Взаимодействие полиалкиленоксидов с компонентами клеточных мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

□ОЗОБЗОЭ2

ЖИРНОВ Артём Евгеньевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИАЛКИЛЕНОКСИДОВ С КОМПОНЕНТАМИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

02.00.06 - высокомолекулярные соединения по химическим наукам 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА-2007

003053092

Работа выполнена в лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук

Гроздова Ирина Дмитриевна кандидат химических наук Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович доктор биологических наук, профессор Рубцов Александр Михайлович

Ведущая организация: Институт синтетических полимерных

материалов РАН им. Н.С. Ениколопова

Защита состоится 28 февраля 2007 г. в ¿4 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу. 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан января 2007 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, к.х.н. Долгова А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Амфифильные полиалкиленоксиды, в частности, блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) состава (ЭО)п/2(ПО)т(ЭО)пл, называемые также плюрониками, являются нетоксичными поверхностно-активными веществами и известны своими фармакологическими свойствами. В начале 90х годов прошлого века было обнаружено, что они способны устранять проявления синдрома множественной лекарственной устойчивости (ШЖ), возникающего при длительной химиотерапии рака и являющегося большим препятствием на пути эффективного лечения опухолей. В последующие годы был подобран оптимальный состав активной полимерной композиции, и препарат, полученный на её основе, в настоящее время проходит клинические испытания. Вместе с тем, обширные данные литературы по механизму такого воздействия плюроников носят косвенный характер. В связи с этим представляются актуальными прямые исследования взаимодействия плюроников и других полиалкиленоксидов с клетками и выявление клеточных компонентов, ответственных за вызываемые полимерами эффекты.

Целью работы являлось изучение локализации блок-сополимеров при их связывании с клетками, выявление компонентов биологических мембран, непосредственно взаимодействующих с сополимерами, и анализ зависимости влияния сополимера от липидного состава мембран.

Научная новизна. В работе впервые показано, что двублочный сополимер ЭО и ПО и его аминопроизводные способны эффективно уменьшать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Установлено, что при связывании с клетками, сополимер локализуется на внешней стороне плазматической мембраны. С использованием сополимера, содержащего фотоактиви-руемую группу, показано, что при связывании с клеткой он находится в липид-ном окружении, связывание с каким-либо из мембранных белков не обнаружено. Впервые установлено, что при большей степени связывания с липосомами двублочный сополимер оказывает меньшее влияние на их проницаемость по отношению к доксорубицину по сравнению с трёхблочным. Впервые установлено, что с увеличением микровязкости бислоя влияние плюроника на проницаемость липосом уменьшается. На примере холестерин-лецитиновых липосом показано, что степень влияния на проницаемость одной связанной с бислоем макромолекулы не зависит от содержания холестерина.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют значение для понимания молекулярного механизма взаимодействия плюроников с клеточными мембранами и потому могут служить основой для практического использования существующих сополимеров и создания на основе сополимеров новых лекарственных форм, обладающих повышенной терапевтической активностью.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на III Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2004», Москва, 2004 год; на Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-2005" (секция «Радиохимия»), Москва, 2005 год; на совместном 30ом конгрессе Европейской федерации биохимических обществ (FEBS) и 9ой конференции Международного союза биохимии и прикладной биологии (IUBMB), Будапешт, Венгрия, 2005 год; на совместном Европейском биофизическом конгрессе (15™ Международного союза чистой и прикладной биофизики (IIIPAB) и 50м Европейской ассоциации биофизических обществ (EBSA)), Монпелье, Франция, 2005 год; на II Конференции молодых учёных «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, 2006 год; на Первом Европейском химическом конгрессе, Будапешт, Венгрия, 2006 год.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи и 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 269 ссылок. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 7 таблиц.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны её цели.

Обзор литературы содержит анализ имеющихся сведений о физико-химических свойствах плюроников, их физиологической активности и взаимодействии с компонентами биологических мембран. Также даётся обзор сведений о структуре и свойствах биологических мембран и их отдельных компонентов. Особое внимание уделено явлению лекарственной устойчивости опухолей и влиянию на неё плюроников. В обзоре также описаны методы определения полиалкиленоксидов в присутствии липидов и использования фотоакти-вируемых меток для изучения близких взаимодействий.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе были использованы блок-сополимеры этиленоксида и пропиле-ноксида: трёхблочный плюроник L61 (НО(ЭО)2(ПО)з0(ЭО)2Н) и двублочный REP (НО(ПО)19(ЭО)г4СНз). Полимеры были охарактеризованы методами гель-проникающей хроматографии и ИК-спектроскопии. С использованием этилен-диамина и цианурхлорида или карбонилдиимидазола получены аминопроиз-водные REP-NH2. Методом термической активации трития были получены препараты 3H-L61 и 3H-REP-NH2. Была проведена модификация REP-NH2 флуоресцентной 7-нитробензоксидиазольной меткой и получен препарат REP-

NBD. С использованием N-гидроксисукцинимидного эфира пара-1-трифторметилдиазиринилбензойной кислоты бьш получен изотопно меченный препарат 3H-REP-TMD, содержащий фотоактивируемую группу.

В работе были использованы следующие клетки: лимфоциты периферической крови человека, клетки эритролейкемии человека К562 и сублинии устойчивых (MDR) клеток K562/DOX и K562iS9, клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF7 и их MDR-сублиния MCF7/R.

Моноламеллярные липосомы получали из яичного лецитина или смеси лецитина с другим природным липидом обработкой ультразвуком суспензии мультиламеллярных везикул, средний гидродинамический диаметр липосом составлял около 100 нм.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Свойства двублочного сополимера этиленоксида и пропиленоксида REP

Взаимодействие полиалкиленоксидов с природными и модельными мембранами исследовали с использованием полимеров, содержавших радиоактивную или флуоресцентную метки. В качестве модельного полимера был взят двублочный сополимер ЭО и ПО - REP, содержащий реакционно-способную ОН-группу на свободном конце гидрофобного (ШЮ) блока. На предварительном этапе работы был проведён анализ структуры коммерческого препарата REP и его влияния на клетки.

Мы сравнивали характеристики REP и хорошо изученного плюроника L61, имеющих близкие значения молекулярных масс (около 2000). Значения ККМ сополимеров оказались близки (37 мкМ и 110 мкМ соответственно, при 37°С). Для сравнения гидрофобности были определены коэффициенты их распределения между водой и гексаном РгеКсан/вода- Значение lgPreKcaH/Braa для REP составляло -0,95±0,02, а для L61 ^«кал/вода= -0,24±0,04. Таким образом, гидрофобность как REP, так и L61 невелика. Введение аминогруппы в молекулу REP снижало значение lgPrevcaH/wvia до -2,21±0,11, что указывало на значительное увеличение гидрофильности полимера при такой модификации. Различие в гидрофобности между REP и L61 может быть объяснено их различным строением и содержанием ЭО. Двублочный REP содержал 48%, а трёхблочный плюроник L61 только 10% звеньев ЭО по массе.

Влияние REP на клетки. Как известно, для плюроников характерна сравнительно низкая цитотоксичность и способность уменьшать устойчивость MDR-клеток. Цитотоксичность REP и его аминопроизводного REP-NH2 была изучена на пяти линиях клеток. Показателем токсичности служила максимальная концентрация полимера, при которой выживало 80 - 100% клеток. Токсичность REP для клеток практически не зависела от их устойчивости к лекарствам. Для линии клеток К562 и её устойчивых сублиний она составляла 90 мкМ. Не изменялась токсичность сополимера и при его модификации аминогруппой. Плюроник L61, один из наиболее эффективных в преодолении MDR, более ток-

5

сичен: клетки К562 выдерживают его в концентрации не более 15 - 20 мкМ, то есть в 6 раз меньшей, чем REP и его аминопроизводные. Это свидетельствует о низкой токсичности двублочного сополимера. Аналогичные результаты были получены и для клеток MCF7 и MCF7/R.

Способность полимеров обращать устойчивость опухолевых клеток оценивали по их влиянию на цитотоксичность противоопухолевого антибиотика доксорубицина (DOX). Добавление 0,8±0,1 мкг/мл DOX к клеткам К562 приводило к гибели половины клеточной популяции. В случае клеток K562iS9 для этого требовалась концентрация DOX почти на порядок выше - 6,4 - 6,8 мкг/мл. 90 мкМ REP-NH2 снижал токсичную концентрацию DOX до 2,1 мкг/мл. Так же действовал и немодифицированный REP в своей максимальной нетоксичной концентрации. Аналогичным образом действовали REP и REP-NH2 и на MDR-клетки другой линии - MCF7/R. При этом полимеры не изменяли токсичность DOX для чувствительных клеток. Эффект REP сопоставим с влиянием трёх-блочных плюроников. Так, добавление 17мкМ плюроника L61 к клеткам K562/DOX приводило к снижению токсичной концентрации DOX в 3 раза.

Примечательно, что введение аминогруппы в молекулу REP не вызывало значительных изменений цитотоксичности полимера и его способности уменьшать устойчивость MDR-клеток. Несмотря на значительное увеличение гидрофильное™, REP-NH2 эффективно связывался с клетками и оказывал на них такой же эффект, как REP.

Таким образом, REP и его аминопроизводные обладают сравнительно низкой цитотоксичностью и способностью восстанавливать чувствительность MDR-клеток к DOX, т.е. они проявляют основные функциональные свойства плюроников.

2. Взаимодействие блок-сополимеров с клетками

2.1. Связывание REP с клетками разного типа

Способность REP и REP-NH2 блокировать систему защиты MDR-клеток от антибиотика косвенным образом указывала на связывание полимеров с клетками. Для количественной оценки этого процесса в REP-NH2 был введён тритий и изучено связывание 3H-REP-NH2 с различными типами клеток.

Клетки инкубировали с полимером, добавленным в разной концентрации, и после удаления неприсоединившегося полимера измеряли их радиоактивность. Зависимость количества связанного полимера от концентрации добавленного носило линейный характер и не достигала насыщения (рис. 1). Это свидетельствует о большом количестве центров связывания полимера клетками. В то же время доля связанного полимера невелика - десятые доли процента (в расчёте на 1 млн. лимфоцитов в мл), что указывает на низкое сродство полимера к клеточной мембране. Большое количество мест связывания и слабое сродство характерно для неспецифического связывания.

Рис. 1. Зависимость количества 3Н-ИЕР->Щ2, связавшегося с лимфоцитами человека (в расчёте на миллион клеток), от концентрации добавленного сополимера. 3Н-КЕР-ЫНг инкубировали с 3-4 млн. лимфоцитов в течение 2 ч в 1 мл среды ИРМ1 1640, 10 мМ НЕРЕБ, при 37 °С.

Таблица 1

Связывание REP-NH2 с клетками, пмоль/(мкМ*млн.клеток)

Температура Лимфоциты К562 K562iS9 MCF7 MCF7/R

37°С 0,85±0,06 6,15±0,37 7,1±0,5 6,1±0,4 8,8±0,3

4°С Нет данных 3,2±0,6 3,4±0,6 1,52±0,14 2,71±0,14

На рис. 1 приведены результаты эксперимента с нормальными клетками -лимфоцитами крови человека. Аналогичные зависимости были получены на 4 линиях опухолевых клеток, чувствительных и устойчивых. Тангенс угла наклона полученных прямых использовали для количественной оценки связывания полимеров с клетками (табл. 1). Оказалось, что суспензионные К562 и прикрепляющиеся MCF7 чувствительные клетки связывают одинаковое количество REP-NH2. Соответствующие им устойчивые линии клеток связывали несколько большие количества полимера, хотя различие между чувствительными и устойчивыми линиями клеток невелико. Интересно, что нормальные лимфоциты крови человека связывали на порядок меньше полимера. Такие же закономерности ранее были обнаружены при связывании плюроника L61.

Связывание REP-NH2 с клетками зависело от температуры инкубации. При 4°С связывание REP-NH2 с клетками К562 и K562iS9 снижалось в 2 раза, а с MCF7 и MCF7/R - в 3-4 раза по сравнению со связыванием при 37°С (табл. 1). Аналогичный эффект наблюдали ранее и для плюроников. Можно было предположить, что большое количество связанного полимера, обнаруживаемое при 37°С, может быть обусловлено его накоплением внутри клетки, например, путём эндоцитоза. Этот процесс активно протекает в клетке при 37°С, но в значительной степени ослаблен при 4°С. Поэтому результаты анализа при 4°С отражают связывание полимера только на клеточной поверхности, тогда как при 37°С регистрируется суммарное количество полимера внутри и вне клеток.

Такое объяснение температурной зависимости правомочно лишь в том случае, если полимер способен проникать внутрь клетки при 37°С. Выяснение

7

Концентрация полимера, мкМ

этого вопроса важно для понимания молекулярного механизма влияния полимеров на множественную лекарственную устойчивость клеток.

2.2. Локализация REP при связывании с клетками

В этих экспериментах использовали REP, модифицированный небольшой гидрофобной флуоресцирующей группой NBD (мол. масса 200) по концу гидрофобного ППО-блока (REP-NBD). Анализ распределения REP-NBD между гексаном и водой показал, что введение NBD практически не позлияло на гид-рофобность макромолекулы. Для исходного REP lgPreKcaH/,toja был равен -0,95±0,02, а для REP-NBD lgPreKca„^a = -0,9±0,3.

Возможность проникновения REP-NBD в клетки была изучена двумя методами: качественно - методом конфокальной микроскопии и количественно -по гашению дитионитом флуоресценции клеток, обработанных REP-NBD.

При использовании метода конфокальной микроскопии клетки MCF7/R инкубировали с REP-NBD и, после удаления несвязавшегося конъюгата, исследовали локализацию полимера. Яркую флуоресценцию наблюдали по контуру клеток, тогда как в цитоплазме, в области ядра и примыкающего к нему аппарата Гольджи свечения не было видно. Эти данные указывали на локализацию полимера в цитоплазматической мембране и не позволили выявить проникновение полимера в клетку и его связывание с внутриклеточными органеллами, по крайней мере, в заметном количестве.

Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции клеток K562/DOX, приходящейся на одну клетку, от времени их инкубации с REP-NBD. Приведены данные до добавления дитиони-та (1), после его добавления (2) и после добавления Тритона Х-100 (3). Клетки инкубировали в стандартных условиях в среде RPMI 1640, IOmMHEPES.

0,2

i! о о 3 о

9 « 0,15

в в

8

С* 01

• 1

02 A3

50 100

Время инкубации, мин

150

Результаты, полученные методом конфокальной микроскопии, были проверены прямыми флуориметрическими измерениями с использованием дитио-нита натрия, который способен восстанавливать N60 в нефлуоресцирующий продукт. Поскольку липидная мембрана непроницаема для дитионита, то при добавлении к клеткам, преинкубированным с REP-NBD, он восстанавливает N80 только на поверхности клеток. Остаточная флуоресценция соответствует доле REP-NBD, который проник внутрь клеток. Таким образом, этот подход позволяет оценить количество полимера, проникшего в цитоплазму.

Клетки K562/DOX инкубировали с REP-NBD при 37°С, отмывали несвя-завшийся полимер и измеряли флуоресценцию клеток. Количество связанного с клетками полимера росло со временем (рис. 2, точки 1). Добавление дитионита резко снижало флуоресценцию (точки 2). Последующее добавление Тритона X-100, разрушающего клетки, не приводило к её изменению (точки 3). По-видимому, остаточная флуоресценция была обусловлена собственным свечением клеток. Практически полное гашение флуоресценции дитионитом натрия наблюдали во всех образцах клеток независимо от величины исходной флуоресценции в образце, то есть от того, сколько полимера было связано с клетками.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при связывании с клетками при 37°С полимер REP-NBD локализуется на внешней стороне плазматической мембраны и внутрь клеток не проникает, что подтверждает результаты конфокальной микроскопии.

Аналогичные эксперименты были поставлены на модельных липидных мембранах - липосомах. Полимер добавляли к такому количеству липосом, что он практически весь связывался с ними. Связывание полимера с липосомами происходило очень быстро, так что никакой зависимости интенсивности флуоресценции от времени инкубации обнаружено не было. Добавление дитионита гасило флуоресценцию полностью. Эти результаты указывают на локализацию всех молекул REP-NBD на внешней стороне липосом.

Таким образом, эксперименты с двублочным сополимером, содержавшим NBD на гидрофобном конце ППО блока, продемонстрировали, что REP-NBD не проникает сквозь липидный бислой внутрь клеток или липосом, а остаётся связанным с внешней липидной мембраной.

Этот вывод имеет два следствия. Во-первых, из него следует, что сделанное предположение о причине разного связывания 3H-REP-NH2 с клетками при 4°С и 37°С не подтверждается, то есть повышенное его связывание при 37°С обусловлено не накоплением полимера внутри клеток. Во-вторых, поскольку NBD не вносил в свойства REP существенных изменений, то полученные результаты позволяют заключить, что REP восстанавливал чувствительность MDR-клеток к DOX, будучи связанным с их плазматической мембраной.

Известно, что одна из основных причин возникновения MDR состоит в появлении в плазматической мембране раковых ¡слеток гликопротеина Р-170, выбрасывающего из клетки инородные вещества, в^частности, лекарства. В литературе высказывались предположения, что вызываемое плюрониками восстановление чувствительности MDR-клеток объясняется взаимодействием полимеров с Р-170 и, как следствие, его ингибированием. С другой стороны, многочисленные данные о взаимодействии плюроников с липосомами, построенными только из липида, указывают на возможность взаимодействия плюроников с липидами. Противоречие имеющихся данных поднимает вопрос, с какими компонентами плазматической мембраны взаимодействуют плюроники. Прямые

экспериментальные данные по этому вопросу в литературе отсутствуют. В настоящей работе сделан первый шаг в этом направлении, а именно, предпринята попытка дифференцировать два основных компонента клеточных мембран, белки и липиды, в качестве ближайшего окружения полиалкиленоксидов.

2.3. Идентификация ближайшего окружения полиалкиленоксидов в мембране

Для идентификации компонентов мембраны, с которыми непосредственно взаимодействует полимер, мы использовали REP, модифицированный по гидрофобному концу фотоактивируемой группой TMD (пара-1-трифторметил-диазиринилбензоил), способной при облучении светом образовывать ковалент-ную связь со своим ближайшим окружением - белками или липидами. Эффективность выбранной метки была проверена в реакции REP-TMD с БСА. Известно, что БСА имеет склонность к связыванию гидрофобных веществ. Можно было ожидать, что он будет также взаимодействовать и с гидрофобным блоком REP. Смесь БСА с 3H-REP-TMD облучали, после чего отделили методом ГПХ несвязанный полимер от фракций, содержавших БСА. Наличие радиоактивности в этих фракциях свидетельствовало о том, что 3H-REP-TMD действительно

Рис. 3. Определение радиоактивности отдельных участков геля после анализа взаимодействия БСА и ^-REP-TMD методом электрофореза в дена-турируюдих условиях. По оси абцисс отложены значения доли радиоактивности от суммы раддоактивностей всехучастков. 1 участок соответствует епрту, 6 - фронту, размер каждого участка -1 см.

Электрофоретический анализ фрактяй, содержавших БСА и 3H-REP-TMD, и измерение радиоактивности вдоль p-рожки геля (рис. 3) показали, что около

60% 3iI-REP-TMD двигалось пте: зцктрофорезе с фронтом (рис. 3, участок 6).

* j

Вероятно, это соответствует фракт-М H-REP-TMD, связанного с БСА некова-лентно. В то же время повышений уровень радиоактивности был обнаружен в

На участке 3, соответствующем электрофоретической подвижности БСА (мол. масса 66200Y Мы полаггм>что пик радиоактивности в месте расположения БСА отражает образоз*ние ковалентной связи БСА - 3H-REP-TMD, Этот результат показал, что ¡использование TMD позволяет получать конъюгаты белок - 3H-REP-TMD, }элекулярная масса которых мало отличается от массы исходного белка, что облегчает их обнаружение по электрофоретической подвижности; 2) 3H-REr' TMD способен образовывать ковалентную связь с белком даже при столь cj-jom сродстве, как к БСА; 3) использованные методы анализа

присоединялся к альбумину.

Доля радиоактивности на участке

00 02 04 06

в принципе позволяют выявить образование ковалентного комплекса 3Н-ЛЕР-ТМБ - белок.

Клетки, обработанные полимером

Гомогенизация во льду растиранием

Гомогенат клеток (100% полимера, 100% белка) Метанол-хлороформ

Растворимая в хлороформ-метанольной смеси фракция

(1) Осадок белков

(19+15% полимера, 98,1+0,7% белка)

+СаС/г, водный раствор

(2) Липидный экстракт

(78+13% полимера, 0% белка)

Водная фракция (2,7+1,6% полимера, 1,5+0,7% белка)

Упаривание в вакууме (20°С)

+Ацетон

+Буфер

для образцов

Образцы для ТСХ

Образцы для электрофореза (0,7+0,4% полимера, 98,1+0,7% белка)

Рис. 4. Схема выделения из клеток белковой (1) и липидной (2) фракций. В скобках указано содержание белка и 3H-REP в процентах к их количеству в клеточном гомогенате.

3H-REP-TMD был использован для выяснения вопроса, взаимодействует ли REP с белками клеточных мембран. Особый интерес представлял белок Р-170, поскольку в литературе неоднократно высказывалось предположение, что плюроники устраняют устойчивость MDR-клеток, присоединяясь к этому белку. Чтобы проверить, взаимодействует ли полимер с этим белком непосредственно, мы взяли MDR-клетки MCF7/R с высоким содержанием Р-170. Этот фактор благоприятствовал обнаружению взаимодействия полимера с белком. Для сравнения в тех же опытах исследовали взаимодействие полимера и с чувствительными клетками MCF7, не содержавшими Р-170. Клетки MCF7 или MCF7/R инкубировали с 3H-REP-TMD, отмывали несвязанный полимер и об-

лучали клетки для образования ковалентной связи между присоединившимся полимером и его ближайшим окружением. Нековалентное связывание полимера с компонентами клеточных мембран оценивали по контрольным пробам, в которых клетки инкубировали с предварительно облучённым полимером.

Клеточный гомогенат подвергали фракционированию по Фолчу (рис. 4) с целью выделения фракций, обогащенных белками или липидами. В каждой фракции определяли содержание 3Н-ЯЕР по радиоактивности и количество белка. Органорастворимую фракцию экстрагировали из гомогената смесью метанола и хлороформа, осаждая при этом практически все белки. В этом осадке содержалось около 20% связавшегося полимера, причём после промывания осадка ацетоном его радиоактивность снижалась на порядок. Таким образом, лишь незначительная часть полимера достаточно прочно связалась с белками.

Анализ белковой фракции методом электрофореза в денатурирующих условиях. Осадок клеточных белков анализировали так же, как продукты взаимодействия БСА и ИЕР-ТМО (рис. 3). На рис. 5 приведено распределение радиоактивности вдоль дорожек геля, на которые были нанесены различные образцы. Как и в случае с БСА-ЯЕР, более половины полимера во всех образцах двигалась с фронтом (участок 6), причём доля радиоактивности в этой секции была одинакова для опытных и контрольных проб: 0,55±0,04 и 0,54±0,09, соответственно. По-видимому, радиоактивность в этой области была обусловлена наличием свободного 3Н-11ЕР-ТЖ), который не был удалён ацетоном из белкового осадка и отделился от белков в процессе электрофореза.

Повышенная радиоактивность была также обнаружена в белковых агрегатах, которые концентрировались на границах гелей (участок 1). В опытных образцах ШЖ-клеток в этом участке обнаруживалось 21±12% всей нанесённой радиоактивности, и практически такая же доля приходилась на первую секцию в образцах из чувствительных клеток 17±4%. В контрольных образцах содержание полимера в этой области было несколько ниже: 13±4%, но эта разница статистически недостоверна. Аналогичное явление наблюдали и при электрофорезе БСА-ЯЕР (рис. 3). Поэтому мы полагаем, что этот небольшой пик радиоактивности обусловлен соосаждением полимера с белками и неполным растворением осадка в буфере для образцов.

Распределение полимера по разделяющему гелю (участки 2-5) оказалось равномерным, соответствующим содержанию белка в каждой из секций (рис. 5). Сходную картину наблюдали со всеми образцами: чувствительных клеток (Л), устойчивых (8) и контрольными (0). Такие же электрофореграммы и профили радиоактивности были получены при анализе суммарного клеточного белка, выделенного другим методом, а именно осаждением из гомогената три-хлоруксусной кислотой. Если бы существовало какое-либо предпочтение во взаимодействии полимера с каким-либо клеточным белком, это должно было проявиться в увеличении радиоактивности в секции, соответствующей молекулярной массе этого белка, как в случае БСА-ИЕР (рис. 3). Однако при анализе

клеточных белков никакого максимума радиоактивное™ вдоль разделяющего геля обнаружено не было. В частности, в области, соответствующей электро-форетической подвижности Р-170 (участок 2), уровень радиоактивности был одинаков в опытных и контрольных образцах. Такой же уровень радиоактивности был обнаружен и в образцах, полученных из чувствительных клеток, в которых гликопротеин Р-170 не экспрессируется.

Рис. 5. Распределение радиоактивности вдоль дорожек геля при электрофоре-тическом анализе белковой фракции клеток. По оси абцисс отложена доля радиоактивности соответствующего участка геля. R - образцы из MDR-клеток MCF7/R, S - образцы из клеток MCF7. О - контрольные образцы. В качестве белковых стандартов использовали иммуноглобулины мыши и смесь низкомолекулярных белковых маркеров (слева). Гель разрезали и определяли его радиоактивность так же, как и на рис. 3.

Таким образом, образования ковалентной связи между 3H-R£P-TMD и каким-либо клеточным белком, в частности, с Р-170 обнаружить не удалось. Эти результаты указывают на слабое взаимодействие полимера с белками мембран и отсутствие предпочтительного связывания REP с каким-либо клеточным белком, в том числе и с Р-170.

Анализ лнпидпого экстракта методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). В липидных экстрактах содержалось около 80% радиоактивного полимера (рис. 4). Очевидно, что основная часть этой радиоактивности обусловлена присутствием свободного полимера, образовавшегося в результате диссоциации нековалентных комплексов полимера и липидов в процессе экстракции клеток органическими растворителями. Вторым радиоактивным компонентом в экстрактах могли быть ковалентные комплексы липид-полимер, если таковые образовались при облучении клеток. Необходимым условием обнаружения таких комплексов методом ТСХ является разная подвижность свободного и свя-

Доля радиоактивности на участке

0 0.2 0.4 0.6 0.8

£

занного полимера. Для достижения их максимального разрешения были исследованы различные условия проведения ТСХ в прямой и обращенной фазе. Различие в подвижности полимера и его конъюгатов с лип идами в прямой ТСХ было невелико. Варьирование состава элюента не приводило к удовлетворительному разделению свободного и связанного полимера. Поэтому мы обратились к ТСХ в обращенной фазе. Мы использовали обращённофазовую ТСХ на пластинах, покрытых октадецилсшшкагелем, с использованием диметилфор-мамида в качестве подвижной фазы.

R5 R6 R7 RS S5 S6 S7 S8

Рис. б. Изображение пластины ТСХ липидных экстрактов в обращенной фазе, полученное методом радиоавтографии. На каждую из дорожек нанесено равное по радиоактивному счёту количество фракции 360000 ерш. Образцы R5, R6 получены из MDR-клеток MCF7/R, S5, S6 - из MCF7. Образцы R7, R8 (из MCF7/R) и S7, SS (из MCF7) были контрольными, полученными с использованием предварительно инактивированного, облучённого полимера. Хроматографическая система: ДМФА-пластина С ,R-sifica on glass, толщина слоя 250 мкм ("Uniplate", Anaitech, США). Авторадиографию проводили в течение двух недель на плёнке Hyperfi!m-3H, L'Amersham", США.

