Синтез и структурно-функциональное исследование ультратонких ориентированных мембран на основе синтетических и природных полимеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Р Г 5 ОД

к .,.11 /«л. на правах рукописи

" J /.¡¿И Г.у,

УДК 514.64:541.183:577.3552.2

ЗАЙЦЕВ Сергей Юрьевич

СИНТЕЗ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАТОНКИХ ОРИЕНТИРОВАННЫХ МЕМБРАН НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ И ПРИРОДНЫХ ПОЛИМЕРОВ

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений; 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им.академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. Б. Эеэин

доктор химических наук, профессор И. М. Паписов

доктор химических наук, профессор М. И. Штильман

Ведущая организация:

Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л. Я. Карпова

Защита диссертации состоится " 29 " декабря 1994 года в 10 часов на заседании специализированного Совета Л-063.41.05 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: Москва 119831, Г-436, ул. М. Пироговская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан " 24 " ноября 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор химических наук, профессор

-—И. А. Грицкова

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Ультратонкие ориентированные мембраны -Уникальные системы для изучения химических реакций (прежде всего Радикальной полимеризации), протекающих на границе раздела фаз. 1сследование этих систем вносит существенный вклад в решение таких гроблем химии полимеров как управление процессом полимеризации и юлучение полимеров с заданными свойствами. Кроме того, указанные системы являются удобными моделями для структурно-функционального 1сследования биологических мембран и их компонент, так как содержат голекулы в определенном порядке на фиксированных расстояниях с требуемой ориентацией относительно поверхности раздела фаз. Такие та дели особенно ценны при изучении процессов самоорганизации биологически активных молекул, молекулярного узнавания, фоторецепции i мембранного транспорта, протекающих в биомембранах. В этой связи /льтратонкие ориентированные мембраны перспективны для применения в Зиосенсорных устройствах, молекулярной электронике, голографии и медицинской диагностике.

В данной работе исследованы основные классы указанных систем: чономолекулярные слои (сокращенно - монослои) различных поверхностно-активных веществ (ПАВ) и мономеров (ПАМ) на границе раздела жидкость/газ, а также moho-, би- и мультислои ПАВ и ПАМ, перенесенные с водной субфаэы на специальные твердые подложки (ленгмюровские пленки) и полимерные пленки толщиной до 100 мкм, исследуемые на границах раздела твердое тело/газ и твердое тело/жидкость.

В отличие от традиционных ПАВ, ультратонкие мембраны на основе синтетических и природных полимеров изучены мало и фрагментарно. Детальное и систематическое исследование в этой области оказалось возможным благодаря развитию, в последнее время, наряду с известными физико-химическими методами (изотермы поверхностного давления, поверхностного потенциала, флуоресцентная и оптическая спектроскопия), новых методов изучения таких систем: рефлектсметрия и микроскопия Ерустеровского рассеяния (БАР и БАМ соответственно), спектроскопия резонансного комбинационного рассеяния (РКР) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), сканирующая туннельная микроскопия (СТМ) и микроскопия атомных сил (АФМ). Применение этих методов позволяет получать о таких системах адекватную структурно-функциональную информацию и разрабатывать на их основе оптимальныо условия получения материалов с заданными свойствами.

Цель работа заключалась в том, чтобы выявив обшц закономерности полимеризации в монослоях ряда следиальн синтезированных поверхностно-активных мономеров заданной структуры а также изучив процессы молекулярного узнавания и фоторецепци биологически-активных соединений на границе раздела фаз, предложит: основные принципы создания фукциональных ультратонки ориентированных мембран на основе синтетических и природам полимеров с комплексом требуемых свойств для использования их ка: моделей биологических мембран и перспективных материалов i биосенсорных устройствах.

Научная новизна работы состоит в установлении новых подходов i созданию ультратонких ориентированных мембран на основе синтети ческих и природных полимеров с комплексам заданных свойств Количественно исследована радикальная полимеризация широкого круг; производных фосфолипидов с заданным строением в монослоях на границ« раздела жидкость/газ и установлено влияние структуры монослоя н< кинетику процесса.

Впервые получены монослои и ленгмюровские пленки на основ« специально синтезированных поверхностно-активных производных краун-эфиров и изучено их комплексообразование с катионами целочныз металлов непосредственно на границе раздела жидкость/газ. I результате сравнительного исследования монослоев пептидных ионофоро! (валиноыицина и грамицидина) установлено различие их конформаций н; границе раздела фаз при селективном связывании катионов шелочны? металлов, что определяет отличие механизмов переноса этих катионо! через синтетические и природные мембраны.

Впервые получены монослои белков реакционных центров и£ фотосистемы II шпината. Na* ,К*-аденозинтрифосфатазы и определен! оптимальные условия формирования моно- и мультислоев други> мембранных белков (бактериородопсина, реакционных центров ие фотосинтезируюших бактерий) и их смесей с различными липидоподобными мономерами на границе раздела фаз. Проведен сравнительные структурно-функциональный анализ и изучен механизм

фотоиндуцированного разделения Зарядов в указанных мембранах, чтс позволило оценить ориентацию данных белков на границе раздела фаз. Впервые установлена возможность управления ориентацией мембранных светочувствительных белков с помощью подбора соответствующей липидной или полимерной матрицы.

Впервые для липид-белковых монослоев показана возможность стабилизации определенных конформаций биологически-активных

оединений путем полимеризации липидного окружения и/или олимериэуюшихся групп специально введенных в их молекулы.

Разработаны метода получения стабильных ультратонких риентированных мембран, в том числе полимерных, на основе различных ерментов (глнжоэооксидазы, уреаэы, , каталаэы, бактериолюцифераэы) сохранением их функциональной активности и изучены процессы ермент-субстратного связывания на граница раздела жидкость/газ.

Практическая значимость работа. На основе проведенных гистематических исследований разработаны методы получения 1ункциональных ультратонких ориентированных мембран с комплексом |аданных свойств, что представляет собой первый и ключевой этап на гути развития молекулярной электроники и биосенсорики. Впервые [енгмгаровской технологией были получены биосенсоры на основа юлимерных пленок с иммобилизованной глзокоэооксидаэой, способные >пределять глюкозу в физиологическом интервале концентраций.

Используя принципы молекулярного узнавания были получены юноселективные мембранные электроды на основе краун-эфиров и юлиномицина, а также латексы-маркеры (с дигитонином) для соличественного определения холестерина в плазматических мембранах кивотных клеток при атеросклерозе.

Впервые получены ультратонкие полимерные пленки с иммобилизованным светочувствительным мембранным белком (бактерио-эодопсином) и показана их применимость в качестве высоко-г/вствительных материалов для ' записи и хранения оптической информации, а также фоторефрактивных элементов в голографических /стройствах.

Сформулированные научные положения синтеза, полимеризации и структурно-функционального исследования полимерных ультратонких ориентированных мембран излагаются в спецкурсе "Полимеры с комплексом специальных свойств" (МГАТХТ им. М.В.Ломоносова).

Диссертационная работа выполнена по плану НИР Института Зиоорганической химии Российской Академии наук.

Публикации. Основное содержание работы изложено в 40 статьях в научных журналах, 4 авторских свидетельствах на изобретения, а также в тематических изданиях, сборниках конференций и симпозиумов.

Апробация работа. Результаты работы докладывались на 8 Всесоюзной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Ташкент 1983); 16 Конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва 1984) ; 2 и 3 Есзссюэш.1Х конференциях по химии макроциклов (Одесса 1904 и 1303); 1 и 2 Есассгаэных пколах-

конференциях по ленгмюровским пленкам (Звенигород 1987 и 1989); Международной конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии (ЧССР, 1988); 1 и 2 Международных конференциях' по молекулярно электронике и биокомпютерам (ВНР, 1988; Москва 1989); Всесоюзно конференции "Радикальная полимеризация" (Горький 1989); Всесоюзно конференции "Химические сенсоры-89" (Ленинград 1989); Всесоюзны школах-конференциях "Функциональные полимеры" (Алушта 1990 и 1991) Международном конгрессе по мембранам и мембранным процессам (США 1990); 3 и 4 Европейских конференциях по организованным органически тонким пленкам (ФРГ 1990; Англия 1992) ; Конференциях п аналитической химии и прикладной спектроскопии (США 1991 и 1992); и 6 Международных конференциях по организованным молекулярны пленкам (Франция 1991; Канада 1993), 13 конференции Европейское Физического Общества (ФРГ 1993) ; 2 и 3 Международных симпозиумах ni молекулярной биотехнологии (Франция 1993; Швейцария 1994,); 1 Международной конференции по химическим сенсорам (Италия 1994).

Структура к otíbsu работа. Диссертация состоит иэ введения обзора литературы, 4 глав эксперимента и обобщений, заключения выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на

страницах машинописного текста, содержит //"[* рисунков и таблиц. Список литературы насчитывает¡^f"% наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе диссертации изложены результаты анализе состояния исследований в области получения и изучения монослоев у ленгаюровских пленок на основе различных классов ПАМ и биологически-активных соединений. С нашей точки зрения основными направлениями исследований, которые чрезвычайно важны для разработки теории создания функциональных ультратонких ориентированных мембран с комплексом заданных свойств, являются: поиск оптимальных условий синтеза ПАМ Заданной структуры и получения монослоев синтетических и природных полимеров на границе раздела яидкость/газ, установление механизма формирования и полимеризации моно- и мультислоев ПАК определенной структуры на границе раздела фаз, развитие физико-химических методов исследования ультратонких ориентированных мембран на основе синтетических и природных полимеров и изучение перспектив их применения как технических материалов. В комплексе эти вопросы до настоящего времени не решены. Место данной работы и ее взаимосвязь с другими областями знания отражены на следующей схеме.

2. СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ МОНОМЕРОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ В МОНОСЛОЯХ

Нами проведен направленный синтез широкого круга поверхностно-активных и липидоподобных мономеров, которые можно классифицировать по следующим основным признакам: 1) положению полимериэующейся группы в гидрофильной или гидрофобной частях молекулы, 2) количеству полимериэующихся групп в одной молекуле ПАМ (одна или две), 3) количеству гидрофобных цепей в одной молекуле ПАМ (одна или две). В работе описаны наиболее интересные представители каждого из типов ПАМ. Структурные формулы некоторых иэ них приведены в табл. 1. Строение полученных соединений подтверждено методами ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопии, элементным анализом и тонкослойной хроматографией. Такой широкий набор соединений позволил провести детальное исследование поверхностно-активных свойств и особенностей полимеризации ПАМ и определить наиболее удачные структуры для последующей иммобилизации биологически-активных соединений.

