Мицеллы блок сополимеров оксида этилена и оксида пропилена (плюроников)для доставки противораковых цитостатиков и лечения опухолей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Р "" 5 ОД им. М.В.ЛОМОНОСОВА

1 з уда 1996

Химический факультет

На правах рукописи УДК 678.01: 541.18

ДОРОДНЫХ ТАТЬЯНА ЮРЬЕВПА

мицеллы блок сополимеров оксида этилена и оксида пропилена (плгороииков) для доставки противораковых цитостатнков и лечения опухолей

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений 03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -1996

Работа выполнена в Московском институте биотехнологии и на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук А.В. Кабанов

кандидат химических наук Е.В. Батракова

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

кандидат химических наук, профессор В.Ю. Алахов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор И.М. Паписов доктор биологических наук, профессор Л.С. Ягужинский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский физико-химический институт им. Н.Я. Карпова

Защита состоится 29 мая 1996 г. в _час. на заседании

диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, В-234, Воробьёвы Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан апреля 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук А.А.Миронова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание систем доставки лекарств, способных обеспечивать высокую концентрацию препаратов в очаге поражения, снижать побочные эффекты от введения их в организм и увеличивать продолжительность действия лекарственных соединений на пораженный орган или ткань, является одной из фундаментальных задач современной фармакологии.

Наиболее перспективными системами доставки физиологически активных соединений в организме являются комплексы лекарственных препаратов с полимерными носителями различной природы, выполняющими роль "микроконтейнеров". Данные комплексы представляют собой пространственную конструкцию, в которой молекулы фармакологического агента окружены оболочкой из молекул носителя. При этом, лекарство может быть как конъюгировано с полимером, так и не связано с ним ковалентно. Нековалентное включение физиологически активных веществ в микроконтейнеры полимерного носителя обладает рядом существенных преимуществ перед широко используемым методом конъюгирования препаратов с полимером.. При нековалентном связывании не происходит изменения химической структуры лекарственного соединения и снижения его физиологической активности. Кроме того, оболочка носителя препятствует быстрой биологической деградации лекарства, обеспечивая более длительное его воздействие на организм, а также блокирует неспецифическое взаимодействие препарата со здоровыми тканями, снижая тем самым нежелательные побочные эффекты. Использование таких микрокоНтейнеров для доставки фармакологического агента в пораженный орган или ткань позволяет снизить действующую концентрацию препарата при сохранении его активности, что повышает общий терапевтический эффект.

В качестве носителей, обладающих требуемыми свойствами, могут быть использованы поверхностно-активные блок сополимеры оксида этилена (ПОЭ) и оксида пропилена (ПОП) с различной протяженностью гидрофильных и гидрофобных блоков в молекуле (полоксамеры или плюроники). Такие носители нетоксичны, устойчивы в биологических средах и образуют в водных растворах упорядоченные мицеллярные структуры. Плюроники способны хорошо солюбилизировать низкомолекулярные вещества и доставлять их в различные органы. Причем, используя полимеры с различным гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ), характеризующим полярность молекулы полоксамера и определяющимся соотношением вкладов полярного гидрофильного и неполярного липофильного блоков, можно добиться преимущественного накопления веществ в определенных тканях организма.

Особый интерес концепция мицеллярного контейнера как носителя физиологически активных соединений представляет для противоопухолевой терапии, поскольку эффективность лечения злокачественных порообразовании, в значительной мере, зависит от высоко специфического взаимодействия лекарства с опухолевыми клетками и отсутствия побочных эффектов от его введения.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение возможности использования различных плюроников в качеств^, микрэконтейнеров для осуществления транспорта противоопухолевые препаратов в организме, а также исследование физиологического и терапевтического действия новой формы лекарственных соединений на клеточном уровне и в условиях организма.

В качестве объектов исследования были выбраны плюроники с различной величиной гидрофильно-липофильного баланса (наименьшее численнсс значение величины ГЛБ соответствует наименее гидрофильному пол им еру V L-61 ("гидрофобная" группа, ГЛБ - 1-6), Р-85, L-64 ("промежуточная" группа, ГЛБ - 14-16), F-68, F-108 ("гидрофильная" группа, ГЛБ-27-31). В качестве лекарственных соединений использовались антибиотики антрациклинового ряда: дауномицин (ДМ), фармарубицин (ФР) и доксорубицин (ДР).

Первый этап исследований состоял в изучении влияния структуры полимерных носителей на их физиологическую активность in vitro (на клеточном уровне) и in vivo (в условиях организма) и определении . соответствия их критериям носителей физиологически активных соединений в организме; а также в получении токсикологических, фармакодинамических и фармакокинетических характеристик выбранных плюроников. Вторым этапом работы являлось исследование фармакодинамики (действия вещества на организм) и фармакокинетики (изменения во времени концентрации вещества и его метаболитов) мицеллярной формы противоопухолевых препаратов и изучение их эффективности на различных моделях раковых опухолей (на клеточных культурах и на мышах с привитыми опухолями).

