Синтез и исследование полимеров с рецепторной структурой для компонентов нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ОРДЕНА ЛЕНИНА. И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТШУТ БИОСРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ

На правах рукописи

ПИЛЕЦКИЙ Сергей Анатольевич

Уда 541.183.1+577.113.3

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРОВ С РЕЦЕПТОРНОЙ СТРУКТУРОЙ да КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ кислот

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Киев 1991

Работа выполнена нефтехимии АН УССР.

в Институте биоорганической химии и

•Научные руководители: акаречик АН УССР,

доктйр химических наук Кухарь В.П.

кандидат-биологических наук Федоряк Д.М.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Брык М.Т.

кандидат химических наук Галушко C.B.

Ведущая организация: Институт химии поверхности АН УССР

Защита диссертации состоится " 2Ц " гШЩлЛ' 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.016.65.01 при Институте биоорганической химии АН УССР по адресу: 252160, Киев, Харьковское шоссе, 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН УССР.

Автореферат разослан " * Л'^-л/^а 1991 'г.

Ученый секретарь специализированного совета j\J) кандидат биологических наук

Я

V

1

Д. М. Фелоряк

ь

ОН'УШ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТУ

Актуальность теш. В настоящее время имеется большое количество ценных по разработке полимерных материалов с заранее заданными свойствами. Однако конструирование синтетических полимеров с пористой структурой, способной к распознаванию веществ на молекулярном уровне по сих пор остается сложной задачей. Одним из путей решения этой проблемы является матричный способ формирования субстрат-селективных полимеров, разработанный Ф.Дикки ( сшсеу ,1949) и развитый впоследствии Г.Вульфом (Wulff, 1986). Особый интерес эти полимеры представляют как модели прирошшх рецепторов и ферментов. Исследования в этой области перспективны для использования в медицине, биологии и биотехнологии (выделение особо чистых реагентов, разделение сложных смесей,близних по составу компонентов) .

Однако работы по конструированию полимеров с заданной порис- . тостью не систематичны и не позволяют созиать модель рецепторной структуры матричных полимеров, удовлетворительно объясняющей все экспериментальные данные, В достаточной мере изучено формирование субстрат-селективных полимеров лишь для .двух классов природных соединений - Сахаров и аминокислот.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является синтез и исследование полимеров, селективных для нукле-озидов, нуклеотидов и полинуклеотидов. В связи с этим в работе решались следующие задачи:

1. Выбор подходящих материалов .для формирования высокоспецифичных полимерных сорбентов матричной полимеризацией.

2. Выбор методов формирования высокоспецифичных полимерных сорбентов.

3. Синтез и изучение сорбентов, селективных для нуклеозидов, нуклеотидов и полинуклеотидов.

4. Анализ природы субстратной специфичности полимеров, сформированных матричной полимеризацией.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены и охарактеризованы сорбенты на основе силикагелей и мета-кршгосых сополимеров, проявляющие селективность по отношению к нуклеозичам, нуклеотидам и полинуклеотидам. Проведено систематическое изучение условий формирования полученных матричных поли-

меров на их адсорбционные свойства. В результате установлено,что основными факторами, влияющими на селективность этих сорбентов, являются полярность среды и способность мономеров образовывать водородные связи с основаниями нуклеозииов и нуклеотидов,

Препложена оригинальная методика получения высокоспецифичных сорбентов на основе силикагелей, заключающаяся в обработке сили-кагеля с адсорбированной матрицей парами трИметилхлорсилана.

Разработан метоп получения гранулированных полимерных сорбентов с повышенной селективностью к матричным веществам,

Разработан новый метод получения селективных мембран на основе оиэтиламиноатилметакрилата и втиленгликольциметакрилата. Показано, что формирование полимерных мембран в присутствии матричных веществ оказывает ьлияние на их пористую структуру.

Преодолена модель рацепторной структуры матричных полимеров, составными элементами которой являются селективные каверны с ориентированными функциональными группами, а также горловины в порах со структурой, комплементарной молекулам-формователям.

