Влияние макромолекулярной архитектуры амфифильных сополимеров на их взаимодействие с биологическими мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

□034Э324Э

На правах рукописи

ПАВЛОВ ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЙ АРХИТЕКТУРЫ АМФИФИЛЬНЫХ СОПОЛИМЕРОВ НА ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ

МЕМБРАНАМИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2009

003493249

Работа выполнена и лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится «9» декабря 2009 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 3, Химический факультет, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 0 » ноября 2009 г.

Научный руководитель:

доктор химических наук Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Паписов Иван Михайлович доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация:

Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова Российской академии наук

Ученый секретарь диссертационного совета, к. х. н.

Долгова А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интенсивное развитие синтетических методов химии полимеров в последние 10-15 лет открыло новые возможности получения огромного разнообразия макромолекул с заранее заданной дендритной, звездообразной или гребнеобразной архитектурой. Исследование процессов самоорганизации в таких системах привело к пониманию того, что форма макромолекулы и распределение в ней полярных и гидрофобных групп определяет свойства образуемых ей структур. Можно ожидать, что взаимодействие полимеров с анизотропными системами наноскопических размеров, такими как биологические или искусственные липидные мембраны, будет приводить к изменениям их структуры и проницаемости. Опубликованные в последнее время теоретические работы предсказывают, что встраивание амфифильных полимеров в липидную мембрану должно приводить к ее деформации, причем этот эффект в значительной мере определяется архитектурой полимерной макромолекулы. Известно, что деформация мембраны приводит к значительному изменению её барьерных свойств и скорости диффузии мембранных компонентов. Тем не менее, в литературе практически отсутствуют кспериментальные данные о взаимосвязи между геометрией амфифильных молекул и их способностью вызывать возмущения в упаковке липидного бислоя. астоящая работа направлена на исследование этой проблемы.

Цель работы состояла в определении структурных особенностей мфифильных сополимеров, которые обеспечивают их влияние на барьерные войства модельных липидных мембран и мембран живых клеток.

Научная новизна. В работе впервые показано, что наибольший эффект на зменение барьерных свойств искусственных мембран оказывают амфифильные ополимеры гребнеобразного строения. Установлено, что молекулярная рхитектура амфифильных сополимеров в значительной мере определяет их лияние на проницаемость мембран. Впервые показано, что способность ополимеров к образованию трансмембранных пор в липосомальных мембранах оррелирует с их токсичностью по отношению к клеткам аденокарциномы олочной железы. Подтверждены критерии, позволяющие предсказывать пособность полимеров к изменению проницаемости липидных мембран. Впервые родемонстрировано ускорение транспорта лекарств и увеличение подвижности ипидов в бислое и подавление множественной лекарственной устойчивости МЛУ) раковых клеток в присутствии сополимеров диметилсилоксана (ДМС) и тиленоксида (ЭО).

Практическая значимость работы. В работе показано, что блок-сополимер иметилсилоксана и этиленоксида способен увеличивать эффективность действия ротивоопухолевых препаратов, подавляя множественную лекарственную стойчивость раковых клеток - серьезное осложнение, возникающее при имиотерапии рака. Полученные в работе данные являются основой для «правленного поиска новых сополимеров, эффективных для лечения устойчивых форм онкологических заболеваний.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов, до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, 2005, 2006 и 2008 годы; Конференции «Структура и динамика молекулярных систем», Марий Эл, 2005, 2006, 2007, 2008 годы; III Съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2005 год; Малом полимерном конгрессе, Москва, 2005 год; Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, 2006, 2007 годы; 1ом Европейском химическом конгрессе, Будапешт, Венгрия, 2006 год; IV Всероссийской каргинская конференции «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007 год; 7ом Балтийском полимерном симпозиуме, Друшкининкай, Литва, 2007 год; бом Международном симпозиуме «Молекулярный порядок и подвижность в полимерных системах», Санкт-Петербург, 2008 год; 2ой Санкт-Петербургской международной конференции по нанобиотехнологиям «НаноБио 08», Санкт-Петербург, 2008 год; 4ом Международном симпозиуме макро- и супрамолекулярная архитектура и материалы, Дюссельдорф, Германия, 2008 год.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 24 печатных работах, включая 2 статьи в российских журналах, 1 статью в периодическом сборнике, 1 статью в иностранном журнале и 20 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 основных глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на Ир страницах, включая Чо рисунков и // таблиц. Список литературы состоит из ¡¡2 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследования взаимодействий амфифилышх сополимеров с биологическими мембранами, сформулированы основные задачи диссертационной работы.

В литературном обзоре представлен обзор сведений о структуре и составляющих биологических мембран, модельным системам на их основе и методам изучения их свойств. Рассмотрены теоретические представления о влиянии геометрии отдельных компонент на структуру бислоя. Описаны физико-химические свойства растворов амфифильных блок-сополимеров различной природы и архитектуры цепи, а также дан обзор данных по взаимодействию амфифильных сополимеров с модельными липидными системами и мембранами живых клеток.

В экспериментальной части описаны методы синтеза сополимеров, впервые полученных в настоящей работе, описаны методы получения липидных везикул, изучения их проницаемости, скорости трансмембранной миграции липидов. определения коэффициентов распределения полимеров между водой и липидным бислоем с помощью изотермической титрационной калориметрии и изучения цитотоксичности полимеров

Полученные автором результаты н их обсуяадение представлены в виде 2 разделов, одип из которых посвящен взаимодействию полимеров с модельными мембранами, а второй - взаимодействию полимеров с опухолевыми клетками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связь между строением амфифильных сополимеров и их взаимодействием с модельными липидными мембранами

В работе был исследован широкий круг амфифильных неионогенных полимеров, различающихся молекулярной массой, гидрофобностью, природой гидрофобного и гидрофильного блоков. Варьирование целого ряда структурных факторов позволяет установить, какие особенности строения амфифильных сополимеров определяют их способность изменять свойства искусственных и клеточных мембран. По химической природе и взаимному расположению блоков исследованные макромолекулярные структуры можно разделить на 6 структурных групп (см. рис. 1).

"С

&

ОН.ОН

гГр™

но он Ь-1 он

1011-2)

и Я^ССО ССЦСНРЩО), (7-13) Ш.й.1= лишпеат (№ 17)

I/ О—ХОНДН \ ОН "г-и.^Л-УуоН

Ч)ч /он

IV. К^-Н рй1в-21) 11,-ОД Кг-Н(НИ2) К1-Н, ЙСДРМЗ)

V. XI26-23

и К1= с^ор^сщснуо^рцс^о^цсц-

Р&4-6)

111.11,-^бНоРЬИ-И)

^ 11

VI. к-зал

IV! №25

Рис. 1. Структура исследованных амфифильных полимеров.

Первую группу составили сополимеры декстрана ([Иех), модифицированные относительно короткими полипропиленоксидными (ППО) фрагментами. Данные полимеры представляют собой «молекулярные щетки» со случайным распределением гидрофобных заместителей по цепи. Вторая и третья группы представлены сополимерами, содержащими гидрофильный блок полиглицерина (ПГлц) и различающимися природой гидрофобных цепей. Макромолекулы представителей четвертой группы построены из полиэтиленоксида и полипрониленоксида и имеют различную архитектуру. В данную группу вошли двух-, трех- и мультиблочные сополимеры. В пятую группу выделены наиболее изученные трехблочные сополимеры строения ПЭО-ППО-ПЭО. К шестой группе были отнесены синтетические поверхностно-активные вещества, состоящие из остатков высших спиртов и полиэтиленоксида. Состав,

значения гидрофильно-липофилыюго баланса и некоторые другие характеристики исследованных сополимеров представлены в табл. 1. Рассматривая все представленные группы можно выделить три основных типа макромолекулярной архитектуры: линейные блок-сополимеры (двух- и трехблочные), звездообразные сополимеры со случайно распределенными по поверхности заместителями, и, занимающие промежуточную между двумя названными типами нишу, гребнеобразные сополимеры. С точки зрения химической природы гидрофобных блоков все полимеры подразделяются на две группы: сополимеры, содержащие полипропиленоксид, и сополимеры, содержащие углеводородные радикалы. Гидрофильные компоненты в рассматриваемом наборе полимеров представлены декстраном, полиглицерином и полиэтиленоксидом (ПЭО).

Для всех сополимеров была исследована их способность к образованию трансмембранных каналов и активации транспорта ионной формы красителя Карбоксифлуоресцеина (КФ)

1.1. Влияние сополимеров на мембранный транспорт ионного красителя карбоксифлуоресцеина

Изучение способности сополимеров к образованию гидрофильных пор проводили с использованием малых моноламеллярных везикул (липосом). Липосомы из яичного лецитина заполняли раствором КФ с концентрацией 0,1 М. При этой концентрации КФ практически не флуоресцирует, поскольку излучаемый свет поглощается невозбужденными молекулами хромофора (эффект внутреннего фильтра). При рН 7,2 все молекулы КФ находятся в заряженной форме (рКа(1) = 6,4, рКа<2'=3,5) и не способны диффундировать через липидный бислой по механизму распределения-дифузии. Как показано на рис. 2, интенсивность флуоресценции образца липосом практически не меняется во времени (начальный участок кривой на рис. 2). При добавлении к липосомам раствора сополимера (показано стрелкой на рис. 2) наблюдалось возгорание флуоресценции, свидетельствующее о выходе КФ из внутреннего объема липосом во внешний буферный раствор. При этом кинетика увеличения интенсивности флуоресценции соответствуют моноэкспоненциальной зависимости увеличения концентрации КФ вне липосом.

Рис. 2. Кинетическая кривая возгорания флуоресценции КФ (а), определение концентрационно-независимого параметра $кя> (б)

Наклон графика концентрационной зависимости можно использовать в качестве величины, характеризующей способность макромолекул образовывать гидрофильные поры в липосомальных мембранах, поскольку этот параметр не зависит от концентрации полимера в образце. Тангенс угла наклона мы обозначим как рКф.

где С(Ро1) - концентрация полимера в образце в % массы, ко - эффективная константа скорости вытекания КФ в отсутствие полимера, а к - эффективная константа скорости транспорта КФ в присутствии данной концентрации полимера. Как правило, спонтанного вытекания КФ не наблюдалось, поэтому в большинстве опытов к0 принимали равной 0.

