Пьезокварцевые иммуно- и ПМО-сенсоры для определения ряда антибиотиков и природных токсинов

Карасева, Надежда Александровна

Пьезокварцевые иммуно- и ПМО-сенсоры для определения ряда антибиотиков и природных токсинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Карасева, Надежда Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Воронеж МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Пьезокварцевые иммуно- и ПМО-сенсоры для определения ряда антибиотиков и природных токсинов»

Автореферат диссертации на тему "Пьезокварцевые иммуно- и ПМО-сенсоры для определения ряда антибиотиков и природных токсинов"

На правах рукописи

005060377

КАРАСЕВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫЕ ИММУНО- И ПМО-СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЯДА АНТИБИОТИКОВ И ПРИРОДНЫХ ТОКСИНОВ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук '

3 0 п.':п ¿ии

Воронеж -2013

005060377

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Липецкий государственный технический университет»

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Дзантиев Борис Борисович,

доктор химических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, заместитель директора по научной работе

Селеменев Владимир Федорович,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», заведующий кафедрой аналитической химии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский)

федеральный университет»

Защита состоится «22» мая 2013 года в 17-00 на заседании диссертационного совета Д 212.038.19 по химическим наукам при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет» по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ВГУ, химический факультет, ауд. 439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «19» апреля 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Крысин М.Ю.

Общая характеристика работы

Актуальность работы.

Необходимость определения следовых концентраций биологически активных веществ в пищевой продукции и биологических пробах стимулировала развитие экспрессных, высокочувствительных и селективных методов анализа, основанных на применении сенсоров различной природы.

Пьезокварцевые гравиметрические сенсоры положительно зарекомендовали себя при анализе газов и жидкостей. Чувствительность определения аналитов связана со свойствами пьезокварцевого преобразователя, в то время как рецепторный слой на поверхности его электродов влияет на чувствительность и селективность детектирования. Наиболее часто при анализе жидких сред в качестве распознающих молекул используются иммунореагенты, позволяющие существенно упростить и сократить процесс пробоподготовки при анализе сложных многокомпонентных проб. Способ создания рецепторного слоя на поверхности электрода сенсора зависит от свойств иммобилизуемых биомолекул и может существенно повысить чувствительность определения индивидуальных соединений. Как правило, для формирования распознающего слоя используется ковалентное-закрепление иммунореагентов на предварительно сформированную подложку, обеспечивающую прочную связь с поверхностью металлического электрода и влияющую на продолжительность его службы. Наиболее часто применяются подложки на основе самоорганизованных монослоев тиолов и силоксанов. Способы иммобилизации биомолекул на электрополимеризованные тонкопленочные покрытия в пьезокварцевых сенсорах используются значительно реже, несмотря на возможность изменять их характеристики непосредственно в процессе генерирования.

Кроме иммунореагентов для создания рецепторного слоя пьезокварцевых сенсоров применяются полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), которые, как правило, получают методом блочной полимеризации. Перед нанесением полимеров на поверхность электрода сенсора требуется их размельчение, фракционирование и последующее закрепление в виде суспензии, что является причиной невысокой воспроизводимости свойств покрытия. Применение метода электрополимеризации позволяет существенно повысить надежность получения слоя с воспроизводимыми характеристиками, сократить продолжительность получения покрытия и упростить процедуру анализа. Поэтому получение полимеров непосредственно на поверхности электрода сенсора методом электрополимеризациии или применение наночастиц с поверхностными отпечатками определяемого соединения расширит возможности использования ПМО в пьезокварцевых сенсорах в качестве заменителей антител, как в прямом, так и конкурентном формате псевдоиммуноанализа.

Предложенные подходы планируется реализовать при создании сенсоров для определения следовых концентраций антибиотиков бета-лактамной группы, хлорамфеникола, природных фико- и бактериотоксинов, содержание которых в пищевой продукции строго нормируется.

Работа выполнялась при финансовой поддержке ведомственной целевой аналитической программы Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011)» (№2.1.1/14142), гранта РФФИ «Иммунохимические системы для молекулярного распознавания антибиотиков и оценка безопасности пищевых продуктов» (09-03-975бб-р_центр_а), темплана Минобрнауки РФ «Пьезокварцевые биосенсоры нового поколения для определения токсинов и физиологических активных веществ» (№3.2727.2011), Фонда развития малых форм

предприятий «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» «У.М.Н.И.К» (тема№17126, 2012-2013 гг.)

Цель исследования - создание пьезокварцевых сенсоров на основе иммунореагентов и полимеров с молекулярными отпечатками для селективного определения следовых концентраций ряда антибиотиков и природных токсинов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить условия ковалентной иммобилизации гапген-белковых конъюгатов и антител на электрополимеризованные пленки полианилина и полипиррола;

- определить кинетические характеристики обратимой гетерогенной иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, рассчитать константы аффинности и коэффициенты перекрестного реагирования гомологичных и групп-специфичных антител;

- изучить условия получения in situ методом электрополимеризации покрытий на основе полимеров с молекулярными отпечатками пенициллина G и цефотаксима;

- изучить закономерности синтеза методом преципитации наносфер с молекулярными отпечатками пенициллинов и исследовать условия их использования в пьезокварцевых сенсорах;

- разработать пьезокварцевые иммуносенсоры для определения индивидуальных биологически активных соединений (хлорамфеникол, пенициллин G, ампициллин, окадаиковая кислота, стафилококковый энтеротоксип А) и суммарного количества пенициллиновых антибиотиков; ПМО-сенсоры для определения пенициллина G, ампициллина, цефотаксима в пищевой продукции.

Научная новизна.

Установлено влияние условий получения электрополимеризованных тонкослойных пленок полианилина и полипиррола на характеристики рецепторного слоя сенсоров, предназначенных для определения следовых концентраций антибиотиков и природных токсинов. Показано, что иммобилизация гаптен-белковых конъюгатов и антител на полипиррольную подложку обеспечивает более высокую чувствительность определения биологически активных соединений.

Предложен электрохимический способ формирования распознающего слоя на основе полимеров с молекулярными отпечатками цефотаксима и пенициллина G непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора. Показано, что формирование покрытия методом циклической вольтамперомегрии и применение в качестве кросс-мономеров диоксибензолов (гидрохинон, резорцин) способствует созданию однородного слоя ПМО оптимальной массы и толщины, с высокой поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков.

Впервые изучены условия синтеза наносфер с поверхностными отпечатками пенициллинов методом преципитации и обосновано влияние природы функционального и кросс-мономеров, органического растворителя, температуры и ультразвука на размер и дисперсность наночастиц ПМО. Показана возможность применения наночастиц ПМО в пьезокварцевых сенсорах.

Практическая значимость.

Разработаны сенсоры для определения следовых концентраций индивидуальных биологически активных веществ (пенициллин G, ампициллин, цефотаксим, окадаиковая кислота и стафилоккоковый энтеротоксин А) и суммарного количества антибиотиков пенициллиновой группы. Разработаны способы синтеза тонких пленок ПМО цефотаксима и пенициллина G и наночастиц ПМО пенициллинов методом преципитации. Сенсоры апробированы при анализе реальных пищевых объектов (мясо, молоко, яйца, мед, креветки, кальмары). Научная

новизна способа определения хлорамфеникола подтверждена положительным решением Роспатента о выдаче патента (№ 2011129725 от 3 марта 2013).