Полученные результаты имеют теоретическое значение .для развития новых методов формирования аффинных сорбентов.

Полученные полимеры перспективны для практического выделения особо чистых биохимических препаратов (нуклеозиды, нуклеотиды, АТР, м-РНК), а также идя разделения оптических изомеров аминокислот.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы докладывались на научной конференции Института биоорганической химии ДН УССР (1989 г.), 1?-м Международном симпозиуме ГОРАС по химии природных продуктов (Нью Дели, 1990 г.).

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах иашинЬписного текста, содержит 38 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 164 источника. Литературный обзор посвящен моделированию рецепторной функ. ии ферментов..

МАТЕРИАЛЫ И МШДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез специфических сорбентов. Синтез нуклеозид-специфичес-ких силикагелей осуществляли с помощью следующих методик.

а) 5 г силикагеля С1 (ОХП ИОНХ АН УССР) промывали водой и метанолом, высушивали при НО °С. Затем навеску силикагеля помещали в колбу с I %-нш раствором нуклеозица в 0,13 М растворе НаНдТО^и 0,13 МНа2НР04. Параллельно готовили контрольный образец

в отсутствие нуклеозида. Образцы тщательно встряхивали на качалке в течение 7 суток. Матрицу из силикагеля вымывали смесью бута-нол-нол-вода-уксусная кислота (8:3:3). Далее образцы птюмывали метанолом, водой и высушивали при НО °С в течение 12 часов.

б) Образец силикагеля готовили 1ю предыдущей методике, дополнительно обрабатывая высушенный сорбент с адсорбированной матрицей парами триметилхлорсилана.

в) Образец силикагеля с адсорбированной матрицей обрабатывали парами триметилхлорсилана без предварительной модификации силикагеля в фосфатном буфере.

Синтез нуклеотид-специфических силикагелей осуществляли в соответствии с методикой "б".

Метакриловые мономеры, используемые в матричной полимеризации очищали жидкостной хроматографией на колонке с силикагелем.

Синтез нуклеозид,-селективных полимерных сорбентов осуществляли по типовой методике: в 5 мл ТГШ, содержащем 10 % веры, при нагревании на водяной бане растворяли 250 мг дезоксиаденозина. К раствору добавляли 5 % динитрила азобисиэомасляной кислоты и .после перемешивания 5 мл мономера. Параллельно готовили контрольный образец полимера в отсутствие нуклеозида. Полимерную смесь в запаянной ампуле помещали на I сутки в термостат при 65 °С. Далее ампулу вскрывали, полимер' измельчали, переносили на стеклянный фильтр и отмывали от матрицы последовательной промывкой ТП&, водой, 0,5 М раствором ггасх, снова водой и ацетонитрилом. Полноту вымывания матрицы контролировали спектрофотометрически. Полимер высушивали при 120 °С в течение 12 часов. На ситах отбирали фракцию с дааметром частиц 50-65 мкм.

Синтез полимерных сорбентов, селективных доя нуклеогкдот) проводили аналогично синтезу нуклеозид-селект1шнгх пол»;?«, пой, с тем отличием, что в полиг/еризяционную смесь вводили Д1,этилги:,,но-этилметакрилат ( РЕле-м).

Получение гранулированных сорбентов осуществляли суспензионной полимеризацией в полиметилеилоксаново.. жидкости: 10 мл мономерной смеси при постоянном перемешивании ввозили в 200 мл нагретого до 75 °С силиконового масла ПМС-200. Полимеризацию вели 4 ч, после чего полученные гранулы извлекали и отмывали эфиром, ацетоном, I М ИаС1, 0,5 МИаОНи водой.

ЛТР-селективные полимерные сорбенты получали блочной полимеризацией,аналогично синтезу нуклеотиа-селективных полимеров.

