Характеристика протеолитических ферментов протеазы В и протеазы С и их ингибиторов из семян хлопчатника тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

рга ог

- а шг? шве

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

имени академика САДЫКОВА А. С.

На правах рукописи

КАСЫМОВА ТАМАРА ДАРХАНБАЕВНА

УДК 577.156

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРОТЕАЗЫ В И ПРОТЕАЗЫ С И ИХ ИНГИБИТОРОВ ИЗ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА

02.00.10 — Биоррганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТАШКЕНТ - 1996

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте химии растительных веществ АН РУ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук профессор ЮЛДАШЕВ П. X.

доктор химических наук, профессор А. А. САДЫ КО В,

доктор биологических наук, профессор К. Д. ДА В РА НОВ

Институт биохимии

Защита диссертации состоится «17» сентября 1996 г. в /3 часов на заседании Специализированного Совета Д 015.21.01 при Институте биоорганической химии им. акад. Садыкова'А. С. ,АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, ул. X. Аб-дуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБОХ АН РУз.

^^¿^Ал/ ^еелам

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор химических наук ЛЬ Ос^СС^у Н> И БАРАМ

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена изучению протеолитическюг ферментов и белковых ингибиторов этих ферментов из семян хлопчатника, для которых разработаны методики выделения в гомогенном состоянии. Проведена ферментативная характеристика цистеиновой прс-теазы З.сериновой протеазы С и показано участие ферментов в процессе деградации глобулинов семян хлопчатника и участие ингибиторов в регулировании ферментативных процессов.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Цротеолитические ферменты играют важную роль в процессах биосинтеза и деградации запасных белков. От того насколько быстро и полно будет протекать этот процесс зависит всхожесть семян и развитие растения. В связи с этим выделение, изучение, идентификация протеаз,выяснение их роли при деградации запасных белков и установление структурно-функциональных параметров позволит изучить -процесс протеолиза.

Известны несколько возможных механизмов регулирования проте-одитической активности и один из них связан с присутствием в семенах белковых ингибиторов протеаз.

У высших растений белки-ингибиторы, кроме участия в регуляции активности собственных ферментов,д ряде случаев могут выполнять защитную функцию,нейтрализуя активность протеаз из патогенных микроорганизмов.

В связи с этим актуальным является сравнительное изучение протеаз и их ингибиторов в здоровых и зараженных вшггом семенах хлопчатника Это позволит выяснить, какие изменения с ними происходят, выявить причинно следственные связи структуры и функции белков и послужит одним из подходов к пониманию их физиологических функций в растении.

СЕЛЬ РАБОТЫ состояла в получении высокоочищенньк ферментов цистеиновой протеазы В и сериновой протеазы С и их белковых ингибиторов из покоящихся семян хлопчатника, и исследовании ферментативных свойтв и функций этих ферментов и их ингибиторов в сернах.

В процессе работы выполнялись следующие задачи:

- разработка эффективных методов выделения и идентификации

протеолитических ферментов из семян хлопчатника,

- определение физико-химических и структурных характеристик выделенных протеаз. Анализ субстратной специфичности изучаемых протеолитических ферментов и особенности гидролиза белковых субстратов,

- сравнительное изучение протеолитической активности здоровых и заравэнных вилтоы семян хлопчатника,

- поиск природных ингибиторов исследуемых протеаз. Наделение, физико-химическая и биологическая характеристика и роль их в механизме защиты растения от заражения фитопато-геном, вызывающим вертициллезное заболевание хлопчатника.

НАУЧНАЯ ШВИЗНА. Впервые из семян хлопчатника выделены в гомогенном состоянии цистеиновая протеаза В, сериновая протеаза С и белковые ингибиторы этих протеаз. Показано, что протеаза В и протеаза С, покоящихся семян, принимают участие в деградации запасных белков только после предварительной' структурной модификации последних.

Цри заражении семян вилтом общая протеолитическая активность в них уменьшается, можно предположить, что это является ответом на внедрение патогена в растение, то есть увеличивается количество ингибиторов протеаз, которые прежде всего ингибирукгг свои собственные протеазы. В данной работе исследовано и доказано влияние ингибитора протеазы В и ингибитора протеазы С не только на собственные протеазы хлопчатника, но и на протеазы гриба УегЪ1с1Шшп с1аЫ1аз, что является веским аргументом в пользу участия ингибиторов протеаз в механизме защиты растения от поражения фотопатогеном.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ- Результаты работы представляет теоретический интерес с точки зрения понимания биологической роли протеаз, которые специфически расщепляет собственные запасные белки семян хлопчатника и тем самым наряду с другими ферментами участвует в запуске генетического аппарата растения на начальных этапах роста и развития растения.

Полученные данные, указывающие на роль ингибиторов протеаз в заяяте хлопчатника, шгут послужить базой в расшифровке защитного механизма и позволят использовать ингибиторы как биологическое средство зааяты не нарушалае экологи» и создать тронсформи-

- о -

роваяное растение более устойчивого к заболеваниям, путем клонирования гена ингибитора протеаз, тем сашы будут снижены потери урожая от инфекционных болезней.

АПРОБАДИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации были доложены на 11 Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов /Углич 1979/, 'Всесоюзном симпозиуме Химия белков и пептидов /Рига 1983/, Всесоюзном координационном совещании по вилту хлопчатника / Ташкент 1988/,IX Всесоюзном соведании по иммунитету растений к болезням и вредителям /Минск 1991/, V-ом Мэждуна-родном симпозиуме по вертициллиуму /.Ленинград 1990/, 1-ом Международном симпозиуме Зймия природных соединений /1994/, IY-om Мелщународном симпозиуме Protein Structure Function Relationship /Карачи,Пакистан 1995/.

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, литературного обзора .обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Содержание работы изложено на 120 страницах и включает 11 таблиц, 17 рисунков.

Список литературы состоит из 150 наименований.

ОСШЗИЫВ РдЗУД>ТАТН мссвдсадаш и ИХ ШЗНЕШЗ.

ЩЕЛЕВИЕ ПРОТЕАЗЫ В ИЗ ШКОЯПЩСЯ СЕШИ ХЛОПЧАТНИКА.

В покоящихся семенах хлопчатника присутствуют протеолитичес-кие ферменты, действующие в широком интервале рН с тремя максимумами: рН 2,8-3,0: 4,5-5,0: 9,0-9,3 / Кученкова Н. А. 1981/

Уножгственный состав протеолитических ферментов в сешнах является отражением разнообразных функций ферментов, основной из которых является способность гидролизовать запасные белки.

К началу наших исследований в литературе не бьио сведений о выделении гомогенных протеолитических ферментов ив покоящихся семян хлопчатника. Вследствии этого на первом этапе исследования наш была разработана методика получения гомогенного прстеолити-ческого фермента Исходным сырьем для выделения фермента служили измельченные и обезжиренные ацетоном и эфиром семена хлопчатника сорта Тгшкент-1. Очистка фермента иллюстрируется табл. 1 я рис. 1,2.

- б -

Таблица 1

Выделение протеазы В иг покоящихся семян хлопчатника.

Этап очистки Обьем Общий Общая Удельная Выход

мл белок активность активност X

ыг ед. актив. ед/г

Экстракция обез-

жиренного порошка

0,1м фосфатный

буфером,рН 7,4 500 5400 5400 1

Осаждение суль-

фатом аммония

602-ное насыще-

ние. 175 675 2308 3,42 100

Хроматография

на КМ-целлюло-

зе, (Н-фракия) 75 . 63 2091- 33,2 ю •

Гельфильтрация 2000 40,0

на акрилексе П-10 50 50 7

на сефадексе 6-75 5 10 1280 128,0 1,5

Белковая фракция,, полученная при 0-60% насыщении экстракта сернокислым аммонием, обладающая протеолитической активностью, была разделена на колонке с КМ-целлюлозой. Злюция велась 0,01 Ы ацетатным буфером рН 5,4 при использовании ступенчатого градиента с возрастающей концентрацией от 0,1 до 1 И КаС1. Наибольшей про-

Е280

250 300 N фракций

Рис.1 Хроматография на колонке (6x36 см) с КМ-целлюлозой.

Протеолитическая активность (---) и концентрация

белка (-) определялись в кавдой фракции.

20 40

В 280 0,8

0,6

0,2 + 0 о

10 30

50

N фракций

80 100

N фракций

Рис.2 Хроматографическая очистка протеазы &

А - гельфильтрация на колонке (5,0x90 сы) с акрилексом П -10, В - гельфильтрация через сефадекс G-75 на колонке (0,7x35 см), элювдю вели ацетатным буфером рН 5,5. теолитической активностью, обладала фракция II, количественный выход

которой по белку составлял 5%. Дальнейшая очистка этой Фракции, представлявшей собой раствор, содержащий пигменты и низкомолекулярную примесь, осуществлялась на акридексе П-10 и затемна сефадексе G-75. Еыделенный фермент был назван протеазой В.

В серии экспериментов было замечено, что при гельфильтрации протеазы В на сефадексе G-75 (рис.3) в присутствии денатурирухших агентов ' на профиле злюции появлялся, второй пик с.меньшей молекулярной массой. Количественное соотношение пиков не было постоянным зависело от длительности инкубации фермента в IX SDS или 8М мочевине, продолжавшейся от двух до шести часов, при температуре 45 С. Аналогичную картину мы наблюдали при электофорезе в 7,52-ном полиакриламидком геле . На электрофореграмме протеаза. В обнаруживалась а виде одной полосы в средней части геля. Инкубация фермента в растворе SDS перед электрофорезом приводила к снижению интенсивности окрашивания белковой. полосы в средней части геля, и к полному ее исчезновению при пяти часовой инкубации и возрастанию интенсивности окраски белковой полосы в нижней части геля, данные приведены на рис.3.

