Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

005001053

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

ЧИЧКОВА Нина Валентиновна

ФИТАСПАЗА: АПОПТОТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА РАСТЕНИИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва-2011

005001053

Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Румш Лев Давидович

Ведущая организация: Институт Биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится 20 декабря 2011 г. в 15 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан {С ноября 2011 г.

доктор химических наук, профессор Филиппова Ирина Юрьевна

доктор биологических наук, профессор Рубцов Петр Михайлович

J

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Программированная клеточная смерть (ПКС) является фундаментальным биологическим процессом, позволяющим многоклеточным организмам удалять избыточные и поврежденные клетки. ПКС функционирует в процессе развития организма, участвует в ответе на стрессовые воздействия и играет защитную роль при инфекции патогенами. Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, характеризующийся определенным набором морфологических и биохимических признаков. Ключевую роль в программированном самоубийстве клеток животных играют каспазы - семейство высокоспецифичных цистеиновых протеаз, активирующихся при апоптозе и вносящих единичные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков. Каспазы обладают исключительной специфичностью гидролиза, внося разрыв после остатка аспарагиновой кислоты (О), находящегося в определенном аминокислотном контексте. Направленная фрагментация белков-мишеней каспазами приводит в конечном счете к упорядоченной гибели клетки. И напротив, ингибирование каспаз препятствует осуществлению апоптоза.

В полном соответствии с названием «апоптоз» (от греч. «опадание листьев»), ПКС функционирует и в организмах растений и используется для тех же целей, что и у животных. Следует отметить, что молекулярные механизмы ПКС растений изучены существенно хуже, чем в случае апоптоза животных. Однако наличие ряда сходных черт в ПКС животных и растений позволяет предполагать, что при осуществлении ПКС организмы двух царств используют сходные принципы. В этой связи существенно и удивительно, что у растений, судя по результатам секвенирования растительных геномов, отсутствуют каспазы - основные исполнители ПКС животных. В то же время, имеются многочисленные данные о том, что ингибиторы каспаз животных способны подавлять развитие ПКС растений. В соответствии с этим, при ПКС растений часто наблюдается активация неидентифицированных «каспазо-подобных» протеаз, способных гидролизовать разнообразные пептидные субстраты каспаз. Эти результаты позволяют думать, что в осуществлении ПКС у растений задействованы протеазы, являющиеся функциональными аналогами каспаз животных, но структурно сильно отличающиеся от каспаз.

Какая протеаза играет роль каспаз животных при осуществлении ПКС у растений? Такой фермент был найден и охарактеризован в ходе выполнения данной диссертационной работы и получил название «фитаспаза» {растительная аспартат-специфичная протеаза).

Цель работы. Обнаружение, идентификация, выяснение структуры, свойств и роли апоптотической протеазы растений - фитаспазы.

1

Задачи:

1. Исследовать поведение ядерного белка животных протимозина альфа в здоровых и апоптотических клетках человека и использовать полученные данные для разработки принципа поиска белков-субстратов каспаз.

2. Используя потенциальный белок-мишень фитаспазы, сконструировать репортерный белок, позволяющий детектировать активацию фитаспазы при ПКС и выделить фермент.

3. Определить субстратную специфичность фитаспазы.

4. Исследовать участие фитаспазы в осуществлении ПКС растений.

5. Идентифицировать фитаспазу и выяснить ее структурную организацию.

6. Определить пути активации фитаспазы.

7. Вьиснить локализацию фитаспазы в здоровых и в апоптотических тканях растений.

8. Провести сравнительный анализ структуры и свойств апоптотических протеаз животных и растений.

Решение поставленных задач должно было позволить выявить и всесторонне охарактеризовать апоптотическую протеазу растений, являющуюся функциональным аналогом каспаз животных, и определить сходства и различия апоптотических протеаз животных и растений.

Научная новизна и практическая значимость. В структуре белка человека протимозина альфа идентифицирован сигнал ядерной локализации. Одной из выявленных ядерных функций протимозина альфа является участие в защите клеток от окислительного стресса.

Обнаружено, что в процессе апоптоза в клетках человека происходит фрагментация протимозина альфа каспазой. В результате гидролиза протимозин альфа теряет сигнал ядерной локализации и меняет свою внутриклеточную локализацию с ядерной на цитоплазматическую.

Биоинформатический поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина каспазой, выявил белок УЮ2 агробактерии Agrobacterium Ште/асгет (патогена растений) в качестве потенциальной мишени каспаз. Экспериментально установлено, что белок У\гТ)2 фрагментируется каспазой-3 человека и идентифицированы места гидролиза.

Используя принцип изменения внутриклеточной локализации белка вследствие фрагментации каспазой, выявленный на примере протимозина альфа, мы обнаружили активацию фитаспазы при индукции ПКС в листьях табака. Показано, что фитаспаза гидролизует белок У1гБ2 после остатка Б в том же месте, что и каспаза-3 человека. Фитаспаза выявлена у широкого круга растительных организмов.

Разработана процедура выделения фитаспазы из растительных экстрактов. Фитаспазы табака и риса получены в индивидуальном состоянии. Определена субстратная специфичность фитаспаз, показавшая, что эти

2

растительные ферменты, как и каспазы, гидролизуют субстраты строго после остатка D в благоприятном аминокислотном контексте.

Установлена роль фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной как биотическим (вирусная инфекция), так и абиотическими стрессами (окислительный и осмотический стресс).

Фитаспазы табака и риса идентифицированы как субтилизин-подобные (сериновые) протеазы растений.

Активация фитаспазы происходит путем автокаталитического процессинга профермента в соответствии со специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования активной фитаспазы и для ее секреции.

В здоровых листьях растений фитаспаза накапливается в межклеточной жидкости (апопласте), куда направляется N-концевым сигнальным пептидом профермента. Индукция ПКС сопровождается перемещением фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.

Фрагментация агробактериального белка VirD2 фитаспазой является защитным механизмом, препятствующим доставке чужеродной ДНК в ядро растительной клетки.

Таким образом, у растений идентифицирован и охарактеризован новый тип протеаз, являющихся функциональными аналогами каспаз животных, и выявлены свойства апоптотических протеаз, специфичные для растений.

Все результаты диссертационной работы получены впервые.

Результаты работы опубликованы в виде 15 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах, 1 главы в книге и 1 международного патента.

Работа была поддержана грантами РФФИ, Королевского общества Великобритании, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференциях: Bilateral German-Russia Symposium, October 15-18, 2006, Titisee, Germany; VI Съезде общества физиологов растений России, 18-24 июня 2007 г., Сыктывкар; International Biochemistry and Molecular Biology Mini-Symposium, May 5-7, 2007, Tainan, Taiwan; IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск; Russia-German Bilateral Symposium "Molecular Biomedicine", 29 мая-2 июня 2008, Санкт-Петербург; The 1st International Conference on Plant Proteases, April 10-14,2011, Hemavan, Sweden.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 202 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы, список литературы. Материал иллюстрирован 74 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 206 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена обнаружению, выяснению структуры, свойств и роли апоптотической протеазы растений, которую мы назвали фитаспазой (от «растительная асиартат-специфичная протеаза»), Протеазу, играющую роль в программированной смерти растений (ПКС), аналогичную роли каспаз животных, и обладающую сходной с каспазами субстратной специфичностью, пытались найти и до этой работы, но безуспешно. По-видимому, решающую роль в обнаружении фитаспазы сыграл использованный нами подход, который базировался на достаточно общих представлениях о том, что может происходить с белками при апоптозе. А сами эти представления сформировались у нас при изучении объекта, у растений и вовсе не встречающегося, - белка животных протимозина альфа.

1. Белок животных протимозин альфа как источник концепции

Протимозин альфа (ПроТа) - это мультикопийный ядерный белок животных. При своем маленьком размере (-12 кДа) и исключительно высоком содержании остатков дикарбоновых аминокислот (50%), белок лишен элементов упорядоченной структуры и существует, как принято считать, в виде статистического клубка. Это, однако, не мешает протимозину быть жизненно важным белком, блокирование синтеза которого приводит к остановке клеточного деления и к апоптозу.

1.1. Протимозин альфа - белок с ядерной локализацией и внутриядерной функцией

Поскольку ядро - это основной компартмент, где накапливается ПроТа, мы выяснили, что направляет ПроТа в ядро. С помощью мутационного анализа ПроТа человека мы выявили сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), расположенный в С-концевой области молекулы белка - Рис. 1. Этот сигнал оказался двучастным, т.е. состоящим из двух блоков основных аминокислотных остатков, разделенных относительно коротким спейсерным участком. Точечные мутации в каждом из основных блоков нарушали импорт ПроТа в ядро, а удаление второго (С-концевого) блока (аминокислотные остатки 101-109) делало белок полностью неспособным накапливаться в ядре. Присоединение NLS ПроТа к репортерному белку GFP приводило к исключительно ядерной локализации химерного белка в клетках человека. Это доказывало не только необходимость, но и достаточность NLS ПроТа для активного транспорта белка в ядро в клетках человека.

Среди партнеров ПроТа, исследованных нами для выяснения функции этого белка, особого внимания заслуживает белок Keapl, поскольку в этом

случае нам удалось не только детально исследовать взаимодействие между этими двумя белками, но и выяснить его биологический смысл.

j 87 99 I 104

KR......DDVDTKKQK

с белком Keapl

Рис. 1. Структура ПроТа человека. Вблизи С-конца расположен NLS. Гидролиз каспазой (красная стрелка) разрушает NLS.

Белок Keapl был обнаружен нами как потенциальный партнер ПроТа с помощью дрожжевой двугибридной системы. Keapl является ингибитором транскрипционного фактора животных Nrf2. А сам этот транскрипционный фактор является позитивным регулятором (активатором) экспрессии целого ряда генов, обеспечивающих защиту клеток животных от окислительного стресса. К тому моменту, как мы занялись исследованием взаимодействия белков Keapl и ПроТа, была принята модель, согласно которой цитоплазматический белок Keapl ингибирует активность Nrf2, поскольку взаимодействует с Nrf2, удерживает транскрипционный фактор в цитоплазме и направляет его на протеасомную деградацию.

Эта схема ясно указывала, что ПроТа, взаимодействуя с белком Keapl, может быть вовлечен в защитную реакцию клетки на окислительный стресс. Однако наша гипотеза наталкивались на принципиальное противоречие. ПроТа, как мы сами показали, обладает сильным NLS и является исключительно ядерным белком. В то же время белок Keapl, каким его себе представляли, является исключительно цитоплазматическим белком, и в этом как раз заключался биологический смысл действия Keapl. Как два белка с различной внутриклеточной локализацией (ПроТа и Keapl) могут быть партнерами?

Для разрешения этого противоречия мы предположили, что Keapl на самом деле является белком-челноком, непрерывно мигрирующим между ядром и цитоплазмой. Если он проводит большую часть времени в цитоплазме, то это создаст иллюзию его исключительно цитоплазматической локализации. Для такого поведения Keapl должен обладать способностью транспортироваться в ядро. Но, что более важно, он должен также обладать мощным сигналом экспорта из ядра (NES, nuclear export signal), что обеспечило бы ему преимущественно цитоплазматическую локализацию. Для проверки этого предположения мы заблокировали экспорт белков из ядра в клетках человека различных линий путем обработки клеток специфическим ингибитором экспорта - лептомицином Б. В полном соответствии с нашими ожиданиями, белок Keapl тут же изменил свою внутриклеточную локализацию с цитоплазматической на ядерную - Рис. 2.

5

Рис. 2. Белок Keapl в клетках человека мигрирует между ядром и цитоплазмой. Обработка клеток ингибитором экспорта белков из ядра лептомицином Б (LMB) (схема слева) приводит к накоплению белка Keapl в ядре. Верхний ряд - окрашивание белка Keapl; нижний ряд - окрашивание ядер (ДНК). Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии.

Это свидетельствовало как о способности Keapl импортироваться в ядро, так и о наличии в его составе NES. И действительно, с помощью мутационного анализа нам удалось идентифицировать NES в центральной части белка Keapl (см. Рис. 3) и доказать его необходимость и достаточность для экспорта белка из ядра. Существенно, что внутриклеточная локализация транскрипционного фактора Nrf2 в нестрессированных клетках человека непосредственно зависела от способности белка Keapl покидать ядро. При нарушении экспорта Keapl из ядра, вызванным обработкой лептомицином Б или мутацией в NES Keapl, в ядро нестрессированных клеток перемещался не только белок Keapl, но и транскрипционный фактор Nrf2. Это обстоятельство указывало на то, что между ядром и цитоплазмой мигрирует комплекс Nrf2-Keap 1.

~ РгоТа

NES: LVKIFEELTÎ

Г

\ /

BTB/POZ домен M Kelch-повторы

t

Nrf2

Рис. 3. Белок Keapl содержит функциональный NES. Мутации в составе NES (отмечены *) предотвращают экспорт белка из ядра. ПроТа и Nrf2 взаимодействуют с С-концевой половиной белка Keapl (содержащей Kelch-повторы), образующей структуру бета-пропеллера.

Таким образом, нам удалось снять противоречие, связанное с различной внутриклеточной локализацией белков Keapl и ПроТа. Дальнейшие наши исследования, проведенные in vivo и in vitro, показали, что ПроТа способен непосредственно (т.е. напрямую) и специфично взаимодействовать с белком Keapl, что за взаимодействие с Keapl отвечает центральный участок ПроТа (см. Рис. 1), и что точечные мутации в этой области предотвращают взаимодействие двух белков. Попутно мы выяснили, что ПроТа является Zn2+- и Са2+-связывающим белком, и присутствие этих двухвалентных катионов резко усиливало его взаимодействие с Keapl.

В чем может заключаться роль ПроТа в процессе защитного ответа клеток на окислительный стресс? С помощью делеционного анализа мы показали, что ПроТа взаимодействует с С-концевым доменом белка Keapl, образующим структуру так называемого бета-пропеллера - Рис. 3. Поскольку было известно, что транскрипционный фактор Nrf2 взаимодействует с этим

6

же участком белка Keapl, то мы предположили, что роль ПроТа может заключаться в диссоциации поступающего в ядро комплекса Nrf2-Keapl путем связывания белка Keapl. Высвобождающийся при этом транскрипционный фактор Nrf2 способен связываться с ДНК и активировать транскрипцию целевых генов. В системе in vitro, состоящей из трех очищенных рекомбинантных белков (Nrf2, Keapl и ПроТа), мы показали, что ПроТа и Nrf2 действительно конкурируют между собой за связывание с белком Keapl (Рис. 4 А) и что ПроТа способен диссоциировать предобразованный комплекс Nrf2-Keapl с высвобождением транскрипционного фактора - Рис. 4Б. С предложенной интерпретацией согласуются наши данные, полученные in vivo. Повышение уровня ПроТа в клетках человека стимулирует Мг£2-зависимую транскрипцию, в то время как i

понижение внутриклеточного содержания ПроТа ее угнетает.

Таким образом, стало ясно, что ядерная локализация ПроТа, обеспечиваемая наличием NLS в составе этого белка, играет существенную ,

Рис. 4. ПроТа конкурирует с транскрипционным фактором Nrf2 за взаимодействие с белком Keapl. A: Nrf2 вытесняет '"Р ПроТа из иммобилизованного на IgG-сефарозе комплекса zz-Keapl-ПроТа. Б: ПроТа высвобождает Nrf2 из

иммобилизованного комплекса zz-Keapl-Nrf2. Треки 1 и 4: + буфер; треки 2 и 5: + ПроТа дикого типа; треки 3 и 6: + ПроТа с мутацией в Keapl-связывающей области; 7 - маркер Nrf2. Анализ с помощью иммуноблоттинга с антителами к Nrf2.

Функции ПроТа, связанные с пролиферацией клеток животных и с их защитой от окислительного стресса, важны для жизнедеятельности, но они же, вероятно, могут служить препятствием, когда клетки надо убить, направив их на путь апоптоза. Поэтому нас заинтересовал вопрос: что происходит с ПроТа в апоптотических клетках человека?