Синтез полимерных сорбентов, селективных для полинуклеотидов осуществляли как'блочной, так и суспензионной-полимеризацией, аналогично выгеприведенным методикам получения нуклеотиа-селективных полимеров.

Полимернаационную смесь длк получения субстрат-селективных мембран готовили в соответствии с методикой синтеза полимеров, селективных для нуклеотидов. Смесь заливали в чашки Петри слоем толщиной около 0,5 мм, плотно закрывали и выдерживали I сутки при 80 °С. Вырезали кружки диаметром 3 см. Для получения армированных мембран полимеризационную смесь заливали на стеклянном фильтре ПС-2.

Физические методы исследования. Статические адсорбционные исследования осуществляли по методике Дж.Киплинга ( КхрИпе,1965).

Проницаемость мембран для нуклеотидов и аминокислот оценивали по количеству вещества, перенесенного из катодной камеры в анодную при пропускании через ячейку, разделенную исследуемой мембраной постоянного тока напряжением 200 В.

Потенциометрическое титрование ВЕАЕ -групп на поверхности анионообменных сорбентов проводили с помощью ионометра ЭВ-74 (СССР).

Калориметрические исследования осуществляли с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДСМ-2М (СССР) при скорости сканирования 4 град/мин. Расчеты проводили по методике С.Роуленда (Роуленд, 1981).

Спектральные исследования растворов нуклеозидов осуществляли с помощью спектрофотометра ШО (Карл Цейс, Иена, ГДР) в интервале длин волн 190-300 нм.

Флуоресцентные исследования проводили на люминиецентном микроскопе МЛ-2 (СССР) с фотометрической приставкой при длине волн 540 нм с зондом площадью 0,5 мкм. Оценивалась сорбция на поли-А-

селективном сорбенте полиадениловой кислоты, обработанной и необработанной о-фталевым альдегидом и ^-меркаптоэтанолом. Интенсивность свечения каждой отдельной полимерной гранулы определяли по результатам 3-х измерений в различных участках гранулы.

Ферментный гидролиз полиуриаиловой кислоты, находящейся в адсорбированной и "впечатанном" состоянии на модифицированных ею сорбентах осуществляли по стандартной методике с помощью рибону-' клеазы А. Контроль за процессом расщепления полинуклеотила'осуществляли путем хроматографирования продуктов гидролиза на колонке с ШЦЕ-метакриловой смолой.

Рентгенофазный анализ полимеров был проведен с помощью рентгеновского дифрактомера ДРОН-1 (СССР) в соответствии с методикой Ю.С.Липатова (Липатов и др., 1982).

Электронная микроскопия полимеров была выполнена в соответствии с методикой В.Я.Карупу (Карупу, 1984). Ультратонкие срезы просматривалична электронном микроскопе ТезХа В-500 (ЧСФР) при ускоряющем напряжении 90 кВ, фотографировали при увеличении от 8 до 100 тысяч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Модифицирование силикагелей нуклеозидами. Формирование рецепторной структуры на поверхности готового силикагеля осуществляли путем переконденсации кремниевой кислоты, катализируемой фосфат-ионами, в присутствии нуклеозидов. Селективность полученных сорбентов изучали путем сравнения сорбционных свойств специфического и неспецифического,приготовленного в отсутствие матрицы, силикагелей (рис. I).

сорбция мг/г

Рис. I. Изотермы адсорбции цезокск-апенозина из воды на 1-специфическом и 2- неспецифическом к А снликагелях

С, мг/'мл

0,2

0,4

Разница в'сорбции цеэоксиаденоэина на таких сорбентах (специфическая сорбция) составляет 1,4 мг/г .сорбента (23%). Экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что селективные отпечатки на поверхности силикагеля сформированы для димеризованных молекул пезоксиаценозина.

Дополнительное наращивание высоты стенок селективных отпечатков за счет присоединения триметилхдорсилана позволило увеличить специфическую сорбцию матрицы еще на 10 % (рис. 2).

