Сорбционное концентрирование и последующее определение аминогликозидных антибиотиков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

:/ - /'./ / /

АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТИТОВА ОЛЬГА ЛЬВОВНА

СОРБЦИОННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ

И ПОСЛЕДУЮЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук, профессор Н. М. Алыков

Астрахань -1998

СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ........................................................-.................2

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ............5

I. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ..............................9

1.1 Общие сведения об антибиотиках.............................................................9

1.1.1. Аминогликозидные антибиотики...............................................Ю

1.1.1.1. Канамицины............................................................................12

1.1.1.2. Гентамицины..........................................................................14

1.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ

АНТИБИОТИКОВ...............................................................................................17

II. ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ С ОРГАНИЧЕСКИМИ РЕАГЕНТАМИ И ИОНАМИ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ......................................27

2.1. Условия образования комплексов и соотношение

компонентов......................................................................................................30

2.1.1. Влияние солевого фона на комплексообразование.................33

Соотношение компонентов в соединениях........................................34

2.2. Кинетика реакций комплексообразования............................................34

III. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ НА СОРБЕНТАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ.....................................................................................39

3.1 Исследованные сорбенты........................................................................39

3.2 Общая характеристика природных сорбентов, получаемых из

опок Астраханской области (сорбенты СВ).................................................42

3.2.1. Изучение удельной поверхности сорбентов группы СВ..................................................................................................................44

3.3 Изучение сорбции аминогликозидов......................................................45

3.3.1 Влияние рН на сорбцию..................................................................46

3.3.2 Десорбция антибиотиков..............................................................49

3.4 Изучение возможности комплексообразования КФТ: РЗЭ : АБ

на сорбентах......................................................................................................49

3.5 Изучение кинетики комплексообразования на сорбентах.................. 57

IV. МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ.........................68

4.1. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА СОРБЕНТЕ ЮЕЭЕиЗЕ!. 60Н..................................................................................................69

4.1.1.Аппаратура, материалы и реактивы.........................................69

4.1.2. Подготовка к определению..........................................................69

4.1.3. Проведение определения...............................................................70

4.1.4. Обработка результатов..............................................................71

4.2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА СОРБЕНТЕ

БЮг.пНгО............................................................................................................72

4.2.1.Аппаратура, материалы и реактивы.........................................72

4.2.2. Подготовка к определению..........................................................72

4.2.3. Проведение определения...............................................................73

4.3. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА СОРБЕНТЕ СВ-1............75

4.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы........................................75

4.3.2. Подготовка к определению..........................................................76

4.3.3. Проведение определения...............................................................77

4.3.4. Обработка результатов..............................................................77

ВЫВОДЫ................................................................................80

ЛИТЕРАТУРА..........................................................................84

ПРИЛОЖЕНИЕ 1.....................................................................91

ПРИЛОЖЕНИЕ 2.....................................................................93

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем современной аналитической химии является разработка методов идентификации физиологически активных веществ, к числу которых относятся, в частности, антибиотики. Все нарастающий объем производства и использования антибиотиков, частая бесконтрольность их применения ведут к возникновению аллергических реакций, появлению новых форм микроорганизмов, устойчивых к действию некоторых антибиотиков. Это создает необходимость разработки и внедрения методов химического контроля содержания остаточных количеств антибиотических веществ в различных объектах и степени очистки выпускаемых в объекты окружающей среды отходов их производства. Существующие в настоящее время методы определения антибиотиков (хроматографические, электрохимические, фотометрические,

люминесцентные, биологические и др.) в большинстве случаев имеют нижние границы определяемых содержаний на уровне 0.05-10 мкг/мл, что не может удовлетворить потребности практики. Те же методы, которые имеют высокую чувствительность, требуют наличия дорогостоящей аппаратуры или весьма длительны по времени и трудоемки.

В условиях непрекращающегося экономического кризиса применение дорогостоящих методов определения становится нереальным, поэтому все большее значение приобретают экспрессные методы анализа, не требующие особого аппаратурного обеспечения. Фотометрические методы являются наиболее доступными и удобными. Фотоэлектроколориметрами и спектрофотометрами оснащены практически все научно-исследовательские, клинические и заводские лаборатории. Для развития фотометрических методов необходимо систематическое изучение реакций образования окрашенных

соединений с участием антибиотиков и различных реагентов. Для создания высокочувствительных методов необходимо детальное изучение процессов концентрирования с целью выбора наиболее подходящих концентрирующих систем. Поэтому актуальным остается поиск новых сорбентов для количественного извлечения антибиотиков из жидких сред. Не менее важен поиск новых подходов к определению антибиотиков после их сорбционного выделения непосредственно в фазе сорбента.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физической химии Астраханского государственного педагогического университета и РАН по направлению "Органический анализ", в рамках Комплексной программы "Экологическая безопасность России".