Величина ркф является не зависящей от концентрации полимера мерой его способности вызывать транспорт КФ через мембрану, а следовательно, служит показателем эффективности образования пор в липидном бислое. Значения величин ркф приведены в таблице 1. Наиболее сильное воздействием на ионную проницаемость мембраны оказывали сополимеры, имеющие щеточное строение. Звездчатые сополимеры на основе полиглицерина, содержащие в качестве гидрофобных заместителей полипропиленоксидные блоки, также ускоряли перенос КФ через мембрану, однако, в значительно меньшей степени, чем полимерные щетки. Двух- и трехблочные сополимеры этиленоксида и пропиленоксида также были способны эффективно образовывать поры в липидных бислоях.

Напротив, амфифильные сополимеры, содержащие углеводородные радикалы (полиэтоксилированные углеводороды, алкильные или ацильные производные полиглицеринов (С,6И!ГГлц2, С16Н3гГлц10, С16НзгГлц76 и Глц2$-линолевая кислота) характеризуются существенной способностью образовывать гидрофильные поры.

с £ -

2

"Ч ,. в

(а)

• Глц, - (ПО„)„

• Глц,,.(ПОД

С

г г

и Ъ

'о 1

в

(б)

эо-по-эо.

Э0.-по_-эо.„

эо-по-эо_

Число цепей ППО

г>°

00 150

п ЭО

Рис. 3. (а) Влияние объема гидрофобного блока на способность сополимера к формированию трансмембранных пор. (б) Влияние степени полимеризации гидрофилльного блока на способность сополимера к формированию трансмембранных пор.

№ | Сополимер | Рлф, мг/мл'1 с' | р ВОх, мг/мл'1 | ГЛБ

I. Декстран-ППО

1. Оех301Г(ПО35)5 120+6 16.7

2. 0ех3„1Г(П035)13 90±6 13.2

II. Сополимеры полиглицерина и полипропиленоксида

3. (П031Гсо-Э05)-Глц2 1±0.1 65.2+5 1.5

4. Глцг(П031гС0-Э0;)-Глц2 1.2±0.05 2.8

5. (ПО3(гсо-ЭО5)-Глц30 0.14+0.01 2.77±0.28 7.0

6. (П031Гсо-Э05)-Глц76 0.004+0.0005 0.11+0.01 7.6

7. ГлцгПОв нет эффекта 0.38+0.21 5.2

8. ГлцгПО,7 0.25±0.04 5.2±1.7 2.8

9. Глцг(ПО,7)2 0.78+0.07 9.43+0.83 1.3

10. Глцг(П017)3 3±0.4 12.32+1.08 0.7

11. Глц2ГП06 0.13±0.01 1.7±0.16 11.2

12. Глц2!-ПО,7 0.01±0.01 0.06+0.005 8.5

13. Глц2Г(ПО,7)2 0.075±0.007 0.59+0.1 6.1

III. Полиглицерины с гидрофобными заместителями

14. С16НЗГ Глц2 0.58 8.4

15. С16НЗГ Глц,„ 0.05 15.4

16. С16НЗГ Глц76 0.006 19.2

17. Глц2Глинолевая к-та 0.0024+0.0002 0.11+0.07 8.8

IV. Дву- и мультиблочные полиалкиленоксиды

18. эогпо6 2.75 42.5 12.1

19. эо,гпо,7 1.5 25.8 12.6

20. эо,гпо,7 1.78 34.2 12.8

21. эогпо„ 2.06 36.8 12.2

22. с4игэо,гпо2, 0.9+0.1 4.36 11.3

23. Э0,ГП02ГСН3 2.4±0.2 9.7 12.6

24. по,гэо,гпо,3 5+1 19.3 13.0

25. Полиметакрилоил-проксанол, ПМП 119±6 460 26.3

V. Трехблочные полиалкиленоксиды (плюроники)

26. Э0гП03<гЭ02 0.62+0.06 48 3

27. эо13-по31Гэо,3 0.1+0.011 8.62 15

28. Э0и-П03,гЭ076 0.00023±0.00001 0.71 29

29. ЭО,0<гПО(гЭОт 2.7±0.03 20 22

VI. Полиэтоксилированные углеводороды

30. с1бн33о-эо,в 0.53 12

31. с16н33о-эо2„ 0.27 16

32. с,2н2,о-эо4 0.22 9.7

33. с12н25о-эо23 0.1 16.9

Практически для всех групп сополимеров увеличение суммарной степени полимеризации гидрофобного и уменьшение степени полимеризации гидрофильного блока приводит к увеличению их влияния на скорость транспорта КФ (см. табл. 1). Так, сополимер ГлцгП06, имеющий только 6 звеньев ППО вообще не способен образовывать поры, а сополимер Глщ-ПОп, в котором степень полимеризации гидрофобного блока увеличивается до 17, проявляет уже заметную порообразующую способность. Увеличение количества таких полипропиленоксидных цепей со степенью полимеризации 17 в «звездчатых» сополимерах ГлцгЩО^г и Глц!-(11017)3 и в серии полимеров на основе полиглицерина со степенью полимеризации 25 (Глц2гПОп и Глц2г(П017)2) также приводит к значительному увеличению Рд-ф- Наконец, увеличение длины полипропиленоксидного блока в плюрониках от 30 до 65 при переходе от плюроника .Гб« (Э07/гП031ГЭ076) к П27 {Э01в№-П065-Э0ш) приводит к увеличению (Зл-д> почти на 4 порядка.

Очевидно, что встраивание сополимеров в липидный бислой является первой и необходимой стадией взаимодействия амфифильньтх сополимеров с липидными мембранами. Сродство амфифильных соединений к биологическим мембранам коррелирует с их гидрофобностью, критической концентрацией мицеллообразоваиия (ККМ) и гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ). Величина ГЛБ может быть легко рассчитана исходя из структуры полимера (табл. 1), поэтому этот параметр в дальнейшем был использован для учета гидрофобное™ полимеров для исследования связи между структурой полимеров и их способностью образовывать поры в липидных мембранах. Корреляция скорости вытекания красителя, вызванного добавлением полимера, с его значением ГЛБ представлена на рис. 4.

Наиболее высокой способностью к порообразованию обладали сополимеры первой группы, имеющие щеточное строение, а также ПМП (№ 25) и отличающиеся от остальных исследованных в работе сополимеров более высокими молекулярными массами. По-видимому, разницу на 2 порядка по сравнению с остальными сополимерами можно объяснить кооперативностыо взаимодействий нескольких цепей пропиленоксида с бислоем. Можно предположить, что, будучи присоединенными к одной макромолекуле, несколько цепей полипропиленоксида способны образовать устойчивую пору в липидной мембране, причем атомы кислорода полипропиленоксида способствуют гидратации этой поры.

Как видно из рис. 4, порообразующая способность сополимеров, содержащих одинаковый гидрофобный блок и имеющих общую архитектуру (плюроники, сополимеры ПО-Глц, цетилированные полиглицерины), линейно зависит от ГЛБ макромолекул. Поскольку зависимости для таких групп не укладываются на одну прямую, должен существовать, по меньшей мере, еще один фактор, который требуется учесть при составлении корреляционной зависимости.

Ранее1 было показано, что степень разупорядочивания ЖК упаковки липидного бислоя под действием амфифильных полимеров определяется в значительной мере объемом гидрофобной части макромолекулы. Объем пропиленоксидных блоков рассчитывали, исходя из модели свободно-сочлененной цепи. Объем углеводородных заместителей учитывали как сумму вандерваальсовых объемов заместителей.

С 2 "и 2

"о

100 10 1 0.1 =^0,01 1Е-3 1Е-4

§

« (5КфГлц-ПО

▲ 30410

в РКФэо"р

о РКф Овх-ПО

А ?КФГлч*

□ Экф эо-ло-эо

Рис. 4. Зависимость способности сополимеров к образованию

трансмембранных пор от величины ГЛБ

макромолекулы полимера.

30

10 20 ГЛБ, отн. ед.

Важнейшим условием подбора параметров для построения многопараметрических корреляций является их линейная независимость. Оказалось, что коэффициент корреляции между объемом гидрофобного блока и ГЛБ составляет 0.02, что говорит о линейной независимости этих параметров, по крайней мере, на использованном наборе полимеров. Это дало нам право использовать эти параметры для построения двухпараметрической линейной регрессии между логарифмом р¡¡ф и линейной комбинацией ГЛБ и объема гидрофобного блока:

\%ркф = 0.20-0.11х 7775+0.13 хГ^

0-1

в СП.

О) -2

Се*зоа-<ПСУ5

.....■..........

пмп

Оех^ЧПсу.з

(11=0.73, Р=12) (2).

Рис. 5. Корреляция способности сополимеров к образованию трансмембранных пор с ГЛБ макромолекулы и объемом гидрофобного блока.

-2

0,2-0,11 ГЛБ + 0,13 V

гфб

' Оетша Т, СттогсЬуа I, Кгу!оуа О, Иигаоу А, кшноу V, Ргеу Н, КаиИ Н, МеНк-КиЬают N. ВюсЬяшзйу. 2005 V. 44, р. 4042-4054.

Как следует из уравнения 2, рост гидрофобности, т.е. снижение ГЛБ, и увеличение размеров гидрофобного блока повышают способность полимера к образованию пор в липидной мембране. Из рисунка 6 следует, что все сополимеры, имеющие линейное и звездообразное строение, лежат вблизи корреляционной прямой, однако, как и в случае с однопараметрической корреляцией, из нее выпадают полимеры, имеющие щеточное строение. Это свидетельствует о том, что, гребнеобразная архитектура макромолекулы способствует стабилизации гидрофильных пор.

Таким образом, мы показали, что способность амфифильных сополимеров, имеющих линейное или звездообразное строение, к формированию пор в липидных мембранах определяется их гидрофильно-липофильпым балансом и объемом их гидрофобного блока. Мы впервые обнаружили, что сополимеры, имеющие щеточное строение обладают аномально высокой способностью к формированию пор в биологических мембранах. По всей видимости, это объясняется сильным несоответствием формы их макромолекул и молекул липида, вследствие чего встраивание таких полимеров в липидный бислой вызывает его значительную деформацию и приводит к образованию гидрофильных пор, проницаемых для малых ионов.

