Сорбционное концентрирование и последующее определение антрациклиновых антибиотиков в биологических объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

со от.

^ На правах рукописи

г-и

ЯКОВЛЕВА ЛЮДМИЛА ВЯЧЕСЛАВОВНА

СОРБЦИОННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ

И ПОСЛЕДУЮЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Астрахань -1998

Работа выполнена на кафедре физической химии Астраханского государстве ного педагогического университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Алыков Н. М.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, старший научный

сотрудник Дворкин В. И.

Ведущая организация: Астраханская государственная медицинская

академия

Защита состоится 20 мая 1998 г. в 13 час. в ауд. 3 на заседании диссертацио: ного совета К-113.71.02 в Астраханском государственном педагогическс университете по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке университета по адрес; 414056, Астрахань, ул. Татищева, 20а

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять в адрес уш верситета: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1. АГПУ

доктор химических наук, профессор Джумакаев К. X.

Автореферат разослан _ 1998

г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Антраци клиновые антибиотики нашли широкое применение в медицине и биологии. Для их определения в различных объектах применяют хроматографические, электрохимические, фотометрические, люминесцентные, биологические и другие методы, а также комбинированные методы с фотометрическим и люминесцентным окончанием. В большинстве случаев методы определения сложны, требуют длительного времени, аналитические формы малоустойчивы. В практике требуются легкодоступные экспресс-методы с высокой чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками. Нижняя граница определяемых содержаний антрациклиновых антибиотиков, при использовании известных методик, равна 100-200 нг/мл, что не может удовлетворить потребности практики. Для определения остаточных количеств и терапевтических доз антибиотиков в крови, моче и других биологических объектах необходимы методы, характеризующиеся нижней границей определяемых содержаний на уровне 1-50 нг/мл.

Концентрирование микрокомнонентов (экстракция, сорбция и др.) недостаточно используется для определения антибиотиков. Между тем методы, имеющие нижнюю границу определяемых содержаний на уровне 1-5 нг/мл, пока могут быть созданы лишь при использовании концентрирования. Из методов определения антрациклиновых антибиотиков в различных биологических объектах наиболее быстрыми, доступными и удобными являются фотометрические и люминесцентные методы. Для развития этих методов требуется систематическое изучение кислотно-основных равновесий, процессов комплексообразования и других равновесий в растворах, содержащих сами антибиотики и различные ионы металлов. Необходимо детальное изучение процессов сорбции и экстракции с целью выбора наиболее подходящих концентрационных систем. Это позволило бы создать высокочувствительные методы определения антибиотиков группы аитрашклинов, например при использовании фотометрии или спектроскопии диффузного отражения.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физической химии Астраханского государственного педагогического универ-

ситета и РАН по направлению "Органический анализ", в рамках Комплексной го дарственной программы "Экологическая безопасность России".

Цель работы: теоретическое и экспериментальное изучение процессов к центрирования для создания экспресс способов селективного и суммарного опреде ния антрацикгшновых антибиотиков методами спектрофотомстрии, флуориметрш спектроскопии диффузного отражения.

Для достижения поставленной цели необходимо было изучить:

- кислотно-основные равновесия рубомицина, адриамицина и карминамищ в водных растворах при различных значениях pH;

- процессы компяексообразования рубомицина с медью(Н), магнием, алк» нием, железом(Ш), марганцем, цинком, молибденом(У1) и никелем(И);

- сорбционное концентрирование антрациклиновых антибиотиков на та* сорбентах, как СВ-1, карбонат кальция, Kieselgel 60-G, Kieselgel 60-Н, IRS-50, Kies gel 6O-H-F254, Kieselgel 6O-G-F254 и амберлиг CG-50-1I и расчет основных термоди) мических и кинетических характеристик изучаемых процессов.

Научная новизна работы: представлен механизм сорбционного концепт; рования ашрациклинов сорбентами СВ-1 и карбонатом кальция. Оценены фактор определяющие аналитический сигнал, показаны пути увеличения чувствительное воспроизводимости определения и расширения диапазона определяемых содержаии

Осуществлен поиск высокочувствительных реакций на антрациклиновые ; тибиотики с учетом процессов комллексообразования антибиотиков с металлами. С разование таких соединений может быть связано с участием в комплексообразован как мономерных гидролизованных форм металлов, так и координационных полимс ных соединений.

Практическое значение и реализация результатов. В работе впервые i пользуется сорбент СВ-1, продукт нехимической переработки опок Астраханской с ласти, обладающий по отношению к антрациклинам наилучшими сорбциони аналитическими характеристиками по сравнению с другими сорбентами.