Анализ липидных экстрактов показал, что существенных различий в подвижности липидов между контрольными и экспериментальными образцами нет (данные окраски йодом пластин ОФ-'ГСХ не приведены). На радиоавтографе (рис. 6) видно, что при хроматографии опытных образцов (R5, R6, S5, S6) основная часть полимера оказывалась на старте и на фронте. Этот результат указывал на присутствие, по крайней мере, двух видов соединений, содержащих JH-REP-TMD. Несомненно, что одним из них был свободный полимер. Результаты предварительных экспериментов указывали на то, что радиоактивное пятно в области фронта было образовано свободным 3H-REP-TMD. Это заключение подтверждали данные, полученные при анализе контрольных образцов (R7, R8, S7, S8), в которых присутствовал предварительно облучённый и, следова-

14

тельно, свободный полимер: в этих образцах основная часть радиоактивности концентрировалась на фронте.

Сравнение радиоавтографов контрольных и опытных образцов выявило разницу в интенсивности пятен на старте. Они были отчетливо видны во всех опытных образцах и значительно слабее выражены в контроле. Контрольные образцы отличались от опытных только тем, что содержали полимер, облучённый до инкубации с клетками и, следовательно, потерявший способность к образованию ковалентных связей с клеточными компонентами. Поэтому резкое уменьшение интенсивности пятен на стартовой линии при переходе от опытных образцов к контрольным можно объяснить присутствием в опытных образцах конъюгатов REP-липид. В таком случае полученные нами результаты свидетельствуют об образовании ковалентных связей между 3H-REP-TMD и липидами. Это означает, что в живой клетке полимер располагался в липидном окружении и в момент облучения ковалентно присоединялся к липидам.

Взаимодействие полимера с липидами клеточной мембраны хорошо согласуется с неспецифическим характером его связывания с клетками и объясняет его. Столь тесного взаимодействия с белками, необходимого для образования ковалентной связи с фотоактивируемой меткой, обнаружено не было.

3. Взаимодействие блок-сополимеров с липосомами

3.1. Взаимодействие сополимеров с липосомами из яичного лецитина

Итак, при связывании с клетками двублочный сополимер REP взаимодействует, в основном, с липидными компонентами мембраны. В связи с этим изучение взаимодействия полиалкиленоксидов с модельным липидным бислоем -липосомами имеет важное значение для понимания механизма взаимодействия сополимеров с биологическими мембранами.

Эксперименты на »слетках показали, что двублочный сополимер REP восстанавливает чувствительность MDR-клеток столь же эффективно, как и плю-роник L61. В то же время REP отличался от плюроника L61 меньшей цитоток-сичностью. Чтобы выяснить причину этого явления, мы исследовали взаимодействие L61 и REP с липосомами, сравнивая их связывание с липидными везикулами и влияние на проницаемость липидной мембраны для DOX.

Связывание полимеров с липосомами оценивали по коэффициенту распределения полимера между водной фазой и липидным бислоем, который определяется как соотношение концентраций полимера в мембранной [Р]м и вод-[Р]

ной [Р]в фазах: КР Поскольку оба исследуемых полимера имеют не-

большой молекулярный вес и потому способны проникать сквозь поры диализной мембраны, для измерения коэффициентов распределения использовали метод равновесного диализа. Суспензию липосом диализовали против раствора полимера, взятого в концентрации ниже ККМ, а после установления равновесия определяли концентрацию полимера по обе стороны диализной мембраны.

Концентрацию связанного с липосомами полимера [Р]связ определяли как разность его концентраций во внутреннем резервуаре и во внешнем растворе.

10-, 8 » 6 'Л

S

и

К2 о

S

О 20 40 60 80 100 Концентрация липосом, мг/мл

Рис. 7. Изотермы связывания полимера 3Н-КЕР-МН2 (1) и плюроника Ь61 (2) с липосомами. Начальная концентрация полимера во внешнем растворе 10 мкМ, буферный раствор: 10 мМ

На2НР04, 150 мМ ЫаС1, температура 37°С, рН 7.4.

Для расчёта КР была получена зависимость количества полимера в липид-ной фазе [Р]с«яз от концентрации липосом во внутреннем резервуаре (рис. 7). С

V w г m [Р]оС1Шида помощью нелинейной регрессии согласно уравнению I"]«« =---, где

С* 4- пяилида

^ липида jr

Ар

[Р]о - общая концентрация полимера в растворе, Слиггал и рлигаи - массовая концентрация (мг/мл) липида и его плотность в бислое (1,014 г/см3), было получено, что для L61 Кр=45±9, а для REP-NH2 Á>=78±17. Это значит, что при концентрации липосом 1 мг/мл с одной липосомой с гидродинамическим диаметром 70 нм может связаться в среднем 47 молекул REP-NH2 или 28 молекул плюроника L61. Эти данные показывают, что двублочный REP-NH2, несмотря на низкую валовую гидрофобность по сравнению с L61, обладает большим сродством к липидному бислою. Очевидно, этот эффект связан с различиями в блочной архитектуре этих макромолекул. В отличие от L61, в котором оба конца макромолекулы содержат гидрофильные звенья ЭО, REP содержит гидрофильный блок лишь с одной стороны макромолекулы. Такая геометрия макромолекулы, по всей видимости, способствует лучшему взаимодействию этого сополимера с липидным бислоем.

Большее сродство REP к липидным мембранам по сравнению с плюрони-ком L61 наблюдалось и при исследовании их взаимодействия с клетками -лимфоцитами человека. Для REP-NH2 величина связывания составила 0,85±0,04 пмоль/(мкМ-млн. кл.), а для плюроника L61 она была в 2 раза ниже -0,4±0,03 пмоль/(мкМ-млн. кл.). Связывание REP с 4 линиями опухолевых клеток, как чувствительных, так и устойчивых также значительно выше (табл. 1), чем связывание трёхблочного плюроника L61 с клетками миеломы SP2/0 (1,2 пмоль/(мкМ-млн.клеток)).

Таким образом, как в случае липосом, так и при взаимодействии с клетками двублочный сополимер REP проявлял большее сродство к мембранам, чем трёхблочный L61.

г'

•Рис. 8. Зависимость ускорения

76-

Сх=5.0±0,2мМ

|-1 транспорта БОХ от концентрации добавленного сополимера 11ЕР (1) и плюроника Ь61 (2). Липосомы заполнены 0,3 М цитратным буферным раствором (рН 4,0), внешний буферный раствор содержал 20 мМ НЕРЕБ (рН 7,0) и 0,6 М сахарозу, 32°С. Концентрация липосом 1 мг/мл, БОХ — 50 мкМ.

2 1 О

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 5 0.6 Концентрация полимеров, мМ

Влияние полимеров на проникновение DOX в липосомы. В этих экспериментах использовали липосомы, заполненные буфером рН 4,0 и суспендированные в среде рН 7,0. DOX содержит первичную аминогруппу с рК=8,6. При рН 7 около 2,5% молекул DOX электронейтральны и поэтому способны диффундировать через липидный бислой. Внутри липосом при рН°4 DOX протони-руется, теряет способность проходить через мембрану и вследствие этого накапливается внутри липосом. Концентрирование DOX внутри везикул приводит к самотушению его флуоресценции и падению общей интенсивности излучения в системе. Таким образом, транспорт DOX в липосомы проявляется в снижении флуоресценции образца, которое описывается экспоненциальным уменьшением интенсивности флуоресценции во времени и характеризуется константой скорости первого порядка. Качественно характер влияния REP и L61 на проницаемость липидного бислоя был одинаков. Добавление сополимеров приводило к ускорению транспорта DOX, причём отношение наблюдаемых констант скорости транспорта в присутствии (kP) и в отсутствие (ко) сополимера увеличивалось пропорционально его концентрации (рис. 8). Наклон этой зависимости,

способности полимера ускорять транспорт DOX. Для REP эта величина составила 5,0±0,2 мМ'1, а для плюроника L61 она оказалась на порядок больше: 55±2 мМ"1. Вероятно, это связано с тем, что сополимер, имеющий трёхблочное строение, обладал значительно более выраженным возмущающим действием на структуру мембран, чем двублочный. Двублочный сополимер REP проявлял в 1,6 раз большее сродство к модельным и биологическим мембранам, но влиял на скорость накопления DOX в липосомах в 10 раз слабее, чем плюроник L61.

является концентрационно-независимой характеристикой

Таким образом, воздействие одной связанной с бислоем молекулы двублочного сополимера было в 16 раз слабее, чем влияние трёхблочной макромолекулы.

Итак, мы показали, что взаимодействие полимеров с биологическими и модельными липидными мембранами, построенными из яичного лецитина, приводит к связыванию полимеров и возмущению упаковки липидных молекул. Согласно теоретическим представлениям, эти процессы зависят от плотности упаковки липидов, экспериментально определяемой по микровязкости бис-лоя. Эти параметры в первую очередь зависят от его липидного состава. Поэтому в следующей части работы мы исследовали влияние состава мембран на способность плюроника Ь61 изменять их проницаемость.

3.2. Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиле-ноксидов слипосомами

Исследование было проведено на двухкомпонентных липосомах, основным компонентом которых всегда был лецитин, а вторым компонентом - исследуемый липид. В качестве такового были исследованы основные классы липидов животных клеток: глицерофосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатиди-лэтаноламин, фосфатидная кислота и кардиолипин), фосфосфинголипиды (сфингомиелин), гликосфинголипиды (ганглиозид ОМ1) и стеролы (холестерин). Эти липиды смешивали с лецитином в разных соотношениях, изменяя долю исследуемого компонента, и получали липосомы по стандартной методике. В каждом образце измеряли микровязкость липосом и изменение скорости рН-индуцированного транспорта БОХ под действием сополимера.

Влияние плюроника на проницаемость липидного бислоя сильно зависело от состава мембраны. Введение ганглиозида, фосфатидилэтаноламина и, особенно, холестерина, приводило к увеличению микровязкости мембраны. Это сопровождалось ослаблением влияния плюроника на транспорт ООХ. Сфингомиелин и кардиолипин не влияли на микровязкость и на чувствительность бислоя к действию плюроника. Введение фосфатидной кислоты уменьшало микровязкость бислоя. Добавление плюроника к таким липосомам приводило к дестабилизации мембраны и образованию пор. Эти наблюдения указывали на взаимосвязь между микровязкостью бислоя и его чувствительностью к действию плюроника.

Для проверки этого предположения мы сравнили микровязкость бислоя и соотношение константы скорости транспорта БОХ в присутствии 20 мкМ плюроника и в его отсутствие (кр/ко) (рис. 9). Увеличение мембранной микровязкости сопровождалось уменьшением чувствительности бислоя к действию плюроника. Коэффициент линейной корреляции зависимости кр/ко от микровязкости для всех исследованных систем, кроме фосфатидилэтаноламина, (N=18) составлял 0,9. Таким образом, микровязкость бислоя является важным фактором, определяющим его чувствительность к возмущающему действию плюроника.

Рис. 9. Корреляция между микровязкостью двухкомпонентной липидной мембраны и её чувствительностью к возмущающему действию плюроника L61. Величины чувствительности и микровязкости приведены относительно одноком-понентных лецитиновых липосом. Липосомы с холестерином обозначены как с ФК - ■, со сфингомиелином - с фосфатидилэтаноламином - о, с ганг-лиозидом - А, с кардиолипином -

На однокомпонентных липосомах из лецитина мы обнаружили, что влияние полиалкиленоксида на проницаемость бислоя зависит от двух свойств полимера: его способности внедряться в бислой и возмущать его. Возникает вопрос, на какое из этих свойств влияет микровязкость бислоя.

Для ответа на этот вопрос мы исследовали связывание REP и плюроника L61 с двухкомпонентными липосомами из лецитина и холестерина. Оказалось, что по мере увеличения содержания холестерина увеличивалась микровязкость мембран и уменьшалось связывание сополимеров с ними (рис. 10). Причём, увеличение микровязкости сильнее сказывалось на связывании REP.

Следует отметить, что этот феномен определяется именно микровязкостью, а не тем фактором, который вызвал её изменение. Доказательством тому могут служить результаты, полученные нами на лецитиновых липосомах, в состав которых был введён полипептид грамицидин, способный эффективно встраиваться в мембраны. Известно, что введение грамицидина в лецитиновые мембраны увеличивает их микровязкость. Оказалось, что в этом случае связывание полимеров с липосомами также снижается. Так же, как и в случае с холестерином, увеличение содержания грамицидина сильнее отражалось на связывании REP по сравнению с плюроником L61.

н -

х о:

а> s

s г

а- ю

s е; f §

-е- §■

то о.

£ 5

as о.

60

40

20

REP

110? s

so 108| а>

1 Оба §

104| го

1.02J5

4 00=?'

0.0 01 02 0.3 04 J? Содержание холестерина, мольные доли

50

Ё «

Is

Э- о s с

g S

■в" Ф О Q.

¡2 "

40

30

20

й Ю

L61

©*

!? 20 Э

1.5 § s 3 Ф ■о

ш 10>

Рис. 10. Зависимость коэффициента распределения сополимера между водой и ли-пидным бислоем (левая ось, ■) и ускорения транспорта DOX в присутствии 20 мкМ сополимера (правая ось, о) от содержания холестерина в двухкомпонентных липосо-мах. На верхнем рисунке приведены данные для дву-блочного сополимера REP, на нижнем - для трёхблочно-го плюроника L61.

0 0 01 02 0 3 0.4 Содержание холестерина, мольные

доли

Влияние полимеров на проницаемость мембраны по отношению к БОХ также уменьшалось по мере увеличения доли холестерина в бислое (рис. 10). Мы сопоставили связывание полимеров и их влияние на транспорт БОХ при введении различных количеств холестерина в липосомы. Если бы микровязкость влияла не только на связывание полимеров, но и на их способность возмущать бислой, то следовало ожидать, что эффект полимеров на проницаемость мембраны как результат обоих факторов будет уменьшаться быстрее, чем одно только связывание. Однако оказалось, что значения кр/ко для обоих полимеров снижались пропорционально уменьшению количества связанного с мембранами полимера. Это означало, что микровязкость бислоя не вносила дополнительный вклад в способность полимеров возмущать бислой.

