Генетический "нокдаун" протимозина альфа методом интерференции РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имена М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На прав ах рукописи

АБАЕВА ИРИНА СТАНИСЛАВОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ "НОКДАУН" ПРОТИМОЗИНА АЛЬФА МЕТОДОМ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

академик РАН, профессор Богданов Алексей Алексеевич;

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Евстафьева Александра Георгиевна.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович;

кандидат биологических наук, Лунин Владимир Глебович.

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится 22 февраля 2005 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 21 января 2005 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Одной из наиболее сложных задач в области молекулярной биологии является выяснение функций белков. Исследование механизмов функционирования белков может повлечь за собой не только неожиданные фундаментальные открытия, но также иметь и существенные прикладные аспекты. Объектом наших исследований является ядерный белок протимозин альфа. Это небольшой (13 кДа), высококонсервативный, мультикопийный белок, проявляющий свойства онкобелка.

Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что исследования функции протимозина альфа, проводимые в последние годы, позволили обнаружить участие этого белка в самых разнообразных биологических процессах: от клеточной пролиферации до запрограммированной клеточной смерти. Тем не менее, механизм функционирования протимозина альфа в большинстве случаев остается неустановленным. В данной работе была предпринята попытка, используя метод интерференции РНК, выяснить функциональную роль протимозина альфа в жизнедеятельности клетки, и в защите от окислительного стресса, в частности.

Цель исследования: Цель настоящей работы состояла в осуществлении генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК для изучения его функции в клетках человека.

Научная новизна и практическая значимость: В ходе данной работы был осуществлен генетический "нокдаун" протимозина альфа методом интерференции РНК в клетках человека. Снижение количества протимозина альфа было подтверждено тремя независимыми методами: блот-гибридизацией РНК, электрофоретическим анализом препаратов частично очищенного протимозина альфа, а также с помощью

иммуноферментного анализа. Впервые было показано, что генетический "нокдаун" протимозина альфа приводит к снижению уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1 - одного из генов ответа клетки на окислительный стресс. Полученные результаты представляют несомненную значимость, так как проливают свет на новую функцию протимозина альфа в жизнедеятельности клетки - участие этого белка в ответе клеток на окислительный стресс.

Публикации и апробации работы: По материалам диссертации были опубликованы 3 печатные работы. Результаты исследований докладывались на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004) и научной конференции «Ломоносов 2004».

Структура и объем работы: Диссертация изложена на ^-¿страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Список литературы включает источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Осуществление протимозин альфа-специфичной интерференции РНК в клетках человека

Одним из возможных подходов к исследованию функционирования определенного белка в клетке является селективное подавление или, наоборот, усиление его синтеза. Для изучения механизма функционирования протимозина альфа в клетках человека мы решили использовать метод, основанный на явлении интерференции РНК. Суть данного метода состоит во введении в клетку коротких двуцепочечных РНК, последовательность которых идентична фрагменту

гена-мишени. Такие двуцепочечные РНК, так называемые siRNA (от англ. small interfering RNA), способны высокоселективно распознать свою мишень. Мишенью служит мРНК соответствующего гена. После того, как мишень найдена, siRNA в комплексе с нуклеазами осуществляют ее деградацию. Выбор метода интерференции РНК для решения поставленной задачи был мотивирован несколькими соображениями. Протимозин альфа относится к числу жизненно важных белков. По этой причине полное выключение работы этого гена (генетический "нокаут") приведет к клеточной смерти. Метод же интерференции РНК позволяет осуществить так называемый генетической "нокдаун" - дозо-зависимое снижение уровня экспрессии гена-мишени, а не выключение его работы полностью. Кроме того, исходя из литературных данных, этот метод отличается высокой эффективностью. На настоящий момент этот метод является одним из наиболее широко используемых и хорошо себя зарекомендовавших способов быстрого получения функционально "нокаутных" организмов.

Для осуществления интерференции РНК специфичные к гену протимозина альфа можно было бы получить химическим

синтезом. Альтернативой химическому синтезу служит получение соответствующих генетических конструкций, экспрессирующих протимозин альфа-специфичные за счет клеточных ферментов.

Мы остановили свой выбор осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа на использовании экспрессионных векторов. Этот выбор был обусловлен тем фактом, что такие конструкции позволили бы нам в дальнейшем получить стабильные клеточные линии со сниженным уровнем экспрессии гена протимозина альфа.

1.1. Конструирование плазмид для осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа в клетках человека

Для получения генетических конструкций, экспрессирующих в клетках человека протимозин альфа-специфичные мы

использовали два вектора: рБирег, содержащий Ш промотор, и вектор на основе Ш+27 промотора. Известно, что промоторы РНК-полимеразы III Ш и Ш+27 позволяют осуществлять синтез в клетках высших эукариот коротких неполиаденилированных РНК. Последовательность, клонируемая под соответствующий промотор, должна представлять собой инвертированные повторы длиной 19 нуклеотидных остатков, разделенные небольшим спейсером. Такие конструкции вводятся в клетку. В ходе транскрипции РНК-полимеразой III с соответствующего промотора в клетках высших эукариот синтезируется РНК, имеющая шпилечную структуру. Далее такой предшественник подвергается процессингу, и в конечном итоге в клетке образуются функционально активные ген-специфичные

Первоначальный этап получения генетической конструкции для экспрессии протимозин альфа-специфичных состоял в выборе

соответствующего участка-мишени длиной 19 нуклеотидных остатков в нуклеотидной последовательности мРНК протимозина альфа. С этой целью был проведен анализ нуклеотидной последовательности кДНК протимозина альфа. Для получения эффективно работающих важен целый набор параметров. Наиболее важным моментом является выбор такой нуклеотидной последовательности в которой

совпадение с нуклеотидными последовательностями мРНК других генов будет минимальным. Кроме того, выбранный участок в мРНК гена-мишени должен быть доступен для комплементарных взаимодействий с антисмысловой цепью з11ША. Содержание GC пар з11ША должно

составлять 50-70%. Последовательность не должна содержать блоков из 4-5 остатков тимидиловой кислоты. Желательно, чтобы участок на мРНК, к которому синтезируют вНША, находился на расстоянии 70-100 нуклеотидных остатков от инициирующего кодона в сторону 3-конца мРНК. Вблизи АТв кодона обычно связываются факторы инициации трансляции, и это может создавать сложности для взаимодействий вЯИ^А с матричной РНК. Кроме того, дополнительным требованием для системы с использованием упомянутых выше векторов является то, что выбираемая последовательность должна быть с 5-конца фланкирована двумя остатками адениловой кислоты. Известно, что в ходе транскрипции с Ш и Ш промоторов нуклеотидной последовательности, содержащей в качестве терминатора транскрипции 4-5 остатков тимидиловой кислоты, образуется шпилечная структура РНК с двумя (возможно, что и тремя в небольшой части молекул) остатками уридиловой кислоты на 3-конце. В ходе созревания такого предшественника будущих петля образованной шпильки

разрезается клеточными нуклеазами так, что в существенной части молекул на 3-конце смысловой цепи оказывается два неспаренных остатка уридиловой кислоты. Таким образом, в конечном итоге в клетках образуются двуцепочечные РНК с 3 -выступающими концами, которыми являются остатки уридиловой кислоты. Было показано, что такое строение важно для эффективной интерференции РНК. Кроме того, так как выбранная 19-членная последовательность в кДНК гена-мишени фланкирована с 5-конца двумя остатками адениловой кислоты, то комплементарность между антисмысловой цепью образованных и

соответствующим участком мРНК гена-мишени составит уже не 19, а 21 нуклеотидный остаток. Был выбран участок в нуклеотидной последовательности белок-кодирующей части кДНК протимозина альфа

с 90 по ПО и.о., удовлетворяющий всем перечисленным выше требованиям для дизайна siRNA (рис. 1).

atgtcagacgcagccgtagacaccagctccgaaatcaccaccaaggactt 50

aaaqgagaaqaaaaaaattatqaaaaaaacaaaaaataaaaaaqacaccc 100

gaggtagacgaagaagaggaagaaggtggggaggaagaggaggaggaaga 200 agaaggtgatggtgaggaagaggatggagatgaagatgaggaagctgagt 250 cagctacgggcaagcgggcagctgaagatgatgaggatgacgatgtcgat 300 accaagaagcagaagaccgacgaggatgactag

Рис.1. Нуклеотидная последовательность белок-кодирующей части кДНК протимозина альфа человека.