Разработаны фотометрические методы определения антрациклиновых airr биотиков, основанные на сорбционном концентрировании на таких сорбентах, к; СВ-1, карбонат кальция, Kieselgel 60-G, Kieselgel 60-Н, IRS-50, Kieselgel 60-H-F254, К

езе^е! 60-С-Р254 и амберлит СС-50-Н с пределами обнаружения на уровне 1-5 нг/мл, которые характеризуются широким диапазоном определяемых содержаний 15 минимальными значениями относительного стандартного отклонения.

Разработан метод определения антращнслиновых антибиотиков с использованием спектроскопии диффузного отражения с пределами обнаружения на уровне 0,2-5 нг/мл.

На защиту выносятся:

- представление механизма сорбции антрациклиновых антибиотиков на сорбентах различной природы: СВ-1, карбонат кальция, ЮеБе^е! 60-С, Клевере! 60-Н, №5-50 и амберлит СО-50-И;

- результаты изучения реакций комплексообразования ионов металлов с антра-циклиновыми антибиотиками различными методами;

- результаты изучения сорбционного и экстракционного концентрирования антрациклиновых антибиотиков;

- комплекс методов контроля рубомииина в различных биологических объектах при его использовании в медицинской практике.

Апробация работы. Результаты работы доложены на семинаре кафедры физической химии Астраханского государственного педагогического универснтега (Астрахань, 1997 г.) и на семинаре кафедры аналитической химии Воронежской технологической академии (Воронеж, 1996 г.). В целом работа доложена на расширенном семинаре кафедр физической химии АГПУ, общей и неорганической химии АГТУ и кафедр биохимии и фармакологии Астраханской государственной медицинской академии (Астрахань, 1997 г.). Материалы диссертации доложены на 20 различных конференциях, съездах и конгрессах, среди которых: Всесоюзная конференция по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991); II Международная конференция по экстракции, (Воронеж, 1992); Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды (Экоаналитака-94, Краснодар, 1994); Международный экологический конгресс (Воронеж, 1996); Российская конференция по экологическим проблемам Волги и Прикаспия (Астрахань, 1996); Международный конгресс по аналитической химии (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 8 тезис докладов региональных и международных конференций и конгрессов.

Структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах, состоит из вг дения, четырех глав и выводов, включает 48 рисунков, 19 таблиц и список цитируем литературы, содержащий 143 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко излагается актуальность проблемы, обоснование выбо методов сорбционного и экстракционного концентрирования антрациклиновых ант биотиков с целью дальнейшего определения в биологических объектах, а также изл гается и практическая значимость разработок, направленных на определение рубом цина, карминомицина и адриамицина.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре представлены результаты исследования по использованию в медиц не антрациклиновых антибиотиков различных групп, проблемы их модификации трансформации, а также механизмы их воздействия на различные структурные эл менты организма.

Приведены обзор и критическая оценка современных методов определен! антрациклиновых антибиотиков. Обсуждены преимущества методов спектрофотоме рии, флуориметрии и спектроскопии диффузного отражения.

В результате изучения информационных источников установлено, что для ра вития методов аналитической химии антрациклиновых антибиотиков требуется во стороннее изучение концентрирования как самих антибиотиков, так и их комплексны соединений с металлами.

ГЛАВА II. ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ С АНТРАЦИКЛИНОВЫМИ АНТИБИОТИКАМИ

Изучено комплексообразование антрациклинов с алюминием, железом (III марганцем (И), кобальтом (II), молибденом (VI),медью (II), никелем (II), цинком, ка;] мием (II) и магнием. Исследованы оптимальные значения рН реакций, константы ус тойчивости, термодинамические характеристики образования комплексов (изменени

энтальпии (ДН), энтропии (Д8), энергии Гиббса (ДО)) и влияние ионной силы на ком-гшексообразование.

Соотношение компонентов в соединениях изучено методами изомолярных серий, насыщения и отношения наклонов. Вместе с тем, ни один из этих методов не позволил однозначно установить соотношение компонентов в соединениях. Это свидетельствует о том, что при взаимодействии антибиотика с ионом металла образуется несколько малоустойчивых соединений, что подтвердилось при использовании первой производной (/•) для установления соотношения компонентов в соединениях. Было установлено, что М§2+ образует с антибиотиком соединения с соотношением компонентов 1:1 и 1:3, Мп2+ - 3:1 и 1:2, Ре3к образует соединения с соотношением компонентов 4:1, 2:1, 1:1 и 1:2, А13+-1:2.