Научная новизна и практическая ценность. В качестве системы доставки антрациклиновых антибиотиков впервые предложено использовать мицеллы амфифильиых трехблочных сополимеров оксида пропилена и ■ оксида этилена - плюроников Р-85 и L-61 ("мицеллярные контейнеры"). Показано, что солюбилизация антибиотиков в мицеллах плюроников приводит к экранированию лекарств от воздействия ферментов плазмы крови, препятствуя их быстрой биологической деградации, и замедляет вывод их из организма. Показано, что антибиотики, солюбилизированные в мицеллах плюроников Р-85 и L-61, обладают существенно меньшей миелотоксичностью (ингибирующим воздействием на клетки костного мозга - миелоциты, нарушающим процесс кроветворения), чем исходные лекарства и, в отличие от обычных антибиотиков, не вызывают лейкопении

(уменьшения количества лейкоцитов) у животных с привитыми опухолями. Включение препаратов в мицеллярный контейнер существенно снижает уровень содержания в кровотоке токсических метаболитов, являющихся главной причиной кардиотоксичности антрацнклиновых антибиотиков. Результаты исследования тканевого распределения препаратов в организме животных с привитыми опухолями свидетельствуют о том, что включение цитостатика в мицеллы плюроников приводит к его перераспределению из печени в опухолевые ткани. Терапия опухолей различной этиологии с использованием мицеллярной формы препаратов приводит к существенному увеличению средней продолжительности жизни экспериментальных животных и кардинальному снижению скорости роста опухолей по сравнению с действием исходных антибиотиков. Показана высокая эффективность мицеллярной формы противоопухолевых препаратов при лечении опухолей мышиной миеломы с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, которые не поддаются терапии обычными антибиотиками.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на IX Всесоюзном научном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звенигород, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (2 главы), постановки задачи, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы (185 наименований). Работа изложена на 143 страницах и включает 7 таблиц и 31 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Влияние структуры полимерных носителей на их физиологическую активность.

Существует большое количество плюроников, различающихся по физико-химическим свойствам, способных осуществлять доставку низкомолекулярных веществ в организме. Однако, наряду с повышением эффективности взаимодействия полимеров с биологическими мембранами, усиливается их токсическое воздействие на организм. Таким образом, полимерные носители для физиологически активных веществ должны отвечать ряду требований: быть нетоксичными и неиммуногенными, хорошо солюбилизировать низкомолекулярные соединения и обеспечивать их эффективную доставку через биологические мембраны в клетку.

В качестве носителей были выбраны плюроники, различающиеся по

величине ГЛБ (3-27) и молекулярному весу, физико-химические характеристики которых соответствовали требованиям экспериментов in vivo: низкие величины основных параметров мицеллообразования полимеров в водных растворах - критической концентрации (ККМ= 0,002 - 0,006% при 37° С) и критической температуры мицеллообразования (КТМ не выше 37° С), узкий диапазон распределения размеров мицелл (12-30 нм), высокая стабильность ассоциатов в широком диапазоне концентраций полимера, температуры и рН среды. Этим условиям удовлетворяли следующие полимеры: L-61 ("гидрофобная" группа), Р-85 ("промежуточная" группа), F-108 ("гидрофильная" группа).

В опытах на клеточных опухолевых культурах было показано, что солюбилиззг.ия различных низкомолекулярных веществ в мицеллах достаточно гидрофобных плюроников (Р-85) приводит к усилению проникновения внутрь клетки этих соединений, в обычном состоянии не способных проходить через клеточную мембрану.

Для исследования способности выбранных полимеров осуществлять доставку лекарственных соединений в различные органы и ткани был проведен эксперимент по изучению распределения трис -[(гидроксиметил) метил]аминометил тиоуреидилфлуоресцеина (трис-флуоресцеина или ТФ) в организме мышей. Детекция ТФ проводилась методом флуоресцентной микроскопии криосрезов органов мышей после введения в кровоток метки, солюбилизированной в мицеллах плюроников. Было показано, что степень сорбции метки в тканях животных коррелирует с величиной ГЛБ полимерного носителя: интенсивность флуоресценции ТФ значительно выше в случае использования гидрофобных плюроников (L-61, L-64) по сравнению с гидрофильными (F-68) (рис.1).

Ого связано, по-видимому, с тем, что мицеллы гидрофобных плюроников более эффективно удерживают флуоресцентную метку; а способность гидрофобных полимеров встраиваться в биологические мембраны обеспечивает попадание большего количества ТФ в клетку, по сравнению с меткой, вводимой в гидрофильных проксанолах.

Использование плюроников в качестве носителей физиологически активных веществ должно соответствовать требованиям низкой токсичности полимеров при введении их в организм. Для получения токсикологических " характеристик выбранных плюроников был проведен эксперимент по определению величин их LD 50 (дозы препарата, приводящей к гибели 50% животных в группе) и MTD (максимальной толерантной дозы, не приводящей к гибели животных).

Количественные характеристики токсичности плюроников, полученные из обсчета кривых выживаемости животных в зависимости от введенной дозы полимера, представлены в табл. 1.

Как и большинство водорастворимых плюроников, L-61, Р-85 и F-108 характеризуются низкой токсичностью (LD5o=0,8 г/кг для L-61 и Р-85

и 9 г/кт- для Р-108). Причем, в ряду выбранных полимерен, токсичность существенно снижается с увеличением значения ГЛБ и мо.1ек\ .ирного веса плюроника.

Таблица 1 Значение I.!) 50 п МТО для плюроников, рамичающпхея по величине Г.'11> и молекулярному весу.

Плюроник ППОЛПГ Мг ГЛБ Ш 50 М 1 1)

10% р-р мг/кг ж в М1 КГ Ж 8

Ь-61 9.1 , 2 000 3 790 100

Р-85 1 1 4 500 16 790 500

Р-108 1 4 14 000 27 9 000 5 000

х 200

Рис.1 Флуоресценция криосрезов образцов тканей легких мышей, обработанных "ГФ (5 мг/кг) в растворах различных плюроников (Л) в растворе трис-11С I буфера,

(Б) в 10% растворе Р-68, (В) в 10% растворе Ь-64, (Г) в 10% растворе Ь-61. Опираясь на полученные значения ЬБзо и МТО, в экспериментах на животных плюроники использовались в концентрациях на порядок болеенизких, чем величина их МТБ (до 1% раствора).

Достоверным показателем общего состояния организма при введении какого-либо физиологически активного агента в кровоток является динамика количества лейкоцитов, свидетельствующая об активизации или угнетении иммунитета под действием введенной субстанции. Поэтому, для подтверждения безвредности применения полимеров в используемых концентрациях был проведен эксперимент по определению динамики количества лейкоцитов в периферической крови мышей (рис.2).

