Реакционный центр CHLOROFLEXUS AURANTIACUS: изучение топографии, структурно-функциональных особенностей и природы термостабильности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ВИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМКИ им.М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи УДК 577.112.5

КУТУЗОВ Михаил Александрович

РЕАКЦИОННЫЙ ЦЕНТР СИШВОНЕШБ АИШПЛСиЗ: ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГРАФИИ, СТРУКТУРНО-ШШИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ И ПРИРОДЫ ТЕРМОСТАБМЛЫЮСТИ

С2.00.10 - Еиоорганичоская химия,

химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ : диссертации на соискание ученой степени кандидата. штческит наук

МОСКВА -.1390

Работа выполнена в Институте Оиоорганической химии имени М.М.Шемякина Академии наук СССР

Научный руководитель-доктор химических наук Н.Г.Абдулаев

Официальные оппоненты: доктор химических наук О.Г.Чахмахчева доктор биологических наук И.Д.Волотовский

Ведущая организация - Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР.

.Д. >/ илАуЧ ми.

Защита состоится "26" декабря 1990г. в /0 чао. на заседании специализированного совета Д 002 35 01 по защите дис-

5

сертаций на соискание учбной степей! доктора наук при Институте Сиоорганической химии им.М.Ы.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП Москва-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться'^ библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякиня Академии наук СССР,

Автореферат разослан "Л:" 19Э0г.

Учёный секретарь специализированного соЕета кандидат химических наук

Ж А. НЕСМЕЯНОВ

Актуальность проблемы. Изучение фотосштвтического аппарата зелбной термофильной бактерии Chloroflexus aurontlacua представляет интерес с различных точек зрения. Во-первых, О.аигап-tlocus относится к одной из древнейших ветвей эубактерий, и информация об организации его фотосинтетического аппарата существенна для понимания эволюции фотосинтеза. Во-вторых, фотосинтетический реакционный центр (РЦ) G.auront locus - наиболее просто устроенный ГЦ из охарактеризованных к настоящему времени - относится к так называемому хиноновсму типу, а, следовательно, может служить простейшей моделью РЦ фотосистемы II цианобакте-рий и растений. Кроме того, РЦ С.auront locus, обладая повышенной термостабильностью по сравнению с близкими к нему по структуре РЦ пурпурных бактерий, мог бы оказаться удобным объектом для изучения механизмов стабилизации пространственной структуры мембранных белков термофильных организмов.

1 Цель работы. Настоящая работа является частью программы структурно-функциональных исследований фотосинтетического реакционного центра зелбной термофильной бактерии Chloroflexus auront locus, проводимых в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР. Работа посвящена изучению роли N-koh-цеЕых областей субъединиц РЦ С.aurontlocus в функционировании и обеспечении тэрмостабилыюсти РЦ, а также их топографии с помощью ограниченного протеолиза РЦ протеазами различной специфичности в неденатурирующих условиях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен простой полуколичественный метод, .оценки термостабильности РЦ С.aurontlacua, который может быть применен в дальнейших работах по изучению термостабильности этого белка. Проведено сравнение термостабильности РЦ C.aurantlacus в различных детергентах и в искусственной мембране. С помощью ограниченного протеолиза получена информация о топографии N-концевых областей L- и М-субъединиц РЦ C.aurantlacus и их роли в обеспечении его тврмостабильности и функционирования. Полученные данные могут быть использованы в исследованиях природы термостабильности и молекулярных основ функционирования РЦ С.aurontiacus с помощью направленного мутагенеза.

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликованы дао статьи; материалы диссертации докладывались на V Международной конференции молодых учёных социалистических стран по биоорганичоской химии (Пущине, 1983 г.), симпозиуме "Молекулярная биология мембранных комплексов фототрофных бактерий" (Фрайбург, ФРГ, 1989 г.). Советско-Индийском симпозиуме "Регуляция фотосинтеза" (Пущино, 1990 г.) и VI Советско-Uioa¡»царском симпозиуме "Биологические мэмбраны: структура и функции" (Нев-шатель, Швейцария, 1990 г.).

ООъйм работы. Диссертация изложена на 88, страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литература, включающего Soi наименований. Работа содержит (Lj рисунков и 1 таблицу.

ВВЕДЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории было показано, что РЦ С.auront 1а-сиз состоит из двух гомологичных друг другу субъединиц (L и М), полные аминокислотные последовательности которых были определены с использованием методов белковой химии и генетической инженерии. На основании сходства организация цепи переноса электронов и гомологии L- и М-субъедишц РЦ С.curant lacua и пурпурных Оактерий (для двух видов которых известны пространственные структуры РЦ) hdmti была предложена'1йюдэль укладки в мембране полипзптидных цепей РЦ C.aurantlanun (Овчинников с соавт. [1988]; см. такке рис.2). Эта модель согласуется также с расчетами профилей гидрофсбности.