Установлено, что все синтезированные ПАМ способны образовывать монослои на границе раздела жидкость/газ. Синтетические ПАМ с полимеризукщимися группами в гидрофильной части молекул занимают несколько большую площадь (А,,) , приходящуюся на молекулу ПАМ в монослое, и площадь (Ак), при которой наблюдается коллапс монослоя, чем исходные ПАВ или их насыщенные аналоги (табл. 2), что свидетельствует о жидко-растянутом состоянии монослоев таких ПАМ.

Таблица 1. Структурные формулы и сокращенные^ обозначения некоторые поверхностно-активных мономеров (ПАМ).

СН3(СН2)9 - С = С - С г С - (СН2)5СООН СН3(СН2)9С г С - С = С(СН2)5СООСН2 СН3(СН2)9С = С - С = С(СН2)5СООСН о

(ТДК)* (ТДФХ)

СН2ОРОСН2СН2М(СН3)3

СН3(СН2)5 - СН = СИ - СН = СИ - (СН2)7СООН СН3(СН2)5СН = СН-СН = СН(СН2)7СООСН2

(БДК)* (ДОДЛ)

СН3(СН2)5СН = СН-СН = СН(СН2)7СООСН о

I I! +

СН2ОРОСН2СН2ГМ(СН3)3

о

СН3(СН2)7С - СН=СН - (СН2)6СООН

СН3(СН2)7^-С11=СН-(СН2)6СООСН2 СН3(СН2)7С-СН=СН-(СН2)6СООСН о

(ОДК) (ОДФХ)

о

СН3(С112)16СОО - СН=С112 С113(СН2)|7М1| - СН=СН2

о

СН3(СН2),5СООСН2 сн3(сн2),5соо(Ьн о

С]120Р0СН2С112^(С113)3

о

(ВС) (АКОДА)

(АКФЭ)

Г" II

СН2ОРОСН2СН2]ЧН - С - СН = сн2 он О

СН3(СН2),6ОССН2[\(СН3)2(СН2)2 - О - С - С = СНг ВТ (МА-16,Вг)**

о

О СНз

* - синтезировано в лаборатории X.Рингсдорфа (Университет г. Майнц), ** - синтезировано на'кафедре ВМС МГУ под руководством В.В.Егорова.

Таблица 2. Значения основных параметров монослоев некоторых. ПАМ.

Вещества Ао» ЛК» АК' к'10-3-6,

нм2/мол. мН/м нм2/мол. мН-мол./м^

ВС 0 ,235 26 5 0 190 5,82

Стеариновая к-та 0 ,205 57 0 0 190 50,00

АКОДА 0 ,250 60 7 0 165 7,14

Окт адецил амин 0 ,220 64 5 0 170 12,90

ТДК 0 ,675 20 5 0 470 1,11

ТДФХ 1 ,005 24 s . 0 305 0 ,35

БДК 0 ,320 35 7 0 185 2,50

ДОДЛ . 0 ,685 55 6 0 300 1,44

ОДК 0 ,315 35 5 0 180 2,63

ОДФХ 0 ,925 52 5 0 515 1,28

АКДПФЭ 0 ,515 49 5 0 360 3,19

ДПФЭ 0 ,415 62 2 0 360 11,31

MAI 6Вг 1 ,04 0 41 0 0 150 0,42

Уменьшение величины давления коллапса (тгк) монослоев ПАМ и тангенса угла наклона прямолинейной части их изотерм (к) по сравнению с исходными ПАВ (табл. 2) ука-^хвает на снижение жесткости и прочности монослоев ПАМ. Обнаруженные эффекты тем значительнее, чем больше размеры полимеризующейся группы в гидрофильной части молекулы.

Изотермы поверхностное давление (л) - площадь на молекулу (А) для ПАМ, содержащих полимеризугошлеся группы в гидрофобной области молекул (прежде всего диеновых и диацетиленоЕЫх кислот), имеют, как правило, три области: при больших площадях и низких давлениях (жидко-растянутое состояние I) ; малых плоцадях и больших давлениях (жидко-конденсированноа состояние II) и область перехода между ними в виде плато (рис. 1, кривая 2). Состояние I монослоя тетракоза-11, 13-дииновой кислоты (ТДК), при котором площадь на молекулу приблизительно а 2 раза больпе площади сечения жирной алифатической цепи, можно представить как сложенную вдвое цепь, перпендикулярную поверхности раздела фаз. Стабильность состояния I невелика и уже при давлении порядка 20 мН/м происходит переход (область плато на изотерме я-А) з состояние II, в котором алифатическая цепь молекулы строго перпендикулярна поверхности раздела фаз. Структура образующегося полимера существенно зависит от того, з каком состоянии (I или II) монослоя протекает полимеризация, но а любом

случае образуется линейный полимер с системой сопряженных связей что контролировали спектрофотометрически.

Рис. 1 . Изотермы поверхностно* давление - площадь на молекул: для монослоев ТДК до (2) и пост полимеризации при л=10 мН/м (3! и 30 мН/м (1).

Полимеризация монослоя ТДК прг 71=10 мН/м заметно стабилизируем жидко-растянутое состояние 1, что проявляется в существенное увеличении величины к и давления 0.2 0.4 0.6 А, ньАмол. коллапса полимерного монослоя

по сравнению с мономерным (рис. 1, табл. 3). При полимеризации этого же мономера в области жидко-конденсированного состояния II (я=30 мН/м) образующийся полимерный монослой также находится в жидко-конденсированном состоянии с высоким значением як (рис. 1, кривая 1). Этот пример свидетельствует о возможности стабилизировать определенные состояния монослоя ПАМ путем его полимеризации. При полимеризации производных липидов, имеющих две жирные алифатические цепи с диацетиленовыми или диеновыми группами (бифункциональных мономеров), это г эффект еще более ярко выражен из-за образования сшитых полимерых монослоев.

Таблица 3. Значения основных поверхностно-активных полимеров.

параметров

монослоев

некоторых

Вещества *к< Ак, к10"16

нм^/мол. мН/м нм^/мол. мН'мол. /мЗ

поли(ВС) 0,250 62,3 0,205 13,83

поли (АКОДА) 0,310 68,1 0,190 5,68

поли(ТДК) 0,520 64,3 0,220 2,14

поли(ТДФХ) 0,585 30,0 0,205 0,79

поли (ОДФХ) 0,700 53,0 0,480 2,40

поли(ДОДП) 0,530 62,0 0,167 1 ,71

поли (АКДПФЭ) 0,492 72,4 0,357 5,36

поли(МА16Вг) 0,510 58,0 / 0,250 2,38

/

осле полимеризации таких ПАМ в монослое наблюдается уменьшение пощади, приходящейся на мономерное звено полимера, по сравнению с лощадыо на молекулу соответствующего мономера, и существенное величение поверхностного давления, что свидетельствует о высокой есткости и прочности полимерных монослоев (табл. 3).

Наиболее удобным для количественного исследования полимеризации АМ является контроль изменения площади монослоя при постоянном авлении, что является двумерным аналогом дилатометрического метода, ри поЛ'имеризациу-;. ПАМ под действием УФ-оСлучения монослоя \\ = 254 1л) обнаружено наличие ингибирующего эффекта кислородом воздуха и :табильным радикалом - ТЕМПО, что указывает на радикальный механизм :роцеоса. Как сыло показано X. ЕМнгсдорфом, уменьшение площади юнослоя прямо пропорционально конверсии мономер. Поэтому общую скорость полимеризации ПАМ в монослое Су'пр ) рассчитывали по бедующей формуле:

упр. ----- уФон. '

<Аьмак •

где - контракция монослоя за время ЛЬмак_ - полная контракция

юнослоя к концу полимеризации, - скорость фонового процесса

(контракция монослоя неполимериаующегося под действием УФ-облучения »налога ПАМ). На примере МА16Вг показано, что в пределах погрешности зксперимента, порядок реакции полимеризации по мономеру близок к 1, 1 по инициатору - 0,5. Поэтому для описания реакции радикальной толимеризации ПАМ в монослое использовали следующее уравнение:

V = к • уин.°'5 ' ' глде через К мы обозначали отношение констант скорости реакций роста 1 обрыва цепи (К ~ 1Ср/'к0^ - , ~ скорость элементарной реакции

чниииирояания, [ М ] - концентрация ПАМ

Из полученных данных (табл. 4) следует, что ^биая скорость толимеризации ПАМ в монослое (УПр ' и отношения «'онстамт скорости реакций роста и сПрьта цепи (К* значительно попытка, чем обычно наблюдаются при полимеризации этих или аналогичных ПАМ и обьемэ (в растворе или в массе). Это объясняется меньсей энергией активации реакции полимеризации ПАМ в ориентированном состоянии на поверхности раздела фаз. Из результатов исследования структуры монослоев ПАМ выяснено, что различия в ориентации ПАМ, а, следовательно, и полимериэуюшихся групп, задаются прежде всего изменением

поверхностного давления в монослое. Поэтому нами деталь исследована зависимость кинетики полимеризации ПАМ различие строения от величины поверхностного давления в монослое.