Результаты изучения констант равновесия и основных термодинамических характеристик процессов комплексообразования рубомицина с ионами металлов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты изучения констант равновесия и термодинамических характеристик образования комплексов рубомицина с металлами

Металл рНогп 1дК291 |дк281 ДН, кДж/моль Д52Э1, кДж/моль-К Д^гэь кДж/моль

Марганец (II) 9 5,4 5,2 31,3 0,21 -30,05

Молибден (IV) 4 3,6 3,8 31,3 0,18 -20,00

Магний (II) 10 9,0 2,0 1095,4 3,94 -50,08

Кобальт (II) 9 9,5 8,5 156,4 0,72 -50,86

Алюминий (III) 7 5,5 4,4 172,0 0,69 -30,60

Железо (III) 8 4,1 3,9 32,4 0,19 -22,80

Выяснено, что более устойчивыми (Дй находится в пределах от -50 до -30 кДж/моль) являются комплексные соединения рубомицина с магнием, кобальтом, марганцем и алюминием. Уравнение реакции комнлексообразования рубомицина с ионами металлов можно представить схемой:

^Mx(0H)y(H20)z^+ +qHm4R'~ о

[pm-q(i+n)]T

+ qnH+ +paH2C

Для определения антрациклиновых антибиотиков можно использовать npi цессы образования комплексных соединений этих антибиотиков с металлами. Пос; выделения комплексных соединений адсорбцией или экстракцией проводят коше рентную реакцию, используя для этого подходящий органический реагент с необх димыми характеристиками. По поглощению или флуоресценции нового комплексно! соединения можно судить о содержании антибиотика в пробе. Данный прием мош использовать для повышения избирательности реакции.

ГЛАВА III. ЗАКОНОМЕРНОСТИ СОРБЦИИ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ И ИХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С МЕТАЛЛАМ

В качестве сорбентов для концентрирования антрациклиновых антибиотике были использованы СВ-1, карбонат кальция, Kieselgel 60-Н, Kieselgel 60-G, IRS-5I Kieselgel 6O-H-F254, Kieselgel 6O-G-F254 и Амберлит CG-50-II. Предварительно опре деляли интервал рН, ионной силы и температуры сорбции. За исключением карбонат кальция и амберлитов IRS-50 и CG-50-II все остальные сорбенты - это различные су ликагели, алюмогели и продукты переработки природных образований - глин и опок.

Представлены методы создания сорбентов группы СВ, изучены их основны характеристики для концентрирования с целью дальнейшего определения антрацш линовых антибиотиков. Подготовка сорбента СВ-1 к работе заключается в получени вещества с определенным размером зерен. Для этого сорбент размалывают до части; различных размеров, отсеивают крупные, средние, мелкие частицы, далее частиц! диаметром около 1 мм размалывают и перетирают, производят отсев частиц заданноп размера (в работе используют частицы диаметром 0,1-0,2 мм). Помещают около 100 150 г сорбента с определенным размером частиц в стакан емкостью 1000 см3', прили вают 500-700 см3 0,1 М раствора серной кислоты, включают мешалку и вымывают и сорбента соли металлов, для чего необходимо проведение очистки в течение 25-40 ча сов. Декантируют водную фазу, несколько раз приливают по 500-600 см3 дистилиро

ванной воды, выдерживают по 1-2 часа, через 5 промывок приливают 200 с»

см ацетона

или изопропиловопо спирта (ос.ч или х.ч). перемешивают 1 час, сливают жидкую фазу и сорбент высушивают при температуре 105-110°С 10 часов. При такой обработке сорбент не содержит тяжелых металлов или различных фенолов. После этого (когда остынет сорбент), в него приливают 200 см3 гексана для хроматографии, перемешивают 0,5-1 час и, после декантации жидкой фазы, высушивают сорбент 10 часов при температуре 105-110°С. Сорбент после такой обработки не содержит углеводородов.

Определение удельной поверхности СВ-1 проводили по изучению поверхностного натяжения растворов поверхностно-активных веществ (изопропилового, бутилового спирта или хлорида цетилпиридиллия). Одновременно изучали для растворов ПАВ величины предельной адсорбции из водного раствора. Согласно правилу Ребин-дера, при адсорбции ПАВ разность полярностей между адсорбентом и растворителем уменьшается. Сшшкагель („ опоки) хорошо адсорбируют ПАВ из полярных жидкостей, в качестве которых практически всегда выступает вода.

Результаты опытов и расчетов позволили установить, <гто удельная поверхность сорбента СВ-1 находится в пределах от 100 до 125 м2/г и эта величина сопоставима с удельной поверхностью цеолитов и некоторых активных углей.

Были изучены, как по литературным источникам, так и экспериментально, основные характеристики таких сорбентов, как К1езе!Ве1 60-С, К1е5е18е! 60-Н. 1К$-50 амберлит СО-50-И и карбонат кальция.