В Н-кониевнх гидрофильных участках обеих субъединиц РЦ С.auronttacus отсутствует значительная гомология с соответствующими участками РЦ пурпурных бактерий. Болео того, L-субъедани-ца РЦ С .auront lactia удлинена с N-конца приблизительно на 30 аминокислотных остатков. Напротив, сравнение аминокислотных последовательностей РЦ 4 видов пурпурных бактерий показывает высокую степень гомологии между N-концевыми участками одноименных субъединиц (особенно L-субъедшшц). На основании этих, данных можно предполагать, что отличия в первичной структуре К-конце-

Büx участков могут быть связаны с отсутствием в РЦ С .auront locus Н-субъединицы (в РЦ пурпурных бактерий она расположена с той m стороны мембраны, что и N-кощевые участки) или же с ка-1СИМИ--ТО другими отличительными чертами РЦ G.auront 1асиз, например, с его тормостабильностью.

Для выяснения возможной роли N-концевых участков РЦ С.'jurant locus, а также для изучения их топографии, мы использовали подход, основанный на отщеплении этих участков протеазами различной специфичности, идентификации точек расщепления и после-' дувшем тестировании полученных препаратов на термостабильность и транспорт электронов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЖЗ РЦ Ch'WROFMXUS MRANTIACUS

Для расщепления РЦ использовали следующие протеззы: трипсин, клострипаин, протеиназу из St.aureus V8, химотрилсин, термолизин и проназу Е. Первоначально для пповедения ограниченного протеолиза РЦ встраивали в азолектирсл.ые липосомы. Использовавшийся метод приготовления протеолипосом (постепенное удаление холата натрия из липид-детергентных мицелл диализом) давал липосомы с РЦ,.на 30-40% ориентированными акцепторной стороной (то есть N-концами) наружу. Однако из-за очень низкой скорости расщепления РЦ в протоолипосомах даже при таких фермент-субстратных отношениях, как 1:1 - 10:1 (по весу), и необходимости длительной инкубации с ферментом (деся;.к часов при 39°С) мы баш вынуждены использовать другой подход: проводить протеолиз РЦ, солюбилизированнсго в 50 мМ Трис-HGl, pH 9,0; 0,1% лаурил-диметиламин N-оксиде- (ДДАО). В этих условиях скорость протеолиза увеличивалась на 2-3 порядка.

Расщепление Щ проводили в темноте либо при комнатной температуре, либо при 37°С. За ходом реакции следили с помощью SDS-электрофореза; контролировали также спектры поглощения расщепляемого ГЦ. Все ферменты, за исключением химотрипсина, давали относительно стабильшо продукты расщепления с электрофоре-тическими подвижностями субъздиниц несколько выше, чем у субъе-

T CP Рг St Th LMWRC Ch TCP -—■- '■"■ - - -

Рис.1. БШ-^електрофорез продуктов ограниченного протеолиза FU C.aurantiaous. Условия протеолиза: 1,5 час, 37°С,. Обозначения протеаз: Т - трипсин; CP - клострипаин; Рг - проназа Е; St - протеаза из St.aureus V8; Th - термолизин; Ch - химотрип-син. XiMW - бёлки-маркеры молекулярной массы: 94, 67, 43, 30, 20 и 14 кДа; Р.С - исходный препарат РЦ. Фермент-субстратные отношения: Т - 1:5; CP - 1:30; Рг - 1:40; St - 1:10; Th - 1 :7; Ch -1:2. N-концевые аминокислотные Ьс^атки продуктов триптического гидролиза: А - Thr 1¡ ; Б - Ala Ii ;

дишщ исходного РЦ (рис.1). Эти продукты не расщеплялись далее при инкубации с соответствующими ферментами в течение нескольких часов при 37°С; в дальнейшем ми будем называть их "конечными" продуктами расщепления. Все ферменты давали одни и те же конечные продукты йри комнатной-температуре и при 37°С.

