различных организмах. Продуцируемый

в клетке в свободном состоянии, GFP равномерно распределен по всей клетке (за счет диффузии сквозь ядерные поры), однако, будучи слитым с исследуемым белком, "повинуется" его сигналам внутриклеточного транспорта.

Ю.П. Рубцовым в нашей лаборатории была получена плазмида pYeLGFP/prot а, продуцирующая в дрожжах химерный белок, состоящий из GFP и полноразмерного протимозина а человека. В настоящей работе была сконструирована плазмида pYeGWK , в которой под контролем GAL10-CYC1 промотора находится ген, кодирующий GFP, слитый с ЧпТа, лишенным 9 С-концевых остатков. Для этого кДЖ укороченного ЧпТа была переклонирована из плазмиды рКНТЗ! в плазмиду pYeLGFP, способную направлять синтез GFP в дрожжевых клетках. Плазмидами pYeLGFP, pYeLGFP/prota и pYeGWK были трансформированы дрожжевые клетки штамма 2805. Были получены экстракты из клеток, выращенных в присутствии индуктора. Флуориметрия белковых экстрактов выявила характерный для GFP спектр флуоресценции с максимумом испускания при 508 нм, причем флуоресценция экстрактов из клеток, продуцирующих оба гибридных белка оказалась на порядок выше, чем у экстракта из клеток, синтезирующих GFP. Этот результат может объясняться, например, повышенной устойчивостью химерных белков или увеличением интенсивности флуоресценции за счет изменения структуры GFP, связанного с ЧпТа. С помощью электрофоретического анализа белковых экстрактов было показано, что слитые белки, состоящие из GFP и обоих вариантов ЧпТа, синтезируемые в клетках, имеют молекулярную массу, соответствующую расчетной.

Исследование клеток, продуцирующих химерные белки, проводилось с

*

помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 7). Отчетливо видно, что слитый с GFP ЧпТа дикого типа накапливается в ядре, тогда как для

укороченного варианта ЧпТа характерна ядерно-цитоплазматическая

j ' —- —— —

Автор благодарит H.A. Воробьева (НИИ ф/х биологии МГУ им. Белозерского) за помощь в определении внутриклеточной локализации белков методом флуоресцентной микроскопии.

А Б В

Рисунок 7. Флуоресцентная микроскопия дрожжевых клеток, продуцирующих с;рр, слитый с протимозином а дикого типа (Л) и с мутактным белком (Б), а также вРР в свободном состоянии (В).

локализация. Из этих наблюдений следуют два важных вывода. Во-первых, присоединение вРР не меняет внутриклеточной локализации протимозина а. Во-вторых, удаление С-концевого фрагмента белка нарушает импорт протимозина а в ядро.

Полученные результаты служат доказательством того, что 9 С-концевых аминокислотных остатков протимозина а человека содержат сигнал ядерного транспорта или, по крайней мере, его часть. При изменении локализации ЧпТа в дрожжевых клетках с ядерной на ядерно-цитоплазматическую этот белок теряет способность подавлять клеточный рост. Следовательно, можно с большой долей уверенности утверждать, что клеточная мишень протимозина а человека находится именно в ядре дрожжевой клетки.

3. Протимозии а человека не оказывает существенного влияния на активность репортерного промотора в клетках дрожжей.

Из спектра внутриядерных клеточных процессов, в которых может принимать участие протимозин а, особого внимания заслуживает транскрипция. Действительно, протимозин а - кислый белок и этим напоминает активационные домены многих эукариотических активаторов транскрипции, таких, как дрожжевые белки Gal4, Gcn4 или Gcrl . Кроме того, элементы транскрипционного аппарата дрожжей и млекопитающих проявляют большое сходство, что могло бы позволить ЧпТа конкурировать со своим дрожжевым аналогом (например, связывая какой-либо транскрипционный фактор), не обладая, однако, при этом всеми свойствами, необходимыми в данной системе, и, таким образом, нарушая ее нормальную работу. Мы решили выяснить, способен ли протимозин а человека влиять на транскрипцию в дрожжевой клетке. Для этого мы воспользовались конструкцией, содержащей ген Р-галактозидазы, находящийся под контролем дрожжевого промотора GAL10, в дальнейшем называемого нами репортерным. Общим свойством эукариотических промоторов является наличие в них UAS (upstream activating sequence) - элементов, служащих местом связывания специальных белков, активаторов транскрипции. В случае GAL10 промотора таким активатором служит белок Gal4. В составе данного активатора можно выделить ДНК-связывающий (BD) и активирующий (AD) домены, необходимые и достаточные для его функционирования.

