Иммунохимические методы определения аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

005003936

Воронежцева Ольга Вячеславовна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ И ТЕТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ, ТРИЦИКЛИЧЕСКИХ АНТИДЕПРЕССАНТОВ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-8 ДЕК 2011

Воронеж 2011

005003936

Работа выполнена в Липецком государственном техническом университете

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Евтюгин Геннадий Артурович доктор химических наук, профессор Бобрешова Ольга Владимировна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 28 декабря 2011 г. в 14— на заседании диссертационног совета Д 212.038.19 по химическим наукам при Воронежском государственно университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежског государственного университета

Автореферат разослан « 25 » ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

М.Ю. Крысин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Неконтролируемое использование лекарственных препаратов в ветеринарной практике для борьбы с инфекционными заболеваниями и повышения продуктивности животноводства и птицеводства приводит к их накоплению в продуктах питания и представляет потенциальную

угрозу здоровью людей.

Снизить негативное влияние лекарственных препаратов возможно введя строгий контроль их остаточного содержания в продуктах питания. Для регулярного мониторинга остаточных количеств фармацевтических препаратов в животноводческой продукции и кормах в настоящее время используют микробиологические и хроматографические методы анализа. Микробиологические методы, основанные на способности антибиотиков к ингибированию микроорганизмов, используются для полуколичественного определения, продолжительны и не всегда специфичны, из-за мешающего влияния присутствующих в пищевых продуктах жиров, кислот, красителей и соединения с антибактериальной активностью. Хроматографические методы позволяют осуществлять идентификацию и одновременное определение нескольких фармацевтических препаратов, однако требуют достаточно сложной пробоподготовки, использования дорогостоящего оборудования и существенных временных затрат, что сдерживает их применение для рутинного анализа.

Таких недостатков лишены иммунохимические методы, позволяющие с высокой чувствительностью и селективностью определять остаточные количества лекарственных препаратов без предварительного выделения из анализируемой пробы. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя для селективного и чувствительного определении следовых концентраций сульфопрепаратов, пестицидов и других физиологически активных веществ. Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) характеризуется высокой экспрессностью и также ранее применялся для детектирования ряда лекарственных препаратов, пестицидов, микотоксинов в

пищевых продуктах.

Однако для определения аминогликозидов и тетрациклинов, трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах пьезокварцевые иммуносенсоры и метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа ранее не применялись. Изучение новых возможностей определения остаточных концентраций лекарственных препаратов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в пищевых продуктах является актуальной аналитической задачей.

Цель исследования - изучение особенностей определения антибиотиков (аминогликозиды, тетрациклины) и трициклических антидепрессантов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью гравиметрических пьезокварцевых иммуносенсоров.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие |

задачи: ~х/

обосновать условия формирования биорецепторного слоя, включающего образование подложки на основе самоорганизующихся монослоев тиолов или кросс-сшитого хитозана, активацию поверхности бифункциональным реагентом и иммобилизацию белковых конъюгатов антибиотиков и антидепрессачтов;

исследовать закономерности гомогенной и гетерогенной иммунохимической реакции в растворе и на поверхности сенсора, установить коэффициенты перекрестного реагирования гомолитичных антител к антибиотикам (гентамицин, стрептомицин, дишдрострептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин, апрамицин, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин) и групп-специфичных антител к тетрациклинам и трициклическим антидепрессантам;

оптимизировать условия синтеза монодисперсностных наночастиц золота и оценить возможность их применения для амплификации сигнала пьезокварцевого иммуносенсора для аминогликозидных антибиотиков;

разработать методики определения трициклических антидепрессантов, аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, включающие экстракционное извлечение лекарственных препаратов. Научная новизна:

предложены новые подходы к формированию биорецепторного слоя на поверхности сенсора, включающие образование самоорганизующихся монослоев ациклических и гетероциклических тиолов, кросс-сшитого хитозана и ковалентную иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов с использованием различных бифункциональных реагентов;

установлены условия образования смешанных слоев ациклических и гетероциклических тиолов, обеспечивающих высокую поверхностную плотность антигенных детерминант, хорошую адгезию к поверхности сенсора и устойчивость при эксплуатации в жидкости и при регенерации;

показано, что обработка монослоя хитозана растворами бифункциональных реагентов способствует увеличению устойчивости биослоя за счет кросс-сшивки полисахарида;

установлено, что проведение синтеза наночастиц золота в микроэмульсиях при конвекционном нагревании и в условиях микроволнового пагрева приводит к образованию моиодисперсных фракций коллоидных частиц, на размер которых влияют соотношения концентраций используемых реагентов;

изучены закономерности гомогенных и гетерогенных иммунохимических реакций между гомолитичными и групп-специфичными антителами и фармацевтическими препаратами, которые использованы для разработки методик определения антибиотиков и антидепрессантов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик определения аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Предложены способы получения самоорганизующихся монослоев на поверхности сенсора на основе ациклических и гетероциклических тиолов, смешанных монослоев, кросс-сшитого хитозана. Разработана методика синтеза наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты в микроэмульсиях н в условиях микроволнового нагрева, показано применение наночастиц золота для усиления сигнала ньезокварцевого иммуиосенсора. Установлены оптимальные условия определения антибиотиков и антидепрессантов методом ГТФИА. Научная новизна способа определения стрептомицина с помощью пьезокварцевого иммуиосенсора подтверждена патентом РФ.

На защиту выносятся:

закономерности создания подложек на основе самоорганизующихся монослоев ациклических и гетероциклических тиолов, смешанных монослоев, кросс-сшитого хитозана и иммобилизации белковых конъюгатов антибиотиков, антидепрессантов;

условия получения монодисперсных фракций наночастиц золота при синтезе в микроэмульсиях и микроволновом нагреве и их применения для амплификации сигнала пьезокварцевого иммуиосенсора;

кинетические исследования гетерогенной и гомогенной иммунохимической реакции, значения констант аффинности и констант трейсера, коэффициенты перекрестного реагирования антител, использованные при разработке методик определения фармацевтических препаратов;

методики определения индивидуальных соединений (аминогликозидные и тстрациклшговые антибиотики) и суммарного количества тетрациклииов и трициклических антидепрессантов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в пищевых продуктах.

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации доложены на Всероссийской конференции «Экотоксикодогия-2009, 2010» (Москва-ГТущино, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2009, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010), Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010), Всероссийской конференции «Нано-и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (Белгород, 2010), XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011), Молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); ХШ Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов - ИОНИТЫ - 2011» (Воронеж, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 5 статьях (4 входят в список статей, рекомендованных ВАК) и 10 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 29 рисунков и 23 таблицы. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 211 ссылок на работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, приборы и методы исследования

В качестве объектов исследования выбраны аминогликозидные (гентамицин (ГЕНТ), стрептомицин (СТР), дигидрострептомицин (ДСТР), канамицин (КАНА), тобрамишга (ТОБР), амикацин (ШИК), неомицин (НЕОМ), апрамицин (АПР)) и тетрациклиновые (хлотетрациклин (ХТЕТР), окситетрациклин (ОТЕТР), тетрациклин (ТЕТР)) антибиотики, трициклические антидепрессанты (амитриптилин (АМИТ), имипрамин (ИМИП)).

Для получения рецепторных покрытий использовали 2-амино-З-меркаптонропионовую кислоту (АМПК), 11-меркапто-1-ундеканоя (МУ); S-меркаптоянтарный ангидрид (АМК); цистамин (Sigma, США), ((2-окси-З-меркаптоэтил)-3-бензоилпиримидин (ОМБП), 2-М-4-меркапто-6-фенил-1,3,5-триазшт (МФТ), 2-амино-5-меркапто-1,3,4-триазол (AMT), хитозан.

В качестве кросс-реагентов применяли: глутаровый альдегид (ГА) («Reanal», Венгрия), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК), N-гидроксисукцинимид (ГС), Ы,№-дициклогексилкарбодимиид (ДГК); 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) - карбоксиимид мето-р-толуилсульфонат (ЦГМКТ),

Для иммунохимического определения гентамицина применяли поликлональные {{ПАГ-1 («АЬсага», Великобритания); ПАГ-2 (Китай), ПАГ-3, ПАГ-4, ПАГ-5 (Королевский колледж, Великобритания)] и моноклональные (МАГ (Голландия)) антитела; иеомицииа - поликлональные антитела (ПАН-1 (Китай), ПАН-2 (Королевский колледж, Великобритания)); апрамицина (ПААП («Ahcam», Великобритания)); амикацина (ПААМ («АЬсаш», Великобритания)), тобрамицина (ПАТ-1 («АЬсаш», Великобритания)); ПАТ-2 (Китай)); стрептомицина (ПАС-1, ПАС-2 (Королевский колледж, Великобритания)); канамицина (ПАК-1, ПАК-2 (Королевский колледж, Великобритания)); тетрациклина (ПАТР-1); хлортетрациклина (ЛАХТР) («Abcam», Великобритания)); суммарного содержания тетрациклинов поликлоначьные антитела (ПАТР-2, ПАТР-3 (Королевский колледж, Великобритания)); трициклических антидепрессантов (ПАТА (Королевский колледж, Великобритания)).

В работе применяли гаптен-бедковые конъюгаты, полученные сшивкой определяемого соединения с белковой молекулой (БCA, СИТ, ОБА) методом активированных эфиров. АСМ исследование осуществляли на атомном силовом микроскопе SOLVER Р47 Pro.

Восстановление наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК) (х.ч., «АУРАТ») проводили с помощью цитрата натрия (ЦН), гидроксиламииа солянокислого (ГАС), хлорида олова (ХО), гидразина солянокислого (ГЗН), аскорбиновой кислоты (АК) (х.ч., «Реахим», Россия), боргидрида натрия (БН) («Sigma», США), в присутствии ПАВ - додецилсульфата натрия (ЦСН), полиэтиленгяикодя 2000, 3000 (ПЭГ) («FERAK», Германия), цетилтриметиламмониумбромида (ЦТАБ), Тритона - ТХ-100 (ТХ-100) («Sigma»,

США). В качестве органического растворителя применяли гсксан («Reanal», Венгрия).

Поляризацию флуоресценции замеряли на TDx-анализаторе («Abbott», США) и поляризационном флуориметре «Beacon 2000» («Panvera», США). Трейсеры синтезировали карбодиимидным методом*.