сорбция

<1А

Рис.2, Изотермы адсорбции дезоксинукле-озидов из воды на I-специфическом и 2- неспецифическом к йа си-

ликагелях 0,2 0,4 0,6

С,мг/мл

Наш впервые предложен способ получения специфических сили-кагелей для воцонерастворимых веществ. Суть метода состоит в проведении предварительной адсорбции матричного вещества на поверхности силикагеля из любого удобного растворителя. При удалении растворителя высушенный сорбент обрабатывается парами триме-тилхдорсилана. Специфическая сорбция на таком сорбенте достигает 20 %. Такая величина близка к специфической сорбции вещества на силикагелях, полученных переконденсацией кремниевой кислоты. Можно предположить, что стенки селективных отпечатков состоят не более чем из одного-пвух слоев кремниевой кислоты.

Полученным сорбентам присуще медленное установление адсорбционного равновесия (рис. 3), Это позволяет сделать вывод о важности взаимной ориентации матричных молекул и селективных отпечатков в процессе формирования силикагелей и в процессе адсорбции.

Лимитирующим фактором в применении этих сорбентов является то, что И)с рецепторная структура разрушается поп действием щелочей, сояей фосфорной и ряда органических кислот.

сорбция

мг/г 10

Рис. 3. Зависимость сорбции на I- специфическом и 2- неспецифическом к дезоксйаде-Нозину силикагелей от времени

2

4 б 8 10 t ,час

2. Модифицирование полимеров нуклеозидами. Для синтеза матричных полимеров использовали производные метакриловой кислоты, которые, как следует из литературных данных ( G. Wulff et al., 1986), обеспечивают сшитую пространственную структуру, необходи-муя для сохранения формы специфических каверн;

MI:

СН 0 0

I 3 И II

СН,=С — C-O-Cf^-CHg-O-C

М2:

СН о

! з II

=с — с-о-сн

сн30

мз

сн0 о

I з II

сн. о

I з II

: (Cf^^G — С-0-СН2-СН2-)3И М4: (СН^—C-O-CHg-KC-CHg-OH

Полученные полимеры измельчали до размера частиц 40-50 мкм. Состав и сорбционные свойства полимерных сорбентов, селективных для .дезоксиаденозина привечены в таблице I.

Табл. I. Состав и адсорбционные свойства полимеров, полученных в присутствии (П) и в отсутствие (К) дезоксиаденозина

Полимер Мономер, ТГФ, Матрица Сорбция, мг/г сорбента

5 г мл йА,% ¡и ас (10 сИ?

П1 М1 5 5 2,64 1,65 0,49 1,49

кт М1 5 - 1,65 1,65 0,49 0,49

П2 М2 5 5 7,59 1,62 1,49 4,95

К2 М2 5 - 6,59 1,66 1,48 3,96

ПЗ мз 5 5 5,28 1,62 1,48 3,30

КЗ мз 5 - 4,13 1,62 . 1,48 3,30

П4 ш 5 5 4,96 1,65 1,32 4,46

К4 т 5 — 3,96 1,65 1,32 3,96

Полученные результаты свидетельствуют о наличии специфического сродства к дезоксиаденозину у всех модифицированных им полимеров, по величине сравнимого со специфической сорбцией нукле-оэидов на модифицированных силикагелях. Подобная закономерность обнаружена и для полимеров, модифицированных другими нуклеоэида-ми (табл. 2).

Табл. 2. Специфическая сорбция дезоксинуклеозидов

на модифицированных ими полимерных сорбентах

Полимер,селектиР!г(.гй Специфическая сорбция, мг/г сорбента для нуклеозида -

/¿ш/ &А. ас ао ат

/¿А/ 1,0 0 0 -I

/60/ 0 1,42 -1,42 0

МО/ 0 -1,04 1,2 о

/ат/ -0,8 0 0 1,32

Установлено, что клк специфическая, так и неспецифическая сорбция нуклеозииов возрастает с увеличением полярности разба-

вителя, используемого в полимеризации. Разница в составе полимеров не оказывает заметного влияния на специфическую сорбция нуклеозидов.