1.2. Влияние сополимеров на скорость мембранного транспорта противоопухолевого антибиотика доксорубицина

Липидный бислой проницаем для неионогенных соединений, а также для незаряженных форм кислот и оснований, способных проходить через липидную мембрану по механизму распределения-диффузии. Молекулы могут встраиваться в мембрану и диффундировать через бислой. Ранее было показано, что некоторые амфифильные сополимеры, в частности плюроники и сополимеры полипропиленоксида и полиглицерина, ускоряют транспорт антрациклинового антибиотика доксорубицина (ООХ) через модельные мембраны.

Для изучения скорости транспорта ООХ через липосомальную мембрану мы использовали подход, основанный на том, что при рН 7 около 2,5% молекул ООХ, имеющего аминогруппу с рКа=8.6, электронейтральны. Такие молекулы способны, встроившись в липидный бислой, диффундировать через него на внутренний монослой мембраны. Если получить липосомы, заполненные кислым буферным раствором (рН 4), проникший внутрь липосом ООХ будет протонироваться, теряя способность к проникновению через липидный бислой. За накоплением ООХ во внутренней полости везикулы мы следили по концентрационному самотушению его флуоресценции.

Накопление Б ОХ внутри липосом описывается экспоненциальным уменьшением интенсивности флуоресценции во времени и характеризуется константой скорости процесса первого порядка (рис. 6). Добавление полимеров приводило к ускорению транспорта ООХ, количественно оцениваемому по соотношению наблюдаемых констант скорости транспорта в присутствии (к) и в отсутствие (ко) полимера.

•ОН

X

о

В 25

Ю

НО 1-'

ын2

Доксорубицин фОХ)

о

200

Время, с

400

Рис. 6. Кинетическая кривая накопления доксорубицина внутри липосом.

Как и в случае транспорта заряженного красителя, эффект, оказываемый амфифильными сополимерами на транспорт незаряженной формы И ОХ, увеличивался пропорционально их концентрации. Концентрационно-независимую характеристику способности полимера ускорять транспорт ИОХ мы обозначим Рвохи определим ее как

где С(Ро1) - концентрация полимера в мг/мл, ко - эффективная константа скорости транспорта В ОХ в отсутствие полимера, а к - эффективная константа скорости транспорта в присутствии данной концентрации полимера.

Этот параметр количественно отражает способность сополимера к дестабилизации структуры бислоя.

Значения рвох для всех исследованных полимеров представлены в таблице 1. Как можно видеть из представленных данных, влияние полимеров на транспорт незаряженной формы ПОХ подчиняется тем же закономерностям, что и их влияние на формирование в мембране гидрофильных пор. Это означает, что

(3)

600

о

вызываемые полимерами дефекты в липидных мембранах приводят к увеличению обоих типов мембранной проницаемости.

а оа

о

§ 200

| 400

Рис. 7. Влияние степени полимеризации гидрофильного блока на способность плюроников (1) и сополимеров ППО-ПГ (2) ускорять транспорт незаряженной

формы доксорубицина через лшшдные мембраны.

0 50 100 150

Степень полимеризации гидрофильного блока

Самое высокое значение рСОх было найдено для гребнеобразного полиметакрилоилпроксанола ПМП (табл. 1, №25). На порядок меньшие значения Рвох были получены для самых гидрофобных линейных сополимеров -полиглицерина и полипропиленоксида (ПОю-со-ЭО^-Глцг и плюроника Ь61. Уменьшение гидрофобности полимера за счет увеличения степени полимеризации гидрофильного блока приводило к резкому снижению значений ¡}ВОх в рядах плюроников (рис. 7, кривая 1) и сополимеров Глц-ПО (рис. 7, кривая 2).

Анализ ряда сополимеров, содержащих около 20 звеньев этиленоксида и около 30 звеньев пропиленоксида, но различающихся взаимным расположением блоков (ряд СМгЭОи-ПОп — Э01ГП011-С4Н9 — Э0,гП030-Э0п — П01ГЭ01Г ПОц), показал, что сополимер ПО^-ЭОц-ПОп, имеющий два небольших по размеру гидрофобных блока, обладал значительно более высокой способностью увеличивать проницаемость мембран по отношению к Б ОХ, чем сополимеры, имеющие один гидрофобный блок вдвое большего размера. Интересно, что при этом плюроник Ы1 и сополимеры С4НгЭ01гП021 и Э01ГП02ГС4Н9, различающиеся расположением гидрофильных звеньев, характеризовались близкими и значительно меньшими по величине значениями рвох- Можно предположить, что наличие множественных гидрофобных блоков в молекуле сополимера, обеспечивающих его многоточечное связывание с липидным бислоем, увеличивает способность полимера возмущать липидные мембраны. Это предположение хорошо согласуется с тем, что сополимер ПМП (№25), имеющий около 9 пропиленоксидных блоков, проявляет самую высокую по сравнению со всеми исследованными в настоящей работе полимерами способность ускорять транспорт БОХ.

Закономерности влияния полимеров на транспорт ионного красителя КФ и незаряженной формы БОХ близки, т.е. основные факторы, определяющие эффективность воздействия сополимера на проницаемость мембран в обоих случаях имеют близкую природу. Тем интереснее проследить, насколько хорошо согласуются численные значения эффектов, оказываемых сополимерами на различные типы транспорта. На рисунке 8 показана корреляция между значениями

Р оох и Ра'ф изученных нами сополимеров.

Рис. 8. Сопоставление эффектов оказываемых сополимерами на транспорт заряженных и незаряженных соединений через липидный бислой.

рКФ, мг/мл-1 С"1

От корреляционной зависимости резко отклоняются две группы сополимеров. К первой относятся плюроник Ь61 (Э0гП03в-Э02) и полиглицерин

13

(П03гСО-Э05)-Глц2, более склонные к ускорению транспорта незаряженной формы йОХ, и в меньшей степени инициирующие транспорт заряженных соединений. Ко второй группе принадлежат гребнеобразный ПМП, и, в меньшей степени, «обращенный плюроник» ПОц-ЭОц-ПОц и звездчатый полиглицерин ГлцгШОп)}. Какие же общие черты мы можем выделить внутри каждой из групп?

Для первой группы характерно очень низкое содержание гидрофильных звеньев и малый объем гидрофильной части, сравнимый по своим размерам с полярной головкой молекулы липида. Вследствие термодинамической невыгодности контактов углеводород-77770 происходит нарушение укладки алкильных радикалов молекул липида, но в то же время гидрофильная часть слишком мала для того, чтобы сформировать гидрофильную внутреннюю поверхность поры, доступной для проникновения молекул воды и низкомолекулярных ионов.

Полимеры второй группы (ПМП, ПО^ЭОц-ПОц и Глцг(П017)3) представляют собой макромолекулы с достаточно большой центральной гидрофильной частью и несколькими (>2) гидрофобными фрагментами. Расчеты, выполненные ранее в работе2, предсказывают, что встраивание в бислой макромолекул с такой архитектурой должно способствать деформации мембраны с образованием впадины. Такая деформация может приводить к образованию поры, что и наблюдается в наших экспериментах. В этом случае отклонение от прямой пропорциональности зависимости $кф-%ох может также объясняться также занижением наблюдаемых констант скоростей транспорта БОХ вследствие размывания градиента рН.

Таким образом, в настоящей работе впервые получены данные, указывающие на важную роль архитектуры макромолекулы амфифилыюго полимера для его взаимодействия с липидными мембранами, построенными из фосфатидилхолина, содержание которого в природных ■ мембранах составляет около 25-30%. Известно, что состав мембраны сильно влияет на взаимодействие с ней сополимеров. В первую очередь, состав бислоя определяет связывание с ним полимера. Одним из наиболее распространенных липидов в составе мембран животных клеток является холестерин. В литературе нет данных о взаимосвязи между структурой полимера и степенью чувствительности оказываемых им эффектов на барьерные свойства мембран от содержания холестерина. Между тем данный аспект представляет большой интерес с точки зрения взаимодействия полимеров с клеточными мембранами.

1.3. Влияние структуры амфифильных полимеров на их взаимодействие с модельными мембранами, содержащими

холестерин

Холестерин заполняет свободный объем в бислое, повышая его микровязкость. Можно ожидать, что полимеры, гидрофобная часть которых больше их полярной головки, будут хуже встраиваться и в меньшей степени

2 Кт УЖ., Бшщ Ж./ТЪу*. Яет. Е, V. 63, Р. 041910-1-041910-5.

14

воздействовать на свойства бислойных мембран, содержащих большое количество холестерина, чем на бислои построенные из лецитина.

эо15-по2Гс<н9\ эо13-по1Гэо13 пмп

С4НгЭ01ГП021

Рис. 9. Форма макромолекул полимеров различной архитектуры.

Для проверки этого предположения мы сравнили влияние ряда полиалкиленоксидов на проницаемость липидных мембран, содержащих и не содержащих холестерин. Для этого мы использовали ряд сополимеров этиленоксида и пропиленоксида, содержащих приблизительно одинаковые количество ЭО и ПО звеньев, организованных в двублочную (ЭО^ПОц-СМ«; С4НгЭ0ц-П02}), трехблочную (ЭО;гЯО;гЭО;!) и щеткообразную мультиблочную структуры (ПМП). В этом ряду полимеров форма макромолекулы плавно изменяется от почти цилиндрической к остроугольно-конической и, в случае ПМП, к тупоугольно-конической.

Рис. 10. Влияние критического параметра упаковки

макромолекул амфифильных сополимеров на вызываемое ими ускорение транспорта доксорубицина (1) и карбоксифлуоресцеина (2) через мембрану липосом из яичного лецитина по

сравнению с липосомами, содержащими 25% (масс.) холестерина.

