Идентификация участков протимозина альфа, обеспечивающих транспорт белка в ядро дрожжей S. cerevisiae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1. Список сокращений

2. Введение

3. Импорт белков в ядро (обзор литературы)

3.1. Введение

3.2. Сигналы ядерной локализации белка

3.3. Рецептор сигнала ядерной локализации

3.4. Взаимодействие импортина альфа с сигналом ядерной локализации

3.5. Взаимодействие импортина альфа с импортином бета

3.6. Комплекс ядерной поры

3.7. Транспорт через ядерную пору

3.8. Другие пути транспорта в ядро

3.9. Регуляция импорта белков в ядро

3.9.1. Регуляция транспорта в ядро при помощи маскирования N1,8 ,. •.

3.9.2. Регуляция активности N1,8 с помощью фосфорилирования

4. Детерминанты, определяющие транспорт протимозина альфа в ядро сегеушае (результаты и обсуждение)

4.1. Роль отдельных участков протимозина альфа в транспорте белка в ядро клеток & сегеутае

4.2. Взаимодействие протимозина альфа с дрожжевым импортином альфа

4.3. Попытка оценить взаимодействие протимозиновых производных с импортином альфа с использованием двугибридной системы

4.4. Возможные причины аномального поведения N1,8 протимозина альфа в дрожжах & сегеушае

5. Материалы и методы 57 5.1. Конструирование плазмид

1. Список сокращений

ПЭГ полиэтиленгликоль

ДСН додецилсульфат натрия

ДМСО диметилсульфоксид

КДа килодальтон

1РТО изопропил-1 -тио-Р-Б-галактопиранозид

Х-§а1 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-В-галактопиранозид

Трис трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА этилен-диамин-тетраацетат

ПСА персульфат аммония

МБА метилен-бис-акриламид

В процессе эволюции эукариотические клетки, в отличие от клеток бактерий, приобрели ядро, окруженное ядерной оболочкой, состоящей из двух липидных бислоев, которая отделяет генетический материал, хромосомную ДНК, от цитоплазмы. Транскрипция в интерфазе клеточного цикла происходит в ядре, а трансляция - в цитоплазме, то есть эти процессы пространственно разобщены. Для обеспечения жизнедеятельности эукариотической клетке необходимы механизмы специфического транспорта макромолекул между ядром и цитоплазмой. С одной стороны, мРНК должны выходить из ядра в цитоплазму, чтобы с них могли транслироваться разнообразные белки. С другой стороны, белки, требующиеся в ядре, должны эффективно транспортироваться от места их синтеза в цитоплазме в ядро. Активный транспорт белков из цитоплазмы в ядро называется ядерным импортом белков. Сборка различных рибонуклеопротеидных частиц (например, рибосом) также требует эффективного переноса компонентов этих комплексов через оболочку ядра.

Обмен макромолекулами между ядром и цитоплазмой в клетках эукариот осуществляется через ядерные поры - макромолекулярные образования, пронизывающие ядерную оболочку и играющие ключевую роль в ядерно - цитоплазматическом транспорте [1]. Строение ядерных пор допускает свободную диффузию через них небольших молекул, включая низкомолекулярные белки. Несмотря на это, транспорт в ядро большинства белков происходит активным способом [2].

Одним из ключевых моментов в многоступенчатом процессе ядерного транспорта является узнавание транспортируемого белка рецептором в цитоплазме. Существование ограниченного числа видов рецепторов налагает определённые ограничения на транспортируемые в ядро белки. Эти белки имеют аминокислотные последовательности, узнаваемые

3. Импорт белков ядро (обзор литературы) 3.1. Введение

Основные компоненты системы ядерно - цитоплазматического транспорта, такие как общая архитектура транспортного канала и ядерной поры, структура различных рецепторов, являются эволюционно консервативными. Общая схема транспорта белка в ядро приведена на рисунке 1-1. На первом этапе импорта в ядро транспортируемый субстрат узнается растворимым рецептором в цитоплазме. В качестве такого рецептора выступает гетеродимер, состоящий из двух белков - импортина а и импортина |3. Область в составе транспортируемого белка, узнаваемая этим гетеродимером называется NLS (nuclear localization sequence). Затем образовавшийся тройной комплекс (транспортируемый комплекс) достигает канала ядерной поры. Третьей стадией импорта является транслокация транспортируемого комплекса через ядерную пору. После этого транспортируемый белок высвобождается внутри ядра, и в качестве последней стадии можно рассматривать транспорт освободившихся транспортных факторов из ядра в цитоплазму, что придает импорту белков в ядро циклический характер.

3.2. Сигнал ядерной локализации белка

Транспорт белков в ядро осуществляется таким образом, что каждый ядерный белок, с одной стороны, не требует своего особенного транспортёра и, с другой стороны, легко отличим от цитоплазматических белков.

Ядерная оболочка

-ARan +

Нуклеоплазма ДКСТР/

Цитоплазма

ГВВ домен

Рис. 1-1. Общая схема транспорта NLS - содержащих белков в ядро. Обозначения: а - импортин а, (3 - импортин р.

Последовательность в составе белка, определяющая, будет ли он узнаваться рецептором и транспортироваться в ядро называется сигналом ядерной локализации (NLS, nuclear localization sequence). Говоря, что NLS направляет белок в ядро, обычно подразумевают необходимость и достаточность сигнала ядерной локализации для транспорта белка в ядро. Необходимость проявляется в том, что мутации в области предполагаемого NLS должны делать белок вместо ядерного цитоплазматическим, а достаточность заключается в том, что, будучи присоединённым к цитоплазматическим белкам, NLS способен направлять их в ядро [3].

Существует несколько типов наиболее распространённых сигнальных последовательностей, направляющих белок в ядро. Основную роль в первичной структуре классического NLS играет блок из остатков основных аминокислот. Существует две группы таких сигналов ядерной локализации: одночастичный и двучастичный.

Примером одночастичного сигнала ядерной локализации является ИЬБ Т антигена вируса 8У40 (Т N1,8), приведённый на рисунке 1-2.

Белок NLS

Т антиген SV40 PKKKRKV v-Jun RKRKL

Oct-3 ARKRKRT

Рис. 1-2. Белки, обладающие NLS типа NLS большого Т антигена вируса SV40.

NLS данного типа являются короткими пептидами, обогащенными положительно заряженными остатками Lys (К) и Arg (R). Т NLS состоит из семи аминокислотных остатков PKKKRKV, пять из которых являются остатками основных аминокислот. Необходимость этого NLS подтверждена тем, что мутации по остаткам Lys (К) инактивируют данный сигнал [4], а достаточность этой аминокислотной последовательности подтверждается тем, что она, будучи присоединённой к таким в норме цитоплазматическим белкам как бычий сывороточный альбумин и ß -галактозидаза, способна направлять их в ядро [3]. Многие белки имеют сигнал ядерной локализации, схожий с сигналом ядерной локализации Т антигена, некоторые из них приведены на рис. 1-2.

Двучастичные сигналы ядерной локализации состоят из двух блоков остатков основных аминокислот, разделённых спейсерным участком. Первым белком, в котором был идентифицирован двучастичный сигнал ядерной локализации, был нуклеоплазмин [2]. NLS нуклеоплазмина состоит из двух доменов, сформированных остатками основных аминокислот, и "спейсерного" участка, сформированного 10 аминокислотными остатками между этими доменами (рис. 1-3).

Наличие двух доменов в сигнале ядерной локализации было показано мутационным анализом последовательности N1,8 нуклеоплазмина, когда исследовалась способность мутантного ЫЬБ направлять в ядро репортёрный цитоплазматический белок. Мутационный

Белок N1^

Нуклеоплазмин 155ККраа1кка§яаКККК170 р53 ККафпг^ззрярККК

Прогистерон Ккссяа^у^ККЖК

Протимозин а ККаае(МесШускККдК с-Ров 1Шегп к тааакс ИиШи*

Рис. 1-3. Нуклеоплазмин - подобные КГЬБ, встречающиеся в различных белках. Жирным шрифтом выделены аминокислоты, образующие домены двучастичного ЫЬБ. анализ №8 нуклеоплазмина показал, что мутации в N - концевом основном блоке (155КЯ156) делают белок неспособным транспортироваться в ядро, если только не происходит замены одной основной аминокислоты на другую. Замены в спейсерном участке не оказывают влияния на ядерный транспорт. Одиночные мутации в С - концевом блоке, состоящем из остатков лизина, также не влияют на транспорт, однако двойные замены в этом участке полностью инактивируют N1,8 нуклеоплазмина. Повидимому, аминокислотный состав спейсерного участка не имеет значения, однако его протяжённость весьма существенна: увеличение спейсера до двадцати аминокислотных остатков не мешает белку транспортироваться в ядро, в то время как уменьшение серьёзно нарушает транспорт в ядро [2]. Длина спейсера в двучастичном N1,8 в среднем равна десяти аминокислотным остаткам, хотя и может существенно превышать это число. Например, белок вируса гриппа ВР1 имеет двучастичный N1,8 со спейсером из шестнадцати аминокислотных остатков [5], а ДНК- связывающий белок аденовируса несёт в своём N1,8 спейсер из тридцати семи остатков аминокислот [6]. Известны более сложные случаи, когда свойствами N1,8 обладают участки белка, сформированные из трёх основных доменов, как в Ь - периаксине [7]. В качестве другого примера можно привести большой Т антиген вируса полиомы [10]. Он содержит два N1,8, оба из которых необходимы для транспорта белка в ядро.

Согласно полученным недавно данным, активность N1,8 может заметно изменяться в зависимости от расположения и вида аминокислотных остатков, окружающих его. Примером этого является модифицированный N1,8 нуклеоплазмина [8]. Обычно, при удалении первого блока остатков основных аминокислот он утрачивает способность направлять белок в ядро. Оказалось, что если к Н- концу второго основного блока добавить последовательность Рго-А1а-А1а, то образовавшийся фрагмент РААККККЬБ способен вести себя как полноценный Ж,8. При этом остатки лейцина и аспарагиновой кислоты, расположенные с С - конца основного блока, также необходимы для полноценного транспорта белка в ядро.

Таким образом, неактивный кластер основных аминокислотных остатков превращается в N1,8 при его фланкировании нейтральными и кислыми аминокислотными остатками. Схожую структуру имеет N1,8 онкобелка с-шус, РААККУКЬБ, в котором по сравнению с модифицированным N1,8 нуклеоплазмина (РААККККЬО) два центральных лизина заменены на аргинин и валин. Для этих N1,8 показано, что расположение последовательности Рго-А1а-А1а перед блоком принципиально важно для их функционирования, а нахождение лейцина и аспарагиновой кислоты после основного блока заметно усиливает ядерную локализацию белка, т.е. остатки дикарбоновых и нейтральных аминокислот способны входить в состав N1,8 [8].

3.3. Рецептор сигнала ядерной локализации

После экспрессии в цитоплазме белок, имеющий NLS, должен быть узнан рецептором ядерного транспорта, называемым импортином альфа или кариоферином альфа. Рецептор узнаёт NLS в составе транспортируемого белка и связывается с ним. Импортин альфа может быть представлен в организме семейством родственных белков [13, 28] или являться единственным, как в случае S. cerevisiae. В силу высокой консервативности механизма ядерного транспорта, структурная организация импортинов альфа различных организмов похожа [11,13, 28]. Импортины альфа представляют собой белки массой приблизительно 60 кДа.

В составе импортина альфа можно выделить несколько функциональных доменов. Домен, ответственный за взаимодействие с сигналом ядерной локализации расположен в середине белка. На N -конце белка расположен IBB (importin beta binding) домен, ответственный за связывание импортина бета [27]. В человеческом импортине альфа он образован 1-61 аминокислотными остатками. С - концевой участок импортина альфа (365-382 а.к. для человеческого импортина) участвует во взаимодействии с белком CAS, осуществляющим экспорт импортина альфа из ядра[26, 77] .

Домен, взаимодействующий с сигналом ядерной локализации, образован восемью сгруппированными парами так называемыми "armadillo - like" (Arm) повторов, каждый из которых состоит из приблизительно 40 аминокислотных остатков. Предположительно, эти повторы являются одним из видов структур, обеспечивающих белок - белковые взаимодействия [12]. Arm повторы располагаются между N - и С -концевыми доменами импортина альфа. Анализ первичной структуры выявляет высокое сходство Arm повторов, N - и С - концевых доменов в различных организмах, от грибов до человека. Высокий консерватизм выражается также во взаимном расположении Arm повторов внутри импортина альфа. Например, первый Arm повтор дрожжевого импортина альфа более похож на первые Arm повторы различных человеческих импортинов, чем на свои собственные другие повторы. Это говорит о том, что повторы не являются взаимозаменяемыми и переставляемыми. Филогенетический анализ позволяет выделить две группы импортинов альфа: импортины альфа1 и импортины альфа2. Нужно отметить, что разделение происходит не по видам организмов: так, в человеческих клетках представлены импортины обоих классов. В случае, когда в организме существует несколько видов импортинов альфа, они могут по разному экспрессироваться в различных тканях [13, 14, 18].

3.4. Взаимодействие импортина альфа с сигналом ядерной локализации.

Сравнительно недавно в кристаллическом виде были получены комплексы двух NLS и фрагмента мышиного импортина альфа, а также свободный человеческий импортин альфа [16, 17]. Изученные комплексы состояли из фрагмента мышиного импортина альфа, лишённого N -концевой части, кристаллизованного в комплексе с одночастичным Т NLS вируса SV40 и двучастичным NLS нуклеоплазмина. В этих комплексах импортин альфа представляет собой один протяжённый домен, образованный восемью Arm повторами, каждый из которых содержит три альфа спирали (HI, Н2, НЗ), соединённые петлями. Эта структура сохраняется в обоих комплексах и идентична структуре свободного импортина альфа.

В рассматриваемом комплексе с Т NLS одна молекула импортина

126 132 альфа связывает два пептида PKKKRKV , кодирующих Т NLS, задействуя при этом два сайта связывания. Более сильные взаимодействия пептида с импортином наблюдается на сайте, расположенном ближе к N концу импортина альфа и образованному остатками между первым и четвёртым Arm повторами, что позволяет считать этот сайт основным. Второй сайт включает в себя остатки между четвёртым и восьмым Arm повторами. В обоих сайтах связанная пептидная цепь Т NLS расположена антипараллельно относительно суперспирали Arm повторов. Жёлоб, содержащий сайты связывания NLS, формируется НЗ спиралью Arm повторов. Именно в этой области расположены консервативные в ряду повторов аминокислотные остатки. Все остатки импортина альфа, взаимодействующие с одночастичным NLS, расположены в НЗ спирали или примыкают к её С — концу.

Двучастичный NLS нуклеоплазмина, 155KRPAATKKAGQAKKK170, связывается одновременно с обоими сайтами импортина альфа. Вспомогательный сайт связывает N - концевой основной кластер двучастичного сигнала ядерной локализации (ICR). Основной сайт связывания взаимодействует с С - концевой областью NLS. Спейсер сигнала ядерной локализации слабоупорядочен, что говорит об отсутствии или малом количестве специфических контактов с импортином. Это хорошо согласуется с данными о том, что мутации в данной области NLS не влияют на ядерный транспорт [2].

Бороздка, сформированная повторяющимися Arm мотивами на поверхности импортина альфа, позволяет образовать структуру для специфического связывания сигналов ядерной локализации. Расположение консервативных в ряду Arm повторов остатков образует серию сайтов связывания для остатков NLS. Связывание сигналов ядерной локализации в обоих сайтах импортина альфа происходит схожим образом и складывается из следующих составляющих: 1) полярные взаимодействия консервативных остатков аспарагиновой кислоты импортина с основной цепью NLS, задающие направление цепи сигнала ядерной локализации; 2) гидрофобные взаимодействия между боковыми цепями консервативных триптофановых остатков импортина альфа, которые формируют малую бороздку, и протяжёнными боковыми цепями остатков основных аминокислот NLS, располагающимися в этой бороздке; 3) взаимодействия положительно заряженных боковых цепей NLS с отрицательно заряженными остатками импортина альфа, расположенными на бороздке; 4) взаимодействие основных остатков NLS с диполями, образованными НЗ спиралями.

Следует отметить, что IBB домен импортина альфа содержит последовательность, напоминающую NLS. Третичная структура свободного импортина альфа показывает, что этот фрагмент расположен во внутренней области импортина альфа аналогично тому, как располагается при связывании NLS. Можно предположить, что таким образом происходит маскирование IBB, что предотвращает связывание импортина бета с импортином альфа и дальнейший транспорт этого комплекса в ядро в отсутствие NLS - содержащего белка [16, 17].