В процессе программированной клеточной смерти животных (ПКС, апоптоз) ключевую роль играют высокоспецифичные протеазы - каспазы. |

Эти ферменты активируются при индукции апоптоза путем процессинга неактивных белков-предшественников и вносят единичные (как правило) разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков после остатка D, находящегося в определенном аминокислотном контексте. Эта специфическая фрагментация белков приводит в конечном счете к гибели

роль в функционировании ПроТа.

10090" 8070 -60 50 40 -3020 -to-

so 60

время, мин

связанный'с Кеар 1 вытесненный Nrf'2

1.2. Как можно утратить NLS

клетки. Мы показали, что ПроТа человека является мишенью каспаз при индукции апоптоза, вызванного различными стимулами. Гидролиз полипептидной цепи происходит в С-концевой области ПроТа после остатка D99 и ведет к образованию укороченного ПроТа(1-99) и отщепленного короткого (10-членного) С-концевого пептида белка - Рис. 1 и 5A. In vitro фрагментацию ПроТа способны осуществлять каспазы-3 и -7 человека (Рис. 5Б), a in vivo главная роль в расщеплении ПроТа принадлежит каспазе-3 -основной «исполнительной» каспазе человека. При использовании более жестких условий гидролиза каспаза-3 способна вносить еще два разрыва в молекулу ПроТа, однако основной продукт расщепления, накапливающийся в апоптотических клетках человека, - это фрагмент ПроТа(1-99).

А Б

— ПроТа

— ПроТа (Í-991

WT ПроТа 0(99>N

- +

WTПроТа DI991N

- + - +

Рис. 5. ПроТа фрагментируется каспазой при апоптозе (А) и in vitro (Б) в сайте DDVD99. А: ПроТа, выделенный из здоровых клеток человека (1) и из апоптотических TNF-обработанных (2) и УФ-облученных (3) клеток. (4) и (5) - рекомбинантные белки-маркеры. Б: мутант ПроТа по месту расщепления (D99N) устойчив к гидролизу каспазой.

В чем смысл фрагментации ПроТа каспазой? Из Рис. 1 видно, что место гидролиза расположено в спейсере, разделяющем два функциональных блока двучастного N1.8 ПроТа. Таким образом, в результате гидролиза протимозин утрачивает вторую (С-концевую) часть своего ЫЬБ, что, как мы выяснили ранее, нарушает импорт белка в ядро. И хотя, на первый взгляд, потеря от фрагментации ПроТа каспазой невелика (утрачивается менее 10% молекулы белка), функциональные последствия от расщепления каспазой для ПроТа драматичны. Белок перестает накапливаться на своем рабочем месте -в ядре. Вместо этого он равномерно распределяется по всей умирающей клетке (Рис. 6) и, более того, выходит на ее поверхность.

А_ Б_ Рис. 6. Гидролиз фитаспазой

разрушает ЫЬв и нарушает импорт вРР-ПроТа в ядро клетки человека. Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии.

• íft *

tí

Полноразмерный ПроТа ПроТа (1-99)

Таким образом, инактивация ПроТа при апоптозе достигается просто, но эффективно. Гидролиз каспазой единственной пептидной связи в молекуле ПроТа приводит к изменению внутриклеточной локализации белка-мишени и нарушению его функционирования. Следует ожидать, что природа, взяв на вооружение эту элегантную стратегию инактивации белка путем

разрушения его NLS, могла бы применять ее чаще, чем в случае одного только ПроТа.

2. Компьютерный поиск ядерных белков, утрачивающих NLS при гидролизе каспазами

Чтобы найти новые ядерные белки, которые, подобно ПроТа, могли бы изменять внутриклеточную локализацию при апоптозе в результате расщепления каспазами, мы провели компьютерный поиск белков, содержащих потенциальный сайт расщепления каспазами, расположенный вблизи потенциального двучастного NLS. Следует отметить, что при проведении такого анализа имеется ряд отягчающих обстоятельств, связанных с вырожденностью обоих искомых мотивов. Поэтому, используя для поиска базу данных доменов и функциональных сайтов белков PROSITE на биоинформационном портале ExPASy, мы варьировали последовательности обоих мотивов и расстояние между ними. Мы не ввели ограничения «искать только по базам данных животных», и эта неосторожность коренным образом изменила ход дальнейших исследований. В результате проведенного поиска был получен список из нескольких десятков белков-кандидатов, и про некоторые из этих белков было уже известно, что они являются мишенями каспаз. В основном в списке присутствовали новые белки животных, но далее речь пойдет не о них.

К нашему удивлению, один из выявленных нами белков-кандидатов имел бактериальное происхождение, несмотря на то, что поиск производился с целью обнаружения белков, обладающих NLS и каспазным сайтом, а бактерии не имеют ни ядра, ни каспаз. Белок назывался VirD2 и принадлежал агробактерии Agrobacterium tumefaciens - патогену растений, вызывающему трансформацию растительной клетки и образование опухолей («корончатый галл», например). И хотя попадание белка VirD2 в наш список выглядело на первый взгляд чистым недоразумением, мы не отмахнулись от этого белка по следующим причинам.

Агробактерии заражают растения и трансформируют растительные клетки, доставляя в них одноцепочечную молекулу бактериальной ДНК (Т-ДНК, transfer DNA), которая синтезируется с бактериальной Ti-плазмиды (tumor-inducing). Та же самая Ti-плазмида агробактерий содержит гены вирулентности, кодирующие Vir-белки, необходимые для заражения растения и его трансформации. Один из этих белков, тот самый VirD2, необходим для инициации синтеза Т-ДНК агробактерий и оказывается ковалентно присоединенным к 5'-концу переносимой в растительную клетку Т-ДНК. Попав в цитоплазму растительной клетки, бактериальный белок VirD2 импортируется в ядро и транспортирует туда присоединенную к нему Т-ДНК. Для активного транспорта в ядро растительной клетки белок VirD2, хотя он и является бактериальным, оснащен NLS. Оказалось, что

9

предсказанный нами двучастный 1УЬ8 в составе белка \Чг02 в точности совпадает с экспериментально определенным - Рис. 7.

VirD2

каспаза ?

447

эндонуклеазный домен

NLS

Рис. 7. Белок агробактерий VirD2 содержит двучастный NLS вблизи С-конца. Эндонуклеазный домен - место присоединения Т-ДНК.

В таком случае, возможно, и второе наше предсказание - наличие сайта расщепления каспазой перед NLS (Рис. 7) - не лишено оснований? Можно было ожидать, что белок VirD2 является мишенью каспаз растений, поскольку существенную часть своей жизни он проводит в растительной клетке. Здесь нас ожидало обескураживающее обстоятельство. Оказалось, что из данных по секвенированию растительных геномов (арабидопсиса и риса) однозначно следует, что у растений нет гомологов каспаз. Хотя программированная клеточная смерть у растений, несомненно, есть, и она имеет определенные сходные морфологические и биохимические черты с апоптозом животных. В то же время, литература по ПКС растений содержит многочисленные данные о присутствии каспазо-подобных протеолитических активностей, т.е. о способности неизвестных протеаз в экстрактах растительных тканей гидролизовать специфические пептидные флуорогенные субстраты каспаз животных (XXXD-AFC, где AFC -7-амино-4-трифторметил-кумарин). Более существенно, специфические пептидные ингибиторы каспаз животных (XXXD-CHO, -fmk, -cmk) в ряде случаев были способны предотвращать развитие ПКС у растений, что указывало на участие каспазо-подобных (по специфичности гидролиза) растительных протеаз в осуществлении ПКС у растений.

Совокупность этих данных позволила нам высказать предположение, что в ПКС у растений принимает участие протеаза(-зы), обладающая специфичностью гидролиза, сходной со специфичностью каспаз, но структурно совершенно не похожая на каспазы и поэтому до сих пор не идентифицированная. Если белок VirD2 действительно является мишенью растительной каспазо-подобной протеазы, то использование VirD2 в качестве наживки может позволить обнаружить и идентифицировать эту неуловимую каспазо-подобную протеазу растений.

Однако для начала следовало убедиться, что белок VirD2 может гидролизоваться хотя бы каспазой животных. Мы получили рекомбинантный белок VirD2 и обработали его каспазой-3 человека. Выяснилось, что каспаза-3 вносит один основной и один минорный (требующий более жестких условий гидролиза) разрыв в молекулу белка VirD2 вблизи ее С-конца - Рис. 8. Места гидролиза были идентифицированы с помощью мутационного и

Ni-NTA

масс-спектрометрического анализа (масс-спектрометрические анализы здесь и далее проведены М. Калкумом, Beckman Research Institute, США). Основной (наиболее эффективный) гидролиз происходил после остатка D400 в мотиве TATD, а минорный разрыв - после остатка D37' в мотиве GEQD. Мутации двух этих остатков D делали белок VirD2 неуязвимым для каспазы-3 человека.

Рис. 8. Каспаза-3 человека гидролизует агробактериальный белок VirD2 вблизи С-конца в двух местах, TATD400 и GEQD37'. Специфический ингибитор каспазы-3 Ас-DEVD-CHO препятствует фрагментации VirD2.

Белок VirD2 содержит (His)6 -тэг на N-конце, и оба высокомолекулярных продукта гидролиза связываются с Ni-NTA агарозой. После электорофореза гель окрашен I 7-45 Кумасси.

Теперь вопрос можно было сформулировать так: существует ли в апоптотических клетках растений протеаза, способная гидролизовать белок VirD2 агробактерий по тому же (тем же) сайту, что и каспаза человека (Рис. 9А)? И, если существует, то что представляет собой этот фермент?

5 £

«ШЛШ-З - + +

Ac-DEVD-cho - - +

М-4937-

— TATO ,

geod'

3. Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений

Для того, чтобы найти и исследовать предполагаемую каспазо-подобную протеазу растений, мы сконструировали рекомбинантный репортерный белок-субстрат, состоящий из ОРР и С-концевой области белка У1гЭ2, содержащей двучастный N1,8 и оба сайта расщепления каспазой-3 человека - Рис. 9Б. Белок был назван 0РР-\%02С1 и оказался весьма удобным по нескольким причинам. Во-первых, флуоресценция СРР-модуля позволяла исследовать локализацию этого химерного белка при продукции его в клетках растений. Во-вторых, наличие антител к белку ОРР позволяло обнаруживать наш субстрат в экстрактах растений, продуцирующих этот белок, с помощью иммуноблоттинга. В-третьих, компактный и сильно структурированный ОБР был весьма устойчив к неспецифической А Рис. 9. А: Положение сайтов

VirD2

эндонуклеазныи домен

А:

каспаза-3 человека „

j 447 гидролиза каспазои-3 и

предполагаемых сайтов гидролиза

белке

GEQD ТАТР 11 '

| NLS растительная каспазоподобная протеаза?

репортерный белок GFP-VirD2Ct

GFP

GEQD'0ТАТР39 11

растительном протеазои в VirD2. Б: Репортерный белок GFP-VirD2Ct - универсальный инструмент для исследования фитаслазы. D39 и DIO в репортерном белке соответствуют D400 и D371 в полноразмерном VirD2.

протеолитической деградации, что позволяло использовать данный рекомбинантный белок, выделенный из клеток Е. coli, в качестве субстрата при анализе и фракционировании растительных экстрактов.

3.1. Обнаружение активности фитаспазы in vivo

Итак, если растительный каспазо-подобный фермент существует и обладает специфичностью гидролиза, сходной со специфичностью каспаз животных, то как его обнаружить? Для ответа на этот вопрос мы использовали опыт, полученный при исследовании фрагментации белка ПроТа в процессе апоптоза у животных. При продукции белка GFP-VirD2Ct в клетках растений в отсутствие ПКС следует ожидать, что репортерный белок (и, соответственно, флуоресценция GFP) будет иметь ядерную локализацию, обусловленную наличием NLS в его составе (Рис. 9Б). Если индукция ПКС в клетках растения сопровождается появлением активности каспазо-подобной протеазы, то гидролиз этим ферментом белка-репортера по сайту (сайтам) узнавания каспазы приведет к отщеплению NLS и, как следствие, флуоресценция продукта гидролиза будет распределяться по всей растительной клетке.

Чтобы проверить эту модель, мы продуцировали белок GFP-VirD2Ct в растениях табака Nicotiana tabacum, используя вирусный вектор рЗОВ на основе вируса табачной мозаики (ВТМ). В этой системе ВТМ играл двоякую роль. Во-первых, встраивание кДНК репортерного белка GFP-VirD2Ct в состав инфекционной копии кДНК ВТМ под контролем субгеномного промотора обеспечивало эффективную продукцию целевого белка в зараженных рекомбинантным вирусом клетках табака (наряду с другими вирусными белками). Во-вторых, растения табака определенного генотипа (содержащие Лг-ген) отвечают на заражение ВТМ активацией ПКС, называемой гиперчувствительным ответом (ГО). Смысл этого защитного явления заключается в самоуничтожении зараженных вирусом клеток растения, что препятствует размножению ВТМ и его распространению по всему растению.

В то же время, ВТМ-индуцируемый ГО в клетках табака является температуро-чувствительным. При температуре выше 30°С ГО не развивается, но при снижении температуры до 24°С (перенос растений, зараженных ВТМ и прединкубированных при 30°С для развития вирусной инфекции, на пониженную температуру) происходит включение механизма ГО (ПКС) и синхронизованная гибель инфицированных клеток. Эта экспериментальная система, таким образом, хорошо подходит для исследования локализации белка GFP-VirD2Ct в нормальных условиях (отсутствие ПКС) и в условиях вирус-индуцированной ПКС.

Флуоресцентная микроскопия листьев табака, зараженных рекомбинантным ВТМ (продуцирующим дополнительный рекомбинантный

12

белок СРР-\%020) показала, что в отсутствие ПКС целевой белок (флуоресценция СИР) является исключительно ядерным - Рис. 10. Это обстоятельство свидетельствует о том, что в отсутствие ПКС каспазо-подобная активность в клетках растений не проявляется. Ядерную локализацию имел и продуцируемый в аналогичных условиях контрольный белок У1Ю2С1-ОРР, в котором флуоресцирующий СРР-модуль был

Рис. 10. Репортерный белок ОРР-У1Ю2С1 и контрольный белок Ун02С1-0РР

локализованы в ядрах клеток табака в отсутствие ПКС. Приведены результаты флуоресцентной микроскопии по локализации флуоресценции йРР, ОАР1 (окрашивает ДНК), и наложение двух сигналов.

При индукции ПКС путем перенесения зараженных растений табака, продуцирующих СРР-\Чг02С1, на пониженную температуру инкубации (24°С) происходило быстрое перемещение флуоресценции из ядер зараженных клеток в цитоплазму - Рис. 11, что могло свидетельствовать об утрате рекомбинантным белком ОРР-УЖ2С1 сигнала ядерной локализации. Первые признаки изменения локализации белка наблюдались уже спустя 1 час после индукции ГО, а спустя 4 часа это явление уже носило массовый характер. Следует отметить, что первые признаки ПКС у растений обычно проявляются спустя 5 и более часов после индукции апоптоза. Следовательно, изменение локализации репортерного белка было вызвано очень ранним событием в процессе осуществления ПКС.

У1гР20-6РР СРР-УГО20: свободный вРР

Ч . ц /^аш ответ клетках табака

ДЯМЗШ¡^^ЙЕ^^^И ж^ъшЯ сопровождается быстрым выходом

белка

(ННбвНИЁР^^КЧВЯН^'^в^^Э^^* время- прошедшее после индукции

Существенно, что при использовании растений табака пп генотипа (отсутствует N ген и ВТМ распространяется системно, не вызывая ГО) белок СРР-У1г02С1 сохранял ядерную локализацию при смене температуры инкубации зараженных растений с 33°С на 24°С. Это обстоятельство указывало на возможную связь изменения локализации белка-репортера и

присоединен к С-концу У1гЭ2СЧ.

У1гР2Р-6РР СРР-УГОга свободный йРР

н ив

■ ^^ТНИ г -А,

1 И&яЙЯ*? л

индукции ПКС в клетках листьев табака. Важно также, что контрольный белок VirD2Ct-GFP, в котором гидролиз каспазой-3 не отщепляет NLS от флуоресцентного GFP-модуля, сохранял свою ядерную локализацию и в процессе ПКС в растениях табака NN генотипа (Рис. 11). Этот результат свидетельствовал о том, что изменение локализации репортерного белка GFP-VirD2Ct в ответ на индукцию ПКС не связано с общим нарушением ядерно-цитоплазматического транспорта, которое могло бы произойти в результате изменения температуры инкубации растений или индукции ПКС. Поэтому мы расценили перемещение белка GFP-VirD2Ct из ядра в цитоплазму в процессе ПКС как возможное подтверждение нашего предположения об отщеплении NLS от репортерного белка.