Ограниченный протеолиз РЦ не вызывал значительных изменений спектра поглощения, лишь поглощение мономерного бактериохлоро-филла (812 нм) за несколько часов инкубации с ферментом уменьшалось на 3-5% при комнатной температуре и на 5-10% (до 20-30% в случае гидролиза проназой и химотрипсином) при З'Рс. Однако

стабильность получаемых препаратов была заметно снижена: если исходный препарат ГЦ может храниться в темноте при 4°С в 0,155 ДЦАО при pH 9,0 несколько недель, то препараты после протеоли-зо - 1-2 суток. Протэолия приводил также к более быстрой денатурации ГЦ под действием света. При длительной инкубации (более 5 часоп при 37°С) РЦ с протеазами (кроме клострипаина и трипсина ) .наблюдалось постепенное исчезновение полос показанных на рис.1 продуктов расцепления РЦ, сопровождавшееся его денатурацией. Вероятно, при длительном протеолизе происходит расыеплэ-. нио молекулы РЦ в каких-то учьсткпх гидрофильных перетяжек между транс»тамбрашшми сегментами, приводящее к быстрой денатурации FU. Инкубация РЦ в aex же условиях, но без фермента, не вызывала его двнатурагца!.

Точки расщепления идентифицировали секвеюгоованием на газофазном секвеноторе либо смеси образовавшихся мембранных фраг-йентов РЦ после оиаадения их этанолом, либо индивидуальных Фрагмэнтоз после разделения SDS-электрофсрезом и переноса на псл5ш5ункетдэнлафтсридную (PVDF ) мембрану. Идентифицированные то'гки наиболее глубокого (с сохранением спектральных свойств РЦ) расщепления показаны на рис.2. Связь между Arg Ь~°и Т1гг L31 ргсг\еплплась трипсином лжаь в препаратах РЦ, выделенных из некоторых партий биомассы О.auront tacna; в большинстве случаев гидролиз тршсином приводил к образованию конечного продукта с N-кокцэвим остатком Ala I23. Причина этих различий неясна. Точка расцепления L-субъедагощы химотржняшом не сила идентифицирована из-за образования смеси нескольких продуктов. Интересно, что отщепление N-концевого участка L-субъедшшцы аномально влияло на её электрофоретическую подвижность. Так, если в результате обработки клострипаином реальные массы L- и М-субъединип умэчыяалчоь соответственно на 2,8 кДа и sa 2,0 кДа, то их кажущиеся молекулярные массы, определяемые по электрофоретической подаигкости. уменьшались на 9,5-10 кДа дая L- субъедкницы и на 1-1,5 кДа для М-субъедишщы.

С-концевые аминокислотные остатки идвнтифищгревгли методом гидразинолиза, а также с помощью карбоксипептидазы А (в последнем случае для увеличения выхода отщеплённых остатков отобелок

Рис.2. Модель укладки гтолштептидных цепей оубъедшпщ РЦ

Chloi-oflexus aurontiacus. Стрелки показывают идентифицированные

í i

точки наиболее глубокого расщепления ферментами. Обозначения г грот е.оз, как на рис.1.

РЦ предварительно иммобилизовали-«а активированном тяол-стек-ле). Результаты С-концевого .анализа' показали, что после обработки РЦ трипсином, клострипаином, протеазой из St.aureus V8 и термолиз1шом его С-концэвыми остатками являются Pro и Val, что свидетельствует о недоступности С-концевых участков обеих субъедшшц РЦ для этих ферментов. В препаратах, обработанных проказой и химотрипсином, обнаруживалось несколько С-концевых остатков (Gly, Leu, Phe, Ala, -pré); точки расщепления С-концевых'участков РЦ этими ферментами идентифицировны не были.

Как видно из рис.2, ни одна из предполагаемых гидрофильных перетяжек, соединяющих трансмембраннне сегменты, не доступна действию иротеаз. Это не противоречит предложенной модели укладки полипептидных цепей РЦ С.auronttacna, поскольку, согласно -данным рвнтгеноструктурного анализа, в РЦ пурпурных бактерий

эти поретяжки образуют «-спирали, лежащие в плоскости мембраны, и, вероятно, погруженные в полярную часть липидного бислоя.

Весь гидрофильный N-концевой участок М-субъединицы оказался доступен ограниченному протеолизу, что согласуется с предложенной модель». Эти данные показывают, что N-конец М-субъедмницы находится на поверхности молекулы и не участвует в образовании какой-либо жбсткой структуры. Что касается гидрофильного N-koh-ца L-субъединицы, то действию протеаз доступна лишь дистальная ого половина. Это позволяет првдттолзгать, что его проксимальная часть погружена вглубь молокулы или (и) образует жёсткую структуру. Интересно, что скорость отщепления N-конца М-субъодгашцы на порядок выше, чем N-конца L-субъедштцы, что говорит о меньшей доступности последнего для протеаз.