Основные сорбиионные равновесия изучали спекгрофотомегрическим методом. Для этого при изучении термодинамики сорбции готовили серию растворов с увеличивающейся концентрацией рубомишша (п -Ю"4 моль/л) путем разбавления исходного раствора и федерировали. Навески сорбента помещали в исследуемые растворы, встряхивали, центрифугировали и измеряли оптические платности осветленных фракций при 495 нм. При температурах 278 и 298 К получены изотермы сорбции в координатах Г(х/т) -[С] (х - концентрация антибиотика в сорбенте, где т - масса сорбента, [С] - равновесная концентрация антибиотика в растворе). Для изучения кинетики сорбции навеску сорбента помешали в раствор антибиотика, встряхивали, через определенные промежутки времени отбирали пробы жидкой фазы, центрифуги-,-

вали и измеряли оптические плотности осветленных фракций. В результате были pai считаны значения констант скоростей сорбции и термодинамические параметры кине тики сорбции: изменения энтальпии - ДН, энтропии - AS энергии Гиббса - AG. Антрг циклиновые антибиотики достаточно эффективно сорбируются на Амберлите CG-5C II, карбонате кальция и СВ-1 в широком диапазоне pH. Адсорбция антрациклиновы антибиотиков происходит с небольшими положительными значениями ДН для Kiesel gel 60-G и Kieselgel 60-Н, что может служить доказательством слабых гидрофоб ны взаимодействий в системе сорбент-антибиотик. Энергия взаимодействия для карбона та кальция и СВ-1 составила от -180 до -270 кДж/моль, что соответствует энерги взаимодействия при хемосорбции.

Для количественной оценки сорбции антрациклиновых антибиотиков на сор бентах различной природы получены и проанализированы изотермы сорбции рубоми цина. Возрастающие ветви изотерм сорбции рубомицина (СВ-1, карбонат кальция Kieselgel 60-Н, Kieselgel 60-G, IRS-50 и Амберлиг CG-50-II) описываются Teopnei Брунауэра-Эммета-Теллера (БЭТ), что обусловлено пористостью и негомогенносгьк сорбирующей поверхности. В области низких концентраций характер зависимости r=f[C) аналогичен изотермам Лэнгмюра и характеризуется заполнением моносло: сорбента. На основании анализа изотерм и термодинамических параметров сорбцт особо выделены те сорбенты, к которым антрациклиновые антибиотики проявляю] максимальное сродство. Наиболее приемлемым сорбентом (хорошая сорбционная емкость, максимальное взаимодействие с анализируемым веществом и возможность десорбции органическими растворителями) является СВ-1, для которого сорбционные характеристики представлены в таблице 2 и 3. Установлено, что процесс концентрирования антибиотиков связан с образованием ион-ионных, Ван-дер-ваальсовых и водородных связей с поверхностью сорбента. Поверхность сорбента покрыта мономолекулярным слоем воды.

Таблица 2. Термодинамические характеристики сорбции рубомицина

Сорбент рНомт ЛИ, кДж/моль Дв, кДж/моль, 'Г"21)8К. Ай, кДж/моль, Т-27»К Дв, кДж/мольК, Т=29НК ДБ, кДж/мольК Т=278К Емкость сорбента, мг/г

К1езе1де1 бО-в 4-5 96,400 -28,485 - 20,484 0,419 0,419 0,646

Кюэе^е! 60-Н 4-5 36,501 -29,198 - 24,788 0,220 0,220 2,610

1К8-50 9-10 112,613 - 22,782 - 13,695 0,454 0,454 8,640

Кюзе1де1 60-С-Г:м 9-10 - 204,435 - 6,842 -20,104 - 0,663 - 0,663 1,530

Кюзе1де1 60-Н-1-',,, 9-10 -275,174 -15,809 - 18,453 -0,923 - 0,923 21,450

Амберлит Св-бО-И 4-9 - 198,500 -10,700 -14,784 0,160 0,160 23,178

СВ-1 3-9 - 252,635 2,770 - 14,371 - 0,857 - 0,857 50,400

Карбонат кальция 6-7 -181,771 3,504 -12,228 -0,612 -0,609 23,630

Таблица 3. Термодинамические характеристики кинетики сорбции рубомицина

Сорбент рН0пт ДН, кДж/моль Дв, кДж/моль, Т=295К ДБ, Кдж/мольК, Т=295К

Юе5е1де1 бО-в 4-5 ' -63,149 -17,366 -0,155

КюэЫде! 60-Н 4-5 21,049 -21,425 0,144

1148-50 9-10 -15,787 10,093 -0,088

Юезе1де1 60-в-р254 9-10 -91,566 9,021 -0,341

СВ-1 3-9 -39,994 11,446 -0,174

Амберлит Св-бО-П 4-9 19,997 5,018 0,051

Карбонат кальция 4-9 6,245 9,144 - 0,009

Установлены основные точки взаимодействий: ион-ионное взаимодействт протонированной аминогруппы гликозида с ионизированной формой гидроксогруппв алюмосиликата; взаимодействие карбонильной группы анграхинонового кольца с ио ном водорода воды на поверхности сорбента; образование водородной связи междз ионом водорода воды поверхности сорбента и гидроксогруппой антрахиноновогс кольца. С использованием известных литературных данных по энергическим характе ристикам сорбции и полученным экспериментальным результатам энергетических ха рактеристик сорбентов оценено участие каждой группы во взаимодействии в систем« сорбент-сорбат.