Для изучения воздействия ЧпТа на транскрипцию в дрожжевой клетке нами были проведены три различных эксперимента, сходных по сути и различающихся используемыми репортерной конструкцией и типом активатора транскрипции. В первом из них мы продуцировали ЧпТа в клетках S. cerevisiae штамма Y153, содержащих интегрированный в хромосому ген Р-галактозидазы E.coli, находящийся под контролем дрожжевого GAL10 промотора. Р-галактозидазная активность препарата суммарных белковых экстрактов, выделенных из этих клеток, позволяет судить об эффективности транскрипции с данного промотора. Клетки штамма Y153 мутантны по Gal4,

14

поэтому для наблюдения за активированным уровнем транскрипции мы трансформировали их плазмидой pGN3, продуцирующей искусственный активатор транскрипции, состоящий из ДНК-связывающего и активирующего доменов GaM.

Нами была получена плазмида pPG5, несущая кДНК ЧпТа под контролем сильного дрожжевого промотора ADHT. Дрожжевые клетки трансформировались одновременно двумя плазмидами, pPGS и pGN3, либо pGAD424, синтезирующей активирующий домен Gal4, и pGN3. Последний вариант использовался нами в качестве контроля. Клетки, содержащие плазмиды pPG5 и pGN3, продуцируют ЧпТа, что было доказано выделением из них этого белка. Из таких клеток и контрольных клеток были выделены суммарные белковые экстракты. Величина Р-галактозидазной активности в обоих случаях оказалась приблизительно равной 50 U. Следовательно, ЧпТа не влияет на активность промотора в данной системе.

Результаты двух других экспериментов подтверждают такое заключение. В одном из них в качестве репортера использовался ген Р-галактозидазы, находящийся на плазмиде pJKlOl под контролем GALIO промотора. Эксперимент проводился в клетках штамма EGY48, не несущих мутации по Gal4, поэтому активатором в этом случае являлся эндогенный белок. Синтез ЧпТа направлялся плазмидой pGBTprotal, включающей в себя кДНК ЧпТа, контролируемую ADHI промотором. Для проведения контрольного эксперимента использовалась плазмида pGBTASPH, аналогичная плазмиде pGBTprotal, но не кодирующая ЧпТа. Дрожжевые клетки трансформировались одновременно двумя плазмидами, pJKlOl и pGBTprotal, либо pJKlOl и pGBTASPH. Среднее значение Р-галактозидазной активности экстрактов, выделенных из клеток, продуцирующих ЧпТа, оказалось равным 1360 U, тогда как для экстрактов из контрольных клеток оно составило 1850 U.

В следующем эксперименте в качестве репортерной использовалась плазмида pSH18-34, несущая ген Р-галактозидазы и промотор, в котором функцию UAS осуществляет кластер из 8 LexA операторов. Здесь активатором транскрипции являлся Gal4, слитый с белком LexA, кодируемый плазмидой

pSH17-4. ЧпТа синтезировался с плазмиды pGBTprotal. М трансформировали клетки штамма EGY48 либо тремя плазмидами, pSH18-3' pSH17-4 и pGBTprotal, либо двумя,- pSH18-34 и pSH17-4. В этом случг среднее значение р-галактозидазной активности для экстрактов, выделенных i клеток, синтезирующих ЧпТа, оказалось равным 3070 U, для экстрактов i контрольных клеток- 1900 U.

В описанных выше экспериментах мы наблюдали незначительное (меш двух раз) изменение транскрипционной активности репортерного промотора присутствии ЧпТа. Более того, в одном случае она уменьшалась, в друго случае - увеличивалась. В целом, приведенные данные позволяют сделан вывод, что протимозин a человека, продуцируемый в клетках дрожжей, г оказывает существенного влияния на транскрипцию с репортерног промотора.

Однако этот результат не исключает возможности участия протимозина в транскрипционных процессах. Известен ряд белков-активаторов, в частносп Нар4 дрожжей и VP16 вируса герпеса, которые способны осуществлять cboi функцию лишь в комплексе с другими белками, доставляющими их промотору. Возможно, протимозин a также может функционироват взаимодействуя с молекулярным помощником. Поэтому нам представлялос интересным изучить, какое влияние на транскрипцию in vivo окажет ЧпТ( искусственно введенный в область промотора репортерного гена в дрожжевс клетке.

4. Протимозин a человека, соединенный с ДНК-связывающи доменом активатора GaI4, подавляет транскрипцию с дрожжевот репортерного промотора

Чтобы проверить, не является ли протимозин a аналогом активационны доменов эукариотических активаторов транскрипции, мы решили адреса доставить ЧпТа к репортерному дрожжевому промотору, содержащее участки связывания Gal4, соединив его с ДНК-связывающим доменом Ga!4, изучить влияние такого слитого белка на транскрипцию.