Подчеркнутая последовательность соответствует участку, выбранному для синтеза протимозин альфа-специфичных siRNA.

Данный участок кодирует с 31 по 37 аминокислоту протимозина альфа. Поиск по геномной базе данных человека с помощью компьютерных программ NCBI BLAST SEARCH и Screening by Similarity Release3.0 показал, что в выбранной нами последовательности-мишени совпадение с посторонними нуклеотидными последовательностями из геномной базы данных составляет не более 15 из 19 нуклеотидных остатков. Последовательности с 15 совпадениями являются открытыми рамками считывания, среди них не оказалось известных генов.

Рис.2 отражает схему получения siRNA, специфичных к мРНК протимозина альфа, в случае использования вектора с H1 промотором, а также первичную структуру соответствующего предшественника протимозин альфа-специфичных используемых в нашей работе.

Синтетические минигены клонировали по указанным на схеме рестрикционным сайтам в вектор под H1 промотор. Схема

получения плазмиды, содержащей 416+27 промотор, аналогична изображенной на рис.2. Встраивание синтетических минигенов в векторы для экспрессии вйША было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Далее в тексте эти генетические конструкции обозначены как

Рис.2. Конструирование вйША для подавления синтеза протимозина альфа.

Л. Схема получения з11ША;

Б. Первичная структура предшественника б^ШЧА;

В. Предполагаемая структура процессированной бПША.

1.2. Оптимизация условий интерференции РНК протимозина альфа

Эффективная трансфекция клеток высших эукариот полученными генетическими конструкциями - важный фактор, влияющий на успех реализации метода интерференции РНК. Существенны два аспекта: во-первых, важно добиться высокого процента (более 50%) трансфицированных клеток, а во-вторых, важно, чтобы в каждую клетку попало достаточное количество плазмидной ДНК для эффективной экспрессии вЯША. Поэтому важными составляющими нашей работы явились подбор и оптимизация условий трансфекций для осуществления

генетического "нокдауна" протимозина альфа. Следует подчеркнуть нетривиальность стоящей задачи. Протимозин альфа относится к числу мультикопийных белков (106 - 107 копий белка на клетку, для синтеза которых необходимо 104-105 копий мРНК), а это подразумевает, что для снижения его экспрессии требуется синтезировать в клетке значительные количества б1К1ЧА. Кроме того, этот белок важен для клеточной пролиферации и особенно высок уровень его продукции в трансформированных клетках, используемых в наших исследованиях. В ходе работы нами были оптимизированы условия осуществления интерференции РНК протимозина альфа полученными генетическими конструкциями. Для достоверного и воспроизводимого детектирования снижения количества протимозина альфа в клетках HeLa проводились двойные трансфекции. Оптимальное количество ДНК, используемое в наших экспериментах, составило 8 мкг на чашку 0 35 мм. Клетки HeLa первоначально трансфицировали с помощью липофектамина 2000 соответствующими плазмидами без добавления сыворотки. Сыворотку добавляли в среду спустя 3 часа. Через 48 часов после добавления сыворотки в среду процедуру трансфекции повторяли. Анализ полученных трансформантов производили спустя 48 часов после второй трансфекции.

2. Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК

2.1. Оценка снижения количества мРНК протимозина альфа в клетках HeLa, трансфицированных рвирегНДОАз-РгоТа

При интерференции РНК снижение экспрессии гена-мишени происходит на пост-транскрипционном уровне, за счет направленного гидролиза соответствующей мРНК. Клетки линии HeLa трансфицировали плазмидой В качестве контроля

использовали клетки, трансфицированные пустым вектором рвирег, не экспрессирующим двуцепочечные РНК. Подавление экспрессии гена протимозина в клетках линии HeLa исследовали с помощью блот-гибридизации РНК, используя радиоактивно меченый зонд, специфичный к мРНК протимозина альфа. Для нормировки количества выделенной суммарной РНК использовали радиоактивно меченый зонд, специфичный к мРНК 0-акгина. Результаты экспериментов по блот-гибридизации РНК представлены на рис.3. Радиоавтограф (А) и количественный обсчет (Б), приведенные на рис.3, иллюстрируют, что в ответ на введение в клетки HeLa генетической конструкции для осуществления протимозин альфа-специфичной интерференции РНК наблюдается уменьшение количества мРНК протимозина альфа примерно в 2 раза по сравнению с контрольными клетками; при этом количество мРНК актина не меняется.

А. Б. 8

Рис.3. Снижение уровня мРНК протимозина альфа при введении в клетки протимозин альфа-специфичных

А. Результаты блот-гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток НеЬа, трансфицированных пустым вектором (8) и вектором для экспрессии вПША, специфичных к протимозину альфа (Я). Для нормировки использовали гибридизацию с зондом, специфичным к мРНК актина. Б. На диаграмме приведены количественные данные, полученные из пяти независимых экспериментов.

2.2. Специфичность использованных siRNA

Процесс интерференции РНК отличается высокой специфичностью. Введение в последовательность вПША точечных замен в некоторых случаях способно снимать эффект подавления экспрессии гена-мишени полностью. Для того, чтобы продемонстрировать специфичность наблюдаемых эффектов снижения количества мРНК протимозина альфа, нами были получены две генетические конструкции, позволяющие экспрессировать в клетках человека два типа мутантных последовательности которых не полностью идентичны соответствующему участку мРНК протимозина альфа. Введенные замены указаны в таблице 1. В нуклеотидную последовательность одного из мутантов вводили одну точечную замену, а другой мутант содержал четыре нуклеотидные замены. Поскольку гидролиз мРНК гена-мишени происходит строго в середине участка комплементарных взаимодействий между антисмысловой цепью и

соответствующего участка мРНК гена-мишени, мутации вводили в центральную область

Таблица 1. Нуклеотидная последовательность мутантных протимозин альфа-специфичных (приведены смысловые цепи, замененные

нуклеотидные остатки выделены).

Название Нуклеотидная последовательность

Дикий тип £а£ас§ссссЛ§(Лаас§£

Мутант 1 §а§ас§ссас1§йаас§в

Мутант 2 gagacgcagaagctaacgg

Полученными плазмидами трансфицировали клетки линии HeLa, и сравнивали эффективность протимозин альфа-направленной интерференции РНК. На рис.4 представлены результаты блот-гибридизации РНК, свидетельствующие о неспособности мутантных siRNA подавлять экспрессию гена протимозина альфа на уровне его мРНК.