II. ХАРАКТЕРИСТИКА ИД C.JSJRANTIAC1]S С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ТЕРМОС'Г АБ'АШ ¡ОСТ й

Изменения спектра РЦ при тепловой денатурации. При прогреве препаратов РЦ наблюдаются следующие характерные изменения в красной и ближней инфра1фасной частях спектра: уменьшение поглощения в максимумах специальной пара бактериохлорофиллов (866 нм) и мономерного бактериохлорофилла (812 нм), увеличение поглощения в максимуме сактериофеофитина (755 нм). Разностный спектр поглощения образца РЦ до и поело прогрева показан на рис.3.

Способы^оценки терыостабильностн препаратов РЦ. В работе Pierson et aZ.П983 J было показано, что РЦ С.awanttacua, будучи солюбилизирован в растворе ЛЦАО,.сохраняет повышенную термостабильность по сравнению с РЦ шзофилышх пурпурных бактерий. Качественный тест, описанный этими авторами, был положен в основу использовавшегося нами способа оценки термостабильности РЦ C.auronttacua. Для сравнения тормостабильности препараты РЦ прогревали на водяной бане; после прогрева образцы немедленно охлаждали до 1 С? С и измеряли спектры поглощения. По спектрам поглощения рассчитывали долю не денатурировавших молекул РЦ г и строили кривые денатурации - зависимссь г либо от температуры

.(при фиксированном времени прогрева), либо от времени програвв (при фиксированной температуре). Выло проведено сравнение двух способов оценки г (рис.4). Очевидно, что более точным из них. является способ, основанный на сравнении ДА^ до и после прогрева, поскольку величина лАдр6 прямо пропорциональна концентрации Р1!, сохранивших специальную пару оактеркохлорсфил-нов. Как видно из рис.46, оба способа дают сходные кривые денатурации . В дальнейшем мы использовали способ оценки тврмостаСкльно-сти по уменьшению поглощения мономерного бактериохлорофилла, поскольку он требует меаьыегс расхода образца и меньших, временных затрат, чем расчёты по дифференциальным спектрам.

Следует отметить, что использовавшиеся наш параметры (поглощение мономэрного бактериохлорофилла и специальной пары) отражают состояние лишь участков связывания соответствуивщх хромофоров, но не комплекса РЦ в целом. Хотя в наши экспери-

Ряс.З. Разностный спектр поглощения образца РЦ О.аигапИа-оиз до и после прогрева (образец - препарат, нро.гретый при 50°С ь ЬО мМ Трис-НС1, рН 9,0; 0,05% ДДАО в течение 15 мин; сравнение - исходный прупчрат с концентрацией РЦ 0,5 мкМ).

Рио.4. Графическое определение доли молекул РЦ г, не денатурировавших за время прогрева (сплошная линия - исходный препарат; пунктир - препарат после прогрева): А - по да$фзренци-альяьм спектрам (образец - с добавлением аскорбата натрия до 10 мМ, сравнение - с добавлением гексацианоферрата калия до 10 мМ): г(%)=-|Щх100; Б - по относительному поглощению при

812 нм: r(#)--j^jj|:x100; В - кривые деиатурацга одного и того же образца, рассчитэннне по дифференциальным спектрам (*) и по уменьшении поглощения при 812 нм (в).

Рис.5. Кривые тепловой денатурации препаратов РЦ, встроенного в азолектиновые протеолилосомы (1) и солюбилизировакного в 50 мМ Трис-HCl (рН 9.0), содержащем: 0,3% дезоксихолат натрия (2), 0,0655 додецилмальтозид (3), 0,2% CHAPS (4), 0.025Й холат натрия (5), 0,05% ЛДАО (6), 0,5&:Тритон 00 (Т).

стк микроокружения мономерного бактериохлорофилла и специальной пары, термостабильность других участков РЦ, вообще говоря, может быть иной.

Териостабильность РЦ С.aurant1асиз в различных детергентах и в искусственной ыеыбране. Сравнение кривых денатурации препаратов РЦ, солюбилизированных в дезоксихолате натрия, додецил-мальтозиде, 3- [ (3-холамидощюпил"Г-Диметиламмонио 1 -1 -пропансуль-фонате (CHAPS), холате натрия, ЛДАО и Тритоне Х-100, и препарата, встроенного в азолектиновые лштосомы (рис.5), показало, что солюбилизация РЦ во всех перечисленных выше детергентах снижает териостабильность РЦ. Таким образом, липид-белковые взаимодействия вносят определенный вклад в термостабильность РЦ С.аигап-

tiaaua; однако, в отличие от термофильной пурпурной бактерии Chromat tum tepldum, в случае С.aurant1асиз эти взаимодействия не являются единственным фактором, обусловливающим термостабильность РЦ.