Действительно изменение содержания холестерина в мембране в различной степени отражалось на ее чувствительности к различным сополимерам. Так, эффект, оказываемый на транспорт карбоксифлуорсцеина двублочным сополимером ЭО15-ПО21-С4Н9, уменьшился лишь в 3,8 раза при введении в мембрану 25 массовых % холестерина, а эффект, оказываемый сополимером Э013-П01гЭ0,3 уменьшился в 8,2 раз. (рис. 10) В наибольшей степени введение в мембрану холестерина отражается на ее чувствительности к влиянию полкметакрилоилпроксанола ПМП на скорость вытекания карбоксиифлуоресцена

из липосом, которое уменьшалось в 14,6. Влияние ЭО^ПОц-С^, ЭО^ПОц-ЭОи и ПМП на транспорт йОХ также снижалось в присутствии холестерина, соответственно, в 2,8; 4,5 и 13,8 раз.

Таким образом, мы показали, что введение в мембрану холестерина, сопровождающееся уменьшением спонтанной кривизны компонентов мембраны, в большей степени затрудняет встраивание макромолекул, имеющих коническую форму, чем молекул, имеющих форму цилиндра или обращенного конуса.

1.4. Взаимодействие с модельными мембранами сополимеров этиленоксида и диметилсилоксана

Представленные данные касались полимеров, содержащих в качестве гидрофобных блоков ППО или алифатические углеводороды, способность которых влиять на проницаемость и структуру бислоя была показана ранее. Подчиняются ли аналогичным закономерностям полимеры, имеющие в своем составе гидрофобные блоки иной природы?

Рассматривая термодинамику взаимодействия амфифильных полимеров с липидными мембранами, можно сформулировать требования к свойствам их гидрофобного блока, необходимые для проявления полимером способности возмущать липидные мембраны. Во-первых, гидрофобный блок должен обладать низкой термодинамической совместимостью с липидным бислоем, и, во-вторых, он должен обладать высокой гибкостью.

Этим требованиям полностью соответствует полидиметилсилоксан. Этот полимер обладает наивысшей гибкостью, и низкой термодинамической совместимостью с алифатическими углеводородами, наиболее адекватно моделирующими свойства гидрофобной области бислоя. Параметр растворимости б для ПДМС составляет 15.1, что сильно отличается от значения 5 для гексана 7.1 (который можно рассматривать, как модель гидрофобной части липидного бислоя). Для изучения нами было выбрано 2 коммерчески доступных сополимера этиленоксида и диметилсилоксана, блочного (I) и чередующегося (И) строения (рис.11).

сн3

Рис. 11. Структурные формулы сополимеров ЭО и ДМС, изученных в работе.

Полагая, что теплота, выделяющаяся при встраивании полимера в липидный бислой пропорциональна количеству связанного с бислоем полимера, мы определили коэффициенты распределения сополимеров ДМС-ЭО между водой и липидной мембраной. Оказалось, что коэффициент распределения блочного сополимера между водой и липидным бислоем (Кр = 22) близок по лорядку величины коэффициенту распределения плюроиика Ь61 ЭОгПОзо-ЭОг и сополимера С^гЭОн-ПОги Чередующийся сополимер характеризовался в 20 раз более высоким коэффициентом распределения (КР=493), что объясняется большей гидрофобностью этого сополимера. Теперь, зная коэффициент распределения Кр,

СН3

можно рассчитать концентрацию связанного с липосомами полимера [Р]а при

любой его общей концентрации [Р]0, учитывая, что [/>],,

КРС,„

-[/>]„, где р -

р + кгсп

плотность липидного бислоя (1014 мг/мл), а Слип - концентрация липосом, также выраженная в мг/мл. Оказывается, что при концентрации липосом 1 мг/мл (стандартная концентрация в большинстве опытов) лишь 2% блочного и около 33% чередующегося сополимераДМС и ЭО связывается с мембранами.

На рис. 12 показаны зависимости ускорения транспорта КФ и О ОХ через липосомальные мембраны от концентрации связанных с мембранами сополимеров ДМС и ЭО блочного (кривые 1) и чередующегося (кривые 2) строения. Видно, что влияние этих сополимеров на транспорт КФ сильно различается: чередующийся сополимер, способный к многоточечным взаимодействиям с мембранами значительно эффективнее действует на транспорт КФ, чем двублочный сополимер (рис. 12а). В то же время транспорт ООХ на порядок эффективнее ускоряется при адсорбции на мембранах блочного сополимера, чем при адсорбции таких же количеств чередующегося сополимера (рис. 126).

0,15

1,25

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Концентрация полимера, мг/мл

0.2 0,4 0,6 0,8 1,0

Концентрация,полимера мг/мл

Рис. 12. Влияние сополимеров этиленокисда и диметилсилоксана блочного (1) и чередующегося (2) строения на (а) транспорт незаряженных, (б) заряженных соединений через бислой и (в) трансмембранную подвижность

компонентов бислоя.

0,5 1.0 1.5 2,0 2.5

Концентрация полимера, мг/мл

Известно, что механизм транспорта БОХ и КФ сильно различаются: йОХ в нейтральной форме проникает через бислой, растворяясь и диффундируя через липидный бислой. Напротив, несущий две заряженные группы КФ не может проникать через мембрану по этому механизму. Таким образом, полученный результат указывает на то, что двублочный полимер эффективно разупорядочивает бислой, но не склонен к образованию в нем сквозных дефектов, а чередующийся - наоборот, склонен образовывать в мембране гидрофильные

поры, проницаемые для красителя. Тогда, можно предположить, что эти различия еще более ярко будут проявляться при изучении влияния этих сополимеров на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флопа).

Скорость флип-флопа изучали на липосомах, содержавших на внутреннем монослое флуоресцентную метку [(Ъ!-7-нитробенз-2-окси-1,3-диазол-4-ил)-дипальмитоил]-фосфатидилэтаноламин (Л/ВО-ФЭ). Такие асимметрично меченные везикулы инкубировали с исследуемым полимером и через определенные промежутки времени определяли долю МВЭ-ФЭ, перешедшего на внешний монослой мембраны за время инкубации. Для этого к липосомам добавляли дитионит натрия, который восстанавливает полностью гася

флуоресценцию метки на внешней поверхности мембраны, и не затрагивая метку на внутреннем монослое. Как показано на рис. 12в, скорость флип-флопа резко ускорялась при увеличении концентрации связанного с липосомами блок-сополимера ДМС и ЭО, а наклон аналогичной зависимости для чередующегося сополимера был меньше почти на 4 порядка.

Полученный результат показывает, что макромолекулярная архитектура полимера сильно влияет на характер его воздействия на барьерные свойства липидных мембран. При этом блочная архитектура макромолекулы в большей степени способствует увеличению ее способности возмущать липидные мембраны без формирования трансмембранных гидрофильных пор. В то же время способность полимера к многоточечным взаимодействиям с мембраной увеличивает его склонность к формированию гидрофильных пор. Такое поведение чередующегося сополимера аналогично поведению молекулярных щеток.

2. Связь между строением амфифильных сополимеров и их цитотоксичностью по отношению к клеткам в культуре

Цитотоксичность полимеров мы исследовали на культурах клеток аденокарциномы молочной железы человека, проявляющих множественную лекарственную устойчивость. Такой выбор культуры был вызван тем, что, как известно из литературы, некоторые амфифильные сополимеры способны увеличивать цитотоксичность лекарств по отношению к таким клеткам. Цитотоксичность всех сополимеров определяли по стандартному протоколу, включающему инкубацию клеток с полимерами в течение 1 часа в бессывороточной среде, смену среды на полную ростовую среду с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и инкубацию клеток с полимерами в течение 3 суток в атмосфере, содержащей 5% С02 при 95% влажности

Для исследования цитотоксичности были выбраны несколько рядов амфифильных полимеров, сильно различающихся по природе и соотошению гидрофобных и гидрофильных звеньев, молекулярному весу и архитектуре макромолекулы. Сополимеры этиленоксида и пропиленоксида в этой серии экспериментов были представлены трехблочным плюроником Ь61, Э0гПОзв-Э0г, и двублочным сополимером С411гЭ01ГП021. Цитотоксичность сополимеров полипропиленоксида и полиглицерина была исследована ранее в нашей лаборатории3. Кроме того была исследована цитотоксичность щеточных

3 Демина Т.В. / Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, М., МГУ, 2007.

18

Также была изучена цитотоксичность блочного и чередующегося сополимеров этиленоксида и диметилсилоксана (табл. 2).

Оказалось, что цитотоксичность исследованных сополимеров варьирует в очень широких пределах (около 3 порядков). При этом наблюдалась линейная корреляция между 1§МТД и ^ГЛБ полимеров:

\%\ГГО = -2А+225\%ГЛБ, 11=0.91, N=8 (3)

При этом уменьшение ГЛБ, т.е. увеличение гидрофобности полимера, приводит к уменьшению его МТД, т.е. к увеличению цитотоксичностн (рис. 13а). Это означает, что чем выше сродство полимера к клеточной мембране, тем выше его цитотоксичность.

От корреляционной зависимости заметно отклонялись щеточные сополимеры, чередующийся сополимер (ДМС-ЭО)ц и С4НгЭ015-П021. Цитотоксичность этих сополимеров была несколько выше, чем предсказывается на основании их ГЛБ общим корреляционным уравнением, полученным для остальной группы полимеров. Можно предположить, что это связано с аномально высокой способностью этих сополимеров к порообразованию в биологических мембранах.

Табл. 2. Максимальные нетоксичные концентрации МТД сополимеров по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека МСБ7/Т)ОХ в культуре.