7 25 5

I 20

Jjl 5

О.

Sio

V—

¿|05

""оо

00 01 02 03 04 Содержание холестерина, мольные доли

Рис. 11. Зависимость ускорения транспорта DOX в липосомы, вызываемого 1 мкМ связанного плюроника L61 (1) и REP (2), от содержания холестерина в липосомаль-ной мембране. Рисунок получен в результате математической обработки рис. 10.

Нормирование эффектов, вызываемых сополимерами, на концентрацию связанных с мембраной макромолекул показало, что воздействие единичной макромолекулы, связанной с мембраной, практически не зависело от содержания в мембране холестерина (рис. 11). Такую закономерность наблюдали как в случае трёхблочного плюроника L61 (кривая 1), так и для REP (кривая 2).

Таким образом, нам удалось показать, что воздействие плюроника L61 на проницаемость липидной мембраны определяется двумя независимыми друг друга свойствами полимера: 1) способностью внедряться в бислой и 2) способностью возмущать упаковку бислоя. Связывание полимера зависит от температуры и микровязкости мембраны, а, следовательно, от её состава, а также от структуры полимера. Способность возмущать липидный бислой определяется химической природой и блочной архитектурой полимера, но, по нашим данным, практически не зависит от свойств мембраны. Полученные результаты имеют большое значение для понимания механизмов воздействия амфифиль-ных сополимеров на свойства клеточных мембран.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что двублочный сополимер этиленоксида и пропиле-ноксида REP обладает способностью восстанавливать чувствительность раковых клеток к противоопухолевому антибиотику доксорубицину столь же эффективно, как и ранее изученный трёхблочный сополимер этиленоксида и про-пиленоксида плюроник L61.

2. Впервые установлено, что нитробензоксидиазольное производное сополимера REP связывается с наружной липидной мембраной клеток или липосом. Обнаружено, что оно не проникает ни внутрь клеток, ни липосом.

3. Впервые обнаружено, что при взаимодействии с клетками REP включается в мембрану в непосредственной близости от липидов. Взаимодействие сополимера с мембранными белками не установлено.

4. Впервые показано, что добавление двублочного сополимера REP приводит к увеличению скорости проникновения доксорубицина в липосомы. При этом установлено, что при большей степени связывания с липидным бислоем двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP оказывает меньшее влияние на проникновение доксорубицина, чем трёхблочный плюроник L61. Впервые обнаружено, что каждая связанная молекула REP оказывает в 16 раз меньший эффект на транспорт доксорубицина в липосомы, чем молекула плюроника.

5. Впервые установлено, что увеличение плотности упаковки липидного бислоя ослабляет влияния дву- и трёхблочного полиалкиленоксидов на проникновение доксорубицина в липосомы. Показано, что это явление обусловлено уменьшением величины связывания сополимера, при этом влияние одной связанной макромолекулы не зависит от плотности упаковки бислоя.

Основные результаты диссертационной работы Жирнова А.Е. изложены в следующих публикациях:

1. Жирное А.Е., Павлов Д.Н., Дёмина Т.В., БадунГ.А., Гроздо-ваИ.Д., Мелик-Нубаров Н.С. Влияние строения блок-сополимеров этиленокси-да и пропиленоксида на их взаимодействие с биологическими мембранами, //Высокомолек. соед. Сер. А. 2006. Т.48. №11. С.2023-2033.

2.ZhirnovА.Е., DeminaT.V., KrylovaO.O., Grozdoval.D., Melik-Nubarov N.S. Lipid composition determines interaction of liposome membranes with Pluronic L61. //Biochim. Biophys. Acta. 2005. V.1720. №1-2. P.73-83.

3.DeminaT., GrozdovaL, KrylovaO., Zhirnov A., IstratovV., FreyH., KautzH., Melik-Nubarov N. Relationship between the structure of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid bilayers. //Biochemistry. 2005. V.44. №10. P.4042-4054.

4. ZhirnovA.E., NesterchukM.V., BadunG.A., Grozdoval.D., Melik-Nubarov N.S. Preferential Interactions of Poloxamers with the Components of Cell Membranes. //Abstracts book of 1st European Chemistry Congress. Budapest. Hungary. August 27th - September 1st. 2006. P.231.

5 .Жирное A E., БадунГ.А., Мелик-Нубаров Н.С. Связывание полиалкиле-ноксидов с модельными и клеточными мембранами. //Тезисы II Санкт-Петербургской конференции молодых учёных «Современные проблемы науки о полимерах». 31 января - 2 февраля 2006 г.. Санкт-Петербург. ИВС РАН. 4.2. С.99.

6. Zhirnov А.Е., Demina Т. V., Grozdova I.D., Melik-Nubarov N.S. Membrane composition influences Pluronic-induced transport of antitumour drugs. //Abstracts book of 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. August 27th -September 1st 2005. Montpellier. France. Eur. Biophys. J. with Biophys. Lett. V.34. №6. P.809.

7. Zhirnov A.E., DeminaT.V., KrylovaO.O., Grozdoval.D., Melik-Nubarov N.S. Influence of lipid membrane composition on its interaction with Pluronic. //Abstracts book of 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference. Budapest. Hungary. 2nd-7th July. 2005. FEBS J. V.272. №sl. P.244-245.

8. Жирное А.Е. Связывание блок-сополимера этиленоксида и пропиленоксида с липидными мембранами и клетками. //Тезисы XII международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-2005". Секция "Химия. Радиохимия". г. Москва. 13-14 апреля 2005 года. Т.2. С.115.

9. Жирное А.Е., Мелик-Нубаров Н.С. Влияние плюроника на проницаемость модельной мембраны в зависимости от её липидного состава. //Тезисы III Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2004». г. Москва. 27 января - 1 февраля 2004 г. T.I. С.264.

Принято к исполнению 23/01/2007 Исполнено 24/01/2007

Заказ № 48 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида.

1.1.1. Номенклатура.

1.1.2. Физико-химические свойства.

1.1.3. Аналитическое определение плюроников в присутствии липидов.

1.2. Биологические мембраны.

1.2.1. Структура биологических мембран.

1.2.2. Свойства липидного бислоя.

1.2.3. Микровязкость бислоя и способы её измерения.

1.2.4. Липидный состав биологических мембран.

1.2.5. Проницаемость липидных мембран.

1.2.6. Модельные системы, используемые для исследования проницаемости мембран.

1.3. Взаимодействие плюроников с компонентами биологических мембран.

1.3.1. Взаимодействие плюроников с белками.

1.3.2. Взаимодействие плюроников с липидными структурами.

1.3.2.1. Связывание плюроников с бислойными мембранами и их локализация в бислое.

1.3.2.2. Влияние плюроников на проницаемость липидных мембран.

1.4. Применение плюроников в медицинских целях.

1.5. Множественная лекарственная устойчивость опухолей и влияние на неё плюроников.

1.6. Использование фотоактивируемых групп для исследования локализации веществ в клетке.

2. Постановка задачи.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Анализ полимеров.

3.2.2. Введение аминогруппы в двублочный сополимер REP.

3.2.3. Получение REP-NH2, меченного тритием.

3.2.4. Модификация REP-NH2 флуоресцентной и фотоактивируемой группой.

3.2.5. Определение коэффициента распределения сополимеров между гексаном и водой.

3.2.6. Приготовление липосом.

3.2.7. Определение микровязкости мембраны липосом.

3.2.8. Связывание сополимеров с липосомами.

3.2.9. Транспорт доксорубицина в липосомы с градиентом рН.

3.2.10. Проникновение сополимера внутрь липосом.

3.2.11. Культивирование клеток и анализ цитотоксичности доксорубицина и сополимеров.

3.2.12. Связывание 3H-REP-NH2 с клетками.

3.2.13. Проникновение REP-NBD внутрь клеток.

3.2.14. Анализ взаимодействия REP-NBD с клетками методом конфокальной микроскопии.

3.2.15. Взаимодействие клеток с REP, содержавшим фотоактивируемую метку.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Свойства двублочного сополимера REP.

4.2. Взаимодействие блок-сополимеров с клетками.

4.2.1. Связывание REP с клетками разного типа.

4.2.2. Локализация REP при связывании с клетками.

4.2.3. Идентификация партнёров полиалкиленоксидов в мембране.

4.3. Взаимодействие блок-сополимеров с липосомами.

4.3.1. Взаимодействие дву- и трёхблочного сополимеров с липосомами из яичного лецитина.

4.3.2. Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиленоксидов с липосомами.

Амфифильные полиалкиленоксиды, в частности, блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) состава (ЭО)ту2(ПО)п(ЭО)т/2, называемые также плюрониками, являются хорошо известными малотоксичными поверхностно-активными соединениями, нашедшими широкое применение в медицине и фармакологии [1]. Сравнительно недавно было обнаружено, что при введении противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда, таких как доксорубицин, фарморубицин и дауномицин, совместно с небольшими дозами плюроников, терапевтическая активность лекарства заметно усиливается. Это влияние сополимеров особенно заметно на опухолях, проявляющих множественную лекарственную устойчивость (MDR) [2].

Эта устойчивость, то есть возрастание необходимой токсической концентрации антибиотика, возникает при длительном лечении опухолей с помощью химиотерапии [3]. Она обусловлена возникновением и активацией множества защитных механизмов клетки, направленных на понижение внутриклеточной концентрации лекарств и устранение последствий их токсического действия. Появляющаяся устойчивость проявляется в отношении широкого круга веществ с разнообразной структурой. Проявление MDR приводит к необходимости увеличения количества вводимых в организм антибиотиков, что в конечном итоге сказывается на их общетоксическом воздействии на больного. Таким образом, устранение устойчивости раковых клеток является одной из важнейших задач современной онкологии. В настоящее время препарат для преодоления MDR на основе плюроников проходит клинические испытания за рубежом [4].

Ранее было показано, что плюроники подавляют устойчивость, связываясь с клетками в виде единичных макромолекул, при этом они уменьшают внутриклеточную концентрацию АТФ и ингибируют целый ряд механизмов устойчивости, от сегрегации антибиотиков в кислых везикулах [5] до активации антиапоптотических процессов на уровне транскрипции [6].

Кроме того, было установлено, что влиянием, подобным плюроникам, обладают и другие полиалкиленоксиды, в том числе блок-сополимеры глицерина и пропиленоксида [7].

Тем не менее, до сих пор неизвестна природа ключевой стадии взаимодействия блок-сополимера с клеткой, и как это взаимодействие приводит к вышеописанным событиям. Речь идёт о том, что неизвестно, например, взаимодействуют ли полиалкиленоксиды непосредственно с мембранными белками, ответственными за выброс лекарств из клетки, или какими-либо другими белками, участвующими в механизмах устойчивости. Иными словами, неизвестна важная составляющая молекулярного механизма взаимодействия блок-сополимеров с клеткой, а именно какие компоненты биологической мембраны непосредственно взаимодействуют с сополимером, и какую роль в этом взаимодействии играет их химическая природа.

Знание молекулярного механизма взаимодействия полимеров с клеткой позволит определить сферу применения существующих препаратов на основе плюроников и в дальнейшем направленно синтезировать препараты с большей эффективностью и кругом применения. Поэтому в настоящей работе мы сделали первую попытку обнаружения тех молекулярных компонентов клетки, взаимодействием с которыми обусловлено вышеописанное влияние полиалкиленоксидов на устойчивость раковых клеток.

6. Выводы

1. Впервые показано, что двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP обладает способностью восстанавливать чувствительность раковых клеток к противоопухолевому антибиотику доксорубицину столь же эффективно, как и ранее изученный трёхблочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида плюроник L61.

2. Впервые установлено, что нитробензоксидиазольное производное сополимера REP связывается с наружной липидной мембраной клеток или липосом. Обнаружено, что оно не проникает внутрь ни клеток, ни липосом.

3. Впервые обнаружено, что при взаимодействии с клетками REP включается в мембрану в непосредственной близости от липидов. Взаимодействие сополимера с мембранными белками не установлено.

4. Впервые показано, что добавление двублочного сополимера REP приводит к увеличению скорости проникновения доксорубицина в липосомы. При этом установлено, что при большей степени связывания с липидным бислоем двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP оказывает меньшее влияние на проникновение доксорубицина, чем трёхблочный плюроник L61. Впервые обнаружено, что каждая связанная молекула REP оказывает в 16 раз меньший эффект на транспорт доксорубицина в липосомы, чем молекула плюроника.

5. Впервые установлено, что увеличение плотности упаковки липидного бислоя ослабляет влияния дву- и трёхблочного полиалкиленоксидов на проникновение доксорубицина в липосомы. Показано, что это явление обусловлено уменьшением величины связывания сополимера, при этом влияние одной связанной макромолекулы не зависит от плотности упаковки бислоя.

5. Заключение

Подведём итог нашего исследования, представляющего собой попытку выяснить молекулярный механизм восстановления чувствительности опухолевых клеток к действию лекарств, происходящего в присутствии амфифильных блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида.

В качестве модельного амфифильного блок-сополимера мы выбрали двублочный сополимер этиленоксида и пропиленоксида REP и показали, что он действует на устойчивость раковых клеток столь же эффективно, как и ранее изучавшийся трёхблочный сополимер плюроник L61 [5,254].

На первом этапе работы были получены количественные параметры взаимодействия REP с клетками различной природы, нормальными и опухолевыми, различающимися степенью чувствительности к антибиотикам. С использованием изотопной модификации было выяснено, что связывание сополимера характеризуется низкой константой и линейностью в широком интервале концентраций. Это дало первое указание на то, что количество условных связывающих центров клетки велико. Некоторые авторы связывали влияние плюроников на устойчивость раковых клеток с непосредственным взаимодействием сополимеров и белковых переносчиков, локализованных в плазматической мембране. Обнаружение большого количества связывающих центров позволило поставить под сомнение эту гипотезу.