Таблица 4. Кинетические параметры полимеризации ПАМ в монослое г. постоянном поверхностном давлении 10 мН/м.______

Мономер ^н.-ю10, к, СМ],

моль/ (л "с) моль/(л "с) (л/моль' с) 0 ' 5 моль/л

ВС 21,0 1,88 47 4,15

АКОДА 28,2 1,51 69 3,32

ТДК 510,0 0,66 6288 1,43

ТДФХ 1,6 0,74 19 0,54

ОДФХ 1,7 0,54 23 0,50

ОДК 11,2 1,32 97 2,87

додл 2,5 0,45 65 0,80

АКДПФЭ 5,9 0,49 79 1,07

МА16ВГ 2,4 0,47 35 0,61

Установлено, что для одно- и двуцепочечных диацетиленовых мономер« (ТДК и ТДФХ) приведенная скорость полимеризации близка к нулю п] низких величинах поверхностного давления К 0,5 мН/м) (рис. 2а), ч: обьясняется низкой концентрацией и ориентацией ПАМ в этих условия: По мере увеличения поверхностного давления (до порядка 10 мН/м) V, резко возрастает. Максимумы на кривых Уцр - л . наблюдаются при 12 8 мН/м для ТДК и ТДФХ, соответственно. При этом абсолютные эначего скорости полимеризации для ТДФХ почти в 400 раз ниже, чем для ТД1 что обусловлено влиянием структуры монослоев одно- или двуцепочечнь ПАМ на кинетику их полимеризации. При дальнейшем увеличена поверхностного давления до 20 мН/м величина У-пр_ для этих соединен* резко уменьшается, что связано с протеканием реакции полимеризации области перехода между двумя состояниями (I и II) монослое указанных ПАМ. Если поверхностное давление больше 20 мН/м, т скорость полимеризации монослоев ГДК остается практически постоянно и достаточно высокой, тогда как для липидоподобного ТДФХ - близка нулю (рис. 2а) . Это можно обьяснить стерическими затруднениями пр взаимодействии полимериэуюиихся групп различных молекул ТДФХ жидко-конденсированном состоянии монослоя с плотной упаковко углеводородных цепей ("хвостов"). В этом случае особенно важн взаимная ориентация молекул ПАМ, тогда как обьемная полярная групп

пр

V10

10 30 мН/М

Рис. 2. Зависимость приведенной скорости полимеризации от величины поверхностного давления для монослоев: а) ТДОХ Ш и ТДК (2): 6) АКФЭ (3) и ОДФХ (4).

ТДФХ способствует вертикальному смещению молекул друг относительн друга. Для ТДК такое смещение должно быть незначительно, поскольк; диаметр полярной группы в молекуле жирной кислоты -близок к диаметр: углеводородной цепи. Указанные эффекты подтверждают гипотезу < влиянии структуры монослоя на реакцию полимеризации диацетиленовы: мономеров, имеющую, как известно, топонимический характер.

Обнаруженная зависимость скорости полимеризации от давления . (1 одним резким максимумом), по-видимому, является универсальной дш всех ПАМ, содержащих полимеризующиеся группы различной природы ] середине "жирных" алкильных цепей. Так, например, скорости полимеризации ОДФХ быстро возрастает с увеличением давления (рис 26) , что коррелирует с возрастанием степени ориентации мономера н; границе раздела фаз. Однако максимум скорости в этом случае наблюдается при достаточно высоком давлении, равном 35 мН/м, Обнаруженное уменьшение скорости полимеризации при дальнейшее возрастании давления, вплоть до давления коллапса монослоя, можнс обьяснить переходом монослоя ПАМ из структуры с плотной упаковкой "головок" в структуру с плотной упаковкой "хвостов" молекул ОДФХ, £ также увеличением вязкости монослоя.

Для монослоев АКФЭ (рис. 26), содержащего акрилатную группу на конце гидрофильной части молекулы, обращенной в водную субфазу, скорость полимеризации максимальна при минимальном поверхностной давлении и резко уменьшается при его возрастании. Установленный факт можно обьяснить влиянием диссоциации ионогенных групп радикала роста цепи, что характерно для разбавленных растворов ПАМ. Минимум на кривой скорости наблюдается при давлении 5 мН/м, а затем следует небольшое возрастание ее, что связано с увеличением степени ориентации мономера. В области давлений 10-15 мН/м появляется иирокий максимум на кривых УПр - л, который связан с различным вкладом эффекта ориентации мономера и эффекта упаковки "головок"-"хвостов", а также изменением вязкости монослоя. Описанные зависимости характерны для всех ПАМ, содержащих полимеризующиеся группы (прежде всего акрилатные) в гидрофильной части молекул. Полимеризация монослоев аммониевых ПАМ, например, МА16ВГ, отличается только положением минимума и максимума на кривых УПр - л при 25 мН/м и 32 мН/м, соответственно.

Таким образом, процесс полимеризации синтезированнных ПАМ в монослое при УФ-ойлучении протекает на 2-3 порядка вьте, чем в обьеме, что объясняется высокой степенью ориентации мономеров на границе раздела фаз. Более того. пЛнямтоиа ~ — -----------

реакции полимеризации от положения полимеризунжихся групп в гидрофильной или гидрофобной частях молекул и структуры монослоя.

3. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО УЗНАВАНИЯ НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ФАЗ

3.1. Синтез поверхностно-активных производных краун-эфиров и изучение в монослоях процесса их комплексообразования с катионами щелочных металлов.

Наиболее простыми из доступных для модификации мембрано-активных соединений являются краун-эфиры. Мы синтезировали ряд диацильных производных дибензо-18-краун-б (ДБК), а именно: 2 ,3;11,12- (4 ' ,4 ' ' -диакрилоил)-дибензо-18-краун-б (ДАДВК) , 2,3,-1.1,12-(4',4''-диацетил)-дибенэо-18-краун-6 (ДАцДБК) , 2 ,.3 ; 11,12-(4 • , 4 ' ' -дистеароил)-дибенэо-18-краун-б (ДСДБК), 2,3;11,12-(4•,4''-диолеил)-дибензо-18-краун-6 (ДОДБК), общей формулы:

Го^

R~9—Е^Г ТГ^З—с—R

° k/O^i о

где R = -СН=СН2 (ДАЛЕК) , -СН3 (ДАцДБК) , -С17Н35 (ДСДБК) , -C17H33 (ДОДБК). Оптимальным методом синтеза является ацилирование исходного ДБК соответствующими карбоновыми кислотами в среде полифосфорной кислоты с последующей очисткой продуктов методом препаративной ТСХ. Получен также ряд гидрофобных производных краун-эфиров с различной величиной циклополиэфирного кольца общей формулы

^о о °н 18 37

^

где n = 1 (I), 2 (II), 3 (III), 4 (IV), 5 (V). Стрсеш«э указанных соединений доказано элементным анализом и методами ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопии.

В отличие от исходных краун-эфиров, не обладающих поверхностно-активными свойствами, все синтезированные гидрофобные производные краун-эфиров способны образовывать монослои на границе раздела вода/воэдух. Показано, что площадь, приходящаяся на молекулу краун-

эфира в монослое, существенно зависит от^ природа и положения гидрофобного Заместителя, а также от состава и концентрации солей щелочных металлов в водной подложке. Так, например, для ДАДБК обнаружено значительное увеличение площади, приходящейся на молекулу вещества в монослое, от 3,84 (СэС1) и 4,26 (КС1) до 5,25 (ЫС1) и 6,14 нм2 (ЫаС1) по сравнению с ее величиной на бидистиллированной воде, которая равна 3,54 нм2/молекулу. Такое изменение площади связано с образованием комплексов между макроциклическим полиэфиром в поверхностном слое и катионом из водной субфазы. Анализ на моделях показал, что площади порядка 3,50 нм2/молекулу характерны для максимально "свернутой" конформации молекулы ДАДБК, в то время как площади, близкие к 6,50 км2/молекулу, соответствуют плоскому расположению циклополиэфирных колец по отношению к плоскости раздела фаз. Полимеризация ДАДВК в монослое позволяет зафиксировать различные конформации полиэфирного кольца молекулы, образующиеся при связывании краун-эфирами различных катионов из водной субфазы. Таким образом удается получать ультратонкие ориентированные пленки как бы "настроенные" на определенный катион. Комплексообразукщая способность ДАДБК в монослое на границе раздела фаз к катионам щелочных металлов изменяется в ряду: Ыа+ > Ьа+ > К4' > Сб+.

Кроме того, установлено, что калий-натриевая селективность производных краун-эфиров (ДА.30 (К+)/ДА-эо (Ыа+)) на границе раздела фаз существенно зависит от размера циклополиэфирного кольца молекулы, изменяясь от наименьшего значения (1,28) для краун-зфира с четырьмя кислородными атомами в циклополиэ&ирном кольце (I) до максимального значения (5,82) для краун-эфира с шестью кислородными атомами (III).

Впервые проведено сравнительное исследование структуры монослоев

»

производных краун-эфиров на солевых подложках и бидистиллате с использованием НАМ. Для солей калия и натрия обнаружено образование сферических доменов при давлениях визе 10 мн/м, в отличие от очень слабых для детекции структур на бидистиллате. Показано, что размер доменов определяется -гипом катиона (большие размеры в случае калия по сравнению с наг -О . Эти различия существенно зависят от величины поверхностного давления и полностью обратимы в циклах растяжение-сжатие монослоя.

Монослои всех изученных производных краун-зфиров количественно переносили на специальные электроды. Результаты электрохимических исследований показали высокую ионную селективность ленгмюровских пленок поверхностно-активных производных краун-эфиров, что позволяет их использовать как ионоселективные мембранные электроды.

3.2. Структура монослоев валиномицина■ и грамицидина в

рисутствии различных катионов в водной субфаза.

Валиномицин - циклический пептид, состояний иэ 12

минокислотных остатков, является подвижным переносчиком катионов

ереэ биомембраны, особенно высокоселективным по отношению к калига.

■рамицидин - линейный пептид, состояш^гй из 14 чередующихся а-амино-

мслот. В гидрофобном окружении грамицидин способен "сворачиваться"

1 а-спирали, образующие канал для переноса различных одновалентных

:атионов. Поэтому нами проведено детальное исследование как

юнослоев индивидуальных валиномицина и грамицидина, так и их смесей

: различными липидами, в том числе с полимеризующимися группами.

Установлено, что монослои валиномицина на КС1 и ИЬС1

:уш,ественно отличаются от таковых на ЫС1, ЫаС1, СбС1 и воде.