Для каждого сорбента наблюдается эффект "выталкивания" определенных нуклеозидов, что проявляется в появлении отрицательной величины специфической сорбции. По-видимому, это явление можно объяснить, используя идеи Уотсона и Крика о специфическом взаимодействии между комплементарными основаниями в ДНК: Л с Т и С с 6. Одной из важнейших особенностей этих пар является подходящая ориентация образуемых водородных связей. Можно допустить, что в процессе полимеризации в присутствии нуклеозида функциональные группы образующегося полимера будут ориентированы на образование водородных связей с основаниями нуклеозидов и останутся в зафиксированном положении, образуя рецепторную структуру.

В ходе изучения полученных полимеров было установлено, что изменения в структуре матричных молекул (наличие новой или отсутствие одной из функциональных групп) приводит к резкому уменьшению специфической сорбции.

Ддя определения количества и состояния воды, сорбированной нуклеозид-селективными полимерными сорбентами, проводили калориметрические исследования с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра. Анализ полученных данных по количеству свободной и связанной воды в сорбентах показывает, что модифицирование образцов приводит к увеличению в них как свободной, так и связанной воды (табл.3). Это указывает на то, что модифицирован-

Табл. 3. Влагосодержание ат -селективных полимеров

Полимер Разбави- Матрица Влагосодер- Замерзаю- Незамерзою-.тель р жание,г/г щая вода, щая вола,

г/г г/г

П5 90% ГГФ сЩ 1,1538 0,7005 0,4453

К5 90% ТГФ - 1,1250 0,6560 0,4682

П6 ДЮА ей? 1,0000 0,5247 0/753

Кб ДШ - 0,2405 0,0553 0,

П7 90% ДММ (И 1,3889 0,6040 0,5841

К7 90% ДММ - 1,2593 0,9738 0,2855

ные образцы являются более микропористыми, чем немопифицированные, так как незамерзающая вода может присутствовать только в порах размером не более 1,0 нм. Эти поры видны и под электронным микроскопом;

Можно предположить, что рецепторной структурой для нуклео-зидов в исследуемых полимерах являются расположенные на поверхно- -сти полимерных гранул каверны с формой, комплементарной матричным молекулам и последовательностью жестко закрепленных функциональных групп, способных к образованию водородных связей с функциональными группами молекул субстрата-формователя.

3. Синтез и исследование полимеров, селективных для нуклеотидов. Для удержания нуклеотидов в состав селективных полимеров вводили ионные группы с помощью пизтиламиноэтилметакрилата ( ГЕАЕ-М )• Результат хроматографического изучения ряда нуклеотад-селективных сорбентов показал, что оптимальным для специфичности является эквимолярное соотношение шаВ-групп по отношению к заряженным фосфатным группам матрицы в полимериэационной смеси. Заметное неспецифическое взаимодействие нуклеотидов с сорбентами, по нашему мнению,является следствием разрушения селективных каверн, которое происходит при измельчении полимера.

Чтобы избежать о того,нами был разработан способ получения гранулированных сорбентов, не нуждающихся в измельчении. Для этого мы провопили суспензионную полимеризацию в полиметилсилокса-новой жидкости. При эмульгировании мономерной смеси в нагретом силиконовом масле получаются прочные сферические гранулы, размер которых можно легко регулировать, изменяя скорость перевешивания реакционной смеси. Селективность гранулированных сорбентов,модифицированных нуклеотидами, выше, чем полученных размалыванием (табл. 4). Потенциометрическое титрование селективных анионооб-менников показало, что часть ШШЗ-групп, входящих в состав полимеров, находится г.нутри селективных каверн. Экранирование стенками каверн приводит к изменению рК этих групп.