Использование REP, модифицированного по концу цепи ППО флуоресцентной меткой, привело к выводу, что при связывании с клеткой сополимер сосредотачивается, в основном, на внешней стороне плазматической мембраны и не проникает внутрь клетки, по крайней мере, в значительных количествах. Ранее А.В. Кабановым [211] было показано, что плюроник Р85 проникает внутрь клетки и избирательно связывается с митохондриями. Сопоставив этот факт с уменьшением концентрации АТФ в клетках при введении полимера, авторы высказали предположение, что плюроник угнетает процессы окислительного фосфорилирования. Известно, что реализация практически всех механизмов устойчивости опухолевых клеток тем или иным способом связана с потреблением АТФ. Поэтому вызываемое сополимером уменьшение концентрации АТФ должно приводить к снижению активности ферментативных систем, связанных с лекарственной устойчивостью.

Отличие этих результатов от наших можно объяснить тем, что в цитируемой работе модифицировали гидрофильную цепь полимера достаточно объёмными остатками флуоресцеинизотиоционата. Такая модификация могла привести к заглублению гидрофильных цепей в гидрофобную сердцевину бислоя, что и приводило к проникновению сополимера внутрь и его связыванию с внутриклеточными мембранами, в том числе и с митохондриями.

В тоже время, уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ не обязательно должно быть связано с угнетением процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях. Известно, что опухолевые клетки имеют изменённый метаболизм и большую часть необходимого им АТФ получают путём гликолиза [268], ферменты которого ассоциированы с клеточными мембранами [269]. Поэтому можно предположить, что связывание сополимера с плазматической мембраной может сопровождаться ингибированием гликолиза и также приводить к уменьшению внутриклеточной концентрации АТФ.

Следующий вопрос, являвшийся центральным в нашей работе, состоял в том, с какими компонентами клеточной мембраны, белками или липидами, непосредственно взаимодействует блок-сополимер при связывании. Для решения этой задачи мы использовали изотопно-меченный REP, модифицированный по концу блока ППО фотоактивируемой группой, которая способна при облучении ковалентно связываться с ближайшим окружением. Использование этого подхода позволило показать, что полимер обладает чрезвычайно низким сродством к белковым компонентам клетки. Основное количество полимера при связывании с клетками оказывается в липидном окружении. Различия в сродстве между полимером и отдельными видами липидов нами не были выявлены. В ходе анализа белковых фракций таким образом обработанных клеток никаких чётких различий в связывании полимерами с отдельными белками также не было обнаружено. Это свидетельствует об отсутствии прямого связывания плюроника с гликопротеином Р-170, ответственным за выброс лекарств из клетки.

Итак, как мы выяснили, основными партнёрами плюроника при взаимодействии с клеткой являются липиды. Поэтому заключительная часть работы была посвящена исследованию взаимодействия блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида с модельными липидными бислоями (липосомами). Ранее было обнаружено, что связывание плюроников с бислоем приводит к изменению его динамических свойств [254]. Тем не менее, ответы на целый ряд важных вопросов получены не были.

Во-первых, существовали лишь косвенные данные о том, как влияет взаимное расположение блоков в амфифильной макромолекуле на её взаимодействие с мембраной. Используя в основной части работы двублочный сополимер, мы сравнили влияние его с хорошо изученным трёхблочным сополимером (плюроником L61). Оказалось, что двублочный сополимер связывался с лецитиновыми липосомами лучше, чем трёхблочный. Несмотря на это, плюроник гораздо сильнее воздействовал на скорость трансбислойной диффузии доксорубицина, чем REP. Мы предполагаем, что это различие связано с разной конформационной свободой гидрофобной цепи, погружённой в сердцевину бислоя. При закреплении этой цепи на поверхности мембраны в двух точках (случай плюроника), её конформационная подвижность ограничивается в большей степени, чем при закреплении всего лишь одного конца (случай REP). Мы полагаем, что изменение проницаемости бислоя является компенсаторным ответом системы на ограничение конформационной свободы. В таком случае, большее её изменение приводит к большему изменению подвижности мембранных компонентов.

Другим важным выводом из этого эксперимента было разделение двух факторов, определяющих влияние полимера на динамические свойства бислоя. Этими факторами являются связывание полимера (коэффициент распределения вода-липидный бислой) и возмущающее воздействие одной связанной макромолекулы. Как показало сравнение дву- и трёхблочного сополимера эти факторы не коррелируют друг с другом. Увеличение связывания не обязательно влечёт за собой увеличение влияния полимера.

Следующим неясным вопросом оставалась температурная зависимость влияния полимера на динамические свойства бислоя. Оказалось, что построенная в координатах Аррениуса зависимость эффективной константы транспорта доксорубицина в присутствии плюроника L61 имела излом в области низких температур (около 10°С). Сравнение температурных зависимостей этих констант в присутствии и в отсутствие полимера позволяет заключить, что при понижении температуры ниже некоторой критической величины его влияние прекращается. Это наблюдение согласовывалось с тем, что полимер не связывался с лецитиновыми липосомами при 4°С.

Наличие критической температуры можно объяснить разной температурной зависимостью свободных энергий растворения полимера в воде и в липидном бислое. Вполне вероятно, что свободная энергия растворения полимера в бислое зависит от его липидного состава. Мы полагаем, что резкие различия в степени связывания полимера с раковыми клетками при 4°С и 37°С может быть вызвано именно этим фактором. Плазматическая мембрана латералыю неоднородна, то есть в пределах одного монослоя сосуществуют области с различным липидным составом. Даже если не принимать во внимание изменения в составе мембраны с понижением температуры, можно предположить, что часть областей теряет способность связывать полимер при понижении температуры до 4°С.

Полученные температурные зависимости влияния полимера на транспорт доксорубицина были рассмотрены в рамках теории активированного комплекса. Согласно этой теории константа транспорта доксорубицина через бислой связана со

AG* свободной энергией активации этого процесса: Inк =--+InТ + const, Изменение

RT свободной энергии активации, в свою очередь, является суммой энтальпийного и энтропийного членов: AG* = АН* -TAS*. Учитывая это, запишем выражение для температурной зависимости кинетической константы транспорта:

АН* AS* . „ ln& =--+-+lnT + const. Поскольку степень влияния плюроника выражается

RT R через отношение констант в присутствии и в отсутствие полимера, то мы можем определить, как меняется при этом свободной энергия активации транспорта и ее к AAG* А АН* AAS* компоненты: In— = In^ — In=--=--+-. Сравнение этого уравнения кй RT RT R и температурной зависимости влияния полимера (рис.21) позволяет сделать вывод, что связывание плюроника приводит к увеличению энтропии активации транспорта доксорубицина и уменьшению энтальпии активации этого процесса, причём влияние плюроника на энтропийную составляющую более выражено. Этот факт подтверждает ранее сделанный вывод о том, что влияние полимера на транспорт доксорубицина действительно определяется изменением динамических свойств бислоя.

Наконец, не было ясно, как влияет природа липидного бислоя на его чувствительность к действию плюроника. В ходе наших экспериментов мы меняли состав липосом, приготовляя их из смеси лецитина и одного из природных липидов. Оказалось, что существует корреляция между микровязкостью бислоя и оказываемым на него влиянием полимера. При увеличении микровязкости степень воздействия плюроника L61 на транспорт доксорубицина уменьшалась.

Это явление было рассмотрено с точки зрения упомянутых выше двух факторов, определяющих влияние полимера на динамические свойства бислоя. Для этого было измерено связывание сополимеров с липосомами, содержащими различное количество холестерина. Рассчитав степень влияния, производимую одной связанной макромолекулой, мы обнаружили, что она практически не зависит от липидного состава. Таким образом, уменьшение влияния полимера с увеличением микровязкости мембраны определяется, прежде всего, уменьшением его связывания. Это объясняется тем, что экспериментально микровязкость бислоя определяется возможностью латеральной диффузии зонда, то есть диффузии в пределах одного монослоя липидов. Эта величина непосредственным образом связана со степенью дефектности бислоя, возможностью встроиться в него для посторонней молекулы, в нашем случае - молекулы полиалкиленоксида. В то же время, величина микровязкости лишь в небольшой степени соотносится с возможностью перемещения молекулы доксорубицина с внешнего липидного монослоя на внутренний. Но именно на скорость этого процесса (трансбислойную диффузию) и влияет встроенный в бислой сополимер.

Итак, в результате проведённого нами исследования взаимодействия полиалкиленоксидов с липосомами впервые было показано, что влияние полимеров на проницаемость мембраны определяется двумя его свойствами: его способностью внедряться в мембрану и вызывать возмущение в её структуре. Анализ связывания полимеров и их влияния на транспорт доксорубицина в различных условиях позволил выделить факторы, влияющие на каждое из этих свойств.

Первое свойство - способность внедряться - зависит от температуры и микровязкости мембраны. Охлаждение системы до температуры ниже критической резко снижает связывание полиалкиленоксидов с липидной мембраной и, как следствие, практически исключает всякое влияние полимеров на бислой. Увеличение микровязкости мембраны также ослабляет связывание полиалкиленоксидов с липосомами, что практически полностью определяет уменьшение влияния полимеров на динамические свойства бислоя.

Внедрение полимера в бислой является необходимым, но недостаточным условием его влияния на проницаемость мембраны.

Второе свойство - влияние на динамические характеристик бислоя, его возмущение - определяется структурой самого сополимера. Трёхблочные полиалкиленоксиды, например, плюроник L61, вызывают на порядок более сильные изменения в проницаемости мембран для доксорубицина, чем двублочные (например, REP). Влияние одной связанной макромолекулы на транспорт доксорубицина практически не зависит от состава бислоя и его микровязкости.

Обнаруженные закономерности представляют собой ещё один шаг в понимании природы взаимодействия полиалкиленоксидов с биомембранами.

1. Moghimi S.M. and Hunter A.C. (2000) Poloxamers and poloxamines in nanoparticle engineering and experimental medicine. a review, Trends Biotechnol. 18,412-420.

2. Kabanov A.V., Batrakova E.V., Alakhov V.Y. (2002) Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer, Adv Drug Deliv. Rev. 54,759-779.

3. Perez-Tomas R. (2006) Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer drug treatment, Curr. Med. Chem. 13,1859-1876.

4. Venne A., Li S., Mandeville R., Kabanov A., Alakhov V. (1996) Hypersensitizing effect of pluronic L61 on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug-resistant cells, Cancer Res. 56,3626-3629.

5. Minko Т., Batrakova E.V., Li S., Li Y., Pakunlu R.I., Alakhov V.Y., Kabanov A.V. (2005) Pluronic block copolymers alter apoptotic signal transduction of doxorubicin in drug-resistant cancer cells, J. Control. Release 105, 269-278.

6. Demina Т., Grozdova I., Krylova O., Zhirnov A., Istratov V., Frey H., Kautz H., Melik-Nubarov N. (2005) Relationship between the structure of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid bilayers, Biochemistry 44,4042-4054.

7. F.E. Bailey, Jr., J.V. Koleske (1990) Alkylene oxides and their polymers, Surfactant Science Series, v.35, New York: Marcel Dekker, 280 p.

8. Emanuele R.M., Hunter R.L., Culbreth P.H. (2002) Polyoxypropylene/polyoxyethylene copolymers with improved biological activity, United States Patent 6359014.

9. Wohlfarth C. (2001) CRC Handbook of thermodynamic data of copolymer solutions, New York: CRC, 520 p.

10. Lopes J.R., Loh W. (1998) Investigation of self-assembly and micelle polarity for a wide range of ethylene oxide-propylene oxide-ethylene oxide block copolymers in water, Langmuir 14, 750756.

11. Alexandridis P., Holzwarth J.F., and Hatton T.A. (1994) Micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymer in aqueous solutions: thermodynamics of copolymer association., Macromolecules 27,2414-2425.

12. Alexandridis P., Athanassiou V., Fukuda S., and Hatton T.A. (1994) Surface activity of polyethylene oxide)-Woc£-poly(propylene oxide)-6/ocA>poly(ethylene oxide) copolymers, Langmuir 10,2604-2612.

13. Altinok H., Yu G.-E., Nixon S.K., Gorry P.A., Attwood D., Booth C. (1997) Effect of block architecture on the self-assembly of copolymers of ethylene oxide and propylene oxide in aqueous, Langmuir 13, 5837-5848.

14. Sims G.E.C., Snape T.J. (1980) A method for the estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions, Anal. Biochem. 107, 60-63.

15. Лакович Дж. (1986) Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 496 с.

16. Нейман JI.A., Смоляков B.C., Шишков А.В. (1985) Радиоизотопные методы в физико-химической биологии. Использование реакций атомарного трития, Итоги пауки и техники. Серия: общие проблемы физико-хшической биологии. М.: ВИНИТИ, т.2, 208 с.

17. Бадун Г.А., Волкова С.В., Кузьмичева О.Н.,. Михалина Е.В, Тясто З.А. (2005) Мониторинг потока «горячих» атомов трития в методе термической активации, Радиохимия 47, 178-181.

18. Бадун Г.А., Михалина Е.В., Тясто З.А. (2006) Определение вероятности реакции атомов трития с полиэтиленом при первом соударении в условиях метода термической активации, Радиохимия 48,520-522.

19. Бадун Г.А. (1988) Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 161с.

20. Бадун Г.А., Костин А.И., Филатов Э.С. (1985) Реакции атомов трития с полиэтиленом в интервале температур 290-55 К, Радиохимия 27,222-227.

21. Бадун Г.А., Филатов Э.С. (1988) Реакция атомов трития с аминокислотами, дейтерированными аминокислотами и смесями аминокислот. Свойство аддитивности и изотопный эффект, Радиохимия 30, 531-537.