лейкоциты х106/мл крови 241

20

16

12

8"

4"

0 -I---1- I-•-I- ----1---1

0 5 10 15 20 25 30

I, сутки

Рис.2. Динамика количества лейкоцитов в периферической крови мышей при в/в

введении: (1) физ. р-ра; (2) 1% р-ра плюроника Р-85. (Мыши линии С57В1аск/6, 6 особей на точку).

Как видно из рисунка, характер кривых динамики лейкоцитов как для физ. раствора так и для раствора полимера практически не различается, что свидетельствует об отсутствии токсического действия на организм растворов плюроников в низких концентрациях (до 1%).

Следовательно, по параметрам отсутствия токсичности и иммуногенности выбранные плюроники соответствуют критериям носителей физиологически активных веществ в организме.

Изучение физиологической активности мицеллярной формы противоопухолевых антибиотиков. Анализ нового лекарства или новой его формы должен давать ответ на два основных вопроса: является ли исследуемый препарат более эффективным по сравнению с уже использующимися лекарственными средствами,.и оказывает ли его введение побочное действие на организм.

В качестве исходного лекарственного соединения был использован противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда дауномицин (ДМ), а в качестве носителя - 1% раствор плюроника Р-85. Токсикологические характеристики ДМ в 0,9% растворе хлорида натрия (исходный антибиотик)

и 1% растворе плюроника Р-85 (мицеллярная форма антибиотика) представлены в табл.2.

Таблица 2. Токсикологические характеристики мицеллярной и исходной форм ДМ.

Препарат ЬР 50, мг/кг ж.в. МТБ, мг/кг ж.в.

ДМ в физ. р-ре ДМ в 1% р-ре Р-85 7 2,7 5 2

Из таблицы видно, что токсичность мицеллярной формы ДМ несколько увеличивается по отношению к исходному препарату. Это, по-видимому, связано с увеличением количества активного антибиотика в кровотоке за счет экранирования его в мицеллах полимера от воздействия ферментов плазмы. При введении животным одинакового количества ДМ в физ. растворе и растворе полимера, мицеллярная форма антибиотика действует на организм аналогично введению более высокой дозы исходного препарата. Обнаруженный эффект синергизма при совместном введении лекарства и полимера описан в ряде работ, в которых отмечается, что плюроники потенциируют действие лекарственных соединений на организм (повышение антибактериальной, противовирусной и противоопухолевой активности различных препаратов, вводимых животным в плюрониках Р-68 и Р-127).

Таким образом, за счет повышения эффективности мицеллярной формы препаратов, можно уменьшить вводимую дозу цитостатика, снизив, при этом, токсическое действие лекарства на организм?.! *

В ходе эксперимента было отмечено существенное запаздывание действия мицеллярной формы антибиотика по сравнению с исходным ДМ. Поэтому была исследована фармакодинамика различных форм антибиотика в дозах с одинаковым значением величины ЬО 50 (рис.3).

% продолжительности жизни животных

Рис.3. Фармакодинамика дауномицина при в/в введении в дозе, соответствующей 1*0 50: (1) ДМ в физ. р-ре (ЬЭ 50-7 мг/кг); (2) ДМ в 1% р-ре плюроника Р-85 (1Л) 50-2,7 мг/кг). (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

Было показано, что средняя продолжительность жизни животных с инъекциями мицеллярной формы ДМ возрастает на 22% по сравнению с выживаемостью животных, обработанных антибиотиком в физ. растворе. Более позднее действие мицеллярной формы препарата может быть обусловлено как экранированием лекарства в мицеллах плюроника, так и депонированием его в организме. Обнаруженный эффект свидетельствует о возможности пролонгированного действия мицеллярной формы антибиотиков в условиях организма.

Изучение состояния иммунного статуса организма при введении различных форм антрациклиновых антибиотиков, в частности, исследование динамики количества лейкоцитов в периферической крови экспериментальных животных показало значительные различия в реакции организма. Помимо обычного воздействия антибиотиков на динамику количества лейкоцитов, приводящего к обратимой лейкопении, ДМ, вводимый в растворе полимера, вызывал последующий обратимый лейкоцитоз (возрастание количества лейкоцитов) в периферической крови мышей (рис.4). Введение раствора плюроника контрольной группе не приводило к каким-либо изменениям количества лейкоцитов (рис.2).

лейкоциты х10 6/мл крови

I, сутки

Рис. 4. Динамика количества лейкоцитов в периферической крови мышей при в/в

введении: (1) ДМ в физ. р-ре; (2) ДМ в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей наточку, концентрация ДМ - 2 мг/кг).

Наблюдаемый лейкоцитоз, в данном случае, является нетривиальной реакцией организма на совместное введение полимера и лекарства и может быть следствием стимулирования иммунной системы мицеллярной формой препарата.

Одним из побочных действий антрациклиновых антибиотиков является миелосупрессия - повреждение клеток костного мозга (миелоцитов), приводящее к нарушению функции кроветворения. При исследовании степени повреждения миелоцитов под действием различных

форм антибиотиков было показано, что при введении животным ДМ в физ. растворе наблюдалось значительное подавление биосинтеза ДНК и снижение уровня репаративного синтеза ДНК в костном мозге мышей, тогда как инъекции животным мицеллярной формы антибиотика не оказывали заметного влияния на эти процессы (рис.5).

% биосинтеза ДНК

ir

% репаративного синтеза ДНК

100-

80-

60-

40- "«да?

20-

1

т

i

А

Б

Рис. 5. Интенсивность биосинтеза (А) и репаративного синтеза (Б) ДНК клеток

костного мозга мышей под действием дауномицина в течение 24 час при в/в введении: (1) ДМ в физ. р-ре; (2) ДМ в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва1Ь/С, б особей на точку, концентрация ДМ-2 мг/кг).