Сополимер РКФу С"1 иг/мл'1 МТД, мг/мл ГЛБ м„

(ПО}1Гсо-ЭО,)-Глц2 2.7 0.016±0.007 1.5 2267

(П0з<гсо-Э05)-Глцзо 1.15 0.3±0.054 7.0 3600

(ПОзгСО-ЭОД-Глцп 0.25 >15.5 7.6 7760

Глцг(П0з<гС0-Э05)-Глц2 2.94 0.03±0.01 2.8 2431

Э0гП031ГЭ02 (¿61) 2.2 0.04±0.01 3 1860

с4нгэо,гпо2, 2.6 0.4 11.3 2189

Э05гДМС7 1.4 0.2±0.1 16.7 3000

(ЭО-ДМС)15 25.2 0.003510.0005 1.45 1200

Вехзо<г(ПОз5)1з 120 0.18 16.7 78000

Оех3)г(ПОл)5 90 0.3 18.5 62000

Можно предположить, что цитотоксичность амфифильных сополимеров должна коррелировать с их способностью образовывать поры в модельных мембранах. Действительно, оказалось, что цитотоксичность большинства сополимеров удовлетворительно коррелирует с приведенными выше (табл. 1) значениями Р^ (рис. 136), согласно следующему уравнению:

МТД = -0.3-2.4-1$», Я= -0.96, п=5 (4)

t; .5

S1E-1' ?

S1E-2

jO^De^nOJ, * Ьех^ЧПОД,

Ф (ЭО-ДМС)15

(б)

Усл-эо.то,, ^„-(ПО^ iOO-flWC)

1 г-г, г- 10

ГЛБ, отн. ед.

ркф,1мг/мл "с

ioai .fooo

Рис. 13. (а) Зависимость собственной цитотоксичности сополимеров выраженной через МТД от величины ГЛБ макромолекулы сополимера, (б) Взаимосвязь цитотоксичности сополимеров с их способностью к образованию трансмембранных пор.

От этой зависимости сильно отклонялись полимеры щеточного строения и чередующийся сополимер этиленоксида и диметилсилоксана. Несмотря на их аномально высокую склонность к образованию пор в модельных мембранах, цитотоксичность этих полимеров была довольно низкой. Нам не удалось измерить собственную цитотоксичность ПМП в пределах его растворимости. Очень высокая цитотоксичность чередующегося сополимера ДМС и ЭО также оказывается несколько ниже, чем можно было бы предположить из его экстремально высокой способности к образованию пор.

Табл. 3. Значения концентраций доксорубицина, соответствующие 50% выживаемости (МТД) различных клеточных линий в отсутствие полимеров и в присутствии фиксированных концентраций различных полимеров.

Клеточная линии DOX DOX+ 0.1 мг/мл Э0гП01гЭ0, (1) DOX+ (ЭО-ДМС),, (П)4 DOX+ 0.1 мг/мл •JCMJOjr'JO, (IV) Блок-сополимер ^«vrWjf Чередующий ся сополимер (ЭО-ДМС),s Плюровик 161 301П01Р01

К562 0.69±0.1 0.7±0.2 0.8±0.2 0.8М.1 0.2ft±0.05 O.OOSiO.OOl 0.15±0.05

KS62/DOX 47±7 6.4±1 25±б 6.411.5 О.ЗЙМ 0.00Ш.Ш1 0.3±0.1

MCF7 1.0МЛ 1.1+fl.l 1.4±0.1 1.1+0.1 O.OSdtO.OS 0.001±0.0005 0.03±0.01

MCF7/DOX 48110 l.S±0J 33±6 l.MOJ 0.2±0.1 0.0035±0.0005 0.07±0.04

Можно предположить, что пониженная токсичность сополимеров, способных к многоточечным взаимодействиям с мембранами объясняется низкой эффективностью их связывания с мембраной клетки. Это объяснение основывается на нашем результате, приведенном в главе 1.3, заключающемся в том, что взаимодействие с модельными мембранами полимеров, имеющих щеточное строение, чрезвычайно чувствительно к присутствию в мембранах холестерина.

' Влияние чередующего сополимера (П) на цитотоксичность ООХпо отношению к клеткам К562 и К562//ЮЛГ исследовали при концентрации полимера Зх1СГ3 мг/мд, а по отношению к клеткам МСР7 и МСР/ЛЭОХ - при концентрации полимера 1х10'3 мг/мл.

Полученные в настоящем разделе данные свидетельствуют также об очень высокой способности сополимеров на основе. полидиметилсилоксана взаимодействовать с клетками. Чередующийся сополимер диметилсилоксана и этиленоксида проявляет чрезвычайно высокую цитотоксичность и высокую способность к образованию в мембранах гидрофильных пор. Способны ли кремнийорганические полимеры, подобно ранее исследозанным шпороникам, влиять на накопление лекарств в раковых клетках, проявляющих множественную лекарственную устойчивость?

Для ответа на этот вопрос мы исследовали действие сополимеров ДМС-ЭО на цитотоксичность Т>ОХ по отношению к клеткам человеческой аденокарциномы молочной железы МСР7ЮОХ и зритролейкемии человека К562/ЛОХ. Эти клетки обладают устойчивостью к действию цитостатиков, т.е. для подавления их роста требуется введение значительно более высоких концентраций антибиотика, чем в случае «чувствительных» сублиний МС¥7 и К562.

В то же время блок-сополимер ДМСгЭОн проявлял высокую активность по отношению к обеим линиям резистентных клеток. Добавление блок-сополимера к клеткам К562/И ОХ и МСР7/ООХ позволило снизить токсическую концентрацию Б ОХ в 6 и 30 раз, соответственно (табл. 3). Блок-сополимер оказался столь же эффективен в подавлении лекарственной устойчивости, как прошедший II фазу клинических испытаний плюроник ¿61.

Таким образом, исследование взаимодействия сополимеров на основе полидиметилсилоксана с опухолевыми клетками показали, что высокую способность блок-сополимера полидиметилсилоксана и полиэтиленоксида обращать лекарственную устойчивость раковых клеток. Этот результат указывает на то, что для преодоления лекарственной устойчивости раковых клеток необходимы такие сополимеры, которые были бы способны разупорядочивать липидный бислой, не образуя в нем гидрофильных пор. Можно предположить, что именно это разупорядочивание, выражающееся в резком (на порядки) ускорении флип-флопа липидов, сказывается на активности мембранных ферментов, и в том числе, на активности Р-гликопротеина, выбрасывающего лекарства из раковых клеток. Поскольку механизм воздействия БОХ на устойчивые и чувствительные к его воздействию клетки одинаков, и подавление резистентности под действием блок-сополимера этиленоксида и диметилсилоксана получено на двух сильно различающихся по происхождению и морфологии клеточных линиях, можно утверждать, что именно разупорядочение структуры бислоя приводит к инактивации белка Р-170.

выводы

1. Впервые показано, что макромолекулярная архитектура амфифильных сополимеров в значительной мере определяет их способность вызывать разупорядочение жидкокристаллической структуры липидного бислоя и образовывать в нем гидрофильные поры. Сополимеры, имеющие архитектуру молекулярных «щеток» и способные образовать контакт с поверхностью мембраны в нескольких точках, в большей мере склонны к образованию пор, в то время как линейная структура блок-сополимеров способствует тому, чтобы они проявляли способность к разупорядочению жидкокристаллической структуры мембран.

2. Введение в липидную мембрану холестерина затрудняет встраивание в нее сополимеров. Впервые установлено, что степень воздействия холестерина зависит от формы полимерной макромолекулы и увеличивается с ростом ее критического фактора упаковки, т.е. сильнее проявляется по отношению к макромолекулам, имеющим коническую форму с полярной головкой в вершине, чем к макромолекулам, имеющим форму цилиндра или конуса с полярной головкой в основании.

3. Продемонстрировано, что цитотоксичность линейных амфифильных полиалкиленоксидов может быть полуколичественно предсказана на основании их ГЛБ и способности к образованию гидрофильных пор.

4. Показано, что блок-сополимер полидиметилсилоксана и полиэтиленоксида способен обращать лекарственную устойчивость раковых клеток так же эффективно, как плюроник Ь61, являющийся компонентом лекарственной формы, прошедшей II фазу клинических испытаний.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Павлов Д.Н., Мелик-Нубаров Н.С. Исследование влияния полимера на основе метакрнлоилпроксанола на динамические свойства модельных липидных везикул. // Сборник статей XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». Марий Эл. 2005. Ч. 2. С. 88-91.

2. Жирнов А.Е., Павлов Д.Н., Дёмина Т.В., БадунГ.А., ГроздоваИ.Д., Мелик-Нубаров Н.С. Влияние строения блок-сополимеров этиленоксида и пропилсноксида на их взаимодействие с биологическими мембранами. // Высокомолек. соед. Сер. А. 2006. Т. 48. № 11. С. 2023-2033.

3. Pavlov D.N., Alexandrova N.A., Krylova О.О., Pohl P., Melik-Nubarov N.S. Effect of block architecture on the ability of polyalkylene oxides to overcome multidrug resistance of tumor cells.//J. Drug. Del. Sci. Tech. 2006. V. 16. № 4. P. 259-265. ■-.,:• - .

4. Павлов Д.Н., Дородных Т.Ю., Заборова O.B., Мелик-Нубаров Н.С. Взаимодействие сополимеров диметилсилоксана. и этиленоксида с модельными мембралами и раковыми клетками. // Высокомолек. соед. Сер. А. 2009. Т. 51. № 3. С. 428-435.

5. Pavlov D.N.. Melik-Nubarov N.S. Relationship between block architecture of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid membranes. // 1st EuCheMS European Chemistry Congress. Hungary. Budapest. 2006. P. 294.

6. Павлов Д.Н., Заборова O.B., Мелик-Нубаров H.C. Влияние' блочной архитектуры амфифильных сополимеров на структуру и проницаемость лшшдных мембран. // IV Всероссийская каргинская конференция «Наука о полимерах 21-му веку». Москва. 2007. Т. 2. С. 411.

7. Zhirnov A., Pavlov D., Demina Т., Grozdova I., Melik-Nubarov N. Influence of polyalkyleneoxides on dynamic and structural properties of lipid membranes. // Baltic polymer symposium 2007. Lithuania. Druskininkai. 2007. P. 89.

8. Pavlov D.N., Zaborova O.V., Istratov V.V., Melik-Nubarov N.S. Relationship between structure of polyglycerol copolymers and their ability to disturb lipid membranes. // 6th International Symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems. St. Petersburg. June 2-6.2008. P. 128.

9. Zaborova O.V., Pavlov D.N., Dorodnych T.Yu., Melik-Nubarov N.S. Interaction of dimethylsiloxane copolymers with biological membranes. // The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies "NanoBio'08". St. Petersburg. June 16-18.2008. P. 153.