22. Филатов Э.С., Орлова М.А., Симонов Е.Ф. (1980) Реакция атомов трития с фенилаланином и тирозином в интервале температур 77-400 К, Вести. Моск. ун-та, сер.2 Химия 21,49-52.

23. Mozhaev V.V., Poltevsky K.G., Slepnev V.I., Badun G.A., Levashov A.V. (1991) Homogeneous solutions of hydrophilic enzymes in nonpolar organic solvents. New systems for fundamental studies and biocatalytic transformations, FEBS Lett. 292,159-161.

24. Veselova I.A., Grigor eva D.L., Shekhovtsova T.N., Korobkov V.I., Badun G.A. (2000) Using different polysaccharides and alkaline phosphatase immobilization, Proceedings of Biocatalysis-2000: Fundamentals and Applications, 173.

25. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. (1997) Proteins on ribosome surface: Measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1289212897.

26. Геннис P. (1997) Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 624 с.

27. Singer S.J., Nicolson G.L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes, Science 175, 720-731

28. Vereb G., Szollosi J., Matko J., Nagy P., Farkas Т., Vigh L., Matyus L., Waldmann T.A., Damjanovich S. (2003) Dynamic, yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 8053-8058.

29. Murase K., Fujiwara Т., Umemura Y., Suzuki K., lino R., Yamashita H., Saito M., Murakoshi H., Ritchie K., Kusumi A. (2004) Ultrafine membrane compartments for molecular diffusion as revealed by single molecule techniques, BiophysJ. 86,4075-4093.

30. Spector A.A., Yorek M.A. (1985) Membrane lipid composition and cellular function, J. Lipid Res. 26,1015-1035

31. Subczynski W.K., Wisniewska A. (2000) Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions, Acta Biochim. Pol. 47, 613-625.

32. Orlowski S., Martin S., Escargueil A. (2006) P-glycoprotein and 'lipid rafts': some ambiguous mutual relationships (floating on them, building them or meeting them by chance?), Cell Mol Life Sci. 63,1038-1059.

33. Ferte J. (2000) Analysis of the tangled relationships between P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and the lipid phase of the cell membrane, Eur. J. Biochem. 267,277-294.

34. Regev R., Assaraf Y.G., Eytan G.D. (1999) Membrane fluidization by ether, other anesthetics, and certain agents abolishes P-glycoprotein ATPase activity and modulates efflux from multidrug-resistant cells, Eur. J. Biochem. 259, 18-24.

35. Galla H.J., Hartmann W., Theilen U., Sackmann E. (1979) On two-dimensional passive random walk in lipid bilayers and fluid pathways in biomembranes, J. Membrane Biol. 48,215-236.

36. Yamaji-Hasegawa A., Tsujimoto M. (2006) Asymmetric Distribution of Phospholipids in Biomembranes, Biol. Pharm. Bull. 29, 1547-1553.

37. Zachowski A. (1993) Phospholipids in animal eukaryotic membranes: transverse asymmetry and movement, Biochem. J. 294, 1-14.

38. Tieleman D.P., Bentz J. (2002) Molecular dynamics simulation of the evolution of hydrophobic defects in one monolayer of a phosphatidylcholine bilayer: relevance for membrane fusion mechanisms, Biophys. J. 83,1501-1510.

39. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. (1986) Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 240 с.

40. Ikonen Е. (2001) Roles of lipid rafts in membrane transport, Curr. Opin. Cell Biol. 13,470-477.

41. Brown D.A., London E. (2000) Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts, J. Biol. Chem. 275,17221-17224.

42. Tauc P., Reyes Mateo C., Brochon J.-C. (1998) Pressure effects on the lateral distribution of cholesterol in lipid bilayers: a time-resolved spectroscopy study, Biophys. J. 74, 1864-1870.

43. Pencer J., White G.F., Hallett F.R. (2001) Osmotically induced shape changes of large unilamellar vesicles measured by dynamic light scattering, Biophys. J. 81,2716-2728.

44. Sparr E., Hallin L., Markova N., Wennerstrom H. (2002) Phospholipid-cholesterol bilayers under osmotic stress, Biophys. J. 83,2015-2025.

45. Paula S., Volkov A.G., Van Hoek A.N., Haines Т.Н., Deamer D.W. (1996) Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness, Biophys. J. 70,339-348.

46. Самойленко С.Г., Калер Г.В., Конев C.B. (1999) Определение микровязкости липидов в биологических мембранах по эксимеризации пирена, Биофизика 44,455-460.

47. Chen Y, Lagerholm ВС, Yang В, Jacobson К. (2006) Methods to measure the lateral diffusion of membrane lipids and proteins, Methods 39,147-153.

48. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 320 с.

49. Niebylski C.D., Petty H.R. (1991) Cyclosporine A induces an early and transient rigidification of lymphocyte membranes, J. Leukoc. Biol 49,407-415.

50. Kleinfeld A.M., Dragsten P., Klausner R.D., Pjura W.J., Matayaoshi E.D. (1981) The lack of relationship between fluorescence polarization and lateral diffusion, Biochim. Biophys. Ada 649, 471-480.

51. Portoles M.T., Pagani R., Diaz-Laviada I., Municio A.M. (1987) Effect of Escherichia coli lipopolysaccharide on the microviscosity of liver plasma membranes and hepatocyte suspensions and monolayers, Cell Biochem. Fund. 5, 55-61.

52. Viti V., Cicero R., Callari D., Guidoni L., Billitteri A., Sichel G. (1983) Effect of lipophilic vitamins on the erythrocyte membrane. 31P NMR and fluorescence studies, FEBS Lett. 158,36-40.

53. Ohno H., Shimidzu N., Tsuchida E., Sasakawa S., Honda K. (1981) Fluorescence polarization study on the increase of membrane fluidity of human erythrocyte ghosts induced by synthetic water-soluble polymers, Biochim. Biophys. Acta 649, 221-228.

54. Melik-Nubarov N.S., Pomaz O.O., Dorodnych T.Yu., Badun G.A., Ksenofontov A.L.,Schemchukova O.B., Arzhakov S.A. (1999) Interaction of tumor and normal blood cells with ethylene oxide and propylene oxide block copolymers, FEBS Lett. 446,194-198.

55. Campanella R. (1992) Membrane lipids modifications in human gliomas of different degree of malignancy, J. Neurosurg. Sci. 36,11-25.

56. Химия биологически активных природных соединений. (1976) Под ред. Н.А. Преображенского и Р.П. Евстигнеевой. М.:Химия, с. 346-368.

57. Daum G. (1985) Lipids of mitochondria, Biochim. Biophys. Acta 822,1-42.

58. Devaux P.F., Seigneuret M. (1985) Specificity of lipid-protein interactions as determined by spectroscopic techniques, Biochim. Biophys. Acta 822, 63-125.

59. Silvius J.R. (1986) Solid- and liquid-phase equilibria in phosphatidylcholine/ phosphatidylethanolamine mixtures. A calorimetric study, Biochim. Biophys. Acta 857, 217-228.

60. Dorfler H.D. (1990) Mixing behavior of binary insoluble phospholipid monolayers. Analysis of the mixing properties of binary lecithin and cephalin systems by application of several surface and spreading techniques, Adv. Colloid Interface Sci. 31,1-110.

61. Lee A.G. (1975) Fluorescence studies of chlorophyll a incorporated into lipid mixtures, and the interpretation of "phase" diagrams, Biochim. Biophys. Acta 413, 11-23.

62. Lee A.G. (1977) Lipid phase transitions and phase diagrams. II. Mictures involving lipids, Biochim. Biophys. Acta 472,285-344.

63. Shimshick E.J., McConnell H.M. (1973) Lateral phase separation in phospholipid membranes, Biochemistry 12,2351-2360.

64. Yeagle P.L., Hutton W.C., Huang C., Martin R.B. (1976) Structure in the polar head region of phospholipid bilayers: A 31P 'H. nuclear Overhauser effect study, Biochemistry 15,2121-2124.

65. Cheng K.H. (1989) Fluorescence depolarization study on non-bilayer phases of phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine lipid mixtures, Chem. Phys. Lipids 51,137-145.

66. Silvius J.R., Brown P.M., O'Leary T.J. (1986) Role of head group structure in the phase behavior of amino phospholipids. 1. Hydrated and dehydrated lamellar phases of saturated phosphatidylethanolamine analogues, Biochemistry 25,4249-4258.

67. Van Dijck P.W., De Kruijff В., Van Deenen L.L., De Gier J., Demel R.A. (1976) The preference of cholesterol for phosphatidylcholine in mixed phosphatidylcholine-phosphatidylethanolamine bilayers, Biochim. Biophys. Acta 455, 576-587.

68. Boni L.T., Hui S.W. (1983) Polymorphic phase behaviour of dilinoleoylphosphatidylethanolamine and palmitoyloleoylphosphatidylcholine mixtures. Structural changes between hexagonal, cubic and bilayer phases, Biochim. Biophys. Acta 731, 177-185.

69. Sugar I.P., Monticelli G. (1983) Landau theory of two-component phospholipid bilayers. I. Phosphatidylcholine/phosphatidylethanolamine mixtures, Biophys. Chem. 18, 281-289.

70. Berclaz Т., McConnell H.M. (1981) Phase Equilibria in binary mixtures of dimyristoylphosphatidylcholine and cardiolipin, Biochemistry 20, 6635-6640.

71. Дятловицкая Э.В. (2000) Взаимосвязь между биологическими функциями липидов и их химической структурой, Биоорг. хим. 26,12-18.

72. Barenholz Y., Thompson Т.Е. (1980) Sphingomyelins in bilayers and biological membranes, Biochim. Biophys. Acta 604,129-158.

73. Lentz B.R., Hoechli M., Barenholz Y. (1981) Acyl chain order and lateral domain formation in mixed phosphatidylcholine-sphingomyelin multilamellar and unilamellar vesicles, Biochemistry 20, 6803-6809.

74. Untrach S.H., Shipley G.C. (1977) Molecular interactions between lecithin and sphingomyelin. Temperature- and composition-dependent phase separation, J. Biol. Chem. 252,4449-4457.

75. Shinitzky M., Barenholz Y. (1978) Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence polarization, Biochim. Biophys. Acta 515,367-394.

76. Barenholz Y., Gibbes D., Litman B.J. (1977) A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles, Biochemistry 16,2806-2810.

77. Bertoli E., Masserini M., Sonnino S. (1981) Electron paramagnetic resonance studies on the fluidity and surface dynamics of egg phosphatidylcholine vesicles containing gangliosides, Biochim. Biophys. Acta 647,196-202.

78. Hill M.W., Lester R. (1972) Mixtures of gangliosides and phosphatidylcholine in aqueous dispersions, Biochim. Biophys. Acta 282, 18-30.

79. Hinz H.-J., Korner O., Nicolau C. (1981) Influence of gangliosides GM1 and GDla on structural and thermotropic properties of sonicated small 1,2-dipalmitoyl-L-alpha-phosphatidylcholine vesicles, Biochim. Biophys. Acta 643, 557-571.

80. Maggio В., Cumar F.A., Caputto R. (1980) Configuration and interaction of the polar head group in gangliosides, Biochem. J. 189,435-440.

81. Schmidt C.F., Barenholz Y., Huang C., Thompson Т.Е. (1978) Monolayer coupling in sphingomyelin bilayer systems, Nature 271, 775-777.

82. Sharom F.J., Grant C.W.M. (1977) A ganglioside spin label: ganglioside head group interactions, Biochem. Biophys. Res. Communs 74, 1039-1045.

83. Sharom F.J., Grant C.W.M. (1978) A model for ganglioside behaviour in cell membranes, Biochim. Biophys. Acta 507,280-293.

84. Madden T.D., Cullis P.R. (1982) Stabilization of bilayer structure for unsaturated phosphatidylethanolamines by detergents, Biochim. Biophys. Acta 684,149-153.

85. Hakomori S. (2002) Glycosylation defining cancer malignancy.' new wine in an old bottle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,10231-10233.

86. Sankaram M.B., Thompson Т.Е. (1991) Cholesterol-induced fluid-phase immiscibility in membranes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8686-8690.

87. Mateo C.R., Acuna A.U., Brochon J.-C. (1995) Liquid-crystalline phases of cholesterol/lipid bilayers as revealed by the fluorescence of trans-parinaric acid, Biophys. J. 68, 978-987.

88. Miao L., Nielsen M., Thewalt J., Ipsen J.H., Bloom M., Zuckermann M.J., Mouritsen O.G. (2002) From lanosterol to cholesterol: structural evolution and differential effects on lipid bilayers, Biophys. J. 82,1429-1444.

89. Wang T.-Y., Silvius J.R. (2001) Cholesterol does not induce segregation of liquid-ordered domains in bilayers modeling the inner leaflet of the plasma membrane, Biophys. J. 81,2762-2773.

90. Almeida P.F.F., Vaz W.L.C., Thompson Т.Е. (1993) Percolation and diffusion in three-component lipid bilayers: effect of cholesterol on an equimolar mixture of two phosphatidylcholines, Biophys. J. 64, 399-412.

91. Keller S.L., Anderson T.G., McConnell H.M. (2000)Miscibility critical pressures in monolayers of ternary lipid mixtures, Biophys. J. 79,2033-2042.

92. Silvius J.R., del Giudice D., Lafleur M. (1996) Cholesterol at different bilayer concentrations can promote or antagonize lateral segregation of phospholipids of differing acyl chain length, Biochemistry 35, 15198-15208.

93. Heerklotz H. (2002) Triton promotes domain formation in lipid raft mixtures, Biophys. J. 83, 2693-2701.

94. Mitchell D.C., Litman B.J. (1998) Effect of cholesterol on molecular order and dynamics in highly polyunsaturated phospholipid bilayers, Biophys. J. 75, 896-908.

95. Chiu S.W., Jakobsson E., Mashl R.J., Scott H.L. (2002) Cholesterol-induced modifications in lipid bilayers: a simulation study, Biophys. J. 83,1842-1853.