я - »гянм«и«ий « « ш и

М1> ЯШМ М1 (мугаип) 1Ю- Ю С ядежмг Я

Рис.4. Специфичность протимозин альфа интерферирующих РНК.

А. Результаты блот-гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток НеЬа, трансфицированных пустым вектором (Б) и плазмидами для экспрессии з1КЫА дикого типа (Я) и ее мутантов (М1 и М2), специфичных к протимозину альфа. Для нормировки использовали гибридизацию с зондом, специфичным к мРНК актина. Б. На диаграмме приведены количественные данные, полученные из трех независимых экспериментов.

2.3. Оценка снижения экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта

Протимозин альфа относится к числу не только мультикопийных, но и чрезвычайно стабильных белков. Поэтому мы задались вопросом: происходит ли снижение количества этого белка в ответ на введение

соответствующей генетической конструкции? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод электрофоретического анализа препаратов частично очищенного протимозина альфа. В силу того, что протимозин альфа является чрезвычайно кислым белком, он, в отличие от других белков, при фенольной экстракции лизатов клеток переходит в водную фазу и совыделяется с нуклеиновыми кислотами. Схема проведения эксперимента приведена на рис.5А. Полученные таким способом препараты протимозина альфа, частично очищенного из клеток, трансфицированных плазмидой р8ирег1ШАьРгоТа и клеток, трансфицированных пустым вектором рвирег, анализировали в 8% денатурирующем ПААГ. Для нормировки количества частично очищенного протимозина альфа использовали тРНК, совыделяемую с этим белком. Рис.5Б иллюстрирует снижение количества протимозина альфа в экспериментальных клетках по сравнению с контрольными.

А, Схема «ыу|иммии1с» протимвэ*»» альфа

НаО *Г1»*<мт^М|йГ>

тттяи» ^^ «ммндоятмиши

3 |Э ¡ЯКВ*МДО - тмШЮЮ

Ш. Результаты »пвктцюфорегичлчякого анализа протимозина аяьфи

Рис.5. Схема получения частично ^чйщённого препарата протимозина альфа (А) и его электрофореИШЩкийЩризЩ!^

ПроТо

Электрофорез образцов ■ проводили в денатурирующих условиях в 8% ПААГ. Гели были окрашены метиленовым синим. На рисунке введены следующие обозначения:

8-препараты из контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором; Я-препараты из клеток, трансфицированных конструкцией рБирегКЫАьРгоТа; иб-препараты из клеток, трансфицированных конструкцией риб+2711НА1-РгоТа.

Из рис.5Б также видно, что интерференционная плазмида на основе промотора Ш+27 давала сравнимые результаты снижения количества протимозина альфа с плазмидой на основе Ш промотора. По этой причине все дальнейшие эксперименты проводили с использованием вектора на основе Ш промотора.

Другим, более количественным методом оценки содержания протимозина альфа, использованным в нашей работе, явился иммуноферментный анализ клеточных лизатов HeLa (ИФА). Для осуществления этого анализа использовали моноклональные антитела к двум разным эпитопам протимозина альфа, одни из которых были биотинилированы. Схема эксперимента изображена на рис.6

Рис.6. Схема "Сэндвич"- иммуноферментного анализа для определения количества протимозина альфа в лизатах клеток HeLa.

На подложку сорбировали моноклональные антитела 2F11, узнающие в протимозине альфа эпитоп в области с 1 по 31 аминокислоту. Затем сорбированные антитела инкубировали с лизатами клеток, трансфицированных соответствующими плазмидами. При проведении анализа количество белков в клеточных лизатах определяли по методу Бредфорда и уравнивали. Следующим этапом являлось взаимодействие с биотинилированными моноклональными антителами 4F4, узнающими в протимозине альфа эпитоп в области с 52 по 89 аминокислоту. Заключительная стадия состояла в образовании комплекса биотина с

коньюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Субстратом для пероксидазы хрена служила смесь пероксида водорода и ортофенилендиамина. Активность пероксидазы детектировали колориметрически, измеряя поглощение при длине волны 492 нм. Для каждого из лизатов клеток строили концентрационные кривые в координатах Д492 (поглощение при 492 нм) - (величина, обратная разведению лизата). На рис.7 приведены примеры двух концентрационных кривых, полученных для лизатов клеток HeLa, трансфицированных пустым вектором контрольные клетки) и

вектором для экспрессии протимозин альфа-специфичных (К1,

опыт). Из рис.7 видно, что интерференция РНК приводит к снижению внутриклеточного уровня протимозина альфа, что хорошо согласуется с результатами электрофоретического анализа (рис.5Б).

О 0,1 0.2 0,3 0,4 , 0.5

Рис.7. Определение содержания протимозина альфа в клетках HeLa с помощью ИФА.

81 - лизат клеток, трансфицированных пустым вектором;

R1 - лизат клеток, трансфицированных плазмидой для экспрессии

v - величина, обратная разведению лизата.

Количественный обсчет концентрационных кривых позволил оценить концентрацию протимозина альфа в каждом из лизатов. Результаты

таких расчетов для одного из опытов (опыта 1) представлены в таблице 2. Здесь указаны средние значения относительного количества протимозина альфа в опытных и контрольных лизатах, полученные из четырех независимых экспериментов. Из таблицы 2 видно, что интерференция РНК приводит примерно к 2-кратному снижению внутриклеточного уровня протимозина альфа.

Таблица 2. Результаты иммуноферментного анализа протимозина альфа в лизатах клеток HeLa (опыт 1).

ОПЫТ 1 Относительная концентрация ПроТ а Среднее значение относительной концентрации ПроТ а

Б | (контроль) 4,6 4,1 ± 1,3

Бг (контроль) 5,6

вз (контроль) 2,6

Б4 (контроль) 3,5

(эксперимент) 2,9 1,9 ±0,8

Я2 (эксперимент) 2,4

Яз (эксперимент) 1

1^4 (эксперимент) 1,6

В таблице введены следующие обозначения:

814_ -лизаты клеток, трансфицированных вектором рЗирег;

^ 4 - лизаты клеток, транс фицированных плазмидой рБирегНЫАьРгоТа

Числовые индексы обозначают соответствующие параллели

проведенных экспериментов.

Аналогичные расчеты проводились также в случае иммуноферментного анализа лизатов клеток HeLa, трансфицированных плазмидой, несущей мутантную протимозин альфа-специфичную (опыт 2). На рис. 8 приведены примеры концентрационных кривых,

полученных для одного из трех независимых экспериментов. Видно, что мутантные вИША не способны в равной степени аЖ1ВДк ого типа подавлять уровень экспрессии протимозина альфа.

0.1

О 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Рис.8. Сравнение эффективности снижения уровня протимозина альфа в случае мутантных вИША и з1]ША дикого типа.

На графике приведены концентрационные кривые, которые были получены из результатов ИФА лизатов клеток, трансфицированных pSuper ^1), рвирег 1ША1РгоТск ^1), а также цдазмидой для экспрессии мутантных вЖЫА ^1). v - величина, обратная разведению лизата.

Результаты количественного обсчета соответствующих концентрационных кривых отражены в таблице 3. В опыте 2 средняя концентрация протимозина альфа в клетках, трансфицированных плазмидой была почти в четыре раза ниже, чем в

контрольных клетках. Мутантная конструкция ^^ давала вдвое более слабый эффект. Следует отметить, что степень подавления экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта варьировала от 2 до 4 раз от опыта к опыту. Мутантная конструкция Ml всегда давала значение, промежуточное между опытным и контрольным.