1,040,8-0,6-0,4 0.2-

-С

-В

1¡r

50 N фракций Рис. 3 Гельфильтрация на колонке с сефадексом ti-7'ü.

Элюция О,Olli ацетатным буфером pH 6,5 (-),злюция

О,IX SDS (---). а,б и в злектрофоретические диаграммы протеазы В в наживном состоянии и после инкубации в SDS 2 и 4 часа соответственно. Протеолитическая активность, определенная после удаления SDL*

В

иа раствора, присутствовала в обоих фракциях. Полученные результаты можно объяснить склонностью белков и ферментов к взаимной агрегации и ассоциации между собой, а также с другими белками и пигментами. Добавление 2-меркаптозтанола в раствор фермента и последующий электрофорез в присутствии диссоциирующих агентов не изменили электрофореграмму, что указывает на отсутствие дисуль-фидных связей между полипептидными цепочками.

5 10 15 20 N фракций

Рис. 4 Иэоэлектрическое фокусирование протеавы В в борат полиольной системе в градиенте ры 3,5-8,0.

" Таблица 2

Аминокислотный состав протеазы В и протеазы С.

Амино- кислотный .. Число остатков на 1 моль бел.

остаток

Цротеаза В Протеаза С

Аэр 28 35

ТЬг 13 16

Бег 21 17

Щи 60 • 63

Рго 8 14

61у 25 22

А1а 19 13

1/2 Суз* 2 6

Уа1 14 10,

1 4

Не 10 7

Ьеи 18 15

1Б 9 8 8 7

Н1з 7 6

иуБ 16 21

Аг? 15 18

* - определено после окисления надмуравьиной кислотой

Совокупность приведенных данных позволила сделать заключение

о том, что протеаза В семян хлопчатника является димерным белком, состоящим из двух каталитически активных мономеров. Do данным гельфильтрации и электрофореза в присутствии маркерных белков молекулярные массы мономера 36000 Да. и димера 72000 Да.

Структурные исследования протеазы В проводили классическими методами белковоа зимии. Изозлектрическая точка протеазы В р1-=5,7, определена методом изоэлектрофокусирования в боратполи-ольной системе в градиенте pH от 3,5 до 8,0. (Рис.4)

В качестве N-концевой аминокислоты фермента методом дансилирования идентифицирована аминокислота аланин, а С-концевой аминокислотой, определенной методом ферментативного расщепления карбоксипептидааой и гидрозинолиза является глицин.

Анализ аминокислотного состава протеазы В хлопчатника, представленный вше, выявил высокое содержание дикарбоновых аминокислот и глицина, что является характерным для протеаз из растительных источников, з также еерина и изолейцина.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕАЗЫ Е Каталитическая активность протеазы В определялась по способности фермента гидролизовать белковый субстрат - гемоглобин денатурированный 8М мочевиной, йзучая влияние рН на активность протеазы В, мы использовали широкий интервал рН от 2,0 до 9,0. При этом было обнаружено, что протеаза В обладает высокой активностью в области рН 4,0- 6,0 с максимумом при рН 5,0 (Рис. 5).

Е550

Рис.5

Зависимость протеолитической активности протеазы В от рН раствора (а) и температурная зависимость скорости гидролиза субстрата протеазой В (в)

Данные приведенные на рис.'5 свидетельствуют также, что мак-

сиыальная активность фермента наблпдается при температуре 371 40°С. Раствор фермета, подвергшийся замораживанию практически не утрачивал свои гидролитические свойства, в то время как протео-литическая активность протеазы В после лиофильной сушки существенно уменьшалась. Потеря активности в разных партиях выделенного фермента составляла от 10 до 30 %.

Таблица 3

■ Влияние некоторых эффекторов на активность протеазы В* семян хлопчатника .

Эффектор

Концентрация мМ

5x10"? 1x10'1 2x10" | 5x10"? 1x10"? 5x10, 1,2x10 | 1x10 2

Активность % от контроля

2-меркаптоэтанал ЗДТА

Диизопропилфторфосфат Цистеин

П-хлориеркурибензоат Соевый ингибитор Дит^отрейтол

116 106 100 400 О 96 460 О

* концентрация протеазы В 0.05 мг/мл, удельн. актив. 128 ПЕ/мг

Принадлежность протеазы В к цистеиновому классу протеаз была выявлена после действия на нее ряда эффекторов.

Как видно из таблицы 3, активность протеазы В полностью подавлялась п-хпормеркурибензоатсш, ингибитором цистежовых протеаз. В то же время под действием цистеина и дитиотрейтола протео-литическая активность фермента увеличивалась в четыре раза. Последнее указывает на то, что в каталитическом центре фермента ищется сульфгидрильная группа, на которую действуют указанные БН-реагенты. Диизопропилфторфосфат, а ' таете соевый ингибитор трипсина не изменили активности протеазы В, что исключает принадлежность ее к сериновьш протеазам.

Таким образом, согласно полученным данным протеаза В, выделенная из покоящихся семян хлопчатника, является цистеиновай протеазой.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТЕАЗЫ С ИЗ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА.