На защиту выносятся:

- распознающие слои иммуносенсоров, полученные ковалентной иммобилизацией гаптен-белковых конъюгатов и антител на электросинтезированные подложки полианилина и полипиррола, позволяющие существенно повысить чувствительность определения биологически активных соединений по сравнению с сенсорами на основе у-аминопропилтриэтоксисилана;

- способ электросинтеза тонкослойных пленок ПМО цефатоксима и пенициллина G непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора, характеризующихся высокой степенью импринтинга и поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков, механической прочностью;

- результаты изучения условий синтеза методом преципитации наносфер ПМО пенициллинов и заключение о влиянии природы функционального и кросс-мономеров, органического растворителя, температуры и ультразвука на размер и дисперсность наночастиц ПМО и возможности применения наносфер в пьезокварцевых сенсорах;

- пьезокварцевые иммуносенсоры, позволяющие определять следовые концентрации хлорамфеникола, пенициллина G, ампициллина, окадаиковой кислоты, стафилококкового энтеротоксина А, суммарное содержание пенициллиновых антибиотиков и ПМО-сенсоры для определения цефотаксима и пенициллина G в пищевой продукции.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на следующих конференциях: Всероссийской конференции «Аналитика России», Краснодар, 2009; Всероссийской конференции «Проведение научных исследований в области индустрии наносистем и материалов», Белгород, 2009; «Экотоксикология - 2009, 2011», Пущино, Тула; Съезде аналитиков России, Москва, 2010; XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», Екатеринбург, 2010, 2011, 2012; Всероссийской конференции «Биосовместимые материалы и покрытия», Саратов, 2011; Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009, 2011», Москва; V Всероссийской конференции "Фагран-2010", Воронеж; XIII Международной конференции «ИОНИТЫ - 2011» Воронеж; 2-ой Научной региональной конференции с международным участием «Химия-2011», Коломна; Общероссийской научной конференции «Полифункциональные химические материалы и технологии», Томск, 2012; The 7th International conference on instrumental methods of analysis modern trends and application, Греция, 2011; Всероссийской конференции «ЭМА-2012», Уфа, 2012; Всероссийской конференции «Химия биологически активных веществ», Саратов, 2012; International Conference on Materials and Applications for Sensors and Transducers, Венгрия, 2012; 1-ой школе-конференции с международным участие «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург, 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей (в том числе б статей в журналах, входящих в Перечень ВАК) и 7 тезисов докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах печатного текста, включает 37 рисунков, 21 таблицу. Состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, выводов и библиографического списка, включающего 198 ссылок на работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, приборы п методы исследования

В качестве объектов исследования выбраны хлорамфеникол (Сар), антибиотики группы (3-лактамов - ампициллин (Amp), пенициллин G (Pen G), цефотаксим (Сер), токсины: окадаиковая кислота (DSP), стафилококковый энтеротоксин A (SEA).

В работе использовали гомологичные поликлональные антитела к пенициллину G - Ab-Pen G или ампициллину - Ab-Amp, моноклональные антитела к хлорамфениколу - АЬ-Сар, окадаиковой кислоте - Ab-DSP, стафилококковому энтеротоксину А - Ab-SEA и групп-специфичные антитела к антибиотикам пенициллиновой группы - Ab-Pen, хлорамфеникол-белковый конъюгат (Cap-STI). Синтез белковых конъюгатов пенициллина G и ампициллина проводили путем сшивки бычьего сыровоточного альбумина (BSA) с антибиотиком через глутаровый альдегид. Иммобилизацию биомолекул проводили на полианилиновую (PANI) или полипиррольную подложку (РР) с помощью бифункционального реагента — глутарового альдегида (GA).

Для электросинтеза полимеров с молекулярными отпечатками в качестве функциональных мономеров применяли анилин, п-аминофенол; кросс-мономеров -пирокатехин, резорцин, ализарин, пирогаллол, гидрохинон. Синтез осуществляли с использованием потенциостата ПИ-50-1 или полярографа LP 7 в трехэлектродной ячейке с индикаторным золотым электродом пьезокварцевого резонатора (электрод сравнения - хлоридсеребряный ЭВЛ-1М3.1, вспомогательный - стальная пластина).

Наночастицы полимеров с молекулярными отпечатками пенициллинов синтезировали методом' преципитации с использованием функциональных мономеров (метакриловая кислота, МАА; 4-винилпиридин, 4-VP; метилметакрилат, ММА); кросс-мономеров (этиленгликольдиметакрилат, EGDMA; триметилопропан триметакрилат, TRIM; дивинилбензол, DVB); инициатора свободных радикалов (азобисизобутиронитрил, ATON); порогенных растворителей (ацетонигрил, ACN; толуол, Toi).

Для исследования морфологии поверхности рецепторных покрытий ■ и установления размера наносфер ПМО применяли сканирующий зондовый микроскоп "Solver P47-PRO (ЗАО «Нанотехнология-МДТ», Зеленоград, Россия); функциональные группы, участвующие в образовании связей с молекулой темплата при синтезе ПМО, выявляли методом ИК-спектроскопии (ИК-спектрометр SPECORD 75IR (Германия), Irafïimty-l"(Shimadzu, Япония)). Удаление молекул темплата из структуры ПМО осуществляли в аппарате Сокслета. Для диспергирования наночастиц использовалась ультразвуковая ванна («ПСБ-Галс», Россия).

В качестве пьезокварцевых сенсоров использовали резонаторы AT - среза с собственной частотой колебаний 10 МГц с электродами, полученными магнетронным напылением золота на шлифованную кварцевую пластинку (ЗАО «ЭТНА», Россия). Предварительно поверхность электрода сенсора обрабатывали соляной кислотой, затем обезжиривали ацетоном и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Измерение аналитического сигнала пьезокварцевого сенсора (ДГ) осуществляли в проточно-инжекционном режиме на установке, включающей дозатор ввода проб; перистальтический насос ("Knauer", Германия), обеспечивающий непрерывный поток жидкости; цифровой модуль «ДиСкоп» ("Бафика", Россия) и персональный компьютер.

Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для определения высоко - и низкомолекулярных соединений

Изучение условий иммобилизации биомолекул. На аналитические характеристики пьезокварцевого иммуносенсора существенное влияние оказывают свойства биорецепторного слоя, такие, как доступность активных «сайтов» распознавания, масса и толщина биослоя, влияющие на чувствительность детектирования, диапазон определяемых содержаний и устойчивость при эксплуатации в жидких средах и при регенерации.

Изучены условия получения селектирующих покрытий сенсоров методом ковалентной иммобилизации, включающим электрогенерирование полимерной подложки на поверхности золотого электрода пьезокварцевого сенсора и иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов или антител с помощью бифункционального реагента, а также путем включения антител в полимерную структуру в процессе электрополимеризации. Поэтапное изменение морфологии поверхности покрытия оценивали методом атомно-силовой микроскопии по значениям средней шероховатости - И, и методом пьезокварцевого микровзвешивания, регистрируя послойное приращение массы - Дш (табл. 1).