Для дальнейшей проверки этой гипотезы мы сконструировали набор мутантов белка GFP-VirD2Ct, содержащих точечные замены аминокислотного остатка D в местах расщепления VirD2 каспазой-3 человека. В белке GFP-VirD2Ct D39A был мутирован основной сайт расщепления каспазой, в белке GFP-VirD2Ct DI OA - минорный сайт, а в белке GFP-VirD2Ct D10,39A - оба сайта. Указанные белки продуцировали в растениях табака (Самсун NN) по описанной выше схеме и исследовали их внутриклеточную локализацию до и после ВТМ-индуцированного ГО. В отсутствие ПКС все три мутантных белка были исключительно ядерными, однако после индукции ГО одиночные мутанты D10A и D39A, подобно белку дикого типа, утрачивали ядерную локализацию - Рис. 12. И лишь двойной мутант D10,39A, устойчивый к гидролизу каспазой-3, свою исключительно ядерную локализацию сохранял, несмотря на индукцию ПКС.

D39A D10A D39,10A Рис. 12. Мутации, делающие белок GFP-

VirD2Ct устойчивым к гидролизу каспазой-3, предотвращают выход белка из ядра клеток табака при ПКС. Флуоресцентная микроскопия листьев табака, продуцирующих

соответствующие белки, после индукции ГО.

Этот результат указывал на то, что, вероятно, белок GFP-VirD2Ct in vivo фрагментируется растительной протеазой, активирующейся при индукции ПКС, по тем же сайтам, по которым происходило расщепление этого белка каспазой-3 in vitro. Анализ экстрактов листьев табака, продуцирующих соответствующие рекомбинантные белки, с помощью иммуноблоттинга с использованием антител к GFP-модулю подтвердил это предположение. Как видно из Рис. 13, белок GFP-VirD2Ct дикого типа присутствовал в зараженных ВТМ клетках листьев табака в интактной форме до момента индукции ГО (т.е. при 33°С). Однако понижение температуры до 24°С, приводящее к индукции ПКС, сопровождалось гидролизом

исследуемого белка по двум рядом расположенным сайтам. В мутанте 039А отсутствовало расщепление по одному из них, а в мутанте ЭЮА отсутствовал гидролиз по второму сайту. В свою очередь, двойной мутант 010,39А был полностью устойчив к протеолизу (Рис. 13, трек 8).

-а* Рис. 13. В апоптотических клетках табака происходит гидролиз белка ОРР-\%ШО по двум местам (указаны стрелками) в соответствии со специфичностью каспазы-3 человека. 33°С - нет ПКС; 24°С - ВТМ-- индуцированная ПКС. Приведен иммуноблот экстрактов с антителами к --' и-с' ' ---- ОРР.

Полученные результаты полностью соответствовали модели, согласно которой при индукции ПКС в клетках табака появляется активность протеазы(-аз), по своей специфичности соответствующей каспазе-3 человека. Гидролиз рекомбинантного белка СРР-УпТОО дикого типа по любому из сайтов, ТАТЕ)19 или ОЕСЮ10, приводит к отщеплению и вызывает ре-локализацию флуоресцентного продукта гидролиза из ядра в цитоплазму. Одиночные мутации 1339А или ОЮА не способны предотвратить отщепление ЫЬБ, в то время как двойной мутант Э10,39А растительным ферментом не гидролизуется и поэтому сохраняет свою ядерную локализацию.

3.2. Фитаспаза: ингибиторы и субстраты

Мы выделили обнаруженный растительный фермент, названный фитаспазой, из листьев табака, используя способность этой протеазы фрагментировать рекомбинантный белок GFP-VirD2Ct (см. описание стадий выделения фитаспазы в разделе 4.1.). Обнаружилось, что in vitro фитаспаза вносит одиночный разрыв в молекулу GFP-VirD2Ct дикого типа - в сайте TATD39 (Рис. 14). Локализация места расщепления была подтверждена как с использованием мутанта D39A - он был устойчив к гидролизу выделенным ферментом (Рис. 14, трек 4), так и масс-спектрометрическим анализом триптических пептидов продукта расщепления.

GKP-VirD2Ct wt D39A

каспаза-3 - + - -

фитаспаза - + +

49-

37- - -

26-

Рис, 14. Фитаспаза вносит уникальный разрыв в молекулу белка ОРР-У№2а в сайте ТАТО. Образующийся продукт (трек 3) указан стрелкой. Мутант 039А устойчив к гидролизу. Результаты электрофоретического анализа продуктов гидролиза. Гель окрашен Кумасси.

Таким образом, вопреки нашим первоначальным ожиданиям, фитаспаза способна гидролизовать белок-субстрат только по основному месту расщепления каспазой-3 человека - сайту TATD39, но не по минорному месту (сайт GEQD10). Из этого следует, что в апоптотических клетках растений должна существовать еще одна каспазо-подобная протеаза, гидролизующая белок GFP-VirD2Ct в области GEQD и ответственная за перелокализацию мутанта D39A in vivo. Однако описание этого второго фермента выходит за рамки настоящей диссертационной работы.

Было очень желательно иметь специфичный ингибитор фитаспазы. Такое соединение могло бы оказаться весьма полезным как для аффинной очистки фермента, так и для выяснения роли фитаспазы в процессе ПКС у растений. Мы предположили, что раз фитаспаза гидролизует белок VirD2 по сайту TATD, то синтетический пептид-альдегид TATD-CHO, включающий как сайт узнавания, так и химически активную группу в составе D, может оказаться ингибитором фитаспазы. Если фитаспаза является Cys- или Ser-зависимой протеазой, то при связывании этого соединения ферментом альдегидная группа (заменяющая альфа-карбоксил аспартата) будет способна ковалентно присоединяться к каталитическому аминокислотному остатку и инактивировать фермент. Поэтому такое соединение, Bio-TATD-CHO (где Bio - биотин, присоединенный к N-концу пептида для удобства выделения комплекса фитаспаза-ингибитор), было синтезировано и использовано для оценки его способности ингибировать расщепление белка GFP-VirD2Ct фитаспазой in vitro. В качестве контроля использовали Bio-DEVD-CHO -ингибитор каспазы-3 человека, основанный на аналогичном принципе.

Как следует из Рис. 15, Bio-TATD-CHO действительно оказался ингибитором фитаспазы. О специфичности его действия говорит тот факт, что контрольный пептид-альдегид Bio-DEVD-CHO на активность фитаспазы никак не влиял. Вместе с тем, оба пептид-альдегида были способны ингибировать гидролиз белка-субстрата каспазой-3. Таким образом, мы пришли к заключению, что фитаспаза растений и каспаза человека имеют сходные (частично перекрывающиеся), но не идентичные участки узнавания.

^ л» ^

Рис. 15. Пептид-альдегид Bio-TATD-CHO ингибирует фитаспазу, a Bio-DEVD-CHO -нет. Протеолитическая активность фитаспазы оценена по способности фрагментировать белок-субстрат GFP-VirD2Ct.

Для дальнейшего сравнения специфичности гидролиза фитаспазы табака и каспазы-3 человека мы использовали белок ПроТа человека. Этот белок богат остатками дикарбоновых аминокислот и остатками D, в

СГ СГ СГ

/ =/ # $ & / + фитаспаза

6FP-_ V¡rD2Ct

частности. Каспаза-3 человека, как описано выше, имеет одно основное место расщепления в молекуле ПроТа (DDVDW) и несколько минорных мест гидролиза (AAVD и NGRD31). Мы сравнили способность фитаспазы и каспазы-3 гидролизовать ПроТа in vitro.

Из Рис. 16 следует, что, несмотря на обилие остатков D в потенциальном субстрате, фитаспаза не вносит в молекулу ПроТа ни одного разрыва. Таким образом, как в отношении ПроТа, так и в отношении белка агробактерий VirD2 фитаспаза проявляет гораздо большую избирательность в отношении мест расщепления, чем каспаза-3.

Рис. 16. Фитаспаза, в отличие от каспазы-3, не способна гидролизовать ПроТа. Слева указаны места гидролиза ПроТа каспазой-3.

ПроТа \

си» \ DDVD__

AAVD6, СЮ DDVD

NGRD3'. 99 "" DDVD

Для сравнения специфичности фитаспазы со специфичностями других каспаз животных мы использовали наборы синтетических три- и тетрапептидных ингибиторов и флуорогенных субстратов каспаз. Пептидный компонент этих соединений содержал предпочитаемый определенной каспазой аминокислотный мотив: YVAD - каспаза-1; VDVAD - каспаза-2; DEVD - каспазы -3 и -7; WEHD - каспаза-5; VEID - каспаза-6; 1ETD -каспаза-8; LEHD - каспаза-9; VAD - ингибитор/субстрат разнообразных каспаз. На С-конце пептидов в случае ингибиторов находилась альдегидная группа, а в случае субстратов - флуорогенная группа AFC. При отщеплении AFC от С-концевого остатка D регистрируется флуоресценция в области -500 нм, интенсивность которой пропорциональна степени гидролиза субстрата.

Результаты анализа способности ингибиторов каспаз предотвращать фрагментацию белка GFP-VirD2Ct фитаспазой приведены на Рис. 17. Как видно, большинство ингибиторов каспаз в концентрации 100 мкМ ингибирует фитаспазу. Ингибирование фитаспазы этими соединениями было обратимым, что проявлялось в реактивации фермента после удаления избытка свободного ингибитора. Степень ингибирования различалась для разных соединений, что более наглядно проявлялось при использовании более низких концентраций ингибиторов. Наибольшим ингибирующим действием обладал Ac-VEID-CHO, и только Ac-DEVD-CHO был, как и раньше, совершенно неактивен.

фитаспаза табака +100 рМ ингибитора

Рис. 17. Пептид-альдегидные ингибиторы каспаз, за исключением производного ОЕУО, в разной степени ингибируют способность

фитаспазы табака гидролизовать

белок GFP-VirD2Ct in vitro.

продукт гидролиза

Комплементарные результаты были получены при изучении способности фитаспазы гидролизовать соответствующие флуорогенные пептидные субстраты каспаз - Рис. 18. Оптимальным субстратом оказался Ас-УЕЮ-АРС, хотя сравнимая (в 2-4 раза меньшая) скорость гидролиза наблюдалась в случае производных УАО, УУАГХ \ZDVAD, 1ЕТО, ЬЕНБ. Как и ожидалось, Ас-ОЕУО-АРС не гидролизовался фитаспазой вовсе.

Поскольку в проводимом анализе мы также использовали пептидный ингибитор и субстрат фитаспазы, созданные на основе мотива узнавания фитаспазой в белке УЮ2 (Вю-ТАТБ-СНО и Ас-БТАТО-АРС), это позволило нам сделать еще одно интересное наблюдение. В то время, как белковый субстрат, содержащий аминокислотный мотив ТАТЭ, очень эффективно расщеплялся фитаспазой, на пептидном уровне соответствующие субстрат и ингибитор оказались далеко не самыми лучшими (примерно в 10 раз уступая лидеру, УЕГО). По-видимому, существуют дополнительные факторы и взаимодействия, обеспечивающие эффективную фрагментацию белка \%02 фитаспазой.

Обнаруженные при исследовании фитаспазы табака закономерности в узнавании пептидных ингибиторов и субстратов каспаз были затем подтверждены и для выделенной нами фитаспазы риса. И в случае фермента риса УЕГО был предпочтительным аминокислотным мотивом, ОЕУБ не опознавался вовсе, а другие пептиды занимали промежуточные положения в иерархии. Таким образом, фитаспазы, даже выделенные из эволюционно отдаленных растительных организмов, обладают сходной субстратной специфичностью, что подразумевает наличие общих структурных элементов у ферментов этой группы.

35

Я зо

Рис. 18. Фитаспаза гидролизует флуорогенные пептидные

субстраты каспаз, за исключением производного ОЕУО.

пептидные

Таким образом, важную роль в способности фитаспаз гидролизовать субстраты играют аминокислотные остатки в положении Р2-Р4, которые, тем не менее, могут варьировать в определенных пределах. Однако фитаспазы проявляют абсолютную специфичность к остатку О как месту гидролиза пептидной связи. Это заключение следует как из анализа мест расщепления в белках-субстратах (и устойчивости мутантных форм), так и из неспособности фитаспазы гидролизовать флуорогенные субстраты, в которых АРС-группа присоединена к другой (нежели О) С-концевой аминокислоте: Е, О, У, Я, в. Показателен пример сравнения в качестве субстратов фитаспазы Ас-УАО-АБС и специально синтезированного для этой цели Ас-УАЕ-АРС. Как видно из Рис. 19, замена одного остатка дикарбоновой аминокислоты на другой полностью предотвратила гидролиз флуорогенного пептида Ас-УАЕ-АРС фитаспазой.

Рис. 19. Гидролиз флуорогенных пептидов Ас-УАЭ-АРС и Ас-УАЕ-АРС (50 мкМ) фитаспазой табака.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213 14 15

время, ч

Способность фитаспаз из разных растительных организмов гидролизовать разнообразные пептидные субстраты каспаз может создать иллюзию относительно низкой избирательности растительного фермента. Однако такое заключение, по-видимому, ошибочно, учитывая то обстоятельство, что на уровне белковых субстратов по своей избирательности фитаспаза превосходит каспазу-3 человека. Фитаспаза, несомненно, является «процессирующим», а не «переваривающим» протеолитическим ферментом. Впрочем, это утверждение относится и к каспазам животных.

Фитаспаза с ее широким спектром гидролизуемых пептидных субстратов каспаз одна способна объяснить почти все многообразие каспазо-подобных активностей, обнаруживаемых при ПКС растений с использованием таких субстратов. Поэтому, вероятно, количество разнообразных каспазо-подобных ферментов у растений не так удручающе велико, как принято считать. Есть, правда, одно исключение. Фитаспаза не обладает ОЕУОазной активностью, которая довольно часто выявляется при

ПКС у растений. Следует ожидать поэтому, что, по крайней мере, еще одна каспазо-подобная протеаза растений до сих пор не открыта.

5.5. Фитаспаза - функциональный аналог каспаз животных

Предшествующий анализ показал, что фитаспаза обладает каспазо-подобной протеолигической активностью, проявляющейся в клетках табака при индукции ГО, вызванного заражением ВТМ. Этого, однако, недостаточно для того, чтобы сделать заключение об участии фитаспазы в осуществлении ПКС. Но теперь у нас появился инструмент для ответа на вопрос о роли фитаспазы в ПКС у растений. Если фитаспаза важна, то добавление ее ингибитора Вю-ТАТЭ-СНО к умирающим клеткам должно противодействовать осуществлению ПКС. В то же время, контрольный пептид-альдегид Вю-ОЕ\Т)-СНО, не способный ингибировать фитаспазу, не должен оказывать влияния на ПКС.

Листья табака генотипа NN инокулировали ВТМ в буферном растворе, не содержащем добавок, либо содержащем 1 мМ Вю-ТАТБ-СНО или Вю-ЭЕУО-СНО. Растения инкубировали при 24°С, что приводило к развитию ГО, выражающемуся в появлении областей мертвых клеток - «некрозов» - Рис. 20. Спустя 42 часа после инокуляции некрозы отчетливо детектировались на половине листа, зараженной вирусом без добавок, но отсутствовали в половине листа, инокулированного ВТМ в присутствии Вю-ТАТО-СНО (Рис. 20А). Еще 10 часов спустя некрозы начали появляться и в этом образце (ВТМ+ТАТО-СНО), но их размер был существенно меньше, чем в контроле (ВТМ). В то же время, развитие ПКС в половине листа, содержащего Вю-ОЕУО-СНО, не отличалось от контроля (Рис. 20Б), что указывало на специфичность действия ингибитора фитаспазы Вю-ТАТБ-СНО. А Б

ВТМ ВТМ + ТАТО-СНО ВТМ ВТМ + ОЕУЭ-СНО

Рис. 20. Ингибитор фитаспазы Вю-ТАТВ-СНО специфично подавляет ПКС в листьях табака ИИ, вызванную заражением ВТМ. Ьр1 - часы после инокуляции листьев вирусом.