1зогермы поверхностное давление (к) - площадь на молекулу (А) и

юверхностный потенциал (АУ) - площадь на молекулу (А) для монослоев

>алинсмицина в присутствии К4, имеют три ярко выраженных участка

(рис. 3) : 1) при низких давлениях и больших площадях (жидко-

сонденсированное состояние I) ; 2) в области давлений 20-30 мН/м и

2

соответствующих им площадей 3,0-1,7 нм /молекулу (жидко-

сонденсированное состояние II) ; 3) в области давлений 30-40 мН/м

2

(вплоть до коллапса монослоя) и малых площадей 1,7-0,6 нм /молекулу (жидко-конденсированное состояние III). Переход иэ состояния I в состояние II можно обьяснить изменением "растянутой" конформации толипептидного кольца молекулы, при которой гидрофильные группы обращены в водную субфаэу, в очень специфическую "браслетную" конформацию, в которой все карбонильные и карбоксильные группы аминокислотных остатков координированы с катионом внутри молекулярной полости. Такая "браслетная" конформация, как было показано Ю.А.Овчинниковым с сотр., является исключительно стабильной и может образовываться даже в растворах валиномицина в присутствии К+ и . Это соответвствует жидко-конденсированному характеру

состояния II, в особенности его низкой сжимаемости. Переход из состояния II в III впервые описан нами как переориентация молекул валиномицина в "браслетной" конформации иэ горизонтального в вертикальное положение в монослое относительно поверхности раздела фаз. Дополнительным подтверждением этому является резкое увеличение значения брустеровского рассеяния (почти в 4 .раза) для монослоев

валиномицина на К* в состоянии III монослоя по сравнению с таковой

+

на воде, что соответствует увеличению толщины монослоя на К ,

Рис. 3. Зависимость изотерм поверхностного давления (а) и поверхностного потенциала (б) от площади на молекулу для смешанных монослоев ДЕЖ (i).c валиномицином (7) на i,0 М растворе KCl при их соотношении (моль/моль) - 10'Л (2), 5:1 (31, 3:1 (4), 1:1 (5), 1:3 (6).

которое можно объяснить только переориентацией молекул валиномицина, имеющих значительную ассиметрию размеров в "браслетной" конформации, из горизонтального в вертикальное положение относительно поверхности раздела фаз. В присутствии других солей в водной подложке изотермы монослоев валиномицина имеют только одну область (жидко-растянутое состояние X) и подобны аналогичным изотермам на воде.

Такое необычное поведение монослоев валиномицина в присутствии катионов К4" или в водной субфаэе свидетельствует о сильном и

высокоспецифическом комплексообраэовании валиномицина с указанными катионами. Полученные результаты находятся в хорошем соответствии с размерами катионов щелочных металлов и константами связывания валиномицина с этими катионами в органических растворителях (табл. 5). Обнаруженные эффекты существенно зависят от концентрации калия в водной субфаэе и от природы и размеров противоионов - анионов.

Таблица 5. Данные изучения монослоев валиномицина при его

комплексообраэовании с катионами щелочных металлов.

Водная подложка Радиус катиона,А К*, отн.ед. А** , нм^/мол. А^шах***-мВ Итах****< Дебаи

Вода - — --- 2 70 590 3,75

1ЛС1 0 68 < 5 2 78 660 3,95

МаС1 0 98 < 50 2 91 610 4,30

КС1 1 33 2600000 3 05 1170 5,65

№С1 1 49 2900000 3 88 1050 5,55

СэС1 1 65 650000 3 95 660 4,95

ИН4С1 1 46 < 47 3 15 620 4,35

* Константа комплексообраэования, ** площадь на молекулу при л = 10 мН/м, *** максимальное значение поверхностного потенциала, **** максимальное значение дипольного момента.

Изотерма тс-А для монослоев грамицидина А даже на бидистиллате

имеет две области: жидко-растянутое состояние I (при больших

площадях и давлении до 15 мН/м) и жидко-конденсированные состояние

2

II (при площадях 1,7-0,7 нм /молекулу и давлениях выше 20 мН/м вплоть до коллапса монослоя) с ярко выраженным плато (областью перехода) между ними, чем существенно отличается от таковых для валиномицина. На основании оценки молекулярных площадей для грамицидина в различных конформациях с помощью молекулярных моделей Стьюарта сделан вывод, о том, что грамицидин переходит, при

увеличении поверхностного давления в монослое, из мономерного состояния (I) в димерное (II), в котором а-спирали перпендикулярны поверхности раздела фаз. Таким способом удается получать непосредственно в монослое грамицидиновый канал, структурно адекватный таковому в биомембранах.

Исследование смешанных монослоев различных липидов с валиномицином и грамицидином показало, что, в зависимости от природы липида и соотношения пептид-липид, параметры монослоя существенно изменяются (рис. 3) . Так, для смешанных монослоев валиномицина с отрицательно Заряженной фосфатидной кислотой (ФК) наблюдаются положительные отклонения от аддитивности для зависимостей усредненого поверхностного давления и потенциала от мольной доли валиномицина в смеси. Эти отклонения наиболее ярко выражены в присутствиии калия в водной субфаэе (рис. 3) . Для смешанных ыонослоев валиномицина с цвиттерионным липидом - фосфатидилхолином (ФХ) таких отклонений не обнаружено. Поэтому считаем, что в первом случае имеет место взаимодействие между компонентами монослоя и ощущается влияние липида при комплексообраэовании валиномицина с катионом калия, а во втором - оно отсутствует. Изотермы л-А и ДУ-А для смеси валиномицина со всеми исследованными липидами, включая полимеризующиеся ПАМ, на солях калия и натрия существенно различаются, подобно таковым для монослоев индивидуального пептида. Следовательно, присутствие липидов в монослое и их полимеризация влияют на характер взаимодействия валиномицина с катионами калия и позволяют фиксировать- определенные конформации пептидов в монослое. Таким образом, подтверждена высокая калиевая специфичность валиномицина на границе раздела фаз, что позволяет использовать ленгмюровские пленки пептидных ионофоров как материалы для ионоселективных мембранных электродов и биосенсоров.

_3.3. Изучение взаимодействия холестерина и полистирольных

латексных частиц с дигитонином в целях медицинской диагностики.

Для изучения взаимодействия холестерина и полистирольных латексных частиц с дигитонином (полученных на кафедре синтеза полимеров МГАТХТ) в качестве модельных мембранных систем выбраны смешанные монослои холестерина с ФХ на границе раздела жидкость/газ. Показано, что введение суспензии латекса-маркера или раствора индивидуального дигитонина в водную субфазу под предварительно сформированный монослой чистого холестерина вызывает практически одинаковое линейное увеличение площади поверхности монослоя во

времени (рис. 4. кривая 6). Этот факт свидетельствует о связывании

молекул дигитонина с холестерином в монослое. Для сравнения в

аналогичных условиях были введены суспензии латекса-маркера или

раствора индивидуального дигитонина в водную субфаэу под

предварительно сформированный монослой чистого ФХ. В этих случаях

площадь монослоя не изменялась даже при длительном выдержавании

(рис. 4, кривая 1) , т. е. встраивание дигитонина в монослой

фосфолипида не происходило. Эти эксперименты показали, что

связывание дигитонина с холестерином является специфической реакцией

и не зависит от состояния дигитонина в водной субфаае (в растворе

или иммобилизованного на поверхности латексных частиц).

. « о/ Рис. 4. Зависимость

А А (То

15

5 "

9

О ^ °

□ □ □

□ О

о □

б 5

ц-

3 2

200

300

г, мин.

изменения площади монослоя от времени при введении полистирольного латекса с дигитонином в водную субфазу под монослой ФХ (1) ,

холестерина (6) и их смесей при мольной концентрации холестерина, равной 0,2 (2), 0,4 (3), 0,6 (4) , 0,8 (5) .

Каждая

клеточная

мембрана характеризуется определенным соотношением холестерина с фосфолипидами. Поэтому изучено поведение их смешанных монослоев при различных молярных соотношениях в присутствии латекса-маркера в водной субфазе (рис. 4). В этом случае после небольшого индукционного периода наблюдается значительное увеличение площади смешанного монослоя. Наклон прямолинейных участков кинетических кривых, полученных для различных холестерин-фосфолипидных смесей, практически одинаков, т.е. скорость реакции холестерина с дигитонином, находящимся на поверхности латексных частиц, не зависит от концентрации холестерина в ионослоо. Абсолютная величина изменения площади монослоя увеличивается с возрастанием количества холестерина в монослое, т.е. насыщение монослоя латексными частицами пропорционально концентрации холестерина. Максимальноа число частиц латекса, которое прореагировало с холестерином монослоя, и время насыщения монослоя

латексом-маркером находятся в линейной зависимости от холестерин-фосфолипидного состава монослоя.

Установлено, что синтезированный латекс-маркер реагирует только с холестерином, входящим в состав липидного монослоя. Так как увеличение концентрации холестерина в монослое приводит к росту максимального числа частиц, прореагировавших с монослоем, то с помощью такого латекса-маркера оценивали холестерин-фосфолипидный состав реальных биомембран. Биологические испытания такого рода проведены на эндотелиальных клетках аорты кроликов и крыс. Для этого применен традиционный метод блокирования определяемого компонента перед реакцией его выявления. Кинетические кривые связывания латекса-маркера с плазматической мембраной эндотелиальных клеток сосудов хорошо согласуются с таковыми для смешанных монослоев. Иэ указанных зависимостей определяли как кинетику взаимодействия латексных частиц с холестерином, так и максимальное число частиц, которые могут с ним прореагировать.

Таким образом, созданный латекс-маркер специфически реагирует с холестерином как модельных, так и биологических мембран, что позволяет рекомендовать его для диагностики атеросклероза.

4 . СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛЕНОК НА ОСНОВЕ МЕМБРАННЫХ СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ

_4.1._Получение и исследование мембран на основе

бактериородопсина и его смесей с полимеризуюшимися липидами.

Бактериородопсин (БР) является мембранным белком и способен образовывать стабильные монослои на границе раздела фаз даже без добавления липида. Нами разработан метод получения монослоев БР при нанесении его иэ водной суспензии на различные солевые подложки. Такой путь предпочтительнее нанесения иэ органических растворителей, т.к. предохраняет белок от денатурации и вымывания электростатически связанных молекул липидов, необходимых для поддержания третичной структуры БР. Установлено, что параметры монослоев БР существенно зависят от концентрации солей в водной субфаэе и степени аггрегации молекул белка в исходной суспензии. Необходимым условием получения стабильных монослоев БР является диспергирование водной - суспензии белка в течении 4 0-50 минут до нанесения на 0,1-0,5 М раствор КС1. Плошздь, приходящаяся на молекулу БР в монослое составляет порядка 8 нм^, что хоропо согласуется с рентгеновскими данными по структуре белка Б мембране. По данным брустеровского

рассеяния толщина монослоя БР на 0,1 М КС1 составляет порядка 5 нм, что соответствует толщине липидного бислоя. Полученные данные позволили впервые показать, что монослои БР являются адекватной моделью нативных мембран пурпурных бактерий.