Анализ литературных данных показал, что в сейшах содержатся протеолитическне ферменты всех классов протеаз н все они участвуют в процессе гидролиза заласныхбедаов при прорастании

Наиболее изучены строение и функции серйновых протеаз . Поэтому целью нашей дальнейшей работы.было выделение и очистка сери-новой протеазы из покоящихся семян хлопчатника' сорта-- Ташкент-!. Начальным этапом при выделении сериковой протеазы явилось изоэ-лектрическое осаждение балластных белкев из экстракта обезжиренного порошка. Плученный концентрат содержал значительное количество пигментов и других белковых веществ, частично избавиться от которых позволил метод фракционирования путем высаливания сульфатом аммония до 7035-ного насыщения. Осадок растворяли в 0,01Н

фосфатном буфере рН 7,4 .содержащим Не2* (1х10"*М) и ЗДТА (1х10"4М). Присутствие ионов в растворе блокировало активный центр цистеиновых протеаз, а ЗДТА - металлопротеаз и при хроматографии на аффинном сорбенте они элюировались исходным буфером.

Хроматографию осуществляли на аффинном сорбенте бацитрацин

IM NaCl f IM NaCl+20% изопрападал

100 200 300 400 500

V мл

Рис.3 Хроматография на колонке <3,0x15 см) с бацитрацин-силохраиом. Стрелками обозначено начало элюции фосфатным буфером pH 5, б, содержащим IM ЛаС1 и 1Ы NaCl+ 20% изопропанола.

силахроме, который обладает широкой специфичностью к различным сериновым, аспарагиновым и металлопротеазам. Лиганд антибиотик-

полипептид бацитрацин содержит ряд остатков гидрофобных аминокислот, которые влияют на образование фермент-субстратных комплексов, а присутствие ЕЪизомеров аминокислот делает антибиотик устойчивым к действию большинства протеолитических ферментов.

На рисунке 6 приведены результаты хроматографического разделения на бацитрацин-силохроме.

лПротеолитические ферменты экстракта семян хлопчатника, внесенные в колонку распределились следующим образом. Фракция I не связавшаяся с сорбентом, по данным электрофореза 7,5ХПААГ состояла из трех белковых компонентов и обладала относительно низкой протесшитической активностью. Фракция III не обладала протеолити-ческой акивностью и содержала низкомолекулярные белки или пептиды и свободные аминокислоты. Фракция II, содержащая сериновую протеа-зу, сгущалась на мембранном фильтре ФМО-2, освобоадаясь при этом от низкшолекулярных примесей. Концентрированный раствор диализо-вали против дистиллированной воды и дальнейшую очистку осуществляли хроматографией на дефадексе 6-75. При этом было получено два белковых пика, но только второй обладал протесшитической активностью. Полученный.индивидуальный фермент, гомогенность которого подтверждена "Ёезультатами электрофореза, назван протеазой С. Молекулярная масса ее, определенная методом гельфильтрации и электрофореза в присутствии белков-маркеров составила 32000 Да.

Молекула фермента состоит из одной плипептидной цепи, Оконце-вой аминокислотой протеазы С, определенной методом Грея-Хартли с получением дансилпроизводной аминокислоты, является фенилаланин. С-концевая аминокислота - лейцик - обнаружена методом расщепления карбсксипептидазой А . Определен аминокислотный состав фермента, в котором следует отметить высокое содержание остатков глютамино-вой и аспарагиновой кислот, глицина , а также лизина , аргинина и цистеина / Табл. 2/. Такой набор аминокислот определяет относительную устойчивость белковой молекулы и ферментативные свойства.

«ИЗИКО-ШИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПРОТЕАЗЫ С СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА.

Фермент достаточно термостабилен, сохраняет активность при нагревании до 80°С: максимальное значение его наблюдалось при 45°С при использовании субтрата аэоказеина (Рис. 7а). Для определе-

ния ormoiyucm рН использовали ацетатный (рН 3.6-5,8) и фосфатный

Е440 0.4 0.2

25 50 75 900 с 4? ф 'р ^ 2 4 6 J ц

Рис. 7 Зависимость протеолитичекой активности протеазы С от температуры (а). рН раствора (б) и времени протекания реакции (в).

(рН 4,0-8.2) буферы, данные представлены на рис. 76. Протеаза С проявляет максимальную степень гидролиза субстратов гемоглобина и азоказеина при одинаковом значении рН 5,8. Линейная зависимость скорости гидролиза субстрата протеазой С от времени протекания реакции, показанная на рис.7в.

Данные о действии ингибиторов и активаторов на протеазу С приведены в таблице 4.