Ю.Павлов Д.Н., Заборова O.B., Дородных Т.Ю., Истратов В.В., Мелик-Нубаров H.C. Влияние строения амфифильных сополимеров на основе полиглицерина на их взаимодействие с липидными мембранами. XV Всероссийская Конференция «Структура и Динамика Молекулярных Систем». Марий Эл. 30 июня - 4 июля. 2008. С. 168.

1 I.Pavlov D., Dorodnych Т., Zaborova О., Melik-Nubarov N. Interaction of ethylene oxide - dimethylsiloxane copolymers with lipid membranes and tumor cells. // 4th International Symposium Macro- and Supramolecular Architectures and Materials. Germany. Dusseldorf. September 7-11. 2008. P. 106.

подписано в печать:

05.11.2009

Заказ № 2927 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Список используемых сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Биологические мембраны.

2.1.1. Мембранные липиды.

2.1.2. Структура липидного бислоя.

2.1.2.1. Организация водно-липидных систем.

2.1.2.2. Фазовые равновесия в биологических мембранах.

2.1.2.3. Домены в липидных мембранах.

2.1.2.4. Латеральная диффузия липидных молекул.

2.1.2.5. Флип-флоп липидов.

2.1.2.6. Микровязкость мембран.

2.1.3. Модельные биологические мембраны.

2.1.3.1. Липосомы.

2.1.4. Спонтанная кривизна бислоя.

2.2. Физико-химические свойства растворов амфифильиых сополимеров.

2.2.1.1. Термодинамика мицеллообразования в растворах алкиленоксидов.

2.2.1.2. Структурные параметры мицелл плюроников.

2.2.1.3. Теоретический подход к изучению структуры мицелл плюроников.

2.2.1.4. Влияние макромолекулярной архитектуры на образование и структуру мицелл амфифильных сополимеров.

2.2.2. Взаимодействие амфифильных сополимеров с мембранами.

2.2.3. Влияние сополимеров на проницаемость биологических мембран.

2.2.3.1. Образование пор.

2.2.4. Взаимодействие амфифильных сополимеров с животными клетками.

2.2.4.1. Подавление множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

2.2.4.2. Трансфекция клеток ДНК.

3. Постановка задачи.

4. Материалы и методы.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

4.2.1. Получение полиметакрилоштпроксанола.

4.2.1.1. Получение макромономера.

4.2.1.2. Проведение полимеризации.

4.2.2. Анализ полимеров методом гель-проникающей хроматографии.

4.2.3. Определение ККМ полимеров.

4.2.4. Кинетика рН-индуцированного транспорта DOX.

4.2.4.1. Получение малых рН-градиентных липосом.

4.2.4.2. Исследование влияния плюроников на рН индуцированный транспорт DOX в липосомы

4.2.5. Влияние полимеров на барьерные свойства липосом.

4.2.5.1. Получение малых везикул, заполненных карбоксифлуоресцеином.

4.2.5.2. Изучение кинетики вытекания карбоксифлуоресцеина из липосом.

4.2.6. Изучение трансбислойного переноса липидов.

4.2.6.1. Получение НБД меченых липосом.

4.2.6.2. Измерение скорости флип-флопа в липосомальных мембранах.

4.2.7. Изотермическая титрующая калориметрия.

4.2.7.1. Расчет термодинамических параметров связывания сополимеров с липосомальными мембранами.

4.2.8. Воздействие полимеров на клетки.

4.2.8.1. Культивирование клеток.

4.2.8.2. Анализ цитотоксичности сополимеров и доксорубицина.

4.2.8.3. Анализ устойчивости клеток к доксорубицину в присутствии полимеров.

5. Результаты и их обсуждение

5.1. Связь между строением амфифильных сополимеров и их взаимодействием с модельными липидными мембранами.

5.1.1. Влияние сополимеров на мембранный транспорт ионного красителя карбоксифлуоресцеина

5.1.2. Влияние сополимеров на транспорт через липидную мембрану противоопухолевого антибиотика доксорубицина.

5.2. Влияние структуры амфифильных полимеров на их взаимодействие с модельными мембранами, содержащими холестерин.

5.3. Взаимодействие с мембранами сополимеров этиленоксида и диметилсилоксана

5.4. Связь между строением амфифильных сополимеров и их цитотоксичностью по отношению к клеткам в культуре. б. ВЫВОДЫ.

Интенсивное развитие синтетических методов химии полимеров в последние 10-15 лет открыло новые возможности получения огромного разнообразия макромолекул с заранее заданной дендритной, звездообразной или гребнеобразной архитектуре [1,2]. Исследование процессов самоорганизации в таких системах привело к пониманию того, что форма макромолекулы и распределение в ней полярных и гидрофобных групп определяет свойства образуемых ей структур [3]. Можно ожидать, что взаимодействие полимеров с анизотропными системами наноскопических размеров, такими как биологические или искусственные липидные мембраны, будет приводить к изменениям их структуры и проницаемости. Опубликованные в последнее время теоретические работы предсказывают, что встраивание амфифильных полимеров в липидную мембрану должно приводить к ее деформации и изменению свободной энергии мембраны, причем этот эффект в значительной мере определяется архитектурой полимерной макромолекулы и той формой, которую она принимает при проникновении в толщу липидной мембраны [4]. Изменение структуры мембраны приводит к значительному изменению её барьерных свойств и подвижности мембранных компонентов. Тем не менее, в литературе практически отсутствуют экспериментальные данные о взаимосвязи между геометрией амфифильных молекул и их способностью вызывать возмущения в упаковке липидного бислоя.

Вторым малоизученным аспектом взаимодействия сополимеров с мембранами является химическая природа гидрофильного и гидрофобного блоков, потенциально способных взаимодействовать с бислоем. До сих пор нет экспериментально проверенных критериев отбора сополимеров способных эффективно воздействовать на структуру бислоя.

Исследование этих факторов важно и с практической точки зрения. Сравнительно недавно было обнаружено, что при введении противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда, таких как доксорубицин, фарморубицин и дауномицин, совместно с небольшими дозами плюроников, терапевтическая активность лекарства заметно усиливается. Влияние сополимеров особенно заметно на опухолях, проявляющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), которая возникает при длительном лечении опухолей с помощью химиотерапии. Лекарственная устойчивость проявляется в отношении широкого круга веществ с разнообразной структурой. Выработка механизмов МЛУ в опухолевых клетках приводит к необходимости увеличения терапевтических доз антибиотиков, что в конечном итоге сказывается на их общетоксическом воздействии на организм Таким образом, устранение устойчивости раковых клеток является одной из 5 важнейших задач современной онкологии, которую удается решить с помощью амфифиьных сополимеров. [5]. В литературе высказывается предположение, что причина воздействия плюроников на транспорт лекарств в раковые клетки состоит в их влиянии на организацию клеточных мембран. [6] Поэтому поиск взаимосвязи между структурой амфифильных сополимеров и их влиянием на свойства биологических мембран является важной задачей. Ранее было показано, что способность амфифильных сополимеров влиять на проницаемость и структуру биологических мембран определяются гидрофобностью макромолекул амфифильного сополимера и размерами его гидрофобного блока. Целью настоящей работы явилось исследование значения макромолекулярной архитектуры амфифильных сополимеров для их способности вызывать разупорядочивание липидной упаковки биологических мембран.

6. выводы

1. Впервые показано, что макромолекулярная архитектура амфифильных сополимеров в значительной мере определяет их способность вызывать разупорядочение жидкокристаллической структуры липидного бислоя и образовывать в нем гидрофильные поры. Сополимеры, имеющие архитектуру молекулярных «щеток» и способные образовать контакт с поверхностью мембраны в нескольких точках, в большей мере склонны к образованию пор, в то время как линейная структура блок-сополимеров способствует тому, чтобы они проявляли способность к разупорядочению жидкокристаллической структуры мембран.

2. Введение в липидную мембрану холестерина затрудняет встраивание в нее сополимеров. Впервые установлено, что степень воздействия холестерина зависит от формы полимерной макромолекулы и увеличивается с ростом ее критического фактора упаковки, т.е. сильнее проявляется по отношению к макромолекулам, имеющим коническую форму с полярной головкой в вершине, чем к макромолекулам, имеющим форму цилиндра или конуса с полярной головкой в основании.

3. В работе продемонстрировано, что цитотоксичность линейных амфифильных полиалкиленоксидов может быть полуколичественно предсказана на основании их гидрофильно-липофильного баланса и способности к образованию гидрофильных пор.

4. Показано, что блок-сополимер полидиметилсилоксана и полиэтиленоксида способен обращать лекарственную устойчивость раковых клеток так же эффективно, как плюроник L61, являющийся компонентом лекарственной формы, прошедшей II фазу клинических испытаний.

1. Odian G. Principles of Polymerization, 4th Edition. Hoboken: Wiley-Interscience, 2004. 812 p.

2. Matyjaszewski K., Davis T.P. Handbook of Radical Polymerization. Hoboken: Wiley-Interscience, 2004.920 p.

3. Reiss G. Polymer Micelles: Amphiphilic block and graft copolymers as polymeric surfactants. In: Handbook of Industrial Water Soluble Polymers, (ed. by Williams P.A.) Oxford: Blackwell Publishing Ltd., 2007. P. 174-238.

4. Lipowsky R. Bending of membranes by anchored polymers. // Europhys. Lett. 1995, V. 30, P. 197-202.

5. Kabanov A.V., Okano T. Challenges in polymer therapeutics. In: Polymer Drugs in Clinical Stage: Advantages and Prospects, (ed. by Maeda H., Kabanov A., Kataoka K., Okano T.) New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. P. 1-27.

6. Demina Т., Grozdova I., Krylova O., Zhirnov A., Istratov V., Frey H., Kautz H., Melik-Nubarov N. Relationship between the structure of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid bilayers. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 4042-4054.

7. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. // Science. 1972. V. 175. P. 720-731.

8. Dowham W., Bogdanov M., Mileykovskaya E. Functional roles of lipids in membranes. In: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes, (ed. by Vance D.E., Vance J.E.) Amsterdam: Elsevier, 2008. P. 1-37.