Разработка пьезокварцевых иммуносеиеоров для определения фармацевтических препаратов

Формирование рецепторного слоя пьезокварцевого илтуносенсора.

Качество рецепторного слоя гравиметрического пьезокварцевого сенсора для определения низкомолекулярных соединений обеспечивается высокой активностью, пространственной доступностью и плотностью антигенных детерминант на поверхности биослоя, устойчивостью при длительной эксплуатации в жидкости и регенерации, невысокой массой, влияющей на диапазон определяемых содержаний. Таким требованиям в максимальной степени отвечают многослойные покрытия, состоящие из подложки с высокой адгезией к золотому электроду, на поверхности которой с помощью бифункционального реагента иммобилизованы гаптен-белковые конъюгаты.

Методами пьезокварцевого микровзвешивания и атомной силовой микроскопии изучены закономерности изменения массы (Дт, мкг) и топографии поверхности при создании подложек на основе самоорганизующихся монослоев ациклических и гетероциклических толов и кросс-сшшого хитозана, иммобилизации иммунореагентов (табл. 1).

Процесс получения подложки включает адсорбцию молекул тиолов за счет координации Au-S- и последующую самоорганизацию, сопровождающуюся уплотнением монослоя вследствие иековалентных взаимодействий. В случае ациклических тиолов (МУ и ЦМ), содержащих неразветвлеиный «спейсер», генерируется плотная пленка на основе практически параллельных друг другу молекул, что сопровождается снижением средней шероховатости (Ra) поверхности золота от 265 до 120 нм (рис. 1 а, б). Такие подложки обеспечивают равномерное распределение и высокую плотность рецепторных молекул гаптен-белкового конъюгата в аффинном слое, что подтверждается значениями концентрационной чувствительности (А 460 - 474 Гц-мл-мкг"'), рассчитанными для иммунохимической реакции гентамицин-антитело, и устойчивостью рецепторного слоя в 20-25 циклах измерений.

Присутствие аминогруппы в стуктуре «спенсера» линейного тиола 2-амино-3-меркаптоиропионовой кислота негативно отражается на качестве самоорганизующегося слоя, а терминальная карбоксильная группа снижает эффективность связывания с рецепторной молекулой. Аналогичные результаты наблюдаются при создании монослоев из гетероциклических тиолов, содержащих донорные атомы азота.

Научный консультант по вопросам синтеза трейссров и поляризационного флуоресцентного иммупоанализа лл.н., проф. Еремнн GA.

1 i-меркапте- 1>илг к ннол-

2 r l.M-»¡»ii.tt't.'i

ПОВЕРХНОСТЬ

«шотог«

1 i-меркшпгв- 1-униекшгол+ 2-ж*шно 5 меркагсго 1.3,4

Рис. 1 Морфология поверхности золотого электрода и монослоев на основе МУ (а), ЦМ (б), смешанных монослоев, полученных послойным (в) и одновременным (г) нанесением МУ и AMT, сшитого ГА хитозана (д).

Изучена возможность получения смешанных монослоев на основе ациклического и гетероциклического тиолов (МУ, AMT), применение которых позволяет изменить архитектуру поверхности за счет чередования молекул серосодержащих соединений с разноуровневыми терминальными группами. Сравнение характеристик смешанных слоев, полученных путем нанесения на поверхность электрода раствора, включающего два тиода (МУ, AMT) (рис. 1 г), или поочередного дозирования ациклического, а затем гетероциклического тиода (рис. 1 в), показало, что во втором способе удается получить более структурированные покрытия и, как следствие, более высокие значения концентрационной чувствительности при проведении иммунохимической реакции.

Таблица 1. Изучение иммобилизации ГЕНТ-БСА на монослоях тиодоо и хнтозана (Р = 0,95, п=в)___________

Монослой тиола Этапы R., нм Am, мкг А*, Гц-мл-мкг"1 N

Ангидрид S-меркагпшнтарной кислоты (0,03%) монослой 311 42,08 - 24

нанесение кросс-реагента ГА 315 52,76 -

закрепление конъюгата 346 74,11 15

1 -меркапто-1 -ундеканол (0,03%) монослой 120 22,26 - 25

нанесение кросс-реагента ГА 131 27,68 -

закрепление конъюгата 175 29,15 474

нанесение кросс-реагеита эдк 140 30,14 -

закрепление конъюгата 183 33,81 409

2-амино-З-меркаптопропионовая кислота (0,1%) монослой 215 25,95 - 8

нанесение кросс-реагента ГА 249 33,68 -

закрепление конъюгата 272 38,89 168

Цистами н (0,015%) монослой 117 9,69 - 20

нанесение кросс-реагента ГА 125 11,20 -

закрепление конъюгата 146 14,03 460

2-амино-5-мерканто-1,3,4 -триазол (0,03%) монослой 348 31,44 - 6

нанесение кросс-реагента ГА 376 37,51 -

закрепление конъюгата 402 47,95 22

Одновременное нанесение МУ и AMT монослой 321 34,53 - 20

нанесение кросс-реагеита ГА 361 16,13 -

закрепление конъюгата 405 17,42 315

Метод молекулярного наслаивания МУ и AMT монослой МУ 347 14,54 - 30

монослой AMT 374 18,35 -

нанесение кросс-реагента ГА 409 22,13 -

закрепление конъюгата 474 29,35 420

Хитозан (0,03%) при 353К монослой - 7,04 - 15

нанесение кросс-реагента ГА 250 13,43 -

закрепление конъюгата 273 21,32 298

нанесение кросс-реагеита ЭДК 268 12,12 -

закрепление конъюгата 290 23,63 341

*А = Д17сдг, где Af- аналитический сигнал иммуносенсора, С „ - концентрация антител к гентамицину

Отмечено, что оптимальные характеристики наблюдаются при использовании 0,06% и 0,03%-ного растворов МУ и ЛМТ соответственна Устойчивость таких слоев в жидкостях максимальна и превышает 30 циклов измерений без изменения массы рецепторного слоя.

Покрытия на основе хитозана могут быть использованы в качестве подложек только после обработки кросс-реагентами. Изучено влияние на качество покрытой природы и концентрации кросс-реагентов, технологии получения стабильных, устойчивых к длительной эксплуатации в жидкости пленок. Показано, что наиболее плотные, стабильные покрытия с оптимальной массой, позволяющие формировать реценторные слои с высокой концентрацией антигенных детерминант, образуются при применении для сшивки ГА (3,5-6 %) (рис. 1 д) и ЭДК (2 - 6 %). Концентрации ГА и ЭДК выше или ниже оптимальной, использование других кросс-реагентов (ДГК и ЦГМКТ) способствовали повышению массы покрытия или снижению устойчивости в жидкости, что исключало использование в ньезокварцевых иммуносеисорах.

Показано, что плотность и однородность пленки кросс-сшитого хитозана зависят от технологии ее получения. При нанесении сначала хитозана, а затем кросс-реагента происходит уплотнение покрытия, увеличению средней шероховатости поверхности. В тоже время покрытие, полученное при нанесении раствора, содержащего 0,03% хитозана и 5% ГА, характеризуется минимальной толщиной (4,42 нм) и высокой устойчивостью в жидкости, его масса сохраняется постоянной в течение 15 циклов измерений. Установлено, что выдерживание подложки при В0°С снижает время получения устойчивой пленки с 4 ч до 15 мин, обеспечивая структурирование слоя.

При иммобилизация гаптен-белкового конъюгата наблюдается увеличением массы и шероховатости рецепторного покрытия. Наибольшая стерическая доступность рецепторных молекул достигается при активации поверхности монослоев тиолов ЭДК и ГА. При использовании глутарового альдегида образуются более тонкие, легкие и однородные покрытия с высокой конформационной доступностью антигенных детерминант для взаимодействия с антителами. Применение других бифункциональных реагентов способствует снижению чувствительности определения.

Изучение закономерностей гетерогенной штунохимической реакции и оценка специфичности применяемых иммунореагентов. Для определения лекарственных препаратов были использованы моноклональные или поликлоналыше антитела к индивидуальным антибиотикам (гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомиции, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин, апрамицин, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин) и групп-специфичные антитела для детектирования суммарного количества тетрациклинов и трициклических антидепрессантов.

С применением методики Скетчарда установлены константы скорости реакций образования (ко) и диссоциации (кР) гетерогенного комплекса антиген-антитело, рассчитаны константы аффинности (КАф), позволяющие оценить сродство иммунореагентов и прогнозировать чувствительность определения антибиотиков и антидепрессантов (табл. 2). Высокие значения констант скорости

образования (ко) свидетельствуют о мгновенном протекании иммунохимической реакции между всеми изученными реагентами. Константы скорости разрушения (кР) имеют близкие значения, что позволило использовать для регенерации рецепторного слоя раствор солянокислого гидрокснламнна одинаковой концентрации (0,1 М). Исключение составляет лишь пара ПЛГ-1+ГЕНТ-БСА, для которой кр практически на три порядка выше (7,2* 10"3, с"1), что обеспечивает регенерацию покрытия менее концентрированными растворами или даже дистиллированной водой.

Таблица 2. Константы скорости прямой и обратной иммунохимической реакции и

_ ______ _____________________

Пара иммунореагентов ко* 1 мальГ^гс"1 к[.*10,с:| Кд/КГ.М-1

ПАГ-1+ГЕНТ-БСА 3,5 720 0,005

ЛАГ-4+ГЕНТ-БСА 3,4 6,9 0,5

ПАГ-2+ГЕНТ-БСА 8,6 3,2 2,7

ПАГ-З+ГЕНТ-БСА 6,7 1,2 5,6

ПААП+АПР-БСА 9,2 5,1 1,8

ПАТ+ТОБР-БСА 0,1 7,7 0,01

ПАТР-1+ТЕТР-БСА 18 1,1 16

ПАХТР+ХТЕТР-БСА 1,5 8,2 0,2

АФ+АФ-БСА 63 1,7 3,7

ПАТР-2+ ТЕТР-БСА 21 2,4 8,9

ПАТШШПГЖА 2,2 2,1 1,0

ПАТА+ИМИП-БСА 31 0,9 35

Величины КАф порядка 107 - 1010 М"1 для всех изученных моно- и поликлональных антител свидетельствуют о высоком сродстве между иммунореагентами, что позволяет их использовать для разработки пьезокварцевых иммуносеноров (табл. 3).