16

Плазмидой pAS4, кодирующей ЧпТа, слитый с ДНК-связывающим доменом GaI4 (BD), мы трансформировали клетки штамма Y153. Синтез в них гибридного белка и его способность связываться с регюртерным промотором были подтверждены экспериментом с изменением подвижности ДНК в геле (рисунок 8). Для этого мы инкубировали белковые экстракты, полученные из клеток, продуцирующих гибридный белок 4nTa|BD, из клеток, продуцирующих ДНК-связывающий домен в свободном состоянии, а также из контрольных, не несущих плазмид клеток, с

32р

-меченным фрагментом ДНК, содержащий участки связывания Ga!4. В отличие от зоны на дорожке 3, соответствующей комплексу BD-ДНК, зона на дорожке 2, соответствующей экстракту из клеток, продуцирующих гибридный белок 4nTa)BD, имеет меньшую подвижность. Она отсутствует в контрольном образце. Эта зона соответствует комплексу ДНК-связывающего домена Gal4, слитого с ЧпТа, и меченного фрагмента ДНК. Любопытно, что в случае препаратов, полученных из клеток, в которых синтезируется гибридный белок, происходит более эффективное образование комплекса белка с ДНК-матрицей (рисунок 8 . дорожка 2), чем для препаратов из клеток, трансформированных плазмидой pASI. синтезирующих один только ДНК-связывающий домен (рисунок 8, дорожка 3). Этот факт может объяснятся как большей константой связывания, так и большей устойчивостью гибридного белка в клетке.

Р-галактозидазная активность белковых экстрактов из клеток, продуцирующих ЧпТа, слитый с ДНК-связывающим доменом, не превышала фонового уровня (-1 U). Таким образом. ЧпТа. искусственно введенный в область дрожжевого промотора, не проявляет свойств активатора. Наоборот, мы наблюдали незначительное понижение Р-галактозидазной активности по сравнению с фоновым уровнем. Следовательно, ЧпТа может оказаться не активатором, а репрессором транскрипции в данной системе. Однако базальный уровень транскрипции невысок сам по себе, и изучение его репрессии весьма затруднено. Поэтому мы разработали систему, позволяющую наблюдать за влиянием ЧпТа на активированное состояние дрожжевого репортерного промотора гп vivo. Эксперимент основан на

включении ЧпТа в состав двухчастного активатора, продуцируемого в клетках дрожжей.

комплекс ЧпТа|ЕЮ-ДНК ->

комплекс В1>ДНК

Рисунок 8. Эксперимент с изменением подвижности ДНК в геле. Дорожки 2 и 3 соответствуют экстрактам из клеток, содержащих плазмиды рАБ4 (кодирует ЧпТа|ЕШ) и рА81 (кодирует ВБ), дорожка 1 - экстракту из ^трансформированных клеток.

Для этой цели мы воспользовались плазмидами рБЕПП и р8Е1112, продуцирующими в дрожжевой клетке активирующий домен Са14, слитый с белком БпП и ДНК-связывающий домен ваМ, слитый с белком 8п£4, соответственно. Поскольку БпП и Бп?4 взаимодействуют друг с другом, при одновременном синтезе таких гибридных белков в клетке собирается активатор транскрипции, состоящий из двух частей, связанных нековалентно (рисунок 9, А).

Нами была создана плазмида рБЕПЭ, кодирующая гибридный белок, е

котором между ДНК-связываюшим доменом 0а14 и БпГ4 находится ЧпТа. Дрожжевые клетки штамма У153 были трансформированы одновременно либо плазмидами р8Е1112 и р8Е1111, либо рБЕ119 и рБЕПП. Р-галактозидазная активность белковых экстрактов, выделенных из контрольных, содержащих двухчастный активатор, клеток, составила приблизительно 10 и. В случае, когда в состав двухчастного активатора входил ЧпТа, р-галактозидазная активность упала до фонового уровня, приблизительно равного 1 и (рисунок 9, Б).

А.

иЛ8(,

1.ас /.

Б.

АО

Нгй'Д < ' ЧпП

ВО

пТа !

т

-х-

иАБоА!.

Ьас Z

Рисунок 9. Протимозин а человека, введенный в состав двухчастного активатора транскрипции, ингибнрует его действие.

Что является причиной угнетения транскрипционной активности репортерного промотора? К сожалению, нельзя однозначно утверждать, что дело здесь исключительно в прямом репрессирующем влиянии ЧпТа. Можно представить себе, что этот белок действует на активацию транскрипции опосредованно,

нарушая взаимодействие белков БпП и 8п!"4. Такой вариант можно буде исключить, если ввести ЧпТа в состав единой полипептидной цепи активатор; транскрипции. Для этого мы создали плазмиду рОВТ969, направляющую синтез гибридного белка, состоящего (в порядке расположения от № к С концу) из ДНК-связывающего домена Оа14, ЧпТа и активирующего домен ваМ. В качестве контроля использовали плазмиду рбЫЗ, синтезирующую клетках дрожжей минимальный вариант активатора Оа14, состоящий из ег ДНК- связывающего и активирующего доменов. Р-галактозидазная активност экстрактов из контрольных клеток, синтезирующих слитые ДНК-связывающи: и активирующий домены Са14, составила 50 единиц. Значение Р галактозидазной активности экстрактов из клеток, несущих плазмид рОВТ969, оказалось близким к фоновому (~1 и), то есть встраивание ЧпТ< между ДНК-связывающим и активирующим доменами Оа14 приводит к том) что составной активатор перестает работать (рисунок 10).