Изучено воздействие фильтрованного излучения в диапазоне 530600 нм (максимум поглощения БР - 570 нм) на монослои БР, его производного, модифицированного акрилоилхлоридом по аминогруппам лизина (АКБР), и их смесей с различными липидами (рис. 5).

Рис. 5. Обратимые изменения площади от времени фотоактивации (570 нм) для исходных монослоев АКБР с АКФЭ (1), БР (2), а также монослоев БР с АКФЭ (3), АКБР с АКФЭ (4) после их полимеризации при 10 мН/м на 0,5 М растворе КС1 (| - включение , | - выключение облучения).

С началом облучениия (стрелка | на рис.5) всей поверхности монослоя БР (X. 570 нм) площадь монослоя уменьшается и через 4-5 минут достигает постоянных значений (поверхностное давление постоянно и равно 10 мН/м) . После прекращения облучения (стрелка Т на рис. 5) величина площади монослоя начинает медленно возвращаться к исходному значению. Аналогичные обратимые изменения поверхностного потенциала монослоев БР обнаружены при тех же условиях фотоактивации белка. Указанные эффекты можно объяснить конформационным изменением белка в тримере и изменением угла наклона его а-спиралей по отношению к поверхности раздела фаз. Впервые обнаружено, что обратимое изменение площади монослоя для смешанных монослоев БР или АКБР с липидами, в том числе с полимеризугощимся липидом АКФЭ (рис. 5, кривая 1) , несколько больше, чем для индивидуального белка (рис. 5, кривая 2). По-видимому, это связано с больней подвижностью БР в липидном окружении. Полимеризация липида при малой интенсивности УФ-облучения (X 254 нм) уменьшает обратимые изменения площади смешанного монослоя ВР-АКФЭ при фотоактиБации белка (рис. 5, кривая 3) . Иными словаки,

иммобилизация БР в пленку линейного полимера ограничивает конформациокную подвижность белка. Сополимеризация АКБР ("поли-функциональиого макромономера") с АКФЭ в смешанном монослое уменьшает величину таких обратимых фотоизменений площади монослоя более чем на порядок (рис.5, кривая 4) . Следовательно, химическая иммобилизация модифицированного белка в липидное окружение с образованием сшитого полимерного монослоя существенно ограничивает конформационную подвижность БР в различных состояниях фотоцикла.

Эти эффекты коррелируют с результатами измерения брустеровского рассеяния (EAP) монослоев БР (рис. 6). Абсолютные величины обратимых изменений ВАР практически одинаковы при различных временах облучения, но зависят от интенсивности света, расстояния между светопроводяшим оптическим волокном и поверхностью монослоя, а также приложенным поверхностым давлением. Принимая во внимание, что изменение БАР пропорционально изменению толщины монослоя, можно сделать вывод о том, что толщина конденсированного монослоя БР несколько уменьшается при облучении и полностью восстанавливается в период темновой релаксации.

Рис. б. Зависимости величины брустеровского рассеяния (1) и поверхностного давления (2) от времени фотореактивации (570 нм) при 22,5 мН/м на 0,1 М растворе КС1 для монослоев БР (|- включение , | - выключение облучения)

Принципиальной является проблема получения высокоупорядоченных пленок на основе биополимеров, обеспечивающих направленный перенос Зарядов через мембрану. Полученные линейные зависимости оптической плотности мультислойных пленок БР при 560 ни (максимум поглощения белка) и величины стационарных фотоиндуцированных изменений при 420 нм (в полосе поглощения отностительно стабильного интермедиата М422 фотоцикла БР) от числа перенесенных монослоев в пленке свидетельствует о регулярном количественном переносе монослоев с поверхности раздела фаз на твердые подложки и достаточно полном

сохранении фотохромных свойств БР. Фотоэлектрические измерения таких пленок, проведенные совместно с Е.П.Лукашевым и А.А.Кононенко на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ, показали, что кинетика образования и распада интермедиата М412 на стационарное и импульсное освещение не отличается от таковой для нативных пурпурных мембран. При стационарном освещении пленки, состоящей из 10 монослоев, возникает фотопотенциал около 15 мВ, кинетика образования и спада которого совпадает с кинетикой интермедиата М42.2 (рис. 7) .

Рис. 7. Обратимые изменения фотоиндуцированного потенциала (а) и оптической плотности при 420 нм (б) в случае фотоактивации (570 нм) лекторов ских пленок,

состоящих из 10 монослоев бактериородопсина < | - включение , | - выключение облуче-ния).

По знаку фотопотенциала определяли преимущественную ориентацию белка в ионослое, а по величине фот .-потенциала степень его .'.р.чдочен-ности. Электропологм'-гельной, для мультислойных пленок БР, является поверхность пленки, обращенная к подложке.

Поскольку перенос монослоя осуществляли по методу Ленгмюра-Шефера (горизонтальный лифт), а фотоиндуцированный транспорт протонов в ЕР происходит в направлении периплаэматического участка, то можно сделать вывод о предпочтительной ориентации ЕР в монослоев на границе раздела вода/воздух цитоплазматической стороной к водной субфазе (рис. 7) . Считаем, что предложенный метод реконструкции БР в ультратонкие пленки по ленгмюровской технологии позволяет получать материалы, в которых БР полностью сохраняет свои нативные оптические и фотоэлектрические свойства. При этом адгезия пленок к использованным

Эе 1п.-йа

твердотельным подложкам и их устойчивость, особенно после полимеризации, являются достаточно высокими. Таким образом, измеренные характеристики пленок БР показывают возможность и> использования в молекулярной и оптоэлектронике.

Наиболее важными для практического применения являются фотохромные и фоторефрактивные свойства пленок БР. Испытания полученных фотохромных материалов (ФХМ) на основе БР, иммобилизованного в различные полимерные матриц (желатин, полиакриламид, поливиниловый спирт, метилцеллгалоза, полистирол) продемонстрировала их хорошие фотохромные свойства: высокую чувствительность > цикличность, узкие и неперекрывающиеся области поглощения исходной ^ фотоиндуцированной форм, высокую разрешающую способность (табл. 6).

Таблица 6. Состав и некоторые фотохромные свойства полимерных пленом с иммобилизованным бактериородопсином._

Состав некоторых ФХМ Фотохромные свойства

N Мц, БР, паи, ПЭГ, Светочувст- Оптич. плот- Время хране-

« % % % вительность ность при 570 нения инфор-

103,Дж/см2 нм, опт. ед. мации , сек.

1 79,9 12,8 ■7,3 ---- 5,4 0,91 180

2 74 ,4 12,0 13,6 ---- 8,2 1,30 550

3 61,7 9,9 28,4 ---- 8,4 1,06 700

4 "48,1 7,6 44,3 ---- 2,1 1,90 450

5» Ло 7,1 48,7 ----

6 , 6 2,2 13,1 ---- 4,7 2,1 1,69 140

7 '71,9 11 ,6 ---- 16,5 3,0 1 ,58 400

8 69,0 11,0 ---- 20,0 3,9 1,61 500

9 65,0 10,3 ---- 24,7 3,6 1,55 430

10 60,2 9,7 ---- 30,1 2,8 1,50 150

* Бахтериородпосин теряет фотохромные свойства.

Одним из наиболее ценных свойств полученных ФХМ является возможность регулирования времени жизни промежуточного возбужденного состояния БР, а, следовательно и времени хранения оптической информации на таком материале. Этот параметр можно регулировать в широких пределах (до 10^ раз) как подбором соответствующей полимерной матрицы, так и введением специальных полимерных модифицирующих добавок (табл. . 6) . Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве полимерной матрицы метилцеллюлозы (№1 56000, со степенью замещения

,9), с введением пластификатора - полиэтиленгликоля (toi 300) и одифициругащей добавки - полиэтиленимина (Мм ЗОООО). Результаты этих сследований показали (табл. 6), что на времена жизни промежуточных орм фотохромного цикла БР влияет не столько эффект увеличения яэкости полимерной матрицы, сколько специфические взаимодействия БР полимерными модифицирующими добавками.

Другим направлением применения полимерных пленок на основе БР вляются фоторефрактивные элементы голографических систем. Получение ФХМ бьши исследованы совместно с Н.М.Кожевниковым и сотр. кафедра обпей физики ЛГТУ) в голографической виброметрии для есконтактной регистрации ультразвуковых вибраций обьектов. В роцессе выполнения работ бьши впервые изготовлены и протестированы пытные образцы различных адаптивных интерферометров с голографи-еской регистрацией сигналов фазовой модуляции световых пучков.

4.2. Сравнительное исследование пленок на_основе белков

еакционных центров и их смесей с липидами.

Реакционные центры (РЦ) фотосинтетических бактерий представляют обой хромофор-белковые комплексы, способные к фотоиндуцированному аправленному переносу электрона через биомембраны. Нами получены и сследованы монослои РЦ из пурпурных (Rhodopseudomonas viridis, hodobacter sphaeroides дикий тип и штамм R-26) и зеленых Chloroflexus aurantiacus) фотосинтетических бактерий. Изотермы 7t-А пя всех указанных РЦ имеют два участка с различным наклоном кривой, аждый из которых соответствует определенному состоянию монослоя, ри- низких давлениях и больших площадях на молекулу (жидко-зстянутое состояние I) поведение монослоев РЦ определяется злекулами. детергента - лаурилдиметиламиноксида (ЛДАО), который ^пользуется при выделении РЦ из биомембран, обволакивая гидрофобную эверхность белковых глобул. Перегиб на 7t-А изотермах РЦ при авлениях 30-32 мН/м соответствует началу сжатия белкового монослоя кидко-конденсированное состояние II) после полного "выдавливания" ЦАО в водную субфазу. Давление коллапса (лк) для монослоев РЦ из С. ürantiacus составляет 58 мН/м, что на 3 и 8 мН/м выше, чем для КЬ. ohaeroides (дикий тип и штамм R-26, соответственно) и на 5 мН/м лае, чем для К. viridis. Это свидетельствует о высокой прочности знослоев РЦ, особенно из С. aurantiacus, которые имеют только едрофобяые белковые субьединицы в отличие от РЦ из других бактерий.