Предел обнаружения антибиотиков и антидепрессантов существенно ниже максимально допустимых уровней, принятых в РФ. Установлена взаимосвязь предела обнаружения от величины константы аффинности. Так для нар иммунореагентов при определении гентамицина наблюдается изменение Стт(ПАГ-1+ГЕНТ-БСА)> СтЬ(ПАГ-4+ГЕНТ-БСА)> Ст1в(ПАГ-2+ГЕНТ-БСА)> Ст\„(ПАГ-3+ГЕНТ-БСА) в соответствии с увеличением значения константы. Такая же закономерность наблюдается и для других иммунореагентов.

Для оценки селективности определения фармацевтических препаратов были рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (ПР,%) поликлональных антител к определяемым соединениям и соединениям родственного строения (табл. 4).

Таблица 3. Метрологические характеристики определения препаратов с

Определяемое соединение Пара иммунореагеитов Cmin? иг/мл Диапазон определяемых содержаний, нг/мл R2

ПАГ-1+ГЕН Т-БСА 22 28-90 0,98

Гентамицин ПЛГ-4+ГЕНТ-БСА 15 20-100 0,99

ПАГ-2+ГЕНТ-БСА 6 10-140 0,98

ЛАГ-З+ГЕНТ-БСА 4 8-150 0,97

Апрамицин ПААП+АПР-БСА 15 30-130 0,98

Тобрамицин ПАТ+ТОБР-БСА 4 6-50 0,99

Тетрациклин ПАТР-1+ТЕТР-БСА 0,007 0,01-1,00 0,97

Хлортетраииюшн ПАХТР+ХТЕТР-БСА 6,4 10-70 0,98

Суммарное содержание тетрадиклипов ПАТР-2+ ТЕТР-БСА 0,2 0,7-60 0,97

Суммарное содержание ПАТА+АМИТ-БСА 35 40-100 0,97

трициклических антидепрессантов ПАТА+ИМИЛ-БСА 8 10-100 0,96

Таблица 4. Коэффициенты перекрестного реагирования для поликлональных гомолитичных антител к стрептомицину и групп-специфичных антител к тетрациклинам и трициклическим антидепрессантам __

Аналит | ПР, % Аналит | ПР, % Аналит | ПР, %

Антитела ПАС-1 Групп-специфичные антитела ПАТА Групп-специфичные антитела ПАТР-2

Стрептомицин 100 Амитриптилли н 100 Тетрациклин 100

Дигидрострептомицин 81 Имипрамин 93 Хлортетрациюин 95

Гентамицин 3 Бацитрацин 2 Окситетрациклин 87

Бацитрацин 6 Гентамицин 1 Ласалоцид 2

Ампициллин 3 Тетрациклин 1 Монецин 4

Тетрациклин 2 Ампициллин 3 Бацитрацин 2

Возможность селективного определения аминогликозидных и тетрациклииовых антибиотиков с помощью гомолитичных антител подтверждается высокими значениями коэффициентов перекрестного взаимодействия для определяемых соединений и низкими (0,01-10%) для структурных аналогов. Исключение составляют антитела к стрептомицину, которые проявляют высокую кросс-реактивность и к его дигидропроизводному (81 %). В случае применения групп-специфичных антител коэффициент ПР, % для определяемых аналитов варьируется в интервале 87 - 100%, при этом не превышает 5% для родственных препаратов.

Синтез и применение наночастиц золота для усиления аналитического сигнала пьезоквар цевого иммупосенсора. Синтез наночастиц золота осуществляли путем восстановлением ЗХВК с помощью ЦН, ГАС, ХО, ГЗС, ЛК, БН. Размер наночастиц оценивали методами спектрофотометрии по положению пика плазменного резонанса и атомной силовой микроскопии.

Для снижения дисперсности наночастиц золота синтез проводили при микроволновом нагреве и в обратных микроэмульсиях. При синтезе в условиях микроволнового воздействия обеспечивается равномерный нагрев внутри пробы и, следовательно, одинаковые скорости нукяеации и роста зародышей наночастиц в каждой точке объема. На размер наночастиц оказывают влияние соотношение концентраций восстановителя и ЗХВК, природа восстановителя, мощность микроволнового излучения (МВИ) и продолжительность иррадиации. Применение в качестве восстановителя боргидрида натрия приводит к большей интенсивности взаимодействия при получении наночастиц золота, о чем свидетельствует максимальные значения интенсивности пика плазмонного резонанса на спектре поглощения по сравнению с другими восстановителями. Уменьшение концентрации ЗХВК приводит к пропорциональному снижению размера наночастиц золота. Например, в системе ЗХВК/БН при изменении соотношения с 0,02/0,8 до 0,005/0,8 диаметр наночастиц снижается с 30 до 12 нм.

Для формирования наночастиц в микроэмульсиях в качестве неполярной среды применяли гексан, неионогенные (ТХ-100) и ионогенные ( ЦТА Б) поверхностно активные вещества. Показано, что диаметр наночастиц золота зависит от концентрации и природы ПАВ, обеспечивающего фиксированный размер микроэмульсий. Использование ОД М цетилтриметиламмониумбромида способствовало образованию частиц диаметром 4±2 нм (рис. 2), тогда как применение ТХ-100 такой же концентрации обеспечивало синтез наночастиц диаметром 6±2 нм. Степень дисперсности наночастиц снижается с увеличением их среднего размера, однако наиболее устойчивы коллоидные

Изучена возможность усиления аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора с помощью наночастиц золота при определении стрептомицина в конкурентном формате анализа. Для этого предварительно проводили связывание наночастиц золота с антителами. Эффективность взаимодействия антител с наночастинами различного размера оценивали методом пьезокварцевого микровзвешивания. Было установлено, что применение наночастиц золота диаметром 4 нм приводит к усилению аналитического сигнала, снижая предел обнаружения стрептомицина с 8 до 0,2 нг/мл и расширяя диапазон определяемых содержаний с 10-50 нг/мл до 0,8-120 нг/мл.

% 1

1.ш.

2 5 4 5 в й,ш

Рис. 2 Гистограмма распределения наночастиц золота, полученных восстановлением ЗХВК ЕН в

МИК80ЭМУЛЬСИЯХ

частицы диаметром 4-6 им.

Исследование условий определения антибиотиков и антидепрессантов

методом ПФИА

Известно, что аналитический сигнал в методе ПФИА зависит от концентрации трейсера и антитела, строения флуоресцентной метки, присоединяемой к молекуле определяемого соединения, степени очистки трейсера, а также значения констант трейсера {Кт), характеризующих сродство антител и меченного флуоресцентной меткой определяемого соединения, и аффинности {КАф). При разработке методик определения аминогликозидных антибиотиков и суммарного содержания трициклических антидепрессантов были установлены оптимальные концентрации трейсера и антител, обеспечивающих максимальный аналитический сигнал,

Экспериментальные исследования показали, что при использовании трейсера, меченного флуоресцеинизотиоционатом, для всех использованных пар иммунореагентов наблюдается более высокое значение тРиах по сравнению с трейсером, меченным 5-([4,6-дихлорогриазии-2-ил]амино)-флуоресцеином. Выбор концентрации трейсеров осуществляли с учетом величины максимума интенсивности флуоресценции при длине волны 492 нм. С помощью зависимости тР = Г V) с учетом значений шРпих и диапазона линейности, определены рабочие концентрации антител к гентамицину (ПАГ-1 - 0,20 мкг/мл), амикацину (ПААМ - 0,15 мкг/мл), канамицину (ПАК - 0,41 мкг/мл), стрептомицину (ПАС-1 - 0,82 мкг/мл), неомицину (ПАН-1 - 0,15 мкг/мл), трициклическим антидепрессантам (ПЛАТ-0,25 мкг/мл), соответствующие 50%-иому связыванию в иммунокомплекс. Использование концентраций антител за пределами линейных зависимостей приводит к искажению сигнала из-за неспецифического связывания трейсера с посторонними компонентами сыворотки.

Установлены гомогенные константы аффинности моноклональных антител; для поликлоналышх антител, поскольку они представляют собой смесь высоко- и низкоаффинных фракций, рассчитаны средневесовые значения Клф_ Сопоставление значений Кт и Клф показало, что во всех случаях константы аффинности превышают константы трейсера на 2 порядка, что указывает на большее сродство антител к определяемым соединениям, чем к соединениям, связанным флуоресцентной меткой и возможность вытеснения трейсера аналитом из комплекса с антителами.

Изучены условия определения антибиотиков методом ПФИА в одностадийном и двухстадийном конкурентном форматах. В случае одностадийного определения использовали предварительно синтезированные комплексы антител с трейсером, а в двухстадийном - растворы трейсера и антител смешивали непосредственно перед добавлением аналита.

Сопоставление метрологических характеристик определения гентамицина, каяамицина, стрептомицина в одностадийном и двухстадийном форматах показало, что в обоих случаях сохраняется постоянное значение предела обнаружения. В первом варианте наблюдается более широкий линейный диапазон градуировочной функции, повышается срок хранения реагентов с 7 до 50 дней, однако продолжительность анализа увеличивается с 7 до 20 мин.

Определение лекарственных веществ в пищевой продукции

Разработаны методики определения аминогликозидных и тетраци клиновых антибиотиков, три циклических антидепрессантов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Методики включали предварительное извлечение фармацевтических препаратов из пищевых продуктов с помощью фосфатного буферного раствора, дистиллированной воды и ацетонитрила. Методики апробированы при определении суммарного количества тетрациклинов (табл. 5) и трициклических антидепрессантов, селективного определения гентамицина, стрептомицина (табл. 6), дигидростреитомицииа, каиамицина, тобрамицина, амикацина, неомнцина, апрамицина, тетрациклина, хлортетрациклина, окситетрациклина в пищевых продуктах.

Таблица 5. Результаты определения суммарного содержания тетрацнклннов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров (Р=0,95, п=3)

Продукт Найдено, мкг/кг Яг

Креветки королевские 867 ±29 0,06

Креветки варено-мороженные 274 ±7 0,03

Горбуша 13,4± 0,1 0,02

Куриное мясо 76,1 ±3,4 0,04

Свинина 162 ± 16 0,06

Мед 0,87 ±0,04 0,02

Йогурт 0,17 ±0,03* 0,01

Молоко 23,3±0,2* 0,03

Сыр 0,44 ±0,06 0,04

* мкг/л

Результаты определения суммарного содержания тетрациклинов характеризуются высокой воспроизводимостью и правильностью. Установлено превышение МДУ тетрациклинов (400 мкг/кг) в креветках.