Из всех использовавшихся детергентов наименьшее дестабилизирующее влияние на РЦ оказывали додецилмальтозид и дезоксихолат натрия, а наибольшее - ЛДАО и Тритон Х-100. Исходя из этого, в дальнейшем при изучении изменений термостабильности и функционирования РЦ в результате ограшчогаюго протеолиза, как правило, наряду с образцами, солгобилизированными в ЛДАО, тестировались также препараты РЦ, встроенные в протеолипосомы.

III. ВЛИЯНИЕ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИЗА НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ РЦ C.AURAIITIACUS

Для исследования возможной рот N-кснцевых областей и их отдельных участков е стабилизации пространственной структуры РЦ при повышенной температуре мы сравнивали термостабильность препаратов РЦ, обработанных протеазами, и контрольных препаратов; контрольные препараты РЦ инкубировали в условиях, идентичных условиям протеолиза, но без добавления ферментов.

Для изучения вклада N-концевых участков в термостабильность РЦ в первую очередь было выбрано расщепление клострипаином, поскольку этот фермент даёт небольшое число легко идентифицируемых промежуточных продуктов. t

На рис,б приведены кривые тепловой денатурации целого РЦ, промежуточного и конечного продуктов его расщепления клострипаином. У конечного продукта отщеплены 18 N-концевых остатков М-субъедитщы и 25 N-концевых остатков L-субъединицы, у промежуточного - те же 18 N-концевых остатков М-субъединицы, но лишь 2 N-концевых остатка L-субъединицы.

Кривые тепловой денатурации целого РЦ и промежуточного продукта расщепления клострипаином почти не отличались при измерениях в растворе ЛДАО и были идентичны после реконструкции РЦ в протеолипосомы, в то время как .термостабильность конечного продукта была заметно снижена. Таким образом,-отщепление от L- и

г.*

Рис.6. Кривые тепловой денатурации препаратов целого Р11 (1), промежуточного (2) и конечного (3) продуктов расщепления РЦ клострипаином. На вставке показан БЕв-электрофорез этих препаратов. Измерения проводились на РЦ, солюбилизированном в 50 мМ Трис-НС1, рН 9,0; " 0.05Ж ЛДАО (•) и встроенном в азолек-тиновнэ лилбЪома (*). Время прогрева - 15 мин.

Г.* " Г : :

проказой (3).

М-субъединиц соответственно 2 и 18 tí-концевых аминокислотам остатков практически не влияет на термостабильность РЦ. Дополнительное отщеплеиив 23 аминокислотных остатков и N-конца L-ч

субъедгсыцы (Ala L - Arg L ■ сникает термостабилыюсть РЦ.

Для выяснения влияния на термостабильность более глубокого расщепления М-субъоданицы сравнивали тепловую денатурацию:"' 1) конечного продукта расщепления РЦ клострипзином и продукта последовательного расщепления РЦ клострялашом и протеазой из St.aureus V8; 2) конечных продуктов расщепления РЦ трипсином и термолизином. Эти препараты содержали идентичные L-субъединицы (с N-концевымк остатками соответственно Val L2b и Ala Ъ23), но различающиеся М-субъединицц (см. рьс.2). Било обнаружено, что расщепление связей Glu М2^ - Asn M30 л Gin M36- Leu M37 не приводит к заметшм изменениям термостабильности РЦ.

Термостзбильность конечного продукта расщепления РЦ прона-зой Е, со державшего М-субъединицы с N-концеьымк остатками Gly32 и Gly-8 в соотношении приблизительно 2:1, оказалась существенно ниже, чем конечного продукта клострипаинового расщепления (рис.7). Поскольку L-субъединицы в этих препаратах имеют один и тот'«е N-концевой аминокислотный остаток (Val L26), a N-концевой участок М-субъедияицн вплоть до Leu не вносит вклада а термостабильность РЦ, из полученных результатов можно сделать вывод о том, что разница в термостабильности продуктов протоо ■ лиза РЦ клострипаином и проназой обусловлена, но всей вероятие~ сти, расщеплением проназой С-концевых участков ГЦ.

IV. ВЛИЯНИЕ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕСШИЗА НА ЗЛЕКТРОНШИ ТРАНСПОРТ В РЦ С. AURAI) TIACÜS

В работе Debus et oí.[1985] с помощью ряда оптических измерений был охарактеризован препарат РЦ пурпурной бактерии Rhodo-bccter aphaeroiaeâ.ws которого была удалена М-субъединица. Нами были проведены аналогичные измерения на препаратах РЦ С.аигач-. tlacua, укороченных с K-концов с помощью ограниченного протео-лиза. Препараты исходного РЦ и РЦ, обработанного лротеазями, были охарактеризованы также прямым электрометрическим методом

после встраивания в протеолипосомы.