Активность протеазы С полностью подавлялась диизопропилфтор-фосфатом - реагентом, блокирующий остаток серина в активном центре сериновых протеаз. П-хлормеркурибензоат и соединения ртути не влияли на активность фермента, что исключает принадлежность его к классу цистеиновых протеаз. Белковые ингибиторы трипсина и химот-рипсина овомукоид и соевый ингибитор, а также специфичный для этих ферментов ингибитор ТРСК через 30 минут инкубации с протеазой С подавляли ее активность на 20-30%.. Ингибитор из картофеля, являвдися ингибитором широкого спектра действия, подавляющего активность сериновых протеаз, на 7055 подавлял активность протеазы С. ЗДТА не ингибировал фермент, однако при исследовании влияния ионов металлов отмечено, что в присутствии Са2+ активность протеазы С сохранялась длитатьно (72 часа), в то время как ферментный раствор терял активность на 85% через 36 часов, при хранении при температуре 20° С. Возможно ионы Саг+ оказывают стабилизирующее действие на нативнув структуру фермента.

Таблица 4.

Влияние некоторых ингибиторов и активаторов на протеоли-тическую активность протеазы С*

Реагент

Концентрация в смеси, М.

1x10 Л

1,5x10", 1,2x10"? 2,6x10"!

5x10 |

3.8x10"® 1x10"? 5x10" к Зх10"| 3x10

Остаточная активность в %

^иизопропилфторфосфат

Цистеин Глк

Щ

глютатион ТРСК

Овомукоид(утиный) Соевый ингибитор трипсина рт$еля,+ ¿п

Ингибитор из. кар! Fe .Си .СгГ , k

0 100

105 97

100 104

106 75 80 70 30

100

»-Концентрация 0.05 мт/мл, удельная активность 150 ПЕ/мг

Способность протеазы С гидролизовать синтетические субстраты п-нитроанилиды пептидов изучена при использовании L-Ala-L-Ala-L-Leu-pNA, L-Ala-L-Gly-L-Leu-pNA, L-Gly-L-Gly-L-Leu-pNA. Протеаза С хорошо гидролизовала L-Ala-L-Ala-L-Leu-pNA, являющийся специфическим сбстратом сериновых протеаз субтилизинового типа.

Данные полученные при определении специфичности фермента доказывают, что выделенный протеолктический фермент - протеаза С -относится к классу сериновых протеаз.

НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИИ ПРОТЕАЗЫ В И ПРОТЕАЗЫ С В ПОКОЯЩИХСЯ СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА.

В экспериментах in vitro мы обнаружили, что протеаза В и-протеаза С не гидролизуют нативные запасные белки семян хлопчатника HS и 7S глобулины, в отличие от протеазы А. /Межлумьян Л. Г. 1985/ выделенной также из семян хлопчатника. Однако изменения в структурной организации белковых молекул IIS и 7S глобулинов под действием 0,1% SDS , 8М мочевины, или нагревание до 100° С в течение 30 минут, изменяют конформацию молекул запасных белков и делают их доступными для гидролиза протеазой С и протеазой С. На хроматограммах гидролизатов в тонком слое целлюлозы FND мы обнаруживали наличие пептидных пятен.: число которых зависело от времени гидролиза (Рис. §)

с

15 -В

©

Зч 5ч 18ч Зч 5ч 18ч

Рис.8 Хроматограммы гидролизатов US глобулина протеазой С (с) и протеазой В (в).

Полученные результаты позволяет предположить, что протеазы В и С участвуют в процессе расщепления запасных белков хлопчатника после их модификации под действием других ферментов, нарушающих конформационное строение глобулинов семян хлопчатника при прорастании семени.

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ЭКСТРАКТАХ ЗДОРОВЫХ И ПОРАЖЕННЫХ ВИЛТОМ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА.

При исследовании протеолитической активности семян хлопчатника сорта Ташкент-1 было замечено, что активность в пораженных вилтом семенах намного ниже, чем в здоровых. При 50% поражении растения вилтом в семенах активность протеолитических ферментов сохраняется только на 10-20%. Для выявления качественного изменения в составе протеаз семян . собранных с растений зараженных вилтом на 50% по сравнению с семенами здоровых растений мы провели разделение суммарных белковых экстрактов на колонке с ДЗАЗ-цел-лвлозой и определили протеолитическую активность в вымываемых фракциях . (Рис.9). Графики разделения суммарного белка,получнного из здоровых (а) и пораженных вилтом.(б) семян относительно близки, тогда как графики проявления протеолитической активности резко различаются. В экстракте, полученном из зараженного растения, фракция А2 отсутствует, а А1 сохраняется только на 20% по сравнению с данными, полученными для здоровых семян.

Следовательно, в семенах относительно устойчивого сорта Таш-

кент-1 наблюдается уменьшение протеолитической активности ори поражении растения вилтои.

20 40 60 20 40 60

Ыфракции Ыфракции

Рис. 9 Разделение суммарной белковой фракции из здоровых (а) и пораженных вилтом (б) семян хлопчатника.