Сопоставлены результаты определения стрептомицина в курином мясе методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров (табл. 6).

Таблица 6. Определение стрептомицина в курином мясе с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом Т1ФИА (Р=0,95, п=3)

Объекты исследования Найдено

с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров методом ПФИА

мг/кт Яг мг/кг 8,

Грудки куриные, Канада 0,03±0,01 0,01 0,02±0,01 0,03

Грудки куриные, Россия (Москва) 0,02±0,01 0,02 0,02±0,01 0,02

Грудки Куриные, Россия (Липецк) 0,02±0,01 0,01 0,02±0,01 0,03

Установлено, что результаты, полученные двумя методами, равноточны. Однако с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров возможно определение более низких концентрации стрептомицина. Превышения МДУ стрептомицина в курином мясе (0,5мг/кг) не выявлено.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что наиболее плотные монослои, обеспечивающие иммобилизацию максимального количества белковых молекул, образуются при использовании ациклических тиолов, не содержащих дополнительных радикалов в спейсере, или смешанных монослоев на основе ациклических и гетероциклических тиолов, сформированных путем одновременного нанесения раствора 11-меркалто-1-ундеканола и 2-амино-5-меркапто-1,3,4 -триазола. Применение глутарового альдегида для кросс-сшивки хитозана обеспечивает создание пленок модификатора оптимальной массы и толщины, устойчивых при длительной эксплуатации в жидкости.

2. Обоснованы способы получение наночастиц золота с узким распределением по размерам путем восстановления ЗХВК в условиях микроволнового нагрева или в обратных микроэмульсиях. Показано, что при изменении концентрации восстановителя и ЗХВК, мощности микроволнового излучения (МВИ) и продолжительности иррадиации возможно получение устойчивых коллоидных частиц золота диаметром 12-100 нм. Установлено, что в обратных микроэмульсиях на основе гексаиа и ТХ-100, ЦТАБ диаметр наночастиц зависит от концентрации ПАВ, обеспечивающего фиксированный размер микроэмульсий. Наиболее устойчивы коллоидные частицы диаметром 4-6 нм использованы для усиления сигнала пьезокварцевого сенсора, предназначенного для определения стрептомицина. Предел обнаружения антибиотика снижается с 8 до 0,2 нг/мл.

3. Оптимизированы условия определения индивидуальных антибиотиков и суммарного содержания тетрациклинов и трицикяических антидепрессантов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров. С использованием значений КАф и Кт, коэффициентов перекрестного реагирования обоснованы условия чувствительного и селективного определения фармацевтических препаратов.

4. Разработаны методики иммунохимического определения аминогликозидных (гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин, апрамицин) и тетрациклиновых (тетрациклин, хлортеграциклин, окситетрациклин) антибиотиков и суммарного количества тетрациклинов и трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом ПФИА. Показано, что при определении антибиотиков и антидепрессантов в продукции животного происхождения наиболее полное извлечение из мяса и рыбы достигается с помощью фосфатного буферного раствора (рН 7,2), из креветок и яиц -ацетонитрила. Разработанные методики, основанные на применении пьезокварцевых иммуносенсоров и метода ПФИА, позволяют проводить

определение антибиотиков в пищевой продукции на уровне 0,01 - 200 нг/мл и 0,15-4,50 мкг/мл соответственно.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Дергунова Е.С. Проточно-инжекционное определение 4-аминофенола в фармацевтических препаратах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров / Е.С. Дергунова, О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева Н Хим,-фарм. журн. 2008. -Т. 42. - №4. - С. 46-49.

2. Воронежцева О.В. Определение аминогликозидных антибиотиков в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноаиализа / О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Вестник ВГУ: серия химия, биология, фармация. 2009. - №2. - С.11-18.

3. Воронежцева О.В. Иммунохимические реакции, протекающие на поверхности пьезокварцевого сенсора при определении стрептомицина в пищевых продуктах / О.В. Воронежцева, Ю.В. Нартова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. - Т. 9. - № 5. - С. 694-702.

4. Воронежцева О.В. Определение аминогликозидных антибиотиков с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров в пищевых продуктах / О.В. Воронежцева, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы, 2011. - Т.1. - №1. - С.68-76.

5. Мелихова Е.В. Применение пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения сульфаметоксазола и 4-аминофенола в лекарственных препаратах / Е.В. Мелихова, Е.С. Дергунова, О.В. Воронежцева, Т.Н. Ермолаева // Медицинские приборы и технологии. 2007. №1. С. 119-122.

6. Патент на изобретение RU №2419797, зарегистрирован в государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.06.2011 г. Способ определения стрептомицина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора / Т.Н. Ермолаева, О.В. Воронежцева.

7. Воронежцева О.В. Иммунохимические методы определения аминогликозидных антибиотиков в пищевых продуктах / О.В. Воронежцева, Ю.В. Нартова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Всерос. коиф. «Аналитика России»: тез. докл. - Краснодар, 2009. - С.129.

8. Воронежцева О.В. Разработка методик определения аминогликозидных антибиотиков в мясе / О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Всерос. конф. «Экотоксикология-2009»: тез. докл. - Пущиио: ИБФМ РАН, 2009. - С.23-25.

9. Воронежцева О.В. Молекулярное распознавание аминогликозидных антибиотиков в пищевых продуктах _ перспективы применения метода поляризационного флуоресцентного иммуноаиализа и пьезокварцевых иммуносенсоров / О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Всерос. конф. «Аналитическая химия - новые методы и возможности. Съезд аналитиков-2010»: тез. докл. - Клязьма, 2010. - С.71.

10. Воронежцева О.В. Экстракционное извлечение и иммунохимическое определение аминогликозидных антибиотиков в мясе / О.В. Воронежцева,

С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // IV Международ, конф. «Экстракция органических соединений»: тез. докл. - Воронеж, 2010. - С.73.

11. Воронежцева О.В. Определение стрептомицина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного наночастицами золота / О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Всерос. конф. «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процесса», Белгород, 2010, С.45-49.

12. Воронежцева О.В. Новые иммунохимические методы определения аминогликозидов и тетрациклинов в пищевой продукции / О.В. Воронежцева, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Всерос. конф. «Экотоксикология-2010»: тез. докл. -Тула, 2010. - С.35.

13. Терещенкова A.A. Пьезокварцевый иммуносенсор на основе самоорганизующихся монослоев тиолов для определения тетрациклинов в пищевых продуктах / A.A. Терещенкова, О.В. Воронежцева, Т.Н. Ермолаева // Международ, конф. «Ломоносов-2011»: тез. докл. - Москва, 2011. - С. 10.

14. Воронежцева О.В. Пьезокварцевый иммуносенсор для определения тетрациклинов в пищевых продуктах / О.В. Воронежцева, A.A. Терещенкова, Т.Н. Ермолаева // XXI Рос. молод, науч. конф. «Проблемы теоретической и экспериментальной химии»: тез. докл. -Екатеринбург, 2011. - С.202-203.

15. Воронежцева О.В. Экстракционное выделение и определение тетрациклинов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора / О.В. Воронежцева, Т.Н. Ермолаева // III Всерос. сипм. «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии»: тез.докл. -

Краснодар, 2011. - С.232.

16. Воронежцева О.В. Применение методов пьезокварцевого микровзвешивания и атомно-силовой микроскопии для изучения формирования самоорганизующихся монослоев тиолов на поверхности золотого электрода / О.В. Воронежцева, Т.Н. Ермолаева // XIII Международ, конф. «Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов (ИОНИТЫ-2011): тез. докл. - Воронеж, 2011. - С. 252-254.

Работы № 1-4 опубликованы в изданиях, входящих в список ВАК.

Автор выражает искреннюю благодарность за предоставленные реагенты зав. кафедрой органической химии ВГУ, д.х.н.. проф. Шихалиеву Х.С.; R. Abuknesha, King's College

University of London. л;

Работа выполнялась при финансовой поддержке гранта РФФИ Ns 09-0S-97.56Ö-р центп а Ведомственной программы Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» <рег. номер: 2.1.1/N142, 2011 г), Фонда содействия развитию .малых форм предприятий «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») (№р/13991, 2011 г).

Подписано в печать 22.11.2011 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Ризография. Объем 1 п. л. Тираж 120 экз. Заказ № 722 Полиграфическое подразделение Издательства Липецкого государственного технического университета . 398600 Липецк, ул. Московская, 30.

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ СТРУКТУРА РАБОТЫ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика лекарственных веществ

1.2. Методы определения фармацевтических препаратов

1.2.1. Иммуноферментный метод анализа

1.2.2. Иммунохроматографические методы 21 1.2.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

1.3. Применение иммуносенсоров для определения 25 антибиотиков

1.3.1. Сенсоры на основе поверхностного плазмонного 25 резонанса

1.3.2. Амперометрические иммуносенсоры

1.3.3. Другие иммуносенсоры

1.3.3.1. Импедиметрический иммуносенсор

1.3.3.2. Пьезокварцевые иммуносенсоры

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 35 II. 1. Характеристика объектов исследования, химических 35 реагентов и иммунореагентов

II. 2. Синтез иммунореагентов

II. 3. Иммобилизация иммунореагентов на поверхности 39 электрода пьезокварцевого сенсора

II. 4. Измерение аналитического сигнала пьезокварцевого 41 иммуносенсора

II. 5. Проведение анализа методом ПФИА 42 II. 6. Определение констант скорости и константы аффинности 43 гетерогенной и гомогенной иммунохимической реакции

II.7. Синтез наночастиц золота

II. 8. Подготовка проб пищевых продуктов к анализу

III. РАЗРАБОТКА ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ 49 ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ III. 1. Формирование рецепторного слоя и его характеристики 50 III. 2. Изучение закономерностей гетерогенной иммунохимической реакции

III. 3. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту протекания иммунохимических реакций

III. 4. Оценка специфичности иммунореагентов

III. 5. Исследование влияния условий регенерации рецепторного 74 слоя

III. 6. Изучение условий определения лекарственных препаратов 76 с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров

III. 7. Синтез наночастиц золота

IV. ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 93 АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА

IV. 1. Влияние структуры иммунореагентов на характеристики 93 ПФИА

IV. 2. Исследование закономерностей определения аминогликозидных антибиотиков методом ПФИА

V. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ 102 АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ И ТЕТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ. ТРИЦИКЛИЧЕСКИХ АНТИДЕПРЕССАНТОВ В ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ

VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВОЙ 107 ПРОДУКЦИИ

ВЫВОДЫ

Актуальность. Неконтролируемое использование лекарственных препаратов в ветеринарной практике для борьбы с инфекционными заболеваниями и повышения продуктивности животноводства и птицеводства приводит к их накоплению в продуктах питания и представляет потенциальную угрозу здоровью людей.