Площадь (Ак), соответствующая давлению коллапса монослоя РЦ, зедставляет собой сечение наиболее плотной упаковки молекул и

сравнима с кристаллографическими данными для РЦ в биомембранах. Максимальные плодили Ак для РЦ иэ Rb. sphaeroides (дикий тип и штамм R-26) и С. aurantiacus составляют порядка 35-45 нм2, что соответствует диаметру б,6-7,6 нм для белка в сферической аппроксимации. Указанные параметры совпадают для трех РЦ, имеющих существенные отличия в строении: три белковые субединицы (L, М, Н) 1 РЦ иэ КЬ. sphaeroides, или только две мембранные субединицы (L, М) -РЦ иэ С. aurantiacus. Отсюда можно сделать вывод, что гидрофильная И-субьединица, которая прочно связана с РЦ из Rb. sphaeroides с цитоплааматической стороны мембраны, не влияет на параметры РЦ в монослое. Максимальная площадь на молекулу РЦ из R. viridis составляет порядка 90 нм2, что соответствует диаметру белковой сферы в 10,7 нм. Таким образом, Ак для РЦ иэ R. viridis в монослое находится между двумя асимметричными (13,0 - 7,0 нм) кристаллографическими размерами белка, что свидетельствует о наклонном расположении длинной оси этого РЦ относительно поверхности раздела фаз.

Детальное исследование параметров монослоев всех указанных РЦ при различных составах, pH и температуре водной субфазы выявило следующие оптимальные условия их формирования: 10 мМ фосфатный буфер в водной субфазе при pH 7,0 и температуре 15-20°С. При этих условиях монослои РЦ бьши количественно перенесены методом Ленгмюра-Блоджетт на различные твердотельные подложки с оптимальным коэффициентом переноса (95 %) при давлении 40 мН/м (в состоянии. II монослоя) ,

Спектральные свойства мультислоев РЦ хорошо согласуются с таковыми для суспензий аналогичных белков. Впервые записаны спектры ГКР монослоев всех указанных РЦ (рис. 8) , перенесенных на электрохимически разрыхленные серебрянные электроды, при различных длинах волн возбуждающего излучения. Например, при длине . волны возбуждения 488 нм в спектрах ГКР монослоев РЦ иэ R. viridis и Rb. sphaeroides (дикий тип) хорошо видны три полосы поглощения (15201530, 1157-1161 и 1003-1004 см"*), соответствующие молекулам каротеноидов, что является важным структурным отличием этих РЦ от двух других (рис. 8). В спектрах ГКР Rb. sphaeroides (штамм R-26) и С. aurantiacus четко видны менее интенсивные полосы поглощения бактериохлорофила и бактериофеофитина, составляющих основу фоточувствительного пигаентного комплекса кофакторов у всех РЦ. Полосы кофакторов лучше разрешены при длине волны возбуждения 406,7 нм, причем появление интенсивных полос поглощения при 1370 и 690 см"^ в спектре ГКР R. viridis соответствует присутствию цитохрома непосредственно на поверхности электрода. На основании спектров ГКР,

Рис. 8. Спектры ГКР монослоев РЦ из фогосштезнрующих бактерий: ЕЪ. sph. (w.t.) (1), Е. viridis (2), С. aur. (3),Rh.sph. (R-^26) (4) на серебряных электродах при лазерном Еозбузденян 488 нм и 10 мВт.

полученных для монослоев РЦ при различных условиях переноса на электрода и при различных интенсивностях возбуждающего излучения, определена преимущественная ориентация этих пигмент-белковых комплексов на границе раздела фаз.

Структура и функция РЦ фотосистемы IX (ФС11) растений подобна

таковым для РЦ фотосинтетических бактерий, но в целом ФС11 является

более сложным комплексом, менее стабильным при выделении. Нами

впервые получены и исследованы монослои как РЦ, так и

еветособираюцюс комплексов ФС11 шпината. Обнаружено, что параметры

монослоев ФС11РЦ зависят незначительно от природы и концентрации

/

буфера в водной субфазе в области 1-100 мМ, тогда как на бидистиллированной воде не удается получить стабильных монослоев. Площадь Ак для ФС11РЦ в монослое составляет в среднем 12,5 нм^ на пигмент-белковый комплекс и зависит от концентрации белка, pH и температуры водной субфазы. Анализ результатов СДС-электрофореза образцов, собранных из различных мест "ленгмгаровской ванны", показал, что весь ФС11РЦ находится на поверхности раздела фаз в виде нативного комплекса. Спектры ГКР для монослоев ФС11РЦ, перенесенных различными методами на Ag-электроды, подобны нативным мембранам и позволяют оценить ориентацию ФС11РЦ на границе раздела фаз. При исследовании фотохимической активности белка обнаружено, что интенсивность полосы окисленной формы cyt-559 уменьшается, а интенсивность полосы восстановленной формы цитохрома увеличивается с возрастанием мощности лазерного облучения (от 0,6 мВ до 20,0 мВ) . Этот эффект полностью обратим, что свидетельствует о сохранении функциональной активности ФС11РЦ в монослое. Дополнительным подтверждением тому явиляется наличие максимума при 681,2 нм, типичного для активной формы комплекса, в спектре флуоресценции монослоя ФС11РЦ при "быстром" сжатии перед переносом на электрод.

Анализ данных фотоэлектрических измерений мультислоев РЦ и их смесей с липидами указывает на сохранение активности белка в модельных мембранах и позволяет оценить его ориентацию на границе раздела фаз (рис. 9) . На основании знака фотопотенциала (плюс на БпОг-электроде в случае РЦ из ЕЬ. sphaeroides) и определенного спектрофотометрически колическтва белка в пленке, показано, что в монослое этих РЦ Н-субьединица ориентирована по направлению к водной субфазе и степень ориентации составляет порядка 80 %. Для пленок РЦ из R. viridis (минус на SnOg-электроде), обнаружено, что более гидрофильная суб ь единица - цитохром, сориентирована в водную

субфазу, а Н-субьединица - на воздух. В случае пленок РЦ из С. аигап^асиэ величина фотопотенциала незначительна, что, наряду с сохранением функциональной активности белка по спектральным данным, свидетельствует об отсутствии преимущественной его ориентации на границе раздела фаз. Это можно обьяснить отсутствием существенной асимметрии в структуре РЦ иэ С. ашгап1:1асиз.

Рис. 9. Фотоэлектрический потенциал ленгмюровских пленок, состоящих из 10 монослоев РЦ Шэ. БрЬ. - АКФЭ (1:10, моль/ моль) (а) и 25 монослоев РЦ ИЪ-врЬ. - ТДК (1:100, моль/ моль) (б) при фотовозбуждении (1 - включение, Т - выюочение облучения)

Использование специально синтезированных полимеризу-

ющихся липидоподобных мономеров позволяет существенно влиять на ориентацию РЦ в смешанных монослоях и увеличивать их стабильность. Так, пленки на основе РЦ из №. БрИаегохйеБ и АКФЭ (1:10, моль/моль) после полимеризации полностью сохраняют свои спектральные и фотоэлектрические свойства (рис. 9) . Знак фотопотенциала и кинетика его генерации как до, так и после полимеризации соответствовали таковым для пленок индивидуального РЦ иэ ЛЬ. грЬаего1с!ез (плюс на Зп02~электроде) (рис. 9). В то же время, смешанные пленки на основе РЦ иэ КЪ. БрЪае гохс^в и тетракоэадиинсвсй кислоты (7ДК) (1:100, моль/моль) как до, так и после полимеризации имели противоположный знак фотопотенциала (минус на впС^-электроде) (рис. 9).

Следовательно, ориентацию белковых молекул в монослое можно изменять в желаемом направлении путем использования специально синтезированных ПАМ, что открывает новые перспективы для создания фоточувствительных материалов и датчиков на их основе.

5. УЛЬТРАТОНКИЕ ОРИЕНТИРОВАННЫЕ МЕМБРАНЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ

Для изучения процессов иммобилизации ферментов определяли способность глюкоэооксидаэы (ГОД) адсорбироваться на монослои различных ПАВ типа стеариновой кислоты, цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) , липидов (ФХ, ФЭ, ФК) и их смесей на границе раздела вода/воздух. Показано, что ГОД значительно сильнее адсорбируется на монослои положительно заряженных смесей липидов с ЦТАБ, чем на монослои цвиттерионных или отрицательно Заряженных липидов. Так, например, площадь на молекулу липида в присутствии фермента (после 1 часа релаксации) увеличивается на 34 % в случае индивидуального ФХ и почти в 3 раза для смеси ФХ-ЦТАБ (1:1 моль/моль) . В то же время давление коллапса липид-белковых монослоев практически не отличается от такового для исходных монослоев липидов, что свидетельствует об их высокой стабильности. Повышенную адсорбцию фермента на смешанные монослои ФХ-ЦТАБ можно объяснить электростатическим взаимодействием отрицательно заряженных участков белковых глобул с положительно заряженными аммониевыми и холиновыми группами ПАВ при нейтральных рН. Одновременно проведенная оценка активности и распределения фермента в "ленхыюровской ванне" показала, что концентрация и активность ГОД в монослое существенно выше в присутствия предварительно сформированного монослоя липида.

Полученные липид-белковые монослои достаточно стабильны при высоких поверхностных давлениях (20-40 мН/м), что позволило переносить их на различные твердотельные подложки (в том числе на специальные электроды) с образованием мультислойных структур эаданой толщины. Типичный амперометрический сигнал такого ферментного электрода (биосенсора) достигает максимального значения в 1-2 нА через 10 с после добавления раствора глюкозы в измерительную ячейку.

С целью улучшения параметров биосенсора использовали полимери-зующийся аналог ЦТАБ (МА16Вг). Этот положительно заряженный ПАМ способен образовывать стабильный монослой в отсутствие других липидов, что приводит к повышению суммарного положительного заряда монослоя ПАМ и увеличивает адсорб-цию фермента на такой монослой. При использовании МА-16-Вг амперо-метрический сигнал биосенсора увеличивался на порядок (рис. 10) по сравнению с наилучшими результатами для смеси ФХ-ЦТАБ, что обьясняется увеличением концентрации фермента на единицу площади электрода. После полимеоиэаиии монослоя МА16Вг с адсорбированным ферментом,

улучшается воспроизводимость измерений и увеличивается срок службы биосенсора за счет того, что полимерный монослой липида предотвращает постепенное вымывание фермента с поверхности электрода.