2

Миелопротекторный эффект плюроника Р-85 связа^-по-видимому, со сродством некоторых полоксамеров к определенным"- тканям. Так, гидрофильные плюроники F-108 и F-127 вызывают перераспределение полистироловых частиц из печени и селезенки в костный мозг и легкие. В случае с Р-85 происходит, по-видимому, перераспределение антибиотика из миелоцитов в другие ткани, что, в свою очередь, уменьшает токсическое воздействие цитостатика на костный мозг.

Таким образом, солюбилизация ДМ в мицеллах плюроника Р-85 увеличивает длительность воздействия лекарства на организм, повышает иммунитет животных, а также блокирует токсическое воздействие лекарства на костный мозг, повышая таким образом эффективность проводимой химиотерапии и уменьшая побочные эффекты.

Фармакокинетика различных форм антибиотиков в плазме крови.

Для изучения природы наблюдаемых различий в фармакодинамике свободной и мицеллярной форм антибиотиков было проведено исследование их фармакокинетики в плазме крови мышей с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На рис. 6 представлены фармакокинетические кривые для ДМ, вводимого в кровоток в физ. растворе и в растворе плюроника Р-85.

ДМ, мкг/200 мкл плазмы

2,5-1

2,СИ

Л

0,5-

1.5-

1,0-1

В

0,0

О 50 100 150 200 250 300 350

t, мин

Рис.6 Фармакокинетика дауномицина (ДМ) в плазме крови мышей при в/в введении: (I) ДМ в флз р-ре, (2) ДМ в I % р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии C57Black/6, 2 особи наточку; концентрация ДМ- 10 мг/кг).

В отличие от ДМ, имеющего традиционную экспоненциальную кривую выведения, фармакокинетика мицеллярной формы препарата представляет собой кривую с максимумом. Площадь под фармакокинетической кривой отражает количество антибиотика в кровотоке, т.о. уровень содержания мицеллярной формы ДМ в организме животных, по сравнению с исходным лекарством, выше на 40%. При этом, степень накопления в плазме даунорубицинола (основного метаболита ДМ) при инъекции цитостатика в растворе полимера снижается до 50%, по сравнению с количеством метаболита, образующегося при введении исходного препарата. Аналогичный характер фармакокинетической кривой наблюдался и при введении в кровоток ДМ в 0,5% растворе плюроника L-61. Замедленный метаболизм и клиренс антибиотика в кровотоке связаны, по-видимому, с достаточно прочным гидрофобным взаимодействием лекарства с мицеллярным носителем, которое изменяет как фармакодинамику, так и фармакокинегику цитостатика в организме.

Таким образом, солюбилизация антибиотиков в мицеллах полимеров позволяет экранировать лекарство от воздействия ферментов плазмы, препятствуя его быстрой биологической деградации, и замедляет его вывод из организма, обеспечивая, тем самым, пролонгирование его действия.

Фармакокинетика и распределение плюроников в организме. Нетрадиционный характер кривых выведения мицеллярных антибиотиков из плазмы крови обусловил необходимость исследования фармакокинетики самих полимеров. С этой целью меченные тритием

плюроники Ь-61, Р-85 и Р-108 вводили в кровоток мышей и исследовали их фармакокинетику в крови и различных органах.

Было показано, что фармакокинетика плюроников в сыворотке крови представляет собой кривую с затухающей амплитудой и увеличивающейся шириной пиков (рис.7).

t, час

Рис.7. Фармакокинетика плюроников, меченных тритием, в сыворотке крови мышей при в/в введении 1% р-ров с уд. радиоактивностью 2x107 СРМ/20 г ж в.: (1) плюроник F-108; (2) плюроник Р-85; (3) плюроник L-61. (Мыши линии Balb/C, 2 особи на точку).

Существуют определенные различия в характере кривых для полимеров с различной величиной ГЛБ и молекулярным весом: длительность выведения из крови гидрофильного плюроника F-108 (Мг 14000) составляет около 80 часов, тогда как, для более гидрофобных Р-85 (Мг 4500) и L-61(Mr 2000) эта величина равна 200-210 часам. Различаются также профили и количество пиков, соответствующих максимальному содержанию полимеров в крови: узкие и высокие пики для F-108 и более пологие и растянутые во времени пики для Р-85 и L-61. Отмеченные различия в фармакокинетике исследуемых плюроников связаны, по-видимому, с различной степенью сродства полимеров к биологическим мембранам: гидрофильный плюроник F-108 хуже взаимодействует с клеточными мембранами, чем более гидрофобные L-61 и Р-85, и, в результате, быстрее выводится из организма.

Следовательно, с уменьшением ГЛБ молекулы плюроников усиливается колебательный характер их фармакокинетических кривых и замедляется вывод полимеров из кровотока.

На рис.8 представлена кинетика выведения и распределение радиоактивно меченного плюроника Р-85 по различным органам мышей. Максимальное количество полимера сорбируется в печени и селезенке; в

и

небольших дозах плюроник также регистрируется в сердце, легких, почках и мозге. Время элиминирования полимера из организма измеряется несколькими неделями. Для фармакокинетикй плюроников в различных органах также сохраняется колебательный характер кривых выведения.

СРМ/10 мг ткани

Рис 8 Фармакокинетика меченного тритием плюроника Р-85 в органах мышей при в/в введении 1% р-ра с уд. радиоактивностью 2х107СРМ/20 г ж.в.: (1) мозг; (2) сердце; (3) легкие; (4) почки; (5) селезенка; (6) печень. (Мыши линии Balb/C, 2 особи на точку).

Сравнительный анализ фармакокинетических кривых плюроников с различной величиной ГЛБ показал, что экстремальный уровень содержания полимеров в органах и крови регистрируется в сходных временных интервалах (табл.3).