Снизить негативное влияние лекарственных препаратов возможно введя строгий контроль их остаточного содержания в продуктах питания. Для регулярного мониторинга остаточных количеств фармацевтических препаратов в животноводческой продукции и кормах в настоящее время используют микробиологические и хроматографические методы анализа. Микробиологические методы, основанные на способности антибиотиков к ингибированию микроорганизмов, используются для полуколичественного определения, продолжительны и не всегда специфичны, из-за мешающего влияния присутствующих в пищевых продуктах жиров, кислот, красителей и соединений с антибактериальной активностью. Хроматографические методы позволяют осуществлять идентификацию и одновременное определение нескольких фармацевтических препаратов, однако требуют достаточно сложной пробоподготовки, использования дорогостоящего оборудования и существенных временных затрат, что сдерживает их применение для рутинного анализа.

Таких недостатков лишены иммунохимические методы, позволяющие с высокой чувствительностью и селективностью определять остаточные количества лекарственных препаратов без предварительного выделения из анализируемой пробы. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя для селективного и чувствительного определении следовых концентраций сульфопрепаратов, пестицидов и других физиологически активных веществ. Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) характеризуется высокой экспрессностью и также ранее применялся для детектирования ряда лекарственных препаратов, пестицидов, микотоксинов в пищевых продуктах.

Однако для определения аминогликозидов и тетрациклинов, трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах пьезокварцевые иммуносенсоры и метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа ранее не применялись. Изучение новых возможностей определения остаточных концентраций лекарственных препаратов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в пищевых продуктах является актуальной аналитической задачей.

Цель исследования - изучение особенностей определения антибиотиков (аминогликозиды, тетрациклины) и трициклических антидепрессантов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью гравиметрических пьезокварцевых иммуносенсоров.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: обосновать условия формирования биорецепторного слоя, включающего образование подложки на основе самоорганизующихся монослоев тиолов или кросс-сшитого хитозана, активацию поверхности бифункциональным реагентом и иммобилизацию белковых конъюгатов антибиотиков и антидепрессантов; исследовать закономерности гомогенной и гетерогенной иммунохимической реакции в растворе и на поверхности сенсора, установить коэффициенты перекрестного реагирования гомолитичных антител к антибиотикам (гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин, апрамицин, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин) и групп-специфичных антител к тетрациклинам и трициклическим антидепрессантам; оптимизировать условия синтеза монодисперсностных наночастиц золота и оценить возможность их применения для амплификации сигнала пьезокварцевого иммуносенсора для определения аминогликозидных антибиотиков; разработать методики определения трициклических антидепрессантов, аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, включающие экстракционное извлечение лекарственных препаратов. Научная новизна: предложены новые подходы к формированию биорецепторного слоя на поверхности сенсора, включающие образование самоорганизующихся монослоев ациклических и гетероциклических тиолов, кросс-сшитого хитозана и ковалентную иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов с использованием различных бифункциональных реагентов; установлены условия образования смешанных слоев ациклических и гетероциклических тиолов, обеспечивающих высокую поверхностную плотность антигенных детерминант, хорошую адгезию к поверхности сенсора и устойчивость при эксплуатации в жидкости и при регенерации; показано, что обработка монослоя хитозана растворами бифункциональных реагентов способствует увеличению устойчивости биослоя за счет кросс-сшивки полисахарида; установлено, что проведение синтеза наночастиц золота в микроэмульсиях при конвекционном нагревании и в условиях микроволнового нагрева приводит к образованию монодисперсных фракций коллоидных частиц, на размер которых влияют соотношения концентраций используемых реагентов; изучены закономерности гомогенных и гетерогенных иммунохимических реакций между гомолитичными и групп-специфичными антителами и фармацевтическими препаратами, которые использованы для разработки методик определения антибиотиков и антидепрессантов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик определения аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Предложены способы получения самоорганизующихся монослоев на поверхности сенсора на основе ациклических и гетероциклических тиолов, смешанных монослоев, кросс-сшитого хитозана. Разработана методика синтеза наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты в микроэмульсиях и в условиях микроволнового нагрева, показано применение наночастиц золота для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора. Научная новизна способа определения стрептомицина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора подтверждена патентом РФ.

На защиту выносятся: закономерности создания подложек на основе самоорганизующихся монослоев ациклических и гетероциклических тиолов, смешанных монослоев, кросс-сшитого хитозана и иммобилизации белковых конъюгатов антибиотиков, антидепрессантов; условия получения монодисперсных фракций наночастиц золота при синтезе в микроэмульсиях и микроволновом нагреве и их применения для амплификации сигнала пьезокварцевого иммуносенсора; кинетические исследования гетерогенной и гомогенной иммунохимической реакции, значения констант аффинности и констант трейсера, коэффициенты перекрестного реагирования антител, использованные при разработке методик определения фармацевтических препаратов; методики определения индивидуальных соединений (аминогликозидные и тетрациклиновые антибиотики) и суммарного количества тетрациклинов и трициклических антидепрессантов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в пищевых продуктах.

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации доложены на Всероссийской конференции «Экотоксикология-2009, 2010» (Москва-Пущино, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2009, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010), Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010), Всероссийской конференции «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (Белгород, 2010), XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011), Молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); XIII Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов - ИОНИТЫ - 2011» (Воронеж, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 5 статьях (4 входят в список статей, рекомендованных ВАК) и 10 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 29 рисунков и 23 таблицы. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 211 ссылок на работы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что наиболее плотные монослои, обеспечивающие иммобилизацию максимального количества белковых молекул, образуются при использовании ациклических тиолов, не содержащих дополнительных радикалов в спейсере, или смеси ациклических и гетероциклических тиолов, наносимых дозированием раствора, содержащего 11-меркапто-1-ундеканол и 2-амино-5-меркапто-1,3,4 -триазол. Применение глутарового альдегида для кросс-сшивки хитозана обеспечивает создание пленок модификатора оптимальной массы и толщины, устойчивых при длительной эксплуатации в жидкости.

2. Обоснованы способы получение наночастиц золота с узким распределением по размерам путем восстановления ЗХВК в условиях микроволнового нагрева или в обратных микроэмульсиях. Показано, что при изменении концентрации восстановителя и ЗХВК, мощности микроволнового излучения (MBU) и продолжительности иррадиации возможно получение устойчивых коллоидных частиц золота диаметром 12-100 нм. Установлено, что в обратных микроэмульсиях на основе гексана и ТХ-100, ЦТАБ диаметр наночастиц зависит от концентрации ПАВ, обеспечивающего фиксированный размер микроэмульсий. Наиболее устойчивы коллоидные частицы диаметром 4-6 нм использованы для усиления сигнала пьезокварцевого сенсора, предназначенного для определения стрептомицина. Предел обнаружения антибиотика снижается с 8 до 0,2 нг/мл.

3. Оптимизированы условия определения индивидуальных антибиотиков и суммарного содержания тетрациклинов и трициклических антидепрессантов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров. С использованием значений Каф и Кт; коэффициентов перекрестного реагирования обоснованы условия чувствительного и селективного определения фармацевтических препаратов.

4. Разработаны методики иммунохимического определения аминогликозидных (гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин, апрамицин) и тетрациклиновых (тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин) антибиотиков и суммарного количества тетрациклинов и трициклических антидепрессантов в пищевых продуктах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и методом ПФИА. Показано, что при определении антибиотиков и антидепрессантов в продукции животного происхождения наиболее полное извлечение из мяса и рыбы достигается с помощью фосфатного буферного раствора (рН 7,2), из креветок и яиц -ацетонитрила. Разработанные методики, основанные на применении пьезокварцевых иммуносенсоров и метода ПФИА, позволяют проводить определение антибиотиков в пищевой продукции на уровне 0,01 - 200 нг/мл и 0,15-4,50 мкг/мл соответственно.

1. Heilig S., Lee P. Curtailing antibiotic use in agriculture // West J Med. 2002. -V. 176. — № 1. - P. 9-11.

2. McManus P. S., Stockwell V. O., Sundin G. W., Jones A. L. Antibiotic use in plant agriculture // Annual Review of Phytopathology. -2002.-V. 40.-P. 443-465.

3. Токманцева И. Лошадиная доза // Ж. Однако. 2010. -№ 15. - С. 31-35.

4. Rana S., Uralets V. P., Ross W. A new method for simultaneous determination of cyclic antidepressants and their metabolites in urine using enzymatic hydrolysis and fast GC-MS // J. Anal. Toxicol. 2008. -V. 32. -P. 355 - 363.

5. Florea N. F., Nightingale С. H. Review of the pharmacodynamics of antibiotic use in animal food production // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. -2004.-V. 32.-P. 355 -363.

6. Егоров H. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука. -2004.-528 с.

7. Navratilova P. Screening methods used for the detection of veterinary drug residues in raw cow milk a review // Czech J. Food Sci. - 2008. -V. 26.-P. 393-401.

8. Chopra I., Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. -V. 65. -P. 232-260.

9. Комаров А.А., Вылегжанина E.C., Нестеренко И.С., Беловодский JI.B., Жуков А.В. Определение остаточного содержания лекарственных препаратов в продукции животноводства //Ветеринария. -2011. №1. -С. 59-62.

10. Roberts М. Genetic mobility and distribution of tetracycline resistance determinants // FEMS Microbiol. Rev. 1996. -V. 19. -P. 1-24.

11. Munoz-Olivas R. Screening analysis: an overview of methods applied to environmental, clinical and food analyses // Trends Anal. Chem. 2004. -V. 2.-P. 203-216.

12. Ловягин A. H. Сведения о наиболее эффективных лекарственных препаратах. Современный фармацевтический справочник// Изд-во Феникс, Ростов-на-Дону.- 2009. -С. 1088.