Дополнительные исследования полученных сорбентов проводили с помощью рентгеновского лифрактометра ДР0Н-1. Наличие одного размытого дифракционного максимума на кривых рассеяния рентгеновских лучей (рис. 4) свидетельствует об отсутствии ближней упоря-моченности синтезированных полимеров.

Табл. 4. Сорбция нуклеотицов из водного раствора с концентрацией 2 мг/мл на йШР -селективных полимерных сорбентах

Полимер Способ получения СоРб«ия <Ш1Р' СоРб1<"я <^>3 уд. J/v

мг/г мг/г

П8 Блок-сополимери- 29,2 23,6 134

зация

П9 Суспензионная 31,2 15,6 58

полимеризация

Из полученных данных мошо сделать вывод, что оба полимера, кан полученный блок-сополимеризацией, так и-суспензионной полимеризацией имеют аморфную структуру. Значительная дисперсия межмолекулярных контактов не противоречит модели структурной организации полимеров,предложенной В.А.Кабановым (Кабанов и др.,1974).Согласно этой модели, морфологической единицей полимера является фибрилла, состоящая из аоменов, образованных сложенными на себя макромолекулами. По нашему мнению, именно домены и являются материальной основой рецепторной структуры изучаемых полимеров.

Удачным примером использования матричной технологии являются сорбенты, пригодные для практического выделения АТР из нуклео-тилной смеси (рис. 5).

I.C

отн.ед.

2 0

5 10 15 20 25 30

Рис.4. Кривые широкоуглового рассеяния рентгеновских лучей для сорбентов I- П8 и 2- П9

О

Л (260)

ШР А1Р

AW

А (260)

Ai!P ADP

AIP

10 20 30 40

10 20 30 40 50 "t ,мин t ,мин

Рис. 5. Профиль э: щии смеси аденозинмоно-, ди- и три-фосфата на колонках 4 х 200 мм, заполненных сорбентами: а - неселективном; б - селективном к АТР

Ди- и трифосфаты остальных нуклеозидов сходят с колонки, заполнед-ной АТР-селективным сорбентом на 30 минуте.

4. Модифицирование полимеров полинуклеотидами. При увеличении алины последовательности нуклеиновой кислоты, используемой для модифицирования полимеров, осложняется освобождение пор от "впечатанной" матрицы (рис. 6). '

А

70

60 £0 40 30 20 10

Рис. 6. Зависимость вымывания матричных молекул из полимеров от алины цепи. А -количество нуклеиновой кислоты, вымытой из полимера, %, 1 -длина олигонуклеотица ( в мономерных звеньях )

1-2 34 5 678

L

Полнота вымывания матрицы не зависит от состава полимера и

олигонуклеотида.

Нами было синтезировано несколько полимерных сорбентов, селективных тля полиадениловой кислоты. Их адсорбционные свойства приведены в таблице 5.

Табл. 5. Адсорбционные свойства полимерных сорбентов, селективных для полиадениловой кислоты

Полимер Способ получения Сорбция, мг/г Вуд. ,ьг/г

поли-А поли-U AMP GMP

Блок-сополилимери-ПЮ эация 25 21,5 47 25 167

ПИ Суспензионная полимеризация 47 22 48 20 116

Гранулированный сорбент, полученных суспензионной полимеризацией имеет большую селективность, чем сорбент, полученный измельчением блок-сополимера. Интересно, что сорбенты, модифицированные полиадениловой кислотой, имеют большую аффинность к AMP, чем к GMP , хотя последний и более полярен, чем АЫР. По-видимому, потенциал специфической сорбции поли-А на полимере, полученном в присутствии полиапениловой кислоты является аддитивной величиной, зависящей от потенциала сорбции отдельных моиомерных звеньев.

Флуоресцентный и ферментатизный анализы позволяют сделать вывод, что большая часть сорбированной последовательности поли-нуллеотида находится вне сорбента в виде выступающих петель или хвостов, причем конформации молекул в адсорбированном и "впечатанном" в полимер состоянии значительно отличаются. В адсорбированном состоянии сохраняется значительная часть фрагментов поли-нуклеотида с нативной структурой.

