Поиск белков, взаимодействующих с противомозином α , с помощью дрожжевой двугибридной системы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список условных обозначений.

Введение.

1. Дрожжевая двугибридная система и ее применение в молекулярной биологии (обзор литературы).

1.1. Что такое двугибридная система.

1.2. Преимущества дрожжевой двугибридной системы перед методами in vitro и бактериальными системами поиска взаимодействующих белков.

1.3. Новые версии двугибридной системы.

1.4. Одногибридная система.

1.5. Применение дрожжевой двугибридной системы.

1.6. Поиск новых белок-белковых взаимодействий с помощью дрожжевой двугибридной системы.

Ключевую роль в процессах, протекающих в клетках живых организмов, играют взаимодействия между белками. Для понимания механизмов, по которым протекают эти процессы необходимо знать, какие белки в них участвуют. Благодаря проектам по секвенированию геномов различных организмов появляется все больше информации о новых белках и их структуре. Однако, даже самая полная информация о структуре белка не позволяет определить его функцию в клетке.

Одним из способов понять, какую роль в клетке играет белок X, является поиск его молекулярных партнеров, т.е. белков, с которыми он взаимодействует. Информация о белках, взаимодействующих с исследуемым, может указать на его участия в тех или иных клеточных процессах. Кроме того, таким образом можно проверить, действительно ли белок X участвует в изучаемом процессе. Одним из наиболее мощных и широко используемых методов исследования белок-белковых взаимодействий является дрожжевая двугибридная система [1]. Она позволяет не только тестировать in vivo взаимодействия между известными белками, но и искать новые белки, взаимодействующие с иследуемым.

Данная работа посвящена идентификации белка-партнера протимозина а человека. Протимозин а - это небольшой (12 кДа), мультикопийный (около 107 копий на клетку) и очень кислый белок млекопитающих (изоэлектрическая точка pl=3,5) - почти половина его аминокислотных остатков - это остатки аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Данный белок практически лишен элементов вторичной структуры и существует в виде статистического клубка при физиологических условиях [2]. Кроме того, протимозин а высококонсервативен и синтезируется практически во всех тканях и организмах, что говорит о его важной функции в клетке. На данный момент накоплено большое количество эксперименталных данных, указывающих на участие протимозина а в процессах клеточного деления. Однако, достоверных сведений о механизме его действия в клетке пока нет.

В данной работе с помощью дрожжевой двугибридной системы мы попытались найти белки, с которыми взаимодействует протимозин а человека, для того, чтобы понять какую роль он играет в клетке и в каких процессах участвует.

ВЫВОДЫ:

С помощью скрининга библиотек кДНК в дрожжевой двугибридной системе идентифицирован белок, взаимодействующий с протимозином а человека. Им оказался белок Keapl человека - репрессор активатора транскрипции генов белков ответа на окислительный стресс Nrf2. С помощью дрожжевой двугибридной системы определены минимальные участки протимозина а и Keapl, ответственные за их взаимодействие. В протимозине а это область с 32 по 52 аминокислотный остаток, а в Keapl - С-концевой домен, представляющий собой мотив из 6 диглициновых повторов. Кроме того, найден точечный мутант протимозина а с заменами остатков глутаминовой аминокислоты на глицин в положениях 44 и 50, потерявший способность взаимодействовать с Keapl.

Взаимодействие протимозина ос с Keapl подтверждено с помощью экспериментов по связыванию in vitro и коиммунопреципитации протимозина а с Keapl из лизата клеток HeLa/Keap 1.

Показано, что протимозин а способен конкурировать in vitro с Nrf2 за связывание с Keapl.

На основании полученных экспериментальных данных предложена модель участия протимозина ос в процессе ответа клеток на окислительный стресс.

1. Fields S. & Song О. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340, 245-247.

2. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P., Crane-Robinson C. (1990) Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins. Eur. J. Biochem., 192, 643-651.

3. Chien C.T., Bartel P.L., Sterglautz R. & Fields S. (1991) The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9578-9582.

4. Van Criekinge W. & Beyaert R. (1999) Yeast two-hybrid: state of the art. Biological Procedures Online, 2 (1).

5. Finley J.R. & Brent R. (1995) Interaction trap cloning with yeast. Hames, Glover, eds Oxford Univ. Press, 169-203.

6. Keegan L., Gill G. & Ptashne M. (1986) Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein. Science, 231, 699.

7. Hope I.A. & Struhl K. (1986) Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activator protein, GCN4 of yeast. Cell, 46, 885.