13. Kaufman A., Maden К. Determination of 11 Aminoglycosides in Meat and liver by liquid chromatography with tandem mass spectrometry // J AOAC Int. 2005. - V. 88. - P. 1118-1125.

14. Гаврилов В.Б., Еремин С.А., Егоров А.М Сравнительный анализ иммунохимического определения гентамицина по поляризации и тушению флюоресценции // Антибиотики и химиотерапия. 1992. -Т.37. - №9.-С. 36-39.

15. Haasnoot W., Stouten P., Cazemier G., Lommen A., Nouws J. F. M., Keukens H. J Immunochemical detection of aminoglycosides in milk and kidney // Analyst. 1999. - V. 124. - P. 301-305.

16. Babin Y., Fortier S. A high-throughput analytical method for determination of aminoglycosides in veal tissues by liquid chromatography/tandem mass spectrometry with automated cleanup // J AOAC Int. 2007. -V. 90. -№ 5. -P. 1418-1426.

17. Mattlasson В., Svensson K., Borrebaek C., Jonsson S., Kronvall G. Non-equilibrium enzume immunoassay of gentamicin // Clin. Chem. -1978. -V. 24.-№ 110.-P. 1770-1773.

18. Jin Y., Jang J-W, Han C-H, Lee M-H Development of immunoassays for the detection of kanamycin in veterinary fields // Vet. Sci. 2006. - V. 7. -P. 111-117.

19. Manyanga V, Kreft K, Divjak B, Hoogmartens J, Adams E. Improved liquid chromatographic method with pulsed electrochemical detection for the analysis of gentamicin // J Chromatography A. 2008. - V.1189. -P. 347-354.

20. Gramse M. J., Jacobson P. E. Determination of penicillin G in feeds by liquid chromatography with solid-phase extraction // J. AOAC Int. -2005.-V.88.-P. 679-683.

21. Schubert-Ullrich P., Rudolf J., Ansari P., Galler В., Molinelli A. Commercialized rapid immunoanalytical tests for determination ofallergenic food proteins: an overview // Anal. Bioanal. Chem. 2009. - V. 395.-P. 69-81.

22. Whitehead H. R., Cox G. A. The detection of penicillin in milk // J. of Applied Microbiology. 2008. - V. 19. - P. 247-249.

23. O'Neill A. M., Gillespie S. H., Whiting G. C. Detection of Penicillin Susceptibility in Streptococcus pneumoniae by pbp2b PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis // J Clin. Microbiol. 1999. -V. 37.-P. 157-160.

24. Zbinden R., Ritzier M., Ritzier E., Berger-Bachi B. Detection of penicillin-binding protein 2a by rapid slide latex agglutination test in coagulase-negative staphylococci // J Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 412-413.

25. Chao H-P, Lee W-C A bioelectrode for penicillin detection based on gluten-membrane-entrapped microbial cells // Biotechnology and Applied Biochemistry.- 2000. -V. 32.-№l. -P. 9-14.

26. Bai G., Chu X., Pan G., Li X., Yong W. Determination of 9 cephalosporin drug residues in beef by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry// Se Pu. -2009.-V. 27.-P.417-420.

27. Sorouraddin M. H., Iranifam M., Imani-Nabiyyi A. Study of the enhancement of a new chemiluminescence reaction and its application todetermination of p-lactam antibiotics // Luminescence.-2009. -V. 24. -P. 102-107.

28. Omar M. A., Abdelmageed O. H., Attia T. Z. Kinetic spectrophotometric determination of certain cephalosporins in pharmaceutical formulations // Int J Anal. Chem. 2009.

29. Fabre H., Kok W. T. Determination of cephalosporins and decomposition products by liquid chromatography with indirect electrochemical detection // Anal. Chem. 1988. - V. 60. - P. 136-141.

30. Nabi S. A., Laiq E., Islam A. Selective separation and determination of cephalosporins by TLC on stannic oxide layers // Acta Chromatographica. -2004.-V. 14.-P. 92-101.

31. Okoye N. N., Nwokedi G. I. C., Ukwueze N. N., Okoye F. B. C. Spectrophotometric determination of some cephalosporin antibiotics using Prussian blue reaction // Scientific Research and Essay. 2007. - V. 2 .-№8.-P. 342-347.

32. Rodziewicz L., Zawadzka I. Rapid determination of chloramphenicol residues in honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry and the validation of method based on 2002/657/EC // APIACTA. -2007. -V. 42.-P. 25-30.

33. Eboka C. J., Smart J., Adelus S. A. An alternative colorimetric method for the determination of chloramphenicol // Tropical J Pharmac. Research. 2003. - V. 2. - №. -2. - P. 215-221.

34. Morrisa H. C., Millerb J., Campbella R. S., Hammondb P. M., Berryc D. J., Pricea C. P. A rapid, enzymatic method for the determination of chloramphenicol in serum // J. Antimicrob. Chemoter. V. - 22.- 3.-6. -P. 935-944.

35. Cavaliere C., Curini R., Corcia A., Nazzari M., Samperi R. A. J. A simple and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg// J Agric. Food Chem.-2003.-V. 51.-P. 558-566.

36. Catala I. M., Garcia M. J. V., Fernandez L. M., Martinez C. J. Enhanced flow-injection-chemiluminometric determination of sulphonamides by on-line photochemical reaction // Anal. chim. acta. -2003. V. 499. - № 1 - 2. - P. 57 - 69.

37. Baxter A. G., O'Connor M., Haughey S., Crooks S., Elliott T. C. Evalution of an immunobiosensor for the on site testing of veteri-nary drug residues at an abattoir. Screening for sulfamethazine in pigs // Analyst. -1999.-V. 124.-P. 1315-1318.

38. Bjurling P., Baxter A. G., Caselunghe M., Jonson C., O'Connor M., Persson B., Elliot T. C. Biosensor assay of sulfadiazine and sulfamethazine residues in pork//Analyst.-2000.-V. 125.-P. 1771 1774.

39. Beasley С. M. Jr, Sayler M. E., Potvin J. H. Fluoxetine versus amitriptyline in the treatment of major depression: a multicenter trial // Int Clin Psychopharmacol.-1993 V. 8.-P. 143-149.

40. Bignamini A, Rapisarda V. Performing your original search, a doubleblind multicentre study of paroxetine and amitriptyline in depressed outpatients // Int Clin Psychopharmacol.- 1992.-V. 4. -P. 37-41.

41. Geertsen G. Determination of residual tetracyclines in eggs by HPLC-UV // Danish Veterinary and Food Administration. 2004. - P. 28.

42. Pena A.L., Lino C.M., Silveira M.I. Determination of tetracycline antibiotics in salmon muscle by liquid chromatography using post-column derivatization with fluorescence detection // J AO AC Int. 2003. - V. 86. №5.-P. 925-929.

43. He X., Zhang Yu., Chen L. Determination of tetracyclines in food samples by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography //Talanta. 2009. - V. 79. - P. 926-934.

44. Яшин Я.И., Яшин E.A., Яшин А.Я. // Газовая хроматография. М.:ТрансЛит. 2009. - С. 528.

45. Мелентьев А.Б. Катаев С.С. Иванова Е.П. Определение амитриптилина и нортриптилина в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором // Судебно-медицинская экспертиза. 2007. - №1. - С. 31-34.

46. Garland W. A Quantitative determination of amitriptyline and its principal metabolite, nortriptyline, by GLC-chemical ionization mass spectrometry // J Pharmaceutical Sciences. 1977. - V. 66. - P. 77-81.

47. Pastor-Navarro N., Moráis S., Maquieira A., Puchades R. Synthesis of haptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues// Anal Bioanal Chem. -2004. -V.594.-P.211-218.

48. Abuknesha R. A., Luk C. Enzyme immunoassays for the analysis of streptomycin in milk, serum and water: development and assessment of a polyclonal antiserum and assay procedures using novel streptomycin derivatives// Analyst. -2005. -V.130.-P.964-970.

49. Brinkley M., A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Haptens, and Cross Linking Reagents// Bioconjugate Chem.- 1992.-V.3. -P. 2-13.

50. Aga, D.S., Goldfish, R., Kulshrestha, P. Application of ELISA in determining the fate of tetracyclines in land-applied livestock wastes.//Analyst.-2003.-V.128.-P.658-662.

51. Jin R.Y., Gui W.J., Guo Y.R., Wang C.M., Wu J.X., Zhu G.N. Comparison of monoclonal antibody-based ELISA for triazophos between the indirect and direct formats.// Food Agric. Immunol.- 2008. V.19. -P.49-60.

52. Watanabe H., Statake A., Kido Y., Tsuji A. Monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic rapidassay for dihydrostreptomycin in milk.//Analyt. Chim. Acta.- 2002.-V. 472.i1. P.45-53.

53. Westermann J., Hubl W., Kaiser N., Salewski L. Simple rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC.// Method Clin. Lab.-2002.V.-48(l-2).-P.61.

54. Huang B., Yin Y. Preparation of high-affinity rabbit monoclonal antibodies for ciprofloxacin and development of an indirect competitive ELISA for residues in milk// Biomed. And Biotechnol.- 2010.-V. 11(10).- P. 812-818.

55. Jornet D., Gonzalez-Martinez MA., Puchades R, Maquiera A. Antibiotic immunosensing determination of sulfathiazole in water and honey // Talanta.-2010.-V. 81.- P. 4-5.

56. Mahgoub O., Kadim I.T., Mothershaw A., Al S.A. Use of enzyme linked immunosorbent assay (elisa) for detection of antibiotic and anabolic residues in goat and sheep meat // World Journal of Agricultural Sciences.-2006.-V. 2.- P. 298-302.

57. Pastor-Navarro N, Moráis S, Maquieira A, Puchades R. Synthesis of gaptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues. Application to honey samples.// Anal. Chim. Acta.- 2007.-V. 594.-P. 211 -218.

58. Jeon M, Rhee Paeng I. Quantitative detection of tetracycline residues in honey by a simple sensitive immunoassay// Anal. Chim. Acta.-2008.-V. 626.-№2.-P. 180-185.

59. Pastor-Navarro N, Gallego-Iglesias E., Maquieira A., Puchades R Development of group-specific immunoassay for sulfonamides. Application to bee honey analysis. // Talanta.-2007.-V. 71.- P. 923 933.

60. Hubain P.P. Alprazolam and amitriptyline in the treatment of major depressive disorder a double-blind clinical and sleep EEG study.// J- Affect-Disord.-1990.-V. 18.-P. 67-73.