идвоА Гас 2

АО С)

ВО пТа | • "" - —X—►

! 1

Ьас Ъ

Рисунок 10. Протимозин а человека, расположенный между ДШ сязывающим и активирующим доменами искусственного активатор транскрипции, подавляет активацию транскрипции с репортерного дрожжевог промотора.

Приведенные выше результаты позволяют считать, что вовлечение фотимозина а в состав инициаторного транскрипционного комплекса ¡локирует транскрипцию. Они также дают ответ на вопрос, почему до гастоящего времени попытки найти молекулярного партнера протимозина а с юмощью двугибридной системы оказывались неудачными. В таких кспериментах при скрининге библиотеки белков, слитых с активирующим .оменом активатора 0а14, использовался гибридный белок, состоящий из [ротимозина а и ДНК-связывающего домена Оа14. Даже если в результате вязыванпя протимозина а с неизвестным белком из библиотеки ктивирующий домен оказывался вблизи промотора, репрессирующее действие ротимозина а должно было маскировать активацию транскрипции.

Как можно обойти проблему, возникшую при поиске молекулярных артнеров протимозина а? Ответом на этот вопрос может служить результат гтедующего эксперимента.

Нами была сконструирована плазмида рвР5, позволяющая синтезировав дрожжевых клетках гибридный белок, включающий в себя (в порядке тедования от М- к С-концу) ДНК-связывающий домен Са14, активирующий омен Оа14 и протимозин а человека, р-галакгозидазная активность белковых <страктов из клеток, несущих такую плазм иду, составила 75 I), что даже ревышает значение Р-галакчозидазной активности для искусственного стиватора, не несущего в себе Чп Га (50 Ь1). Этот результат указывает на то, со ингибирующее транскрипцию влияние ЧпТа исчезает при его удалении от НК-евязывающего домена активатора транскрипции Оа14. В таком случае, ажио предположить, что для эффективного поиска молекулярных партнеров пТа с помощью двугибридной системы необходимо вставить протяженный гейсер между ДНК-связывающим доменом Оа14 и протимозином а. Следует кидать, что ингибирующее влияние иТо. на транскрипцию в составе гбридной конструкции ДНК-связывзющий белок | полипептид-спейсер | гтТгх 'дет преодолено. Таким образом, открывается возможность для поиска :лков, взаимодействующих с протимозином а, с помощью двугибридной [стемы.

выводы

1. Протимозин а человека, продуцируемый в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, подавляет их деление.

Сигнал ядерной локализации или, по крайней мере, его часть, расположен в районе 9 С-концевых аминокислотных остатков белка. Удаление этого сигнала приводит к неспособности протимозина а человека транспортироваться в ядро и подавлять деление дрожжевых клеток.

2. Протимозин а в свободном состоянии не оказывает заметного влияния на транскрипцию с дрожжевого репортерного промотора.

Протимозин а человека, слитый с ДНК-связывающим доменом активатора Gal4, не препятствует узнаванию регуляторного сигнала промотора, но подавляет транскрипцию репортерного гена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Евстафьева А.Г., Павлов H.A., Вартапетян А.Б., Богданов A.A. Структура у функции протимозина а. I всероссийская планово-отчетная конференция пс направлению «Белковая инженерия». Москва, 1993 г.

2. Pavlov N., Evstafieva A., Rubtsov Y., Vartapetian A. (1995) Human prothymosir a inhibits division of yeast Saccharomyces cerevisiae cells, while its rautan lacking nuclear localization signal does not. FEBS Lett. 366,43-45.

3. Рубцов Ю.П., Воробьев И.А., Золотухин A.C., Чичкова Н.В., Павлов H.A. Каргер Е.М, Евстафьева А.Г., Вартапетян А.Б. Идентификация сигнал,' ядерной локализации белка протимозина а. II съезд биохимическоп общества РАН. Москва, 1997 г.

4. Rubtsov Y.P., Zolotukhin A.S., Vorobjev I.A., Chichkova N.V., Pavlov N.A, Karger E.M., Evstafieva A.G., Felber B.K., Vartapetian A.B. (1997) Mutationa analysis of human prothymosin a reveals a bipartite nuclear localization signai FEBS Lett.413, 135-141.

22

Заказ 39 Тираж 100