3.5. Взаимодействие импортина альфа с импортином бета

Импортин бета - это белок, взаимодействующий с импортином альфа и обеспечивающий дальнейший ядерный транспорт тройного комплекса NLS - импортин альфа - импортин бета. Существуют противоречивые данные, описывающие сам процесс связывания импортина альфа и импортина бета. Свободный импортин альфа способен связывать NLS [18, 19], однако считается, что в цитоплазме он изначально существует в комплексе с импортином бета. Как и импортин альфа, импортин бета представлен множеством гомологов, также эволюционно консервативных от дрожжей до человека [29]. Общей чертой всех импортинов бета является наличие так называемых HEAT мотивов. Первичная структура HEAT мотивов весьма вырождена, но каждая пара повторов даёт консервативную вторичную структуру, состоящую из антипараллельных а - спиралей с небольшими соединительными петлями между ними [20, 21]. В состав большинства импортинов бета входит 14-15 сдвоенных HEAT повторов, фланкированных 100 - 150 аминокислотными остатками. В силу высокой вырожденности первичной структуры HEAT повторов, трудно говорить о гомологии импортинов бета на уровне первичной структуры [11]. Так, гомология между HEAT повторами человеческого импортина бета не превышает 12% [22].

В составе импортина бета можно выделить несколько участков, отвечающих за взаимодействие с различными партнёрами. Человеческий импортин бета взаимодействует с импортином альфа участком, расположенным между 331 и 871 аминокислотными остатками, что соответствует области HEAT повторов [24, 27]. В составе импортина бета также идентифицировано два сайта связывания с комплексом ядерной поры: 1 -306 и 331 - 876 [24]. Участок 1 - 364 также отвечает за взаимодействие с белком Ran [27, 55, 63, 65, 66].

Данные рентгеноструктурного анализа комплекса человеческого импортина бета с IBB доменом человеческого импортина альфа говорят о следующей пространственной структуре комплекса импортинов [22]. В общей структуре комплекса IBB домен располагается в центре и как бы обвит импортином бета. За счёт этого комплекс очень компактен. Каждый HEAT повтор импортина бета состоит из цепей А и В, соединённых несколькими аминокислотными остатками. Повторы уложены таким образом, что формируют внешнюю выпуклую сторону молекулы, состоящую из А цепей, и внутреннюю из В цепей. Соседствующие повторы соединены остатками, образующими линкер. Размер HEAT повторов колеблется между 32 и 61 аминокислотными остатками, что приводит к колебанию в размерах А спиралей (3-6 оборотов), В спиралей (3.5-8 оборотов) и линкеров (1-19 остатков).

Несмотря на низкую степень гомологии HEAT повторов, их сравнение выявляет некоторое постоянство химической природы остатков в определённых местах повтора. Такие "консервативные" остатки участвуют в образовании структуры повторов и взаимодействии между повторами. Соседствующие повторы закручены друг на друга, что придаёт "закрученность" и всей молекуле.

IBB домен импортина альфа уложен в виде буквы L, в которой N -концевая часть (all - a23) перпендикулярна С - концевой спирали (а24 -а51). Остатки основных аминокислот составляют приблизительно 40% IBB домена, создавая потенциал на поверхности, обратный по знаку потенциалу на внутренней стороне импортина бета, образованному остатками дикарбоновых аминокислот. Во взаимодействии с импортином бета участвует примерно 40% поверхности IBB домена. В составе N -концевой части IBB домена есть всего два остатка Argl3 и Lys 18, консервативных в ряду импортинов альфа. Они специфически узнаются немногими консервативными остатками в составе импортина бета, расположенными в HEAT повторах 7-11. Роль остатков Argl3 и Lys 18 также подтверждается данными мутационного анализа [26]: делеция участка импортина альфа вплоть до Argl3 не сказывается на активности белка при импорте in vitro, делеция Argl3 понижает активность в два раза, а дальнейшее делетирование фрагмента вплоть до Lys 18, вызывает падение активности ещё в три раза. С - концевая спираль IBB домена "обёрнута" В спиралями повторов 12 - 19, что объясняет, почему этой спирали достаточно для формирования комплекса с импортином бета, который, правда, оказывается менее устойчивым [23]. Из 16 заряженных остатков спирали, 13 образуют солевые связи с импортином бета.

То, что во взаимодействии с IBB доменом участвуют HEAT повторы 7 - 19, и не участвуют повторы 1 - 6, хорошо согласуется с данными по делеционному анализу импортина бета [24]. Анализ связывания делеционных мутантов импортина бета с импортином альфа показал, что мутант, состоящий из остатков 256 - 876 (повторы 7 - 19), связывает импортин альфа так же, как и полноразмерный белок; мутант, несущий в себе повторы 8-19, связывает импортны альфа гораздо слабее, а мутант, лишённый повторов 18 и 19, совсем не связывает импортин альфа.

Поскольку HEAT повторы охватывают IBB, можно предположить, что при образовании комплекса происходит конформационное изменение импортина бета и IBB домена. В пользу этого говорят и другие экспериментальные данные. Свободный импортин бета гораздо более легко расщепляется протеазами, чем импортин бета в комплексе с импортином альфа. Аналогичным образом собственно IBB домен в комплексе с импортином бета делает последний нечувствительным к протеолизу в отсутствие целого импортина альфа. Поскольку ограниченный гидролиз позволяет определить доступность сайтов, можно сделать вывод, что взаимодействие с импортином альфа приводит к конформационным изменениям импортина бета, т.к. участки связывания импортина альфа не перекрываются с сайтами гидролиза [25]. Предполагается и обратное влияние. Как говорилось ранее, часть IBB домена импортина альфа экранирует сайт связывания NLS. Считается, что связывание импортина бета с импортином альфа переводит последний в форму, более благоприятную для взаимодействия с NLS. Экспериментальные данные подтверждают, что связывание импортина бета с импортином альфа стабилизирует комплекс последнего с NLS [55].

После образования в цитоплазме, тройной комплекс NLS - импортин альфа - импортин бета достигает внешней стороны ядра.

3.6. Комплекс ядерной поры

Ядро отделено от цитоплазмы двойной ядерной мембраной. Для того, чтобы обеспечить двунаправленный транспорт макромолекул существуют ядерные поры, образованные белковыми конгломератами, известными как комплексы ядерной поры (nuclear pore complex, NPC). NPC является универсальной и эволюционно консервативной структурой всех эукариот [30, 33]. Ионы, метаболиты и другие небольшие молекулы способны проникать в ядро через NPC в результате пассивной диффузии по каналу, диаметр которого составляет 10-25 нм [34]. Белки, масса которых менее 50 кДа также способны проникать в ядро в результате пассивной диффузии, более крупные молекулы должны активно транспортироваться в ядро через NPC [30].

NPC - это очень большие (масса порядка 105 кДа) белковые комплексы, встроенные в оболочку ядра и прикрепленные к нуклеоскелету. Результаты исследований компонентов NPC показывают, что в состав этих комплексов входит, по меньшей мере, 30 различных белков, причем многие из них, вероятно, представлены 8 или 16 копиями. Наиболее полно исследован NPC дрожжей S.cerevisiae [33, 34, 35, 36]. Хотя точное число белков ядерной поры (нуклеопоринов) неизвестно, можно утверждать, что существует порядка 30 дрожжевых нуклеопоринов. Примерно 65% белков, образующих NPC в S.cerevisiae, имеют явные родственные белки в геномах позвоночных [32]. Согласно предсказаниям на основе анализа аминокислотных последовательностей, NPC позвоночных должен быть больше, чем у дрожжей и состоять из примерно 50 компонентов [36, 37]. Нуклеопорины NPC S.cerevisiae можно разделить на три группы по их расположению в комплексе ядерной поры [35]. Большинство нуклеопоринов расположено симметрично и обнаруживаются как на цитоплазматической, так и ядерной стороне NPC на примерно равном расстоянии от центра симметрии поры. Для четырёх белков, также обнаруживаемых на обеих сторонах NPC, характерно смещение относительно центра симметрии (marked biased localization). Незначительное количество белков локализовано только на одной стороне ядерной поры. Например, Nuplp и Nup60p, локализованные на ядерной стороне NPC и расположенные на значительном удалении от центра NPC, считаются белками, образующими ядерную "корзину" [38, 39] (более подробно см. рис. 1-4). Белки Nupl59p, Nup42p и Nup82p, расположенные на цитоплазматической стороне 1ЧРС, являются частью цитоплазматических фнламентов [40, 41]. Очевидно, что различия в структуре цитоплазматической и ядерной сторон ИРС связаны с различием процессов, происходящих на них. Так, например, известно, что можно стимулировать структурные изменения ядерной корзины, не затрагивающие остальную часть ЫРС. Было показано, что эти корзины способны обратимо "открываться" и "закрываться" под воздействием различных концентраций кальция [43], возможно, именно подобные структурные перестройки участвуют в регулировании ядерного транспорта в клетке. Приблизительно треть массы дрожжевого КРС составляют так называемые Рв белки - члены РО (Р, фенилаланин; О, глицин) семейства нуклеопоринов [38]. Для этих белков характерно наличие множества вЬРО, БхРО или Рв повторов (Ь, лейцин; х -любая аминокислота), разделённых участками, образованными полярными аминокислотами [42]. Считается, что Рв повторы участвуют в связывании транспортируемого белка [35].

Изучение КРС дрожжей (уКРС) и позвоночных (уКРС) позволяет говорить об общих чертах и различиях в пространственной структуре ЫРС [36,44]. Общая схема у№С приведена на рисунке 1-4.

Рис. 1-4. Общая схема третичной структуры уКРС

Сравнение дрожжевых МРС и ЫРС позвоночных выявляет наличие как общих консервативных элементов структуры, так и различий. По сравнению с уИРС, уЫРС является гораздо более компактной структурой. Дрожевой КРС заключён между двумя типами вытянутых доменов (рис. 15, 1 и 2), домены 1 образуют цилиндрический канал в середине уИРС.

Рис. 1-5. Схема различий

Vbrtosrat® И PC l !,•;(?•. ¡ir.ii qc1e

A Ycoit ЫРС

T'cii-cporlor щь^ • jggk - ^Hl . -здЩк*, *Щ mm,'''

- INM' «с

V ' I \ /

КРС дрожжей и позвоночных. Слева -дрожжевой №С, справа -ИРС позвоночных. А -вид №>С "в разрезе"; В -видОТС "сверху".

У ! Bcsk'.'f

Vi "

1. г- i i г* fJ"

CD-ми

300 A ifowrf HPC

VOi ti-ln iifr: NPC Щ fir^V M ' - § 4

Luiivmic; liiKl'

Другими компонентами yNPC являются цитоплазматические филаменты (CF) и ядерная корзина (basket). NPC позвоночных построен из цитоплазматических филаментов (CF) и цитоплазматических частиц (CP), филаментов, расположенных на внутреннем кольце (IRF), которые соединяют центральный канал (СС) с тонкими цитоплазматичеким (CR) и ядерным (NR) кольцами. В yNPC отсутствует целый ряд доменов, контактирующих с тонкими внешним и внутренним кольцами доменами в vNPC (рис. 1-5).

Сравнение NPC позвоночных и дрожжей говорит о том, что в процессе эволюции NPC претерпел значительные структурные изменения. Возможны два варианта развития, приведшие к подобным различиям в структуре. Дрожжевой NPC мог образоваться из более крупного NPC, претерпев изменения, необходимые для существования небольшого и быстро делящегося организма. Более вероятным представляется вариант, при котором ранние эукариоты обладали небольшим и сравнительно просто устроенным NPC, который мы наблюдаем в дрожжах, в то время как животные клетки приобрели более сложный и развитый NPC.

3.7. Транспорт через ядерную пору

Механизм транспорта белков через ядерную пору всё ещё не до конца ясен. Известно, что достигший комплекса ядерной поры (NPC) тройной комплекс NLS-содержащий белок - импортин альфа - импортин бета связывается с внешней стороной NPC. Связывание с белками ядерной поры осуществляет импортин бета, взаимодействуя с определёнными нуклеопоринами, содержащими FG повторы [27, 45, 56, 57, 58]. Поскольку эти нуклеопорины расположены по длине всей ядерной поры, вероятно, они образуют некие "дорожки", по которым импортин бета движется вглубь NPC. Известно, что сам импортин бета транспортируется по каналу, образованному NPC, но не выходит из него с ядерной стороны [55].

Переход транспортируемого белка из цитоплазмы в ядро должен сопровождаться разрушением комплекса белка с импортёром (импортином а/(3). Основную роль в этом играет белок Ran. Ran - небольшой (25 кДа)

GTP связывающий и гидролизующий белок, перходящий из RanGTP в

21

RanGDP форму и обратно в результате гидролиза GTP и нуклеотидного обмена [46, 67, 68], что сопровождается изменение пространственной структуры белка.

Ran является уникальным в ряду родственных небольших G -белков, поскольку имеет протяжённый С - конец, конформация которого различна в GTP и GDP - ассоциированных формах Ran [64]. Сравнивая рентгеноструктурные данные по комплексам RanGppNHp (аналог GTP) в комплексе с импортином бета из разных организмов [62, 63], а также RanBDl (Ran связывающий домен белка RanBP2) [64] можно понять суть конформационных переходов Ran. Нужно отметить, что область связывания импортинов бета не перекрывается с областью связывания RanBDl. В структуре Ran и других Ras - подобных белков выделяют два домена, назовём их домен 1 и домен2, конформация которых меняется, в зависимости от партнёров Ran по комплексу [62, 89]. В комплексах RanGppNHp с импортином бета и RanBDl конформация домена 1 сильно отличается от его конформации в комплексе RanGDP. Две спирали и один (3 слой исчезают при переходе от RanGDP к RanGTP. На основании этих данных для белка Ran домен 1 определяют в границах Thr-32 - Val-45. Домен 2 образует спираль в комплексе Ran-RanBDl, но не в Ran -импортин бета. Это объясняется тем, что, в отличие от RanBDl, импортин бета непосредственно контактирует с некоторыми аминокислотными остатками домена 2. На основании этих данных, домен 2 определяют в границах Thr-66 - Туг-79.

Переход из RanGTP в RanGDP стимулируется белком RanGAPl (GTPase-activating protein) более чем в 105 раз [48, 49, 50, 51]. Гидролиз GTP происходит с ещё большей скоростью в присутствии Ran -связывающих белков RanBPl/RanBP2 [69, 70, 74]. RanGAPl -цитоплазматический белок, прикреплённый Ran - связывающими доменами (RanBD) белков RanBPl и RanBP2 к фибрилам NPC [52, 53, 61, 90]. Таким образом, в цитоплазме Ran присутствует в форме RanGDP.

RanGTP образуется из RanGDP путём обмена нуклеотидов. Этим занимается белок RCC1, так называемый фактор обмена гуанина (guanine exchange factor, GEF). Он более чем в пять раз стимулирует скорость обмена [46, 47]. Поскольку RCC1 крепится к хроматину и является ядерным белком [60], он переводит Ran в форму RanGTP внутри ядра. В результате цитоплазматический Ran находится преимущественно в виде RanGDP, а ядерный - в виде RanGTP. Образовавшийся градиент концентрации RanGTP между цитоплазмой и ядром и определяет направление транспорта через ядерную пору. Это подтверждается тем, что направление транспорта можно изменить на противоположенное путём повышения концентрации RanGTP в цитоплазме [71]. В ряде работ показано, что для импорта в ядро не нужен собственно гидролиз GTP, необходим лишь градиент концентрации RanGTP, когда уровень трифосфата в ядре существенно выше, чем в цитоплазме [71, 72].

Роль Ran в ядерном транспорте основана на его способности разрушать транспортные комплексы или способствовать их образованию в зависимости от того, в какой форме он находится - RanGTP или RanGDP. RanGTP, но не RanGDP, образует комплекс с импортином бета, при этом он способен вытеснять импортен альфа, если тот был связан с импортином бета ранее, за счёт перекрывающегося сайта связывания. В образовавшемся комплексе RanGTP - импортин бета способность Ran к гидролизу GTP может быть восстановлена только при одновременном присутствии RanGAP и RanBPl [73, 74, 59, 75]. Таким образом, этот комплекс может образоваться в ядре и будет устойчив, пока не окажется в цитоплазме, где под воздействием RanGAP и RanBPl произойдёт гидролиз GTP и распад комплекса.

Считается, что комплекс импортин бета - импортин альфа -транспортируемый белок, достигнув NPC способен проникнуть в канал комплекса ядерной поры и за счёт многократного обратимого взаимодействия импортина бета с нуклеопоринами двигаться либо в сторону цитоплазмы, либо в сторону ядра по каналу, образованному NPC. Направленность этому движению придают необратимые события на ядерной стороне NPC, когда RanGTP разрушает комплекс импортин альфа - импортин бета. Образуются два комплекса: импортин бета - RanGTP и импортин альфа - транспортируемый белок. Импортируемый белок диссоциирует от импортина альфа, последний экспортируется обратно в цитоплазму в виде тройного комплекса с похожим на импортин бета белком CAS (cellular apoptosis susceptibility protein) для клеток HeLa или его дрожжевым гомологом Cselp в S. cerevisiae и RanGTP [76, 77, 79]. В цитоплазме этот комплекс диссоциирует, т.к. RanBPl и RanGAP вызывают гидролиз GTP в составе RanGTP, а образовавшийся RanGDP уже не может поддерживать комплекс [50, 54, 78]. Ситуация по устойчивости транспортируемого комплекса при экспорте из ядра обратна той, что наблюдалась для транспорта в ядро, когда комплекс диссоциировал RanGTP. Экспорт импортина бета из ядра представляется менее понятным. Было показано, что для экспорта импортина бета из ядра не нужен RanGTP, в комплексе с которым он появляется на ядерной стороне NPC, но зависит от домена, обеспечивающего взаимодействие импортина бета с нуклеопоринами [80]. С другой стороны, имеются данные о том, что экспорт импортина бета в значительной степени подавляется инъекцией гомолога RanGAP 1 в ядро Xenopus [81], что заставляет подозревать участие RanGTP в экспорте. Возможно, импортин бета способен экспортироваться в цитоплазму как Ran - зависимым образом, аналогично импортину алфа, так и независимо от Ran.