Такие полимерные сорбенты могут быть пригодны для препаративного выделения РЖ, содержащих полиадениловую последовательность. Вероятно, более тонкое распознавание последовательности невозможно из-за отличий конформации полинуклсотида н адсорбированном и "впечатанном" состоянии.

5. Субстрат-селективные полимерные мембраны. По ммюг/ предположению матричные молекулы принимаю с участие i; формирова-

нии всей системы пор полимера. Размер и структура сквозных пор, по крайней мере в некоторых местах, должна быть близки к диаметру и форме матричных молекул, вокруг которых происходил процесс образования полимера. Мембрана, полученная из такого материала, должна обладать проницаемостью только для молекул, размер которых не превышает размера матрицы.

Для экспериментального подтверждения нашей гипотезы мы изучали электроперенос нуклеотипов через мембрану, выполненную из селективного для вденозинмонофосфорной кислоты полимера (рис.7).

Это не связано с большей ионной силой раствора AMP; измерение электропроводаости раствора AMP л GLIP показало, что они практически равны. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что поток анионов AMP через мембрану к аноду значительно больше,чем поток анионов СЫР в тех же условиях. Следовательно, мембрана, модифицированная вденозинмонофосфорной кислотой обладает свойством селективного переноса AMP, матричного соединения, участвовавшего в формировании структуры полимера. Отметим, что для AMP и GUP существует предельный ток, 22 и 5 мА соответственно. Ото свидетельствует о том, что рдя данной разности потенциалов существует предельная скорость диффузии, которая долее не возрастает с рсстом концентрации электролита и определяется своПстьами мембраны. Toi; насыщения для АУР примерно равен току насыщения для Ш'ЛХ},. Для G MP насыщение наступает при меньшей концентрации, чем

для АМР.

Рассмотренный выше процесс - это, в сущности,электроанализ, т.е. разделение веществ на основе разных скоростей диффузии через мембрану, которая имеет для них разную проницаемость. Однако полученная нами мембрана обладает большей селективностью, чем обычные мембраны для диализа и ультрафильтрации, не позволяющие разделять низкомолекулярныв вещества с близким строением и свойствами.

Полимерные мембраны, в состав которых не входят ионизирующиеся мономеры, ток не проводят. Это позволяет предположить, что ионселективная мембрана должна строиться из ионизированных мономеров, образующих комплекс -с матричными молекулами. Прохождение ионов через такую мембрану можно описать по механизму "прыжковой" или же "эстафетной" проводимости (Тимашев,1988). В результате переноса под действием разности потенциалов реализуются перескоки заряженных частиц между местами их связывания - ионогенными группами, распределенными по поверхности пор:

н- остаток нуклеозила

Полученные мембраны оказались довольно хрупкими. Для преодоления этого недостатка нами была разработана методика синтеза более долговечных мембран, которая заключается в том, что полимеризация производится на плотном стеклянном фильтре. Армированные таким образом мембраны показали стабильную работу в течение нескольких недель.

Общность матричного принципа формирования селективных мембран была подтверждена изучением полимерной мембраны, селективной для Ь -фенилаланина. Для сравнения с Ь-РЬе оценивали перенос через мембрану, приготовленную в его присутствии таких аминокислот,как в-фенилаланин,Ь-триптофан,Ь- и 0-тирозин. Количество прокюдшай через мембрану аминокислоты определяли спектрофотометрически.Оказалось, что пргктически отсутствует транспорт через мембрану три;н

тофана. Ь- и Д-тирозин через мембрану проходит одинаково. В тех же условиях количество прошедшего фенилаланина в 7-8 раз больше, причем оказывается, что1-йав задерживается мембраной в большей степени, чем Б-РЬе (рис. 8). Вероятно, это связано с дополнительным взаимодействиемЬ-фенилаланина с поверхностными селективными кавернами.