Изучены процессы сорбции на карбонате кальция комплексов рубомицина с ионами Мя2+, Бе3+, Си2!, №2+, Хп2+, Мо6+. Определены условия адсорбции комплексов (рН, огтгимальный температурный интервал, емкость сорбента) и определены термодинамические параметры сорбции (энтальлия-ДН, кДж/моль, энтропия-Д8, кДж/моль-К, энергия Гиббса-ДС, кДж/моль) Результаты изучения термодинамики сорбции комплексов рубомицина с ионами металлов на карбонате кальция представлены в таблице 4.

Таблица 4. Термодинамические характеристики сорбции комплексов металл^ рубомицин на карбонате кальция

металл pH ДН (кДж/моль) AS (кДж/моль-К) AG, (кДж/моль) Емкость сорбента, (mir)

Медь 7 74,345 0,357 -32,17 9,96

Магний 10 -3,382 0,092 -30,93 6,05

Алюминий 6 -36,211 -0,021 -30,04 14,42

Марганец 10 -0,238 0,082 -24,84 0,06

Марганец 8 -9,710 0,062 -28,33 2,80

Цинк 9 6,151 0,087 -19,687 0,07

Молибден 5 41,122 0,235 -28,93 10,62

Никель 8 4,349 0,144 -38,47 9,80

Результаты, представленные в таблице 2 и 4, могут свидетельствовать о том, что сорбция самих антибиотиков имеет значительно меньшие значения АН и ДО .Это можно связать с тем, что сорбция самих антибиотиков и их соединений с металлами проходит по разным механизмам.

Десорбция антраниклинов. Это важная часть методики концентрирования антибиотиков, т.к. извлечение антибиотиков с сорбентов в ряде случаев является трудной задачей. Десорбцию антрациклинов проводили ацетоном, хлороформом, этанолом, дютиловым эфиром или смесью ацетон-уксусная кислота (98:2), ацетон-соляная кислота (98:2), этанол-уксусная кислота (98:2), этанол-соляная кислота (98:2). Наилучшими системами для элюирования оказались: для карбоната кальция - ацетон, для амберлита СО-50-П - смесь ацетон-уксусная кислота (98:2), для СВ-1 - смесь ацетон-соляная кислота (98:2). Эти системы били использованы для создания методик определения антрациклиновых антибиотиков.

ГЛАВА IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТРАДИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Результаты проведенных исследований явились основой для создания методов определения антибиотиков в различных биологических объектах. Предварительное концентрирование особенно эффективно в тех случаях, когда содержание антрациклинов в анализируемом объекте незначительно, но условия опыта позволяют ислользо-

вать для анализа большое количество материала. Таким объектом может служить моча, анализ которой состоит из этапов сорбции антрациклинов сорбентом, внесенным е анализируемую пробу (карбонах кальция, СВ-1, амберлит СС-50-11), отделения сор бента и промывания его водой, извлечения антрациклинов с сорбента системой растворителей (ацетон или смесь ацетон-кислота), далее - использование какого - либс варианта определения (фотометрия, флуориметрия или спектроскопия диффузного от ражения).

4.1. Методика определения антрациклиновых антибиотиков после их концентрирования на амберлите СС-50-11

Амберлит СС-50-Н достаточно эффективно сорбирует антрацикпиновые анта биотики в широком диапазоне рН. Процессы сопровождаются небольшими стрица тельными изменениями энтальпии и положительными изменениями энтропии, чтс может служить доказательством слабых гидрофобных взаимодействий в системе сор бент - антибиотики. В условиях оптимальных значений рН сорбции антибиотики на ходятся в катионных или нейтральных формах. Десорбировахь антибиотик можш смесью ацетона и уксусной кислоты, этанолом или хлороформом. Для десорбции сме сыо ацетона и уксусной кислоты характерны более низкие значения энтальпии, чей для десорбции водным раствором кислоты. Важно и то, что ацетон удается легко ото гнать и при этом дополнительно сконцентрировать антибиотики. Данная методика по зволяет определять рубомицин, карминомицин и адриамицин на уровне 10-15 нг/мл I моче.

Концентрирование и фотометрическое определение антрациклиновых анти биотиков в моче с использованием амберлита СО-50-И проводили по следующей схе ме: анализируемый образец — сорбция на амберлите СС-50-11 — (жидкость отбрасы вают) — амберлит СО-50-Н —промывка водой — десорбция смесью ацетона и уксус ной кислоты (амберлит СС-50-11 отбрасывают) — отгонка ацетона (сухой остаток) — обработка раствором Н3ВО3 в Н2Б04 — измерение флуоресценции.