Электрогенерирование полимерных пленок полианилина и полипиррола проводили в потенциодинамическом режиме с циклической разверткой потенциала в интервале (-0,2 +1,4) В или (-0,2 + +0,8) В соответственно. Применение в качестве фонового электролита при электросинтезе полианилина 0,1 М и 0,3 М серной, соляной или хлорной кислот способствует формированию покрытия примерно одинаковой массы (10-30 мкг). Однако морфология полимерного слоя существенно отличается. Так, электросинтез в растворе серной кислоты приводит к получению рыхлого слоя с невысокой адгезией к поверхности золотого электрода, легко разрушающегося при контакте с водой. Увеличение концентрации хлорной и соляной кислот до 0,5 М способствует получению «тяжелых» покрытий, вызывающих срыв частотных колебаний резонатора. Оптимальные по морфологии и массе полианилиновые слои, полностью покрывающие поверхность электрода сенсора, формируются в среде 0,3 М хлорной кислоты при проведении трех циклов поляризации.

Электросинтез полипиррольных покрытий рекомендовано проводить в 0,1 М растворе хлорида натрия, позволяющим в течение одного цикла полимеризации получать однородное тонкопленочное покрытие оптимальной массы. При повторном использовании сенсора, вследствие изменения структуры поверхности золотого электрода под действием концентрированных азотной или серной кислот, применяемых для удаления использованного распознающего слоя, для получения покрытия с такими же характеристиками требуется три цикла полимеризации.

Генерирование на поверхности электрода сенсора полимерной подложки приводит к снижению средней шероховатости от 80±10 нм до 60±10 нм, что обеспечивает равномерную иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов или антител по всей поверхности электрода и высокую концентрацию активных «сайтов» распознавания.

Оценку концентрации пространственно доступных «сайтов» распознавания осуществляли С ПОМОЩЬЮ величины концентрационной чувствительности (вс), рассчитанной как отношение аналитического сигнала сенсора к концентрации аналита. Иммобилизация биомолекул на полипиррольных пленках (табл. 1) более предпочтительна, поскольку приводит к 2-3 кратному увеличению по сравнению с полианилиновой или силоксановой подложками. Кроме того, при использовании

полипиррольных подложек увеличивается продолжительность службы аффинного слоя до 15 циклов измерений без существенно снижения его активности.

При иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов хлорамфеникола, пенициллина й и ампициллина достигаются более высокие концентрации антигенных детерминант в рецепторных слоях (вс = 21-72 Гц-мл-нг"1) по сравнению с распознающими слоями на основе антител к окадаиковой кислоте или стафилококковому энтеротоксину А (вс = 6-12 Гц-мл-нг" ).

Таблица 1. Свойства иммуноаффинных покрытий

Аналит Иммуноаффин-ный слой Метод атомно-силовой микроскопии Метод пьезокварцевого микровзвешивания

Ra, нм Дш, мкг So, Гц-мл-нг"1 N циклов

Хлорамфеникол APTS+GA+ Cap-STI 40±12 25±3 25 8

PAÑI 55±10 25±3 - -

PANI+GA 70±20 49±2 - -

PANI+GA+ Cap-STI 85±10 55±1 37 10

PP 60±10 13±2 ... •-

PP+GA 75±10 18±1 -

PP+GA+ Cap-STI 90± 15 22±1 72 12

Пенициллин G PP+GA+ Pen G-BSA 130±20 23±2 45 15

Ампициллин PP+GA+ Amp-BSA 100±15 24±3 21 15

Окадаиковая кислота PP+GA+ Ab-DSP 125±20 33±3 6 15

Стафилококковый энтеротоксин А PP+GA+ Ab-SEA 120±25 25±4 12 15

PP+Ab-SEA 86±12 20±2 0,3 14

При иммобилизации антител к стафилококковому энтеротоксину А путем включения в полимерную матрицу в процессе электрополимеризации концентрационная чувствительность имеет минимальное значение 0,3, что не позволяет проводить определение SEA на уровне нг/мл. Однако такой прием получения распознающего слоя обеспечивает достаточно высокую устойчивость покрытия и приводит к существенному сокращению продолжительности иммобилизации (с 24 час до 1 час).

Характеристика применяемых поликлональных и моноклональных антител. Кинетические исследования обратимой иммунохимической реакции позволили рассчитать значения констант скорости образования и диссоциации иммунокомплекса и констант аффиности.

Значения констант скорости образования комплекса антитело-антиген, установленные методом Скетчарда, примерно одинаковы для всех используемых иммунореагентов и находятся на уровне ~ 108, что позволяет наблюдать за ходом образования иммунокомплекса практически в режиме реального времени. Значения констант аффинности, рассчитанные как отношение констант скоростей прямой и обратной реакции, порядка свидетельствуют о высокой специфичности

антител к индивидуальным антибиотикам или к.соединениям всей пенициллиновой группы, прочности образовавшегося поверхностного иммунокомплекса. Моноклональные и поликлональные антитела обеспечивают определение лекарственных препаратов и токсинов на уровне нг/мл (табл. 2) и позволяют проводить детектирование пенициллина О, ампициллина, хлорамфеникола, окадаиковой кислоты в относительно широком диапазоне концентраций.

Таблица 2. Метрологические характеристики определения антибиотиков и токсинов

Аналит Пара иммунореагентов Cmirb нг/мл Диапазон определяемых содержаний, нг/мл

Пенициллин G Ab-PenG - Реп G-BSA 2,1 3-250

Ампициллин АЬ-Ашр - Amp-BSA 0,8 3-500

Хлорамфеникол Ab-Cap - Cap-STI 0,2 1-100

Окадаиковая кислота Ab-DSP- DSP 1,4 5-500

Стафилококковый энтеротоксин А Ab-SEA - SEA 0,4 1-80

Возможность селективного определения биологически активных соединений была оценена по значениям коэффициентов перекрестного реагирования моно- и поликлональных антител (CR, %). Наиболее высокую специфичность проявляют моноклональные антитела к хлорамфениколу (CRi,% для антибиотиков других групп меньше 1) (табл. 3).

Таблица 3. Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных и моноклоналъных антител

Антибиотик CR,, % cr2, % CR3, % CR4, %

Хлорамфеникол 100 - - -

Пенициллин G <1 100 10 100

Ампициллин - 14 100 94

Бициллин - 6 7,3 99,3

Цефазолин - 1,7 3 9

Цефотаксим <1 <1 1,5 5 •

Стрептомицин <1 <1 <1 1,7

Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных гомологичных антител к пенициллину в и ампициллину свидетельствуют о возможности селективного определения антибиотиков в присутствии аминогликозидов (0*2,3 < 1%) и цефалоспоринов (0*2,3 < 3 %). Присутствие в пробе антибиотиков родственного строения в более высоких концентрациях, чем определяемые, может

приводить к искажению результатов определения. Близкие значения CRi (88-100 %) моноклональных групп-специфичных антител по отношению к пенициллину G, ампициллину и бициллину свидетельствуют о возможности определения их суммарного содержания при совместном присутствии.