8. Brent R. & Ptashne M. (1985) A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell, 43, 729.

9. Ma J. & Ptashne M. (1987) A new class of yeast transcriptional activators. Cell, 51, 113-119.

10. Sadowski I., Ma J., Triezenberg S. & Ptashne M. (1988) GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator. Nature, 335,563.

11. Chasman D.I., Leatherwood J., Carey M., Ptashne M and Kornberg R.D. (1989) Activation of yeast polymerase II transcription by herpesvirus VP 16 and GAL4 derivatives in vitro. Mol. Cell. Biol., 9, 4776-4779.

12. Ma J. & Ptashne M. (1988)Converting a eukaryotic transcriptional inhibitor into an activator. Cell, 55, 443.

13. Durfee Т., Becherer К., Chen P-L., Yeh S-H., Yang Y., Kilburn A.E., Lee W-H. and Elledge S.J. (1993) The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic submit. Genes Dev., 7, 555-569.

14. Gyuris J., Golemis E., Chertkov H. and Brent R. (1993) Cdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell, 75, 791803.

15. Vojtek A.B., Hollenberg S.M. and Cooper J.A. (1993) Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell, 74, 205-214.

16. Dalton S and Treisman R. (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell, 68, 597-612.

17. Fields S. & Sternglanz R. (1994) The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. Trends Genet., 10(8), 286-292.

18. ProQuest two-hybris system, GIBCO BRL Products.

19. Yeast protocols handbook, CLONTECH laboratories.

20. Yocum R.R., Hanley S., West R.J. and Ptashne M. (1984) Use of lacZ fusions to delimit regulatory elements of the inducible divergent GAL1-GAL10 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol., 4, 19851998.

21. Guarente L. And Ptashne M. (1981) Fusion of Escherichia coli lacZ to the cytochrome с gene of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2199-2203.

22. Finley Jr.RL. & Brent R. (1994) Interaction mating reveals binary and ternary connections between Drosophila cell cycle regulators. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12980-12984.

23. Finkel T. et al. (1993) Detection and modulation in vivo of helix-loop-helix protein-protein interactions. J. Biol.Chem., 268, 5-8.

24. Beranger F., Aresta S., Jean de Gunzburg and Camonis J. (1997) Getting more from the two-hybrid system: N-terminal fusions to LexA are efficientand sensitive baits for two-hybrid studies. Nucl. Ac. Res., 25(10), 20352036.

25. Osborne M.A., Stephen D. and Kochan J.P. (1995) The yeast tribrid system genetic detection of trans-phosphorilated ITAM-SH2-interactions. Biotechnology, 13.

26. Evangelista C., Lochshon D. And Fields S. (1996) Cell. Biol., 6.

27. Allen J.B., Walberg M.W., Edwards M.C. and Elledge S J. (1995) Finding prospective partners in the library: the two-hybrid system and phage display find a match. Trends Biochem. Sci., 20, 511-516.

28. Cormack R.S. and Somssich I.E. (1997) Dampening of bait proteins in the two-hybrid system. Analytical Biochem., 248, 184-186.

29. Marsolier M-C., Prioleau M-N. and Sentenac A. (1997) A RNAIII-based two-hybrid system to study RNA polymerase II transcriptional regulators. J. Mol. Biol., 268, 243-249.

30. Hengen P.N. (1997) False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biol. Sci., 22, 33-34.

31. Herskowitz I. (1988) Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev., 52, 536-553.

32. James P., Halladay J. And Craig E.A. (1996) Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics, 144, 1425-1436.

33. Serebriiskii I., Khazak V. & Golemis E.A. (1999) A two-hybrid dual bait system to discriminate specifity of protein interactions. J. of Biol. Chem., 274, 17080-17087.

34. Leanna С.A. and Hannink M. (1996) The reverse two-hybrid system: a genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions. Nucl. Ac. Res., 24, №17, 3341-3347.

35. Vidal M., Brachmann R.K., Fattaey A., Harlow E. & Boeke J.D. (1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 10315-10320.

36. Aroncheim A., Zandi E., Hennemann H., Elledge S.J., Karin M. (1997) Isolation of an AP-1 repressor by a novel method for detecting protein-protein interactions. Mol. Cell. Biol., 17,3094-3102.