Таблица 3. Количественная оценка уровня протимозина альфа в лизатах клеток HeLa (опыт2).

ОПЫТ 2 Относительное Среднее значение

кол-во кол-ва протимозина а

протимозина а

Б) (контроль) 2,13 2,02 ± 0,20

Бг (контроль) 2,15

Б3 (контроль) 1,77

И] (эксперимент) 0,54 0,52 ± 0,02

Ил (эксперимент) 0,52

Кз (эксперимент) 0,50

М] (мутант1) 1,25 1,17 ±0,70

М2 (мутант 1) 1,11

М3 (мутант!) 1,16

В таблице введены следующие обозначения:

81-3- лизаты клеток, трансфицированные плазмидой р8ирег;

^ з - лизаты клеток, трансфицированные вектором рВирегЮЯАьРгоТа;

М13 - лизаты клеток, трансфицированные вектором, кодирующим

мутантные протимозин альфа-специфичных $11ША.

Числовые индексы обозначают соответствующие параллели проведенных экспериментов.

Итак, экспериментальные данные, полученные с помощью ИФА, свидетельствуют о том, что с помощью метода интерференции РНК можно добиться 2-4 кратного снижения уровня протимозина альфа в клетках человека. Мутантные бЖКА не способны в равной степени с дикого типа подавлять экспрессию гена протимозина альфа. Обращает на себя внимание тот факт, что мутантная потеряла

способность вызывать деградацию мРНК протимозина альфа (см. рис.4), но, по-видимому, может в некоторой степени ингибировать ее

трансляцию (табл.3), т.е. ведет себя как микро-РНК. Этот результат согласуется с имеющимися данными о том, что в зависимости от степени идентичности нуклеотидной последовательности нуклеотидной

последовательности мРНК гена-мишени, в ряде случаев способны

выступать как микро-РНК и ингибировать трансляцию, а не способствовать деградации соответствующей мРНК.

3. Специфичность эффекта снижения экспрессии гена протимозина

альфа

Следующим этапом нашей работы явилось подтверждение специфичности эффекта снижения экспрессии гена протимозина альфа. Мы исследовали влияние протимозин альфа-направленной интерференции РНК на уровень продукции четырех произвольно выбранных белков, к которым у нас имелись антитела: актину, гистону Н1, 1кВа, прокаспазе-3. На рис.9 представлены результаты иммуноблотинга суммарных белковых экстрактов, выделенных из клеток HeLa, трансфицированных пустым вектором, а также генетической конструкцией для экспрессии протимозин альфа-специфичных з11ША. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение в клетки протимозин альфа-специфичных приводит

к снижению количества протимозина альфа, но не сказывается на количестве других исследованных белков. Таким образом, следует сделать вывод о том, что протимозин альфа-направленная интерференция РНК достаточно специфична.

$

-тРКК

Результаты эластрофорбТйЧ8(Жвго анаша -ч превратен частично «нвдекввго аротвкозт ] аяьфа «з хяет« траасфааврсшшш

> пусши аехторои рйфвг (8) я яшмядой I рЗирегВДА!-Рг оТа (Ц)

*—Пршхяаза-З "ЯЙК ♦ ТисхояЯ!

Результаты иммукоблотавга экстрактов, напученных за клеток ЯеЬа, тршфяцароаатш» пустык аектсром рЗирег (3) * шшнадвЙ р&регйКАз-й-оТа (й). J Иссользовтсь ашггаа ж ттщ Ш, арсшдае-З, р-штшу, ВсВа.

Рис.9. Специфичность генетического "нокдауна" протимозина альфа.

4. Исследование участия протимозина альфа в ответе клетки на окислительный стресс

В нашей лаборатории с помощью дрожжевой двугибридной системы был найден один из партнеров протимозина альфа - белок Keap1. Основная функция белка Keap1 - это репрессия активатора транскрипции участвующего в ответе клетки на окислительный

стресс. В нормальных условиях Keapl репрессирует N1112, удерживая его в цитоплазме. В условиях же окислительного стресса такая репрессия снимается, комплекс диссоциирует, активатор транскрипции

становится способным накапливаться в ядре и активировать гены белков, защищающих клетки от окислительного стресса. Диссоциация комплекса облегчается за счет модификаций обоих белков при окислительном стрессе.

Полученные в нашей лаборатории экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что протимозин альфа и способны конкурировать между собой за связывание с одним и тем же участком белка Keapl. Более того, протимозин альфа способен связывать Кеар1,

высвобождая из комплекса На основе перечисленных

выше данных можно представить себе следующую модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс с участием протимозина альфа. Протимозин альфа способен вытеснять №£2 из комплекса с Кеар1. В нормальных условиях этот процесс малоэффективен, поскольку комплекс достаточно устойчив, и это приводит к базальному

уровню экспрессии -зависимых генов. В условиях окислительного стресса связь ослабляется, протимозин альфа связывается с

а освобождается и активирует экспрессию генов ответа

клетки на окислительный стресс. Описанная модель отражена на рис.10.

Рис.10. Модель участия протимозина альфа в ответе клетки на окислительный стресс.

Тогда, согласно такой модели, снижение количества протимозина альфа должно приводить к снижению уровня экспрессии генов ответа клетки на окислительный стресс. Мы решили проверить эту гипотезу, используя для снижения уровня протимозина альфа в клетках метод интерференции РНК. Для оценки влияния уровня протимозина альфа на зависмую транскрипцию мы остановили свой выбор на изучении уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1 (НО-1) - одного из генов ответа клетки на окислительный стресс. Клетки линии HeLa трансфицировали

плазмидой рВирегИЧАл-РгоТа. В качестве контроля использовались клетки, трансфицированные пустым вектором рБирег. Из клеток выделяли суммарную РНК и последовательно гибридизовали на блоте с тремя радиоактивно меченными зондами, специфичными к мРНК протимозина альфа, гемоксигеназы-1 и (3-актина. На рис.11 А представлен радиоавтограф одного такого эксперимента, а на диаграмме (рис. 11 Б) приведен количественный обсчет результатов трех независимых экспериментов по блот-гибридизации РНК. Из рисунка видно, что понижение количества мРНК протимозина альфа в 2 раза с помощью метода РНК-интерференции приводит в свою очередь приблизительно к двукратному снижению уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1, но не влияет на экспрессию гена (5-актина, который является независимым.

Рис.11. Влияние интерференции РНК протимозина альфа на экспрессию гена гемоксигеназы - 1 (НО-1).

А. Результаты блот гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток HeLa, трансфицированных пустым вектором (S) и клеток, экспрессирующих протимозин альфа-специфичные siRNA (R). Б. На диаграмме приведены количественные данные об уровне экспрессии гена НО-1, полученные из трех независимых экспериментов. Визуализацию радиоактивных полос на нейлоновой мембране и обсчет данных проводили при помощи прибора Phosphorlmager, используя компьютерную программу Image Quant 5.0.

Изучение влияния снижения количества протимозина альфа на уровень экспрессии гена гемоксигеназы-1 проводили и в условиях окислительного стресса. В качестве индуктора окислительного стресса использовали диэтилмалеат (DEM). Результаты блот-гибридизации РНК представлены на рис. 12А. Свидетельством успешного осуществления окислительного стресса являлось резкое возрастание уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1 в случае добавления в среду индуктора окислительного стресса (сравнить треки 1 и 3,2 и 4 на рис. 12А). Однако, наиболее существенным результатом явилось снижение уровня мРНК НО-1 в ответ на протимозин альфа-направленную интерференцию РНК как в отсутствие, так и в присутствие индуктора окислительного стресса (см. рис.12А; треки 1 и 2, 3 и 4).