Можно заметить, что в приведённой схеме транспорта белка в ядро Ran "вымывается" из ядра. Маленький размер Ran позволяет ему проникать обратно в ядро засчёт диффузии, однако существует специальная система импорта Ran, что косвенно подтверждается практически исключительно ядерной локализацией Ran в клетке [46]. Ключевую роль в импорте Ran в ядро играет белок NTF2. Для него было показано взаимодействие с RanGDP (но не RanGTP) и рядом нуклеопоринов, содержащих фенилаланин-глицин (xFxFG) повторы, причём их сайты взаимодействия не перекрываются, допуская одновременное связывание RanGDP и нуклеопоринов [82, 83, 84, 85]. В качестве партнёра NTF2 был также идентифицирован импортин бета [85].

Рентгеноструктурный анализ комплекса RanGDP-NTF2 позволил выделить основные элементы, обеспечивающие специфичность этого взаимодействия [86].

Для транспорта Ran в ядро необходим NTF2 и градиент концентрации RanGTP, но не гидролиз GTP [83, 87]. Было показано, что импорт Ran в ядро не нуждается в функционирующем импортине бета [87], а также, что NTF2, находящийся в ядре, не связан с NPC [88]. Вероятно, транспорт Ran в ядро осуществляется следующим образом: NTF2 связывает RanGDP в цитоплазме, и транспортирует сквозь NPC засчёт способности NTF2 обратимо взаимодействовать с рядом нуклеопоринов. На ядерной стороне происходит обмен GDP на GTP, комплекс RanGTP-NTF2 неустойчив и поэтому диссоциирует в ядре. Роль импортина бета, с которым взаимодействует NTF2, может заключаться в экспорте его из ядра, хотя малый размер NTF2 позволяет ему свободно диффундировать в цитоплазму независимо от всей транспортной машины.

3.8 Другие пути импорта белков в ядро

Вышеописанный механизм транспорта в ядро касается белков, содержащих канонические NLS. Однако в клетке реализуются и альтернативные пути импорта белков в ядро.

По мере идентификации NLS различных ядерных белков были обнаружены последовательности, которые не имели ничего общего с каноническими NLS, но, тем не менее, были необходимы и достаточны для импорта в ядро. Один из белков, обладающий такой необычной последовательностью - это белок гетерогенных ядерных рибонуклеопротеидов А1 (hnRNPAl) млекопитающих [122]. hnRNPAl относится к группе белков, которые образуют комплексы с гетерогенными ядерными РНК (hnRNA) и участвуют в процессах метаболизма РНК, в частности, в их процессинге и транспорте. Эти многокопийные белки, как правило, сконцентрированы в ядре и для них характерна способность постоянно переходить из ядра в цитоплазму и обратно (челночный транспорт через NPC) [123, 124]. Как импорт, так и экспорт hnRNP являются сигнал - зависимыми, насыщаемыми и зависят от температуры [124].

В последовательности hnRNPAl был обнаружен непрерывный блок, состоящий из 38 аминокислотных остатков (участок М9), необходимый и достаточный для ядерного импорта и экспорта белка [125, 126, 127]. Последовательность М9 не похожа на классические NLS, однако М9 - опосредованный импорт в ядро имеет схожие биохимические характеристики с импортин - зависимым импортом в ядро (в частности, зависит от равновесия GTP/GDP форм Ran). Тем не менее, М9 -опосредованный импорт в ядро невозможно ингибировать с помощью добавления больших количеств пептида, представляющего собой канонический NLS [127]. Это свидетельствует о том, что импорт в ядро М9 - содержащих субстратов направляется специфическим рецептором, отличным от импортинового рецептора NLS. Оказалось, что с последовательностью М9 специфически взаимодействует белок, цолучивший название транспортина [126]. В клетках дрожжей S. cerevisiae также был идентифицирован белок Кар104р, который образовывал комплекс с двумя ядерными мРНК - связывающими белками, а именно с Nab2p и с Hrplp [128]. Оба этих белка также принадлежат к группе челночных белков, причем Hrplp является гомологом hnRNPAl высших эукариот [129]. Таким образом, Кар104р является дрожжевым гомологом транспортина позвоночных.

Анализ аминокислотной последовательности транспортина показал, что этот белок гомологичен импортину Р, который входит в состав обычного рецептора NLS [130]. Импортен Р необходим для доставки комплекса NLS-содержащего белка с импортином а к ядерной поре и транспорта этого комплекса в ядро. Как следует из свойств транспортина, этот белок, подобно импортину Р, доставляет импортируемый субстрат к ядерной поре, но, в отличие от последнего, он непосредственно узнает сигнальную последовательность (М9) в составе белка, выполняя тем самым и функцию импортина а [130]. В частности, было установлено, что Кар104р связывается с теми же нуклеопоринами, что и импортен Р, а также что мутации в гене КАР 104 приводят к переходу белков Nab2p и Hrplp, которые в норме имеют преимущественно ядерную локализацию, в цитоплазму клеток. При этом уровень экспорта мРНК из ядра практически не снижается, что подтверждает участие Кар104р исключительно в стадии импорта в ядро. Ещё одним отличием в функционировании Кар104р -зависимого транспорта от обычного пути является то, что диссоциация комплекса Nab2p-Kapl04p RanGTP более чем в семь раз дополнительно стимулируется добавлением РБК [102]. Это, вероятно, связано с РНК -связывающими свойствами Nab белков.

Следует заметить, что М9 - зависимый путь ядерно-цитоплазматического транспорта белков является необычным, так как одна и та же сигнальная последовательность направляет как импорт в ядро, так и экспорт белка из ядра. Другими словами, М9 совмещает свойства NLS и сигнала экспорта из ядра (NES, nuclear export signal). Точечный мутагенез М9 показал, что в этой последовательности невозможно выделить аминокислотные остатки, необходимые только для импорта белка в ядро или только для экспорта из ядра.

Другим типом последовательности, узнаваемой рецепторами, отличными от тех, что узнают классический NLS, является последовательность в белке hnRNP К. Этот белок относится к той же

27 группе белков гетерогенных ядерных нуклеопротеидов, что и А1. В его составе первоначально был выявлен один двучастичный NLS, способный направлять слитые с ним белки в ядро [131]. Однако оказалось, что и без этого фрагмента hnRNP К остаётся ядерным. В оставшемся фрагменте белка был картирован участок из тридцати восьми аминокислотных остатков, несущий в себе детерминанту транспорта в ядро. Этот участок не содержит последовательностей, напоминающих NLS вируса SV40, нуклеоплазмина или М9, и был назван KNS. Он также способен направлять слитые с ним белки в ядро. Как и в случае М9, оказалось, что KNS представляет из себя одновременно не только NLS, но и NES, которые перекрываются. При попытке найти клеточные рецепторы KNS выяснилось, что транспорт KNS - содержащего белка является энергозависимым и насыщаемым, однако сам KNS узнаётся рецептором, отличным от тех, что узнают классический NLS и М9. Предположение о том, что транспорт KNS происходит без участия импортина а, подтвердилось тем, что избыток IBB домена не оказал заметного влияния на этот транспорт. Также не восприимчив оказался KNS - зависимый транспорт и к избытку М9 - содержащего субстрата. Интересно то, что избыток KNS подавляет транспорт как М9 так и NLS - содержащих белков. Предположительно, KNS - содержащий белок способен самостоятельно связываться с NPC, конкурируя при этом с транспортином и импортином (3 [132].

Еще один тип цитоплазматических рецепторов, узнающих специализированные сигналы импорта в ядро, участвует в транспорте некоторых рибосомных белков [133, 134]. Рибосомные белки эукариот для сборки прерибосом импортируются из цитоплазмы в ядро. Сигналы, направляющие транспорт рибосомных белков в ядро, изучены плохо, однако известно, что некоторые белки эукариотических рибосом содержат особые последовательности, отличные от канонических NLS, от последовательности М9 и KNS, необходимые и достаточные для импорта

133]. Помимо гена КАР 104, кодирующего дрожжевой гомолог транспортина, в геноме дрожжей были обнаружены еще две открытые рамки считывания, кодирующие белки, похожие на импортин (3. Эти новые гомологи импортина Р получили названия Кар123р и Pselp. Генетический анализ PSE1 и КАР123 показал, что соответствующие белки могут участвовать в экспорте мРНК из ядра [135]. И Кар123р и Pselp локализованы преимущественно в ядре, а для штаммов дрожжей, несущих мутантные гены этих белков, характерно накопление ро1у(А)+мРНК в ядре. Однако полученные недавно результаты свидетельствуют, что основная функция Кар123р и Pselp заключается в импорте некоторых рибосомных белков в ядро [133]. В частности, установлено, что белок Кар123р, подобно другим белкам этого семейства, прямо связывается с транспортируемым субстратом (рибосомными белками и их сигналами импорта в ядро), взаимодействует с нуклеопоринами, содержащими FG-повторы, а также с RanGTP [134]. Кар123р направляет импорт в ядро только специфической группы рибосомных белков за счет связывания с ними и ядерной порой in vivo. Аминокислотная последовательность белка Pselp, а также его свойства чрезвычайно похожи на свойства и последовательность Кар 123р. Он также направляет в ядро специфические рибосомные белки и способен заменить при этом Кар123р [133].

Помимо белков в ядро импортируются также различные рибонуклеопротеидные комплексы. В частности, U мяРНК, входящие в состав таких комплексов, после транскрипции в ядре экспортируются в цитоплазму, где связывают специальные белки и дополнительно метилируются в области кэпа с тем, чтобы снова вернуться в ядро [136]. Связывание белков является необходимым условием импорта, тогда как образование триметилгуанозинового кэпа лишь увеличивает скорость импорта. Какие именно сигналы, содержащиеся в U мяРНП, направляют их импорт в ядро не установлено. Ясно лишь то, что транспорт этих комплексов в ядро является активным и не конкурирует с транспортом других типов белков, а следовательно, требует наличия в клетке специальных медиаторов этого процесса [137].

Ещё один вариант импорта в ядро, слегка отличный от "классического", можно видеть на примере белка RPA (replication protein А). Этот ядерный белок взаимодействует с белком XRIPa, не являющимся гомологом импортина альфа. XRIPa, в свою очередь, взаимодействует с импортином бета и далее всё идёт по обычному пути. Важно заметить, что XRIPa не только не является гомологом импортина, но и узнаваемая им область не содержит классического NLS [101].

Таким образом, существует несколько независимых путей импорта в ядро белков. Для каждого из этих путей характерны различные NLS, направляющие белки в ядро. Узнавание каждого типа NLS и доставка транспортируемого субстрата к ядерной поре требует, соответственно, специализированных цитоплазматических рецепторов. Однако все известные пути импорта белков в ядро объединяет стадия транслокации через ядерную пору, которая наиболее консервативна и, по-видимому, одинакова для транспорта в ядро разных типов белков.

3.9. Регуляция импорта белков в ядро

В результате пространственного разобщения цитоплазмы и содержащегося в ядре хроматина клетки эукариотических организмов получили возможность регуляции ключевых внутриклеточных процессов на уровне ядерно-цитоплазматического транспорта, которая недоступна клеткам прокариот. Селективный и регулируемый ядерно-цитоплазматический транспорт белков позволяет клеткам эукариот контролировать такие сложные процессы как дифференцировка, клеточное деление, ответ на различные воздействия и т.д.

Скорость ядерно-цитоплазматического транспорта макромолекул, в частности, импорта белков в ядро, а также размеры канала и количество функционирующих ЫРС в активно делящихся клетках значительно больше, чем в покоящихся клетках [138]. Это указывает на регулируемый характер процесса импорта белков в ядро. Такая регуляция, по-видимому, сопряжена с интенсивностью клеточного метаболизма (например, со скоростью сборки рибосом), однако способ осуществления контроля за ядерно-цитоплазматическим транспортом остается неясным. Тем не менее, можно выделить по крайней мере три уровня регуляции активного импорта белков в ядро. Первый связан с изменением количества ядерных пор и диаметра канала [139], второй касается модификации растворимых транспортных факторов, в частности рецепторов сигналов импорта, что, по-видимому, позволяет изменять их активность. Наконец, третий и наиболее исследованный путь регуляции состоит в изменении доступности сигналов импорта для цитоплазматических рецепторов с помощью их модификации или маскирования [140, 141]. Именно он и будет рассмотрен далее.

Становится очевидно, что распределение регуляторных белков в клетке подвержено контролю с помощью разнообразных механизмов. Один из них заключается в обратимом маскировании-демаскировании N1,8 белков.

3.9.1. Регуляция транспорта в ядро при помощи маскирования N1^

Маскирование N1,8 наилучшим образом изучено на примере семейства активаторов транскрипции ТчПР-кВ [91, 92]. Активная (ядерная) форма Г^Ш-кВ состоит из белков р65 и р50, которые связываются с ДНК в виде гомо- или гетеродимеров. Оба этих белка содержат гомологичные участки протяженностью около 300 аминокислотных остатков, в состав которых входит и NLS.

Белок р50 синтезируется в цитоплазме в виде протяженного предшественника pi 10, причем р50 представляет собой N-концевой домен рИО [92]. Показано, что р110 в норме является цитоплазматическим белком. Антитела, специфичные к NLS р50, не узнают белок р110; кроме того, делеция небольшого участка на С-конце р110 приводит к перераспределению белка в ядро. Таким образом, NLS р50 в предшественнике р110 маскирован С-концевым фрагментом этого белка. Специфический протеолиз р110, который приводит к образованию р50, способного импортироваться в ядро, как полагают, индуцируется направленным фосфорилированием этого белка в ответ на внешние сигналы. Зрелый р50 специфически связывается с белком 1кВу (70 кДа С-концевой домен белка р110 - предшественника р50). Данное взаимодействие происходит как in vitro, так и in vivo и, по-видимому, также приводит к маскированию NLS, на этот раз межмолекулярному. Разрушение комплекса в цитоплазме происходит, согласно полученным данным, вследствие специфического фосфорилирования его компонентов протеинкиназами, причем фосфорилирование 1кВу вызывает его протеолитическую деградацию.

Межмолекулярное маскирование NLS р65, согласно имеющимся данным, обусловлено взаимодействием этого белка с белками семейства ингибиторов NF-кВ, называемыми 1кВ. Делеция или мутация в NLS р65 устраняет связывание с ингибиторами. Демаскирование NLS в этом случае также происходит с помощью деградации 1кВа и 1кВ(3, которая индуцируется за счет их фосфорилирования протеинкиназой С [92].

Таким образом, в клетке существует сразу несколько степеней защиты от несанкционированного импорта белков семейства NF-кВ в ядро. Согласно представленным данным, контроль за импортом р50 и р65 достигается за счет внутри- или межмолекулярного маскирования NLS, которое в ответ на соответствующие цитоплазматические сигналы устраняется путем фосфорилирования и/или протеолиза белков семейства ингибиторов ОТ-кВ.

3.9.2. Регуляция активности N1-8 с помощью фосфорилирования

Регуляция функционирования N1.8 путем прямого фосфорилирования №.8-содержащих белков, по-видимому, наиболее распространена. На рисунке 1-6 приведены возможные способы регуляции импорта белка в ядро путём фосфорилирования транспортируемого субстрата или связанных с ним белков. Инактивация N1.8 (или активация) при таком способе регуляции является результатом фосфорилирования аминокислотных остатков, входящих в состав N1.8 или расположенных рядом с ним. Фосфорилирование казеинкиназой II (СКП), как правило, активирует N1.8; фосфорилирование другими протеинкиназами, в особенности циклин - зависимыми протеинкиназами, напротив, угнетает импорт белка в ядро (рис. 1-6, I и II). Таким образом, эффект фосфорилирования может быть двойственным. Как полагают, появление отрицательно заряженного фосфата вблизи N1.8 может негативно влиять на узнавание положительно заряженного сигнала рецептором N1.8. Кроме того, изменение активности N1.8 (маскирование/демаскирование) может происходить вследствие конформационных переходов, индуцируемых фосфорилированием разных участков белка, независимо от их близости к N1.8. Первые доказательства регуляции активности N1.8 путем обратимого фосфорилирования были получены при исследовании N1.8 большого Т антигена 8У40. Было установлено, что участки этого белка, окружающие его минимальный N1.8, значительно усиливают уровень импорта в ядро, направляемого этой последовательностью. Оказалось, что такой эффект связан со способностью более протяженного фрагмента к фосфорилированию СК11, сайт которой расположен с Ы-конца по

Ядро

Цитоплазма N1,5 М т.<>

П.