Для оценки специфичности антител к окадаиковой кислоте и стафилококковому энтеротоксину А изучено мешающее влияние на аналитический сигнал сенсора соединений белковой природы, которые могут присутствовать в экстракте морепродуктов или мяса. Было установлено, что значение Af при экспонировании сенсора в растворе BSA не превышает сигнала шума, что обеспечивает селективное определение токсинов в присутствии белков.

Сенсоры на основе электрополимеризованных ПМО

Исследованы условия электрохимического синтеза непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора полимеров с молекулярными отпечатками цефотаксима и пенициллина G на основе функциональных мономеров анилина, п-аминофенола в присутствии кросс-мономеров (гидрохинон, ализарин, пирогаллол, резорцин, пирокатехин), обеспечивающих образование поперечных связей между слоями и облегчающих встраивание в структуру молекул темплата. Электросинтез ПМО цефотаксима и пенициллина G проводили методом циклической вольтамперометрии в среде, состав которой был заранее подобран экспериментально (0,3 M НСЮ4 или 0,1 M H2SO4 соответственно). Преимуществом электрохимического синтеза ПМО на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора является возможность управлять массой (рассчитываемой по уравнению Зауэрбрея по величине Af, измеренной относительно сенсора сравнения с неимпринтированным полимером) и толщиной пленки (h, нм), путем изменения интервала развертки потенциала, числа циклов полимеризации, природы и концентрации кросс-мономера.

Степень импринтинга антибиотиков оценивали по разности между массой электросинтезированного ПМО и массой полимера после удаления молекул темплата (Дтвс), а также по концентрации молекулярных отпечатков, приходящихся на единицу поверхности электрода (R, ммоль/см2), концентрационной чувствительности (Sc) и толщине пленки, пропорциональной массе слоя (табл. 4).

Так, наиболее высокая степень импринтинга полимера с молекулярными отпечатками цефотаксима была достигнута при применении гидрохинона (0,01 М). Увеличение концентрации гидрохинона до 0,07 M приводит к нарушению связей между слоями, что сопровождается снижением массы пленки и, соответственно, уменьшением количества молекул темплата, включенных в полимерный слой (R снижается с 6,3 до 1,8 ммоль/см2). Применение в качестве кросс-мономера пирогаллола (0,03 М) приводит к образованию более тяжелых и, следовательно, толстых пленок ПМО, что вызывает включение молекул темплата не только в поверхностные, но и объемные слои полимера, из которых их трудно извлечь. Поэтому такие покрытия характеризуются более низкими значениями R и R' (концентрация молекулярных отпечатков при повторном связывании ПМО с молекулами аналита). В случае применения в качестве кросс-мономеров резорцина и ализарина наблюдается существенное снижение адгезии ПМО к поверхности электрода.

Электросинтез ПМО пенициллина G на основе п-аминофенола осуществляется в результате одной развертки потенциала. Применение в качестве кросс-мономера резорцина (0,03 М) способствует получению пленок ПМО с

оптимальными характеристиками, как по степени импринтинга, так и концентрационной чувствительности. Несмотря на более высокую массу и толщину пленки, по сравнению с полимерами на основе полианилина, удается достичь более высоких концентраций поверхностных отпечатков пенициллина в (Л =11,1 ммоль/см2), в том числе и при повторном использовании полимера (И' = 9,5 ммоль/см2). Использование высоких концентраций пирогаллола или гидрохинона (0,07 М) приводит к получению рыхлой структуры, разрушающейся уже на стадии синтеза.

На связывающую способность электросинтезируемых ПМО оказывает влияние природа растворителя, используемого для удаления темплата. Применение ацетонитрила более предпочтительно, поскольку он не обладает функциональными возможностями для взаимодействия со связывающими участками ПМО и не может конкурировать с молекулами темплата при повторном связывании. Однако для всех синтезированных ПМО отмечается снижение значений И' по сравнению с величиной II, что может быть объяснено неполным удалением растворителя или молекул темплата, а также набуханием полимерной матрицы в органическом растворителе или водном растворе.

Таблица 4. Характеристики ПМО цефотаксима и пенициллина в_.

Кросс- Скм» тпмо> ь, Дп1вс, к. , Атпвс К',

мономер М мкг нм мкг ммоль/см , мкг ммоль/см2 Гц-мл-нг

Полимер с молекулярными отпечатками цефотаксима (Саннлин55 0,2 М)

Пирокатехин 0,01 14,5 5,1 1,5 7,1 0,9 3,5 0,7

0,03 17,4 6,1 - - - - -

0,07 10,2 3,6 - - - - -

Гидрохинон 0,01 15,8 5,5 1,6 6,3 1,4 5,5 1,2

0,03 17,1 6,0 1,4 4,8 1,1 4,4 0,9

0,07 15,3 5,4 0,4 1,8 0,2 0,9 0,2

Пирогаллол 0,01 17,1 6,0 1,1 4,0 0,7 2,6 0,6

0,03 20,6 7,2 1,3 4,9 0,8 3,0 0,7

0,07 7,0 2,5 - - - - -

Полимер с молекулярными отпечатками пенициллина в (Сп-аминоФенол = 0,3 М)

Резорцин 0,01 16,3 5,7 - - • - - -

0,03 36,1 12,6 2,1 11,1 1,8 9,5 1,5

0,07 30,0 10,5 0,5 2,6 0,4 2,1 0,3

Гидрохинон 0,01 12,2 4,3 - - - - -

0,03 64,4 22,5 1,5 7,9 1,1 5,8 0,9

0,07 12,0 4,2 - - - - -

Пирогаллол 0,01 - - - - - - -

0,03 27,2 9,5 1,2 6,4 0,9 4,8 0,7

0,07 20,0 0,7 - - - - -

Несмотря на более низкие значения концентрационной чувствительности 8С и предела обнаружении сенсоров на основе ПМО пенициллина й и цефотаксима (3,0 и 7,6 нг/мл) по сравнению с иммуносенсорами, они могут быть использованы для определения антибиотиков в диапазоне концентраций (нг/мл) 5-150 и 10-150 соответственно.

Для оценки селективности ПМО-сенсоров были рассчитаны модифицированные коэффициенты перекрестного реагирования СИ', %, как отношение аналитических сигналов при определении мешающего и целевого антибиотиков. Было установлено, что значения СЯ\ % существенно зависят от концентраций антибиотиков в пробе (табл. 5).