Рис. 10. Зависимость величины амперометри-ческого сигнала (I) от введения глюкозы [С] в измерительную ячейку для Pt - электродов, покрытых двумя (1), четыремя (2), шестью (3), восемью (4) и десятью (5) монослоями МА16Вг - глкжозо-оксидазы.

2 4 6 С, мМ

Обнаружена линейная зависимость амперометрического сигнала биосенсора от концентрации глюкозы в области 0,5-5,0 мМ (рис. 10). При дальнейшем увеличении концентрации глюкозы сигнал возрастает нелинейно, что можно обьяснить как субстратным насыщением молекул фермента, так и кинетическим контролем амперометрического сигнала. Обнаружена линейная зависимость величины сигнала от числа нанесенных на электрод липид-белковых монослоев и от величины поверхностного давления, при котором осуществлялся перенос липид-белковых монослоев на электрод. Оба эффекта связаны с изменением количества фермента на электроде при указанных условиях. Таким образом, тонкопленочной технологией впервые получен биосенсор, способный измерять глюкозу в физиологической области концентраций.

Аналогичные исследования, проведенные с рядом других ферментов (уреаэой, каталаэой, бактериолюциферазой, аденоэинтрифосфатазой), показали применимость такого подхода к созданию стабильных ультратонких ориентированных пленок как материалов биосенссрных устройств.

ВЫВОДЫ

1. В результате установленных общих закономерностей полимеризации специально синтезированных липидоподобных мономеров в монослоях и процессов молекулярного узнавания (на примере краун-

I ,нА

эфиров, пептидных ионофоров, латексов-маркеров, ферментов), а также процессов фоторецгпкии светочувствительных мембранных белков на границе раздела фаз, сформулированы основные принципы создания функциональных ультратонких ориентированных мембран как моделей биомемйран и перспективных материалов для биосенсорных устройств. Установлены принципы стабилизации определенных конформаций биологически-активных соединений, иммобилизованных в монослои НАМ, путем полимеризации липидного окружения.

2. Впервые для изучение структуры биологически-активных соединений в монослое применены методы рефлектометрии и микроскопии брустеровского рассеяния, спектроскопии резонансного и гигантского комбинационного рассеяния, что дало уникальную структурно-функциональную информацию об этих системах.

3. Разработаны методы синтеза ряда липидсподобных мономеров, содержащих полимеризующиеся группы в различных частях молекулы, а также условия модификации биологически-активных соединений полимери-зуюшимися группами при сохранении их функциональной активности.

4. Количественно описана радикальная полимеризации ряда производных фосфолипидов в монослое на границе раздела жидкость/газ и показано влияние структуры монослся на кинетику процесса.

5. Впервые получены монослои и ленгмюровские пленки, в том числе полимерные, при использовании специально синтезированных поверхностно-активных производных краун-эфиров. Проверено детальное изучение монослоев пептидных ионофоров (валиномицина и грамицидина) и их смесей с липидами как моделей биомембран. Показана высокая селективность указанных биологически-активных соединений при ксмплексообраэовании с катионами щелочных металлов на границе раздела фаз и возможность использования таких систем как ионоселективных мембранных электродов.

1 6. Впервые получены и систематически исследованы полимерные ультратонкие мембраны с иммобилизованным светочувствительным белком - бактериородопсином. Показано применение таких пленок как элементов фотодатчиков и фотохромных материалов для записи и хранения оптической информации. Впервые изготовлены и протестированы опытные образцы различных адаптивных интерферометров с топографической регистрацией сигналов фазовой модуляции световых пучков, в которых как фоторефрактивные элементы использованы полимерные пленки с иммобилизованным бактериородопсином.

7. Определены оптимальные условия формирования и проведено сравнительное исследование моно- и мультислоев белков реакционных

*ентров (РЦ) из фотосинтетических бактерий {Ehodopseudomoiias

riridis, Rhodobacter sphaeroxdes (дикий тип и штамм R-26) , Zhloroflexus auranfciacus) и фотосистемы II шпината. Впервые >бнаружена способность белков РЦ к переориентации в монослое при вменении липидного окружения и доказано влияние структуры пигмент-¡елковых комплексов на преимущественную ориентацию РЦ на границе эаздела фаз. Показано, что по своим спектральным и фотоэлектрическим :войствам такие пленки РЦ перспективны для использования как )оточувствительные элементы биосенсорных устройств.

8. На основе изучения взаимодействия полистирольного латекса-гаркера с холестерином в модельных и биологических мембранах >азработаны рекомендации для его использования при измерении уровня холестерина в мембранах и диагностике атеросклероза.

9. Изучена адсорбция различных ферментов (глхжоэооксидазы, ■реазы, каталаэы) с сохранением их функциональной активности на юнослои ПАМ и получены на их основе ленгмюровские пленки, пригодные I качестве чувствительных элементов биосенсоров на соответствующие :убстраты.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1. Зайцев С.Ю. , Луценко В.В., Зубов В.П. Получение и исследова-ие мономолекулярных слоев на основе производных дибенэо-18-краун-б / Биоорганич. химия. - 19ВЗ, Т.9, N.4, С.567-569.

2. Зайцев С.Ю., Луценко В.В., Зубов В.П. Исследование поверх-остно-активных свойств и полимеризации в монослоях некоторых ПАМ // III Всесоюзная конф. по коллоидной химии и физико-химической меха-ике: Тезисы докл. - Ташкент, 1983, С.25-26.

3. Зайцев С.Ю. , Зубов В.П. Синтетические модели биологических ембран на основе полимеризующихся поверхностно-активных мономеров /16 Международная конф. ФЕБО: Тезисы докл. - Москва, 1984, С.356.

4. Зайцев С.Ю. Ионная селективность валиномицина в мономолеку-ярных слоях // 2 Всесоюзная конф. по химии макроциклов: "Тезисы зкл. - Одесса, 1984, С. 140.

5. Зайцев С.Ю., Эвонкова E.H., Зубов В.П. Синтез полимеризуемых эоизводных фосфолипидов и создание полимерных монослоев и липосом

1 их основе с иммобилизованным бактериородопсином // Биоорганич. 1мия. - 1986, Т.12, N.12, С.1675-1677.

6. A.c. СССР N.1389491. 1987. Фотохромный материал. Зубов В.П., шцев С.Ю., Новикова М.Б., Всеволодов H.H., Жармухамедов С.К.

7. A.c. СССР N.1389492. 1987. Фотохромный материал. Зубов В.П., Зайцев С.Ю., Новикова М.Б., Всеволодов H.H., Жармухамедов С.К.

8. A.c. СССР N.1473563. 1988. Голографическое устройство для регистрации вибраций в режиме реального времени. Абдулаев Н.Г., Барменков Ю.О., Зайцев С.Ю., Зосимов В.В., Зубов В.П., Кожевников Н.М. , Лямшев Л.М. , Новикова М.Б.

9. Зайцев С.Ю., Зубов В.П., Кочетков Е.Д., Лускинович П.Н., Соболев А.Г., Травкин H.H., Чернов С.Ф. Свечение туннельных структур металл-барьер-металл на основе ленгмюровских пленок // Поверхность. Физика, химия, механика. - 1987, N.6, С.81-85.

/

10. Горковенко A.A., Берман Е.Л., Зайцев С.Ю. , Зубов В.П., Пономаренко В.А. Синтез и поверхностно-активные свойства углеводных амфифилов и полимеров на их основе // Известия АН СССР, серия химическая. - 1987, С.2304-2308.

11. Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Полимерные монослои и липосомы на основе липидоподобных мономеров // Биологич. мембраны. - 1988, Т.5, С.252-257.

12. Зайцев С.Ю., Дзехцер С.В., Зубов В.П. Полимерные монослои с иммобилизованным бактериородопсином // Биоорганич. химия. - 1988,

Т.14, N. 6, С.850-852.

13. Абдулаев Н.Г., Барменков Ю.О., Зайцев С.Ю., Липовская М.Ю., Зубов В.П., Кожевников Н.М. Фоторефрактивная чувствительность полимерных пленок, содержащих бактериородопсин // Журн. технич. физики. - 1988, Т.58, Вып.4, С.833-836.

14. Повалий Т.М., Попова Е.Г., Зайцев С.Ю., Гусев С.А., Гриц-кова И.А., Коган Э.М. Холестерин в плазмалеме эндотелеоцитов аорты е норме и при гаперхолестеринемии // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1988, N.11, С.47-51.

15. Zaitsev S.Yu., Zubov V.P. Polymer Membranes with Immobilized Proteins // 1 Conference on Problems and Prospects of Biotechnology: Abstracts. - Bratislava, 1988, P. 47.

16. Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Ионная избирательность валиномицинг в монослоях // Виологич. мембраны. - 1988, Т.6, N.8, С.883-891.

17. Zaitsev S.Yu., Dzekhtser S.V., Zubov V.P. Polymer Membrane: with Iirroobilized Bacteriorhodopsin // Studia Biophysica. - 1989, V.132, N.1-2, P.105-110.

18. Lykashev E.P., Zaitsev S.Yu., Kononenko A.A., Zubov V.P. Photoelectrical Properties of Bacteriorhodopsin in Langmuir Films // Studia Biophysica. - 1989, V.132, N.l-2, P.111-118.

19. Лукашев Е.П., Зайцев С.Ю., Кононенко A.A., Зубов В.П. Фотоэлектрические свойства мономолекулярных пленок бактериородспсина // Докл. АН СССР. - 1989, Т.308, N.1, С.225-230.

20. Зубов В.П., Егоров В.В., Зайцев С.Ю. Полимеризация поверхностно-активных мономеров '// Всесоюзная конф. "Радикальная полимеризация": Тезисы докл. - Горький, 1989, С.188-189.

21. Зайцев С.Ю., Зубов В.П., Ханке Т., Эберт Б., Шеллер Ф. Биосенсор на основе ленгмюровских пленок глюкозооксидззы // Всесоюзная конф. "Химические сенсоры": Тезисы докл. - Ленинград, 1989, С.215.

22. Егоров В.В., Зайцев С.Ю., Клямкин A.A., Зубов В.П. Радикальная полимеризация катионных поверхностно-активных мономеров в монослоях на границе раздела вода-газ // Высокомолекул. соедин. -1990, Т.32А, N. 5, С.949-954.