Чтобы подтвердить, что ингибирование фитаспазы препятствует развитию ПКС, в каждом из описанных выше образцов с помощью ОТ-ПЦР оценили уровень экспрессии гена к$г20Ы - раннего молекулярного маркера ГО. Экспрессия этого гена возрастала после заражения вирусом в контрольном образце, не содержащем добавок, но была подавлена в образце, содержащем ингибитор фитаспазы Вю-ТАТО-СНО. Образец, содержавший

20

Bio-DEVD-CHO, не отличался от контроля. Следует заметить, что на поздних стадиях вирусной инфекции разница между образцами исчезала.

Таким образом, мы пришли к заключению, что хотя ингибитор фитаспазы и не предотвращает ПКС полностью (следует иметь в виду, что пептид-альдегиды являются обратимыми ингибиторами фитаспазы), он, тем не менее, существенно и специфично подавляет осуществление клеточной смерти. Этот результат указывает на важную роль фитаспазы в осуществлении ПКС.

Теперь мы можем оценить, является ли фитаспаза функциональным аналогом каспаз животных. Чтобы соответствовать этому определению, растительный фермент должен, на наш взгляд, удовлетворять следующим требованиям: 1) быть высокоизбирательной протеазой; 2) его субстратная специфичность должна быть сходна со специфичностью каспаз; 3) фермент должен активироваться в клетках растений при индукции ПКС; 4) специфический ингибитор этого фермента должен подавлять ПКС. Как видно из данных, представленных в разделах 3.1.-3.3., фитаспаза соответствует всем перечисленным критериям.

3.4. Механическое повреждение растительной ткани приводит к появлению активности фитаспазы

Наши данные об отсутствии активности фитаспазы в здоровых клетках растений и о фрагментации фитаспазой и pe-локализации белка GFP-VirD2Ct из ядра в цитоплазму /и vivo в процессе вирус-индуцированной ПКС допускали простую интерпретацию. Можно было думать, что при ПКС фитаспаза переходит из неактивного состояния в активное, например, путем процессинга профермента, как это происходит у животных в случае каспаз и многих других протеолитических ферментов. Или же активность фитаспазы в норме маскирована (например, взаимодействием с белком-ингибитором), но демаскируется при ПКС. Поэтому мы ожидали, что уровень фитаспазной активности в экстрактах, полученных из апоптотических листьев растений, будет значительно превышать уровень ферментативной активности в экстрактах здоровых листьев.

Для проверки этого предположения мы получили экстракты из здоровых и зараженных ВТМ листьев табака Самсун генотипов NN и пп. В этом наборе апоптотическим был только образец, полученный из зараженных ВТМ растений генотипа NN. В остальных случаях (растения с генотипом пп независимо от вирусной инфекции и растения с генотипом NN в отсутствие вируса) симптомы ПКС должны были отсутствовать и действительно не наблюдались. В экстракт добавляли стандартные ингибиторы протеаз различных классов, которые, как мы показали раньше, не ингибируют фитаспазу. Это позволило снизить неспецифическую деградацию белка-

субстрата GFP-VirD2Ct до приемлемого уровня, позволявшего детектировать образование продукта гидролиза фитаспазой.

Полученные результаты нас удивили. Оказалось, что отчетливая

фитаспазная активность, выявляемая во всех экстрактах, примерно одинакова

и не зависит от того, была или не была индуцирована ПКС в листьях табака -

Рис. 21. Мы подтвердили, что детектируемое расщепление белка-субстрата

действительно осуществляется фитаспазой по сайту TATD39, поскольку

мутант GFP-VirD2Ct D39A при инкубации с экстрактом не давал целевого

продукта, а активность фермента, гидролизующего белок GFP-VirD2Ct

дикого типа, подавлялась ингибитором фитаспазы Bio-TATD-CHO. + экстракт табака

I NN NN+TMV пп nn+TMVS

¡Я ^ ^ ,-fi-ï Î-П-F Й

i wmwmwmwmQ

щ^т mm *** mm Ш0

тф »»* mt «f# <Ш «*» «*»

На основании этих экспериментов мы предположили, что фермент способен очень быстро (за время получения экстракта) претерпевать процессинг или демаскироваться. Правильное объяснение, заключающееся в том, что фитаспаза в норме секретируется из растительной клетки и получает доступ к внутриклеточным белкам только при индукции ПКС (см. раздел 4) или при разрушении ткани, возникло позже, после идентификации фитаспазы и выяснения структурных особенностей и локализации этого фермента.

Как бы то ни было, присутствие активной фитаспазы в растительных экстрактах независимо от ПКС имело свои достоинства и недостатки. К недостаткам следует отнести то обстоятельство, что измеренная активность фитаспазы в экстрактах не отражает уровень активности фермента в растительных клетках, из которых эти экстракты были получены. Достоинство же заключалось в том, что для проявления своей ферментативной активности фитаспаза не нуждается ни в вирусном, ни в любом другом ПКС-зависимом компоненте. Поэтому активность фитаспазы можно детектировать в экстрактах тканей различных растений, даже не имея представления о том, что является истинным активатором фермента in planta.

Мы воспользовались этим обстоятельством для того, чтобы обнаружить присутствие активности фитаспазы в широком круге здоровых растительных организмов: томатах, картофеле, бентамиане, подорожнике, рисе, пшенице, кофе и т.д. О наличии искомой протеолитической активности мы судили по фрагментации рекомбинантного белка GFP-VirD2Ct в экстракте листьев, приводящей к образованию продукта гидролиза характерной длины. В качестве дополнительных аргументов выступали чувствительность расщепления к ингибитору фитаспазы Bio-TATD-CHO,

22

Рис. 21. Уровень активности фитаспазы в экстрактах листьев табака высок вне зависимости от того, была индуцирована ПКС {Ж+ТМУ) или нет. В качестве субстрата использован ОТР-У1г02СЧ дикого типа (уу) или устойчивый к фигаспазе мутант 039А (ш). Гель окрашен Кумасси.

нечувствительность к Bio-DEVD-CHO, и отсутствие специфической фрагментации при использовании мутанта GFP-VirD2Ct D39A в качестве субстрата.

В результате проведенного анализа мы пришли к заключению, что фитаспаза имеется у самых разных растений, включая двудольные и однодольные. Оставалось выяснить, что представляет собой этот новый протеолитический фермент растений с такой уникальной специфичностью и функцией.

4. Фитаспаза: структурно-функциональное исследование

Для идентификации фитаспазы как белка мы выбрали фитаспазу табака N. tabacum и риса Oryza sativa. Наш выбор объяснялся тем, что N. tabacum и его близкий родственник Nicotiana benthamiana представляют собой исключительно удобную модельную систему для дальнейшего изучения свойств фитаспазы. На рис наш выбор пал, поскольку для этого растения расшифрован геном и потому, что фитаспаза риса по субстратной специфичности весьма близка к фитаспазе табака. В то же время, рис (однодольное растение) эволюционно далек от табака (двудольное), и сравнение аминокислотных последовательностей фитаспаз этих двух организмов могло позволить выявить характерные черты, обеспечивающие уникальную субстратную специфичность фитаспаз.

4.1. Выделение и идентификация фитаспаз табака и риса

Фитаспазы табака и риса выделяли из экстрактов здоровых листьев, поскольку, как отмечено выше, в экстрактах фитаспаза присутствует в активном состоянии. Для выделения целевого белка использовали несколько последовательных хроматографических фракционирований белков растительного экстракта. Отдельные стадии выделения включали в себя сульфат аммонийное фракционирование, хроматографию на DEAE-целлюлозе и В1ие-агарозе. Для детекции активности фитаспазы во фракциях использовали способность фитаспазы специфично гидролизовать рекомбинантный белок GFP-VirD2Ct.

В результате этих стадий фракционирования нам удалось достичь более 1000-кратной очистки целевого белка, но полученный препарат фермента все еще содержал целый набор белков. Поэтому на заключительной стадии для получения фитаспазы в виде индивидуального белка мы использовали аффинную хроматографию. Активность фитаспазы (как табака, так и риса) подавляется ингибитором Bio-TATD-CHO, что подразумевает, что альдегидная группа ингибитора модифицирует остаток Cys или Ser в активном центре фермента и ингибитор оказывается ковалентно (но обратимо) присоединен к фитаспазе. Такой предобразованный комплекс фитаспаза-биотинилированный ингибитор мы

23

отделяли от прочих сопутствующих белков с помощью хроматографии на авидин-агарозе. Элюцию фитаспазы в комплексе с ингибитором с сорбента осуществляли раствором биотина, после чего активность фермента восстанавливалась за счет обратимости присоединения ингибитора. Определение активности фитаспазы в элюате с аффинного сорбента подтвердило, что нам удалось выделить интересующий нас фермент.

В качестве контроля использовали прединкубацию препарата фитаспазы с Bio-DEVD-CHO (который, как показано выше, не является ингибитором фитаспазы), с последующей хроматографией на авидин-агарозе. Элюированные белки фракционировали электрофорезом в ДСН-содержащем полиакриламидном геле.

Как видно из Рис. 22, в полученных в результате фракционирований препаратах фитаспазы табака и риса, обладающих специфической активностью фитаспазы, присутствует единственный мажорный белок с молекулярной массой ~80 кДа. Соответствующая полоса отсутствовала, если вместо Bio-TATD-CHO для аффинной очистки использовали Bio-DEVD-CHO или растворитель. Следует отметить, что оценка молекулярной массы протеолитически активной фитаспазы, проведенная с помощью гель-фильтрации, вполне согласовывалась с электрофоретическими данными, что означает, что фитаспаза присутствует в растворе в виде мономера.

Рис. 22. Фитаспазы табака и риса, выделенные в индивидуальном состоянии с помощью аффинной хроматографии, имеют MW 80кДа. Трек "bio-TATD-CHO" - препарат фермента был прединкубирован с ингибитором фитаспазы Bio-TATD-CHO перед аффинной

хроматографией. В элюате с сорбента содержится единственный белок. Трек "bio-DEVD-CHO" -препарат фермента был прединкубирован с Bio-DEVD-CHO перед аффинной хроматографией.

табак

Масс-спектрометрический анализ триптических пептидов полученных белков (как общий профиль m/z пептидов, так секвенирование некоторых из них) показал, что фитаспаза как табака, так и риса демонстрирует необычайное сходство с субтилизин-подобными протеазами, которыми фитаспазы, по-видимому, и являются. Несмотря на то, что каждый вид растений содержит примерно 60 генов субтилизин-подобных протеаз, масс-

^ О г\

" i5 Р

j2J

/ ff

i? -s s

/

116- * —

66- 3 —

/

i g м

116-

66-

£ $ У ä

s £

# £

■4 s

4535-

4535-

25-

25-

рис

спектрометрические данные позволили нам идентифицировать ранее ^охарактеризованный ген (и кДНК) фитаспазы риса в полностью секвенированном геноме риса (GI 32977156). С фитаспазой табака дело обстояло сложнее, т.к. геном этого организма не секвенирован. Однако в базе данных EST, содержащей данные о случайным образом секвенированных мРНК N. tabacum, нам удалось обнаружить нуклеотидную последовательность (GI 76871138), которая могла соответствовать центральной части фитаспазы табака. Это позволило, получив суммарную кДНК табака и используя RACE-ПЦР, амплифицировать недостающие 5'- и 3'-концевые участки мРНК фитаспазы табака и, таким образом, получить полную кДНК этого фермента (GQ249168) и определить его полную аминокислотную последовательность.

Сравнение аминокислотных последовательностей фитаспаз табака и риса показало, что эти два белка очень похожи друг на друга (степень идентичности 53%), на субтилизин-подобные протеазы (субтилазы) в целом и на субтилизин-подобные протеазы растений (подсемейство S8A -пиролизин-подобные субтилазы), в частности. Фитаспазы содержат характерную для субтилаз триаду каталитических остатков D149, Н220 и S537 (нумерация дана по аминокислотной последовательности фитаспазы табака), расположенных в требуемой очередности и фланкированных консервативными аминокислотными последовательностями. В структуре фитаспаз выявляются три характерные для субтилаз области - Рис. 23. На самом N-конце расположена короткая гидрофобная область (аминокислотные остатки 1-24), которая часто является сигнальным (лидерным) пептидом, направляющим белок в эндоплазматический ретикулум и на последующую секрецию из клетки. Следом идет продомен (аминокислотные остатки 25-117), и затем - собственно протеазный домен, содержащий дополнительную С-концевую область, характерную для субтилаз растений (аминокислотные остатки 118-763). Продомен субтилаз служит для правильного сворачивания протеазного домена и для ингибирования фермента до тех пор, пока продомен не будет отщеплен.

;25

MANCn-LYFLFLAILLTLNPflMAlQSETY... I I117) Саит процессинга

[537] Ser

[1-24] Сигнальный

пептид [118-598] Протеазный домен ПрофиТЭСПЭЗа

Рис. 23. Схема, иллюстрирующая структуру профитаспаз табака и риса. Нумерация и приведенные аминокислотные последовательности даны для фитаспазы табака. Красным цветом выделены каталитические аминокислотные остатки, стрелками указаны места процессинга профитаспазы.

Таким образом, имелись все основания полагать, что фитаспазы являются субтилизин-подобными протеазами и что они синтезируются в виде белка-предшественника, который затем подвергается процессингу. И хотя мы с самого начала предполагали, что каспазо-подобные (в функциональном смысле) протеазы растений будут структурно отличаться от каспаз животных (в противном случае фитаспазы давно идентифицировали бы по гомологии), мы не ожидали, что различие будет столь значительным. Действительно, субтилизин-подобные протеазы структурно очень сильно отличаются от каспаз. Субтилазы являются Бег-зависимыми протеазами, в то время как каспазы - Сув-зависимые. Активная каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших и двух малых субъединиц, в то время как фитаспаза является мономером. Наличие потенциального сигнального пептида в белке-предшественнике фитаспаз могло указывать на внеклеточную локализацию фермента, а каспазы являются внутриклеточными белками. Поэтому следовало убедиться в том, что мы правильно понимаем, как устроена фитаспаза, и затем выяснить, каким образом фитаспаза может играть роль каспаз при ПКС растений.

4.2. Процессию белка-предшественника фитаспазы

Действительно ли фитаспаза синтезируется в виде белка-предшественника, который затем претерпевает процессинг, заключающийся в отщеплении продомена? Косвенно в пользу этого обстоятельства говорил тот факт, что многочисленные пептиды, идентифицированные масс-спектрометрически в зрелых протеолитически активных фитаспазах как табака, так и риса, ложатся в область протеазного домена, и ни один из идентифицированных пептидов не попадает в область продомена. Для того, чтобы получить прямой ответ на поставленный вопрос, была определена "N1-концевая аминокислотная последовательность активной фитаспазы, выделенной из листьев табака. Полученная последовательность имела вид ТТНТ8(}РЬ..., что означало, что зрелый фермент не содержит ни ТЧ-концевого гидрофобного пептида, ни продомена, а его аминокислотная последовательность начинается непосредственно с протеазного домена - с остатка Т118 - Рис. 23. Следует отметить, что мотив ТТНТ - это характерная аминокислотная последовательность места отщепления продомена у субтилаз растений.

Следующий существенный вопрос: действительно ли фитаспаза является Бег-зависимой протеазой? Поскольку фитаспазы демонстрируют значительное сходство с субтилизин-подобными (Бег-зависимыми) протеазами, мы идентифицировали предполагаемый каталитический остаток 8ег537 в фитаспазе табака с помощью множественного выравнивания последовательностей субтилаз (соответствует Бег535 в фитаспазе риса). Затем мы сконструировали точечного мутанта фитаспазы табака 8537А,

26

содержащего единственную аминокислотную замену предсказанного остатка Ser на Ala, и сравнили свойства этого мутанта со свойствами фитаспазы дикого типа. В качестве контроля параллельно также мутировали близлежащий к Ser537 остаток Cys540 (достаточно консервативный у субтилаз растений).