Методика определение антрациклинов в моче В 50 см3 мочи вносили 1 см 0,2% -ного водного раствора ОН3СООН и 1 г амберлита СО-50-П, встряхивали 10 мш и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. Центрифугах отбрасывали, к сорбент

прибавляли 50 см3 воды, перемешивали 2 мин, вновь центрифугировали и отбрасывали водную фазу. Промывание водой повторяли еще дважды. Далее к сорбенту прибавляли 50 см3 смеси (98:2) ацетона и уксусной кислоты, взмучивали содержимое центрифужных пробирок, перемешивали 15 мин и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. Отделяли жидкую фазу, вновь ее центрифугировали и отгоняли ацетон. К сухому остатку после отгона прибавляли 0,05 см3 2% раствора Н3В03 и 0,5 см3 концентрированной H2S04 Флуориметрировали с желтым первичным (570-575 нм) и красным вторичным (610-615 нм) фильтрами или измеряли спектр флуоресценции в области от 550 до 630 нм (максимум флуоресценции находится при 610 нм).

Содержание антибиотика находили по градуировочному графику, для построения которого обрабатывали образцы мочи, в которые вносили возрастающее количества антибиотиков (в пределах, ожидаемых в опытах). Правильность разработанной методики определения антрациклинов проверяли методом «введено - найдено» (табл. 5.) и сопоставили с методикой прямого флуориметрического определения.

Таблица 5. Результаты (нг/мл) проверки правильности методики определения антрациклииовых антибиотиков в моче

Антибиотик Введено Данная методика Методика для сравнения

Рубомицин 1 0,7+0.3 —

5 4±1 —

10 9+1 —

50 45±5 55+10

100 95±10 80+30

200 190+.Ю 190±35

Адриамицин 1 0,8+0.3 _

5 4±1 —

10 .9+1 —

50 48±5 40+40

100 95+10 90+40

200 190+10 190+40

Карминомицин 1 0,5+0.4 _

5 4+0,4 —

10 9±2 —

50 45±5 40i40

100 95+10 90+40

200 190±20 190+40

Как видно из данных таблицы 5, только при достаточно высоких концешрац ях антрациклинов вполне удовлетворительно работает методика, взятая для сравн ния. Для низких концентрациях антибиотиков можно использовать только разраб танную нами методику.

4.2. Методика определения антрациклиновых антибиотиков после

их концентрирования на карбонате кальция Концентрирование и фотометрическое определение ашрациклиновых ант биотигав в моче с использованием карбоната кальция проводили по следующей схем анализируемый образец — сорбция на карбонате кальция — (жидкость отбрасываю — карбонат кальция —промывка водой — десорбция ацетоном (карбонат кальция о брасывают) — фотометрирование.

Методика определения антрациклинов в моче. В 50 см3 мочи вносили 0,5 карбоната кальция, встряхивали 10 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/ми Центрифугах отбрасывали, к сорбенту прибавляли 50 см5 воды, перемешивали 2 ми вновь центрифугировали и отбрасывали водную фазу. Промывание водой повторяв еще дважды. К сорбешу прибавляли 5 см3 ацетона, взмучивали содержимое центр! фужных пробирок, перемешивали 15 мин и центрифушровали 10 мин при 20( об/мин. Отделяли жидкую фазу, вновь ее центрифугировали, после чего фотомегрир вали жидкую фазу при 490 нм. Результаты определения содержания рубомицина в м че данным методом приведены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты проверки правильности методики определения рубомицина в моче с использованием карбоната кальция (п = 6; Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено (х), нг/мл S, Vn

12 15,9 1,81 15,9+ 1,45

16 18,6 3,03 13,6 + 2,42

20 21,8 2,80 21,8 + 2,24

30 29,9 3,37 29,9 + 2,7

40 38,4 7,15 38,8 ± 5,72

60 57,3 7,46 57,3 ± 5,97

80 71,9 1,18 71,9 + 9,47

Данный метод позволяет проводить с достаточной достоверностью определе ние рубомицина при содержании его в образце от 6 до 150 нг/мл.

4.3. Методика определение антрацнклииовых антибиотиков после ИХ концентрирования на СВ-1

Фотометрическое определение рубомицина в моче с использованием сорбента СВ - 1 проводили по следующей схеме: анализируемый образец — сорбция на СВ-1 (жидкость отбрасывают) СВ - 1 -промывание водой - десорбция смесью ацетона с соляной кислотой (СВ - 1 отбрасывают) —фотомстрирование.