1гп ил тая

Ш. ттл м мл ггп м

IV. пи

Рис. 1-6. Регуляция импорта белков в ядро путем изменения активности ЫЬБ с помощью фосфорилирования. I - фосфорилирование вблизи N1^ усиливает импорт белка в ядро; II - фосфорилирование вблизи N1,8 ингибирует импорт белка в ядро; III - фосфорилирование белка устраняет внутримолекулярное маскирование ИЬБ; IV - фосфорилирование белка устраняет маскирование ЫЬБ, вызванное связыванием с якорным белком. отношению к минимальному N1,8 (рис. 1 -7) Второй сайт, расположенный вблизи N1,8 большого Т антигена 8У40, специфически фосфорилируется протеинкиназой р34°ас2, которая участвует в контроле клеточного цикла. В данном случае фосфорилирование значительно снижало активность N1,8 [142].

Аналогичным образом регулируется ядерно-цитоплазматическое распределение дрожжевого фактора транскрипции 8\¥15 [143]. Внутриклеточная локализация этого белка зависит от стадии клеточного цикла. 8\¥15 располагается в цитоплазме в течение 8, в2 и М фазы клеточного цикла, однако в 01 фазе он накапливается в ядре и активирует транскрипцию гена эндонуклеазы НО. Три остатка серина, расположенные

Рис. 1-7. Схема регуляции активности NLS на примере большого Т антигена вируса SV40. Указаны номера аминокислотных остатков - акцепторов фосфатных групп. вблизи двухчастичного NLS этого белка, могут фосфорилироваться киназой CDC28 (гомолог CDC2) как in vitro, так и in vivo. Направленный мутагенез этих аминокислотных остатков показал, что их фосфорилирование угнетает импорт белка в ядро. In vivo было показано, что накопление белка в ядре достигается за счет дефосфорилирования идентифицированных остатков серина в конце митоза [143].

Аналогичным образом регулируется импорт в ядро вирусного транскрипционного фактора v-Jun, который является цитоплазматическим в G1 фазе и переходит в ядро в G2 фазе. Изменение локализации v-Jun

248 связано с обратимым фосфорилированием остатка Ser , расположенного непосредственно перед NLS белка: S248RKRKL. Фосфорилирование приводит к тому, что белок перестаёт транспортироваться в ядро. Интересно отметить, что клеточный аналог v-Jun - c-Jun, являющийся

248 перманентно ядерным, несёт мутацию именно по остатку Ser [93]. Аналогичным образом регулируется локализация "корового белка " вируса гепатита В [94], транскрипционного фактора Msn2p [95].

S1US112DDEATADSQHS TI24FPKKKRKV сайт фосфорилирования сайт фосфорилирования NLS CKII p34cdc2

Помимо представленных примеров, регуляция активности NLS путем такого двойного фосфорилирования, по-видимому, используется для контроля импорта в ядро широкого спектра белков. Во всяком случае, известны десятки примеров, подтверждающих данное предположение. Кроме того, в аминокислотных последовательностях многих белков обнаружены потенциальные сайты фосфорилирования CKII и CDC2, расположенные вблизи NLS.

Учитывая высокую консервативность механизмов, использующихся для импорта белков в ядро, можно утверждать, что такой способ регуляции импорта в ядро является универсальным и имеет большое значение.

Регуляция ядерного импорта транскрипционного фактора Xenopus xnf7 также осуществляется посредством фосфорилирования. Цитоплазматическая форма xnf7 является фосфорилированной, в то время как переход белка в ядро сопровождается его дефосфорилированием [96]. Множественные сайты фосфорилирования xnf7 являются сайтами узнавания циклин - зависимой киназы [97]. Однако, в отличие от приведённых ранее примеров, цитоплазматическая локализация фосфорилированного белка связана в первую очередь с действием "заякаривающего" в цитоплазме (CRD, cytoplasmic-retention domain) домена. Действие домена снимается при дефосфорилировании сайтов p34cdc2 в составе xnf7. Действие CRD заключается в заякоривании белка в цитоплазме, а не маскировании NLS, поэтому даже добавление второго NLS к xnf7 не приводит к переходу белка в ядро [97]. Аналогичным образом регулируется транспорт в ядро белка XMyoD [98].

В приведённых выше примерах регуляция ядерного транспорта осуществлялась только на уровне транспортируемого белка. Однако, ядерный транспорт можно контролировать и регулируя активность других его компонентов. Например, сравнение ядерного транспорта частиц золота, соединённых с нуклеоплазмином, в делящихся и покоящихся клетках выявило более чем двухкратное увеличение диаметра транспортного канала во время активного увеличение числа ядерных пор [99, 100].

4. Детерминанты, определяющие транспорт протимозина альфа в ядро S.cerevisiae (результаты и обсуждение)

Протимозин альфа - небольшой белок млекопитающих, с молекулярной массой 13 кДа и состоящий из 109 аминокислотных остатков, половина из которых являются остатками дикарбоновых аминокислот [106-108]. Результатом столь необычного аминокислотного состава является отсутствие регулярной вторичной и третичной структуры, в результате чего белок описывают как "статистический клубок" [109, 110]. Протимозин является одним из наиболее многокопийных белков клетки, число копий достигает 10 [111]. Механизм действия протимозина альфа не ясен, но известно, что он вовлечён в процесс клеточного деления. Известно, что уровень протимозина альфа возрастает в делящихся клетках [112, 113], а блокировка синтеза протимозина лишает клетки возможности делиться [114]. Недавно полученные данные о направленном гидролизе протимозина при апоптозе, в сочетании с высокой консервативностью этого белка, позволяют утверждать, что протимозин альфа является важным белком в жизни клетки [115].

Протимозин альфа является ядерным белком в клетках млекопитающих. В составе протимозина альфа был идентифицирован двучастичный NLS, расположенный в С - концевой части молекулы протимозина альфа (рис. 2-1, рис. 2-2).

Компоненты ядерно - цитоплазматического транспорта эволюционно консервативны; ряд исследований показал, что сигналы ядерной локализации белков млекопитающих функционируют в дрожжах S.cerevisiae [116], однако в случае протимозина альфа человека это не так. Его сигнал ядерной локализации необходим и достаточен для транспорта в ядро человеческих клеток, т.е., мутации в области NLS нарушают транспорт, в то время как полученный генноинженерным способом химерный белок, состоящий из репортёрного цитоплазматического белка и

1 15 30 acs daavdtsseittkdlkekkevveeaengr 31 45 60 dapangnaneengeqeadnevdeeeeegge 61 75 90 eeeeeeegdgeeedgdedeeaesatg к r а а 91 105 109 eddedddvdt к к о к т d е d d

Рис. 2-1. Аминокислотная последовательность протимозина альфа человека. Остатки основных аминокислот выделены жирным; остатки, входящие в состав NLS, подчёркнуты. сигнала ядерной локализации протимозина, является ядерным. Иная ситуация наблюдается в S.cerevisiae. В то время как полноразмерный протимозин альфа человека является по - прежнему ядерным в клетках дрожжей и мутации в области NLS нарушают ядерный транспорт, его изолированный NLS не способен направлять в ядро репортёрный белок, т.е. в дрожжах S.cerevisiae NLS протимозина альфа необходим, но не достаточен для транспорта в ядро.

Столь необычное поведение NLS протимозина в дрожжах позволяет поставить следующие вопросы: что в составе протимозина отвечает за транспорт в ядро дрожжей и каковы могут быть механизмы этого транспорта.

4.1. Роль отдельных участков протимозина альфа в транспорте белка в ядро клеток S.cerevisiae

Поскольку полноразмерный протимозин альфа является ядерным, а его NLS недостаточен для транспорта в ядро S.cerevisiae, было сделано предположение, что в ядерный транспорт вносят вклад, помимо NLS, и другие участки белка.

87kraaeddedddvdtkkqk104

Рис. 2-2. NLS ПроТа человека. Жирным шрифтом выделены два блока основных аминокислот, необходимых для функционирования NLS.

Для того, чтобы проверить это предположение, был создан ряд делеционных мутантов протимозина альфа и определена их внутриклеточная локализация в клетках S. cerevisiae.

Фрагменты ДНК, кодирующие протимозиновых мутантов, вставляли в полилинкер плазмиды pYeGFP (рис. 2-3). Наличие в плазмиде синтетического индуцибельного промотора GAL10/CYC1 позволило контролировать синтез рекомбинантных белков. Слежение за прижизненной внутриклеточной локализацией белка осуществлялось следующим образом: все мутанты экспрессировались в виде химерных белков, состоящих из собственно протимозиновой части, на N - конце которой находился репортёрный белок GFP (Green Fluorescent Protein).

Рис. 2-3. Схема плазмиды рУсОРР. вРР - белок, состоящий из 238 аминокислотных остатков, примечательный тем, что в результате посттрансляционной модификации, не требующей ничего, кроме кислорода, приобретает способность флуоресцировать зелёным светом при облучении светом с длиной волны

40

Р0«С*1С1АЯ госу^и.'тииА*

БИВДИОВДА

475 нм. Ранее было показано, что сам по себе ОБР не способен активно транспортироваться в ядро ^.сегеуише и в силу своего размера, допускающего пассивную диффузию через ядерную пору, равномерно распределён по клетке. Это говорит о правомерности его использования в качестве маркёра при изучении ядерного транспорта.

Для определения внутриклеточной локализации производных протимозина, клетки ^.сегеушяе трансформировали плазмидами, кодирующими соответствующие химерные белки (рис. 2-4). После индукции транскрипции добавлением галактозы оценивали уровень название конструкции мЛ I

III

IV V

VI

VII

VIII

IX способность транспортироваться в ядро связывание импортина альфа +

109 + + + +

Рис. 2-4. Схема делеционных мутантов протимозина альфа. Арабскими числами обозначены номера аминокислотных остатков в полноразмерном протимозине. Также на рисунке суммированы результаты опытов по локализации мутантов протимозина в клетках & cerevisiae и по связыванию импортина альфа (подробное описание опытов см. ниже). Количество плюсов отражает способность соответствующих белков аккумулироваться в ядре: +++, исключительно ядерная локализация; ++, преобладание ядерной локализации; +, белок способен к активному импорту в ядро; белок равномерно распределён по клетке, т.е. не способен накапливаться в ядре. синтеза и отсутствие деградации химерных белков с помощью иммуноблоттинга, а с помощью флуоресцентной микроскопии по флуоресценции GFP определяли внутриклеточную локализацию протимозиновых производных. В качестве контроля использовались полноразмерный протимозин альфа, слитый с GFP, и свободный GFP.

Как уже говорилось, было необходимо показать, что продуцируемые в клетке GFP - производные протимозина альфа, за распределением которых мы наблюдали, действительно экспрессируются и не подвергаются деградации. Для этого дрожжевые экстракты были проанализированы с помощью электрофореза по Лэммли с последующим иммуноблоттингом, для которого использовали антитела к GFP.

На рисунке 2-5 видно, что все рекомбинантные белки синтезируются в клетках дрожжей, их размер соответствует ожидаемому, и заметной деградации белков не происходит. Это позволяет утверждать, что в опытах по определению внутриклеточной локализации белков мы имеем дело с ожидаемыми продуктами синтеза. v4 I II III IV V VI VII VIII IX GFP

Рис. 2-5. Иммуноблоттинг лизатов клеток дрожжей, трансформированных конструкциями, указанными над дорожками. Лизаты фракционировали в 12% ПААГ и после переноса на мембрану детектировали антителами к ОБР.

Анализ локализации химерных белков в клетках дрожжей показал, что, как и следовало ожидать, полноразмерный протимозин альфа является исключительно ядерным: свечение ОРР окрашивает только ядро клетки (рис. 2-6, М), в чём можно убедиться, сравнив область флуоресценции с границами клетки, видимыми на фазовом контрасте. N1,8 протимозина альфа (рис. 2-4, мутант III) действительно не способен транспортировать репортёрный белок ОБР в ядро, в результате чего равномерно флуоресцирует вся клетка (рис. 2-6, III), как и в случае свободного вРР, что говорит о недостаточности КПЬБ для ядерного транспорта. Полная делеция N1,8, а также делеция девяти С - концевых аминокислотных остатков протимозина альфа, частично затрагивающая его двучастичный сигнал ядерной локализации (мутанты I и II, рис. 2-4), также делает химерный белок неспособным к активному транспорту в

Рис. 2-6. Исследование внутриклеточной локализации протимозиновых мутантов, слитых с ОБР, в клетках 51. сегеушае с помощью флуоресцентной микроскопии. Обозначение панелей - как на рис. 2-4. ядро, что проявляется в равномерной флуоресценции клетки в силу пассивной диффузии белков (панели I, II рис. 2-6). Этот результат служит доказательством необходимости ТЧЬ8 для транспорта протимозина альфа в ядро Можно также сделать вывод о том, что транспорт протимозина альфа в ядро Б.сегеу1$1ае обеспечивается комбинацией составляющих, состоящей из сигнала ядерной локализации, расположенного на С - конце белка и некой детерминанты или детерминант, расположенных за пределами С - концевой области протимозина альфа. Для того, чтобы картировать эти дополнительные участки, необходимые для транспорта, были созданы и использованы несколько делеционных мутантов протимозина, размер которых постепенно увеличивался от С - к N - концу белка (конструкции IV, V, VI на рис. 2-4).

Добавление к N1^ протимозина альфа предшествующих 29 аминокислотных остатков (мутант IV) привело к тому, что получившийся химерный белок начал накапливаться в ядре. Об этом можно судить по тому, что несмотря на значительную долю белка в цитоплазме, свечение ядра начало преобладать и его стало возможно выделить на фоне всей клетки (рис. 2-6, IV). Этот результат был неожиданен, поскольку, согласно литературным данным, основную роль в формировании сигналов ядерной локализации играют остатки основных аминокислот, в то время как добавленный фрагмент не только не содержит их, но и более чем на 50 % состоит из остатков дикарбоновых аминокислот. Дальнейшее добавление 20 аминокислотных остатков (мутант V) привело к более ярко выраженному накоплению белка в ядре (рис. 2-6, V), а добавление ещё 18 аминокислотных остатков (мутант VI) привело к полной передислокации мутанта протимозина в ядро (рис. 2-6, VI), что дало окрашенность клетки аналогичную случаю с транспортом полноразмерного протимозина (рис. 26, На основании полученных данных можно предположить, что несколько различных участков протимозина совместным образом вносят вклад в его ядерный транспорт. Также, сравнивая внутриклеточную локализацию полноразмерного протимозина и мутанта VI, можно предположить, что 14 N - концевых аминокислотных остатков протимозина не важны для его ядерного транспорта, поскольку их делетирование не сказывается заметным образом на внутриклеточной локализации белка (рис. 2-6, VI).

Чтобы проверить эти предположения, были созданы и использованы мутанты, состоящие из фрагментов 1-13 и 1-31, соединённых генноинженерным способом с сигналом ядерной локализации протимозина альфа (рис. 2-4, мутанты VII и VIII), и была изучена их внутриклеточная локализация. Мутант VII был равномерно распределён по клетке, будучи таким образом неспособным к активному транспорту в ядро (рис. 2-6, VII). Это подтверждает предположение, что N - концевой участок протимозина не задействован в ядерном транспорте. Мутант VIII демонстрирует небольшую способность к накоплению в ядре за счёт направленного транспорта. При этом вся клетка окрашена в зелёный цвет, однако ядро окрашено более интенсивно, как и в случае мутанта IV (рис. 26, VIII). Такое стимулирование транспорта, по - видимому, объясняется добавлением к фрагменту 1-13 (мутант VII) фрагмента 15-31, роль которого при транспорте в ядро была ранее продемонстрирована при переходе от мутанта IV к мутанту V.

Однако, неспособность мутанта VII накапливаться в ядре позволяет не только сделать вывод об отсутствии роли N — концевого участка протимозина в ядерном транспорте, но и позволяет говорить, что транспорт химерного белка в ядро S.cerevisiae нельзя стимулировать добавлением произвольного спейсерного участка между сигналом ядерной локализации протимозина и GFP. Для того, чтобы подкрепить этот вывод, был создан ещё один мутант протимозина альфа, отличавшийся от мутанта VII добавлением на N - конец протимозиновой части (между протимозином и GFP) фрагмента, состоящего из 13 аминокислотных остатков, кодируемых полилинкером плазмиды (рис. 2-4, мутант IX). Изучение внутриклеточной локализации мутанта IX показало, что он не способен к активному транспорту в ядро (рис. 2-6, IX).

Результаты экспериментов по изучению ядерно -цитоплазматического транспорта суммированы на рис. 2-4. На их основании, можно придти к заключению, что транспорт в ядро дрожжей протимозина альфа обеспечивается совокупностью следующих элементов: 1) двучастичного сигнала ядерной локализации, расположенного на С -конце белка и являющегося необходимым компонентом транспортируемой конструкции, 2) несколькими вполне определёнными участками протимозина, каждый из которых вносит свой вклад в транспорт и которые в совокупности обеспечивают полный переход протимозина в ядро З-сеггушае.