37. Zhang J. & Lautar S. (1996) A yeast three-hybrid method to clone ternary protein complex components. Analytical Biochem., 242, 68-72.

38. Van Criekinge W., Van Gurp M., Decoster E., Schotte P., Van de Craen M., Fiers W., Vandenabeele P. & Beyaert R. (1998) Use of the yeast three-hybrid system as a tool to study caspases. Anal. Biochem., 263, 62-66.

39. Ozenberger B.A., Young K.H. (1995) Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. Mol. Endocrin., 9, 1321-1329.

40. Putz U., Skehel P., Kuhl D. (1996) A tri-hybrid system for the analisys and detection of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res., 24, 48384040.

41. Brachmann R.K., Boeke J.D. (1997) Tag games in yeast: two-hybrid system and beyond. Curr. Op. Biotech., 561-568.

42. Luban J, Bossolt K.L., Franke E.K., Kalpana G.V. & Goff S.P. (1993) Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A andB. Cell, 73, 1067-1078.

43. Harper J.W. et al. (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 75, 805-816.

44. Li D., Desai-Yajnik V., Lo E., Schapira M., Abagyan R. & Samuels H.H. (1999) NRIF3 is a novel coactivator mediating functional nspecificity of nuclear hormone receptors. Mol. and Cell. Biol., 19(10), 7191-7202.

45. Clark K.L., Dignard D., Thomas D.Y. and Whiteway M. (1993) Interactions among the subunits of the G protein involved in Saccharomyces cerevisiae mating. Mol. Cell. Biol., 13, 1-8.

46. Legrain P., Chapon C. and Gallison F. (1993) Interactions between PRP9 and SPP91 splicing factors identify a protein complex required in prespliceosome assembly. Genes Dev., 7, 1390-1399.

47. Brown N.C., Costanzo M.C. and Fox T.D. (1994) Interactions among three proteins that specifically activate translation of the mitochondrial COX3 mRNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 14, 10451053.

48. Chevray P.M. and Nathans D. (1992) Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jun. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5789-5793.

49. Iwabuchi K., Li В., Bartel P.L. and Fields S. .(1994) Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(13), 6098-102.

50. Chardin P. et al. (1993) Human Sosl: a guanine nucleotide exchange factor for Ras that binds to GRB2. Science, 260, 1338-1343.

51. Ruppert S., Wang E.H. and Tjian R. (1993) Cloning and expression of human TAFII250: a TBP-associated factor implicated in cell-cycle regulation. Nature, 362, 175-179.

52. Luban J. et al. (1992) Genetic assay for multimerization of retroviral gag polyproteins. J. Virol., 66, 5157-5160.

53. Holt K.H., Olson A.L., Moye-Rowley W.S. and Ressin J.E. (1994) Phosphatidylinositol 3-kinase activation is mediated by high-affinity interactions between distinct domains within the pi 10 and p85 subunits. Mol. Cell. Biol., 14, 42-49.

54. Li B. And Fields S. (1993) Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two-hybrid system. FASEB J., 7, 957-963.

55. Bartel P.L. Roecklein J.A., SenGupta D., Fields S. (1996) A protein linkage map of Escherichia coli bacteriophage T7. Nat. Genet., 12, 72-77.

56. Uetz P. & со (2000) A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 403, 623-627.

57. Geyer C.R., Colman-Lerner A. & Brent R. (1999) "Mutagenesis" by peptide aptamers and pathway connections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 8567-8572.

58. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. (1984) Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,1008-1011.

59. Bach J.F., Dardenne M., Goldstein A.L., Guha A., White A. (1971) Appearence of T-cell markers in bone marrow rosette-forming cells after incubation with thymosin, a thymic hormone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2734-2738.

60. Auger С., Stahli С., Fabien N., Monier J.C. (1987) Intracellular localization of thymosin alpha 1 by immunoelectron microscopy using a monoclonal antibody. J. Histochem, 35, 181-187.

61. Barja P., Freire M. (1994) Prothymosin alpha and factors from thymic cells decrease expression of Thy 1.2 antigen among small thymocytes from C57BL/6 mice. Immunopharmacol. Immunotoxicol, 16, 403-418.