Таблица 3 Временные интервалы максимумов накопления плюроников с различной величиной ГЛБ в организме мышей.

Плюроник 1 пик . 2 пик 3 пик 4 пик 5 пик

F-108 30 мин 15,5 час 48 час - -

Н-85 1 час 15 час 50 час 75 час 120 час

L-61 1-3 час 18 час 48 час 75 час 125 час

Колебательный характер фармакокинетических кривых обусловлен, по-видимому, депонированием избыточного количества вводимого полимера в тканях или органах. Отмеченная синхронность сорбции плюроника различными органами и обратного выведения его в кровоток связана с определенными регуляторными функциями организма и требует дальнейшего изучения.

Наряду с исследованием фармакокинетики плюроников в крови и органах, представлялось важным изучить степень сорбции и кинетику полимеров в опухолевых тканях. Известно, что некоторые плюроники (Р-68, Г-108, И-127) обладгют определенной противовоспалительной и противоопухолевой активностью. Эффективность действия плюроников на опухоли зависит, в основном, от количества полимера, сорбирующегося в опухолевых тканях, а также от длительности его сорбции.

С помощью радиоизотопного исследования было показано, что длительность сорбции плюроников Р-85 и Ь-61 в опухоли составляет 250-300 часов, а их содержание в опухолевых тканях сравнимо по величине с уровнем накопления полимеров в печени (рис.9).

% от введенной дозы радиоактивности

. - - 0 50 100 150 200 250

" 1, час

Рис.9. Фармакокинетика меченного тритием плюроника Р-85 в органах мышей с привитой мышиной миеломой 5Р2/0 при в/в введении 1% р-ра с удельной радиоактивностью 4x10 СРМ/20 г ж.в : (1) печень; (2) опухоль. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

Колебательный характер кривой выведения плюроников из опухоли аналогичен фармакокинетике полимеров в других органах и тканях.

Было также обнаружено, что введение мышам с привитыми опухолями 1% раствора плюроника Р-85 оказывает небольшой терапевтический эффект.

Таким образом, фармакокинетика изучаемых полимеров в организме животных имеет нехарактерный вид колебательных кривых с синхронной сорбцией и обратным выведением в кровоток плюроников из различных органов и тканей. Изучаемые полоксамеры хорошо сорбируются различными органами, в том числе, опухолями, причем, длительность сорбции увеличивается с ростом гидрофобности полимера. Кроме того, выбранные плюроники обладают также некоторой противоопухолевой активностью,что также обусловливает возможность их использования в качестве носителей лекарств в организме.

Противоопухолевое действие антибиотиков, солюбилизированных в мицеллах плюроников.

В настоящее время использование полоксамеров в качестве носителей в противоопухолевой терапии сводится, в основном, к применению гидрофильного плюроника Е-127. Причем, введение цитостатиков в организм осуществляется в полимерном растворе, который при температуре тела (37"С) превращается в структурированный гель. Терапевтический эффект антибиотика лимитируется скоростью выхода лекарства из массы геля. Однако, использование гелевых лекарственных форм для терапии различных видов опухолевых заболеваний часто оказывается неэффективно, так как многие опухоли (в том числе, твердые новообразования - солиды) недоступны для структурированных гелей. Поэтому, использование концепции "мицеллярного контейнера" представляет большой интерес для лечения опухолей различной этиологии.

Для изучения противоопухолевого действия различных форм антибиотиков в организме были использованы две модели раковых опухолей: асцитная (опухолевые клетки накапливаются в брюшине в виде жидкости - выпота) и солидная (опухолевые клетки локализуются под кожей в виде твердого новообразования - солида).

Для получения асцитной модели мышам внутрибрюшинно (в/б) прививали клетки мышиного моноцитоидного лейкоза Р388, вызывая образование внутрибрюшинного экссудата (асцита). Терапия опухолей проводилась однократной инъекцией антибиотика через сутки после привития "Лейкоза. Эффективность действия препаратов оценивалась по величине средйей продолжительности жизни животных в экспериментальной группе, отнесенное к величине продолжительности жизни контрольной группы нелеченных животных (принятой за 100%), в зависимости от введенной дозы лекарства.'

Концентрационная зависимость продолжительности жизни экспериментальных животных имеет традиционный вид кривой распределения, где максимальному значению продолжительности жизни соответствует оптимальная концентрация введенного лекарства. При этом, увеличение или уменьшение дозы препарата приводит к снижению величины продолжительности жизни: при низких концентрациях антибиотик оказывает недостаточное воздействие на рост опухоли, а при высоких концентрациях препарат становится токсичным. Уменьшение концентрации вводимого препарата за счет повышения его эффективности позволяет повысить терапевтический эффект при одновременном снижении общей токсичности.

На примере асцитной модели раковой опухоли было показано, что, даже при небольшом снижении продолжительности жизни животных, эффективная концентрация мицеллярной формы фармарубицина (ФР) уменьшалась в 3 раза, по сравнению с вводимой дозой-исходного препарата,

демонстрируя, тем самым, усиление противоопухолевой активности антибиотика, солюбилизированного в мицеллах плюроника Р-85 (рис. 10).

%, продолжительность жизни

[ФР], мг/кг

Рис. 10. Противоопухолевая активность фармарубицина на мышах с привитыми асцитными опухолями мышиного моноцитоидного лейкоза Р388 при в/в введении : (1) ФР в физ. р-ре; (2) ФР в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва!Ь/С, 6 особей на точку).