Рис.12. Влияние генетического "нокдауна" протимозина альфа на уровень экспрессии гена гемоксигеназы-1 (НО-1) в условиях окислительного стресса.

А. Результаты блот-гибридизации суммарной РНК, выделенной из клеток HeLa, трансфицированных пустым вектором (S), и из клеток, экспрессирующих протимозин альфа-специфичные (R), в

условиях окислительного стресса (+DEM) и в его отсутствие (-DEM). Б. На диаграмме приведены количественные данные об уровне экспрессии гена НО-1 в условиях окислительного стресса, полученные из трех независимых экспериментов.

А»

S.

1 "' 2 V 3 4

II

Из количественного обсчета результатов трех независимых экспериментов, приведенного на рис. 12Б, можно заключить, что генетический "нокдаун" протимозина альфа приводит к пропорциональному снижению уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1 и в условиях окислительного стресса.

Описанные результаты опытов по интерференции РНК хорошо согласуются с результатами опытов по суперпродукции протимозина альфа, проведенными в нашей лаборатории. Было показано, что суперпродукция протимозина альфа в клетках ЫеЬя приводит к возрастанию уровня экспрессии гена гемоксигеназы-1. Таким образом, опыты по суперпродукции протимозина альфа и интерференции РНК дают согласующиеся результаты: протим'озин альфа оказывает позитивное влияние на №£2-зависимую экспрессию генов. Это подтверждает предложенную нами модель и дает основания полагать, что протимозин альфа действительно принимает участие в защите клетки от окислительного стресса

ВЫВОДЫ:

1. Осуществлен генетический "нокдаун" протимозина альфа в клетках человека линии ЫеЬя методом интерференции РНК. Снижение количества протимозина альфа в ответ на введение в клетки плазмиды

подтверждено тремя независимыми методами: блот-гибридизацией РНК, электрофоретическим анализом препаратов частично очищенного протимозина альфа и иммуноферментным анализом протимозина альфа в клеточных лизатах.

2. Показана специфичность генетического "нокдауна" протимозина альфа: протимозин альфа-специфичные подавляют экспрессию

протимозина альфа, но не влияют на уровень ряда клеточных белков, siRNA, несущие точечные мутации, не способны вызывать деградацию мРНК протимозина альфа.

3. Снижение концентрации протимозина альфа в клетках линии HeLa в нормальных условиях и условиях окислительного стресса приводит к подавлению экспрессии гена гемоксигеназы-1 (одного из генов ответа клетки на окислительный стресс), что подтверждает предложенную модель участия протимозина альфа в защите клеток от окислительного стресса.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Абаева И.С., Карапетян Р.Н., Фатеева Т.В., Евстафьева А.Г., Вартапетян А. Б. Исследование функции протимозина а методом интерференции РНК. Тезисы докладов и стендовых сообщений III съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 2004,

4.П,стр. 351.

2. Абаева И.С. Генетический "нокдаун" ядерного онкобелка протимозина альфа. Тезисы научной конференции «Ломоносовские чтения», Москва, 2004, стр. 26.

3. Karapetian R.N., Evstafieva A.G., Abaeva I.S., Chichkova N.V., Filonov G.S., Rubtsov Y.P., Sukhacheva E.A., Melnikov S.V., Schneider U., Wanker E.E. and Vartapetian A.B. 2005. Nuclear oncoprotein prothymosin a is partner of Keapl: implications for expression of oxidative stress-protecting genes. Mol. Cell. Biol. 25, 1089-1099.

Принято к исполнению 17/01/2005 Исполнено 18/01/2005

Заказ № 548 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

l t £ *

I J Ï

16 m ?ods^ s \J

Список условных обозначений.

Введение.

1. Интерференция РНК и ее применение в молекулярной биологии (обзор литературы).

1.1. Феномен интерференции РНК.

1.2. Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК.

1.3. Особенности протекания процесса интерференции РНК в клетках млекопитающих.

1.4. Роль интерференции РНК в жизнедеятельности клетки.

1.5. Характеристика систем осуществления интерференция РНК в клетках высших эукариот.

1.5.1. Химический синтез.

1.5.2. Транскрипция in vitro.

1.5.3. Получение интерферирующих РНК с помощью фермента Diser.

1.5.4. Экспрессионные векторы.

1.6. Примеры использования интерференции РНК в молекулярной биологии.

2. Генетический "нокдаун" протимозина альфа человека методом интерференции РНК (результаты и их обсуждение).

2.1. Осуществление протимозин альфа-специфичной интерференции РНК в клетках человека.,.

2.1.1. Конструирование плазмид для осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа в клетках человека.

2.1.2. Оптимизация условий интерференции РНК протимозина альфа.

2.2. Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК.

2.2.1. Оценка снижения количества мРНК протимозина альфа в клетках

HeLa, трансфицированных pSuperRNAi-ProTa.

2.2.2. Специфичность использованных интерферирующих РНК.

2.2.3. Оценка снижения экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта.

2.3. Специфичность эффекта снижения экспрессии гена протимозина альфа.

2.4. Исследование участия протимозина альфа в ответе клетки на окислительный стресс.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и реактивы.

3.2. Используемые методы.

3.3. Манипуляции с клетками млекопитающих.

3.4. Конструирование плазмид.

Выводы.'.

Одной из наиболее интересных и сложных для решения задач в области молекулярной биологии является изучение функции генов. Появление всего лишь нескольких мутаций в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего, например, белок, вовлеченный в процесс регуляции деления клеток, может дать начало росту злокачественной опухоли. Поэтому изучение функции генов важно не только в связи с возможными I фундаментальными открытиями, но также существенно для создания подходов, позволяющих воздействовать на биологические функции, например, подавлять рост опухоли или размножение вируса. К настоящему моменту некоторые гены достаточно полно охарактеризованы на молекулярном уровне -известны их полные нуклеотидные последовательности, известно какой белок они кодируют, как этот белок взаимодействует с другими белками. Но, несмотря, на это чаще всего детальные сведения об участии этих генов в тех или иных клеточных I процессах и механизмах их регуляции чрезвычайно скудны. А функцию большинства генов генома еще только предстоит выяснить.

Путь от обнаружения гена к выяснению его функции сложен. Определение функции какого-либо гена в клетке и соответственно кодируемого этим геном белка основано на использовании методов молекулярной биологии, генетики и биохимии. В число этих методов входит, например, направленный мутагенез и его частный случай - "нокаут". Еще один способ понять, какую функциональную значимость несет тот или иной белок в клетке - это поиск его молекулярных партнеров. Искать белки, взаимодействующие с исследуемым белком, позволяет мощный и широко используемый метод двугибридной системы. Этот список может продолжить открытое не так давно явление интерференции РНК, позволяющее осуществить в клетке процесс генетического "нокдауна", т.е. специфически подавить уровень экспрессии избранного гена-мишени, но не выключить его работу полностью. Таким образом, интерференция РНК дает возможность изучать функцию жизненно важных для клетки генов, для которых генетический "нокаут" не может быть применим, так как в этом случае нокаутированные клетки будут нежизнеспособны.