4.2. Взаимодействие протимозина альфа с дрожжевым импортином альфа протимозина альфа не первый, демонстрирующий неожиданное поведение в дрожжах. Ранее было показано, что одиночный классический Т N1,8 вируса БУ40 не способен транспортировать один из вариантов ОБР в ядро $.сегеж$1ае, хотя известно, что в человеческих клетках подобный химерный белок является ядерным [1]. В статье было показано, что для ядерного транспорта необходимо два сигнала ядерной локализации, причём располагающаяся между ними последовательность способна влиять на ядерный транспорт конструкта. К сожалению, авторы работы не приводят данных о связи между способностью транспортироваться в ядро и способностью связывать дрожжевой импортин альфа. Известно, что, несмотря на высокое сходство между дрожжевым и человеческими импортинами, достигающее 50% [14,15], ни по отдельности, ни вместе, человеческие импортины не способны комплементировать в дрожжах делецию дрожжевого гена [14]. Это позволяет утверждать, что существуют ситуации, в которых декларируемая универсальность сигналов ядерного транспорта не срабатывает.

Неспособность изолированного сигнала ядерной локализации протимозина обеспечить транспорт белка в ядро 3.сегетБ1ае может объясняться тем, что он не узнаётся единственным импортином альфа дрожжей, в то время как в человеческих клетках импортны альфа представлен целым семейством родственных белков. В силу этого можно представить, что требования к NLS, предъявляемые в дрожжевых клетках более жёсткие, чем в человеческих. При этом те мутанты, в составе которых NLS узнаётся импортином альфа, транспортируются в ядро, а остальные - нет. Существование в дрожжах единственного известного гомолога импортина альфа также облегчает задачу по моделированию этого этапа транспорта in vitro.

Для того, чтобы выяснить, способен ли дрожжевой импортин альфа узнавать сигнал ядерной локализации протимозина, решено было смоделировать это взаимодействие in vitro. Ген дрожжевого импортина альфа, называемого Srplp, был клонирован в экспрессионную бактериальную плазмиду таким образом, что на N - конце располагались zz домен (z - IgG связывающий домен белка А золотистого стафилококка), сайт тромбина и сайт протеинкиназы А (рис. 2-7). ш 5|р1р

Рис. 2-7. Схема химерного белка, использовавшегося как источник 32Р меченного

БгрТр. ъъ - гъ домен; 1хЬ - сайт тромбина; РКА - сайт протеинкиназы А.

После экспрессии в E.coli белок выделяли на IgG сефарозе, связывание с которой обеспечивал zz - домен рекомбинантного белка. Затем,

32 иммобилизованный белок радиоактивно метили с помощью у- Р АТР и каталитической субъединицы протеинкиназы А. Далее, меченый белок, закреплённый на смоле, обрабатывали тромбином, что приводило к отщеплению zz - тэга и к отсоединению от смолы фрагмента, состоящего

32 из собственно Srplp и довеска с Р меткой (см. рис. 2-7).

Контроль за тем, что элюированный таким образом белок не содержал примеси zz - содержащего белка осуществляли с помощью электрофореза с последующей радиоавтографией, при этом процессированный тромбином белок имел более высокую подвижность, чем его гг предшественник, и не содержал примеси исходного препарата (рис. 2-8). zz-32PSrp1p 32PSrp1p

Рис. 2-8. Анализ меченного импортина альфа после обработки тромбином. Левая дорожка - исходный препарат до обработки тромбином, правая дорожка - препарат после обработки тромбином. Препарат разделяли в 10 % ПААГ, после чего белки детектировали с помощью радиоавтографии.

Элюированный таким образом белок далее использовали для связывания с производными протимозина альфа. Различные мутанты протимозина альфа были клонированы в экспрессионный вектор таким образом, что на их N - конце располагался zz - домен, что позволило выделить их из лизатов клеток E.coli и иммобилизовать для связывания с Srplp на IgG сефарозе. Помимо протимозиновых мутантов в качестве положительного контроля использовался сигнал ядерной локализации вируса SV40 (Т NLS), являющийся классическим примером, а также просто zz - домен, в качестве отрицательного контроля.

Связывание проводилось следующим образом: к имммобилизованному на смоле мутанту протимозина добавляли меченый Srplp, после инкубации несвязавшуюся метку отмывали, а количество связавшегося импортина альфа оценивали по количеству задержавшейся на сорбенте метки. Для того, чтобы убедиться, что оцениваемая метка присутствует исключительно в виде меченного полноразмерного Srplp, связавшийся со смолой меченый препарат полностью снимали с неё и анализировали электрофорезом по Лэммли.

Положение белка на полученном геле определяли с помощью радиоавтографии. Весь радиоактивный фосфор оказался включённым в состав полноразмерного белка; таким образом, измеряемые при связывании значения адекватно отображают процент импортина альфа, связавшийся с образцом.

На рис.2-9 представлены результаты связывания иммобилизованного на смоле протимозина альфа и его мутантов с меченным импортином альфа. За единицу взято связывание полноразмерного протимозина.

Об адекватности выбранной системы можно судить по тому, что взятый в качестве положительного контроля Т NLS вируса SV40, демонстрирует связывание с импортином, значительно превышающее фоновый уровень (т.е. связывание с изолированным zz - доменом, взятым в качестве отрицательного контроля). Рассматривая связывание мутантов I и И, можно увидеть, что частичная или полная делеция сигнала ядерной локализации приводит к неспособности связать импортин альфа. Обращаясь к результатам изучения транспорта мутантов в ядро, можно заметить, что оба мутанта, не способные связать импортин, были также неспособны накапливаться в ядре. Способность мутантов IV, V, VI и VIII связывать импортин также коррелирует с их способностью транспортировать репортёрный белок в ядро. Необходимо подчеркнуть, что все эти мутанты несут в себе полноразмерный двучастичный NLS протимозина альфа.

Неожиданными являются результаты по связыванию импортина альфа мутантами III, VII и IX. Мутант III представляет собой тот самый NLS протимозина альфа, способный к транспорту репортёрного белка в ядро млекопитающих, но не являющийся достаточным для транспорта в ядро дрожжей. Как мы ранее видели (рис. 2-6), он действительно не обеспечивает направленный транспорт GFP в ядро S.cerevisiae. Можно было ожидать, что нарушение транспорта происходит на стадии узнавания белка импортином альфа. Данные по связыванию импортина с мутантами II и Ш опровергают это предположение: NLS протимозина альфа

Связывание импортина альфа

01

1-1

WtProtfX I

II

III

IV V

VI

VII

VIII

IX TNLS zz

Рис. 2-9. Связывание дрожжевого импортина альфа ( PSrplp) с протимозиновыми мутантами. За единицу взято связывание полноразмерного протимозина альфа с Srplp. необходим (мутант II) и достаточен (мутант III) для связывания рецептора ядерного транспорта - импортина альфа. На основе этого вывода можно понять поведение мутантов VII и IX при связывании с импортином. Несмотря на то, что ни один из них не способен активно транспортироваться в ядро, они оба несут в себе полноразмерный сигнал ядерной локализации протимозина альфа, чем и объясняется их способность связываться с импортином альфа.

Одним из возможных осложнений в интерпретации и сравнении результатов транспорта в ядро S.cerevisiae и связывания импортина альфа in vitro является тот факт, что в первом случае использовались конструкции, содержащие на N - конце протимозина и его мутантов белок ОБР, а во втором на N - конце находился ъъ - домен. Можно представить, что в силу пространственных различий ОБР и ъъ - домен оказывают различное влияние на соседний фрагмент протимозина альфа, взаимодействующий с импортином альфа. Для того, чтобы прояснить и по возможности отринуть это предположение, эксперимент по связыванию импортина с протимозином был несколько модифицирован. Для иммобилизации на смоле и последующего связывания с меченым импортином альфа были созданы конструкции, схема котрых приведена на рисунке 2-10.

TL

GFP мутантны и протимозин

Рис. 2-10. Схема химерных белков, использовавшихся на втором этапе связывания с 8гр1р.

На N - конце находился zz - домен, обеспечивающий закрепление белка на аффинном сорбенте, далее шёл GFP, на С - конце которого располагался полноразмерный протимозин или его мутант. Такая конструкция более адекватно моделировала ситуацию, имевшую место при изучении транспорта производных протимозина альфа в ядро S.cerevisiae. С касетой zz - GFP были слиты наиболее характерные представители семейства полученных мутантов: полноразмерный протимозин альфа, мутанты II и III. Далее белки были продуцированы в E.coli, имммобилизованы на аффинном сорбенте и использованы для исследования их взаимодействия с PSrplp. Результаты связывания этих химерных белков с Srplp воспроизвели результаты, полученные для данных форм протимозина альфа ранее (рис. 2-11).

32 P Srplp

Рис. 2-11. Связывание 32Р - меченного Srplp с zz-GFP — производными протимозина альфа. Дорожки: wt - связывание с производным протимозина дикого типа; II -связывание с производным мутанта П, Ш - связывание с производным мутанта III (NLS). Приведён радиоавтограф 12% ПААГ, полученного при фракционировании 32PSrplp , связавшегося с соответствующими рекомбинантнами белками.

Полноразмерный протимозин и его NLS (мутант III) по - прежнему связывали импортин альфа, присутствие GFP на N - конце протимозина альфа не мешало белкам взаимодействовать. В то же время, неспособность мутанта II связываться с импортином также не претерпела изменений. Таким образом, этот эксперимент подтвердил правомерность рассуждений о том, что замена GFP на zz - домен при переходе от опытов in vivo к связыванию in vitro не сказалась на интересующих нас свойствах протимозина и его мутантов.

4.3. Попытка оценить взаимодействие протимозиновых производных с импортином альфа с использованием двугибридной системы

Для того, чтобы оценить взаимодействие производных протимозина с импортином альфа in vivo, решено было воспользоваться двугибридной системой. Метод основан на том, что дрожжевой активатор транскрипции GAL4 состоит из двух доменов, причём для функционирования GAL4 не обязательно, чтобы эти домены были соединены в одну полипептидную цепь. Достаточно того, чтобы они оказались пространственно сближены. Для оценки взаимодействия двух белков один из них продуцируется в виде химерного белка с активирующим доменом GAL4, а другой - в виде химерного белка с ДНК связывающим доменом GAL4. Если исследуемые белки взаимодействуют, то домены вАЬ4 оказываются сближенными и происходит активация транскрипции репортёрного гена, например, (3 -галактозидазы. В нашем случае решено было рассмотреть взаимодействие химерного белка, состоящего из Бф1р и активационного домена ОАЬ4 с белком, состоящим из протимозинового мутанта и ДНК - связывающего домена ОАЬ4. Предполагалось, что в случае взаимодействия 8гр1р с протимозиновым фрагментом, домены вАЬ4 окажутся сближены и произойдёт активация транскрипции р - галактозидазы, о чём можно будет судить по её активности. Взаимодействие белков и активация транскрипции происходят в ядре, таким образом, в схеме эксперимента имелся серьёзный недостаток: взаимодействие импортина альфа с сигналом ядерной локализации устойчиво в цитоплазме, но разрушается в ядре. Предполагалось, что высокий уровень экспрессии белков -компонентов двугибридной системы позволит продлить срок жизни комплекса 8гр1р - протимозин альфа настолько, что произойдёт активация транскрипции репортёрного белка. Если транскрипция не активируется, то это может значить как собственно отсутствие взаимодействия белков, так и разрушение комплекса до того, как он сможет активировать транскрипцию гена р - галактозидазы.

Решено было оценить взаимодействие 8гр1р с полноразмерным протимозином альфа и мутантом, лишённым сигнала ядерной локализации. В качестве положительного контроля, позволяющего судить о работоспособности системы, использовалась пара белков протимозин альфа - Кеар1, взаимодействие которых было показано в нашей лаборатории, а в качестве отрицательного контроля - пара 8гр1р - ДНК связывающий домен ОАЬ4 (без каких - либо довесков).

Оба контроля дали ожидаемые результаты: Кеар1 взаимодействовал с протимозином альфа, а 8гр1р не взаимодействовал с ДНК связывающим доменом ОАЬ4. Ни полноразмерный протимозин, ни его мутант, утративший 1МЪ8, не вызвали активации транскрипции гена (3 галактозидазы при экспрессии в клетках совместно с химерным белком Бгр1р - активационный домен ОАЬ4. По описанным выше причинам, нет возможности утверждать, что белки не взаимодействуют, т.к. невозможно отличить отсутствие взаимодействия от его разрушения в ядре дрожжей. Таким образом, двугибридная система оказалась непригодной для оценки взаимодействия Бгр1р с производными пртимозина альфа.

4.4. Возможные причины аномального поведения ]ЧЬ8 протимозина альфа в дрожжах

На основе проведённых экспериментов можно сформулировать два основных вопроса, возникающих при рассмотрении функционирования 1ЧЪ8 протимозина в клетках Я. сегеугягае:

1) чем же обусловлена разница между функционированием сигнала ядерной локализации в клетках человека и дрожжей?

2) почему удлинение протимозина от С - конца к N - концу способствует ядерному транпорту в дрожжах?

Возможно, константы связывания импортина альфа с сигналом ядерной локализации могут различаться, соответственно более успешно транспортируются в ядро мутанты протимозина, образующие более устойчивые комплексы с импортином альфа. Подобная мысль высказывалась ранее [14] с целью объяснить различную способность человеческих импортинов транспортировать в ядро репортёрный белок. В этом случае роль участков протимозина альфа, для которых была показана способность усиливать транспорт в ядро, состоит в том, что они стабилизируют комплекс протимозина с импортином. Тогда разница между требованиями к сигналу ядерной локализации в клетках дрожжей и человека объясняется, возможно, тем, что изолированный протимозина образует в клетках человека устойчивый комплекс с одним из представителей семейства импортинов альфа, в то время как единственный дрожжевой импортны альфа предъявляет более жёсткие требования к сигналу ядерной локализации, которым протимозиновый NLS удовлетворяет лишь частично. Эта гипотеза несколько расходится с результатами связывания протимозина и импортина альфа in vitro (рис.24), когда все мутанты, содержащие NLS, связывали импортин примерно в равной степени. Можно, однако, предположить, что связывание in vitro не способно уловить тонкие различия в силе взаимодействия. Известно, что в человеческих клетках на связывание импортина альфа с сигналом ядерной локализации могут оказывать влияние другие белки, изменяя силу подобного взаимодействия [18]. Отсутствие соответствующих белков в дрожжах может объяснить разницу в функционировании NLS в этих организмах.

С другой стороны, восстановление способности производных протимозина транспортироваться в ядро при добавлении к NLS определённых участков протимозина альфа может свидетельствовать об участии в транспорте дополнительных факторов, взаимодействующих с этими детерминантами, в процессе ядерного импорта в клетках дрожжей. Такие компоненты ядерного транспорта могут существенно различаться в клетках разных организмов, что объясняет столь различные требования к NLS протимозина в клетках человека и дрожжей.

Результаты данной работы можно рассматривать как демонстрацию различий в системе распознавания импортируемых субстратов в клетках человека и дрожжей, наблюдаемую несмотря на разительное сходство этих систем в целом. Однако, с нашей точки зрения, следует учитывать и другую возможность, а именно: выявленные области молекулы протимозина альфа, предшествующие его NLS, возможно, вносят вклад в импорт белка в ядро не только в клетках дрожжей, но и в клетках млекопитающих. Действительно, импорт протимозина альфа в ядро клеток млекопитающих очень эффективен: несмотря на мультикопийность протимозина, этот белок детектируется практически только в ядре. Для определения возможной роли выявленных областей протимозина альфа в его транспорте в ядро клеток млекопитающих потребуются, вероятно, кинетические исследования.

И, наконец, может ли быть практически использована выявленная способность N1,8 протимозина альфа функционировать в клетках человека, но не дрожжей? Нам представляется, что с её помощью можно суперпродуцировать в цитоплазме дрожжей рекомбинантные белки, содержащие N1,8 протимозина альфа, без их интерференции с внутриядерными процессами. После выделения таких белков из клеток дрожжей и введения в клетки человека, эти химерные конструкции должны вести себя как полноценные ядерные белки.

5. Материалы и методы Реактивы и компоненты сред дтт

Трис

Акрил амид

МБА

ПСА

ТЕМЕД

ВРВ

ХС

ЭДТА

Этидий бромид

Бакто-триптон

Дрожжевой экстракт

Бакто-агар

ДСН

ПЭГ 4000 ПЭГ 6000 сЮТР

Дрожжевые азотистые основания

Казаминовые кислоты Галактоза

ДНК-лигаза фага Т4 Фрагмент Кленова Рестриктазы

РНКаза А Эндонуклеаза 81

Fluka)

Sigma)

Serva)

Serva)

Merck)

Merck)

Merck)

BDH)

Sigma)

Merck)

Difco)

Difco)

Difco)

Serva)

Loba Feinchemie) (Loba Feinchemie) (Promega)

Difco)

Difco)

Sigma)

Fermentas)

Fermentas)

Fermentas, New England Biolabs, Promega) (Serva) (Promega)

Набор для секвенирования

ДНК "Sequence 2" (USB)

Ампициллин (Serva)

Канамицин (Serva) а-32Р] dATP, 5000Ки/ммоль (ФЭИ, г. Обнинск)

Остальные реактивы и соли - квалификации ОСЧ и ХЧ.