Для получения солидной модели раковых опухолей мышам подкожно (п/к) прививали клетки мышиной миеломы 8Р2/0, вызывая рост под кожей твердею злокачественного новообразования (солида). Терапия опухолей проводилась трехкратной инъекцией антибиотика через определенные промежутки времени (в 0, 4 и 8 -е сутки) на мышах с уже сформировавшимися солидами. Эффективность противоопухолевых препаратов оценивалась по скорости роста солидов (У/Уо, где V - средний объем опухолей в группе в процессе эксперимента; У0 - первоначальный средний объем опухолей в группе перед началом терапии) и величине средней продолжительности жизни животных. (Расчет величины объема опухоли проводили по формуле: У= 'Л ЬШ2, где Ь - больший диаметр, аШ-меньший диаметр опухоли).

Было показано, что действие мицеллярной формы ФР (в отличие от ФР в физ. растворе) приводит к почти полному прекращению роста опухолей; при этом, разница в размерах солидов у животных, получавших терапию различными формами антибиотиков, через 3 недели после начала лечения достигала более двух порядков (рис.11).

Продолжительность жизни животных в группах, получавших инъекции ФР в оптимальной дозе (7,5 мг/кг ж.в.), в случае мицеллярной формы препарата на 55% выше по отношению к исходному антибиотику (рис.12).

Аналогичные исследования терапевтической • эффективности мицеллярных форм препаратов на твердых (солидных) опухолях были

выполнены с использованием другого антибиотика антрациклинового ряда -доксорубицина (ДР), вводимого в кровоток в растворах гидрофобного (Ь-61) и гидрофильного (Р-108) плюроников.

I, сутки

Рис. 11. Динамика роста солидных опухолей у мышей с привитой мышиной миеломой БР 2/0 при терапии фармарубицином в концентрации 7,5 мг/кг: (1) физ. р-р (контроль); (2) ФР в физ. р-ре; (3) ФР в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

%, продолжительность жизни

[ФР], мг/кг

Рис. 12. Противоопухолевая активность фармарубицина на мышах с привитыми

опухолями мышиной миеломы 5Р 2/0 при в/в введении: (1) ФР в физ. р-ре; (2) ФР в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

Было показано, . что, при использовании в качестве носителя плюроника Ь-61 (как и в случае с Р-85), терапевтическая эффективность мицеллярной формы ДР увеличивается на два порядка по сравнению с

исходным препаратом, приводя к почти полному торможению развития опухолей и увеличивая продолжительность жизни экспериментальных животных на 22% (рис.13).

I, сутки

Рис.13. Динамика роста солидных опухолей у мышей с привитой мышиной миеломой ЭР 2/0 при терапии доксорубицином в концентрации 2,5 мг/кг: (1) физ. р-р (контроль); (2) ДР в физ р-ре; (3) ДР в 0,25% р-ре плюроннка Ь-61. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку). __

В отличие от плюроников Ь-61 и Р-85, терапевтическая эффективность ДР, солюбилизированного в мицеллах гидрофильного полимера (10% Е-108), оказалась не столь высока (рис.14).

I, сутки

Рис.14. Динамика роста солидных опухолей у мышей с привитой мышиной миеломой БР 2/0 при терапии доксорубицином в оптимальной концентрации препарата:

(1) физ. р-р (контроль); (2) ДР в физ. р-ре (ДР- 2 мг/кг), (3) ДР в 10% р-ре плюроника И-108 (ДР- 5 мг/кг). (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

Это может быть связано с недостаточно эффективной солюбилизацией антибиотика мицеллами гидрофильного плюроника, а также более слабым взаимодействием полимера с мембранами опухолевых клеток.

Для мицеллярного препарата наблюдался сдвиг максимума кривой продолжительности жизни мышей в сторону увеличения концентрации антибиотика, что свидетельствует о снижении токсичности мицеллярной формы ДР по отношению к исходной. Относительное увеличение продолжительности жизни животных, получавших инъекции мицеллярной формы препарата, составляет 27%.

Для изучения природы высокой терапевтической эффективности антибиотиков, солюбилизированных в мицеллах гидрофобных плюроников (Ь-61, Р-85), методом ВЭЖХ было проведено сравнительное исследование содержания ДМ в печени и солидной опухоли мышей с привитой мышиной миеломой БР 2/0 при в/в введении различных форм препарата.

Было показано, что при введении ДМ в растворе плюроника Р-85 происходит перераспределение цитосгатика из печени в опухоль (рис.15).

[ДМ], мкг/10 мгткани 0,16-|

0,12

0,08-

0,04

0,00

1 2 ДМ в физ. р-ре

1 2 ДМ в 1% р-ре Р-85

Рис.15. Содержание дауномицина в органах мышей через 24 часа после в/в введения антибиотика в физ. р-ре и в 1% р-ре плюроника Р-85: (1) в печени; (2) в опухоли. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей наточку).

Таким образом, повышение действующей концентрации антибиотика в опухоли с одновременным уменьшением его содержания в печени, по-видимому, и обеспечивает высокую терапевтическую эффективность

мицеллярной формы препарата параллельно со снижением его общей токсичности.

Этот вывод подтверждается также исследованием динамики количества лейкоцитов у мышей с привитыми подкожными опухолями миеломы БР 2/0, получавших терапию различными формами препарата. Было показано, что, в отличие от действия исходпого антибиотика, вызывающего значительную лейкопению на фоне общего лейкоцитоза (развитие опухоли в организме сопровождается повышением количества лейкоцитов), введение животным мицеллярной формы ДР практически не изменяло лейкоцитарную динамику на протяжении всего эксперимента (рис.16).

в

лейкоциты х 10 /мл

1, сутки

Рис 16 Динамика количества лейкоцитов в периферической крови мышей с

привитыми солидными опухолями мышиной миеломы 5Р 2/0 при в/в введении (1) физ. р-ра, (2) ДР в физ. р-ре; (3) ДР в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва!Ь/С, 6 особей на точку; концентрация ДР-7,5 мг/кг ж.в ).