Настоящая работа посвящена использованию явления интерференции РНК для осуществления "нокдауна" гена протимозина альфа. Протимозин, альфа является высококонсервативным, жизненно важным белком. Это ядерный мультикопийный белок с молекулярной массой 13 кДа. Его первичная структура содержит половину остатков глутаминовой и аспаргиновой аминокислот. Протимозин альфа не имеет каких-либо элементов вторичной и третичной структуры [1]. Несмотря на значительное количество накопившихся к настоящему времени экспериментальных данных, касающихся возможной роли этого белка в жизни клетки, механизм его действия неизвестен. Было показано, что этот белок важен для процесса клеточного деления. Совсем недавно в нашей лаборатории было установлено, что протимозин альфа имеет на С-конце сигнал для узнавания каспазами-3 и -7 и является антиапоптотическим белком. Кроме того, посредством дрожжевой двугибридной системы был обнаружен один из молекулярных партнеров протимозина альфа. Им оказался белок Keapl - репрессор активатора транскрипции генов ответа на окислительный стресс Nrf2. Приведенные данные указывают на то, что протимозин альфа может выполнять в организме несколько функций, т.е. он является белком многоцелевого назначения.

Цель данной работы заключалась в отработке метода интерференции РНК протимозина альфа в клетках человека. Используя этот метод, мы также попытались пролить свет на возможную роль протимозина альфа в механизме ответа клетки на окислительный стресс. Эти исследования,'несомненно, важны для понимания основных регуляторных путей молекулярного механизма защиты клетки от окислительного стресса, нарушение которых тем или иным образом может оказаться губительным для клетки. Детали же участия протимозина альфа в процессе регуляции ответа клетки на окислительный стресс, а также его возможное участие в других важных клеточных процессах, очевидно, еще только предстоит выяснить.

1. ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ РНК И EEJ ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ (обзор литературы)

ВЫВОДЫ:

1. Осуществлен генетический "нокдаун" протимозина альфа в клетках человека линии HeLa методом интерференции РНК. Снижение количества протимозина альфа в ответ на введение в клетки плазмиды pSuperRNAi-ProTa подтверждено тремя независимыми методами: б лот-гибридизацией РНК, электрофоретическим анализом препаратов частично очищенного протимозина альфа и иммуноферментным анализом протимозина альфа в клеточных лизатах.

2. Показана специфичность генетического "нокдауна" протимозина альфа: протимозин альфа-специфичные siRNA подавляют экспрессию протимозина альфа, но не влияют на уровень ряда клеточных белков. siRNA, несущие точечные мутации, не способны вызывать деградацию мРНК протимозина альфа.

3. Снижение концентрации протимозина альфа в клетках линии HeLa в нормальных условиях и условиях окислительного стресса приводит к подавлению экспрессии гена гемоксигеназы-1 (одного из генов ответа клетки на окислительный стресс), что подтверждает предложенную модель участия протимозина альфа в защите клеток от окислительного стресса.

1. Watts J.D., Сагу P.D., Sautiere P., Crane-Robinson С. (1990) Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins. Eur. J. Biochem., 192, 643-651.

2. Kurreck J. (2003) Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem., 270, 1628-44.

3. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391, 806-811.

4. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous gene in trans. Plant Cell, 2, 279-289.

5. Romano N., Macino G. (1992) Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol., 22, 3343-3353.

6. Tabara H., Sarkissian M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A., Mello C.C. (1999) The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell, 99, 123-132.

7. Bertrand J.R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A., Malvy C. (2002) Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun., 296, 1000-1004.

8. Miyagishi M., Hayashi M., Taira K. (2003) Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 13, 1-7.

9. Vickers T.A., Koo S., Bennett C.F., Crooke S.T., Dean N.M., Baker B.F. (2003) Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase Hidependent antisense agents. A comparative analysis. J. Biol. Chem., 278, 71087118.

10. Montgomery, M.K. and A. Fire. (1998) Double-stranded RNA as a mediator in sequence-specific genetic silencing and co-suppression. Trends Genet., 14, 255258.

11. Montgomery M.K., Xu S., Fire A. (1998) RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 15502-15507.

12. Voinnet O., Baulcombe D.C. (1998) Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell; 10, 937-946.

13. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., and Martienssen R.A. (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science, 297, 1833-1837.

14. Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C. (2004) RNA silencing genes control de novo DNA methylatioh. Science, 303, 1336.

15. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama Т., Gygi S., Grewal S.I., Moazed D. (2004) RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex. Science, 303, 672-678.

16. Bartel D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis mechanism, and function. Cell; 116, 281-297.

17. Yang D., Lu H., Erickson J.W. (2000) Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos. CurrBiol., 10, 1191-200

18. Tuschl Т., Zamore P.D., Lehmann R., Bartel D.P., Sharp P.A. (1999) Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev., 13, 31913197.

19. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, 404, 293 296 .

20. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kol?ayashi R., Hannon G.J. (2001) Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science, 293, 1146-1150.

21. Caudy A.A., Hannon G.J. (2004) Induction and biochemical purification of RNA-induced silencing complex from Drosophila S2 cells. Methods Mol. Biol., 265, 59-72.

22. Waterhouse, P.M., Graham, M.W., and Wang, M.B. (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultane expression of sense and antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959-13964.

23. Zamore P.D., Tuschl Т., Sharp P.A., Bartel D.P.,(2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide

24. T intervals. Cell, 101, 25-33.

25. Elbashir S.M., Lendeckel W., and Tuschl T. (2001a) RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Dev., 15, 188-200.

26. Byrom M., Pallotta V., Brown D., Ford L.P. (2002) RNAi in mammalian cells: visualizing siRNA and analyzing induction of RNAi. Ambion Tech. Notes, 9, 68.

27. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. (2001) Role for a ^ bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 409,363.366.

28. Knight S.W. and Bass B. L. (2001) A role for the RNase III enzyme DCR-1 in RNA interference and germ line development in Caenorhabditis elegans. Science, 293, 2269-2271.

29. Lee Y.S., Nakahara K., Pham J.W., Kim K., He Z., Sontheimer E.J., and Carthew R.W. (2004) Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell, 117, 69-81.

30. Robertson H.D., Webster R.E., Zinder N.D. (1968) Purification and propertiesof ribonuclease III from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 243, 82-91.

31. Nicholson A.W. (2003) The ribonuclease III superfamily: forms and functions in RNA maturation, decay, and gene silencing. In RNAi: A Guide to Gene Silencing, Hannon G.J, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 149-174.

32. Kolb F.A., Zhang H., Jaronczyk K., Tahbaz Nv Hobman T.C., Filipowicz W. (2005) Human Dicer: Purification, Properties, and Interaction with PAZ PIWI Domain Proteins. Methods Enzymol., 392, 316-36.

33. Provost P., Dishart D., Doucet J., Frendewey D., Samuelsson В., Radmark O. (2002) Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMBO J., 21,5864-5874.

34. Myers J.W., Jones J.T., Meyer Т., Ferrell J.E. (2003) Recombinant Dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suitable for gene silencing. Nat. Biotechnol., 21, 324-328.

35. Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, Li^ndeckel W, Tuschl T. (2001) Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J., 20, 6877-6888.

36. Tabara H., Sarkissian M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A., Mello C.C. ( 1999) The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell; 99, 123-32

37. Catalanotto C., Azzalin G., Macino G., Cogoni C. (2000) Gene silencing in worms and fungi. Nature, 404, 245.

38. Pal-Bhadra M., Bhadra U., Birchler J.A. (2002) RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila Mol. Cell, 9, 315-327.