Для получения рекомбинантных форм фитаспазы мы продуцировали целевые белки в растениях N. benthamiana, т.е. в гомологичной (растительной) системе. Используемый подход имел то преимущество, что позволял осуществить правильное сворачивание и пост-трансляционную модификацию исследуемого фермента. Для выделения целевого белка из экстракта растительных тканей мы присоединили к С-концу белка-предшественника фитаспазы тэг - белок глутатион-Б-трансферазу. Полученные кДНК (содержащие полную ОРТ профитаспазы) были встроены в бинарный вектор под контролем сильного конститутивного промотора 35S, что должно было обеспечить их эффективную транзиентную экспрессию в растительных клетках. Полученными плазмидами трансформировали агробактерии A. tumefaciens и инфильтрировали листья растений N. benthamiana суспензией полученных агробактерии. Спустя 3 суток из экстрактов инфильтрированных листьев выделили рекомбинантные белки с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе и исследовали их протеолитическую активность по способности специфически фрагментировать белок-субстрат фитаспазы GFP-VirD2Ct.

Первое существенное заключение, которое мы сделали: рекомбинантная фитаспаза дикого типа обладала активностью и такой же специфичностью при расщеплении белка-субстрата, как и нативная (не рекомбинантная) фитаспаза табака - Рис. 24. Продукт гидролиза субстрата имел характерную длину, ингибитор фитаспазы Bio-TATD-CHO подавлял фрагментацию субстрата, а мутантный субстрат, содержавший аминокислотную замену D39A в мотиве TATD, не гидролизовался ни нативной, ни рекомбинантной фитаспазой. Таким образом, идентификация фитаспазы табака и ее кДНК были осуществлены правильно.

Рис. 24. Рекомбинантная фитаспаза обладает протешштической

активностью и субстратной специфичностью нативного фермента. В качестве субстрата использован белок GFP-VirD2Cí или его мутант D39A, устойчивый к гидролизу фитаспазой. Гель окрашен Кумасси.

GFP-VirD2Ct wi D39A muí

нативная рекомб.

Q Q

о £ о ^ /

$ & 8 i > л. ¿. К

<5 /3" л? £

4535-

Второй принципиальный результат этого эксперимента заключался в том, что мутант фитаспазы 8537А, в соответствии со сделанным предсказанием, полиостью утратил протеолитическую активность - Рис. 25. В то же время, контрольный мутантный белок, С540А, в значительной степени сохранил способность фрагментировать белок-субстрат ОРР-\%02С1. На этом основании мы сделали заключение, что фитаспаза

Рис. 25. Мутация 8ег537 полностью инактивирует фитаспазу. Рекомбинантные ферменты получены в виде фитаспаза-08Т; 1 и 0,2 обозначают относительные количества рекомбинантного белка.

У субтилаз отщепление продомена в процессе образования зрелого фермента часто происходит автокаталитически. Поэтому следующий вопрос заключался в том, зависит ли отщепление продомена фитаспазы от ее собственной протеолитической активности. Возможность задать такой вопрос у нас уже появилась, поскольку мутант фитаспазы S537A протеолитической активностью не обладал. Для удобства работы мы заменили С-концевой тэг в составе рекомбинантного белка с GST на GFP, продуцировали фитаспазу дикого типа и мутанта S537A в листьях N. benthamiana и исследовали размеры синтезированных белков, содержащихся в экстрактах, с помощью иммуноблоттинга с использованием антител к GFP.

Результаты, представленные на Рис. 26, показывают, что фитаспаза дикого типа (соединенная с GFP) детектировалась в виде двух полос, верхняя из которых предположительно соответствовала белку-предшественнику с неотщепленным продоменом, а нижняя - зрелому ферменту, не содержащему продомена. Справедливость этих предположений была подтверждена с помощью N-концевого секвснирования обеих форм фитаспазы дикого типа. Фермент из верхней полосы имел N-концевую последовательность 23QSETYV1FIM, т.е. не содержал предполагаемого сигнального пептида (аминокислотные остатки 1-24), но содержал продомен - см. Рис. 23 с аминокислотными последовательностями стыков доменов. Фермент из нижней полосы имел N-концевую последовательность usTTHTSQFL, т.е. не содержал ни сигнального пептида, ни продомена, и был, таким образом, полностью процессированным.

Существенно, что протеолитически неактивный мутант фитаспазы S537A детектировался в виде единственной полосы, совпадающей гю электрофоретической подвижности с непроцессированной формой фитаспазы - Рис. 26. И действительно, мутант имел N-концевую

действительно является Ser-зависимой протеазой,

/ / / / / /

45

5 6 7 8 9 10

/

рекомбинантные формы фитаспазы

. GFP-Vir02Q . продукт гидролиза

последовательность 25QSETYVIHM, т.е. отщепление продомена в мутантном

Рис. 26. Процессинг фитаспазы происходит автокаталитически. Фермент дикого типа (WT) и мутант S537A продуцированы с тэгом EGFP и выявлены с помощью иммуноблота с антителами к GFP.

На этом основании мы пришли к заключению, что отщепление продомена фитаспазой происходит автокаталитически - за счет собственной протеолитической активности фермента. По-видимому, процессинг белка-предшественника происходит только in eis, т.е. внутримолекулярно. Если бы это было не так, то эндогенная фитаспаза, содержащаяся в листьях N. benthamiana, могла бы осуществить процессинг неактивного мутанта S537A фитаспазы табака.

Мы знали, что фитаспаза проявляет удивительную специфичность при гидролизе белковых и пептидных субстратов, внося разрыв строго после остатка D, находящегося в благоприятном аминокислотном контексте. Поэтому следовало ожидать, что если процессинг белка-предшественника фитаспазы осуществляется автокаталитически, то гидролиз пептидной связи и в этом случае должен происходить после остатка D. И действительно, в фитаспазе как табака, так и риса на С-конце продомена находится остаток D, непосредственно предшествующий мотиву ТТНТ, образующему N-конец зрелого фермента - см. Рис. 23.

Для того, чтобы оценить значимость этого остатка D1'7 для процессинга белка-предшественника фитаспазы, мы сконструировали набор мутантов фитаспазы табака, содержащих аминокислотную замену D117Е, либо D117A, либо полностью измененный сайт процессинга U7DTTHT на АААНА (мутант М4), но сохранив при этом остаток Ser537 в активном центре фермента. Способность полученных форм фитаспазы осуществлять отщепление продомена была оценена по размеру рекомбинантного белка, накапливающегося в инфильтрированных соответствующими конструкциями листьях N. benthamiana. Как видно из Рис. 27, точечных мутаций D1'7 оказалось достаточно, чтобы подавить отщепление продомена. Таким образом, отщепление продомена белка-предшественника фитаспазы происходит автокаталитически и в соответствии с субстратной специфичностью фермента.

Рис. 27. Мутация D1'7 предотвращает процессинг профитаспазы табака. Рекомбинантные белки содержат тэг EGFP. Иммуноблот экстрактов с антителами к GFP.

ферменте было полностью подавлено.

(Т)спродоменом _ 170

-н—■

(2) без продомена _ 95

Шслрсйоменом^^ 170

> «о» — 130

(2) без продомена-^

Является ли отщепление продомена функционально значимым событием? Другими словами, обладает ли фитаспаза с неотщепленным продоменом протеолитической активностью и локализацией зрелого фермента? Для ответа на эти вопросы в состав сконструированных химерных белков фитаспаза-ЕСРР был введен дополнительный С-концевой тэг в виде гексагистидиновой последовательности, что позволяло выделять продуцируемые белки из экстрактов с помощью аффинной хроматографии на N¡-N7А агарозе. Получив белок фитаспаза-ЕОРР-Швб дикого типа и непроцессирующегося мутанта М4 в очищенном виде, мы сравнили их способность гидролизовать флуорогенный пептидный субстрат Ас-УЕГО-АРС. Параллельно все процедуры выделения были проделаны для листьев, инфильтрированных агробактериями, содержащими пустой вектор (контроль).

Как видно из Рис. 28, фитаспаза дикого типа эффективно расщепляла пептидный субстрат. В то же время, мутант с неотщепленным продоменом протеолитической активностью не обладал: кривая накопления продукта не отличалась от контрольной. Мы сделали заключение, что, как и для большинства субтилаз, отщепление продомена необходимо для формирования протеолитически активной фитаспазы.

Рис. 28. Фитаспаза дикого типа (\УТ) гидролизует флуоргенный субстрат Ас-УЕГО-АРС, а непроцессированный мутант (М4) - нет. Рекомбинантные белки содержали тэг ЕвРР-(РП8)б и были выделены из экстракта листьев с помощью хроматографии на N¡-N7 А агарозе.

В процессе выделения рекомбинантной фитаспазы и ее непроцессированного мутанта из растительного экстракта мы обратили внимание на разницу в поведении этих двух белков. В то время, как основная доля фермента дикого типа находилась в растворимой форме, непроцессированный мутант практически полностью содержался в нерастворимой фракции обломков и органелл клетки. Извлечь его оттуда для определения его ферментативной активности не удавалось ни с помощью увеличения ионной силы раствора и содержания неионного детергента Т\уееп 20, ни с помощью обработки экстракта ультразвуком. И только добавление детергента додецилмальтозида (в концентрации 1 мМ, не ингибирующей фитаспазу дикого типа), известного солюбилизатора клеточных мембран, позволило получить непроцессированную фитаспазу в растворимом виде.

О том, что локализация непроцессированной фитаспазы отличается от локализации зрелого фермента, свидетельствовала и разница в локализации

Время, часы

этих форм фермента (присоединенных к тэгу тЯЕР, мономерному красному флуоресцирующему белку) в листьях табака. Через 24 часа после инфильтрации растений процессированная фитаспаза обнаруживалась только во внеклеточной жидкости, а не успевшая процессироваться - только внутри клеток - Рис. 29. Спустя 48 часов вся фитаспаза присутствовала в процессированной форме и во внеклеточной жидкости.

Рис. 29. Непроцессированная фитаспаза, в отличие от процессированной, не секретируется из клеток табака.

Анализ белков, содержащихся во внеклеточной и внутриклеточной фракциях листьев табака, продуцирующих фитаспазу-тКРР,

иммуноблоттигом с антителами к тКРР. * и ** указывают положение непроцессированной и процессированной формы фитаспазы,

соответственно. ВРА - брефелдин А. Снизу указано время, прошедшее после инфильтрации листьев (часы).

На основании этих экспериментов мы пришли к выводу, что отщепление продомена важно не только для активации фитаспазы, но и для ее транспорта из клетки (секреции) - см. ниже.

4.3. Фитаспаза локализована в апопласте здоровых листьев растений

Как легкость выделения зрелой фитаспазы из разрушенной ткани листьев и обнаружение фитаспазы во внеклеточной жидкости, так и наличие предполагаемого >4-концевого сигнального пептида в составе белка-предшественника фитаспазы наводило на мысль, что фитаспаза может являться секреторным белком, способным, после отщепления продомена, накапливаться в апопласте - межклеточной жидкости. Поэтому мы исследовали локализацию фитаспазы, продуцируемой в виде химерного белка с тИРР или ЕСРР тэгом, в листьях табака и бентамианы с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Для того, чтобы иметь возможность точно картировать местоположение фитаспазы, в этих же растениях продуцировали белок-маркер плазматической мембраны ЬТ16Ь, соединенный с флуоресцентным белком ЕвРР (зеленая флуоресценция) или тОгап§е (оранжевая флуоресценция). Результаты представлены на Рис. 30. Как видно, фитаспаза локализована тонким слоем вдоль границ клеток и не выявляется внутри растительных клеток в сколько-нибудь значимых количествах (Рис. 30А,Г). При большем увеличении видно, что флуоресценция фитаспазы располагается в листьях табака (Рис. ЗОБ, красная флуоресценция белка фитаспаза-тКЕР) и бентамианы (Рис. ЗОД, зеленая флуоресценция белка фитаспаза-ЕОРР) между плазматических мембран двух

ВЁА

Суммарный экстракт

Внеклеточная фракция

Внутриклеточная * фракция

н

24 48 48

соседних растительных клеток, окрашенных маркерным белком 1ЛТ6Ь-ЕСРР (Рис. ЗОБ, зеленая флуоресценция) или ШЧбЬ-тОшще (Рис. ЗОД, оранжевая флуоресценция).

А фитаспаза-тЯРР Б фитаспаза-тЯРР + В фитаспаза-тЯГР+

Шб-ЕбРР брефелдинА

• ? * О • 'V И /Л Сч;- • • V • • . ' 4 V ^ ч • г , ч \ 1 *--- ,' Ч,! ' Г V * » > \ 'У/ Л___> 'V ' >-. \ 1 V %..

Г фитаспаза-ЕвРР Д 6-тОгапде + фитаспаза-ЕйРР

Рис. 30. Фитаспаза накапливается в апопласте в здоровых тканях листьев. Конфокальная флуоресцентная микроскопия листьев табака (А-В) и бентамианы (Г,Д), продуцирующих фитаспазу-тЮгР и фитаспазу-ЕОРР, соответственно. Маркер плазматической мембраны ЬТ16 имеет тэг ЕОРР (Б) или тОгагще (Д). Хлоропласты на А и Б выделены желтым и фиолетовым, соответственно.

Совокупность полученных данных показывает, что фитаспаза в норме секретируется из клетки в апопласт. То обстоятельство, что обработка листьев ингибитором секреции брефелдином А приводит к внутриклеточной локализации фермента (Рис. 29 и ЗОВ), свидетельствует о том, что секреция фитаспазы осуществляется каноническим путем через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Следует отметить, что нарушение секреции в присутствии брефелдина А не мешало процессингу фитаспазы. Таким образом, процессинг фитаспазы может происходить внутри растительной клетки.

Действительно ли секрецию фитаспазы направляет Ы-концевой гидрофобный пептид в составе белка-предшественника? Для проверки этого

предположения мы делегировали участок ОРТ в кДНК фитаспазы табака, кодирующий 1-22 аминокислотные остатки пробелка, и сравнили локализацию такого «безлидерного» мутанта (с присоединенным ЕОРР-тэгом) с локализацией фитаспазы дикого типа, полученной при экспрессии полноразмерной ОРТ в листьях бентамианы.

Данные конфокальной флуоресцентной микроскопии, представленные на Рис. 31, свидетельствуют о том, что «безлидерная» фитаспаза, в отличие от фермента дикого типа, не способна секретироваться из клетки в апопласт и накапливается в цитоплазме в виде скоплений (точек).

фитаспаза дикого типа

"безлидерная" фитаспаза

^¿У .V ...

-л

V. ь.

Рис. 31.

гидрофобный профитаспазы сигнальным

1М-концевой пептид является пептидом.

ЧГ >г>

Конфокальная флуоресцентная микроскопия листьев

бентамианы, продуцирующих полноразмерную профитаспазу-ЕвРР или

«безлидерную» мутантную форму профитаспазы.

Поскольку внеклеточная локализация фитаспазы является естественным состоянием фермента в здоровых тканях растений, то представляет интерес вопрос, находится ли фермент в апопласте в протеолитически активном состоянии? С одной стороны, фитаспаза вне клетки присутствует в процессированной форме и, следовательно, могла бы проявлять протеолитическую активность. С другой стороны, если этот фермент нужен только для осуществления ПКС, то можно ожидать, что в здоровых тканях он инактивирован (например, в результате взаимодействия с белком-ингибитором) до наступления ПКС.

Чтобы выяснить, какой из двух вариантов ответа правильный, мы инфильтрировали листья бентамианы, продуцирующие фитаспазу-ЕСРР, необратимым ингибитором фитаспазы Вю-УУАБ-СМК, содержащим химически активную хлорметилкетонную группировку. Если фитаспаза в апопласте находится в активном состоянии, то она свяжет ингибитор. В результате произойдет модификация 8ег537 в активном центре фермента и ковалентное присоединение пептида, содержащего в своем составе биотин. Присутствие биотина в составе модифицированного фермента можно обнаружить с помощью авидин-пероксидазы.