Это свидетельствует об эффективности лечения животных с привитыми опухолями мицеллярной формой антибиотика и отражает процесс стабилизации иммунного статуса организма, обеспечивающий длительную ремиссию заболевания.

Использование цитостатиков. солюбилизированных в мицеллах

плюроников, для лечения резистентных раковых опухолей. Мицеллярная форма противоопухолевых антибиотиков представляет большой интерес в области терапии резистентных (устойчивых) злокачественных опухолей, в большинстве .случаев, не поддающихся излечению обычными формами цитостатиков. Механизм резистентности, в данном случае, обусловлен гиперэкспрессией трансмембранного белка вР-

170, выполняющего роль молекулярного "насоса" и ответственного за выброс лекарств из клетки. При этом, селекция опухолевых клеток на устойчивость к определенному цитотоксическому агенту приводит к развитию резистентности к широкому ряду структурно и функционально несхожих лекарственных соединений, то есть, возникает эффект множественной лекарственной устойчивости (MDR).

Опухолевые клетки с MDR-фенотипом существенно отличаются от исходных штаммов по морфологическим и биохимическим признакам, демонстрируя пониженный уровень накопления цитостатиков в процессе химиотерапии. Таким образом, одним из возможных путей преодоления селектированной резистентности опухолевых штаммов является блокирование работы GP-170 и, как следствие, увеличение содержания антибиотика в устойчивых раковых клетках до уровня, необходимого для их разрушения. Механизм действия большинства соединений, способных обращать резистентность MDR-сублиний, заключается либо в непосредственном связывании с GP-170 с последующим ингибированием его активности, либо в опосредованном действии на механизмы клеточной регуляции.

Исследование эффективности действия мицеллярной формы лекарств на резистентные раковые опухоли проводилось на клетках (in vitro) и на животных (in vivo). В экспериментах in vitro были использованы чувствительные (SKOV3) клетки карциномы яичника человека и, полученные из них селекцией на устойчивость к действию ДМ, резистентные субяшши (SKVLB).

Для обеих клеточных линий были получены кривые выживаемости при инкубации их со свободным и мицеллярным (в 1% растворе плюроника Р-85) антибиотиками.

В табл.4 представлены величины IC50 (количество препарата, при внесении которого погибает 50% клеточной популяции), полученные из обсчета кривых выживаемости, для чувствительных и резистентных клеточных линий, обработанных различными формами фармарубицина (ФР) и дауномицина (ДМ).

Таблица 4. Величины Ю50 для клеточных линий ЗКОУЗ и БКУЬВ при обработке их исходной (И) и мицеллярной (М) формами ФР и ДМ.

1С50, мкг/мл

Антибиотики SKOV3 (чувств.) SKVLB (резист.)

и М И М

ФР 4,0 1,1 70,0 7,0

ДМ 0,4 0,13 3,3 0,72

Было показано, что цитотоксическая активность мицеллярной формы препаратов увеличивается, по сравнению с исходным цитостатиком, в 3 раза

на чувствительных клетках для обоих антибиотиков и в 5 и 10 раз на резистентных клетках для ДМ и ФР, соответственно. Таким образом, солюбилизация препаратов в мицеллах плюроника Р-85 позволяет лекарствам воздействовать на резистентные клеточные линии с такой же эффективностью, как и на чувствительные.

Аналогичные исследования были проведены с использованием ДМ, солюбилизированного в гидрофобном (L-61) и гидрофильном (F-108) полимерах. Было показано, что обработка резистентных линий карциномы SKVLB дауном ицином в 0,12% растворе плюроника L-61 приводит к снижению их устойчивости к действию лекарства до уровня чувствительных линий SKOV3; тогда как использование ДМ в 1% растворе F-108 не вызывает эффекта "обращения" резистентности устойчивых раковых клеток.

Исследование противоопухолевой активности исходной и мицеллярной форм антрациклиновых антибиотиков против резистентных раковых новообразований in vivo проводили на мышах с привитыми солидными опухолями резистентной формы мышиной миеломы SP 2/0 (резист.), селектированными на устойчивость к действию ДМ (рис. 17).

V/V

о

1, сутки

Рис.17. Динамика роста солидных опухолей у мышей с привитой мышиной миеломой БР 2/0 (резист.) при в/в введении: (1) физ. р-ра (контроль), (2) ФР в физ. р-ре; (3) ФР в 1% р-ре плюроника Р-85. (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особен на точку, концентрацияФР-Ю мг/кг).

Было показано, что лечение животных с резистентной формой миеломы обычным антибиотиком не только не оказывает цитотоксического действия на опухоли, но даже усиливает их рост. Вероятно, это происходит вследствие изменения механизма транспорта лекарства через клеточные мембраны. Обычно, антрациклиновые антибиотики проникают в клетки

путем пассивной диффузии (растворяясь в клеточной мембране). В случае резистентных опухолевых линий,

цитостатик, попадающий в мембрану, связывается с трансмембранным белком-переносчиком вР-ПО и выбрасывается из клетки, не успевая на нее подействовать. Отсутствие противоопухолевого эффекта от введенного антибиотика и воздействие его на здоровые ткани приводит, таким образом, к стимулированию роста опухоли.

В то же время, ФР, вводимый животным в 1% растворе плюроника Р-85, существенно снижает интенсивность развития раковых опухолей. Действие мицеллярной формы препарата на резистентные опухолевые клетки может происходить по двум направлениям: полимерный носитель связывается с поверхностными доменами белка ОР-ПО на внешней стороне клеточной мембраны, ингибируя его ферментативную активность, а антибиотик, проникая в клетку путем жидкофазного эндоцитоза (внутри мицеллярного контейнера) или обычной диффузией, воздействует на ДНК опухолевой клетки, приводя к ее разрушению.

Аналогичные исследования были проведены на мышах с привитыми резистентными опухолями мышиного моноцитоидного лейкоза Р388.