39. Song J.J., Liu J., Tolia N.H., Schneiderman J., Smith S.K. (2003) The crystal Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding, motif in RNAi effector complexes. Nat. Struct. Biol., 10, 1026-1032.

40. Yan K.S., Yan S., Farooq A., Han A., Zeng L., Zhou M.M., Maine E. (2003) Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature, 426, 468474.

41. Tahbaz N., Kolb F.A., Zhang H., Jaronczyk K., Filipowicz W. (2000) Characterization of the interactions between, mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer. EMBO Rep., 5, 189-194.

42. Tijsterman M., Ketting R.F., Okihara K.L., Sijen Т., Plasterk R.H. (2002) RNA helicase MUT-14-dependent gene silencing triggered in C. elegans by short antisense RNAs. Science, 295, 694-671.

43. Parrish S., Fire A. (2001) Distinct roles for RDE-1 and RDE-4 during RNA interference in Caenorhabditis elegans. RNA, 7,1397-1402.

44. Williams R.W., Rubin G.M. (2002) ARGONAUTE1 is required for efficient RNA interference in Drosophila embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6889-6894.

45. Caudy A.A., Myers M., Hannon G.J., Hammond S.M. (2002) Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev., 16, 2491-2496.

46. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. (2002) Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 110, 563-574.

47. Zou C., Zhang Z., Wu S., Osterman J.C. (1998) Molecular nucleotide sequences of cloning and characterization of a rabbit eIF2C protein. Gene, 211, 187-194.

48. Doi N., Zenno S., Ueda R., Ohki-Hamazaki H., Ui-Tei K., Saigo K. (2003) Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors. Curr Biol., 13, 41-46.

49. Hutvagner G., Zamore P.D. (2002) microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science; 297, 2056-2060.

50. Mourelatos Z., Dostie J., Paushkin S., Sharma A., Charroux В., Abel L., Rappsilber J., Mann M., Dreyfuss G. (2002) miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev., 16, 720-728.

51. Caudy AA, Ketting RF, Hammond SM, Denli AM, Bathoorn AM, Tops BB, Silva JM, Myers MM, Hannon GJ, Plasterk RH. (2003) A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature, 425, 411-414.

52. Grishok A., Tabara H., Mello C.C. (2000) Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science, 287, 2494-2497.

53. Yi R., Qin Y., Macara I.G. (2003) Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev., 17, 3011-3016.

54. Lund E., Guttinger S., Calado A. (2004) Nuclear export of microRNA precursors. Science, 303, 95-98.

55. Winston. (2002) Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science, 295, 2456-2459.

56. Feinberg E.H., Hunter C.P. (2003) Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science, 301, 1545-1547.

57. Cogoni C., Macino G. (1999) Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase. Nature, 399, 166— 169.

58. Dalmay Т., Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. (2000) An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell, 101,543-553.

59. Smardon A., Spoerke J.M., Stacey S.C., Klein M.E., Mackin N., Maine E.M. (2000) EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans. Curr. Biol., 10, 169-178.

60. Schwarz D.S., Hutvagner G., Haley B. (2002) Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol. Cell, 10, 537-548.

61. Stein P., Svoboda P., Anger M., Schultz R.M. (2003) RNAi: mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase. RNA, 9, 187-192.

62. Samuel C.E. (1991) Antiviral actions of interferon. Interferon-regulated cellular proteins and their surprisingly selective antiviral activities. Virology, 183, 1-11.

63. Staeheli P. (1990) Interferon-induced proteins and the antiviral state. Adv. Virus Res., 38, 147-200.

64. Thomis D.C., Samuel C.E. (1993) Mechanism of interferon action: evidence1r for intermolecular autophosphorylation and autoactivation of the interferoninduced, RNA-dependent protein kinase PKR. J Virol., 67, 7695-7700.

65. Samuel C.E. (1993) The eIF-2 alpha protein kinases, regulators of translation in eukaryotes from yeasts to humans. J. Biol. Chem., 268, 7603-7606.

66. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. (1979) Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2,5-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells. J. Biol. Chem., 254, 1018010183.A

67. Horisberger M. A. (1992) Interferon-induced human protein MxA is a GTPase which binds transiently to cellular proteins. J. Virol., 66, 4705—4709.

68. Billy E., Brondani V., Zhang H., Muller U., Filipowicz W. (2001) Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A., 98, 14428-14433.

69. Svoboda P. (2004) Long dsRNA and silent genes strike back:RNAi in mouse oocytes and early embryos. Cytogenet. Genome Res., 105, 422-434.

70. Paddison P.J., Caudy A.A., Hannon G.J. (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1443-1448.

71. Clarke P. A., Mathews M. B. (1995) Interactions between the double-stranded RNA binding motif and RNA: definition of the binding site for the interferoninduced protein kinase DAI (PKR) on adenovirus VA RNA. RNA, 1, 17-20.

72. Jagus R., Gray M.M. (1994) Proteins that interact with PKR. Biochimie., 76, 779-791.

73. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. (1992) Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol. Cell Biol., 12, 5238-5248.

74. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. (2001) Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 9742-9747.

75. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. (2001b) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411, 494-498.

76. Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. (2004) Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA, 10, 12-18.

77. Sledz C.A., Holko M., Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R. (2003) Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat. Cell Biol., 5, 834-839.

78. Bridge A.J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A.L., Iggo R. (2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat. Genet., 34, 263-264.

79. Semizarov D., Frost L., Sarthy A., Kroeger P., Halbert D.N., Fesik S. W. (2003) Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 6347-6352.

80. Baulcombe D. (1995) Viruses and gene silencing in plants. Arch. Virol. Suppl., 15, 189-201.

81. Sijen Т., Plasterk R.H. (2003) Transposon silencing in the elegans germ line by natural RNAi. Nature, 426, 310-314.

82. Johnston R.J., Hobert O. (2003) A microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in Caenorhabditis elegans. Nature, 426, 845-849.

83. Grishok A. (2001) Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 106,23-34.

84. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Meyer J., Borkhardt A., Tuschl T. (2003). New microRNAs from mouse and human. RNA, 9, 175-179.

85. Lee R. C., Feinbaum R. L., Ambros V. (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 75, 843-854.

86. Reinhart B. J. (2000)The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 403, 901-906.

87. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl Т., Zamore P.D. (2001) A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science, 293, 834-838.

88. Ambros V. (2001) Development. Dicing up RNAs. Science, 293, 811-813.

89. Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provostton J.C., Weigel D. (2003) The nuclear RNaselll Drosha initiates microRNA processing. Nature, 425,415-419.

90. Olsen P.H., Ambros V. (1999) The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev. Biol., 216, 671-680.

91. Doench J.G., Petersen C.P., Sharp P.A. (2003) siRNAs can function as miRNAs. Genes & Dev., 17, 438-442.

92. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L., Baulcombe D. (2002) Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J., 21, 4671-4679.

93. Chiu Y.L., Rana T.M. (2002) siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis. RNA, 9, 1034-1048.

94. Elbashir S.M., Harborth J., Weber K., TuscHl T. (2002) Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods, 26, 199-213.

95. Yu J.Y., DeRuiter S.L., Turner D.L. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 6047-6052.

96. Donze O., Picard D. (2002) RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase Nucleic Acids Res., 30, 46.

97. Calegari F., Haubensak W., Yang D., Huttner W., Buchholz F. (2002) Tissue-specific RNA interference in postimplantdtion mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. PNAS, 99, 14236.

98. Kawasaki H., Suyama E., Iyo M., Taira K. (2003) siRNAs generated by recombinant human Dicer induce specific and significant but target site-independent gene silencing in human cells. Nucleic Acids Res., 31, 981-987.