Методика определенна В 50 см3 мочи вносили 0,5 г СВ - 1, встряхивали 10 мин и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Центрифугат отбрасывали, к осадку приливали 50 см3 воды и центрифугировали (после перемешивания 5 мин при 3000 об/мин). Операцию промывания проводили дважды. Промывные водь, отбрасывали, к осадку приливали смесь (98:2) ацетона с соляной кислотой объемом 50 см3, тщательно перемешивали и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. После этого центрифугат фотометрировали при 490 „м. Содержание антибиотика находили по гравировочному графику, для построения которого обрабатывали пробы мочи ( 50 см3 ), „ которые предварительно вносили возрастающее количество антрациклиновых антибиотиков Результаты фотометрического определения рубомицина с использованием сорбента СВ-1 приведены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты проверки правильности методики определения рубомицина в моче (п = 6; Р = 0,95) определения

Введено (X), нг/мл Найдено (х), нг/мл в, х^хЛ:8'

8 12 16 20 30 40 60 80 6,1 11,4 17.8 22,2 29,6 40,8 55,8 82.2 1,96 2,58 5,23 4,35 2,88 2,72 6,78 3,50 6,1 ± 1,57 11,4 + 2,07 17,8 + 4,19 22,2 + 3,48 29,6 + 2,3 40,8 + 2,17 55,8 + 5,43 82,2 ±7,13

Используемый в настоящее время флуориметрический метод имеет нижнюю границу определяемых содержаний на уровне 10-15 нг/мл, сорбционный метод с использованием карбоната кальш.я в качестве сорбента до 6 нг/мл, с использованием

СВ-1 можно определить до 2

нгмл антрациклинов. Кроме того, СВ-1 обладает о

очень

большой сорбционной емкостью по отношению к антрациклиновым антибиотикам может быть использован также в технологии выделения и очистки антрациклинов.

4.4. Методика определение аитрациклиновых антибиотиков с использованием спектроскопии диффузного отражения (СДО)

Фотометрическое определение рубомицина в моче с использованием СДО пр водили по следующей схеме: анализируемый образец — экстракция — упаривал экстракта на водяной бане — нанесение экстракта на специальные пластинки с со; бентом НР-ТХС-АМоНеп Клезе^е! 60 — измерение диффузного отражения К

Методика определения. В делительные воронки вносили 50 см3 мочи, довод! ли рН анализируемого объекта до 9 ацегагно-аммонийным буферным раствором. Эк трагировали 1 мл хлороформа, экстракт упаривали на водяной бане до 0,5 мл, нанос] ли по каплям (после испарения растворителя от каждой капли) на специально прип товленные пластинки с сорбентом НР-ТЬС-АМоПеп Кдезе^е160 и измеряли диффу ное отражение К при 490 нм. Правильность разработанной методики определения р; бомицина с использованием СДО проверена методом «введено-найдено» (табл.8).

Таблица 8. Результаты проверки правильности методики определения рубомицина в моче с использованием СДО(п = 6; Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено (х), нг/мл Б, VII

2,5 4,0 2,61 4,0 ± 2,09

5,0 6,5 2,62 6,5 ± 2,10

10,0 13,9 4,30 13,9 ±3,44

20,0 24,1 7,55 24,1 +6,04

30,0 34,35 4,39 34,35 + 3,51

40,0 41,00 6,82 41,00 ±5,45

45,0 50,00 6,70 50,00 ± 5,36

Из таблицы видно, что метод характеризуется удовлетворительной сходимс стью результатов (Бг = 6,04 - 2,09), а также отсутствием значимой систематической по грешности при анализе образцов.

Использование метода диффузного, отражения и сравнение полученных ре зультатов с известным флуориметрическим методом позволяет считать, что мето, диффузного отражения является более надежным для определения концентраций , ко

торые при использовании других методов или невозможно определить, или определяются с большой погрешностью.

Направлением дальнейших исследований по выбранной теме может быть: разработка теоретических положений сорбции аптрациклинов и других антибиотиков, основой которой являются явится реитгено-структурное, термографическое, ИК -спектроскопическое исследование сорбентов группы СВ, а также квантово-химическое исследование основных энергетических и структурных индексов антра-циклииов и поверхности сорбентов группы СВ. Это позволило бы повысить избирательность сорбции по отношению к антрациклинам, что может служить основой для создания более надежных методов определения антрациклиновых и других антибиотиков в различных объектах.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Представлен механизм сорбции антрациклиновых антибиотиков на сорбентах различной природы. Процесс концентрирования антибиотиков на поверхности сорбентов связан с образованием ион-ионных, Ван-дер-ваальсовых и водородных связей с поверхностью сорбента. Установлены основные точки взаимодействий: ион-ионное взаимодействие протонированной аминогруппы гаикозида с ионизированной формой гилроксогруппы алюмосиликата; взаимодействие карбонильной группы ан-трахинонового кольца с ионом водорода воды на поверхности сорбента; образование водородной связи между ионом водорода воды поверхности сорбента и гидроксогруп-пой антрахинонового кольца. С использованием известных литературных данных и полученных экспериментальных результатов энергетических характеристик сорбции оценено участие каждой группы во взаимодействии в системе сорбент-сорбат.