Следовательно, солюбилизация цитостатика в мицеллах плюроника Р-85 качественно изменяет характер воздействия антибиотика на резистентную опухоль, приводя к замедлению ее развития на уровне организма.

Использование в качестве мицеллярного "контейнера" более гидрофобного (по сравнению с Р-85) плюроника Ь-61 увеличивает противоопухолевую активность^антрациклиновых антибиотиков при терапии резистентных форм раковых заболеваний (рис.18).

УЛ/„

80-,

Рис.18. Динамика роста солидных опухолей у мышей с привитой мышиной миеломой 5Р 2/0 (резист.) при терапии доксорубицином (5 мг/кг ж.в ): (1) физ. р-р (контроль); (2) ДР в физ. р-ре; (3) ДР в 0,5% р-ре плюроника Ь-61 (Мыши линии Ва1Ь/С, 6 особей на точку).

Введение экспериментальным животным ДР в 0,5% растворе плюроника Ь-61 приводит к изменению характера кривых роста солидных опухолей: максимальная противоопухолевая активность мицеллярной формы антибиотика развивается только на 18-20 день после начала терапии. Продолжительность жизни животных, при этом, увеличивается на 17%.

Необычный характер динамики роста опухолей может быть обусловлен тем, что плюроникЬ-61 более эффективно (по сравнению с Р-85) удерживает солюбилнзированный в его мицеллах антибиотик, что приводит к пролонгированию действия лекарства на раковую опухоль.

Таким образом, использование в терапии резистентных раковых опухолей достаточно гидрофобных плюроников (Ь-61, Р-85) в качестве носителей антрациклиновых антибиотиков приводит к ряду положительных эффектов: повышению физиологической активности лекарства, экранированию его от воздействия ферментов плазмы и пролонгации его действия на опухоль. Мицеллярная оболочка микрокоитейнера блокирует неспецифическое взаимодействие лекарства со здоровыми тканями, снижая общую токсичность препарата, а также изменяет характер действия антибиотиков на устойчивую форму раковых опухолей. При этом, цитостатик, солюбилнзированный в мицеллах полимера, не распознается трансмембранным эффлюксным белком СР-170 и не выбрасывается из клетки. По достижении пороговой концентрации в клетке антибиотик эффективно действует на резистентную опухоль точно так же, как и на чувствительную. То есть, наблюдается эффект "обращения" резистентности, дающий возможность проводить успешную терапию неизлечимых ранее раковых заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. В качестве системы доставки антрациклиновых антибиотиков впервые предложено использовать мицеллы амфифильных трехблочных сополимеров оксида пропилена и оксида этилена - плюроников Р-85 и Ь-61 ("мицеллярные контейнеры").

2. Показано, что солюбилизация антибиотиков в мицеллах плюроников Р-85 и Ь-61 приводит к экранированию препаратов от воздействия ферментов плазмы крови, препятствуя быстрой биологической деградации лекарства, и замедляет их вывод из организма.

3. Исследованием токсикологических характеристик мицеллярных форм препаратов показано, что антибиотики, солюбилизированные в мицеллах плюроников Р-85 и Ь-61, обладают существенно меньшей миелотоксичностыо, чем исходные лекарства и, в отличие от обычных антибиотиков, не вызывают лейкопении в организме животных с привитыми опухолями.

4. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показано, что включение препаратов в мицеллярный контейнер существенно снижает уровень содержания в кровотоке токсических метаболитов, являющихся главной причиной кардиотоксичности антрациклиновых антибиотиков. Результаты исследования тканевого распределения различных форм препаратов в организме животных с привитыми опухолями свидетельствуют о том, что включение цитостатика в мицеллярный контейнер приводит к его перераспределению из печени в опухолевые ткани.

5. Исследованием противоопухолевой активности антибиотиков, солюбилизированных в мицеллах плюроников Р-85 и L-61, продемонстрировано, что терапия опухолей различной этиологии мицеллярной формой препаратов приводит к существенному увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных и кардинальному снижению скорости роста опухолей, по сравнению с действием исходных лекарств.

6. Показана высокая эффективность мицеллярной формы противоопухолевых препаратов при лечении опухолей мышиной миеломы с эффектом множественной лекарственной устойчивости, которые практически не поддаются лечению обычными антибиотиками.

Основные результаты диссертационной работы Дородных Т.Ю. изложены в следующих публикациях:

1. Батракова~£,В:лДородных Т.Ю., Федосеев Н.А. "Использование макромолекул для систем направленного транспорта физиологически активных веществ из кровотока в мозг". Тезисы докладов IX Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения", 1991, Звенигород.

2. A.V. Kabanov, E.V. Batrakova, N.S. Melik-Nubarov, N.A. Fedoseev, T.Yu. Dorodnich, V.Yu. Alachov, V.P. Chekhonin, I.R. Nazarova and V.A. Kabanov. A new class of drug carriers: micelles of poly(oxyethylene)-poly (oxypropylene) block copolymers as microcontainers for drug targeting from blood in brain. -J. Control!. Release, 22 (1992) 141-158.

3. Alakhov, V.Yu., Batrakova, E.V., Dorodnich, T.Yu., Li, S., Venne, A. and Kabanov, A.V, Block Copolymeric Drug Cariers: 1. Delivery of Antineoplastic Drugs. Abstract of 1 si International Symposium on Polymer Therapeutics, London, January 1996.

4. Batrakova, E.V., Dorodnich, T.Yu., Klinskii, E.Yu., Kliushnenkova, E.N., Shemchukova, O.B., Arjakov, S.A., Alakhov, V.Yu., and Kabanov, A.V. Antliracycline antibiotics non-covalently incorporated into micelles of pluronic block copolymers: in vivo activity against drug sensitive and resistant tumors. Br. J. Cancer, 1996, in press.