Можно предположить, что в ответ на внедрение патогена в растение, увеличивается количество ингибиторов протеаз, которое прежде всего ингибируют свои собственные протеазы, чем и обьясня-ется резкое уменьшение протеолитической активности. В зараженных семенах хлопчатника сортов Ташкент-1, Ташкент-б и С9063 была обнаружена разная степень уменьшения протеолитической активности. Очевидно это связано с различием в степени устойчивости этих сортов к поражению вилтом. Чем вше устойчивость растения, тем большее количество ингибитров синтезируется в нем в момент внедрения патогена, тем ниже протеолитическая активность ферментов.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗЫ В И ПРОТЕАЗЫ С . ИЗ ЗДОРОВЫХ СЕЭШ ХЛОПЧАТНИКА.

На основе проведенных исследований по выделению и очистке ингибиторов протеазы В и протеазы С из -обезжиренного хлопкового порошка нами разработана схема получения ингибиторов, включающих шесть стадий очистки. Последним этапом является высокоэффективная очистка на аффинных сорбентах, синтезированных нами путем активирования сефарозы 46 ВгСЫ и присоединения протеазы В или протеазы С соответственно.

•Гомогенность полученных препаратов ингибиторов протеазы В и протеазы С определяли гельфильтрацией на сефадексе Б-75 и электрофорезом в 7% ПААГ в трис-НС1 буфере рН 8,2,содержащем 0,01% 505. На электорсфореграммах бедки-ингибиторы обнаруживались в виде мфашенных полос,злекгрофоретическая подвижность которых в

присутствии белков- калибрантов соответствовала белкам с молекулярной массой 12000 и 17000 Да.

СХЕМА

ВЫДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗЫ В И ПРОТЕАЗЫ С ИЗ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА Хлопковая мука °

Экстракция 0.1М фосфатным буфером рН 6,5 соотношение 1:5, 16 ч. Экстракт

(Центрифугирование 20 мин,6000 об/мин

Раствор

Раствор

Высаливание до 802-ного насыщения, - центрифугирование, 6000 об/мин

Неактивная фракция

Осадок

|Растворение в воде, диализ Раствор

|Изоэлектрическое осаадение |рН 4,0-4,5 .центрифугирование Осадок

Растворение в 0.1М фосфатном буфере рН 7,0 , диализ.

Раствор

-(Гельфильтрация на акрилексе П-10

Активная фракция (Сумма ингибиторов протеаз СИП)

Хроматография на аффинных сорбентах Щхэтеаза В-сефароза 4В Протеаза С-сефароза 4В

*

ингибитор протеазы В

-1 •

ингибитор протеазы С

Определены аминокислотные составы ингибитора протеазы В и ингибитора протеазы С, в которых следует отметить присутствие большого количества дикарбоновых аминокислот и глицина, а в молекуле ингибитора протеазы В относительно большое количесто цистеина, с которым отчасти связана устойчивость ингибитора протеазы В к различным воздействиям, таким как высокая температура и крайнее значение рН -раствора, о чем свидетельствуют данные приведенные в

таблице 6.

•20 -• 40 60 -• 80 -100

V Фракций

Рис.11 Аффинная хроматография ингибитора протеазы С семян хлопчатника. Условия элвирования: 1- О,1И ацетат аммония рН 7,5 ,2- 0,1М ацетат аммония, содержащий 0. ЗМ ИаС1. 3- 0,1М ацетат аммония, содержащий 0.5М НаС1 и 0,2М СНЗСООН, рН 2,5

Таблица 5

Аминокислотный1 'состав ингибиторов протеазы В и протеазы С.

АК-остаток " Число остатков на молекулу белка

Ингибитор протеазы В|Ингибитор протеазы С

квр 18 21

ТЬг 2 — ■

Бег 5 8

Ии 18 23

Рго 3 и

?1у • 8 19

А1а ' 8 12

1/2Сув* 8 2

Уа1 8 7

Ме! 3 1

Не 4 8

Ьеи 8 И

Туг 7 в

Рпе 6 И

Н1б 5 8

Ьу5 6 7

Агк 5 в

Общее число остатков 114 158

Молекулярная масса 12300 17170

*- определена после окисления надиуравьиной кислотой

Таблица 6

Влияние факторов на активность ингибитора протеазы В

Фактор Условия обработки Остаточная актив. %

Нагревание до 80-С 1 час.фосфат.буф.рН 7.4 100

Нагревание до 100С 15мин фосфат, буф. рН 7,4 94

ОДЫ Ш1 3 часа, 18 С 100

0.1М ЫаОН 3 часа, 18 С 100

12 Ж-На 24 часа 20 С, рН 7,6 98

6 мочевина 24 часа 20 С, рН 7,4 100

ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА.

Ингибитор протеазы С семян хлопчатника подавлял протеолити-ческую активность трипсина, протеазы С семян хлопчатника,химот-рипсняа.а тага® активность протеаз мицеллия гриба УегисШ1шп ааЬНае. Как видно из приведенного графика (Рис. 12),линейный характер ингибирования сохранялся для трипсина до 201 подавления активности, для химотрипсика, протеазы.С и протеаз экстракта мицеллия Уег.йаЬНае до 27,40,42% соответственно. Концентрация ферментов в приведенном опыте составляла 0,1 мг/мл, а молекулярные массы белковых молекул известны, сопоставляя эти значения с величинами молекулярных масс расчетали мольные соотношения взаимодействующих молекул. Один моль трипсина связывает 2,88 моля ингибитора протеазы С,один моль химотрипсина 3,8 ингибитора протеазы

Рис. 12 Действие ингибитора протеазы С семян хлопчатника на активность трипсина (1),химотрипсина( 2),протеазы С(З), .протеаз экстракта мицеллия УегисИПшп с1аМ1еа(4).