96. Anderson T.G., McConnell H.M. (2001) Condensed complexes and the calorimetry of cholesterol-phospholipid bilayers, Biophys. J. 81,2774-2785.

97. Anderson T.G., McConnell H.M. (2002) A thermodynamic model for extended complexes of cholesterol and phospholipid, Biophys. J. 83,2039-2052.

98. Kessel A., Ben-Tal N., May S. (2001) Interactions of cholesterol with lipid bilayers: the preferred configuration and fluctuations, Biophys. J. 81,643-658.

99. Feigenson G.W., Buboltz J.T. (2001) Ternary phase diagram of dipalmitoyl-PC/dilauroyl-PC/cholesterol: nanoscopic domain formation driven by cholesterol, Biophys. J. 80,2775-2788.

100. Brown D.A. (2001) Seeing is believing: visualization of rafts in model membranes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,10517-10518.

101. Brown R.E (1998) Sphingolipid organization in biomembranes: what physical studies of model membranes reveal, J. Cell Sci. Ill, 1-9.

102. Dietrich C., Bagatolli L.A., Volovyk Z.N., Thompson N.L., Levi M., Jacobson K., Gratton E.2001) Lipid rafts reconstituted in model membranes, Biophys. J. 80,1417-1428.

103. Guo W„ Kurze V., Huber Т., Afdhal N.H., Beyer K„ Hamilton J.A. (2002) A solid-state NMR study of phospholipid-cholesterol interactions: sphingomyelin-cholesterol binary systems, Biophys. J. 83, 1465-1478.

104. Yuan C., Johnston L.J. (2000) Distribution of ganglioside GM1 in L-alpha-dipalmitoylphosphatidylcholine/cholesterol monolayers: a model for lipid rafts, Biophys. J. 79, 2768-2781.

105. Yuan C., Furlong J., Burgos P., Johnston L.J. (2002) The size of lipid rafts: an atomic force microscopy study of ganglioside GM1 domains in sphingomyelin/DOPC/cholesterol membranes, Biophys. J. 82,2526-2535.

106. Gandhavadi M., Allende D., Vidal A., Simon S.A., Mcintosh T.J. (2002) Structure, composition, and peptide binding properties of detergent soluble bilayers and detergent resistant rafts, Biophys. J. 82,1469-1482.

107. Wang T.-Y., Leventis R., Silvius J.R. (2000) Fluorescence-based evaluation of the partitioning of lipids and lipidated peptides into liquid-ordered lipid microdomains: a model for molecular partitioning into "lipid rafts", Biophys. J. 79,919-933.

108. Mouritsen O.G., Jorgensen K. (1995) Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid bilayers and its influence on macroscopic membrane properties, Mol. Membr. Biol. 12, 15-20.

109. Hao M., Mukheijee S., Maxfield F.R. (2001) Cholesterol depletion induces large scale domain segregation in living cell membranes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,13072-13077.

110. Schutz G.J., Kada G., Pastushenko V.P., Schindler H. (2000) Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy, EMBO J. 19,892-901.

111. Bergelson L.D., Dyatlovitskaya E.V., Torkhovskaya T.I., Sorokina I.B., Gorkova N.P. (1970) Phospholipid composition of membranes in the tumor cell, Biochim. Biophys. Acta 210,276-286.

112. L.D. Bergelson, E.V. Dyatlovitskaya, T.I. Torkhovskaya, I.B. Sorokina and N.P. Gorkova (1968) Dedifferentiation of phospholipids composition in subcellular particles of cancer cells, FEBS Lett. 2, 87-90.

113. Дятловицкая Э.В., неопубликованные данные.

114. Reynier M., Sari H., d'Anglebermes M., Куе Е.А., Pasero L. (1991) Differences in lipid characteristics of undifferentiated and enterocytic-differentiated HT29 human colonic cells, Cancer Res. 51,1270-1277.

115. Podo F. (1999) Tumour phospholipid metabolism, NMR Biomed. 12,413-439.

116. Tessitore L., Dianzani I., Cui Z., Vance D.E. (1999) Diminished expression of phosphatidylethanolamine N-methyltransferase 2 during hepatocarcinogenesis, Biochem. J. 337, 2327.

117. Johnson S.M., Robinson R. (1979) The composition and fluidity of normal and leukaemic or lymphomatous lymphocyte plasma membranes in mouse and man, Biochim. Biophys. Acta 558, 282-295.

118. Ramu A., Glaubiger D., Weintraub H. (1984) Differences in lipid composition of doxorubicin-sensitive and -resistant P388 cells, Cancer Treat Rep. 68, 637-641.

119. Паламарчук В.И., Трикаш И.О. (1983) Изменения в составе стеролов и в свойствах мембран эритроцитов крыс при лейкемии Швеца и после УФ облучения, Вопр. Мед. Хим. 29, 67-70.

120. Hidvegi E.J., Yatvin M.B., Dennis W.H., Hidvegi E. (1980) Effect of altered membrane lipid composition and procaine on hyperthermic killing of ascites tumor cells, Oncology 37,360-363.

121. Csuka O., Sugar J. (1978) Alterations of membrane constituents in carcinomas and drug resistant tumour cells, Arch. Geschwulstforsch. 48, 770-782.

122. Кобляков B.A., Сомова О.Г., Кондаленко В.Ф., Осташкина Н.М., Кандыба А.Г., Дубовая Т.К., Дятловицкая Э.В. (2001) Различия в липидном составе и пролиферативной активности крысиной гепатомы-27 в зависимости от органа, Биохимия 66,745-750.

123. Tapiero H., Mishal Z., Wioland M., Silber A., Fourcade A., Zwingelstein G. (1986) Changes in biophysical parameters and in phospholipid composition associated with resistance to doxorubicin, Anticancer Res. 6,649-652.

124. Ramu A., Glaubiger D., Weintraub H. (1984) Differences in lipid composition of doxorubicin-sensitive and -resistant P388 cells, Cancer Treat Rep. 68, 637-641.

125. Holleran W.M., DeGregorio M.W., Ganapathi R., Wilbur J.R., Macher B.A. (1986) Characterization of cellular lipids in doxorubicin-sensitive and -resistant P388 mouse leukemia cells, Cancer Chemother. Pharmacol. /7,11-15.

126. Котык А., Яначек К. (1980) Мембранный транспорт. М.:Мир, 188-197.

127. Evtodienko V.Y., Kovbasnjuk O.N., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. (1996) Effect of the alkyl chain length of monocarboxylic acid on the permeation through bilayer lipid membranes, Biochim. Biophys. Acta 1281,245-251.

128. Jackson M.J. (1987) Weak electrolyte transport across Biological membranes, General principles. In: Membrane physiology (ed.by Thomas Andreoli), New York and London: Plenum Medical Book, 235-236.

129. Deamer D.W. (1987) Proton permeation of lipid bilayers, J. Bioenerg. Biomembr. 19,457-479.

130. Al-Awqati Q. (1995) Chloride channels of intracellular organelles, Curr. Opin Cell Biol. 7, 504-508.

131. Doherty M.M., Michael M. (2003) Tumoral drug metabolism: perspectives and therapeutic implications, Curr. Drug Metab. 4, 131-149.

132. Andreoli Т.Е. (1974) Planar lipid bilayer membranes, Methods Enzymol. 32, 513-539.

133. Montal M., Mueller P. (1972) Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,3561-3566.

134. Prenner E.J., Lewis R.N., McElhaney R.N. (1999) The interaction of the antimicrobial peptide gramicidin S with lipid bilayer model and biological membranes, Biochim. Biophys. Acta 1462, 201-221.

135. Bainbridge G., Gokce I., Lakey J.H. (1998) Voltage gating is a fundamental feature of porin and toxin beta-barrel membrane channels, FEBSLett. 431,305-308.

136. Latorre R., Alvarez O. (1981) Voltage-dependent channels in planar lipid bilayer membranes, Physiol. Rev. 61,77-150.

137. Zakharov S.D., Cramer W.A. (2002) Insertion intermediates of pore-forming colicins in membrane two-dimensional space, Biochimie 84,465-475.

138. Kourie J.I., Wood H.B. (2000) Biophysical and molecular properties of annexin-formed channels, Prog. Biophys. Mol. Biol. 73,91-134.

139. Hilgemann D.W. (1997) Cytoplasmic ATP-dependent regulation of ion transporters and channels: mechanisms and messengers, Annu. Rev. Physiol. 59, 193-220.

140. White S.H., Petersen D.C., Simon S., Yafuso M. (1976) Formation of planar bilayer membranes from lipid monolayers. A critique, Biophys. J. 16,481-489.

141. Hansch С., Dunn W.J. (1972) Linear relationships between lipophilic character and biological activity of drugs, J. Pharm. Sci. 61, 1-19.

142. Alegria A.E., Santiago G. (1997) Adriamycin and daunomycin semiquinone membrane/buffer partition constants using the spin-broadening technique, Arch. Biochem. Biophys. 346,91-95.

143. Griffin E.A., Vanderkooi J.M., Maniara G., Erecinska M. (1986) Anthracycline binding to synthetic and natural membranes. A study using resonance energy transfer, Biochemistry 25, 78757880.

144. Soderlund Т., Jutila, A., Kinnunen, P.K. (1999) Binding of adriamycin to liposomes as a probe for membrane lateral organization, Biophys. J. 76, 896-907.

145. Heywang C., Saint-Pierre Chazalet M, Masson C.M., Bolard J. (1998) Orientation of anthracyclines in lipid monolayers and planar asymmetrical bilayers: a surface-enhanced resonance Raman scattering study, Biophys. J. 75,2368-2381.

146. Frezard F, Garnier-Suillerot A. (1991) DNA-containing liposomes as a model for the study of cell membrane permeation by anthracycline derivatives, Biochemistry 30, 5038-5043.

147. Harrigan P.R., Wong K.F., Redelmeier Т.Е., Wheeler J.J., Cullis P.R. (1993) Accumulation of doxorubicin and other lipophilic amines into large unilamellar vesicles in response to transmembrane pH gradients, Biochim. Biophys. Acta 1149, 329-338.

148. Chakrabarti A.C., Clark-Lewis I., Harrigan P.R., Cullis P.R. (1992) Uptake of basic amino acids and peptides into liposomes in response to transmembrane pH gradients, Biophys. J. 61, 228234.

149. Maurer-Spurej E., Wong K.F., Maurer N., Fenske D.B., Cullis P.R. (1999) Factors influencing uptake and retention of amino-containing drugs in large unilamellar vesicles exhibiting transmembrane pH gradients, Biochim. Biophys. Acta 1416, 1-10.

150. Males R.G., Herring F.G. (1999) A 'H-NMR study of the permeation of glycolic acid through phospholipid membranes, Biochim. Biophys. Acta 1416, 333-338.

151. Осипова C.B. (1990) Ассоциативные свойства блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена в водных растворах. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, М.: МГУ.

152. Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Снитко Л.Э., Хворов Н.В. (1994) Термоиндуцированное комплексообразование между а-химотрипсином и амфифильным блок-сополимером., ДАН 339,498-502.

153. Топчиева И.Н., Сорокина Е.И., Курганов Б.И., Жулин В.М. (1996) Комплексообразование между а-химотрипсином и блок-сополимерами на основе окиси этилена и окиси пропилена, индуцируемое действием высоких давлений, Биохимия 61, 10411045.

154. Almeida N.L., Oliveira C.L., Torriani I.L., Loh W. (2004) Calorimetric and structural investigation of the interaction of lysozyme and bovine serum albumin with poly(ethylene oxide) and its copolymers, Colloids Surf. В Biointerfaces 38, 67-76.

155. Lojewska Z. and Loew L.M. (1987) Insertion of amphiphilic molecules into membranes is catalyzed by a high molecular weight nonionic surfactant, Biochim. Biophys. Acta 899, 104-112.

156. Топчиева И.Н., Осипова С.В., Банацкая М.И., Валькова JI.A. (1989) Мембранотропные свойства блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена, ДАН СССР 308,910-913.

157. Firestone М.А., Wolf А.С., Seifert S. (2003) Small-angle X-ray scattering study of the interaction of poly(ethyleneoxide)-b-poly(propylene oxide)-b-poly(ethylene oxide) triblock copolymers with lipid bilayers, Biomacromolecules 4, 1539-1549.

158. Firestone M.A., Seifert S. (2005) Interaction of nonionic PEO-PPO diblock copolymers with lipid bilayers, Biomacromolecules 6,2678-2687.

159. Kostarelos K., Tadros Th.F., Luckham P.F. (1999) Physical conjugation of (tri-)block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems, Langmuir 15, 369-376.

160. Johnsson M., Silvander M., Karlsson G., Edwards K. (1999) Effect of PEO-PPO-PEO triblock copolymers on structure and stability of phosphatidylcholine liposomes, Langmuir 15, 6314-6325.

161. Bryskhe K., Schillen K., Loefroth J.-E., Olsson U. (2001) Lipid-block copolymer immiscibility, Phys. Chem. Chem. Phys. 3, 1303-1309.

162. Krylova OO, Pohl P. (2004) Ionophoric activity of pluronic block copolymers, Biochemistry 43, 3696-3703.

163. Atkinson T.P., Smith T.F., Hunter R.L. (1988) Histamine release from human basophils by synthetic block co-polymers composed of polyoxyethylene and polyoxypropylene and synergy with immunologic and non-immunologic stimuli, J. Immunol. 141, 1307-1310.

164. Wu G., Majewski J., Ege C., Kjaer K., Weygand M.J., Lee K.Y.C. (2004) Lipid corralling and poloxamer squeeze-out in membranes, Phys. Rev. Lett. 93, 028101-1-028101-4.

165. Jamshaid M., Farr S. J., Kearney P., Kellaway I. W. (1988) Poloxamer sorption on liposomes: comparison with polystyrene latex and influence on solute efflux, Int. J. Pharm. 48,125-131.