Состав буферов и сред

Буфер ТЕ

10 мМ Трис-HCl рН 8.0, 1мМ ЭДТА

Буфер ТВЕ

Буфер ВБЭ

50 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА рН 8.2-8.3

0.1 М Трис-HCl рН 8.0, 0.2 М NaCl, 10 мМ Р-МЭ, 20% глицерин, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ

Буфер TS

50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 150 мМ NaCl

10х буфер для лигирования ДНК

0.5 М Трис-HCl рН 7.4, 100 мМ MgCl2, 100 мМ ДТТ, 10 мМ спермидин буфер для протеинкиназы А

20мМ HEPES, рН 7.6, 50 мМ КС1, 10 мМ MgCl2 буфер для тромбина

20мМ Трис-HCl, рН 7.6, 50 мМ NaCl буфер для связывания

20мМ HEPES, pH 6.7, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0.05% Tween 20, 0.5 % BS А буфер TGES

20% EtOH, 0.025мМ Трис pH 8.3, 0.192 М глицин, 0.1% ДСН

YPD

1% дрожжевой экстракт, 2% триптон, 2% глюкоза

SD

0.67% YNB, 0.1% казаминовые кислоты 2% глюкоза

S5

0.67% YNB, 0.1% казаминовые кислоты 2% галактоза

SD-arap

SD + 2% агар

Центрифугирование препаратов проводили на центрифуге 5415С фирмы Eppendorf. Высушивание образцов производили на приборе "Speed Vac Concentrator" (Savant), а сушку гелей - на приборе "Slab Gel Dryer" (LKB). Электрофорез проводили с использованием источников постоянной мощности: "LKB-2297" и "ИПЭ-2000-0.2".

Для радиоавтографии гелей использовали рентгеновскую пленку "Retina".

Штаммы

В работе использовались штаммы Е. coli JM109 и дрожжей S. cerevisiae 2805 [МАТа, pep4::His3, prb 1-S, canl, Gal2, His 33, ura3-52].

Методы

Манипуляции с плазмидной ДНК

Все стандартные манипуляции с плазмидной ДНК осуществляли в соответствии с руководством [117]. Рестрикцию, лигирование и остальные ферментативные обработки фрагментов ДНК проводили при соответствующих температурах в стандартных буферах. Трансформацию клеток Е. coli осуществляли по методике [117], для выделения плазмид использовали методику [117].

Трансформация клеток дрожжей S. cerevisiae плазмидной ДНК

Трансформация клеток дрожжей штамма 2805 плазмидами проводилась по методике [118]. Культуру дрожжей на ночь засевали в 3 мл среды YPD и инкубировали при 30°С и активном перемешивании. Утром ее разбавляли в 50 раз свежей средой YPD, и 3 мл разбавленной культуры инкубировали в тех же условиях 2-3 часа (пока культура не достигала оптической плотности Абоо ~ 0.3 - 0.6 ое/мл). Клетки дрожжей собирали путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 2 мин, ресуспендировали в 3 мл 0.1 М LiOAc/TE (pH 8.0), после чего еще раз осаждали и ресуспендировали в 1 мл 0.1 М LiOAc/TE (pH 8.0). Из полученной суспензии клеток отбирали аликвоту объемом 60 мкл и добавляли к ней 5-8 мкл раствора плазмидной ДНК (0,5 - 1 мкг). Содержимое пробирки мягко перемешивали и оставляли на 5-8 мин при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 140 мкл 50% раствора ПЭГ 4000 в 0.1 М 1лОАс/ТЕ (рН 8.0) и тщательно перемешивали суспензию клеток, переворачивая пробирку. После этого пробирку со смесью инкубировали в течение 45-50 мин при 30°С и интенсивном перемешивании. Затем к смеси добавляли 25 мкл ДМСО (~ 10% от общего объема), перемешивали содержимое пробирки и инкубировали при 42°С в течение 5-7 мин (тепловой шок). Клетки осаждали центрифугированием, промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в 1 мл воды. 100200 мкл суспензии клеток высевали на чашки с твердой средой ББ-агар и инкубировали в течение трех суток при 30°С.

Получение суммарных лизатов из клеток, трансформированных производными pYeGFP

Клетки дрожжей штамма 2805, трансформированные плазмидами -производными pYeGFP, кодирующими химерные белки GFP - мутанты протимозина, выращивали в течение ночи в жидкой среде SD при 30°С. Клетки осаждали центрифугированием, промывали несколько раз средой S5, чтобы избавиться от следов глюкозы, которые могут препятствовать индукции транскрипции галактозой. Затем клетки ресуспендировали в 3-5 мл свежей среде S5 и выращивали в течение ночи при 30°С до OD60o ~ 610. Клетки осаждали, промывали небольшим объёмом воды ( ~ 1 мл ) и снова осаждали. К осадку добавляли 200 - 300 мг стеклянных шариков (Sigma, диаметр 425-600 нм) и 150 - 200 мкл буфера ВБЭ, интесивно встряхивали 2-3 мин. и инкубировали во льду 3 мин. После этого смесь центрифугировали 3 мин. на скорости 1500 об/мин. Супернатант отбирали, а осадок подвергали повторной аналогичной обработке. Супернатанты объединяли и использовали для электрофоретического анализа.

Секвенирование ДНК по методу Сэнгера

Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК в составе плазмид определяли по методике [119] с использованием модифицированной ДНК-полимеразы фага Т7 ("Секвеназа 2.0", фирма USB). Для секвенирования применяли стандартные прямой и обратный праймеры к плазмиде pUC19, а также праймеры к внутренним участкам кДНК ПроТа. Радиоактивное мечение ДНК проводили с помощью [a- P]dATP. Электрофоретическое разделение образцов осуществляли в 6% денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) (соотношение акриламид : метиленбисакриламид (АА : МБ А) - 20:1, электродный буфер - lxTBE) при мощности тока 50-80 Вт. После электрофореза гель фиксировали в растворе, содержащем 10% СН3СООН и 10% этанола, переносили на плотную бумагу, высушивали и радиоавтографировали.

Флуоресцентная микроскопия клеток, продуцирующих химерные белки ОГР - мутанты протимозина

Клетки дрожжей штамма 2805, трансформированные плазмидами -производными рУеОБР или рУеОРР+, кодирующими химерные белки (вБР, слитый с мутантными формами протимозина), выращивали в течение ночи в жидкой среде ББ при 30°С. Клетки осаждали центрифугированием и промывали несколько раз средой 85. Затем клетки ресуспендировали в 3 мл в свежей среды 85 и выращивали в течение ночи при 30°С. Клетки осаждали, ресуспендировали 200-300 мкл объеме воды, и аликвоту объемом 5-10 мкл смешивали на покровном стекле с равным объемом 1% расплавленной легкоплавкой агарозы, предврительно охлажденной до 37°С. Локализацию GFP-содержащих белков в клетках дрожжей проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Photomicroscope 3, оборудованного масляной иммерсионной линзой Neofluar ЮОх. Выражаю благодарность И.А. Воробьёву за помощь в работе, связанной с флуоресцентной микроскопией.

Электрофоретические методы

Гель-электрофорез лизатов дрожжей, продуцирующих гибридные белки GFP - протимозиновый мутант

Из полученного лизата отбирали аликвоту и анализировали при помощи элетрофореза в 12% ПААГ по Лэммли [120]. Для детекции GFP -содержащих белков использовали иммуноблоттинг.

Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле

Анализ фрагментов ДНК проводили в 0,8 - 2 % агарозных гелях. Гели и электродный буфер TBE содержали 1мкг/мл бромистого этидия. Образцы наносили на гель в растворе, содержащем 0.05% ВРВ и 5% глицерин. В качестве маркёров длин использовали гидролизаты pUC19/MspI и X/Pstl. Фрагменты ДНК детектировали в геле при его облучении УФ светом с длиной волны 302 нм. Элюцию фрагментов ДНК из агарозных гелей проводили с помощью набора QIAEX II (QIAGEN).

Детекция протимозиновых производных GFP методом имммуноблоттинга

После разделения белков из лизатов дрожжей электрофорезом в ПААГ гель вымачивали 10 минут в буфере TGES, после чего белки электрофоретечески переносили на мембрану Protran ВА83 (Schleicher & Schuell) в течение 2-х часов при силе тока 100 мА. После переноса мембрану 10 минут вымачивали в буфере TBST.

После этого производили забивку мембраны в 5% молоке, растворённом в буфере TBST при 4° С в течение 10 часов. Затем мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре в минимальном объёме 13 мл) TBST + 40 мкл антител к GFP, OD28o= 0.345. Далее мембрану промывали 3 раза по 10 минут свежим TBST и инкубировали в течение 1 часа с 3 мкл вторичных ослиных анти - кроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и раствтворённых в TBST. После этого несвязавшиеся антитела отмывали TBST 3 раза по 10 минут. Детекцию белков проводили при помощи набора ECL (Amersham Pharmacia).

Суперэкспрессия и выделение рекомбинантных белков из Е. coli

Производные протимозина, слитые с zz доменом, выделяли из свежетрансформированных соответствующими плазмидами клеток E.coli штамма JM109. Клетки выращивали в "Super medium" [104] при 30° С. К клеткам, находящимся на экспоненциальной фазе роста, добавляли IPTG до концентрации 0.5 мМ, индукцию вели при 30° С в течение пяти часов. После этого клетки собирали центрифугированием, ресупендировали в буфере TS и разрушали ультразвуком при 0° С. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием в течение 10 минут, 15000g и 4° С, лизаты инкубировали с 30 мкл IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia)

64 при температуре 4° С в течение двух часов постоянно встряхивая. После этого несвязавшиеся белки отмывали буфером TST (TS + 0.05% Tween 20). Количество и чистоту иммобилизованных на смоле белков определяли методом электрофореза по Лэммли.

Для выделения Srplp, слитого с zz доменом, штамм Е. coli JM109 трансформировался плазмидой pQEzzSrplp, клетки выращивали в "Super medium" при 30° С. Ночную кулльтуру разбавляли в 4 раза и через 2 часа индуцировали синтез белка 0.5 мМ IPTG в течение одного часа. Клетки собирали и ресупендировали в буфере TS с добавлением ПМСФ и лизоцима до концентраций 0.5 мМ и 1 мг/мл соответственно. Клетки инкубировали при комнатной температуре 15 минут, после чего добавляли дезоксихалат натрия и ДНКазу I до концентраций 1 мг/мл и 10 мкг/мл, соответственно, и клетки вновь инкубировали при комнатной температуре 15 минут. Далее, клеточный дебрис отделяли путём центрифугирорвания при 20000g в течение 10 минут при 4° С. zz-Srplp выделяли из полученного таким образом клеточного экстракта на IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia) как описано ранее.

Введение радиоактивной метки в препарат Srplp

Аликвоту Srplp, содержащую примерно 0.5 мкг белка,

32 иммобилизованного на IgG Sepharose, инкубировали с 50 |iCi [у- Р] АТР (5000 Ки/ммоль) и одной единицей протеинкиназы А (каталитическая субъединица, Sigma) в буфере для фосфорилирования в течение 30 минут

32 при 30° С. Невключивпгуюся метку отмывали тем же буфером. Р меченный Srplp элюировали со смолы путём разрезания по сайту тромбина, расположенному между zz - доменом и сайтом фосфорилирования. Для этого сорбент инкубировали с 0.08 единицами тромбина (Novagen) в буфере для тромбина в течение 30 минут при комнатной температуре, реацию останавливали добавлением к смеси

ПМСФ до 5мМ. Полноту гидролиза элюированного 8гр1р подтверждали электрофорезом в 10% ПААГ. Удельная радиоактивность полученного препарата 32Р 8гр1р составила 1,2х105 имп/мин *мкг.

Связывание Р Эгр1р на смоле с иммобилизованными мутантами протимозина альфа

Аликвоты ЗерИагоБе с иммобилизованными ъъ - производными протимозина альфа ( ~ 1 мкг белка на образец) промывали буфером для связывания и ресупендировали в 700 мкл того же буфера. К каждому образцу суспензии добавляли Р Бгр1р (30000 имп/мин), после чего образцы инкубировали два часа при 4° С при непрерывном встряхивании. После этого смолу осаждали в течение 10 секунд при 12000g и дважды

32 промывали тем же буфером. Количество связавшегося Р 8гр1р определяли с помощью сцинциляционного счётчика, после чего связавшиеся белки элюировали со смолы кипячением в буфере для нанесения на электрофорез по Лэммли с последующим разделением в 12% ПААГ, прокрашиванием Кумаси синим и радиоавтографией.

5.1. Конструирование илазмид

Конструирование плазмид, экспрессирующих в клетках дрожжей химерные белки, состоящие из GFP и мутантов протимозина а

Для создания химерных генов GFP и ПроТа и их экспрессии в клетках S. cerevisiae были использованы плазмиды pYeGFP и pYeGFP+ [103]. Ген GFP в этих плазмидах не содержит терминатора трансляции и оканчивается протяженным полилинкером, что облегчает конструирование химерных генов, кодирующих GFP с различными довесками на С - конце.

В качестве источника кДНК протимозина а использовали полученную ранее плазмиду рНТ15[121]. Она представляет собой плазмиду pUC19, в которую по сайту Smal в смысловой ориентации вставлена белок -кодирующая часть кДНК протимозина альфа человека.

Плазмиды, кодирующие GFP, слитый с полноразмерным протимозином, а также с мутантами I и III были получены ранее [103].

Плазмиду, кодирующую мутант II, слитый с GFP, получали так: плазмиду рНТ15 гидролизовали рестриктазами Ndel и Hindill. Полученный фрагмент гидролизовали рестриктазой DdeI и достраивали фрагментом Клёнова, а затем гидролизовали рестриктазой ВатШ. Фрагмент ВатШ - Ddel размером 255 п.н. лигировали с вектором pUC19, предварительно обработанным рестриктазой Xbal, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ. Полученная плазмида называлась pUC-II. Далее эту плазмиду гидролизовали рестриктазами ВатШ и Sali, полученный фрагмент размером 270 п.н. лигировали в плазмиду pYeGFP, обработанную рестриктазами Bglll и Sail.

Плазмиды, кодирующие мутанты IV - VI, были получены следующим образом. Плазмиду рНТ15 гидролизовали Accl, HinII или isco 1301, соответственно. Выступающие концы заполняли фрагментом Клёнова и проводили обработку Kpnl. Образовавшиеся фрагменты размером 184, 246 и 301 п.н. вставляли в плазмиду pYeGFP, которая предварительно была обработана ЕсоШ, затем фрагментом Кленова, и, наконец, КрпI.

Плазмида, кодирующая мутант VII, была сконструирована следующим образом. Плазмиду рНТ15 гидролизовали рестриктазами Ndel и Hindlll. Полученный фрагмент размером 600 п.н. гидролизовали рестриктазой Ddel и тупили выступающие концы эндонуклеазой S1. Далее смесь получившихся фрагментов гидролизовали рестриктазой ЕсоШ. Полученные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, откуда элюировали зону 98 п.н. Полученный фрагмент лигировали в вектор рНТ15, предварительно обработанный рестриктазой £со1301, эндонуклеазой S1 и рестриктазой EcoRl. Полученная плазмида была названа pUC-VII. Плазмиду pGFP-C2 (Clontech), кодирующую белок GFP, гидролизовали рестриктазой NheI, выступающие концы заполняли фрагментом Кленова, после чего гидролизовали рестриктазой ВатШ. Полученный при этом фрагмент длиной 803 п.н. клонировали в плазмиду pUC-VII, обработанную предварительно рестриктазой Hindlll, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ. Полученная плазмида была названа pUGPASty-Dde. Плазмиду pUGPASty-Dde гидролизовали рестриктазами ВатШ и ЕсоШ, полученный фрагмент размером 140 п.н. лигировали в плазмиду pYeGFP, обработанную рестриктазами Bglll и iscoRL

Для синтеза мутанта VIII плазмиду рНТ15 гидролизовали рестриктазами Ndel и Hindlll. Полученный фрагмент размером 600 п.н. гидролизовали Hin II, выступающие концы заполняли фрагментом Клёнова, после чего проводили гидролиз ВатШ. Используя электрофорез в агарозном геле, выделяли фрагмент размером 100 п.н. Параллельно с этим, плазмиду рНТ15 гидролизовали рестриктазой Hinfl, обрабатывали фрагментом Клёнова и рестриктазой Kpnl, и выделяли фрагмент размером 95 п.н. Два полученных фрагмента протимозина одновременно лигировались в вектор pUC19, который предварительно был обработан ВатШ и Kpnl. Полученную плазмиду назвали pUC-VIII. Плазмиду pUC

VIII гидролизовали рестриктазами ВатШ и ЕсоШ. Полученный фрагмент размером 195 п.н. лигировали в вектор pYeGFP, обработанный предварительно рестриктазами BgäI и £coRI (Bglll и ВатШ образуют комплементарные 5'- выступающие концы).