62. Eschenfeldt W.H., Berger S.L. (1986) The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9403-9407.

63. Watts J.D., Cary P.D., Crane-Robinson C. (1989) Prothymosin alpha is a nuclear protein. FEBS Lett., 245, 17-20.

64. Gomez-Marquez J., Segade F. (1988) Prothymosin alpha is a nuclear protein. FEBS Lett., 226, 217-219.

65. Eilers M., Schirm S., Bishop J.M. (1991) The MYC protein activates transcription of the alpha-prothymosin gene. EMBO J., 10, 133-141.

66. Dosil M., Freire M., Gomez-Marquez J. (1990) Tissue-specific and differential expression of prothymosin alpha gene during rat development. FEBS Lett, 269, 373-376.

67. Bustelo X.R, Otero A, Gomez-Marquez J, Freire M. (1991) Expression of the rat prothymosin alpha during T-Lymphocyte proliferation and liver regeneration. J. Biol. Chem, 266, 1443-1447.

68. Sburlati A.R, Manrow R.E, Berger S.L. (1991) Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 253-257.

69. Rodriguez P, Vinuela J.E, Alvarez-Fernandez L. & Gomez-Marquez J. (1999) Cell. Death. Differ, 6 (1), 3-5.

70. Rodriguez P, Vinuela J.E, Alvarez-Fernandez L, Buceta M, Vidal A, Dominguez F. & Gomez-Marquez J. (1998) Overexpression ofprothymosin a accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells. Biochem J., 331, 753-761.

71. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J., Jessup J.M., Steele G.D.Jr., Chen L.B. (1993) Prothymosin alpha mRNA expression correlates with that of c-myc in human color cancer. Oncogene, 8, 2821-2826.

72. Orre R.S., Cotter M.A., Subramanian C. & Robertson E.S. (2000) Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro. J. Biol. Chem.,

73. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I. & Vartapetian A.B. (2000) Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. FEBS Lett., 467 (2-3), 150-154.

74. Papamarcaki Т., Tsolas O. (1994) Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro. FEBS Lett., 345 (1), 71-75.

75. Pavlov N., Evstafieva A., Rubtsov Y. & Vartapetian A. (1995) Human prothymosin alpha inhibits division in yeast Saccharomyces cerevisiae cells, while its mutant lacking nuclear localization signal does not. FEBS Lett., 366, 43-.

76. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., Igarashi K., Engel J.D. & Yamamoto M. (1999) Keapl repress nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the ammo-terminal Neh2 domain. Genes&Develop., 13, 76-86.

77. Ishii Т., Itoh К., Takahashi S., Sato H., Yanagawa Т., Katoh Y., Bannai S. & Yamamoto M. (2000) Transcription factor Nrf2 coordinataly regulates a groop of oxidative stress-inducible genes in macrophages. J. Biol. Chem., 275 (21), 16023-16029.

78. Xue F. And Cooley L. (1993) Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. Cell, 72, 681-693.

79. Bork P. And Doolittle R.F. (1994) Drosophila kelch motif is derived from a common enzyme fold. J. Mol. Biol., 236, 1277-1282.

80. Adams J., Kelso R. & Cooley L. (2000) The kelch repeat superfamily of proteins: propellers of cell function. Trends in Cell Biol., 10, 17-24.

81. Ito N. Et al. (1994) Crystal structure of a free radical enzyme, galactose oxidase. J. Mol. Biol., 238, 794-814.

82. Chichkova N.V., Evstafieva A.G., Lyakhov I.G., Tsvetkov A.S., Smirnova T.A., Karapetian R.N., Karger E.M. & Vartapetian A.B. (2000) FEBS Lett., 267, 4745-4752.

83. Castro J.M., Barcia M.G. (1996) Localization of prothymosin alpha in the nucleus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 140-146.

84. Gallego R., Roson E., Garcia-Caballero Т., Fraga M., Forteza J., Dominguez F., Beiras A. (1992) Prothymosin alpha expression in lymph nodes and tonsils: an optical and ultrastructural study. Acta. Anat. (Basel), 143,219-222.

85. Ляхов И.Г. Экспрессия гена протимозина а человека в клетках E.coli., Москва, 1997, 113.

86. Laemmli U.K. (1970) Nature, 227, 68.

87. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984.

88. QIAEXII Handbook, QIAGEN, 1995.95. "Sequenase 2.0", United States Biochemicals, 1990.