9. Tu K., Klein M.L., Tobias D J. Constant-pressure molecular dynamics investigation of cholesterol effects in a dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer. // Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2147-2156.

10. Геннис P. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997.624 с.

11. Parente R.A., Lentz B.R. Phase behavior of large unilamellar vesicles composed of synthetic phospholipids. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 2353-2362.

12. Tenchov B.G., Boyanov A.I., Koynova R.D. Lyotropic polymorphism of racemic dipalmitoylphosphatidyletanolamine: A differential scanning calorimetry study. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 3553-3555.

13. Blume A. Apparent molar hear capacities of phospholipids in aqueous dispersion. Effects of chain length and head group structure. //Biochemistry. 1983. V. 22. P. 5436-5442.

14. Boggs J.M. Lipid intermolecular hydrogen bonding: Influence on structural organization and membrane function. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 906. P. 353-404.

15. Cevc G. How membrane chain melting properties are regulated by the polar surface of the lipid bilayer. //Biochemistry. 1987. 26. 6305-6310.

16. Cullis P.R., de Kruijff B. The polymorphic phase behaviour of phosphatidyletanolamines of natural and synhtetic origin: A 31P-NMR study. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 513. P. 31-42.

17. Killian J.A., Verkleij A.J., Leumssen, Bijvelt J., de Kruijff B. External addition of gramicidin induces Ни phase in dioleoylphosphatidylcholine model membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 812. P. 21-26.

18. Shimshick E.J., McConnell H.M. Lateral phase separation in phospholipid membranes. //Biochemistry. 1973. V. 12. P. 2351-2360.

19. Bar L.K., Barenholz Y., Thompson Т.Е. Effect of sphingomyelin composition on the phase structure of phosphatidylcholine-sphingomyelin bilayers. Biochemistry. 1997. V. 36. P. 2507-2516.

20. Galla H.-J., Hartmann W., Theilen U., Sackmann E. On two-dimensional passive random walk in lipid bilayers and fluid pathways in biomembranes. // Journal of Membrane Biology. 1979. V. 48. P. 215-236.

21. Lindblom G., Wennerstrom H., Amphiphile diffusion in model membrane systems studied by pulsed NMR. // Biophys. Chem. 1977. V. 6. P. 167-171.

22. Lindblom G., Oradd G. Lipid lateral diffusion and membrane heterogeneity. //

23. Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1788. P. 234-244.

24. Filippov A., Oradd G., Lindblom G. Influence of cholesterol and water content on phospholipid lateral diffusion in bilayers. // Langmuir. 2003. V. 19. P. 6397-6400.

25. Filippov A., Oradd G., Lindblom G. Domain formation in model membranes studied by pulsed-field gradient-NMR: The role of lipid polyunsaturation. // Biophys. J. 2007. V. 93. P. 3182-3190.

26. Kornbergt R.D., McConnell H.M. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes.//Biochemistry. 1971. V. 10. P. 1111-1120.

27. Shaw J.M., Thompson Т.Е. Effect of phospholipid oxidation products on transbilayer movement of phospholipids in single lamellar vesicles. // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 920-927.

28. New R.R.C. Liposomes: A practical approach. Oxford: IRL Press, 1990. 301 p.

29. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. // J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 238-52.

30. Duzgunes N. Preparation and quantitation of small unilamellar liposomes and large unilamellar reverse-phase evaporation liposomes. // Methods in enzymology. 2003. V. 367. P. 23-27.

31. Schubert R. Liposome preparation by detergent removal. // Methods in enzymology. 2003. V. 367. P. 46-70.

32. Helfrich W. Elastic properties of lipid bilayers: Theory and possible experiments. // Z. Naturforsch. C. 1973. V. 28. P. 693-703.

33. Rawicz W., Smith B.A., Mcintosh T.J., Simon S.A., Evans E. Elasticity, strength, and water permeability of bilayers that contain raft microdomain-forming lipids. // Biophys. J. 2008. V. 94. P.4725-4736.

34. Gruner S.M. Intrinsic curvature hypothesis for biomembrane lipid composition: A rolefor nonbilayer lipids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3665-3669.

35. Leikin S., Kozlov M.M., Fuller N.L., Rand R.P. Measured effects of diacylglycerol on structural and elastic properties of phospholipid membranes. // Biophys. J. 1996. V. 71. P. 26232632.

36. Szule A., Fuller N.L., Rand R.P. The effects of acyl chain length and saturation of diacylglycerols and phosphatidylcholines on membrane monolayer curvature// Biophys. J. 2002. V. 83. P. 977-984.

37. Fuller N., Benatti C.R., Rand R.P. Curvature and bending constants for phosphatidylserine-containing membranes. // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 1667-1674.

38. Chen Z., Rand R.P. Comparative study of the effects of several n-alkanes on phospholipid hexagonal phases. //Biophys. J. 1998. V. 74. P. 944-952.

39. Chen Z., Rand R.P. The influence of cholesterol on phospholipid membrane curvature and bending elasticity. // Biophys. J. 1997. V. 73. P. 267-276.

40. Fuller N., Rand R.P. The influence of lysolipids on the spontaneous curvature and bending elasticity of phospholipid membranes. // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 243-254.

41. Kooijman E.E., Chupin V., Fuller N.L., Kozlov M.M., de Kruijff В., Burger K.N.J., Rand P.R. Spontaneous curvature of phosphatidic acid and lysophosphatidic acid. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 2097-2102.

42. Sackmann E. Biological membranes architecture and function. In: Handbook of Biological Physics, (ed. by Lipowsky R., Sackmann E.) Elsevier Science, 1995. V. 1. P. 1-64.

43. Petrov A.G. Liquid crystal physics and the physics of living matter. // Mol. Cryst. Liq. Cryst. 1999. V. 332. P. 577-584.

44. Farsad K., De Camilli P. Mechanisms of membrane deformation. // Current Opinion in Cell Biology. 2003. V.15. P. 372-381.

45. Kang S.Y., Seong B.S., Han Y.S., Jung H.T. Self-organization of amphiphilic polymer in vesicle bilayers composed of surfactant mixtures. // Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 360365.

46. Hui S.W., Sen A. Effects of lipid packing on polymorphic phase behavior and membrane properties. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 5825-5829.

47. Kim Y.W., Sung W. Membrane curvature induced by polymer adsorption. // Phys. Rev. E. 2001, V. 63, P. 041910-1-041910-5.

48. Balgavy P, Devinsky F. Cut-off effects in biological activities of surfactants. // Adv. Colloid Interface Sci. 1996. V. 66. P. 23-63.

49. Kadi M., Hansson P., Almgren M. Determination of isotherms for binding of surfactants to vesicles using a surfactant-selective electrode. // J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 7344-7351.

50. Price C., Woods D. Light-scattering study of micelle formation by polystyrene-g-polyisoprene graft copolymers. // Polymer. 1974. V. 15. P. 389-392.

51. Tuzar Z., Plestil J., Konak C., Hlavata D., Sikora A. Structure and hydrodynamic properties of polystyrene-b-(ethene-co-butene)-b-styrene. micelles in 1,4-dioxane. //Makromol. Chem. 1983. V. 184. P. 2111-2121.

52. Higgins J. S., Dawkins J. V., Maghami G. G., Shakir S. A. Study of micelle formation by the diblock copolymer polystyrene-b-(ethylene-co-propylene) in dodecane by small-angle neutron scattering. //Polymer. 1985. V. 27. P. 931-936.

53. Plestil J., Baldrian J. Determination of the structure parameters of styrene/butadiene block copolymer in heptane by means of small-angle X-ray scattering. // Makromol. Chem. 1975. V. 176. P. 1009-1028.

54. Wanka G., Hoffmann H., Ulbricht W. Phase diagrams and aggregation behavior of poly(oxyethylene)-po!y(oxypropylene)-poly(oxyethylene) triblock copolymers in aqueous solutions. // Macromolecules. 1994. V. 27. P. 4145-4159.

55. Speracek J. !H NMR study of styrene-butadiene block copolymer micelles in selective solvents. // Makromol. Chem. Rapid Commun. 1982. V. 3. P. 697-703.

56. Mortensen K., Brown W. Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymers in aqueous solution. The influence of relative block size. // Macromolecules. 1993. V. 26. P. 4128-4135.

57. Jain N.J., Aswal V.K., Goyal P.S., Bahadur P. Salt induced micellization and micelle structures of PEO/PPO/PEO block copolymers in aqueous solution. // Colloids Surf. A. 2000. V. 173. P. 85-94.

58. Alexandridis P., Holzwarth J.F., Hatton T.A. Micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymer in aqueous solutions: Thermodynamics of copolymer association. //Macromolecules. 1994. V. 27. P. 2414-2425.

59. Alexandridis P., Athanassiou V., Fukuda S., Hatton T.A. Surface activity of poly(ethylene oxide)-block-poly(propylene oxide)-block-poly(ethylene oxide) copolymers. // Langmuir. 1994. V. 10. P. 2604-2612.

60. Chu В., Zhou Z. Physical chemistry of polyoxyalkylene block copolymer surfactants. In: Nonionic Surfactants: Polyoxyalkylene Block Copolymers, (ed. by Nice V.M.) New York: Marcell Deccer, 1998. P. 67-144.

61. Linse P. Micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) block copolymers in aqueous solution: Effect of polymer polydispersity. // Macromolecules. 1994. V. 27. P. 6404-6417.

62. Linse P. Micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) block copolymers in aqueous solution: Effect of polymer impurities. // Macromolecules. 1994. V. 27. P. 2685-2693.

63. Hurter P.N., Scheutjens J.M.H.M., Hatton T.A. Molecular modeling of micelle formation and solubilization in block copolymer micelles. 2. Lattice theory for monomers with internal degrees of freedom. //Macromolecules. 1993. V. 26. P. 5030-5040.

64. Annual progress report of the department of solid state physics. Ed. by Skov Pedersen J., Lebech В., Lindgard P.-A. Roskilde: Riso National Laboratory, 1993. 164 p.