Цель работы. Исследование закономерностей сорбционного концентрирования аминогликозидных антибиотиков и разработка методов сорбционно-фотометрического тест-определения аминогликозидов. Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

ш изучение кислотно-основных свойств аминогликозидных антибиотиков и некоторых органических реагентов, их комплексообразования с ионами РЗЭ;

■ изучение сорбции аминогликозидов в зависимости от условий извлечения и природы сорбента;

■ определение возможности и оптимизация условий комплексообразования аминогликозидных антибиотиков с органическими реагентами и ионами РЗЭ в фазе сорбента; расчет основных термодинамических и кинетических характеристик изучаемых процессов.

Научная новизна. Впервые рассмотрены проблемы комплексообразования органических красителей с ионами редкоземельных элементов и аминогликозидными антибиотиками непосредственно на сорбентах.

Представлен механизм сорбции аминогликозидов на поверхности силикагелей.

Практическое значение и реализация результатов. Разработаны фотометрические методы определения аминогликозидных антибиотиков, основанные на сорбционном концентрировании на таких сорбентах, как К1еэе1де1-60Н, сорбент СВ-1 (продукт нехимической переработки опок Астраханской области) и оксид кремния 8Ю2пН20 с пределами обнаружения 1-10 нг/мл. Методики апробированы при анализе модельных водных растворов. Определена возможность использования сорбентов амберлит С1-50-П, К1езе1де1-60Н, БС-1, СВ- 1, ЗЮ2пН20 для очистки жидких сред от аминогликозидных антибиотиков.

На защиту выносятся:

1. Результаты изучения реакций комплексообразования аминогликозидных антибиотиков с органическими реагентами и ионами РЗЭ.

2. Результаты изучения сорбционного концентрирования аминогликозидных антибиотиков.

3. Закономерности комплексообразования аминогликозидных антибиотиков с ксиленоловым оранжевым и РЗЭ на различных сорбентах.

4. Методики сорбционно-фотометрического определения аминогликозидных антибиотиков в различных биологических объектах.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 20 различных конференциях, съездах и конгрессах, среди которых: Всесоюзная конференция

по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991); II Международная конференция по экстракции, (Воронеж, 1992); Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды (Экоаналитика-94, Краснодар, 1994); Международный экологический конгресс (Воронеж, 1996); Российская конференция по экологическим проблемам Волги и Прикаспия (Астрахань, 1996; Астрахань, 1998); Международный конгресс по аналитической химии (Москва, 1997). В целом работа доложена на семинаре кафедры физической химии Астраханского государственного педагогического университета (Астрахань, 1998 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 7 тезисов докладов региональных и международных конференций и конгрессов.

Структура работы. Диссертация изложена на 95 страницах, состоит из введения, четырех глав, выводов и 2 приложений, включает 22 рисунка, 12 таблиц и список цитируемой литературы, содержащий 108 ссылок.

I. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ

1.1 Общие сведения об антибиотиках

Под термином «антибиотики» в настоящее время понимаются специфические продукты жизнедеятельности или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, актиномицетам, грибам, водорослям, протозоа) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживающие их рост или полностью подавляющие развитие [1].

Характерными особенностями антибиотиков являются, во-первых, высокая биологическая активность по отношению к чувствительным к ним организмам; во-вторых, избирательность их действия.

Из известных на сегодняшний день почти трех тысяч антибиотических веществ [2], применение нашли около 100, но несмотря на большие затраты, требующиеся на их исследования, интерес к ним продолжает расти.

По мнению Н.С.Егорова [3], автора одного из наиболее известных в нашей стране учебников по антибиотикам, причины столь пристального внимания к проблеме антибиотиков, их открытия, исследования, производства и применения заключаются в следующем:

- антибиотики являются незаменимыми лечебными препаратами;

- антибиотики используются в сельском хозяйстве как лечебные препараты и стимуляторы роста животных;

- в связи с появлением резистентных к используемым антибиотикам штаммов микроорганизмов необходимо создание новых антибиотиков;

- антибиотики используются как консерванты;

антибиотики являются объектом исследования биохимиков, физиологов, химиков-органиков и микробиологов как участники метаболизма.

Широкое применение антибиотиков, увеличивающиеся масштабы их производства ставят вопросы о необходимости корреляции уровней положительного и отрицательного воздействия антибиотических веществ на живые организмы и окружающую среду. С точки зрения аналитической химии решение этих вопросов невозможно без определения наличия антибиотиков и их количества в различных объектах. Причем вследствие высокой биологической активности антибиотиков чем меньшие их количества можно будет определить, тем более точные выводы будут затем сделаны. В настоящее время в практике требуются легкодоступные экспресс-методы с высокой чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками.

Целью данной работы явилось теоретическое и экспериментальное изучение процессов концентрирования для создания экспресс-способа определения содержания антибиотиков в различных объектах, основанного на сорбции антибиотика, образовании трехкомпонентного соединения на сорбенте и последующем разложении этого соединения.