99. Byrom M.W., Cheng A.M., Ford L.P. (2003)'Characterizing RNAi Induced with siRNA Cocktails Generated by RNase III. Ambion Tech. Notes, 10(1), 4-6.

100. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science, 296, 550553.

101. Paul C.P., Good P.D., Winer I., Engelke D.R. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol., 205, 505-508.

102. Baer M., Nilsen T.W., Costigan C., Altman S. (1990) Structure and transcription of a human gene for HI RNA, the RNA component of human RNase P. Nucleic Acids Res., 18, 97-103. '

103. Brow D.A., Guthrie С. (1990) Transcription of a yeast U6 snRNA gene requires a polymerase III promoter element in a novel position. Genes Dev., 4, 1345-1356.

104. Kawasaki H., Taira K. (2003) Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res., 31, 700-707.

105. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Shank P.R., Ramratnam B. (2003) Promoter choice affects the potency of HIV-l specific RNA interference. Nucleic Acids Res., 31, 5033-5038.

106. Shen C., Buck A.K., Liu X., Winkler M., Reske S.N. (2003) Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett., 539, 111-114.

107. Ohkawa J., Taira K. (2000) Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum. Gene Ther., 11, 577-585.

108. Fraser A.G., Kamath R.S., Zipperlen P., Martinez-Campos M., Sohrmann M., Ahringer J. (2000) Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature, 408, 325-330.

109. Berns K, Hijmans EM, Mullenders J, Brummelkamp TR, Velds A, Heimerikx ^ M, Kerkhoven RM, Madiredjo M, Nijkamp W, Weigelt B, Agami R, Ge W,

110. Cavet G, Linsley PS, Beijersbergen RL, Bernards R. (2004) A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway. Nature, 428,431-437.

111. Arteaga H.J., Hinkula J., van Dijk-Hard I., Dilber M.S., Wahren В., Christensson В., Mohamed A.J., Smith C.I. (2003) Choosing CCR5 or Rev siRNA in HIV-1. Nat. Biotechnol., 21, 230-231.

112. Radhakrishnan S.K., Layden T.J., Gartel A.L. (2004) RNA interference as a ' new strategy against viral hepatitis. Virology, 323, 173-181.

113. Wilson J.A., Jayasena S., Khvorova A., Sabatinos S., Rodrigue-Gervais I.G., Arya S., Sarangi F., Harris-Brandts M., Beaulieu S., Richardson C.D. (2003)

114. RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis Сireplicons propagated in human liver cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 2783-2788.

115. McCaffrey A.P. (2003) Inhibition of hepatitis В virus in mice by RNA interference. Nat. Biotechnol., 21, 639-644.

116. Martinez L.A. (2002) Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 14849-14854.

117. Brummelkamp T.R. et al. (2002) Stable suppression of tumorigenicity byvirus-mediated RNA interference. Cancer Cell, 2, 243-247.t

118. Scherr M. et al. (2003) Specific inhibition of brc-abl gene expression by small interfering RNA. Blood, 101, 1566-1569.

119. Wu, H. et al. (2003) Small interfering RNA-induced suppression of MDR1 (P-glycoprotein) restores sensitivity to multidrug-resistant cancer cells. Cancer Res. 63, 1515-1519.

120. Tsuruo Т. et al. (2003) Molecular targeting therapy of cancer: drug resistance, apoptosis and survival signal. Cancer Sci., 94, 15-21.

121. Jiang M., Milner J. (2003) Bcl-2 constitutively suppresses p53-dependent apoptosis in colorectal cancer cells. Genes Dev., 17, 832-837.

122. Zhang L. et al. (2003) Vector-based RNAi, a novel tool for isoformspecific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun., 303, 1169-1178.

123. Leirdal M., Sioud M. (2002) Gene silencing inmammalian cells by preformed small RNA duplexes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 744-748.

124. Gossen M., Bujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-response promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89, 5547-5551.

125. Cobum G.A., Cullen B.R. (2002) Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J. Virol., 76, 9225-9231.

126. Lee N.S. et al. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-I rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol., 20, 500-505.

127. Jacque J.M. et al. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature, 418, 435-438.

128. Jiang M., Milner J. (2002) Selective silencing of viral gene expression in HPV-positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference. Oncogene, 21, 6041-6048.

129. Martinez M.A. et al. (2002) Suppression of chemokine receptor expression by RNA interference allows for inhibition of HIV-1 replication. AIDS, 16, 23852390.

130. Tracey K.J., Carami A. (1994) Tumour necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. Annu. Rev. Med., 45, 491-503.

131. Ogita S, Uefuji H, Morimoto M, Sano H. (2003) Producing decaffeinated coffee plants. Nature, 423, 823.

132. Auger С., Stahli С., Fabien N., Monier J.C. (1987) Intracellular localization of thymosin alpha 1 by immunoelectron microscopy using a monoclonal antibody. J. Histochem., 35, 181-187.

133. Haritos A.A., Goodall GJ., Horecker B.L. (1984) Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1008-1011.

134. Eilers M., Schirm S., Bishop J.M. (1991)' The MYC protein activates transcription of the alpha-prothymosin gene. EMBO J., 10, 133-141.

135. Gomez-Marquez J., Segade F., Dosil M., Pichel J. G., Bustelo X. R., Freire M. (1989) The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem., 264, 8451-8454.

136. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. (1991) Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 253257.

137. Rodriguez P., Vinuela J. E., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. (1999) Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells. Cell Death Differ., 6, 3-5.

138. Watts J.D., Cary P.D., Crane-Robinson C. (1989) Prothymosin alpha is a nuclear protein. FEBS Lett., 245, 17-20.

139. Papamarcaki Т., Tsolas O. (1994) Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro. FEBS Lett., 345, 71-75.

140. Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C., Tsolas O., Papamarcaki T. (2002) Prothymosin alpha interacts with the CREB-binding protein and potentiates transcription. EMBO Rep., 3, 361-366.

141. Orre R.S., Cotter M.A., Subramanian C., Robertson E.S. (2000) Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro. J. Biol. Chem., 276, 1794-1799.

142. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I., Vartapetian A.B. (2000) Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. FEBS Lett., 467, 150-154.

143. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., Igarashi K., Engel J.D., Yamamoto M. (1999) Keapl repress nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes and Develop., 13, 76-86.

144. Brown D., Jarvis R., Pallotta V., Byrom M., Ford L (2002) RNA Interference in Mammalian Cell Culture: Design, Execution and Analysis of the siRNA Effect. Ambion Tech Notes, 9.

145. Walters D.K., Jelinek D.F. (2002) The effectiveness of double-stranded short inhibitory RNAs (siRNAs) may depend on the method of transfection. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 12, 411-418.

146. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. (1990) Human prothymosin alpha: purification of a highly acidic nuclear protein by means of a phenol extraction. Protein Expr. Purif., 1, 184-190.

147. Xue F., Cooley L. (1993) kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. Cell, 72, 681-693.

148. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984

149. QIAEXII Handbook, QIAGEN, 1995.161. "Sequenase 2.0", United States Biochemicals, 1990.

150. Laemmli U.K. (1970) Nature, 227, 68.

151. Chung С.Т., Miller Roger H. (1988) A rapid and convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.'Nucleic Acids Research, 16, 3580.

152. Unifectin-56 Transfection Kit. UNIFECT, 2003.

153. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem., 72, 248-254.