Таблица 5. Оценка селективности определения цефотаксима и пенициллина G с помощью ПМО-сенсоров_____

Антибиотик CR', % CR', % CR', % CR', %

0,15 мкг/мл 0,1 мкг/мл 0,05 мкг/мл 0,01 мкг/мл

Полимер с молекулярными отпечатками цефотаксима

Цефотаксим 100 100 100 100

Пенициллин G 58 15 3 -

Цефтриаксон 68 63 11 4

Стрептомицин - - - -

Полимер с молекулярными отпечатками пенициллина G

Пенициллин G 100 100 100 100

Цефотаксим 21 - - -

Ампициллин 53 40 21 6

Цефазолин 29 - - -

Апрамицин - - - -

В случае присутствия в пробе целевого и мешающих соединений в концентрациях 0,15. мкг/мл невозможно селективное определение цефотаксима или пенициллина G, поскольку практически все р-лактамные антибиотики, имеющие близкое строение, могут взаимодействовать с молекулярными отпечатками. При уменьшении концентрации антибиотиков в пробе наблюдается снижение CR', % для соединений родственного строения. Следовательно, ПМО-сенсоры могут быть рекомендованы для селективного определения следовых концентраций цефотаксима или пенициллина G (< 0,05 мкг/мл).

Синтез наночастнц полимеров с молекулярными отпечатками пенициллинов

Для синтеза наночастиц ПМО в порогенный растворитель последовательно вводили фиксированные количества темплата, функционального и кросс-мономера, а затем инициатора свободных радикалов. Полимеризацию проводили при температуре 40-60°С при постоянном перемешивании в течение 3 час до начала осаждения частиц. Молекулы темплата удаляли экстракцией ацетонитрилом в аппарате Сокслета в течение 6 час.

Размер и дисперсность частиц существенно зависят от природы функционального и кросс-мономеров, порогенного растворителя и условий синтеза (рис.1). При выборе функционального мономера учитывали возможность образования устойчивого ассоциата мономер-темпяат за счет не ковалентных взаимодействий. Применение 4-VP способствует образованию частиц относительно небольшого размера (120±20 им), но высокой степени дисперсности. Напротив, при использования МАА образуются монодисперсные фракции частиц большего диаметра (558±64 нм) при применен™ в качестве кросс-мономера EG1JMA, 673±55 нм - DVB или 1800±100 нм - ТИМ).

Поскольку применение малополярных растворителей способствует увеличению прочности не ковалентных связей предложено использовать в качестве

порогенного растворителя смесь ацетонитрила и толуола в соотношении 4:1. С целью уменьшения размера синтезированных наночастиц ПМО применяли обработку пробы ультразвуковым излучением, способствующим вследствие возникновения ультразвуковой кавитации осуществлять эффективное диспергирование и микроизмельчение частиц ПМО. Так, воздействие на систему ультразвуком с частотой 40 кГц в течение 3 час способствовало уменьшению диаметра частиц практически в 5 раз. Также отмечено влияние продолжительности ультразвуковой обработки на однородность и морфологию частиц, а) б)

Рис. 1. Влияние природы функционального мономера (а) и ультразвуковой обработки (б) на диаметр наночастиц

Сопоставление ИК-спектров метакриловой кислоты, темплата, полимера с молекулярными отпечатками и неимпринтированного полимера (НИП) показало изменения в колебательных спектрах, подтверждающие участие функциональных групп мономера в образовании водородных связей с молекулой темплата при формировании предполимеризационного комплекса (рис.2), а) б)

Полимер со встроенным темплатом

-А-Х* о ^ "«Г л

Кросс-мономер С ІІ :

Метакрпловая Предполимеризацноннын

кислота комплекс Экстракцт

Ампициллин

і >

Чч-п с і Ш

Молекулярный отлечпток

Рис. 2. Изучение механизма формирования предполимеризационного комплекса функциональный мономер - темплат а) ИК-спектры МАЛ, ампициллина, ПМО и НИП; б) схема формирования молекулярных отпечатков

Изучены возможности применения наночастиц ПМО в пьезокварцевых сенсорах для определения пенициллинов в прямом и конкурентном форматах псевдоиммуноанализа. В первом случае с помощью наночастиц ПМО пенициллина в (после предварительного смешивания с тетрагидрофураном) формировали рецепторный слой на поверхности электрода сенсора. Определение антибиотика возможно в достаточно узком диапазоне концентраций 0,1-0,5 мкг/мл, что вероятно связано с изменением размера полостей на поверхности наносфер ПМО вследствие набухания при контакте с тетрагидрофураном.

Конкурентное определение ампициллина с помощью наносфер ПМО проводили по классической схеме: к пробе, содержащей антибиотик, добавляли фиксированное количество частиц ПМО и выдерживали в течение 10 мин до завершения процесса встраивания молекул ампицилина в поверхностные отпечатки. Затем каплю пробы помещали на поверхность сенсора - свободные ПМО взаимодействовали с антибиотиком, иммобилизованным на поверхности сенсора в виде гаптен-белкового конъюгата. Аналитический сигнал сенсора линеен в диапазоне концентраций 0,1-1,0 мкг/мл, предел обнаружения составляет 0,09 мкг/мл.

Применение пьезокварцевых иммуно- и ПМО-сенсоров для определения антибиотиков и природных токсинов в пищевой продукции

Пьезокварцевые иммуносенсоры апробированы при определении в мясе, молоке, меде и яйцах следовых концентраций антибиотика хлорамфеникола, применение которого в ветеринарии запрещено в ряде стран ЕС (в РФ МДУ Сар в мясе - 0,01 мг/кг, в яйцах - 0,003 мг/кг, не допускается наличие Сар в продуктах детского питания).

Детектирование хлорамфеникола в экстракте на основе фосфатного буферного раствора (мясо, яйца, мед) или в надосадочной жидкости после осаждения белков (молоко) осуществляли в конкурентном формате анализа (табл. б).

Таблица 6. Результаты определения хлорамфеникола (п=3, Р=0,95)

Образец Введено, нг/мл Найдено, нг/мл Эг Введено, нг/мл Найдено, нг/мл 8г

Куриное мясо Яйцо

1 5,0 5,2±0,5 0,05 5,0 4,5±0,8 0,06

2 10,0 10,4±1,2 0,04 10,0 9,6±1,2 0,05

Молоко Мед

1 5,0 4,3±0,8 0,07 5,0 4,б±0,6 0,06

2 10,0 8,7±1,1 0,05 10,0 9,4±1,3 0;05

Правильность анализа подтверждена методом «введено-найдено». Статистическая обработка данных не выявила систематической погрешности в результатах определения.

Сопоставлены результаты определения пенициллина в, наиболее распространенного антибиотика, применяемого для лечения инфекционных заболеваний в животноводстве, с помощью иммуно- и ПМО-сенсоров, и установлено его присутствие, не превышающее МДУ во всех анализируемых образцах (0,10 мг/кг) (табл. 7). Отмечено, что выполнение анализа с помощью пьезокварцевого иммуносенсора характеризуется более воспроизводимыми результатами (8Г 0,05-0,07).