Поскольку в процессе выделения РЦ 0.aurantlocus теряется вторичный хинон Qb, при необходимости его реконструировали. Для реконструкции исшльг$оьали убихинон (Q10, Sigma, США).

Оптические измерения проводили на РЦ, солюбилизированном в 50 мМ Трис-HCl, pH 9,6; 0,1% ЛДАО. Тестировали следующие параметры: время релаксации Q~-h>р+ в отсутствие Qb, время релаксации Q^—>Р+, время жизни семихинона

Было найдено, что по всем трем параметрам промежуточный продукт расщепления РЦ клострицаином неотличим от контрольного РЦ, не подвергавшегося протеолизу. В то же время конечные продукты расщепления РЦ клострипаином и проназой характеризуются небольшим замедлением релаксации Q~—»P+, значительным замедлением релаксации Q^—»P+, отсутствием стабилизации семихинона Qj^ (табл.1, рис.8); вследствие малого времени яизни Q~ отсутствуют

Таблица 1. Константы скорости рекомбинации зарядов Q~—»Р+ (кдр) и Q^—>Р+ (квр)испада ковдентрации Q^ (kdec) в препаратах БД и LM-комплекса Fhodöbacter aphaerot-des (по данным Debus et alЛ19853) и в контрольном и обработанном клострипаином (конечный продукт) препаратах РЦ Chlorofleans aurcmt locus.

Констан- fib.s phaerotdes G.aurantiacua

та ско-

рости ¿U kRC kRC-CP kRC/kRC-CP

(с-1) •кВР, (С-1) 8.?. 0.72 2.9 5x10~3-9x10"2 2.8 8.0 -1.4X102 14 0.27 12 <4.4x10-2 1.15 >б

^deo, (с1) 4x10-3 0.7-3.1 1.3x10~3-6.1x10-3 3x1О"2 2.7 IQ"2

Рис.8. Влияние ограниченного протеолиза на электронный транспорт в РЦ С.aurantiaoua. А - кинетика релаксации Q~—>Р в отсутствие Q^; Б - кинетика релаксации Q^—»Р+; В — индуцированные последовательными вспышками света изменения поглощения при 450 нм. Q^ реконструировали добавлением в 3-кратном молярном избытке по отношению к РЦ. 1 — контрольный препарат ИД; 2 -конечный продукт тшсщепления РЦ клострщтаином. Стрелками показаны моменты вспышек возбуждающего лазера.

двухтактные колебания поглощения семихинона в зависимости от номера вспышки (рис.86). Аналогичные изменения, вызванные удалением Н-субъединицы из РЦ НЬ.зрЬаего^йеа, наблюдались в работе Debus et al. 11985J. Кроме того, как и для LM-комплекса Rb.sjyha-eroldes, в случае конечных продуктов расщепления клострипаином и проназой FU С.aurantlacua вклад быстрой составляющей в кинетику релаксации Q^—>Р+увеличивался (ср. кривые 1 и 2 на рис.86), что свидетельствует о снижении константы связывания

1J

Тагам образом, удаление дистальной части N-кояцевого участка Ъ-субъедишца РЦ С.aurontlacua и удаление Н-субъеданицы из РЦ Kb.spfyj&roldBS вызырчйт сходные изменения транспорта электронов, выражающиеся прежде всего в нарушении функционирования вторичного хяаоав. Данйые рентгеноструктурного анализа РЦ пурпурных бак-'еррй показывают, что Н-субъединица не участвует непосредственно в связывании ни Q-0, ни какого-либо другого кофактора; её роль в обеспечении нормального функционирования Q.[; заключается, вероятно, в стабилизации пространственной структуры хинонсвязывающего участка. По аналогии можно было бы предположить, что участок Ala ï?~ Arg L25 в РЦ С.aurontíaoua также стабилизирует структуру хинонсзязыващего участка L-субъединицы, а вызываемые протеолизом изменения электронного транспорта объясняются локальной денатурацией участка связывания Qb. В пользу такого предположения косвенно свидетельствовало то, что N-koh-цевой участок L-субъединицы вносит также вклад в термостабуль-

но

ность РЦ, в то время как присутствие участка Ala Ii1- Arg M несущественно ни для термостабильности, ни для нормального функционирования Q,;). Для проверки этого предположения был проведйн следующий эксперимент: РЦ подвергали расщеплению проназой Е при высоком фермент-субстратном отношении (1:5 по весу), что позволило получить конечный продукт 'расщепления в течение первых минут инкубации с ферментом. По ходу реакции отбирали аликвоты для электрофореза и одновременно измеряли время релаксации Q^—*Р+ и время жизни Q^ в присутствии донора электронов. Результаты этого эксперимента показаны на рис.9. Было обнаружено, что после образования конечного продукта расщепления РЦ происходит постепенное увеличение времени релаксации >Р+ и уменьшение времени жизни Эти данныэ свидетельствуют о том, что наблюдаемое нарушение функционирования вторичного хинона действительно является следствием медленной локальной денатурации участка связывания Qb в результате протеолиза.