С а один моль протеазы С связывает 2 моля собственного ингибитора.

В аналогичном эксперименте с ингибитором протеазы В было определено, что один моль протеазы с связывает 2,6 моль собственного ингибитора, а моль папаина взаимодействует с 1,7 моль ингибитора протеазы В. Результаты этих экспериментов показывают поливалентный характер взаимодействия ингибиторов протеаз В и С. Такими же свойствами обладают ингибитор трипсина из семян злаковых н фасоли /Шульгин. 1985, Федуркина 1983/ и семян риса /Векег 1989/.

Определение остатков Arg и Lys в активном сайте ингибитора протеазы В и ингибитора протеазы С проводили действуя малеиновым ангидридом и 1,2циклогександиолом на молекулы ингибиторов. Активность ингибитора протеазы С резко падала под действием 1,2 цикло-гександиола, а активность ингибитора протеазы В оставалась без изменений. Данные о свойствах ингибитора протеазы С сопоставимы со свойствами ингибиторов трипсина из семян ржи,пшеницы, тритикале являющимися ингибиторами трипсина типа Кунитца.

Таким образом, в семенах хлопчатника содержатся ингибиторы белковой природы , способные подавлять активность сериновых и цис-теиновых протеаз как животного происхождения так и собственных протеаз и протеаз.патогенных грибов, вызывающих вертициллезное заболевание хлопчатника. Следовательно, они могут принимать участие как в процессе регулирования ферментативных превращений, так и в защите семян от поражения фитопатогенными микроорганизмами.

вывода

. 1.Из покоящихся семян хлопчатника впервые в гомогенном состоянии выделены четыре белка, два протеолитических фермента и.два белковых эндогенных ингибитора этих протеаз:

2.Показано, что протеаза В является димерным белком с молекулярной массой 72000 Да. N-концевой аминокислотой ее является ала-нин, • а С-концевой аыинокислотой-глицин. Димер и мономер обладают каталитической активностью. Протеаза С - протеолитический фермент состоящий из одной . полипептидной цепи молекулярной массой 32000Да. N-концевой аминокислотой является фенилаланин. С- концевой аминокислотой- лейцин.

3. Проведено изучение ферментативных свойств, протеазы В и протеазы С. Доказана принадлежность протеазы. В к группе ; цистеино-

- 21 -

вых протеаз, а Протеазы С - к груше сериновых протеав.

4. Показано участие ферментов в деградации запасных белков IIS и 7S глобулинов после структурной модификации последних и в процессах заражения растения фитопатогеном VerticiIlium dah.

5.Разработана схема выделения знддгенных ингибиторов протеаз-В и С из здоровых семян хлопчатника.

Ингибитор протеазы С семян хлопчатника имеет молекулярную массу 17000 Да, а ингибитор протеазы В - 12000 Да. Белки-ингибиторы не имеют четвертичной структуры и каждый состоит из одной полипептидной цепи.

6. Изучено влияние ингибитора протеазы С и ингибитора протеазы В на собственные протеолитические ферменты семян хлопчатника. Доказано влияние ингибиторов на ферментативные процессы в семенах, а также на активность протеаз гриба Vertlcillium dahllas, возбудителя вертициллезного заболевания хлопчатника.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ-

1. Касымова Т. Д., Юлдашев П. X. Выделение протеазы В из семян хлопчатника //Химия природ, сое дин. - 1984, -N. 4 - С. 506-510.

2. Касымова Т.Д. .Кученкова U.A., Юлдатев IL X. Очистка и свойства протеолитического фермента семян хлопчатника. //Химия природ, сое дин. - 1985 - N. 2 - С. 276-279.

3. Гарцбейн И. И., Кученкова Ы А., Касымова Т. Д., Юлдашев П. X , Ахмедов К. X., Уэаков Т. II, Ким 3. Г. Изменение активности протеоли-тических ферментов.семян хлопчатника при заражении вилтом. //Химия природ, соедин. - 1987 - М.5 - С. 704-708,

4. Пгредерина Е. А., Касымова, Т. Д., Кученкова VL А., Юлдашев П. X. Действие некоторых пестицидов и стимуляторов роста на изменение протеолитической активности. //Узбекский биологический журнал .-1988 - N.5.- С.22-23.

5. Касымова Т.Д.,Юлдашев П.X. Физико-химические свойства и субстратная специфичность протеазы С из покоящихся семян хлопчатника.- // ХИМИЯ природ, соедин. - 1988 - N.5 - С. 744-746.