166. Silvander M. (2002) Steric stabilization of liposomes, Progr. Colloid Polymer Sci. 120, 35-40.

167. Chandaroy P., Sen A., Hui S.W. (2001) Temperature-controlled content release from liposomes encapsulating Pluronic F127, J. Control. Release 76,27-37.

168. Bergstrand N., Edwards K. (2004) Effects of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymers on structure and stability of liposomal dioleoylphosphatidylethanolamine, J. Colloid Interface Sci. 276,400-407.

169. Kaye S. and Merry S. (1985) Tumor cell resistance to anthracyclines. -a review, Pharmacol 14, 96-103.

170. Lage H. (2003) ABC-transporters: implications on drug resistance from microorganisms to human cancers, Int. J. Antimicrob. Agents 22,188-199.

171. Nielsen D, Skovsgaard T. (1992) P-glycoprotein as multidrug transporter: a critical review of current multidrug resistant cell lines, Biochim. Biophys. Acta 1139,169-183.

172. Akiama S. (1993) Molecular basis for resistance to anticancer agents and reversal of the resistance, Human Cell 6,1-6.

173. Damiani D., Michieli M., Michelutti A., Melli C., Cerno M., Baccarani M. (1993) D-verapamil downmodulates P-170 associated resistance to doxorubicin, daunorubicin and idarubicin, Anticancer Drug 4,173-180.

174. Hinderburg A.A., Baker M.A., Gleyzer E., Stevart V.J., Case N„ Taub R.N. (1987) Effects of verapamil and other agents on the distribution on antracyclines and of reversal of drug resistance, Cancer Research 47,1421-1425.

175. Cornwell M.M., Pastan I., Gottesman M.M. (1987) Certain calcium channel blockers bind specifically to multidrug resistant human KB carcinoma membrane vesicles and inhibit drug binding to P-glycoprotein,/. Biol Chem. 262,2166-2170.

176. De Isabella P., Capranico G., Binaschi M., Tinelli S., Zunino F. (1990) Evidence of DNA-topoisomerase II-dependent mechanisms of multidrug resistance of P338 leukemia cells, Mol. Pharmacol. 37,11-16.

177. Gollapudi S., Patel K., Jain V., Gupta S. (1992) Protein kinase С isoforms in multidrug resistant P338/ADR cells: a possible role in daunorubicin transport, Cancer Lett. 62,69-75.

178. Versantvoort C.H.M., Broxterman H.J., Feller N., Dekker H., Kuiper C.M., and Lankelma J. (1992) Probing daunorubicin accumulation defects in non-P-glycoprotein expressing multidrug resistant cell lines using digitonin, Int. J. Cancer 50,906-911.

179. Munshi N., RapoportN., Pitt W.G. (1997) Ultrasonic activated drug delivery from Pluronic P-105 micelles, Cancer Lett. 118,13-19.

180. Husseini G.A., Myrup G.D., Pitt W.G., Christensen D.A., Rapoport N.Y. (2000) Factors affecting acoustically triggered release of drugs from polymeric micelles, J. Control. Release 69, 43-52.

181. Marin A., Muniruzzaman M., Rapoport N.Y. (2001) Mechanism of the ultrasonic activation of micellar drug delivery, J. Control. Release. 75, 69-81.

182. Rapoport N.Y., Herron J.N., Pitt W.G., Pitina L. (1999) Micellar delivery of doxorubicin and its paramagnetic analog, ruboxyl, to HL-60 cells: effect of micelle structure and ultrasound on the intracellular drug uptake, J. Control. Release 58,153-162.

183. Alakhov V.Y., Moskaleva E.Y., Batrakova E.V., Kabanov A.V. (1996) Hypersensitization of multidrug resistant human ovarian carcinoma cells by Pluronic P85 block copolymer, Bioconjugate Chem. 7, 209-216.

184. Batrakova E.V., Han H.Y., Miller D.W., Kabanov A.V. (1998) Effects of Pluronic® P85 unimers and micelles on drug permeability in polarized BBMEC and Caco-2 cells, Pharmaceutical Research 15, 1525-1532.

185. Batrakova E.V., Han H.Y., Alakhov V.Y., Miller D.W., Kabanov A.V. (1998) Effects of Pluronic® block copolymers on drug absorption in Caco-2 cell monolayers, Pharmaceutical Research 15, 850-855.

186. Alakhov V.Y., Klinsky E.Y., Li S., Pietrzynski G., Venne A., Batrakova E.V., Bronich Т., Kabanov A.V. (1999) Block copolymer-based formulation of doxorubicin. From cell screen to clinical trials, Colloid and Surfaces B: Biointerfaces 16,113-134.

187. Kabanov AV, Batrakova EV, Alakhov VY (2003) An essential relationship between ATP depletion and chemosensitizing activity of Pluronic block copolymers, J. Control. Release 91, 7583.

188. Coon J.S., Knudson W., Clodfelter K., Lu В., Weinstein R.S. (1991) Solutol HS 15, nontoxic polyoxyethylene esters of 12-hydroxystearic acid, reverses multidrug resistance, Cancer Research 51, 897-902.

189. Buckingham L.E., Balasubramanian M., Safa A.R., Shah H., Komarov P., Emanuele R.M., Coon J.S. (1996) Reversal of multi-drug resistance in vitro by fatty acid-PEG-fatty acid diesters, Int. J. Cancer 65, 74-79.

190. Friche E., Jensen P.B., Sehested M., Demant E.R., Nissen N.N. (1990) The solvents Cremohpor EL and Tween 80 modulate daunorubicin resistance in the multidrag resistant Ehrlich ascites tumor, Cancer Commun. 2, 297-303.

191. Batrakova E.V., Miller D.W., Li S., Alakhov V.Y., Kabanov A.V., Elmquist W.F. (2001) Pluronic P85 enhances the delivery of digoxin to the brain: in vitro and in vivo studies, J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, 551-557.

192. Singh A., Thornton E.R., Westheimer F.H. (1962) The photolysis of diazoacetylchymotrypsin, J. Biol. Chem. 237, 3006-3008.

193. Bayley, H. (1983) in Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (eds. Work T.S., Burdon R.H.) vol. 12. Amsterdam/New York: Elsevier, Oxford, 187.

194. Chowdhry V., Westheimer F.H. (1979) Photoaffinity labeling of biological systems, Annu. Rev. Biochem. 48,293-325.

195. Schnapp K.A., Рое R., Leyva E., Soundararajan N., Platz M.S. (1993) Exploratory photochemistry of fluorinated aryl azides. Implications for the design of photoaffinity labeling reagents, Bioconjug. Chem. 4,172-177.

196. Тараненко M.B., Мчедлидзе M.T. (2002) Изучение кинетики фотолиза соединений, содержащих арил(трифторметил)диазириновую группу, Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 43, 47-50.

197. Brunner J., Senn Н., Richards F.M. (1980) 3-Trifluoromethyl-3-phenyldiazirin, J. Biol. Chem. 255,3313-3318.

198. Kotzyba-Hibert F., Kapfer I., Goeldner M. (1995) Recent Trends in Photoaffinity Labeling, Ange. Chem. Int. Ed. Engl. 34,1296-1312.

199. Doring Т., Mitchell P., Osswald M., Bochkariov D., Brimacombe R. (1994) The decoding region of 16S RNA; a cross-linking study of the ribosomal A, P and E sites using tRNA derivatized at position 32 in the anticodon loop, EMBO J. 13,2677-2685.

200. Osswald M., Doring Т., Brimacombe R. (1995) The ribosomal neighbourhood of the central fold of tRNA: cross-links from position 47 of tRNA located at the A, P or E site, Nucleic Acids Res. 23, 4635-4641.

201. Stade K., Riens S., Bochkariov D., Brimacombe R. (1994) Contacts between the growing peptide chain and the 23S RNA in the 50S ribosomal subunit, Nucleic Acids Res. 22,1394-1399.

202. Brunner J. (1996) Use of photocrosslinkers in cell biology, Trends Cell. Biol. 6,154-157.

203. Fleming, S.A. (1995) Chemical reagents in photoaffinity labeling, Tetrahedron 51, 1247912520.

204. Staros J.V., Bayley H., Standring D.N., Knowles, J.R. (1978) Reduction of aryl azides by thiols: implications for the use of photoaffinity reagents, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 568572.

205. Czarnecki J., Geahlen R., Haley, B. (1979) Synthesis and use of azido photoaffinity analogs of adenine and guanine nucleotides, Methods Enzymol. 56,642-653.

206. Tate J.J., Persinger J., Bartholomew B. (1988) Survey of four different photoreactive moities for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes, Nucleic Acids Research 26,1421-1426.

207. Дехант И., Данц P., Киммер В., Шмольке Р. (1976) Инфракрасная спектроскопия полимеров. М.: Химия, 300 с.

208. Ю.Ю.Лурье (1979) Справочник по аналитической химии. М.:Химия, 92-101.

209. Fields R. (1971) The measurement of amino groups in proteins and peptides, Biochem. J. 124, 581-590.

210. New R.R.C. (1990) Liposomes: a practical approach. Oxford: IRL Press, 318 p.

211. Plasek Y., Yarolim P. (1987) Interaction of the fluorescent probe l,6-diphenyl-l,3,5-hexatriene with biomembranes, Gen. Physiol. Biophys. 6, 425-437.

212. Shinitzky M., Inbar M. (1976) Microviscosity parameters and protein mobility in biological membranes, Biophys. Biochem. Acta 433,133-149.

213. Остерман Л. A. (1983) Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 304 с.

214. Walter А. (1985) Continuous mixing experiments allow to determine the size of binding sites for anthracyclines complexed to DNA, Biomed. Biochim. Acta 44, 1321-1327.

215. Mclntyre J.C., Sleight R.G. (1991) Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry, Biochemistry 30,11819-11827.

216. Carmichael J., DeGraff W.D., Gazdar Adi.F., Minna J.D., Mitchell J.B. (1987) Chemosensitivity testing of human colorectal carcinoma cell lines using a tetrazolium-based colorimetric assay, Cancer Res. 47, 936-942.

217. Lowry O.H., Rosenbrought N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) Protein mesuarement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193,265-275.

218. Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. (1957) A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues, J. Biol. Chem. 226,497-509.

219. Cleveland D.W., Fischer S.G., Kirschner M.W., Laemmli U.K. (1977) Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis, J. Biol. Chem. 252,1102-1106.

220. Bonner W.M., Laskey R.A. (1974) A film detection method for tritium-labelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels, Eur. J. Biochem. 46, 83-88.

221. Santos S.F., Zanette D., Fischer H., Itri R. (2003) A systematic study of bovine serum albumin (BSA) and sodium dodecyl sulfate (SDS) interactions by surface tension and small angle X-ray scattering, J. Colloid Interface Sci. 262,400-408.

222. Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 12,248-254.

223. Дёмина T.B. (2007) Диссертация на соискание. канд. хим. наук. М.: МГУ.

224. Глебов Р.Н. (1987) Эндоцитоз и экзоцитоз. Сер.: Биохимия мембран (под ред. Болдырева А.А.) Кн.2. М.: Высш.шк., 95 с.

225. Биологические мембраны. Методы. (1990) ред. Финдлей Дж., Эванс У. М.:Мир, 424 с.

226. Beck-Sickinger A.G., Wieland Н.А., Brunner J. (1995) Synthesis, receptor binding, and crosslinking of photoactive analogues of neuropeptide Y, J. Recept. Signal Transduct. Res. 15, 473485.

227. Abreu M.S.C., Estronca L.M.B.B., Moreno M.J., Vaz W.L.C. (2003) Binding of a fluorescent lipid amphiphile to albumin and its transfer to lipid bilayer membranes, Biophys. J. 84, 386-399.

228. Sotirhos N., Thorngren C., Herslof B. (1985) Reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation and mass detection of individual phospholipid classes, J. Chromatogr. 557,313-320.

229. Krylova O.O., Melik-Nubarov N.S., Badun G.A., Ksenofontov A.L., Menger F.M., Yaroslavov A.A. (2003) Pluronic L61 accelerates flip-flop and transbilayer doxorubicin permeation, Chemistry 9,3930-3936.

230. Hollan S. (1996) Membrane fluidity of blood cells, Haematologia (Budap) 27,109-127.

231. Болдырев A.A., Прокопьева В.Д. (1985) Как регулируется активность мембранных ферментов, Науч. Докл. Высш. Школы. Виол. Науки, №9,5-13.

232. Koynova R., Caffrey М. (1994) Phases and phase transitions of the glycoglycerolipids, Chem. Phys. Lipids 69,181-207.

233. Powell G.L., Hui S.W. (1996) Tetraoleoylpyrophosphatidic acid: a four acyl-chain lipid which forms a hexagonal II phase with high curvature, Biophys. J. 70,1402-1406.

234. Epand R.M., Epand R.F. (1994) Calorimetric detection of curvature strain in phospholipid bilayers, Biophys. J. 66,1450-1456.

235. Leventis R., Fuller N., Rand R.P., Yeagle P.L., Sen A., Zuckermann M.J., Silvius J.R. (1991) Molecular organization and stability of hydrated dispersions of headgroup-modified phosphatidylethanolamine analogues, Biochemistry 30, 7212-7219.

236. Pei В., Chen J.-W. (2003) More ordered, convex ganglioside-enriched membrane domains: the effects of GM1 on sphingomyelin bilayers containing a low level of cholesterol, J. Biochem. 134, 575-581.

237. Marsh D. (1996) Intrinsic curvature in normal and inverted lipid structures and in membranes, Biophys J. 70,2248-2255.

238. Cornell B. (1987) Gramicidin A phospholipid model systems, J. Bioenerg. Biomembr. 19, 655-676.

239. Engelke M., Bojarski P., Diehl H.A., Kubicki A. (1996) Protein-dependent reduction of the pyrene excimer formation in membranes, J. Membr. Biol 153,117-123.

240. Kim J.W., Dang C.V. (2006) Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect, Cancer Res. 66, 8927-8830.

241. Sirover M.A. (1997) Role of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in normal cell function and in cell pathology, J. Cell Biochem. 66, 133-140.