Измерения фотоэлектрических ответов содержащих РЦ протеоли-посон проводили m азолектиновых протеолипосомах, ассоциированных с коллодаевой нлбнкой. Как уже упоминалось, РЦ в протеоли-носомах, получешщх удалением холата натрия из лшид-детергент-

А V-

ч—I— 1—^—(—I—I—(—е—е о «о го зо 43 ко «о то оо чо *»л

Б "

0.4

0.9 с. г 0.1

«с < г з

«

I» <►» «м> ^

I

о 10 го 3,-1 мин

Рис. 9. Вызванные протеолизом изменения времени релаксанта *Р+ (А) и времени жизни (Б) в РЦ С.&ига1^1аоиа. Ооь айо-цисс - время инкубации РЦ" о проназой. На вставке В показан олектрофорез соответствующих аликвот: ЯС - ггоепарат до добавления фермента; 1, 2 И 3 - апиквсш. отобранные» соответственно через 11, 20 и 30 мин после добавления фермента.

Рис.10. Фото&лэктрические ответы содержащих РЦ протеолипо-сом, ассоцкировашгых с коллодиевой плёнкой. Показаны ответы на первую (1) и вторую (2) вспышки. А - контрольный препарат РЦ; В - конечный продукт расщепления РЦ клострипаином, В - конечный продукт расщепления РЦ проназой. Стрелками показаны моменты вснышок возбуждающего лазера. Д<р - трансмембранная разность электрических потенциалов.

шх мицолл диализом* ориентированы на 30-40% акцепторной стороной наруку.Такие лтгасомы неудобны для измерений, так как величина образующегося на них в ответ на лазерную вспышку электрического потенциала относительно невелика. Было найдено,что удаление холата натрия гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50 или G-75 позволяет получать липосомы с ориентацией РЦ 95-100% акцепторной стороной внутрь; этот метод использовали для получения протеолипосом для измерений фотоэлектрического ответа.

Основным параметром, позволяющим судать о нормальном функционировании С^, является наличие дополнительной (хиноновой) фазы в ответ на вторую вспышку (при условии предварительной тедаовой адаптации образца), обусловленной протонирсчвнием Q^". îfe рис.10 представлены результата измерений,' проведанных на ли--посомах со встроенными в них контрольными РЦ и РЦ, обработанными протеазами. Как и ожидалось, в случае РЦ, расщепленного про-назой, хиноноеэя фаза полностью отсутствовала. В то же время измерения, проведенные на препаратах РЦ, обработанных клостри-паином, не выявили их отличий от контроля, что говорит о нормальной стабилизации Q^ в этих препаратах.

Противоречие между . данннми, полученными при измерениях в растворе детергента и в протеолипосомах, вероятно, может быть объяснено тем, что встраивание обработашюго клострипаином РЦ в искусственную мэибрану стабилизирует пространствешум структуру его акцепторной части, необходимую для нормального функционирования вторичного хинона. В случае конечного продукта расщепления РЦ проказой, стабильность которого ещб более снижена из-за отщепления С-кондовых участков, лишл-белковые взаимодействия не могут компенсировать дестабилизирующее действие протеолиза. Таким образом, представляется вероятным, что нарушение функционирования С^ в результате протеолиза РЦ является следствием скорее общей дестабилизации-молекулы, чем нарушения специфического взаимодействия мевду отщепляемыми участками и участком связывания вторичного »шона. По-видимому, большая лабильность участка связывания по сравнению с участками связывания других кофакторов может быть связана с тем, что это единственный участок РЦ, функционирование которого сопряжено с перемещением кофактора.

Что касается вопроса о функциональном сходстве удлинённого N-конца L-субъедшшцы РЦ С.auronttacus и Н-субъединицы РЦ пур-

nypaux бактерий, то он оотаЭтся открытым,, поскольку Функция Н-субъеданяцы однозначно не определена. Нарушение фужционмрова-пия Qb в ей отсутствие, наблюдавшееся Debus et ai Л1985], может быть интерпротнровгнс; как следствие обратимой локальной денатурации Qjj-свлзывашвго участка, вызванной общей дестабилизацией Ш-каштлекса (такая дестабилизация при удалении Н-субъединицы была отмечена авторами). В этом случае основная роль как Н-субъединицы, так и Й-:*онца 1-субъедшицы РЦ С.aurait locus может заключаться в стабилизации молекулы РЦ в целом, а не в специфической стабилизации Оь-связызандего участка. Для проверки этого предположения необходимы эксперименты по более детальному изучению роли Н-субъединицу в РЦ пурпурных, бактерий.