61. Chung-Wei Tsai, Chi-Hsin H., Wei-Hsien W. Determination of nitrofuran residues in tilapia tissue by enzyme-liked immunosorbent assay // J. Chin. Soc.-2009.- V. 56.-P. 1-8.

62. Mohammadi A. Aflotoxin contamination and antibiotic residue in milk in Khorasan province, Iran // Food and Chemical Toxicology.- 2010.-V. 48.- P. 2130-2132.

63. Chafer-Pericas C., Maguieira A., Puchades R. Multiresidue determination of antibiotics in feed and fish samples for food safety evaluation.// J. Food Control.-2011.- V. 22.- P. 993 999.

64. Lee H. J., Lee M. H., Han I. K. Application of ELISA for the detection of penicillin antibiotic residues in live animal.// J Anim. Sci.-2000.-V. 13.-P. 1604-1608.

65. Mark M., Bob B., Jim M. Detection of beta-lactam antibiotics in bulk tank milk // J Food Protection.-1995.-V.58.-P. 577-578.

66. Дыкман JI.А., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии // Успехи химии. 2007. - Т. 76. - № 2. - С. 199-213.

67. Hylan Т. R., Dossenbach М., Meneades L. Antidepressant use in the psychiatrist setting in Austria: a comparison of Citalopram, fluoxetine, and paroxetine.//Journal of Serotonin Research.-1998.-V.- 4.-P. 295—303.

68. Invernizzi G. The efficacy and safety of tianeptine in the treatment of depressive disorder: results of a controlled double-blind multicentre study vs. amtriptyline.// Neuropsychobiology.-1994.-V. 30 (2-3).-P. 85-93.

69. Keegan-D. A comparsion of fluoxetine and amitriptyline in the treatment of major depression.// Int- Clin- Psychopharmacol.-1991.-V. Summer 6(2).-P. 117-124.

70. K. Li, L. Liu, C-L. Xu, X-G. Chu. Rapid determination of chloramphenicol residues in aquaculture tissues by immunochromatographic// Assay Anal. Scien.-2007.-V.23.-P. 1281.

71. Murtazina N. R., Eremin S. A., Mozoleva О. V., Everest S. J., Brown A. J., Jackman R. Fluorescent polarization immunoassay for sulphadiazine using a high specificity antibody .//Intern. J. Food Sci. Tech.-2004.-V.39.-P.879-889.

72. Schwenzer K. S., Anhalt J. P. Automated fluorescence polarization immunoassay for monitoring streptomycin.//Antimicrobial Agents and Chemotherapy.-1983.-V.23.-P. 683-687.

73. Zhang S., Wang Z., Nesterenko I.S., Eremin S.A. Shen J. Monoclonal antibody-based fluorescence polarization immunoassay for Sulfamethoxypyridazine and Sulfachloropyridazine// Int. J. Food Sci. Tech. -2007. -V.42, -P.36-44

74. Eremin S.A., Murtazina N.R., Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Mart'ianov A.A., Yazynina E.V., Michura I.V., Formanovsky A.A., Dzantiev B.B. // Anal. Lett. -2005. -V. 38. № 6. -P. 951-969.

75. Wang Z., Zhang S., Shen J., Nesterenko I.S., Eremin S.A. Monoclonal Antibody-Based Fluorescence polarization immunoassay for sulfamethoxypyridazine and sulfachloropyridazine// J. of Agricultural and Food Chemistry. -2007.-V.55.№ 17.-P. 6871 6878.

76. White L. O., Macgowan A. P., Lovering A. M., Holt H. A., Reeves D. S., Ryder D. Assay of low trough serum gentamicin concentrations by fluorescence polarization immunoassay// J. Antimicrob. Agents Chemother. -1994.-V.33 .№3 .-P. 1068-1070.

77. Joos В., Luthy R., Blaser J. Long term accuracy of fluorescence polarization immunoassays for gentamicin, tobramycin, netilmicin and vancomycin // J.of Antimicrobial Chemotherapy. -1989.-V.24.-P. 797-803.

78. Eremin, S. A., Knopp, D., Niessner, R., Hong, J. Y., Park, S.-J. and Choi, M. J. Highthrouput determination of BTEX by one-step fluorescence polarization immunoassay//Environmental Chemistry. -2005.-V.2. -P. 227234.

79. Гасилова H. В., Еремин С. А. Определение хлорамфеникола в молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа// Журн. анал. химии 2010. - Т. 65, №3. -С. 261-265.

80. Lee J.R., Choi J., Choi M.J. Development of rapid homogeneous fluorescence polarization assay for estrogen receptor binding of endocrine disrupters//J. Kor. Soc. Environ. Anal. -2002. -V.5.№l.-P. 55-61.

81. Gaikwad, Gómez-Hens A., Pérez-Bendito D. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules// Anal. Chim. Acta. -1993.-V.280.-P.129.

82. Wong R. C. Regulatory issues in the development and marketing of lateral flow immunoassays// Lateral Flow Immunoassay. -2009.

83. Cooper M.A., Williams D.H., Cho Y.R. Surface plasmon resonance analysis of glycopeptide antibiotic activity at a model membrane surface// J. Chem. Soc. Chem. Commun.-1997.-V.17.-P. 1625-1626.

84. Gaudin V., Pavy M. L. Determination of sulfamethazine in milk by biosensor immunoassay// J AOAC Int. -1999.-V.82.-P. 1316-1320.

85. Akkoyun A., Kohen V.F., Bilitewski U. Detection of Sulphamethazine with an Optical Biosensor and Anti-idiotypic Antibodies// Sens. Actuators B. -2000.-V. 70.-P. 12-18.

86. Yuana J., Addoa J., Aguilarb M-Is., Wua Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol without surface regeneration//Analytical Biochemistry.-2009.-V. 390.-P. 97-99.

87. Gaudin V., Fontaine J., Maris P. Screening of penicillin residues in milk by a surface plasmon resonance based biosensor assay : comparison of chemical and enzymatic sample treatment//Analytica Chimica Acta. -2001.-V.436.-P. 191-198.

88. Guggisberg D., Widmer T., Koch H. Detection of clenbuterol in urine of meat stock by biosensor BIACORE Q// Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene.2001.-V. 92.-P. 260-276.

89. Gillis E. H., Traynor I., Gosling J. P., Kane M. Improvements to a surface plasmon resonance-based immunoassay for the progesterone // J. AOAC Int. -2006.-V.89.-P. 838-842.

90. Sternesjo A, Mellgren C, Bjorck L. Determination of sulfamethazine residues in milk by a surface plasmon resonance-based biosensor assay// Analytical Biochemistry.- 1995.-V.226.-P.175-181.

91. Traynor I.M., Crooks S.R.H., Bowers J., Elliott C.T. Detection of multi-P-agonist residues in liver matrix by use of a surface plasma resonance biosensor//Analytica Chimica Acta.- 2003.-V.483.-P. 187-191.

92. F. Fernandez, D. G. Pinacho, F. Sanchez-Baeza, M. P. Marco. Portable surface plasmon resonance immunosensor for the detection of fluoroquinolone antibiotic residues in milk//J. of Agricultural and Food Chemistry-201 l.-V. 59.№9.-P. 5036-5043.

93. Raz S. R., Bremer M. G., Haasnoot W., Norde W. Label-free and multiplex detection of antibiotic residues in milk using imaging surfaceplasmon resonance-based immunosensor// Anal. Chem. -2009.-V.81.№18.-P. 7743-7749.

94. Yuan J., Oliver R., Aguilar M.I., Wu Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol // Anal. Chem.- 2008.-V. 80.№21.-P.8329-8333.

95. Crooks S. R.H., McCarney В., Traynor I. M., Thompson C. S., Floyd S., Elliott С. T. Detection of levamisole residue in bovine liver and milk by immunobiosensor // Analytica Chimica Acta.- 2003.-V.483.-P. 181-186.

96. Медянцева Э.П., Халдеева Е.В.,.Будников Г.К. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы иперспективы//Журн. анал. Химии.-2001.-Т. 56.-С. 1015-1031.

97. Conneely G., Aherne М., Lu Н. Н., Guilbault G. G. Development of an immunosensor for the detection of testosterone in bovine urine.// Anal. Chim. Acta.-2007.-V. 583.-P. 153-160.

98. Liu X., Wong D. K.Y. Picogram-detection of estradiol at an electrochemical immunosensor with a gold nanoparticle Protein G-(LC-SPDP)-scaffold.//Talanta.-2009.-V. 77.-P. 1437-1443.

99. Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Шумянцева B.B., Булко Т.В., Егоров A.M. Сравнительная иммобилизация антител на поверхности модифицированных печатных графитовых электродов // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия.-2008.-Т.49.-С. 91-95.

100. Thavarungkul P., Dawan S., Kanatharana P., Asawatreratanakul P. Detecting penicillin G in milk with impedimetric label-free immunosensor. //Biosensors and Bioelectronics.-2007.-V. 23.-P. 688-694.

101. Vaughana R. D., Gearya E., Pravdaa M., Guilbaulta G. G. Piezoelectric immunosensors for environmental monitoring.// International Journal of Environmental Analytical Chemistry.-2003 .-V. 83 .-P. 555-571.

102. DiBenedetto S. A., Facchetti A., Ratner M. A., Marks T. J. Molecular self-assembled monolayers and multilayers for organic and unconventional inorganic thin-film transistor applications.//Adv. Mater.-2009.-V. 21.-P. 1407-1433.

103. Attili B. S., Suleiman A. A. A piezoelectric immunosensor for the detection of Cortisol.// Anal. Lett.-1995i-V. 28.-P. 2149-2159.

104. Калмыкова E.H., Мелихова E.B., Еремин С.А., Ермолаева Т.Н. Определение сульфаметоксазола с помощью пьеэокварцевого иммуно-сенсора.//Антибиот. Химиотерапия.-2004.-Т. 49.-С. 8-13.

105. Мелихова Е.В., Калмыкова Е.Н., Еремин С.А., Ермолаева Т.Н. Применение проточного пьеэокварцевого иммуносенсора для определения сульфаметоксазола в объектах окружающей среды.// Журн. анал. Химии.-2006.-Т. 61.-С. 687-693.