Листья бентамианы, продуцировавшие фитаспазу-ЕСРР, инфильтрировали раствором, содержащим или не содержащим 10 мкМ Вю-УУАБ-СМК. Экстрагированные белки фракционировали с помощью гель-электрофореза, переносили на мембрану и обрабатывали авидин-

пероксидазой, с последующей детекцией биотинилированного белка с помощью реакции хемилюминесценции. Как видно из Рис. 32, в образце, выделенном из обработанных ингибитором листьев, обнаруживается отчетливая полоса меченого белка, которая отсутствует в контрольном образце. Визуализация положения белка фитаспаза-ЕвРР на блоте с помощью антител к вРР показала, что электрофоретическая подвижность меченного ингибитором белка в точности соответствует положению фитаспазы.

I

1 £

-X .0 -о

130 кДа

Авидин-пероксидаза

Рис. 32. Фитаспаза, находящаяся в апопласте, протеолитически активна. Листья бентамианы, продуцирующие фитаспазу-ЕОРР, инфильтрированы Ыо-УУАО-СМК (2) или буфером (1). А: Биотинилированные белки экстракта выявляли на блоте по способности связывать авидин-пероксидазу. Б: фитаспазу обнаруживали с помощью антител к вИР.

АпИ-ЕСРР

Из полученного результата можно заключить, что находящаяся в апопласте фитаспаза является протеолитически активной. Это позволяет предположить, что, помимо участия в осуществлении ПКС (см. раздел 3.3. и ниже), у фитаспазы может быть функция, востребованная в здоровой ткани растений.

4.4. Фитаспаза участвует в осуществлении программированной клеточной смерти растений

Ранее мы показали, что ингибитор фитаспазы Вю-ТАТО-СНО препятствует осуществлению ПКС в листьях табака {МЫ генотип), инфицированных ВТМ (раздел З.З.). Наряду с другим наблюдением -фрагментацией белка 0РР-\ЧгБ2С1 по сайту ТА'П), происходящей в апоптотических, но не в нормальных клетках, - этот результат указывал на важность фитаспазы для клеточной смерти растений. Теперь, имея кДНК фитаспазы, мы смогли оценить роль фитаспазы в ПКС более детально. С использованием этой кДНК были получены трансгенные растения табака N. ?аЬасит NN в которых уровень активности фитаспазы был либо повышен путем суперпродукции фермента, либо понижен вследствие РНК-интерференции (сайленсинга). Эксперименты по получению трансгенных растений и оценке зависимости ПКС от уровня фитаспазы в этих растениях

были проведены в лаборатории М.Э.Тальянского (Scottish Crop Research Institute, Великобритания) в ходе выполнения совместного проекта. Мы определили активность фитаспазы в экстрактах листьев нескольких линий трансгенных растений по способности фрагментировать белок-субстрат GFP-VirD2Ct и убедились, что при суперпродукции уровень активности фитаспазы возрастал примерно в 4 раза, а при РНК-интерференции -снижался примерно в 8 раз по сравнению с исходными (не трансгенными) растениями. Выращенные в условиях теплицы гетерозиготные растения не демонстрировали, однако, каких-либо заметных отличий от растений дикого типа. В случае суперпродукции излишек фитаспазы, секретированный в апопласт и таким образом изолированный от клеточного содержимого, вероятно, мог не оказывать влияния на рост и развитие растений. В случае сайленсинга отсутствие видимых изменений могло быть связано с тем, что фитаспаза либо не принимает участия в онтогенезе, либо с функциональной избыточностью, т.е. с наличием другого фермента, который мог компенсировать пониженный уровень фитаспазы в процессе развития растений.

Поэтому было исследовано, как измененный уровень активности фитаспазы в трансгенных растениях скажется на осуществлении ПКС, вызванной биотическим и абиотическими стрессами. В качестве биотического стресса исследовали ГО, вызванный заражением растений табака NN генотипа ВТМ. В качестве абиотических стрессов, индуцирующих ПКС в листьях табака, использовали окислительный стресс, вызываемый метилвиологеном, и осмотический стресс, вызываемый повышенной концентрацией NaCl.

Оказалось, что развитие ВТМ-индуцированного ГО, выражавшегося в появлении областей мертвых клеток («некрозов») в ответ на индукцию ПКС, было заметно усилено в трансгенных растениях-суперпродуцентах фитаспазы и ослаблено в сайленсированных растениях. Аналогичное заключение можно сделать и на основе анализа экспрессии раннего молекулярного маркера ГО гена hsr203J. Как видно из Рис. ЗЗА, возрастание экспрессии этого гена, определенное с помощью ОТ-ПЦР, особенно значительно в случае ВТМ-индуцированной ПКС в растениях-суперпродуцентах и подавлено в сайленсированных растениях (по сравнению с растениями дикого типа).

Таким образом, данные о важной роли фитаспазы в осуществлении ГО, полученные с использованием трансгенных растений, согласуются с предыдущими результатами, полученными с использованием ингибитора фитаспазы Bio-TATD-CHO (см. раздел 3.3.). В совокупности эти результаты показывают, что фитаспаза вовлечена в осуществление ранних стадий ПКС, вызванной биотическим стрессом.

А

120

а х

ш

§ 100 & 5

>1 а во

1| § 5 60

HSR203J

выход цитохрома с

и

о

X

т

40

гЬ

т

КО Ш ОЕ WT

МУ 10 рМ

2.5 цМ

В

КО Ы ОЕ

контроль ЮмкМ МУ

ЮмкМ МУ-Жр ЮмкМ МУ+Ир5535А

• • • •

II >

он т

•л

контроль 2.5 мкМ ММ

№ WT

Рис. 33. Фитаспаза важна для осуществления ПКС в листьях табака, вызванной биотическим и абиотическими стрессами. чЛ - растения дикого типа; КГ) и ОЕ -трансгенные растения с пониженным или повышенным уровнем активности фитаспазы, соответственно. А: уровень экспрессии гена hsr203J при ВТМ-индуцированном ГО. Б: Выход цитохрома с из митохондрий (М) в цитоплазму (С) при индукции окислительного стресса метилвиологеном (МУ). В: Жизнеспособность клеток при обработке МУ; влияние дополнительной продукции фитаспазы риса (+Яр) или ее неактивного мутанта (+Б{.р3535А) на протекание ПКС.

Оказалось, что фитаспаза участвует также в осуществлении ПКС, вызванной абиотическими стрессами. Обработка листовых дисков, полученных из нормальных растений табака, 10 мкМ метилвиологеном или 250 мМ №С1 вызывала гибель клеток, проявляющуюся в выходе цитохрома с из митохондрий в цитоплазму (Рис. ЗЗБ, левая часть, образец шС), накоплении активных форм кислорода и обесцвечивании дисков (Рис. 33 В, левая панель, образец \\1). В то же время, проявление всех этих признаков ПКС значительно ослаблено в сайленсированных растениях (Рис. ЗЗБ,В, образец КБ). Растения-суперпродуценты фитаспазы, напротив, отличались повышенной чувствительностью к про-апоптотическим стимулам. Так, обработка низкими концентрациями индукторов (2.5 мкМ метилвиологен или 75 мМ №С1), которые в растениях дикого типа не вызывали ПКС (Рис. 33 Б,В), в растениях-суперпродуцентах фитаспазы эффективно вызывали выход цитохрома с из митохондрий (Рис. ЗЗБ, правая часть, образец ОЕ), накопление активных форм кислорода и потерю жизнеспособности клеток (Рис. 33В).

Существенно также, что продукция в сайленсированных растениях табака протеолитически активной фитаспазы риса (но не ее неактивного мутанта 8535А) восстанавливала их способность осуществлять ПКС (Рис. 33В). Следовательно, для осуществления ПКС важна именно протеолитическая активность фитаспазы.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что фитаспаза участвует в осуществлении ПКС, вызванной как биотическими, так и абиотическими стрессами.

4.5. При индукции ПКС фитаспаза ре-локализуется внутрь умирающей растительной клетки

Краеугольным камнем для обнаружения фитаспазы послужил гидролиз этим ферментом внутриклеточного репортерного белка 0ЕР-\%02С1 (см. раздел З.1.). Однако не очень понятно, каким образом фитаспаза, локализованная вне клетки (в апопласте) может осуществлять фрагментацию внутриклеточных белков-мишеней.

Эта проблема получила неожиданное решение. Выяснилось, что индукция ПКС в листьях растений, происходящая под действием как биотических, так и абиотических стрессов, приводит к появлению фитаспазы внутри умирающих клеток. Рис. 34 демонстрирует, что при обработке листьев растений, продуцирующих белок фитаспаза-тКРР (К (аЬасит) или фитаспаза-ЕОРР (К ЬешЬатгапа), различными индукторами ПКС в цитоплазме наблюдается появление характерных скоплений (точек) фитаспазы, выявляемое с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В случае ГО, вызванного заражением ВТМ, причиной появления фитаспазы в цитоплазме является именно ПКС, а не вирусная инфекция сама по себе. Об этом свидетельствует тот факт, что ре-локализации фитаспазы не происходит при заражении ВТМ растений табака, не содержащих N ген, или содержащих N ген, но инкубированных при повышенной температуре, при которой индукции ГО не происходит.

Анализ сравнительного содержания рекомбинантной фитаспазы во внеклеточной жидкости и внутри клеток с помощью иммуноблоттинга также показал, что процессированная фитаспаза начинает обнаруживаться внутри апоптотических клеток растений при индукции ПКС, но не детектируется внутри клеток до индукции - Рис. 35.

Таким образом, наблюдаемое изменение локализации фитаспазы при ПКС находится в соответствии с нашими ранними данными о том, что фрагментация внутриклеточного белка СРР-\Чг02С1 происходит только при индукции ПКС, но не наблюдается в отсутствие ПКС.

фитаспаза-ЕйГР осмотический стресс окислительный стресс

А Ъ су Б • л"' V • ■ \ • . • ■ / - 'л .. "; В ? •

фитаспаза-тЯРР ВТМ-индуцированный ГО окислительный стресс

Т1" С_- л . • Ч ' , , ■ .* ... д 1 " Л- ^ >■■ .... Г г У.

Рис. 34. Фитаспаза обнаруживается внутри умирающих клеток N. ЬемИат'шпа (Б, В -фитаспаза-ЕОРР) и N. IаЬасит (Г, Д - фитаспаза-тЯРР) при индукции ПКС. А: контроль в отсутствие ПКС. Анализ с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.

**

**

-Л*

Рис. 35. Процессированная фитаспаза-тКРР (**) выявляется в апопластной фракции здоровых листьев табака, но перемещается во внутриклеточную фракцию при индукции ПКС метилвиологеном (+МУ). Обработка циклогексимидом (ингибитором трансляции, +СНХ) за 24 часа до индукции ПКС не препятствует ре-локализации фитаспазы. Анализ с помощью иммуноблоттинга с антителами к тИГР.

Появление фитаспазы внутри умирающих растительных клеток может быть вызвано двумя причинами. Одна из них может заключаться в том, что индукция ПКС нарушает секрецию вновь синтезированной фитаспазы из клетки в апопласт. Второе возможное объяснение - это транспорт предсинтезированной и накопленной в апопласте фитаспазы обратно в растительную клетку при ПКС. Следует отметить, что это второе объяснение менее тривиально, поскольку известно, что разрыв плазматической мембраны растительной клетки происходит на поздних стадиях ПКС, а активность фитаспазы внутри клеток мы выявляли спустя уже 1 час после индукции ПКС (Рис. 11). Помимо этого, другая протеаза, в норме

38

накапливающаяся в апопласте растений - катепсин В, сохраняла свою апопластную локализацию и в процессе ПКС.

Для того, чтобы выбрать из двух возможных механизмов ПКС-индуцированного появления фитаспазы внутри растительной клетки правильный, мы использовали два подхода. Один из них заключался в ингибировании циклогексимидом белкового синтеза в листьях N. IаЪасит, продуцирующих белок фитаспаза-тШФ, перед индукцией апоптоза. Если причиной внутриклеточной локализации фитаспазы является нарушение секреции вновь синтезированного фермента, то остановка трансляции должна была предотвратить появление фитаспазы в цитоплазме. Однако, как видно из результатов анализа с помощью иммуноблотгинга вне- и внутриклеточных фракций обработанных циклогексимидом листьев, этого не произошло - Рис. 35, трек 3. В листьях табака с блокированным синтезом белков индукция ПКС с помощью окислительного стресса (а также при ГО, вызванном заражением ВТМ) по-прежнему приводила к появлению фитаспазы внутри клеток. На этом основании мы пришли к заключению, что если при ПКС даже и происходит нарушение секреции, то не это является причиной появления фитаспазы в цитоплазме.

Второй подход оценивал альтернативную возможность: ретроградный транспорт накопленной в апопласте фитаспазы внутрь клетки при ПКС. Для этого мы использовали растения N. Ьеп(Ьат1апа, транзиентно продуцирующие химерный белок, состоящий из фитаспазы и флуоресцентного белка-таймера (РТ). РТ - это генетически модифицированный флуоресцентный белок, который непосредственно после своего синтеза обладает синей флуоресценцией, но по мере созревания (занимающего в нашем случае 3 суток) начинает флуоресцировать красным. Это означает, что если дать белку фитаспаза-РТ накопиться в апопласте и созреть (красная флуоресценция, 72 часа после инфильтрации листьев), а затем индуцировать ПКС, то появление красной флуоресценции в цитоплазме в течение следующих 24 часов будет означать физическое перемещение предсуществующей фитаспазы-РТ из апопласта внутрь клетки. Даже если секреция химерного белка будет нарушена при ПКС, за 24 часа вновь синтезированный ИТ просто не успеет созреть и будет обладать синей, но не красной флуоресценцией.

Результаты этого эксперимента представлены на Рис. 36. Через 24 часа после инфильтрации листьев N. ЬепЛапйапа агробактериями, содержащими плазмиду, кодирующую белок фитаспаза-РТ, синяя флуоресценция рекомбинантного белка появилась в апопласте, что означало, что секреция фитаспазы в норме занимает менее 24 часов. Спустя 72 часа после инфильтрации РТ начал созревать, и в апопласте стала детектироваться красная флуоресценция - Рис. 36А. В этот момент из листьев были вырезаны диски и в них была индуцирована ПКС с помощью обработки

39

метилвиологеном. Через 24 часа после индукции ПКС листовые диски начали обесцвечиваться, что свидетельствовало о развитии ПКС. При этом наблюдалось характерное для ПКС сжатие протопласта умирающих клеток. Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии показал, что к этому же времени красная флуоресценция, соответствующая предсинтезированному белку фитаспаза-РТ, обнаруживалась внутри умирающих клеток - Рис. 36Б. Параллельно происходило ослабление красного флуоресцентного сигнала во внеклеточной жидкости.

Рис. 36. Белок-таймер показывает, что при ПКС происходит физическое перемещение фитаспазы из апопласта в цитоплазму.

Локализация фитаспазы-РТ в листьях бентамианы с помощью флуоресцентной микроскопии до (А) и после (Б) индукции ПКС с помощью метилвиологена.

Стрелками показано направление сжатия протопласта.

Таким образом, совокупность полученных данных указывает на то, что при ПКС происходит физическое перемещение предсинтезированной фитаспазы из апопласта в цитоплазму растительной клетки. Этот обратный транспорт и объясняет появление протеолитической активности фитаспазы внутри умирающей клетки. Следует особо отметить, что обнаруженная ПКС-индуцированная ре-локализация белка из апопласта - явление новое и неожиданное, и потому заслуживающее дальнейшего изучения.

4.6. Биологический смысл расщепления агробактериального белка К/гХ>2 фитаспазой

Изначально основой для обнаружения фитаспазы - апоптотической протеазы растений - послужила способность этого фермента гидролизовать пептидную связь (в положении ТАТО400) в молекуле белка \ЧгЭ2 агробактерии А. tumefaciens. Теперь, когда мы узнали больше о структуре, специфичности и функции этого фермента, имеет смысл вернуться назад и попытаться понять, в чем может заключаться роль фрагментации белка \Чг02 фитаспазой.

Агробактериальный белок \%Б2 участвует в образовании одноцепочечной бактериальной Т-ДНК, которая затем переносится в комплексе с \4rD2 в зараженную растительную клетку. Благодаря N1^ белка УМ)2, присоединенная к белку Т-ДНК транспортируется в ядро

40

растительной клетки и встраивается в хозяйский геном, вызывая трансформацию растения. И хотя основанное на этих свойствах белка \ЧгБ2 получение трансгенных растений находит широкое как научное, так и биотехнологическое применение, для растения агробактерия является несомненным патогеном. Поэтому следует ожидать, что растения имеют средства противодействия агробактериям, что и обуславливает низкую эффективность трансформации растений даже в оптимизированных лабораторных условиях.