ЕНВОДЫ

1. ГЦ С,cjjra.it 1аоиа охарактеризован с точки зрения термоота-бильности. Предложен простой полунолнчестванный ыетод оценки термостабильности препаратов РЦ. Проведено сравнение термостабильности РЦ С.аигалг1асиз, встроенного з искусственную мембрану и солюбшшзмрованнсго в различных детергентах.

2. С помощью ограниченного гидролиза протеазами разданной специфичности получен набор препаратов РЦ С.аигагЛасиз, в разной- степени укороченных с Н-концов. Показано, что весь гидрофильный N-конец М-субьедишцы легко доступен действию '.фоте аз, в то время как лвдь дистальная половина гидрофильного М-кош',а Ь-субъедашцы отцепляется протеаз&ш.

3. Разработан метод реконструкции РЦ С.аигапХ1асиа в протеоли-посош, позволяющий получать протеолипосокы с ориентацией РЦ 95-100'? акцепторной стороной Енутрь.

4. Изучено влияние ограниченного протеолиза РЦ С.аигогл 1асиэ на его термостабйльность и функционирование. Показало, что 37 И-концевых аминокислотных остатков М-субъединицы несущественны для термостабильности РЦ; отщешгашге по крайней мере 18 остатков с Н-конца Ы-субъединицы не влияет на его функционирование. Обнаружено, что дополнительное отщепление дис~ тальной половине гидрофильного 1*-конца Ь-субъедздшш доста-бялпокруэт пространственную структуру РЦ,: снижая ого термо-стабилыюсуь и нарушая (в случае РЦ, солюбюмэированного в р.*' Поре дезергента) фузлапонировянив вторичного хиконозого

акцептора. Показано, что отщепление С-концевых участков также приводит к дестабилизации молекулы РЦ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих статьях

и докладах:

1. Заргаров А.А., Кутузов М.А., Тележинская И.Н., Шмуклер Б.Е.,* ЗолотарЭв А.С. Структурные исследования реакционного центра бактерии Chloroflexua aurantiocua. Материалы V конференции молодах учёных социалистических стран по биоорганической химии, Пущино-на-Оке, 1988, с.50-51.

2. Zolotarev A.S., Kutuzov М.А., Shmukler В.Е., Zargarov А.А., Telezhinskaya I.N., Levina N.B., Abdulaev N.G. Abstracts oi the symposium on molecular biology of membrane bound complexes In phototrophlc bacteria. Photoreaction centre of Chloroflexua aurantiocua. Primary structure and membrane topology. Freiburg, FRG, 1939, p. 109.

3. Кутузов М.А., Шмуклер Б.Е., Заргаров А.А., Тележинская М.Н., Левина Н.Б..Золотарев А.С., Абдулаев Н.Г. Изучение структуры фотосинтетического реакционного центра зеленой термофильной бактерии Chloroflexua jwrantlacua. Биоорган, химия, 1990, т. 16, N 9, в печати/.

4. Kutuzov М.А., Levina N.B., Telezhinskaya I.N., Zolotarev A.S., Abdulaev N.G. Limited proteolysis and Its Influence on thermal stability of the photosynthetic reaction center from Chloroflexua aurantiocua. In: Molecular biology of membrane-bound complexes in phototrophlc bacteria. Plenum,1990. (Proceedings of the FEMS symposium, Freiburg, FRG, 1989).

5. Kutuzov M.A., Levina N.B., Telezhinskaya I.N., Zolotarev A.S., Abdulaev N.G. Limited proteolysis and its Influence on thermal stability and function of the photosynthetic reaction center from Chloroflexua aurantiocua. Abstracts of the VIth Soviet - Indian symposium on regulation of photosynthesis, Pushchino, USSR, 1990, p.54-55.

6. Kutuzov M.A., Levina N.B., Telezhinskaya I.N., Zolotarev A.S., Abdulaev N.G. Photosynthetic reaction center from Chloroflexua entrant 1асиз: structure-functional studies using limited proteolysis. Abstracts of the VIth ¡Joint Swiss -Soviet symposium "Biological membranes: structure and functions", Neuchatel, Swltherland, 1990.

2f

Подп.з иеч.14.11.90. Формат изд 60x84 1/16 Объзм 1,5 п. л. Ьаказ 195/у Тира«. 100

ГЗГПе чатник"Moогорпсчати Н.Краснохолмская д. 5