Выбранные в качестве объекта исследования антибиотики являются одними из наиболее широко используемых в настоящее время [1,2]. По химической классификации они относятся к группе аминогликозидов.

1.1.1. Аминогликозидные антибиотики

Общее название «аминогликозиды» принято для этой группы веществ в связи с тем, что в их молекуле обязательно содержатся аминосахара, соединенные гликозидной связью с агликоновым фрагментом молекулы, являющимся, как правило, производным цикпогексана [5].

Выделяют два поколения аминогликозидов [1,4]. К антибиотикам первого поколения относят стрептомицин, канамицин, мономицин; к антибиотикам второго поколения - гентамицин (гарамицин), тобрамицин (бруламицин, обрацин), сизомицин, амикацин, нетилмицин.

Часть антибиотиков этой группы образуется в природе лучистыми грибами Айупотусев (неомицин, канамицин, тобрамицин); продуцентами другой части антибиотиков являются Мютатопоэрога (гентамицин). В последнее время получены полусинтетические производные этой группы (например, амикацин, являющийся производным канамицина А).

Аминогликозидные антибиотики бактерицидны, обладают широким спектром действия, угнетают грамположительные и, особенно, грамотрицательные микроорганизмы. Некоторые аминогликозиды второго поколения способны подавлять синегнойную палочку. Основное практическое значение имеет способность этих препаратов угнетать активность патогенных кишечных палочек, клебсиелл, гонококков, сальмонелл, шигелл, стафилококков. Помимо этого, стрептомицин и канамицин используют в качестве противотуберкулезных препаратов, мономицин - для воздействия на дизентерийную амебу, лейшмании, трихомонады [7,8].

Механизм действия аминогликозидных антибиотиков заключается в ингибировании синтеза РНК на уровне рибосом [6]. Кроме того, они нарушают, но довольно слабо, функции цитоплазматической мембраны. Молекулярно-биологическими исследованиями установлено, что аминогликозиды реагируют с ЗОэ субъединицей бактериальных хромосом [5]. Однако на этом однозначность трактования имеющихся фактов заканчивается. Механизм действия аминогликозидных антибиотиков на рибосомном уровне остается пока неясным.

Все аминогликозидные антибиотики плохо всасываются из желудочно-кишечного тракта и из просвета бронхов. Хорошо проходят через плаценту, выводятся с молоком. Препараты не подвергаются биотрансформации и выводятся почками в активной форме. Введенные парентерально, они токсичны и могут вызвать ототоксический, нефротоксический эффекты, нарушить нервно-мышечную передачу импульсов и процессы активного всасывания в желудочно-кишечном тракте. Ототоксический эффект антибиотиков является следствием необратимых дегенеративных изменений волосковых клеток кортиева органа (внутреннее ухо) [9]. Нефротоксический эффект связан с нарушением функции многих ферментов в эпителиальных клетках канальцев почек, разрушением лизосом. И, наконец, накапливаясь в стенке кишечника, аминогликозиды нарушают в ней процесс всасывания аминокислот, витаминов и Сахаров [10].

Известно около 50 аминогликозидных антибиотиков, химическая характеристика которых представлена не в одинаковой степени. Уже многие годы изучаются «семейства» стрептомицина, неомицинов, канамицинов. Ниже кратко рассмотрены некоторые данные, относящиеся к химии наиболее употребимых в настоящее время групп аминогликозидов.

1.1.1.1. Канамицины

Выделен в 1957 г. Суммарная формула C18H36O11N4.

В культуральной жидкости продуцента (Str. Kariamyceticus) присутствуют одновременно три вещества: канамицины А, В и С, которые, несмотря на близость химического состава и строения, различаются по биологическим свойствам [11-13]. В лечебных препаратах канамицина содержится около 98% канамицина А.

Канамицины состоят из трех циклических компонентов:

rch2

он

Канамицин А: R = NH2 R' = ОН

Канамицин В : R = NH2 R' = NH2

Канамицин С: R = ОН R' = NH2

Рис. 1.1 Структурная формула канамицина

Канамицин А относится к группе олигосахаридов, является оптически активным основанием, образует соли с органическими и неорганическими кислотами.

Канамицин В, подобно канамицину А, является оптически активным основанием. Растворим в воде, мало растворим в низших спиртах и не растворим в неполярных органических растворителях. По антибиотическому действию канамицин В сходен с канамицином А, отличаясь от последнего большей токсичностью.

Канамицин С присутствует в культуральной жидкости Str. Kanamyceticus в небольшом количестве и практического значения не имеет.

В медицинской практике применяют моносульфат и сульфат канамицина, хорошо растворимые в воде с образованием слабоосновных растворов.

Антибиотик мало растворим в 50% метаноле, ацетоне и других органических растворителях. Ра