Плазмида, кодирующая мутант IX, была получена так: фрагмент плазмиды pGFP-C2 (Clontech), полученный после гидролиза плазмиды рестриктазой Nhel, обработки фрагментом Клёнова и гидролиза рестриктазой ВатШ, был вставлен в плазмиду pUC-VII, обработанную предварительно рестриктазой Hindill, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ. Полученная плазмида была названа pUC-IX. Далее pUC-IX обрабатывалась последовательно рестриктазой EcoRl, фрагментом Клёнова и рестриктазой Sali. При этом из плазмиды был вырезан фрагмент размером 175 п.н., который был вставлен в плазмиду pYeGFP по сайтам Smal и Sali.

Конструирование плазмид, кодирующих белки, использовавшиеся в опытах по связыванию in vitro

Суперэкспрессию zz - производных белков в клетках E.coli вели при помощи серии векторов pQEzz: pQEzz59, pQEzzöO [104], pQEzzöl, созданных в нашей лаборатории на основе плазмиды pQE60 (QIAGEN).

Плазмида pQEzzöl была получена из pQEzz60 путём рестрикции Ассб 51, обработки фрагментом Клёнова в присутствии dNTP и самолигирования.

Фрагменты, кодирующие полноразмерный протимозин альфа и мутант I, были вырезаны соответственно из рНТ15 и pYeGFPA(101-109) [103] в результате обработки этих плазмид рестриктазой ЕсоШ, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ. Полученные фрагменты были лигированы в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой Hindill, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ.

Фрагмент, кодирующий мутант И, был вырезан из плазмиды pUC-II последовательной обработкой рестриктазой Hindill, фрагментом Клёнова, рестриктазой ВатШ и вставлен в плазмиду pQEzz59, подвергшуюся такой же обработке.

Фрагмент, кодирующий мутант III, вырезали из плазмиды pYeGFP-NLS [103] при помощи гидролиза рестриктазой EcoRI, обработки фрагментом Клёнова и гидролиза рестриктазой Bgäl. Далее этот фрагмент вставляли в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой Hindill, фрагментом Клёнова и рестриктазой Bglll.

Фрагменты, кодирующие мутанты IV-VI, вырезали из соответствующих производных pYeGFP, для чего плазмиды гидролизовали рестриктазами Bglll и Асс651. Полученные фрагменты вставлялись в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой HindiII, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ.

Фрагменты, кодирующие мутанты VII и VIII, вырезали из плазмид pUC-VII и pUC-VIII соответственно. Для этого плазмиды были обработаны рестриктазой iscoRI, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ. Полученные фрагменты лигировали в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой Hindill, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ.

Плазмиду pUC-IX обрабатывали рестриктазой Ndél, фрагментом Клёнова и рестриктазой Bglll. Получившийся фрагмент размером 415 п.н. вставляли в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой Hindlll, фрагментом Клёнова и рестриктазой ВатШ.

Для синтеза химерного белка, состоящего из NLS Т - антигена вируса SV40 и zz - домена, плазмида pGAD424 (Clontech) была обработана рестриктазой Hindlll, фрагментом Клёнова и рестриктазой Kpril. Полученный фрагмент размером 75 п.н. был вставлен в плазмиду pQEzzóO, обработанную рестриктазой Sacl, Т4 ДНК - полимеразой и рестриктазой Kpnl.

Для создания плазмид, кодирующих тройные химерные белки zz-GFP-ProTa, фрагменты, кодирующие GFP - протимозин, были вырезаны из соответствующих производных pYeGFP по сайтам рестриктаз ВатШ и ЕсоШ и вставлены в плазмиду pGFP-C2, обработанную аналогичным образом. Далее, из полученных плазмид вырезали фрагмент ВатШ-Hindlll и лигировали его в плазмиду pQEzzöl.

Плазмида pQEzzSrplp кодирует химерный белок, состоящий из следующих элементов (от N - конца к С - концу): zz домен, сайт разрезания тромбином, сайт узнаваниа протеинкиназой и собственно полноразмерный Srplp. Для её конструирования плазмиду pNOY162 [105] (любезно предоставлена М. Nomura) обрабатывали рестриктазой Ncol, фрагментом Клёнова и рестриктазой Notl. Получившийся фрагмент размером 1370 п.н. вставляли в плазмиду pET33b+ (Novagen), обработанную рестриктазой ВатШ, фрагментом Клёнова и рестриктазой Notl. Получившуюся плазмиду далее обрабатывали рестриктазой Ndel, фрагментом Клёнова и рестриктазой Ncol, после чего в неё вставляли фрагмент размером 890 п.н., полученный из pNOY162 в результате обработки рестриктазой Vspl, фрагментом Клёнова и рестриктазой Ncol, полученую плазмиду назвали pETSrp. Наконец, полученная плазмида подвергалась частичному гидролизу рестриктазой Ncol, обработке фрагментом Клёнова и обработке рестриктазой Xhol. Полученный фрагмент размером 2100 п.н., содержащий ген Srplp, вставляли в плазмиду pQEzz59, обработанную рестриктазой ВатШ, фрагментом Клёнова и рестриктазой Sali.

Для получения плазмиды pACTSrp, использовавшейся для опытов с двугибридной системой, плазмиду pETSrp подвергали частичному гидролизу рестриктазой Ncol и обрабатывали Xhol. Полученный фрагмент размером 2100 п.н., содержащий ген Srplp, вставляли в плазмиду рАСТ2.

6. Выводы

Сигнал ядерной локализации протимозина альфа человека необходим, но не достаточен для транспорта химерных белков в ядро клеток З.сегеутае.

В ядерный транспорт протимозина альфа в клетках дрожжей, помимо собственно М^Э, вносят вклад участки, сформированные аминокислотными остатками 15-31, 33-52 и 53-81 молекулы протимозина.

N1^ протимозина- альфа человека необходим и достаточен для взаимодействия с импортином альфа дрожжей (белок 8гр1р), однако это взаимодействие не обеспечивает ядерный импорт в клетках З.сегеушае.

7. Список литературы Borgeld, W., Naruse, К., Zhang, J., Kikuchi, A., Tanaka, M. (1999) Appropriately spaced nuclear localizing signals are necessary for efficient nuclear import of nonnuclear proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256, 278-283. Robbins J, Dilworth SM, Laskey RA, Dingwall С. (1991) Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence. Cell 64, 615-623 Roberts, B. (1989) Nuclear location signal-mediated protein transport. Biochim. Biophys. Acta 1008, 263-280 . Kalderon, D, Smith AE. (1984) In vitro mutagenesis of a putative DNA binding domain of SV40 large-T. Virology 139, 109-37. Nath, ST., Nayak, D.P. (1990) Function of two discrete regions is required for nuclear localization of polymerase basic protein 1 of A/WSN/33 influenza vims (HI N1). Mol. Cell Biol. 10,4139-4135. Morin, N., Delsert, C., Klessig, DF. (1989) Cis-acting elements and a transacting factor affecting alternative splicing of adenovirus LI transcripts. Mol. Cell Biol. 9, 4372-4380. Sherman, D., Brophy, P. (1999) A tripartite nuclear localization signal in the PDZ - domain protein L - periaxin. J Biol. Chem. 275, 4537-4540. Makkerh, P.S., Dingwall, C., Laskey, R.A. (1996) Comparitive mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr. Biol. 6, 1025-1027. Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, von Heijne G. (2000) Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J. Mol. Biol. 300, 1005-1016.

10) Richardson, W.D., Roberts, B.L., Smith, A.E. (1986) Nuclear location signals in polyoma virus large-T. Cell 44, 77-85.

1) Malik, H., Eickbush, T., Goldfarb, D. (1997) Evolutionary specialization of nuclear targeting apparatus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13738-13742.

2) Peifer, M., Berg, S., Reynolds, A.B. (1994) A repeating amino acid motif shared by proteins with diverse cellular roles. Cell 76, 789-791.

3) Kohler, M., Ansieau, S., Prehn, S., Leutz, A., Hartmann, E. (1997) Clonning of two novel human importin-a subunits and analysis of the expression pattern of the importin-a protein family. FEBS Lett. 417, 104-108.

4) Nachury, M., Ryder, U., Lamond, A., Weis, K. (1998) Clonning and characterization of hSRPly, a tissue-specific nuclear transport factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582-587.

5) Yano, R., Oakes, M., Yamaghishi, M., Dodd, M., Nomura, M. (1992) Cloning and characterization of SRP1, a suppressor of temperature-sensitive RNA polymerase I mutations, in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 12, 5640-5651.

6) Fontes, M., The, T., Kobe, B (2000) Structural basis of recognition of monopartite and bipartite nuclear localization sequences by mammalian importin-a. J. Mol. Biol. 297, 1183-1194.

7) Kobe, B. (1999) Autoinhibition by an internal nuclear localization signal revealed by the crystal structure of mammalian importin alpha. Nature Struct. Biol. 6, 388-397.

8) Nadler, S., Tritschler, D., Haffar, O., Blake, J., Bruce, G., Cleaveland, J.

1997) Differential expression and sequence-specific interaction of karyopherin a with nuclear localization sequences. J.Biol. Chem. 272, 4310-4315.

9) Iwasaki, T., Matsuki, R., Shoji, K., Sanmiya, K., Miyao, M., Yamamoto, N.

1998) A novel importin a from rice, a component involeved in the process of nuclear protein transport. FEBS Lett. 428,259-262.

0) Andrate, M. A., Bork, P. (1995) HEAT repeats in the Huntington's disease protein. Nat. Genet. 11,115-116.

1) Ruediger, R., Heintz, M., Fait, J., Mumby, M., Walter, G. (1994) Molecular model of the A subunit of protein phosphatase 2A: interaction with other subunits and tumor antigens. J. Virol. 68,123-129.

2) Cingolani, G., Petosa, C., Weis, K., Muller, C. (1999) Structure of importin-p bound to the IBB domain of importin-a. Nature 399, 221-229.

3) Weis, K., Ryder, U., Lamond, A. (1996) The consereved amino-terminal domain of hSRPla is essential for nuclear import. EMBO J. 15, 1818-1825.

4) Kutay, U., Izaurralde, E., Bischoff, F., Mattay, I., Gerlich, D. (1997) Dominant - negative mutants of importing block multiple pathways of import and export through the nuclear pore comlex. EMBO J. 16, 1153-1163.

5) Cingolani, G., Lashuel, H., Gerace, L., Muller, C. (2000) Nuclear import factors importin a and importin |3 undergo mutually induced conformational changes upon association. FEBS Lett. 484,291 -298.

6) Herold, A., Truant, R., Wiegand, H., Cullen, B. (1998) Determination of the functional organization of the importin a nuclear import factor. J. Biol. Chem. 2, 309-318.

7) Enenkel, C., Schulke, N., Blobel, G. (1996) Expression in yeast of binding regions of karyopherins a and P inhibits nuclear import and cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12986-12991.

8) Weis, K., Mattaj, I., Lamond, A. (1995) Identification of hSRPla as a functional receptor for nuclear localization sequences. Science 268, 1049-1053.

9) Lau, D., Kunzler, M., Braunwarth, A., Hellmuth, K., Podtelejnikov, A., Mann, M., Hurt, E. (2000) Purification of protein A-tagged yeast Ran reveals association with a novel karyopherin P family member, Pdr6p. J.Biol. Chem. 274, 467-471.

3) Pante, N., Aebi, U. (1996) Toward the molecular dissection of protein import into nuclei. Curr. Opin. Cell Biol. 8,397-406.

1) Wente, S. (2000) Gatekeepers of the nucleus. Science 288, 1474-1377.

2) Stoffler, D., Fahrenkrog, B., Aebi, U. (1999) The nuclear pore complex: from molecular architecture to functional dynamics. Curr. Op. Cell Biol. 11, 391-401.

3) Doye, V., Hurt, E. (1995) Genetic approaches to nuclear pore structure and function. Trends Genet. 6, 235-241.

4) Bucci, M., Wente, S. (1997) In vivo dynamics of nuclear pore complexes in yeast. J. Cell Biol. 6, 1997.

5) Route, M., Aitchison, J., Suprapto, A., Hjertaas, K., Zhao, Y.(2000) The yeast nuclear pore complex: composition, architecture, and transport mechanism. J.Cell Biol. 4, 635-651.

5) Yang, Q., Rout, M., Akey, C. (1998) Three-dimensional architecture of the isolated yeast nuclear pore complex: functional an evolutionary implications. Mol. Cell 1,223-234. 7) Fontoura, B., Blobel, G., Matunis, M. (1999) A conserved biogenesis pathway for nucleoporins: proteolytic processing of a 186-kilodalton precursor generates Nup98 and the novel nucleoporin, Nup96. Cell Biol. 144, 1097-1112. S) Rout, M., Blobel, G.(1993) Isolation of the yeast nuclear pore complex. J. Cell Biol.123, 771-783. )) Fahrenkrog, B., Hurt, E., Aebi, U., Pante, N. (1998) Molecular architecture of the yeast nuclear pore complex: localization of Nsplp subcomplexes. J. Cell Biol. 143, 577-588. Kraemer, D., Strambio-de-Castillia, C., Blobel, G., Rout, M. (1995) The essential yeast nucleoporin NUP159 is located on the citoplasmic side of the nuclear pore complex and serves in karyipherin-mediated binding of transport substrate. J. Biol. Chem. 270, 19017-19021. Hurwitz, M., Strambio-de-Castillia, C., Blobel, G. (1998) Two yeast nuclear pore proteins involeved in mRNA export form a cytoplasmically oriented subcomplex Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11241-11245. 1) Wente SR, Blobel G. (1994) NUP145 encodes a novel yeast glycine-leucine-phenylalanine-glycine (GLFG) nucleoporin required for nuclear envelope structure. J. Cell Biol. 125, 955-969. Stoffler, D., Goldie, K., Feja, B., Aebi, U. (1999) Calcium-mediated structural changes of native nuclear pore complexes monitored by time-lapse atomic force microscopy. J. Mol. Biol. 287,741-752.

I-) Akey, C., Radermacher, M. (1993) Architecture of the Xenopus nuclear pore complex resolved by 3D cryo-electron microscopy. J. Cell Biol. 122, 1-19. i) Kutay, U., Izaurralde, E., Bischoff, F., Mattay, I., Gerlich, D. (1997) Dominant - negative mutants of importinP block multiple pathways of import and export through the nuclear pore comlex. EMBO J. 16, 1153-1163. Bischoff, F., Ponstingl, H. (1995) Mitotic regulator protein RCC1 is complexed with a nuclear Ras related polypeptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10830-10834.

0 Klebe, C., Bischoff, F., Ponstingl, H., Wittinghofer, A. (1995) Interaction of the nuclear GTP-binding protein Ran with the regulatory proteins RCC1 and RanGAPl. Biochemistry 34, 639-647.

I) Bischoff, F., Klebe, C., Kretchmer, J., Wittinghofer, A., Ponstingl, H. (1994) RanGAPl induces GTPase activity of nuclear ras-related Ran. Proc. Natl. Acad. Sci. 91,2587-2591. Bischoff, F., Krebber, H., Kempf, T., Hermes, I., Ponstingl, H.(1995) Human RanGTPase activating protein RanGAPl is a homolog of yeast RNAlp involeved in massenger RNA processing and transport. Proc. Natl. Acad. Sci. 92,1749-1753.

3) Backer, J., Melchior, F., Gerke, V., Bischoff, F., Ponstingl, H., Wittinghofer, A. (1995) RNA1 encodes a GTPase-activating protein specific for GSPlp, the Ran/TC4 homolog of S.cerevisiae. J. Biol. Chem. 270, 11860-11865.

1) Corbett, A., Koepp, D., Schlenstedt, G., Lee, M., Hopper, A., Silver, P. (1995) Rnalp, a Ran/TC4 GTFase activating protein, is required for nuclear import. J. Cell Biol. 130,1017-1026.

2) Hopper, A., Traglia, H., Dunst, R. (1990) The yeast RNA1 gene product necessary for RNA processing is located in the cytisol and apparently excluded from the nucleus. J. Cell Biol. Ill, 309-321.

5) Melchior, F., Weber, K., Gerke, V. (1993) A functional homologue of the RNA1 gene product in Schizosaccharomyces pombe: purification, biochemical characterization and identification of a leucine-rich repeat motif. Mol. Cell Biol. 4, 569-581.

4) Coutavas, E., Ren, M., Oppenheim, J., D'Eustachio, P., Rush, M. (1993) Characterization of proteins that interact with cell-cycle regulatory protein Ran/TC4. Nature 366, 585-587.

5) Gerlich, D., Pante, N., Kutay, U., Aebi, U., Bischoff, F (1996) Identification of different roles for RanGDP and RanGTP in nuclear protein import. EMBO J. 20, 5584-5594.

6) Pemberton, L., Blobel, G., Rosenblum, J. (1998) Transport routes through the nuclear pore complex. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 392-399.