Таблица 7. Определение пенициллина G с помощью иммуно- и ПМО-сенсоров (п=3, Р=0,95)__

№ Пьезокварцевый иммуносенсор Пьезокварцевый ПМО-сенсор

Введено нг/мл Найдено, нг/мл Рассчитано, нг/мл Sr Введено, нг/мл Найдено, нг/мл Рассчитано, нг/мл Sr

Молоко

1 10,0 12,6±0,4 2,6±0,3 0,05 10,0 12,1 ±3,2 2,1 ±0,4 0,08

Свинина

2 10,0 43,2±б,3 33,2±5,3 0,06 10,0 40,7 ± 8 . 30,7±7,2 0,09

3 50,0 8б,б±8,7 Зб,6±4,6 0,05 50,0 83,8 ±9.6 33,8±б,6 0,07

Говядина*

4 10,0 20,2±2,4 10,2±1,7 0,07 10,0 27,2 ±4,1 7,2±1,5 0,08

5 50,0 63,5±4,2 13,5±2,0 0,05 50,0 69,0 ± 7,2 19,0±3,2 0,06

Печень*

6 10,0 16,0±1,1 6,0±0,9 0,06 10,0 21,7 ±6.4 11,7±3,1 0,08

7 50,0 57,5±6,2 7,5±1,2 0,06 50,0 64,2 ±8,3 14,2±2,8 0,07

♦образцы из разных партий

Пьезокварцевые иммуносенсоры применены для определения окадаикововй кислоты и стафилококкового энтеротоксина А, продуцируемого патогенными бактериями Staphylococcus aureus и вызывающего острые пищевые отравления (летальная доза менее 100 нг), в прямом формате анализа (табл. 8). Правильность определения токсина подтверждена методами математической статистики с применением теста Стьюдента.

Таблица 8. Результаты определения стафилококкового энтеротоксина А (п-3, Р-0,95)____

Образец Введено, нг/мл Найдено, нг/мл Процент открытия, % 8г

Куриное мясо

1 5,0 4,4±0,7 88 0,08

2 10,0 10,1±1,5 101 0,06

Молоко

1 5,0 4,8±0,3 96 0,09

2 10,0 9,3±1,6 93 0,07

ВЫВОДЫ

1. Показано, что иммобилизация гаптен-белковых конъюгатов и антител на электросинтезированных тонких пленках полипиррола способствует получению устойчивого распознающего слоя пьезокварцевого иммуносенсора с высокой концентрацией доступных активных «сайтов» распознавания, что позволяет осуществлять высокочувствительное и селективное определение биологически активных соединений (хлорамфеникол, пенициллин в, ампициллин, окадаиковая кислота, стафилококковый энтеротоксин А) в широком диапазоне определяемых содержаний.

2. Предложены способы электрогенерации рецепторного слоя сенсора на основе полимеров с молекулярными отпечатками методом циклической вольтамперометрии непосредственно на поверхности электрода сенсора. Установлено влияние природы и концентрации кросс-мономера на степень импринтинга ПМО цефотаксима и пенициллина О, концентрацию молекулярных отпечатков и механическую стабильность. Показано, что оптимальные характеристики рецепторного слоя достигаются при использовании при электросинтезе ПМО цефотаксима смеси анилина (0,2 М) и гидрохинона (0,01 М), ПМО пенициллина О - п-аминофенола (0,3 М) и резорцина (0,03 М). Селективность ПМО сенсоров для определения цефотаксима и пенициллина в возрастает со снижением концентрации антибиотиков в растворе.

3. Обоснованы условия синтеза ноночастиц ПМО пенициллинов методом преципитации. Установлено, что размер и дисперсность синтезируемых наносфер зависит от природы функционального и кросс-мономера, порогенного растворителя, применения ультразвуковой обработки. Отмечено влияние продолжительности ультразвукового воздействия на уменьшение диаметра, однородность и морфологию паночастиц ПМО. Показана возможность применения наночастиц ПМО пенициллинов в прямом и конкурентном форматах псевдоиммуноанализа.

4. Разработаны пьезокварцевые иммуносенсоры для определения индивидуальных биологически активных соединений (хлорамфеникол, пенициллин G, ампициллин, окадаиковая кислота, стафилококковый энтеротоксин А) и суммарного количества пенициллиновых антибиотиков; ПМО-сенсоры для определения пенициллина G, ампициллина, цефотаксима. Сенсоры апробированы при анализе мяса, молока, яиц, морепродуктов, меда и позволяют осуществлять детектирование биологически активных соединений на уровне МДУ и ниже.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карасева Н.А. Закономерности получения ультратонких сорбционных пленок полианилина на поверхности пьезокварцевого сенсора методом электрополимеризации / Н.А. Карасева, И.Г. Соболева, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2011. Т. 11, Вып. 1. С.56-61.

2. Karaseva N. A. A piezoelectric immunosensor for chloramphenicol detection / N.A. Karaseva, T.N. Ermolaeva // Talanta. 2012. V.93. P. 44-48.

3. Безметочный аффинный сенсор для определения окадаиковой кислоты в морепродуктах / Н.А. Карасева, О.В. Воронежцева, Е.Ю. Щербакова, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12, Вып. 6. С. 909-915.

4. Карасева Н.А. Пьезокварцевый сенсор на хлорамфеникол на основе электросинтезированной полианилиновой платформы / Н.А. Карасева // Современные проблемы науки и образования (Электронный журнал). 2012. №6.

5. Karaseva N.A. Piezoelectric immunosensors for toxins' detection in foodstuffs / N.A. Karaseva, T.N. Ermolaeva// Key Engineering Materials. 2013. Vol. 543. P. 515-518.

6. Карасева Н.А. Массочувствительные сенсоры для определения антибиотиков на основе полимеров с молекулярными отпечатками, полученными методом электрохимической полимеризации / Н.А. Карасева, И.Г. Соболева, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Т. 13, Вып. 1. С. 5-9.

7. Формирование рецепторного покрытия массочувствительного сенсора на основе полимера с молекулярными отпечатками пенициллина G методом электрохимической полимеризации / Н.А. Карасева, Н.А. Жеромская, И.Г. Соболева, Т.Н. Ермолаева // Сб. материалов XIII Международной конференции "Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов ИОНИТЫ -2011". 2011. Воронеж. С. 292-295.

8. Карасева Н.А. Изучение условий получения иммуноаффинных покрытий пьезокварцевых сенсоров для определения хлорамфеникола / Н.А. Карасева, Т.Н. Ермолаева // Аналитическая химия - новые методы и возможности: тезисы докл. съезда аналитиков России (Москва, 26-30 апреля 2010 г.). 2010. Москва. С. 141.

9. Ermolaeva Т. Molecular detection and recognition of penicillins in food with the help of piezoelectric sensors on the basis of immunoreagents and molecularly imprinted polymers / T. Ermolaeva, N. Karaseva // The 7th International conference on instrumental methods of analysis modern trends and application. 2011. Chania Crete. P. 234.

10. Karaseva N.A. Piezoelectric immunosensors for toxins' detection in foodstuffs / N.A. Karaseva, T.N. Ermolaeva // Abstracts Book of International Conference on Materials and Applications for Sensors and Transducers. 2012. Budapest. Hungary. P. 137.

11. Карасева Н.А. Применение электрополимеризованных полимеров с молекулярными отпечатками бета-лактамных антибиотиков в пьезокварцевых сенсорах / Н.А. Карасева, И.Г.Соболева, Т.Н. Ермолаева // Материалы VIII

Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012». 2012. Уфа-Абзаково. С.128.