106. Ji X., Ren J., Ni R., Liu X. A stable and controllable Prussian blue layer electrodeposited on self-assembled monolayers for constructing highly sensitive glucose biosensor // Analyst. 2010. V. 135. P. 2092 2098

107. Nuzzo R.G., Aliara D.L. Adsorption of Afunctional organic disulfides on gold surfaces // J. Am. Chem. Soc. 1983. V. 105. P. 4481-4483

108. Moisés Simone S., Schaferling Michael. Toxin immunosensors and sensor arrays for food quality control // Bioanal, 2009, 29, 73-103

109. Grabar K.C., Freeman R.G., Hommer M.B. Natan M.J. Preparation and characterization of Au colloid monolayers // Anal. Chem. 1995. - V. 67.-P. 735-743.

110. Turkevich J. Colloidal gold. Part 1. Historical and preparative aspects, morphology and structure // Gold Bull. 1985. - V. 18. - P. 86-91.

111. Mannelli I. Quartz crystal microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection / I. Mannelli, M. Minunni, S. Tombelli, M. Mascini // Anal.Chem. 2003. - V. 18., № 2 - 3. P. 129 -140.

112. Stendroff C.J., Herschbach D.R. Kinetics of displacement and charge transfer reactions probed by SERS: Evidence for distinct donor and acceptor sites on colloidal gold surfaces // Langmuir. 1985. - V. 1. - P. 131-135.

113. Mariotti E. Surface plasmon resonance biosensor for genetically modified organisms detection / E. Mariotti, M. Minunni, M. Mascini // Anal. Chem. 2002. - V. 453., № 2. - P. 165 - 172.

114. Attili B.S. A Piezoelectric Immunosensor for the Detection of Cocaine / B. S. Attili, A. A. Suleiman // Microchem. J. 1996. - V. 54. - P. 174.

115. Shriver-Lake L.C. Antibody immobilization using heterobifunctional crosslinkers / L.C. Shriver-Lake, B. Donner, R. Edelstein, K. Breslin, S. K. Bhatiat & F. S. Ligner // Biosensors & Bioelectronics. 1997. - V. 12, № 11.-P. 1101-1106.

116. Park J-W. Comparison of stabilizing effect of stabilizers for immobilized antibodies on QCM immunosensors / J-W. Park, S. Kurosowa, H. Aizawa, S-i. Wakida, S. Yamada, K. Ishihara // Sensors and Actuators B. -2003. -V. 91.-P. 158-162.

117. Smith A. Nature of immobilized antibody linked to thioctic acid treated gold surfaces / A. Smith, M. W. Ducey, M. E. Meyerhoff // Biosensors & Bioelectronics. 2000. - V. 15. - P. 183 - 192.

118. Ulbrich, R., Golbik R., Schellenberger A. Different mechanisms of protein immobilization on glutaraldehyde activated supports: Effect of support activation and immobilization condition // Biotechnol. Bioeng. 1991. V. 37. P. 280.

119. Jal P.K., Patel S., Mishra B.K. Chemical modification of silica surface by immobilization of functional groups for extractive concentration of metal ions // Talanta. 2004. V. 62. P. 1005-1028.

120. Нартова Ю.В., Еремин C.A., Ермолаева Т.Н. Малочувствительные иммуносенсоры для определения хлорацетанилидных гербицидов // Журн. аналит. химии. 2008. - Т. 63. -№12. С. 1302-1310.

121. Подлегаева JI.H., Колесников JI.B. Исследование условий получения ультрадисперсных частиц серебра и золота при химическом осаждении. // Вестник КемГУ, Серия: Физика. Кемерово. - 2008. - № З.-С. 96-98.

122. Cognet L., Tardin С., Boyer D., Choquet D., Tamarat P. Single metallic nanoparticle imaging for protein detection in cells. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA.-2003.-V. 100.-№20.-P. 11350-11355.

123. Huang X., EI Sayed I.H., Qian W. El-Sayed M.A. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. //J. Am. Chem. Soc. -2006. - V. 128. -№ 6. - P. 2115-2120.

124. Li J., Wang C., Chen B., Dai Y., Zhang R., Song M. et al The enhancement effect of gold nanoparticles in drug delivery and as biomarkers of drug-resistant cancer cells. // ChemMedChem. 2007. - V. 2. - № 3. - P. 374-378.

125. Young-Pil K., Eunkeu O., Hyun Kyong S., Dae Won M., Tae Geol L., Hak-Sung K. Gold nanoparticle-enhanced secondary ion mass spectrometry and its bio-applications. // Applied Surface Science. 2008. - V. 255. - № 4.-P. 1064-1067.

126. Dong Xi, Xiaoping Luo, Qin Ning, Qianghua Lu, Kailun Yao, Zuli Liu. The detection of HBV DNA with gold nanoparticle gene probes. // Journal of Nanjing Medical University. 2007. - V. 21. - № 4. - P. 207212.

127. Banerjee I. A., Regan M. R. Preparation of gold nanoparticle templated germania nanoshells. // Materials Letters. 2006. - V. 60, - № 7. -P. 915-918.

128. Mingzhou Yu, Jianzhong Lin, Tatleung Chan. Numerical simulation of nanoparticle synthesis in diffusion flame reactor. // Powder Technology. -2008.-V. 181.- № 1.-P. 9-20.

129. Huan Ma, Lenore L. Dai. Synthesis of polystyrene-silica composite particles via one-step nanoparticle-stabilized emulsion polymerization. // J. Colloid and Interface Science. 2009. - V. 333. - №.2. - P. 807-811.

130. Soumen Basu, Sujit Kumar Ghosh, Subrata Kundu, Sudipa Panigrahi, Snigdhamayee Praharaj, Surojit Pande, Subhra Jana, Tarasankar Pal.

131. Biomolecule induced nanoparticle aggregation: Effect of particle size on interparticle coupling //Journal of Colloid and Interface Science. 2007. -V. 313. -№ 2. - P. 724-734.

132. Bachong W., Lucocq J.M., Roth J. Thiocyanate gold: Small (2-3 nm) colloidal gold for affinity cytochemical labeling in electron microscopy // Histochemistry. 1985. - V. 83. - P.409-411.

133. Birrel G.B. Hedberg K.K. Immunogold labeling with small gold particlies : Silver enhancement provides increased detectsbiluty at low magnifications // J. Electron. Microsc. Technol. 1987. - V. 5. - P. 219220.

134. Бусев А.И., Иванов B.M. Аналитическая химия золота. -М.: Наука. 1973. -263 с.

135. Hamamoto К., Kawakita Н., Ohtoa K.and Inoue К. Polymerization of phenol derivatives by the reduction of gold ions to gold metal // Reactive and Functional Polymers. 2009. - V. 69. - №. 9. - P. 694-697.

136. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. 1973. - V. 241. - P. 20-22.

137. Creighton J. A., Eadon D. G. Ultraviolet-visible absorption spectra of the colloidal metallic elements // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1991. - V. 87.-№24.-P. 3881.

138. Henglein A. Radiolytic Preparation of Ultrafine Colloidal Gold Particles in Aqueous Solution: Optical Spectrum, Controlled Growth, and Some Chemical Reactions // Langmuir. 1999. - V. 15. - P. 6738-6744.

139. Tarozaite R., Juskenas R., Kurtnaitiene M., Jagminiene A., Vaskelis A. Gold colloids obtained by Au(III) reduction with Sn(II): preparation and characterization // Chemiya. 2006. - V. 17. - № 2-3. - P.l-6.

140. Wagner J., Tshikhudo T.R., Kôhler J.M. Microfluidic generation of metal nanoparticles by borohydride reduction //Chemical Engineering Journal.-2008.-V. 135.-P. 104-109

141. Yee С. K., Jordan R., Ulman A., White H., King A., Rafailovich M., Sokolov J. Novel One-Phase Synthesis of Thiol-Functionalized Gold, Palladium, and Iridium Nanoparticles Using Superhydride // Langmuir. -1999.-V. 15.-№ 10.-P. 3486-3491.

142. Newman J. D. S., Blanchard G. J. Formation of Gold Nanoparticles Using Amine Reducing Agents // Langmuir. 2006. - V. 22. - № 13. - P. 5882-5887.

143. Шашканова О.Ю., Ермолаева Т.Н. Применение золотых наночастиц для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора // Заводская лаборатория. 2010. - №3. - С. 37-40.

144. Brust M., Kiely С. Some recent advances in nanostructure preparation from gold and silver particles: a short topical review // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2002. - V. 202. - №. 2-3. -P. 175 -186.

145. Ваневец А. С., Третьяков Ю. Д. Микроволновой синтез индивидуальных и многокомпонентных оксидов // Успехи химии. -2007. Т.76. - №5. - С. 435- 451.

146. Бердоносов С.С. Микроволновая химия // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7. - №1. - С. 32-38.

147. Kingston Н. М., Haswell S. J. Microwave Enhanced Chemistry: Fundamentals, Sample Preparation and Applications. American Chemical Society. Washington. - 1997. - P. 772.

148. Salzmann C. Anisotropic copper nanocrystals synthesized in supersaturated medium: nanocrystal growth // Langmuir. 2004. - V. 20. -P.11772-11777.

149. Maue M. M. Heating-induced evolution of thiolate-encapsulated gold nanoparticles: a strategy for size and shape manipulation // Langmuir. -2000.-V. 16.-P. 490-497.

150. Егорова E.M., Ревина A.A., Ростовщикова Т.Н., Кисилёва О.И. Бактерицидные и каталитические свойства стабильных металлических наночастиц в обратных мицеллах. // Вестник Московского университета. Серия 2, Химия, 2001. Т. 42. - №5. - С. 332-338.

151. Разумов В.Ф., Барышников Б.В., Разумова М.Б. Синтез нанокристаллов галогенидов серебра в обратных мицеллах АОТ // Журнал научной и прикладной фотографии. -1996. -Т. 41. -№ 2. С. 3343.

152. Tovstun S.A., Razumov V.F. On the fluctuations of the composition of the reverse micelles // Journal of Colloid and Interface Science. 2010. -Y.351. - № 2. - P. 485-492.

153. Спирин М.Г., Бричкин С. Б., Разумов В.Ф. Использование обратных мицелл для получения наночастиц золота ультрамалого размера // Российские нанотехнологии. 2006. - Т.1. - №1,2. - С.121-126.

154. Bongrand P. Ligand-receptor interactions. // Rep.Prog. Phys. 1999. -V. 62.-P. 921-968.