7) Radu, A., Blobel, G., Moore, M. (1995) Identification of a protein complex that is required for nuclear protein import and mediates docking of import substrate to distinct nucleoporins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1769-1773.

8) Feldherr, C., Akin, D., Moore, M. (1998) The nuclear import factor pi0 regulates the functional size of the nuclear pore complex during oogenesis. Cell Sci. 111,1889-1896.

9) Floer, M., Blobel, G. (1996) The nuclear transport factor karyopherin [3 binds stoichiometrically to Ran-GTP and inhibits the Ran GTPase activating protein. J.Biol. Chem. 10, 5413-5316.

0) Renault, L., Wittinghoher, A. (1998) A 1.7 A crystal structure of the regulator of chromosome condensation (RCC1) reveals a seven-bladed propeller. Nature 392, 97-101.

51) Hillig, R., Renault, L., Vetter, I., Drell, T., Wittinghofer, A., Backer, J. (1999) The crystel structure of rnalp: a new fold for a GTPase-activating protein. Moll. Cell 6, 781-791.

52) Vetter, I, Arndt, A., Kutay, U., Gorlich, D., Wittinghofer, A. (1999) Structural view of the Ran-importin (3 interaction at 2.3 A resolution. Cell 97, 635-646, 1999.

3) Chook, Y., Blobel, G. (1999) Structure of the nuclear transport complex karyopherin-p bound 2-Ran*GppNHp. Nature 399, 230-237.

4) Vetter, I., Novak, C., Nishimoto, T., Kuhlmann, J., Wittinghofer, A. ( 1999) Structure of a Ran - binding domain complexed with Ran bound to a GTP analogue: implications for nuclear transport. Nature 398, 39-46.

5) Stewart, M., Kent, H., McCoy, A. (1998) The structure of the Q69L mutant of GDP-Ran shows a major conformational change in the switch II loop that accounts for its failure to bind nuclear transport factor 2 (NTF2). J. Mol. Biol. 284,1517-1527.

6) Fornerod, M., van Deursen, J., van Baal, S., Reynolds, A., Davis, D., Murti, K., Fransen, J., Grosveld, G. (1997) The human homologue of yeast CRM1 is in dynamic subcomplex with CAN/Nup214 and a novel nuclear pore component Nup88. EMBO J. 16, 808-816.

7) Melchior, F., Paschal, B., Evans, E., Gerace, L. (1993) Inhibition of nuclear protein import by nonhydrolyzable analogs of GTP and identification of the small GTPase Ran/TC4 as an essential transport factor. J. Cell Biol. 123, 16491659.

8) Moore, M., Blobel, G. (1993) The GTP - binding protein Ran/TC4 is required for protein import into nucleus. Nature 365, 661-663.

9) Biscoff, F., Krebber, H., Smirnova, E., Dong, W., Ponstingl, H. (1995) Coactivating of RanGTPase and inhibition of GTP dissociation by Ran GTP binding protein RanBPl. EMBO J. 14, 705-715.

0) Richards, S., Lounsbury, K., Macara, I. (1995) The C terminius of the nuclear RAN/TC4 GTPase stabilizes the GDP -bound state and mediates interactions with RCC1, RAN-GAP, and HTF9A/RANBP1. J. Biol. Chem. 270, 14405-14411.

1) Nachury, M., Weis, K. (1999) The direction of transport through the nuclear pore can be inverted. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9622-9627,1999.

2) Schwoebel, E., Talcott, B., Cushman, I., Moore, M. (1998) Ran-dependent signal-mediated nuclear import does not require GTP hydrolysis by Ran. J. Biol. Chem. 273,35170-35175.

3) Moroianu, J., Blobel, G., Radu, A. (1996) Nuclear protein import: Ran-GTP dissociates the karyopherin oc(3 heterodimer by displacing a from an overlapping binding site on p. Cell Biology 93, 7059-7062.

4) Lounsbury, K., Macara, I. (1997) Ran-binding protein 1 (RanBPl) forms a ternary complex with Ran and karyopherin P and reduces Ran GTPase-activating protein (RanGAP) inhibition by karyopherin p. J. Biol. Chem. 272, 551-555.

5) Floer, M., Blobel, G., Rexach, M. (1997) Disassembly of RanGTP-karyopherin P complex, an intermediate in nuclear protein import. J. Biol. Chem. 272, 19538-46.

6) Kutay, U., Bischoff, F., Kostka, S., Kraft, R., Gerlich, D. (1997) Export of importin alpha from the nucleus is mediated by a specific nuclear transport factor. Cell 90, 1061-1071.

7) Hood, J., Silver, P. (1998) Csel is required for export of Srplp/importin-a from the nucleus in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol. Chem. 273, 35142-35146.

8) Bischoff, F., Gorlich, D. (1997) RanBPl is crucial for the release of RanGTP from importin P-related nuclear transport factors FEBS Lett. 419, 249254. r9) Booth, J., Belanger, K., Sannella, M., Davis, L. (1999) The yaest nucleoporin Nup2p is involved in nuclear export of importin a/Srplp. JBC 274, 3236032367.

0) Kose, S., Imamoto, N., Tachibana, T., Yoshida, M., Yoneda, Y. (1999) p-subunit of nuclear pore-targeting complex (importin-P) can be exported from the nucleus in a Ran-independent manner. J. Biol. Chem. 274, 3946-3952.

I) Izaurralde, E., Kutay, U., von Kobbe, C., Mattaj, I., Gerlich, D. (1997) The asymmetric distribution of the constituents of the Ran system is essential for transport into and out of the nucleus. EMBO J. 16, 6535-6547.

Paschal, B., Delphin, C., Gerace, L. (1996) Nucleotide-specific interaction of Ran/TC4 with nuclear transport factors NTF2 and p97. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7679-7683.

J) Ribbeck, K., Lipowsky, G., Kent, H., Stewart, M., Gorlich, D. (1998) NTF2 mediates nuclear import of Ran. EMBO J. 22,6587-6598.

0 Clarkson, W., Kent, H.,. Stewart, M. (1996) Separate binding sites on nuclear transport factor 2 (NTF2) for GDP-Ran and the phenylalanine-rich repeat regions of nucleoporins p62 and Nsplp. J. Mol. Biol. 263, 517-524.

5) Nehrbrass, U., Blobel, G. (1996) Role of the nuclear transport factor plO in nuclear import. Science 272, 120-122.

5) Stewart, M., Kent, H., McCoy, A. (1998) Structural basis for molecular recognition between nuclear transport factor 2 (NTF2) and GDP-bound form of the Ras-family GTPase Ran. J. Mol. Biol. 277, 635-646.

7) Quimby, B., Lamitina, T., L'Hernault, S., Corbett, A. (2000) The mechanism of Ran import into the nucleus by nuclear transport factor 2. J. Biol. Chem. 37, 28575-28282.

8) Steggerda, S., Black, SM., Paschal, BM. (2000) Monoclonal antibodies to NTF2 inhibit nuclear protein import by preventing nuclear translocation of the GTPase Ran. Mol. Biol.Cell 11, 703-719.

9) Milburn, M., Tong, L., DeVos, A., Brunger, A., Yamaizumi, Z., Nishimura, S., Kim, S. (1990) Molecular switch for signal transduction: structural differences between active and inactive forms of protooncogenic ras proteins. Science 247, 939-945.

0) Mahajan, R., Delphin, C., Guan, T., Gerace, L., Melchior, F. (1997) A small ubiquitin-related polypeptide involeved in targeting RanGAPl to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell 88, 97-107.

1) Jans, D.A. (1995) The regulation of protein transport to the nucleus by phosphorylation. Biochem J. 311, 705-716.

2) Henkel, T., Zabel, U., Zee, K., Muller, J., Fanning, E., Baeuerle, P. (1992) Intramolecular masking of the nuclear location signal and dimerization domain in the precussor for the p50 NF-kB subunit. Cell 68, 1121-1133.

3) Tagawa, T., Kuroki, T., Vogt, P., Chida, K. (1995) The cell cicle-dependent nuclear import of v-Jun is regulated by phosphorylation of a serine adjacent to the nuclear localization signal. J. Cell Biol. 2,255-263.

4) Yeh, C., Wong, S., Fung, Y., Ou, J. (1993) Cell cycle regulation of nuclear localization of hepatitis B virus core protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 64596463.

5) Gorner, W., Durchschlag, E., Martinez-Pastor, M., Estruch, F., Ammerer, G., Hamilton, B., Ruis, H., Schuller, C. (1998) Nuclear localization of the C2H2 zinc finger protein Msn2p is regulated by stress and protein kinase A activity. Genes Dev. 12,586-597.

6) Miller M, Reddy BA, Kloc M, Li XX, Dreyer C, Etkin LD. (1991) The nuclear-cytoplasmic distribution of the Xenopus nuclear factor, xnf7, coincides with its state of phosphorylation during early development. Development 113, 569-575.

7) Li, X., (1994) Cytoplasmic retention of Xenopus nuclear factor 7 before the mid blastula transition uses a unique anchoring mechanism involving a retention domain and several phosphorylation sites. J. Cell Biol. 124, 7-17.

•8) Rupp, R., Snider, L., Weintraub, H. (1994) Xenopus embryos regulate the nuclear localization ofXmyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323.

9) Feldherr, C., Akin, D. (1990) The permeability of the nuclear envelope in dividing andnondividing cell cultures. J. Cell Biol. Ill, 1-8.

00) Feldherr, C., Akin, D. (1993) Regulation of nuclear transport in proliferating and quiescent cells. Exp. Cell Res. 205, 179-186.

1) Jullien, D., Gorlich, D., Laemmli, U., Adachi, Y. (1999) Nuclear localization of RPA in Xenopus egg extracts requires a novel protein XRIPa but not importin a. EMBO J. 15, 4348-4358.

2) Lee, D., Aitchison, J. (1999) Kap 104p-mediated nuclear import. J. Biol. Chem. 274, 29031-29037.

33) Rubtsov, Y. P., Zolotoukhin, A.S., Vorobjev, I. A., Chichkova, N. V., Pavlov, N.A., Karger, E. M., Evstafieva, A.G., Felber, B.K. and Vartapetian, A.B. (1997) Mutational analysis of human prothymosin a reveals a bipartite nuclear localization signal, FEBS Lett. 413, 135-141.

04) Chichkova, N. V., Evstafieva, A.G., Lyakhov, I. G., Tsvetkov, A.S., Smirnova, T.A., Karapetian, R. N., Karger, E.M. and Vartapetian, A.B. (2000) Divalent metal cation binding properties of human prothymosin alpha. Eur. J. Biochem. 267,4745-4752.

05) Yano, R., Oakes, M. L., Tabb, M. M., Nomura, M. (1994) Yeast Srplp has homology to armadillo/plakoglobin/beta-catenin and participates in apparently multiple nuclear functions including the maintenance of the nucleolar structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6880-6884.

06) Pan, L., Haritos, A., Wideman, J., Komyama, T., Chang, M., Stein, S., Slavin, S., Horecker, B. (1986) Human prothymosin a: amino acid sequence and immunologic properties. Arch. Biochem. Biophis. 250, 197-201.

07) Eschenfeldt, W., Berger, S. (1986) The human prothymosin a gene is polimirphic and induced upon qrowth stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9403-9407.

08) Goodal, G., Domínguez, F., Horecker, B. (1986) Molecular cloning of cDNA for human prothymosin a. Roc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8926-8928.

09) Watts J., Cary P., Sautiere P., Crane-Robinson C. (1990) Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins. Eur. J. Biochem. 192, 643-651.

10) Gast, K., Damaschun, H., Eckert, K., Schulze-Forster, K., Maurer, H., Muller-Frohne, M., Zirwer, D., Czarnecki, J., Damaschun G. (1995)

Prothymosin a: a biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry 43, 13211-13218.

1) Sburlati, A., De la Rosa, A., Batey, D., Kurys, G., Manrow, R., Pannel, L., Martin, В., Sheeley, D., Berger, S. (1993) Phosphorylation of human and bovine prothymosin a in vivo. Biochemistry 32,4587-4596.

2) Gomez-Marquez, J., Segade, F., Dosil, M., Pichel, J., Bustelo, X., Freire, M. (1989) The expression of prothymosin a gene in T limphocytes and leukemic limphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem. 264, 84518454.

13) Tsitsiloni, O., Stiakakis, J., Koutselinis, A., Gogas, J., Markopoulos, C., Yialouris, P., Beckris, S., Panoussopoulos, D., Haritos, A. (1993) Expression of a-thymosins in human tissues in normal and abnormal growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9504-9507.

14) Sburlati, A., Manrow, R., Berger, S. (1991) Prothymosin a antisence oligomers inhibit myeloma cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 253257.

15) Evstafieva, A. G., Belov, G. A., Kalkum, M., Chichkova, N. V., Bogdanov, A. A., Agol, V. I., Vartapetian A. B. (2000) Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. FEBS Lett. 467, 150-154.

16) Gorlich, D., Mattaj, I.W. (1996) Nucleocytoplasmic transport. Science 271, 1513-1518.

17) Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. //Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: "Мир" (1984)

18) Hill, J., Donald, K.A.,Griffits, D.E. (1991) DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucl. Acids Res. 19, 5791.

19) "Sequenase Version 2.0 manual " USB, 1990

20) Остерман, JI.A. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: "Наука"

21) Evstafieva, A. G., Chichkova, N. V., Makarova, Т. N., Vartapetian, А. В., Vasilenko, А. V., Abramov, V. М., Bogdanov, А. А. (1995) Overproduction in

Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha. Eur. J Biochem 231,639-643.

12) Pinol-Roma, S., Dreyfuss, G. (1992) Shuttling of pre-mRNA binding proteins between nucleus and cytoplasm. Nature 355, 730-732.

23) Siomi, H., Dreyfusss, G. (1995) A nuclear localization domain in the hnRNP A1 protein. J. Cell Biol. 129, 551-560.

24) Michael, W.M., Choi, M., Dreyfuss, G. (1995) A nuclear export signal in hnRNP Al: a signal-mediated, temperature-dependent nuclear protein export pathway. Cell 83, 415-422.

25) Gorlich, D. (1997) Nuclear protein import. Curr. Opin. Cell Biol. 9,412-419.

26) Pollard, V.W., Michael, W.M., Nakielny, S., Siomi, M.C., Wang, F., Dreyfuss, G. (1996) A novel receptor-mediated nuclear protein import pathway. Cell 86,985-994.

27) Izauralde, E., Jarmolowski, A., Beisel, C., Matta, I.W., Dreyfuss, G., Fischer, U. (1997) A role for the M9 transport signal of hnRNP Al in mRNA nuclear export. J. Cell Biol. 137, 27-35.

28) Aitchinson, J.D., Blobel, G., Rout, M.P. (1996) Kapl04p: a karyopherin involved in the nuclear transport of messenger RNA binding proteins. Science 274, 624-627.

129) Dingwall, C. (1996) Transportin nuclear proteins. Nature 384, 210-211.

130) Bonifaci, N., Moroianu, J., Radu, A., Blobel, G. (1997) Karyopherin beta2 mediates nuclear import of a mRNA binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5055-5060.

131) Michael, W.M., Choi, M., Dreyfuss, G. (1995) A nuclear export signal in hnRNP Al: a signal-mediated, temperature-dependent nuclear protein export pathway. Cell 83, 415-422.

132) Michael, W.M, Eder, P.S., Dreyfuss, G. (1997) The K nuclear shuttling domain: a novel signal for nuclear import and nuclear export in the hnRNP K protein. 16, 3587-3598

53) Rout, M.P., Blobel, G., Aitchinson, J.D. (1997) A distinct nuclear import pathway used by ribosomal proteins. Cell 89, 715-725.

W) Yaseen, N., Blobel, G. (1997) Cloning and characterization of human karyopherin beta3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,4451-4456.

35) Seedorf, M., Silver, P.A. (1997) Importin/karyopherin protein family members required for mRNA export from the nucleus. PNAS 94, 8590-8595.

36) Izaurralde E., Mattaj I.W. (1995) RNA export. Cell 81, 153-159.

37) Michaud, N., Goldfarb, D.S. (1991) Multiple pathways in nuclear transport the import of U2 snRNP occurs by a novel kinetic pathway. J. Cell Biol. 112, 215-223.

38) Nigg, E.A. (1997) Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. Nature 386, 779-787.

39) Doye, V., Hurt, E. (1997) From nucleoporins to nuclear pore complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9,401-411.

40) Silver, P.A. (1991) How proteins enter the nucleus. Cell 64, 489-497.

41) Dingwall, C., Laskey, R.A. (1991) Nuclear targeting sequences - a consensus? Trends Biochem. Sci. 16,478-481.

42) Jans, D.A. (1995) The regulation of protein transport to the nucleus by phosphorylation. Biochem J. 311, 705-716.

43) Vandromme, M., Gauthier-Rouviere, C., Lamb, N., Fernandez, A. (1996) Regulation of transcription factor localization: fine-tuning of gene expression. Trends Biochem. Sci. 21, 59-64.