65. Frank H.S., Evans M.J. Free volume and enthropy in condensed systems. // J. Chem. Phys. 1945. V. 13. P. 507-532.

66. Nemethy G., Scheraga H.A. Structure of water and hydrophobic bonding in proteins. // J. Chem. Phys. 1962. V. 36. P. 3401-3417.

67. Zhou Z., Chu B. Light-scattering study on the association behavior of triblock polymers of ethylene oxide and propylene oxide in aqueous solution. // J. Colloid Interface Sci. 1988. V. 126. P. 171-180.

68. Linse P., Malmsten M. Temperature-dependent micellization in aqueous block copolymer solutions. // Macromolecules. 1992. V. 25. P. 5434-5439.

69. Scheutjens J.M.H.M., Fleer G. Statistical theory of the adsorption of interacting chain molecules. // J. Phys. Chem. 1979. V. 83. P. 1619-1635.

70. Alexandridis P., Nivaggioli Т., Hatton T.A. Temperature effects on structural properties of pluronic® PI04 and F108 PEO-PPO-PEO block copolymer solutions. // Langmuir. 1995. V. 11. P. 1468-1476.

71. Nagarajan R., Ganesh K. Block copolymer self-assembly in selective solvents: Theory of solubilization in spherical micelles. // Macromolecules. 1989. V. 22. P. 4312-4325.

72. Prochazka K., Tuzar Z., Kratochvil P. Association of a three-block copolymer B-A-B in selective solvents for blocks B: Spherical micelles. //Polymer. 1991. V. 32. P. 3038-3044.

73. Pispas S., Hadjichristidis N., Potemkin I., Khokhlov A. Effect of architecture on the micellization properties of block copolymers: A2B miktoarm stars vs AB siblocks // Macromolecules. 2000. V. 33. P. 1741-1746.

74. Goldmints I., Yu G., Booth C., Smith K.A., Hatton T.A. Structure of (deuterated PEO)-(PPO)-(deuterated PEO) block copolymer micelles as determined by small angle neutronscattering. //Langmuir. 1999. V. 15. P. 1651-1656.

75. Linse P. Micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) block copolymers in aqueous solution. // Macromolecules. 1993. V. 26. P. 4437-4449.

76. Altinok H., Yu G.-E., Nixon S.K., Gorry P.A., Attwood D., Booth C. Effect of block architecture on the self-assembly of copolymers of ethylene oxide and propylene oxide in aqueous solution. //Langmuir. 1997. V. 13. 5837-5848.

77. Booth C., Yu G.E., Nace V.M. Block copolymers of ethylene oxide and 1,2-butylene oxide. In: Amphiphilic block copolymers: self-asssembly and applications, (ed. by Alexandridis P., Lindman B.) Amsterdam: Elsevier, 1997. P.57-86.

78. Топчиева И.Н., Осипова C.B., Банацкая М.И., Валькова JI.A. Мембранотропные свойства блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена. // ДАН СССР 1989. Т. 308. С. 910-913.

79. Firestone М.А., Wolf А.С., Seifert S. Small-angle X-ray scattering study of the interaction of poly(ethylene oxide)-b-poly(propylene oxide)-b-poly(ethylene oxide) triblock copolymers with lipid bilayers. //Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 1539-1549.

80. Firestone M.A., Seifert S. Interaction of nonionic PEO-PPO diblock copolymers with lipid bilayers. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2678-2687.

81. Lee В., Firestone M.A. Electron density mapping of triblock copolymers associated with model biomembranes: Insights into conformational states and effect on bilayer structure. // Biomacromolecules. 2008. V. 9. P. 1541-1550.

82. Liang X., Mao G., Simon Ng. K.Y. Effect of chain lengths of PEO-PPO-PEO on small unilamellar liposome morphology and stability: an AFM investigation. // J. Colloid Interface Sci. 2005. V. 285. P. 360-372.

83. Johnsson M., Silvander M., Karlsson G., Edwards K. Effect of PEO-PPO-PEO triblock copolymers on structure and stability of phosphatidylcholine liposomes. // Langmuir. 1999. V. 15. P. 6314-6325.

84. Kostarelos K., Tadros Th.F., Lusckham P.F. Physical conjugation of triblock copolymers to liposomes toward the constration of sterically stabilized vesicle systems. // Langmuir. 1999. V. 15. P. 369-376.

85. Johnsson M., Bergstrand N., Edwards K., Stalgren J.J.R. Adsorption of a PEO-PPO-PEO triblock copolymer on small unilamellar vesicles: equilibrium and kinetic properties and correlation with membrane permeability. // Langmuir. 2001. V. 17. P. 3902-3911.

86. Gau-Racine J., Lai J., Zeghal M., Auvray L. PEO-PPO block copolymer vectors do not interact directly with DNA but with lipid membranes. // J. Phys. Chem. B. 2007. V. 111. P. 9900-9907.

87. Krylova O.O., Pohl P. Ionophoric activity of pluronic block copolymers. // Biochemistty. 2004. V. 43. P. 3696-3703.

88. Kaye S., Merry S. Tumour cell resistance to anthracyclines. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1985. V. 14. P. 96-103.

89. Fromm M.F. Importance of P-glycoprotein at blood-tissue barriers. // Trends Pharmacol. Sci. 2004. V. 8 P. 423-429.

90. Nielsen D, Skovsgaard T. P-glycoprotein as multidrug transporter: A critical review of-current multidrug resistant cell lines. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1139. P. 169-183.

91. Fromm M.F., Kim R.B., Stein C.M., Wilkinson G.R., Roden D.M. Inhibition of P-glycoprotein-mediated drug transport: A unifying mechanism to explain the interaction between digoxin and quinidine. // Circulation. 1999. V. 99. P. 552-557.

92. Venne A., Li S., Mandeville R., Kabanov A., Alakhov V. Hypersensitizing effect ofpluronic L61 on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug-resistant cells. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 3626-3629.

93. Kakizawa Y., Kataoka K. Block copolymer micelles for delivery of gene and related compounds. // Adv. Drug Del. Rev. 2002. V. 54. P. 203-222.

94. Lemieux P., Guerinl N., Paradis G., Proulx R., Chistyakova L., Kabanov A. Alakhov V. A combination of poloxamers increases gene expression of plasmid DNA in skeletal muscle. // Gene Therapy. 2000. V. 7. P, 986-991.

95. Collinson E., Dainton F.S., McNaughton G.S. The polymerization of acrylamide in aqueous solution. Trans. Faraday Soc. 1957, 53, 489-498.

96. Walter A., Gutknecht J. Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes. // J. Membrane Biol. 1986. V. 90. P. 207-217.

97. Diizgiines N., Wilschut J. Fusion assays monitoring intermixing of aqueous contents. Methods. Enzymol. 1993, 3-14.

98. Mclntyre J.C., Sleight R.G. Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry.//Biochemistry. 1991. V. 30. P. 11819-11827.

99. Carmichael J., DeGraff W.D., Gazdar Adi.F., Minna J.D., Mitchell J.B. Chemosensitivity testing of human colorectal carcinoma cell lines using a tetrazolium-based colorimetric assay. Cancer Res. 1987, 47, 936-942.

100. Lojewska Z., Loew L.M. Insertion of amphiphilic molecules into membranes is catalyzed by a high molecular weight nonionic surfactant. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 899. P. 104-112.

101. Istratov V., Kautz H., Kim Y., Schubert R., Frey H. Linear-dendritic nonionic poly(propylene oxide)-polyglycerol surfactants.// Tetrahedron. 2003. V.59. P. 4017-4024.

102. Kabanov A.V., Batrakova E.V., Alakhov V.Y. Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer.// Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V.54. № 5. P. 759-779.

103. Heerklotz H, Seelig J., Marcelino J., Lima J.L., Reis S., Matos C. Assessing the effects of surfactants on the physical properties of liposome membranes. // Chem. Phys. Lipids. 2007. V. 146. P. 94-103.

104. Simard J.R., Pillai B.K., Hamilton J.A. Fatty acid flip-flop in a model membrane is faster than desorption into the aqueous phase. // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 9081-9089.

105. Tarasiuk J., Garnier-Suillerot A. Kinetic parameters for the uptake of anthracycline by drug-resistant and drug-sensitive K562 cells. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 204. P. 693-698.

106. Frezard F., Pereira-Maia E., Quidu P., Priebe W., Garnier-Suillerot A. P-glycoprotein preferentially effluxes anthracyclines containing free basic versus charged amine. // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 1561-1567.

107. Krylova O.O., Demina T.V., Melik-Nubarov N.S. Effects of block copolymers of alkylene oxides on permeability of lipid membranes: possible origins of biological activity. // Dokl. Chem. (Engl.). 2001. V. 380. P. 267-271.

108. Zhirnov A.E., Demina T.V., Krylova O.O., Grozdova I.D., Melik-Nubarov N.S. Lipid composition determines interaction of liposome membranes with Pluronic L61. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1720. P.73-83.

109. Smaby J.M., Momsen M.M., Brockman H.L., Brown R.E. Phosphatidylcholine acyl unsaturation modulates the decrease in interfacial elasticity induced by cholesterol. // Biophys J. 1997. V. 73. P. 1492-1505.

110. Roth M. Solubility parameter of poly(dimethyl siloxane) as a function of temperature and chain length. // J. Pol. Sci. Prt. B: Polymer Physics. 1990. V. 28. P. 2715 2719.

111. Chung O.K., Pomeranz Y., Jacobs R.M. Solvent solubility parameter and flour moisture effects on lipid extractability. // J. Am. Oil Chem. Soc. 1983. V. 61. P.621-814.

112. Griffin W.C. Calculation of HLB values of non-ionic surfactants. // J. Soc. Cosm. Chem. 1954. V. 259.

113. Batrakova E., Lee S., Li S., Venne A., Alakhov V., Kabanov A. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. // Pharm. Res. 1999. V. 16. P. 1373-1379.

114. Wu G., Lee K.Y.C. Interaction of poloxamers with liposomes: An isothermal titration calorimetry study. // J. Phys. Chem. B. DOI: 10.1021/jp906331m. In press.

115. Демина T.B. Взаимодействие амфифильных полимеров с природными и модельными липидными мембранами. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. М., 2006.123 с.