12. Шашканова О. Ю. Проточно-инжекционное определение стафилококкового энтеротоксина А в молоке и мясе с помощью пьезокварцевого иммуносенсора / О.Ю. Шашканова, H.A. Карасева, Т.Н. Ермолаева // Материалы VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012». 2012. Уфа-Абзаково. С. 140.

13. Карасева H.A. Синтез и применение молекулярно-импринтированных наночастиц в пьезокварцевых сенсорах для определения ампициллина / H.A. Карасева, В.Н. Чернышова, Т.Н. Ермолаева // Сборник всероссийской школы-конференции "Химия биологически активных веществ" молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием "ХимБиоАктив-2012". 2012. Саратов. С. 39.

Работы 1-6 опубликованы в изданиях, входящих в Перечень ВАК

Автор выражает искреннюю благодарность к. х. п., доценту И.Г. Соболевой студентам Ю.В. Полетаевой, H.A. Жеромской, E.H. Жбановой, В.Н. Чериышовой за помощь при проведении экспериментальных исследований по электросинтезу ПМО и формированию рецепторного слоя иммуносенсоров.

Подписано в печать 18.04.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная.

Ризография. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 253. Издательство Липецкого государственного технического университета. Полиграфическое подразделение Издательства ЛГТУ. 398600 Липецк, ул. Московская, 30.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Карасева, Надежда Александровна, Воронеж

ФГБОУ ВПО «Липецкий государственный технический университет»

На правах рукописи

04201357471 Карасева Надежда Александровна

ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫЕ ИММУНО- И ПМО-СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЯДА АНТИБИОТИКОВ И ПРИРОДНЫХ ТОКСИНОВ

02.00.02 - аналитическая химия

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель

Доктор химических наук, профессор

Ермолаева Татьяна Николаевна

Воронеж -2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ.................................................................... 4

Глава I. Обзор литературы................................................ 10

1.1. Пьезокварцевые сенсоры для определения низко- и высокомолекулярных соединений.......................................... 10

1.2. Полимеры с молекулярными отпечатками для применения в

пьезокварцевых сенсорах.................................................... 20

Глава II. Экспериментальная часть.................................... 31

II. 1. Характеристика объектов исследования, химических

реагентов, иммунореагентов и аналитического оборудования...... 31

II.2. Иммобилизация биомолекул на поверхности золотого

электрода пьезокварцевого иммуносенсора.............................. 37

И.З. Электросинтез пленок полимеров с молекулярными отпечатками..................................................................... 39

11.4. Синтез наночастиц полимеров с молекулярными отпечатками методом преципитации....................................................... 41

11.5. Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело.............................................................. 42

11.6. Определение коэффициентов перекрестного реагирования антител и ПМО................................................................. 42

11.7. Пробоподготовка образцов пищевой продукции................. 43

Глава III. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для определения высоко - и низкомолекулярных

соединений..................................................................... 46

III. 1 .Формирование рецепторного покрытия иммуносенсора....... 46

III. 1.1. Генерирование подложки методом электрополимеризации. 47 III. 1.2. Иммобилизация биомолекул на поверхности электрода

сенсора........................................................................... 55

III.2. Характеристика применяемых иммунореагентов............... 62

Ш.З. Выбор регенерирующего раствора................................. 67

Ш.4. Метрологические характеристики разработанных

пьезокварцевых иммуносенсоров.......................................... 69

Глава IV. Сенсоры на основе полимеров с молекулярными

отпечатками.................................................................. 73

IV. 1. Формирование покрытия на основе полимеров с

молекулярными отпечатками методом электрополимеризации..... 73

IV.2. Применение ПМО цефотаксима и пенициллина в в

пьезокварцевых сенсорах..................................................... 81

IV.3. Синтез наносфер с поверхностными отпечатками методом

преципитации................................................................... 83

ГУ.3.1. Применение частиц полимеров с молекулярными

отпечатками в пьезокварцевых сенсорах................................. 89

Глава V. Применение пьезокварцевых иммуно- и ПМО-сенсоров для определения антибиотиков и природных

токсинов в пищевой продукции......................................... 94

ВЫВОДЫ...................................................................... 100

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................. 102

Введение

Актуальность работы.

Пьезокварцевые гравиметрические сенсоры положительно зарекомендовали себя при анализе газов и жидкостей. Чувствительность определения аналитов связана со свойствами пьезокварцевого преобразователя, в то время как рецепторный слой на поверхности его электродов влияет на чувствительность и селективность детектирования. Наиболее часто при анализе жидких сред в качестве распознающих молекул используются иммунореагенты, позволяющие существенно упростить и сократить процесс пробоподготовки при анализе сложных многокомпонентных проб. Способ создания рецепторного слоя на поверхности электрода сенсора зависит от свойств иммобилизуемых биомолекул и может существенно повысить чувствительность определения индивидуальных соединений. Как правило, для формирования распознающего слоя используется ковалентное закрепление иммунореагентов на предварительно сформированную подложку, обеспечивающую прочную связь с поверхностью металлического электрода и влияющую на продолжительность его службы. Наиболее часто применяются подложки на основе самоорганизованных монослоев тиолов и силоксанов. Способы иммобилизации биомолекул на электрополимеризованные тонкопленочные покрытия в пьезокварцевых сенсорах используются значительно реже, несмотря на возможность изменять их характеристики непосредственно в процессе генерирования.

полимеризации. Перед нанесением полимеров на поверхность электрода сенсора требуется их размельчение, фракционирование и последующее закрепление в виде суспензии, что является причиной невысокой воспроизводимости свойств покрытия. Применение метода электрополимеризации позволяет существенно повысить надежность получения слоя с воспроизводимыми характеристиками, сократить продолжительность получения покрытия и упростить процедуру анализа. Поэтому получение полимеров непосредственно на поверхности электрода сенсора методом электрополимеризациии или применение наночастиц с поверхностными отпечатками определяемого соединения расширит возможности использования ПМО в пьезокварцевых сенсорах в качестве заменителей антител, как в прямом, так и конкурентном формате псевдоиммуноанализа.

Работа выполнялась при финансовой поддержке ведомственной целевой аналитической программы Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011)» (№2.1.1/14142), гранта РФФИ «Иммунохимические системы для молекулярного распознавания антибиотиков и оценка безопасности пищевых продуктов» (09-03-97566-р_центр_а), темплана Минобрнауки РФ «Пъезокварцевые биосенсоры нового поколения для определения токсинов и физиологических активных веществ» (№3.2727.2011), Фонда развития малых форм предприятий «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» «У.М.Н.И.К» (тема № 17126, 2012-2013 гг.)

природных токсинов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить условия ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и антител на электрополимеризованные пленки полианилина и полипиррола;

- разработать пьезокварцевые иммуносенсоры для определения индивидуальных биологически активных соединений (хлорамфеникол, пенициллин G, ампициллин, окадаиковая кислота, стафилококковый энтеротоксин А) и суммарного количества пенициллиновых антибиотиков; ПМО-сенсоры для определения пенициллина G, ампициллина, цефотаксима в пищевой продукции.