Одним из таких защитных механизмов растений могла бы быть фрагментация белка УЮ2 фитаспазой. Действительно, следствием расщепления У№2 по сайту ТАТЮ400 является удаление короткого С-концевого фрагмента белка \Чг02 (примерно 45 аминокислотных остатков). Однако поскольку именно в этой области УиТ)2 находится его ЫЬБ (см. Рис. 9), то укороченный фитаспазой белок У№2 не должен обладать способностью импортироваться в ядро растительной клетки (аналогия с фрагментацией белка ПроТа каспазой животных очевидна) и транспортировать туда присоединенную к нему бактериальную Т-ДНК.

Чтобы проверить эту гипотезу, был сконструирован мутантный штамм агробактерии А. ¡ите/аЫет, содержащий вместо гена белка \%132 дикого типа мутантный ген У\т02, кодирующий устойчивый к расщеплению фитаспазой белок \%02 0371,400А. Эффективность доставки и экспрессии Т-ДНК в ядро растительной клетки полученной агробактерией (по сравнению со штаммом дикого типа) оценивали, введя в состав Т-ДНК репортерный ген вРР. В случае успешного транспорта Т-ДНК в ядро, клетки растений должны были начать синтезировать ОБР и приобретать зеленую флуоресценцию, выявляемую с помощью флуоресцентной микроскопии. В качестве реципиентов использовали листья широкого круга растений, включающего как двудольные, так и однодольные.

Доставка и экспрессия целевого гена, осуществляемая агробактериями с резистентным к гидролизу фитаспазой белком \4rD2, оказалась значительно более эффективной, чем в случае агробактерий дикого типа - Рис. 37. Как площадь, занимаемая флуоресцирующими клетками, так и интенсивность флуоресценции вРР возросли во много раз в случае использования мутантного штамма агробактерий.

Полученный результат указывал на то, что фрагментация агробактериального белка \Чг02 фитаспазой может являться одним из защитных механизмов растений, ограничивающих доставку и экспрессию чужеродной ДНК.

wt VirD2 mut VirD2

M —

S _

.щш

■ ■ - - | - >

Nicoliana benthamiana

Physalis flaridana

Spinacea olerácea

Brassica napas

Рис. 37. Агробактерии, содержащие ген устойчивого к гидролизу каспазой и фитаспазой белка VirD2 (mut VirD2), обеспечивают более эффективную доставку и экспрессию гена EGFP в клетках растений [по сравнению с агробактериями, содержащими ген VirD2 дикого типа (wt VirD2)].

Zea mays

Hordeum vulgare

4.7. Модель активного центра фитаспазы

Исключительная специфичность фитаспазы в отношении аминокислотного остатка D, расположенного в определенном аминокислотном контексте, при гидролизе субстратов нуждается в объяснении. Почему расщепление происходит только после остатка D, но при этом далеко не любого D? Ответ на этот вопрос мог бы дать рентгеноструктурный анализ фермента, но такие данные пока отсутствуют. Экспериментально определена пространственная структура лишь одной субтилазы растений - SBT3 томатов. Этот фермент не обладает аспартатной специфичностью, но в целом демонстрирует достаточно высокое сходство с фитаспазой табака (49% идентичности аминокислотных остатков). Поэтому мы предприняли попытку с помощью биоинформатических методов, взяв за основу структуру субтилазы SBT3, построить модель пространственной структуры фитаспазы табака. Для построения модели использовали программу MODELLER 9.7, и полученная структура фермента представлена на Рис. 38. Существенно, что аминокислотные остатки, формирующие каталитическую триаду фитаспазы, оказались расположены в правильном порядке и сформировали активный центр фермента.

Для того, чтобы понять, насколько полученная теоретическая модель может соответствовать действительности, с помощью программных средств

Docking Server был проведен молекулярный докинг двух пептид-альдегидов, Ac-VAD-CHO и Ac-VAE-CHO, в боксе, включающем активный центр фитаспазы. Эта пара пептидов была выбрана для сравнения потому, что, несмотря на их сходство, один из них эффективно узнается фитаспазой, а второй полностью лишен такой способности (Рис. 19). Докинг ингибитора Ac-VAD-CHO выявил несколько существенных обстоятельств. Во-первых, альдегидная группа ингибитора заняла положение в непосредственной близости от гидроксильной группы каталитического остатка Ser537 (расстояние от атома кислорода ОН-группы до атома углерода СНО- группы 3.4 А) - Рис. 38, что объясняло ингибирующую способность этого соединения. Во-вторых, боковой радикал аминокислотного остатка D

Asn322

His331

His220

Asp149

His220

Aspl 49

Рис. 38. Модель активного центра фитаспазы с ингибитором Ac-VAD-CHO. А, Б: проекции модели под двумя углами. Более детально показаны каталитические аминокислотные остатки активного центра и His331. Ингибитор выделен зеленым цветом. Синим обозначены атомы азота, красным - атомы кислорода.

в положении Pi ингибитора вписался в S, субстрат-связывающий карман фермента. При этом бета-карбоксильная группа остатка D оказалась сближена с имидазольным кольцом аминокислотного остатка His331 таким образом, что алгоритм Docking Server предсказывает наличие сильного полярного взаимодействия между ними - Рис. 38. В случае докинга пептид-

альдегида Ac-VAE-CHO боковой радикал глутамата в положении Pi не смог занять нужного положения в субстрат-связывающем кармане фермента и, как следствие, его альдегидная группа оказалась удалена от гидроксильной группы каталитического Ser537 (11.4 А).

Таким образом, предложенная модель активного центра фитаспазы не противоречит имеющимся экспериментальным данным и, более того, она способна объяснить исключительную аспартатную специфичность фермента. Эта модель предсказывает, что в фиксации Р] аспартата субстрата в активном центре фермента принимает участие остаток His331, в результате чего гидроксил каталитического остатка Ser537 оказывается сближенным с атакуемой пептидной связью. И хотя предложенная модель, несомненно, требует дальнейшей экспериментальной проверки, следует отметить интересное обстоятельство. В аналогичной позиции аминокислотной последовательности фитаспазы риса также присутствует аминокислотный остаток His, однако в подавляющем большинстве растительных субтилаз этот характерный остаток His отсутствует.

5. Сравнение фитаспаз растений с каспазами животных: общие черты и различия

Учитывая специфичность гидролиза фитаспазой субстратов и роль этого фермента в осуществлении ПКС у растений, фитаспазу можно рассматривать как функциональный аналог каспаз животных. Как ни странно, структурно эти апоптотические протеазы животных и растений совершенно не похожи, и более того, фитаспазы являются Ser-зависимыми, а каспазы -Cys-зависимыми ферментами. Из сравнения свойств каспаз и фитаспаз складывается впечатление, что животные и растения руководствовались различными тактическими схемами, приведшими в итоге к сходному принципиальному решению: созданию протеаз со сходной функцией и специфичностью.

Различные стратегии, используемые клетками животных и растений в отношении своих апоптотических протеаз, схематично изображены на Рис. 39. Как каспазы, так и фитаспазы синтезируются в виде неактивных белков-предшественников, однако дальше пути расходятся. Прокаспазы хранятся внутри клеток животных. Их активация путем процессинга и ассоциации субъединиц происходит в ответ на ПКС-индуцирующие стимулы и приводит к фрагментации внутриклеточных белков-мишеней и гибели клетки.

В противоположность этому сценарию, профитаспазы процессируются конститутивно и автокаталитически с образованием активного фермента даже в отсутствие ПКС-индуцирующих воздействий. Однако зрелые фитаспазы при этом секретируются из клетки в апопласт благодаря наличию сигнального пептида в составе белка-предшественника. Это позволяет

продомен

большая субъединица малая субъединица

Клетка животных

эндоплазматический чретикулум

апопластная жидкость

аппарат Гольджи

фитаспаза

(ндукция

пкс

Рис. 39. Сравнение поведения каспаз животных и фитаспаз растений (пояснения в тексте).

Клетка растения

пространственно отделить активный протеолитический фермент от внутриклеточных белков-мишеней и избежать несанкционированного протеолиза и гибели клеток. При индукции ПКС фитаспаза транспортируется из апопласта внутрь клеток с помощью неизвестного механизма, что приводит к фрагментации внутриклеточных белков.

Как видно, контроль за внутриклеточной активностью каспаз осуществляется на уровне процессинга белков-предшественников, а фитаспаз - на уровне транспорта фермента из апопласта в цитоплазму. Можно заключить, что растения выработали свой собственный механизм контроля за апоптотическими протеазами, не встречающийся (или пока не обнаруженный) у животных. Таким образом, клетки животных и растений демонстрируют как общие черты, так и существенные различия в том, как они обращаются со своими апоптотическими протеазами.

выводы

1. В структуре ядерного белка протимозина альфа человека выявлен сигнал ядерной локализации, направляющий активный транспорт белка в ядро. Ядерная локализация важна для функционирования протимозина альфа, одной из функций которого оказалась внутриядерная диссоциация комплекса транскрипционного фактора Nrf2 с белком-репрессором Keapl.

2. Обнаружено, что при апоптозе происходит инактивация протимозина альфа путем отщепления сигнала ядерной локализации апоптотической протеазой - каспазой. В результате фрагментации каспазой протимозин утрачивает способность накапливаться в ядре, распределяется по цитоплазме и выходит на поверхность умирающей клетки человека.

3. Поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина альфа, выявил белок VirD2 патогена растений агробактерии Agrobacterium tumefaciens как потенциальную мишень каспазо-подобных протеаз. Обнаружено, что белок VirD2 гидролизуется каспазой человека in vitro и определены места гидролиза.

4. При индукции программированной клеточной смерти в растениях табака Nicotiana tabacum, вызванной инфекцией вирусом табачной мозаики, обнаружена активация растительной протеазы, гидролизующей белок VirD2 после аминокислотного остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Эта протеаза получена в индивидуальном виде и названа фитаспазой. Активность фитаспазы регистрируется также при механическом разрушении растительной ткани. Фитаспаза имеется у самых разных растений, включая двудольные и однодольные.

5. Определена субстратная специфичность фитаспазы. Фермент гидролизует субстраты строго после остатка D, находящегося в определенном аминокислотном контексте. Предложена модель активного центра фитаспазы, объясняющая специфичность действия фермента.

6. Установлено участие фитаспазы в осуществлении программированной клеточной смерти растений, вызванной биотическими и абиотическими стрессами. Повышение уровня активности фитаспазы при суперпродукции фермента стимулирует протекание клеточной смерти, а снижение активности фитаспазы при помощи специфического ингибитора или путем РНК-интерференции подавляет программированную клеточную смерть у растений.

7. Фитаспазы табака и риса идентифицированы как близкородственные субтилизин-подобные сериновые протеазы растений. Показано, что фитаспаза синтезируется в виде неактивного белка-предшественника. В структуре профитаспазы идентифицированы N-концевой сигнальный пептид, продомен и протеазный домен.

8. Активная фитаспаза образуется путем автокаталитического процессинга белка-предшественника в соответствии с аспартатной специфичностью

46

фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования протеолитически активного фермента и для его секреции в межклеточную жидкость (апопласт).

9. В здоровых тканях растений фитаспаза накапливается в апопласте. За ее секрецию отвечает N-концевой сигнальный пептид в составе профермента. Фитаспаза присутствует в апопласте в протеолитически активном состоянии.

10. При индукции программированной клеточной смерти фитаспаза перемещается из апопласта внутрь умирающей растительной клетки.

11. Гидролиз фитаспазой белка VirD2 агробактерий представляет собой защитный механизм растительной клетки, ограничивающий доставку в ядро и экспрессию чужеродной ДНК.

12. Сравнительный анализ апоптотических протеаз животных и растений -каспаз и фитаспаз - выявил как общие черты, так и существенные различия в свойствах и поведении этих ферментов и способах контроля клеткой их протеолитической активности.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vartapetian АВ, Tuzhikov AI, Chichkova NV, Taliansky M, Wolpert TJ, (2011)

A plant alternative to animal caspases: subtilisin-like proteases. Cell Death Differ. 18,1289-1297.

2. Tuzhikov AI, Vartapetian BB, Vartapetian AB, Chichkova NV (2011) Abiotic

stress-induced programmed cell death in plants: a phytaspase connection. In: Abiotic Stress Response in Plants - Physiological, Biochemical and Genetic Perspectives. (Shanker A. and Venkateswarlu В., eds.), ISBN: 978-953-307672-0, InTech, Chapt. 7, pp. 183-196.

3. Chichkova N.V., Shaw J., Galiullina R.A., Drury G.E., Tuzhikov A.I., Kim S.H.,

Kalkum M., Hong T.B., Gorshkova E.N., Torrance L., Vartapetian A.B., Taliansky M. (2010) Phytaspase, a relocatable cell death promoting plant protease with caspase specificity. EMBO J. 29,1149-1161.

4. Chichkova N.V., Galiullina R.A., Taliansky M.E., Vartapetian A.B. (2008)

Tissue disruption activates a plant caspase-like protease with TATD cleavage specificity. Plant Stress 2, 89-95.

5. Reavy В., Bagirova S., Chichkova N.V., Fedoseeva S.V., Kim S.H., Vartapetian

A.B., and Taliansky M.E. (2007) Caspase-resistant VirD2 protein provides enhanced gene delivery and expression in plants. Plant Cell Rep. 26, 12151219.

6. Reavy В., Taliansky M., Kim S.H., Vartapetian A.B., Chichkova N.V., Bagirova

S. (2007) Modified VirD2 protein and its use in improved gene transfer. W0/2007/132193.

7. Евстафьева А.Г., Карапетян P.H., Рубцов Ю.П., Филонов Г.С., Абаева И.С.,

Фатеева Т.В., Мельников С.В., Чичкова Н.В., Вартапетян А.Б. (2005)

47

Новые функции известного белка: участие протимозина альфа в защите клеток от апоптоза и окислительного стресса. Молек. Биология 39, 729745.

8. Karapetian R.N., Evstafieva A.G., Abaeva I.S., Chichkova N.V., Filonov G.S.,

Rubtsov Y.P., Sukhacheva E.A., Melnikov S.V., Schneider U., Wanker E.E., and Vartapetian A.B. (2005) Nuclear oncoprotein prothymosin a is a partner of Keapl: Implications for expression of oxidative stress-protecting genes. Mol. Cell. Biol. 25, 1089-1099.

9. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S., Kalkum M., Morozov V.S., Rubtsov

Y.P., Kalinina N.O., Taliansky M.E., and Vartapetian A.B. (2004) A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. Plant Cell 16,157-171.

10. Evstafieva A.G., Belov G.A., Rubtsov Y.P., Kalkum M., Joseph В., Chichkova

N.V., Sukhacheva E.A., Bogdanov A.A., Pettersson R.F., Agol V.l., and Vartapetian A.B. (2003) Apoptosis-related fragmentation, translocation, and properties of human prothymosin alpha. Exp. Cell Res. 284,209-221.

11. Chichkova, N.V., Evstafieva, A.G., Lyakhov, I.G., Tsvetkov, A.S., Smirnova,

T.A., Karapetian, R.N., Karger, E.M., and Vartapetian, A.B. (2000) Divalent metal cation binding properties of human prothymosin a. Eur. J. Biochem. 267,4745-4752.

12. Shakulov V.R., Vorobjev I.A., Rubtsov Y.P., Chichkova N.V., and Vartapetian

A.B. (2000) Interaction of yeast importin a with the NLS of prothymosin a is insufficient to trigger nuclear uptake of cargos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 548-552.

13. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A.,

Agol V.l., and Vartapetian A.B. (2000) Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. EEBS Lett. 467,150-154.

14. Lukashev D.E., Chichkova N.V., and Vartapetian A.B. (1999) Multiple tRNA

attachment sites in prothymosin a. FEBS Lett. 451,118-124.

15. Vartapetian A„ Lukashev D., Lyakhov I., Belyaeva A., Chichkova N., and

Bogdanov A. (1997) Mammalian prothymosin alpha links to tRNA in Escherichia coli cells. RNA 3,1173-1181.