23. Егоров. В.В., Зайцев С.Ю., Клямкин A.A., Ксенофонтова О.Б., Зубов В.П. Структурообразование в монослоях непредельных алкил-аммоний галогенидов на границе вода-газ // Коллоид, журн. - 1990, Т.52, N.4, С.770-774.

24. Киселев Е.М., Будипевская О.Г., Зайцев С.Ю., Грицкова И.А., Пучин В.А. Исследование поверхностно-активных свойств ненасыщенного 5-гмдроперокси-5-метил-1-гексен-3-ен-пероксида на границе раздела вода/воздух // Коллоид, журн. - 1990, Т.52, N.4, С. 668-671.

25. Зайцев С.Ю., Калабина H.A., Зубоз В.П. Биосенсор на основе ленгмюровских пленок глюкозоксидазы //'Журн. аналитич. химии. -1990, Т.45, Вып.7, С.1452-1455.

26. Решетилов А.Н., Абрамочкина Ф.Н., Литвинов Е.Г., Зайцев ' С.Ю., Зубов В.П. Генерация электрохимического потенциала мембранами, содержащими мономолекулярные пленки бактериального родопсина // Журн. аналитич. химии. - 1990, Т.45, Вып.7, С.1410-1415.

27. Львов Ю.М., Ерохин В.В., Зайцев С.Ю. Белковые пленки Ленг-мюра-Блоджетт // Биологич. мембраны. - 1990, Т.7, N.9, С.917-937.

28. Калабина H.A., Зайцев С.Ю., Кутузов М.А., Золотарев A.C., Лукашев В.П., Кононенко A.A., Абдулаев Н.Г., Зубов В.П. Сравнительное исследование монослоев белков фотосинтетических реакционных центров из зеленых нитчатых и пурпурных бактерий // Биологич. мембраны. - 1990, Т.7, N.10, С.1086-1092.

29. Егоров В.В., Клямкин A.A., Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Особенности кинетики радикальной полимеризации катионных поверхностно-активных мономеров в монослоях // Биологич. мембраны. - 1990, Т.7, N.12, С.1332-1336.

30. Зайцев С.Ю. функциональные полимерные ленгмюровские пленки. Структура, свойства, применение // Республ. школа-конф. "Функциональные полимеры": Лекционный курс. - Алушта, 1990, С.75-84.

31. Zaitsev S.Yu., Kalabina N.A., Zubov V.P. Lipid-Protein Langmuir Films // International Congress on Membranes and Membrane Processes (ICOM-90): Preprints. - Chicago, USA, 1990, P.127-129.

32. Zaitsev S.Yu., Zubov V.P. Langmuir Films of Biopolymers: Design and Prospects of Application // 3 European Conference on Organized Organic Thin Films: Preprints. - Mainz, FRG, 1990, P.8.

33. Зайцев С.Ю., Краух Т., Зубов В.П. Монослои поверхностно-активных производных нуклеозидов // Биологич. мембраны. - 1991, Т.8, N.8, С.885-891.

34. Scheller F., Schubert F., Neumann В., Pfeiffer D., Hintsche R., Dransfeld I., Wollenberger U., Renneberg R., Warsinke A., Johansson G., Skoog M., Yang X., Bogdanovskaya V., Buckmann A., Zaitsev S.Yu. Second Generation Biosensors // Biosensors & Bioelectronics. - 1991, V.6, N.3, P.245-253.

35. Зайцев С.Ю., Ханке Т., Волленбергер У., Эберт Б., Калабина Н.А., Зубов В.П., Шеллер Ф. Моно- и мультислойные мембраны с адсорбированной глюкоэооксидаэой // Биоорганич. химия. - 1991,

Т.17, N.6, С.767-772.

36. Егоров В.В., Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Радикальная полимеризация ассоциатобразуюших мономеров в воде // Высокомолекул. соедин. - 1991, Т.ЗЗА, N.8, С.1587-1608.

37. Егоров В.В., Ксенофонтова О.Б., Бондарев В.Н., Супрун Н.В., Клямкин А.А., Новаковский В.Б., Зайцев С.Ю. Влияние температуры на протекание радикальной полимеризации мицеллообразухщих ПАМ // Вестник Московского Университета, серия 2 (Химия). - 1991, Т.32, N.5, С.526-529.

38. Povaliy Т.М., Popova E.G., Gusev S.A., Grigorieva M.E., Zaitsev S.Yu., Gritskova I.A. New Method of Cell Membrane Cholesterol Marking for Scanning Electron Microscopy // SCANNING. -1991, V.13, P.249-253.

39. Krauch Т., Zaitsev S.Yu., Zubov V.P. Synthesis and Behavioi in Monolayers of the Surface-Active Derivatives of Nucleosides // Colloids & Surfaces. - 1991, V.57, P.383-391.

40. Zaitsev S.Yu., Zubov V.P. Functional Polymeric Monolayers and Liposomes // Makromol.Chem.,Macrcmol.Symp. - 1991, V.46, P.9-17

41. Zaitsev S.Yu., Chumanov G.D., Cotton T.M., Uphaus R.A. Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Monolayers of

'hotosynthetic Reaction Centers. // Pittsburg Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (Pittcon-92): Abstracts. - New Orleans, USA, 1992, P.269,

42. Zaitsev S.Yu., Plyasova E.V., Grishina E.N., Zubov V.P. <ineties of Polymerization of the Acrylic and Diacetylene Lipid-like Monomers in Monolayers // 4 European Conference on Organized Organic Thin Films: Preprints - Bangor, UK, 1992, P.DP7.

43. Picorell R., Zaitsev S.Yu., Chumanov G.D., Seibert M., Cotton T.M., Uphaus R.A. Monolayer Characterization and Surface Enhanced Raman Spectroscopy of Photosystem II Reaction Centers //

i European Conference on Organized Organic Thin Films: Preprints -Bangor, UK, 1992, P.BP6.

44. Себякин Ю.Л., Смирнова Ю.В., Клямкин A.A. , Ксенофонтова О.Б., Зайцев С.Ю., Егоров В.В., Евстигнеева Р.П. Особенности радикальной полимеризации в монослоях и мицеллах ненасыщенных алкил-глюкопираноэидов // Докл. АН СССР. - 1992, Г.322, N.5, С.929-934.

45. А.с. СССР N.1807698. 1992. Способ получения полимерных пленок. Егоров В.В., Клямкин А.А., Бондарев А.Н., Зайцев С.Ю., Зубов В.П.

46. Zaitsev S.Yu., Kalabina N.А., Zubov V.P., Lukashev E.P., Kononenko A.A., Uphaus R.A. Monolayers of Photosynthetic Reaction Centers of Green and Purple Bacteria // Thin Solid Films. - 1992, V.210/211, P.723-725.

47. Zaitseva V.V,, Zaitsev S.Yu.,Zaitsev Yu.S. Kinetics of the Copolymerization of the Donor-Acceptor Monomers // Macromolecules. -1992, V.25, N.9, P.2551-2556.

48. Zaitsev S.Yu., Kozhevnikov N.M., Barmenkov Yu.O., Lipov-skaya M.Yu. Kinetics of Dynamic Hologram Recording in Polymer Films with Immobilized Bacteriorhodopsin // Photochemistry & Photobiology. - 1992, V.55, N.6, P.851-856.

49. Hanke Т., Wollenberger U., Ebert В., Scheller F., Zaitsev S.Yu. Glucose Oxidase / Lipid Mixed LB-Filrns on a Pt Electrode; Application as Sensor Model // in "Biosensors: Fundamentals, Technologies and Applications" (Ed. by Scheller F., Schmid R.D.). -1992, V.17, P.43-46.

50. Zaitsev S.Yu., Zubov V.P. Optical and Photoelectrical Properties of Photosynthetic Reaction Centers in Thin Films // 13 General Conference of the Condensed Matter Divison European Physical Society: Preprints. - Regensburg, FRG, 1993, P.1572.

51. Zaitsev S.Yu. Langmuir Films of Proteins as Materials for Boisensors // 2 International Meeting on Molecular Biotechnology: FEBS Advanced Lecture Course. - Strasbourg, France, 1993, P.52.

52. Zaitsev S.Yu., Belohradsky M., Zavada J., Moebius D. Ionic Selectivity of the Surface-Active Derivatives of Crown-Ethers in Monolayers. // 6 International Conference on Organized Molecular Films: Preprints. - Trois-Rivieres, Canada, 1993, P.476.

53. Zaitsev S.Yu., Kalabina N.A., Zubov V.P., Chumanov G., Gaul D., Cotton T.M. Monolayer Characteristics of Bacterial Photosynthe-tic Reaction Centers // Colloids & Surfaces - 1993, V.78, P.211-219.

54. Zaitsev S.Yu. Functional Langmuir Films with Glucose Oxidase // Colloids & Surfaces. - 1993, V.75, P.211-216.

55. Zaitsev S.Yu., Zubov V.P., Moebius D. Monolayer Characteristics of Valinomycin in the Presence of Various Cations in Aqueous Subphase // Biochimica et Biophysica Acta. - 1993, V.1148, P.191-196.

56. . Zaitsev S.Yu. Polymeric Langmuir Films with Glucose Oxidase as Prototype of Biosensors // 5th International Meeting on Chemical Sensors: Technical Digest. - Rome, Italy, 1994, V.l, P.230.

57. Zaitsev S.Yu., Moebius D. Monolayers of Na+ ,1c1"-Adenosine Triphosphatase at the Gas/Liquid Interface // Thin Solid Films. -1994, V.244, P.890-894.

58. Zaitsev S.Yu., Belohradsky M., Zavada J., Moebius D. Ionic Selectivity of the Surface-Active Derivatives of Crown-Ethers in Monolayer II Thin Solid Films. - 1994, V.248, P.78-82.

59. КалаСина H.A., Зайцев С.Ю., ЗуОов В.П. Функциональные молельные мембраны на основе липид-белковых монослоев // Биологич. мембраны. - 1994, Т.11, № 3, С.324-333.

60. Зайцев С.Ю., Маак Ю., Мебиус Д., Зубов В.П. Фотоиндуци-рованные изменения в монослоях бактериородолсина исследованные методом брустеровского рассеяния // Биологич. мембраны. - 1994, Т.11, » 4, С.525-530.