Научная новизна.

Предложен электрохимический способ формирования распознающего слоя на основе полимеров с молекулярными отпечатками цефотаксима и пенициллина в непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора. Показано, что формирование покрытия методом циклической вольтамперометрии и применение в качестве кросс-мономеров диоксибензолов (гидрохинон, резорцин) способствует созданию однородного слоя ПМО оптимальной массы и толщины, с высокой поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков.

Практическая значимость.

Разработаны сенсоры для определения следовых концентраций индивидуальных биологически активных веществ (пенициллин О, ампициллин, цефотаксим, окадаиковая кислота и стафилоккоковый энтеротоксин А) и суммарного количества антибиотиков пенициллиновой группы. Разработаны способы синтеза тонких пленок ПМО цефотаксима и пенициллина О и наночастиц ПМО пенициллинов методом преципитации. Сенсоры апробированы при анализе реальных пищевых объектов (мясо, молоко, яйца, мед, креветки, кальмары). Научная новизна способа определения хлорамфеникола подтверждена положительным решением Роспатента о выдаче патента (№ 2011129725 от 3 марта 2013 г.).

На защиту выносятся:

распознающие слои иммуносенсоров, полученные ковалентной

иммобилизацией гаптен-белковых конъюгатов и антител на

электросинтезированные подложки полианилина и полипиррола,

позволяющие существенно повысить чувствительность определения

биологически активных соединений по сравнению с сенсорами на основе у-аминопропилтриэтоксисилана;

способ электросинтеза тонкослойных пленок ПМО цефатоксима и пенициллина О непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора, характеризующихся высокой степенью импринтинга и поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков, механической прочностью;

- пьезокварцевые иммуносенсоры, позволяющие определять следовые концентрации хлорамфеникола, пенициллина О, ампициллина, окадаиковой кислоты, стафилококкового энтеротоксина А, суммарное содержание пенициллиновых антибиотиков и ПМО-сенсоры для определения цефотаксима и пенициллина С в пищевой продукции.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на

следующих конференциях: Всероссийской конференции «Аналитика

России», Краснодар, 2009; Всероссийской конференции «Проведение

научных исследований в области индустрии наносистем и материалов»,

Белгород, 2009; «Экотоксикология - 2009, 2011», Пущино, Тула; Съезде

аналитиков России, Москва, 2010; XX Российской молодежной научной

конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии»,

Екатеринбург, 2010, 2011, 2012; Всероссийской конференции

«Биосовместимые материалы и покрытия», Саратов, 2011; Международной

научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых

«Ломоносов-2009, 2011», Москва; V Всероссийской конференции "Фагран-

2010", Воронеж; XIII Международной конференции «ИОНИТЫ - 2011»

Воронеж; 2-ой Научной региональной конференции с международным

участием «Химия-2011», Коломна; Общероссийской научной конференции

«Полифункциональные химические материалы и технологии», Томск, 2012;

th •

The 7 International conference on instrumental methods of analysis modern trends and application, Греция, 2011; Всероссийской конференции «ЭМА-2012», Уфа, 2012; Всероссийской конференции «Химия биологически активных веществ», Саратов, 2012; International Conference on Materials and Applications for Sensors and Transducers, Венгрия, 2012; 1-ой школе-конференции с международным участие «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург, 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей (в том числе 6 статей в журналах, входящих в Перечень ВАК) и 7 тезисов докладов

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Пьезокварцевые сенсоры для определения низко- и высокомолекулярных соединений

В настоящее время актуальным является разработка экспрессных, высокочувствительных и селективных методик определения органических соединений в сложных по составу пробах. Решение этой проблемы стимулировало развитие химической и биосенсорики.

Сенсоры представляют собой аналитические устройства, небольшие по размеру, простые по конструкции и легкие в эксплуатации, позволяющие в режиме on-line получать информацию о содержании различных компонентов в анализируемых пробах. Селективность и чувствительность детектирования определяемых соединений связана со свойствами селектирующей мембраны и физического преобразователя (трансдьюсер) (рис. 1).

, © « ® _

щ ф

т. ic А • ©

★ Ш JL.

w ^

Проба

S о.

3 <11 и

> « л

а. о f ч

х ч и

£ u X го

и о.

с; н

Рис. 1. Схема устройства сенсора

В зависимости от вида рецепторных молекул сенсоры подразделяются на химические и биосенсоры [1-3]; по природе применяемого трансдьюсера -на электрохимические [4-10], пьезоэлектрические [10-13], оптические [1415] сенсоры.

Сенсоры характеризуются небольшими размерами, простотой применения, высокой избирательностью, чувствительностью и экспрессностью, позволяют осуществлять селективное и

высокочувствительное определение различных веществ как в газовых, так и в жидких средах при отсутствии длительной и сложной пробоподготовки.

В настоящее время большой интерес вызывают безметочные

пьезоэлектрические сенсоры. По принципу формирования аналитического

сигнала их можно подразделить на сенсоры на основе объемных сдвиговых

волн (кварцевые микро - и нановесы), поверхностных акустических волн,

сдвиговых акустических мод пластины и т.д. Весьма перспективным для

анализа различных соединений является использование

массочувствительных пьезокварцевых сенсоров, работающих по принципу

объемных акустических волн [1, 3, 10-13]. Пьезокварцевый

гравиметрический сенсор представляет собой тонкий диск кристалла а-

кварца АТ-среза, на обеих сторонах которого сформированы электроды из

золота, серебра, платины и т.д. [11]. Аналитическим сигналом

пьезокварцевых сенсоров наиболее часто служит уменьшение частоты

колебаний при увеличении массы рецепторного слоя в результате его

взаимодействия с определяемым соединением [16]. Предел обнаружения

пьезокварцевого сенсора с частотой колебаний 10 МГц составляет 10"" г/мл [16-24].

Однако при использовании пьезокварцевых сенсоров в жидких средах необходимо учитывать влияние таких факторов как вязкость, плотность и диэлектрическая проницаемость жидкости, в связи с чем были разработаны QCM-D сенсоры (Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring) [2528], позволяющие одновременно с изменением частоты колебания измерять степень рассеяния энергии, зависящую от вязкоэластичных свойств анализируемого раствора. При анализе растворов с близкими параметрами влияние вязкости и диэлектрической проницаемости учитывают при градуировке сенсора.

Пьезокварцевые сенсоры получили широкое распространение для

определения как высоко - (белки [29], ДНК [30], антитела [31-32], токсины

[36]), так и низкомолекулярных соединений (пестициды [33], лекарственные

препараты [34], диамины [35] и т. д.) в биологических пробах, пищевой продукции, объектах окружающей среды и т.д.

Чувствительность, селективность и воспроизводимость аналитического сигнала, а также продолжительность службы пьезокварцевого сенсора напрямую зависят от свойств рецепторного покрытия, сформированного на поверхности его электрода. К рецепторному слою предъявляются следующие требования: сохранение высокой активности иммобилизованных биораспознающих элементов, равном