16. Rubtsov Y.P., Zolotukhin A.S., Vorobjev I.A., Chichkova N.V., Pavlov N.A.,

Karger E.M., Evstafieva A.G., Felber B.K., and Vartapetian A.B. (1997) Mutational analysis of human prothymosin alpha reveals a bipartite nuclear localization signal. FEBS Lett. 413,135-141.

17. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B.,

Vasilenko A.V., Abramov V.M., and Bogdanov A.A. (1995) Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha. Eur. J. Biochem. 231,639-643.

Заказ № 14-Р/10/2011 Подписано в печать 05.10.2011 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 2,75

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 [ (У?)/ \vw\v. с/г. ги; е-таП: т/о@ф. ги

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

ЧИЧКОВА Нина Валентиновна ФИТАСПАЗА: АПОПТОТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА РАСТЕНИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Диссертация на соискание учёной степени доктора химических наук

Москва-2011

СОДЕРЖАНИЕ

Содержание..............................................................................................1

Список условных обозначений......................................................................5

I. Введение..............................................................................................7

II. Программированная клеточная смерть и каспазо-подобные протеазы

растений (Обзор литературы)............................................................9

1. Апоптоз в клетках животных: программированная клеточная смерть

с участием каспаз.............................................................................10

Структура и специфичность каспаз...............................................11

Мишени и классификация каспаз................................................. 14

Механизмы активации каспаз...................................................... 16

Роль и способы регуляции активности каспаз..................................21

2. Программированная клеточная смерть растений и поиск каспазо-подобных протеаз...........................................................................................23

Использование пептидных субстратов и ингибиторов каспаз для

выявления каспазо-подобных протеаз растений................................25

Метакаспазы...........................................................................31

Вакуолярная протеаза УРЕ.........................................................35

РВА1 - субъединица протеасомы растений.....................................38

Саспаза..................................................................................40

3. Субтилизин-подобные протеиназы растений.........................................43

Структура субтилизин-подобных протеаз растений...........................45

Субтилазы растений принадлежат к подсемейству 88А.....................48

Специфичность и функции субтилизин-подобных протеаз

растений................................................................................50

П1. Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений

(Результаты и их обсуяедение)...........................................................55

1. Белок животных протимозин альфа как источник концепции................. 55

1.1. Протимозин альфа - белок с ядерной локализацией и внутриядерной функцией..............................................................55

1.2. Как можно утратить NLS...................................................62

2. Компьютерный поиск ядерных белков, утрачивающих NLS при

64

гидролизе каспазами.......................................................................

3. Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений...................................72

3.1. Обнаружение активности фитаспазы in vivo...........................73

3.2. Фитаспаза: ингибиторы и субстраты....................................79

3.3. Фитаспаза - функциональный аналог каспаз животных............93

3.4. Механическое повреждение растительной ткани приводит

к появлению активности фитаспазы..........................................96

4. Фитаспаза: структурно-функциональное исследование.......................ЮО

4.1. Выделение и идентификация фитаспаз табака и риса...............100

4.2. Процессинг белка-предшественника фитаспазы.....................106

4.3. Фитаспаза локализована в апопласте здоровых листьев

114

растении............................................................................

4.4. Фитаспаза участвует в осуществлении программированной

118

клеточной смерти растении...................................................... 110

4.5. При индукции ПКС фитаспаза ре-локализуется внутрь

~ 195 умирающеи растительной клетки.............................................

4.6. Биологический смысл расщепления агробактериального

белка VirD2 фитаспазой......................................................... 130

4.7. Модель активного центра фитаспазы....................................133

5. Сравнение фитаспаз растений с каспазами животных: общие черты

и различия...................................................................................^

i л о

6. Заключительные замечания..........................................................1JO

IV. Материалы и методы

142

1. Живые организмы......................................................................

14?

2. Векторы и плазмиды...................................................................

143

3. Реактивы..................................................................................

4. Приборы и оборудование.............................................................144

5. Работы, выполненные на заказ или в сотрудничестве..........................144

6. Среды и буферные растворы......................................................... I45

7. Работа с клетками Е. coli..............................................................145

8. Манипуляции с ДНК...................................................................146

9. Методы исследования фитаспазы

Конструирование плазмид с геном VirD2 для продукции белка в

клетках Е. coli..................................................................... 147

Плазмиды для продукции производных VirD2 в растениях...............149

Оценка эффективности переноса репортерного гена в растения....... 150

Выделение рекомбинантных белков из клеток Е. coli.....................151

Инокуляция листьев табака ВТМ..............................................152

Выделение фитаспазы из листьев табака.....................................152

Выделение фитаспазы из листьев риса .....................................154

Обработки производных VirD2 фитаспазой и каспазой in vitro..........155

Масс-спектрометрический анализ белков.................................... 156

Измерение активности фитаспазы с помощью флуорогенных

субстратов........................................................................... 157

Клонирование и мутагенез кДНК фитаспазы табака..................... 157

Конструирование плазмид с кДНК фитаспазы табака.....................158

Получение агробактерий с целевой плазмидой и инфильтрация ими

листьев N. benthamiana............................................................161

Выделение и анализ рекомбинантной фитапсазы из

инфильтрированных листьев....................................................163

Индукция и анализ ПКС в листьях табака и бентамианы.................166

Исследование тканей растений с использованием микроскопии.......167

10. Работа с протимозином альфа и клетками животных.......................... 170

Выращивание клеток..............................................................170

Индукция апоптоза................................................................170

Получение фиксированных пермеабилизованных и

непермеабилизованных клеток, иммунолокализация..................... 170

Исследование внутриклеточной локализации GFP-ПроТа и

EGFP-Keap 1 .........................................................................171

Выделение ПроТа человека...................................................... 172

Получение радиоактивно меченого 32Р ПроТа............................... 173

Гидролиз ПроТа каспазами in vitro............................................. 173

Электрофорез ПроТа в денатурирующем полиакриламидном геле......174

Получение рекомбинантных белков (His)ö-Nrf2 и zz-Keapl ..............174

Конкуренция ПроТа и Nrf2 за связывание с Keapl .........................175

11. Методы биоинформатики...........................................................175

V. Выводы.......................................................................................... 177

VI. Список литературы.........................................................................179

Список условных обозначений

Для аминокислот и их производных использовались обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного союза биохимиков (IUP).

В работе использовались также следующие сокращения и обозначения:

ВТМ вирус табачной мозаики

ГО гиперчувствительный ответ

ДСН додецилсульфат натрия

ИПТГ изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

кДа килодальтон

ПААГ полиакриламидный гель

ПКС программированная клеточная смерть

ПроТа протимозин альфа

ПЦР полимеразная цепная реакция

Т-ДНК ДНК, переносимая агробактериями в клетку растения

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

AFC 7-амино-4-трифторметилкумарин

АМС 7-амино-4-метилкумарин

BFA брефелдин А

CARD каспазо-связывающий домен (caspase-recruitment domain)

СНХ циклогексимид

СМК хлорметилкетон

DD домен сигнала к гибели (death domain)

DISC комплекс сигнала индукции гибели

(death-inducing signaling complex)

dNTP дезоксинуклеозидтрифосфат

(E)GFP зеленый флуоресцирующий белок

FADD Fas-ассоциированный DD белок (Fas-associated DD protein)

FMK фторметилкетон

FT флуоресцентный таймер

GST глутатион-8-трансфераза

HEPES 1Ч-2-гидроксиэтилпиперазин-1Ч'-этансульфоновая кислота

IAP белок-ингибитор апоптоза (inhibitor of apoptosis protein)

mOrange белковый тэг, флуоресцирующий в оранжевом спектре

mRFP красный флуоресцирующий белок

MV метилвиологен

NB-LRR нуклеотид-связывающий лейцин-богатый повтор

(nucleotide binding leucine rich repeat)

NES сигнал экспорта из ядра

NLS сигнал ядерной локализации

NOD нуклеотид-связывающий домен, ответственный за олигомеризацию

(nucleotide-binding and oligomerization domain)

NtPhyt фитаспаза табака

PMSF фенилметилсульфонил фторид

PVDF поливинилиденфторид

RACE метод быстрой амплификации концов кДНК

Rubisco рибулозобисфосфаткарбоксилаза оксигеназа

TNF фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor)

VPE вакуолярный процессирующий фермент

X-Gal 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид

I. Введение

Программированная клеточная смерть (ПКС) является фундаментальным биологическим процессом, позволяющим многоклеточным организмам удалять избыточные и поврежденные клетки. ПКС функционирует в процессе развития организма, участвует в ответе на стрессовые воздействия, вызывающие необратимые повреждения клеток, и играет защитную роль при инфекции патогенами. Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, характеризующийся определенным набором морфологических и биохимических признаков, таких как сжатие клетки, конденсация хроматина, фрагментация ДНК, выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль и т.д. Ключевую роль в программированном самоубийстве клеток животных играют каспазы - семейство высокоспецифичных цистеиновых протеаз, активирующихся при апоптозе и вносящих единичные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков. Каспазы обладают исключительной специфичностью гидролиза, внося разрыв после остатка аспарагиновой кислоты (Б), находящегося в определенном аминокислотном контексте. Направленная фрагментация белков-мишеней каспазами приводит в конечном счете к упорядоченной гибели клетки. И напротив, ингибирование каспаз препятствует осуществлению апоптоза.

В полном соответствии с названием «апоптоз» (от греч. «опадание листьев»), ПКС функционирует и в организмах растений и используется для тех же целей, что и у животных. Следует отметить, что молекулярные механизмы ПКС растений изучены существенно хуже, чем в случае апоптоза животных клеток. Однако наличие ряда сходных черт в ПКС животных и растений позволяет предполагать, что при осуществлении ПКС организмы двух царств используют сходные принципы. В этой связи существенно и удивительно, что у растений, судя по результатам секвенирования растительных геномов, отсутствуют каспазы - основные исполнители ПКС животных. В то же время, имеются многочисленные данные о том, что ингибиторы каспаз животных способны подавлять развитие ПКС растений. В соответствии с этим, при ПКС растений часто наблюдается активация неидентифицированных «каспазо-подобных» протеаз, способных гидролизовать разнообразные пептидные субстраты каспаз. Эти результаты

позволяют думать, что в осуществлении ПКС у растений задействованы протеазы, являющиеся функциональными аналогами каспаз животных, но структурно сильно отличающиеся от каспаз.

Какая протеаза играет роль каспаз животных при осуществлении ПКС у растений? Такой фермент был найден и охарактеризован в ходе выполнения данной диссертационной работы и получил название «фитаспаза» {растительная асиартат-специфичная протеаза).

II. Программированная клеточная смерть и каспазо-подобные протеазы растений (Обзор литературы)

"Life is pleasant. Death is peaceful. It's the transition that's troublesome". Isaac Asimov

Существование многоклеточных организмов требует удаления избыточных и поврежденных клеток, которые образуются как в ходе нормального развития, так и в процессе взаимодействия организма с внешней средой. Клеточный процесс, направленный на последовательное уничтожение (самоубийство) нежелательных клеток, известен как программированная клеточная смерть (ПКС). Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, который происходит с участием семейства высокоспецифичных протеолитических ферментов, называемых каспазами (caspases, cysteine-dependent aspartate-specific proteases). Каспазы вносят одиночные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков, что в конечном счете приводит к упорядоченной гибели клетки. Каспазы обладают редкой субстратной специфичностью, гидролизуя белки-мишени после остатка Asp (D), расположенного в определенном аминокислотном контексте. Для того, чтобы избежать преждевременного срабатывания механизма клеточной гибели, каспазы синтезируются и хранятся в цитоплазме клетки в виде неактивных предшественников - прокаспаз. Активация прокаспаз, заключающаяся в их процесс инге с образованием протеолитически активных ферментов, происходит при получении клеткой определенных про-апоптотических сигналов.

В растительных организмах ПКС также играет важную роль, и морфологические признаки ПКС растительных и животных клеток имеют целый ряд общих черт. Поэтому было полной неожиданностью обнаружить (путем секвенирования геномов растений), что растения не содержат генов каспаз (и, соответственно, самих этих протеолитических ферментов). Возникла дилемма: либо принцип специфической фрагментации белков-

мишеней после остатка D не работает при ИКС растений, или же роль каспаз в ПКС растений играют другие, структурно отличные от каспаз протеазы. Экспериментальные данные, полученные в течение последнего десятилетия, показывают, что правильным является второй сценарий. Это, в свою очередь, остро ставит вопрос: какие именно протеазы растений обладают специфичностью каспаз и ролью каспаз в осуществлении ПКС у растений.

В настоящем обзоре будут рассмотрены механизмы апоптоза в клетках животных, функционирующие с участием каспаз, и будут описаны основные участники процесса ПКС. Затем мы рассмотрим сходства и различия в проявлениях ПКС у животных и растений и приведем современные представления о протеазах растений, которые могли бы выполнять роль каспаз при ПКС в растительных организмах. Наконец, поскольку открытая в данной диссертационной работе апоптотическая протеаза растений является субтилизин-подобной протеазой (субтилазой), в заключительной части обзора собрана и проанализирована современная информация о субтилизин-подобных протеазах растений.

1. Апоптоз в клетках животных: программированная клеточная смерть с участием каспаз

Термин апоптоз впервые появился в 1972 году для обозначения вида гибели клеток животных, сопровождающейся фрагментацией геномной ДНК [1]. Кроме фрагментации ДНК, отмечались такие морфологические признаки, как конденсация цитоплазмы и хроматина, округление клеток, вспучивание мембраны, разрушение цитоскелета и, наконец, образование окруженных мембраной апоптотических телец, которые быстро поглощались макрофагами или соседними клетками без активного иммунного ответа [2]. Апоптоз, однако, оставался описательным термином до тех пор, пока молекулярно-генетические исследования механизмов программированной клеточной смерти у нематоды Caenorhabditis elegans не привели к обнаружению трех белков, обозначенных, как CED-3, CED-4 и CED-9 (cell death abnormal), ответственных за выполнение программы клеточной смерти С. elegans. Непосредственным

исполнителем апоптоза в этой тройке явился СЕБ-3 [3]. СЕБ-4 оказался проапоптотической адапторной молекулой, необходимой для активации СЕБ-3 [4]. СЕБ-9 оказался ингибитором апоптоза, предотвращающим взаимодействие СЕБ-3 и СЕБ-4 [5,6].

Переломным моментом в исследовании механизмов программированной клеточной смерти оказался 1993 год, когда было обнаружено, что СЕБ-3 является гомологом незадолго до этого идентифицированной высокоспецифичной протеазы человека - интерлейкин-1 р-конвертазы (этот фермент позже получил название каспаза-1) [3,7-9]. Так впервые возникло представление о том, что существенную роль в ПКС могут играть специфичные протеазы. И действительно, СЕБ-3 оказался цистеиновой протеазой, собственно и ответственной за гидролиз клеточных белков, приводящий к гибели клеток. Позже в клетках млекопитающих были определены гомологи и других СЕБ-белков. СЕБ-9 оказался аналогом белков семейства Вс1-2 [10], а СЕБ-4 - аналогом белков АраМ/МСЮ-Нке рецепторов (см. ниже) [11,12]. СЕБ-3, как уже говорилось, оказался аналогом каспаз. Суперпродукция каспазы-1 человека (гомолога СЕБ-3) в клетках млекопитающих, действительно, приводила к апоптозу [9]. Это послужило толчком в исследованиях в этом направлении, и вскоре в клетках млекопитающих было обнаружено целое семейство каспаз. В настоящее время описано 11 каспаз человека и 10 каспаз мышей.

Структура и специфичность каспаз

Ряд особенностей отличает каспазы от других протеиназ. Как следует из названия, это цистеин-зависимые аспартат-специфичные протеиназы. Как и большинство протеиназ, они синтезируются в виде неактивных предшественников, содержащих продомен. Каспазы активируются в ходе процессинга, при этом утрачивается продомен, а основная часть белка расщепляется на две субъединицы - р20 и р10 (Рис. 1). Активный фермент представляет собой гомодимер, где каждый мономер состоит из одной цепи р20 и одной — р 10. Комплекс формирует два симметричных активных центра. Каталитическая диада представлена аминокислотными остатками цепи р20 и состоит из остатка цистеина �