перено ,

иг/снР 0,4

Рис.8, Зависимость количества перенесенного через ь-РЬе-селективную мембрану:

1- 1-фенилаланина и

2- Л-фенилаланина от времени

5 10 - 15 20'*,мин •

Таким образом, мембраны, полученные матричной полимеризацией обладают хиральными свойствами.

На основе полученных результатов предлагается гипотетическая модель рецепторной структуры субстрат-селективных полимеров:

мировашшх в присутствии матричного вещества, вызвана наличием п

их структуре селективных каверн (отпечатков молекул) с ориентированной структурой функциональных групп,.а также наличием горловин в порах, структура которых комплементарна молекулам-фориователям.

ВЫВОДЫ

1. Систематизированы условия формирования матричным способом силикагелей и полимеров, селективных по отношению к компонентам нуклеиновых кислот. Найдено, что селективность полученных сорбентов зависит от условий их формирования, среди которых определяющими являются полярность среды и способность соответствующих мономеров образовывать водородные связи с нуклеозидами и нуклеотизами.

2. Установлено, что помимо стерических факторов при "узнавании" сорбентом матричных молекул, значительную роль играет наличие и расположение функциональных групп внутри полимерных каверн.

3. Впервые получены и охарактеризованы нуклеотид-селективгае полимерные сорбенты на основе метакриловых сополимеров. Разработан суспензионный метод получения субстрат-селективных полимеров с повышенной селективностью к матричным веществам.

4. Предложены селективные сорбенты на основе диэтиламиноэтил-уетакрпата, пригодные для практического выделения АТР из смеси нуклеозидмоно-, пи- и трифосфатов.

5. Найдено» что о-фталевый альдегид и у«-меркаптоэтанол

(или тиофенол) при взаимодействии с аминогруппами оснований нуклеиновых кислот образует флуоресцирующие соединения,которые могут быть использованы для обнаружения небольших количеств нуклеиновых кислот.

6. Разработан новый метод получения субстрат-селективных мембран, основанный на введении матричного вещества в полимеризаци-онную смесь. Показано,' что формирование полимерных мембран в присутствии матрицы оказывает влияние на их пористую структуру.

7. Предложена модель рецепторной структуры матричных полимеров, составным элементом которой являются селективные каверны с ориентированными функциональными группами, способными к образованию ■водородных связей с матричными молекулами, а также горловины в порах со структурой, комплементарной молекулам-формователям.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Пилецкий С.А., Кухарь В.П., Федоряк Д.М. Получение полимерных сорбентов, селективных к компонентам нуклеиновых кислот// Укр. хим. чурн. - 1989. - Т. 55, * 8. - С. 872-875.

,2. Пилецкий С.А., Феаоряк Д.М., Кухарь В.П. АТР-субстрат-селек-тивные полимерные сорбенты // Докл. АН УССР. Сер. Б. - 1990.* 4. - С. 53-54.

3. Eilet ¿су S.A., iedoiyak ПЛ.,- Dubey I.Ta*, £ükhar V.P. Enzyme analogue built pollers.. Ihe preparation of substrate-selective sorbents for nucleotides // Proc. of the 17-th ШРАС Int. Symp, on the Chemistry of Natural Product. -Hew Delhi, 1990. - P. 553.

4. Пилецкий С.А., Дубей И.Я., Федорян Д.М., Кухарь В.П. Субстра-г-селективные полимерные мембраны. Избирательный перенос компонентов нуклеиновых кислот // Биополимеры и клетка. - 1990. -Т. 6,.» 5. - С. 55-56.

'¡1/

Подл, к яеч. 15.03.91. Формат 60x34/16. Бум.офс. 1>у Офс.печ. Усл.печ.л. 0,93. Усл.кр.-отт. 1,12. Уч.~изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 562. Бесплатно. 4

Участок ротапринтной печати 0НТИ ШП АН УССР 252014 Киев 14, уд.Тимирязевская, 2