6. Касымова Т. Д., Абдурахманова К. А., Юлдашев П. X. Исследование протеаз и ингибиторов семян хлопчатника . // Материалы всесоюзного координационного совещания по вилту хлопчатника 1988 -Ташкент,

7.Касымова Т.Д. Абдурахыанова К.А. .Щдашев ИХ. Ваделение ингибитора трипсина из семян хлопчатника. //Химия природ, соедин. -1990 - N.1 - С. 134-135.

8. Касымова Т.Д. .Шдашев EX. Исследование ингибиторов проте-олитических ферментов семян хлопчатника // Химия природ, соедин. -1995 - N. 3 - С. 445-447.

9. Касымова Т. Д., Петросян JL Р., Кученкова Ц. А. .Юлдашев П. XL Еротеолитические ферменты семян хлопчатника.// Тезисы II Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Углич -1979.- С. 56.

10. Касымова Т.Д., Мгжлумьян Л.Г.,Юлдашев EX. Выделение протеолитических ферментов из семян хлопчатника .// VII Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов. Таллии - 1987.

11. Касымова Т. Д. ,Ыемумьян Л. Г. .Юлдашев ЕX. Ингибиторы проте-аз семян хлопчатника.// V Международный симпозиум по вертициллиу-му - 1990 - Ленинград.

12 .Касымова Т.Д., Межлуыъян ЛГ. .Юлдашев EX. Исследование ингибиторов' протеаз семян хлопчатника, зараженных вилтом.// IX Всесоюзное совещание по иммунитету к болезням. - 1991 - Минск

13. Yuldashev P. Kasimova T.D., tfezhlumyan L.G. .Abdurakft-manova К. A. Inhibitors of the cotton seeds proteases. //4- th International Synposiura of Protein Structure Function Relationship - Karachi - 1995

ХУЛХА

Т.Д. Касимова

Пахта $игитидав ажратиб олинган В ва С протеазалар ва улар ингибиторларининг тавсифи.

В ва С протеазаларини пахта чигитидан ажратиб олит б^йича маьлумотлар килтирилган. Ушбу о^силларнинг физик-кимевий хасолари, фермнтатив коссаларнинг тулик тавсифи берилган, уларнинг пахта чигити усиши жараенида хосил буладиган 11S ва 7S глобулинлар пар-чалакишида ишитирок этилш исботланган.

Олиб борилган тадкикотлар натижасида вилт Силан касалланган пахта чигитидаги протеолитик фаолликнинг каыайиши, уларда касал-ликка жавобан протеаза ингибиторлари мирорининг ошиши билан бог-лик зканлиги к^рсатилган.

Пахта чигитидан протеазалар ингибиторларини ажратиб олиш

схеыаси ишлаб чш^шган ва увда оксил кимёсининг аньанавий услуб-лари билан бир каторда прри даражада хал этувчи биоспецифик хроматография услуби ^улланилган. О^силларнинг тузилилишни тадарп^ этиш натишаоида уларнинг т$^ртламчи структутураси, аминокислота таркиби.Ы-ва С-учлардаги аминокислоталар аникланган.

Щютеааа икгибитбрлари устида олиб борилган тадкикотлар нати-жасида уларнинг усимликни патоген микроорганизмлардан кимол фшпп механизмида иштирок зтипшари урганилман. Ажратиб олинган ингиби-торлар нафакат уз протеазалариги, балки вертициллиум микроорга-низмининг протеазааларига хам таьсиф этади. Бу эса ингибиторлар-дан экологияга таьсир этмайдиган ва трансфориацияланган касаллик-ка чидамли усимлик яратишда биологик' восита сифатида фойдаланишга имкон бе ради.

Бшяпагу

Т. D. Kasirova

Characteristics of Protease В and Protease С and Their Inhibitors from Cotton Seeds.

In the dissertation there are given the date on the isolation of two proteolytic enzimts protease A and protease В . Their physicochemical properties were studied, complete characteristics of fermentative properties of protease В and protease С were given, ferment participation in degradation process of storage proteins US and 7S globulins under seed germination was proved.

In cotten seeds infected by bacterial wilt the ferment proteolytic activity is very low. It was shown by us that proteolytic activity decrease in cotton infected seeds connected with content increase of protease inhibitors which were synthesized in answer to plant infection by a phytopatogen.

Isolation scheme of protease В and С inhibitors from cotton seeds was carried out in which together with the traditional methods of protein chemistry the higly sensitive method of biospeoific chromatography was applied. Structure studies were carried out on the basis of which the quaternary structure was established, amino acids conposition.

The homogenety of isolated proteases and.their inhibitors was convincingly shown by a nuirber of methods.

Detaled study of protease inhibitors and their particihation

in the mechanism of plant protection from phytopatogenic microorganism infection was carried out. Isolated inhibitors influence not only on cotton itself proteinases but on the proteases of Verticillium fungus. This will allow to use the inhibitors as biologicfl protective agents not disturbing the ecology and to create transformed plant more stable to the diseases by gene cloning of protease inhibitor.