2. Изучены кислотно-основные равновесия рубомшшна, адриамишша и кар-минамицина в водных растворах при различных значениях рН;

3. Изучены процессы комплексообразования рубомицина с медью(Н), магнием, алюминием, железом(Ш), марганцем, цинком, молибденом(У1) и кикелем(П);

4. Изучено сорбанонное концентрирование антрациклиновых антибиотиков на таких сорбентах, как Ктейе^е! 60-О, К|С5е1уе1 60-Н, Юеве^е! 60-Н-{ 251, Кь

eselgel 60-G-¥2h, амберлиг CG-50-П, карбонат кальция и СВ-1 и основные термо, намические и кинетические характеристики изучаемых процессов.

5. Апробирован дня концентрирования антрациклинов продукт перераба опок Астраханской области - сорбента СВ-1. Результаты сопоставлены с сорбцией трациклннов широко известными сорбентами. Показана высокая эффективность CI как для концентрирования антибиотиков как в аналитических целях, так и для тех) логических операций при получении антрациклиновых антибиотиков. На основании полученных результатов были разработаны: методика определения антрациклиновых антибиотиков после их концент] рования на амберлите CG-50-II;

методика определения антрациклиновых антибиотиков после их концентр рования на карбонате кальция;

методика определения антрациклиновых антибиотиков после их Konueirrj рования на СВ-1;

методика определения антрациклиновых антибиотиков с использование спектроскопии диффузного отражения.

Намечены перспективы дальнейших исследований в области создания теор тических положений сорбции различных физиологически активных веществ на пр родных и синтетических сорбентах типа кремнеземов и алюмосиликатов.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Алыков Н.М., Некрестьянова Т.В., Яковлева Л.В. Концентрирование и флуориме рическое определение антрациклиновых антибиотиков. //Журн. аналит. хими 1991. Т.46. № 8. С.1642.

2. Алыков Н.М., Воронина Г.Ю., Яковлева Л.В. Сорбцнонное концентрирование и m следующее определение антрациклинов, рифампицинов и тетрациклинов и i комплексных соединений с металлами в биологических обекгах. IV Всес. конф. г аналит. химии орган, вещ-в. Москва, 23-25 января. 1991. Тез. докл. С. 136.

3. Alykov N.M., Voronina G.Y., Alykov N.N., Titova O.L., Yjkovleva L.V. Extraction photometric and fluorometric method of determination of antracycline, tetracycline, am noglycocide, rifampycine and erytromycme in biological objects. International organi

substances solvent extraction konference. Voronezh. Russia, September, 22-25. 1992. V. 2. P. 188.

4. Алыков H.M., Алыков H.H., Гламозда A.B., Прачкина А,А, Яковлева Л.В. Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-94" Краснодар. 1994. Тез. докл. С. 34

5. Alykov N.M., Glamozda A.V., Saprykina V.V., Yjkovleva L.V. Kinetics studies of an-tracycline antibiotics sorption on different origin. International symposium: "Kinetic in analitycal chemistry". Moscow, September, 25-27. 1995. P. 27.

6. Алыков H.M., Яковлева Л.В. Концентрирование и последующее определение рубо-мицина с использованием спектроскопии диффузного отражения. Межд. конф. "Спекгрохимические методы анализа окружающей среды"". Курск, 1-6 сентября, 1995. Тез. докл. С. 117.

7. Алыков Н.М., Гламозда А.В., Клементьева А.В., Титова О.Л., Яковлева Л.В. Использование спектроскопии диффузного отражения в аналитической химии физиологически активных веществ. Сборник научных статей "Черкесовскне чтения". Саратов. 1996. С. 36.

8. Алыков Н.М., Гламозда А.В., Васильева Е.С., Титова О.Л., Яковлева J1.B. Сорбни-онное концентрирование аминогликозидов и антрациклиновых антибиотиков на сорбентах. Конференции по эколого-биологическим проблемам Волжского региона и Северного Прикаспия. Астрахань, 3-4 октября 1996. Тез. докл. С. 38.

9. Alykov N.M., Titova O.L, Yakovleva L.V. The search of systems for testing antibiotics in biological objects. Int. ecolog. congress. Voronezh. Russia, September 22-26. 1996. Section: Science and Environment. Kansas State University, Kansas, USA. P. 28.

10. Alykov N.M., Rgevkina N.A., Yakovleva L.V. Preconcentration and determination of antracyclir.e antibiotics. International congress on analytical chemistry. Moscow. Russia, June 15-21. 1997. Abstracts V.2. P-40.

11. Яковлева Л.В. Сорбционное концентрирование и определение антрациклиновых антибиотиков //Астраханский край: история и современность (к 280-летию образования Астраханской губерни). Астрахань, 26-27 ноября 1997. Материалы Всерос-

сийской науч.-практ. конф. С.259.

Подписано к печати

/3.04

Заказ № Тираж 100 экз.

Издательство Астраханского государственного педагогического университета 414056, Астрахань, ул Татищева, 2а