Монослои, тонкие пленки и везикулы на основе статистических сополимеров и лецитина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

ГУСИХИНА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

МОНОСЛОИ, ТОНКИЕ ПЛЕНКИ И ВЕЗИКУЛЫ НА ОСНОВЕ СТАТИСТИЧЕСКИХ СОПОЛИМЕРОВ И ЛЕЦИТИНА

02.00.04. - физическая химия

02.00.06. - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Нижний Новгород - 2005

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского.

доктор химических наук, профессор Семчнков Юр«й Денисович

доктор химических наук, профессор Мельникова Нина Борясовна

доктор химических наук, профессор Смирнова Наталья Ннколаеаня

доктор химических наук, профессор Троицкий Борис Борисович

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, г. Москва

Защита состоится "^/сас^Лг 2005 года а /О часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.08 по химическим наука при Нижегородском государственном университете им. Н.И.Лобачевского по адресу: 603930, Нижний Новгород, ГСП-20, пр.Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомятся в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского.

Автореферат разослан 005 года.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

ЕЛ.Сулейманов

QjOOb^i1 X G>

11447M

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Мембраны на основе моно- и бимолекулярных слоев липидов - поверхностно активных веществ биоорганического происхождения играют ключевую роль в функционировании живых организмов. Это определяет исключительную актуальность исследований, направленных на изучение строения и моделирования биологических мембран. Важнейшим направлением подобных исследований, стимулированным запросами медицины, является поиск путей направленного транспорта лекарственных веществ к пораженному органу, исключающих их возможное вредное влияние на здоровые ткани. Одним из путей решения этой проблемы является использование везикул (липосом) - одно- или многослойных замкнутых мембран (сферы, эллипсоиды и т.п.) в качестве нано-контейнеров лекарственных веществ. Однако ряд нерешенных вопросов сдерживает развитие соответствующей биомедицинской технологии, к ним в первую очередь относятся:

1. Низкая агрегативная устойчивость липосом. Ясно, что их разрушение сопряжено с попаданием токсичных препаратов в плазму крови со всеми вытекающими отсюда последствиями.

2. Обеспечение достаточной заполйяемости везикул лекарственным препаратом. Здесь помимо эффекта Донана, имеющего общий характер, большую роль могут сыграть адсорбционное, хемосорбционные явления, в Плане достижения эффективных концентраций.

К настоящему времени развито направление по получению достаточно «Лабильных липосом путем полимеризации аналогов фосфолипидов, содержащих полимеризуемые группы. Они активно используются при изучении различных биологических процессов с участием лйпосом, в том числе и при разработке средств направленного транспорта биологически активных веществ в организм1, вместе с этим Представляется перспективным Другое направление - с участием

1 Чупин В В, Аникин А В, Серебренников Г А //Биологические мембраны, Т 10, №3,1993, С 229-251

природных липидов и синтетических полимеров. В единичных работах, в том числе и с участием диссертанта2, было показано, что добавки полимеров заметно повышают агрегативную устойчивость везикул. Отсюда возникает задача направленного поиска таких полимеров (выбор которых, по-видимому, ограничен) и всестороннего изучения моно- и бимолекулярных липидных слоев с иммобилизованными полимерами.

Цель настоящего исследования связана с созданием научной основы липосомальной технологии применительно к системе: липид лецитин, противоопухолевый препарат доксорубицин гидрохлорид (ДР), амфифильные сополимеры. Конкретные задачи исследования связаны в основном с физической химией поверхности полимер-коллоидных систем и состоят в следующем:

• поиск (со)полимеров, увеличивающих агрегативную устойчивость везикул лецитина, экспериментальное определение поверхностной и межфазной энергии Гиббса, а также их полярных и дисперсионных составляющих, определяющих сродство к водной и олеофильной средам;

• изучение свойств тонких пленок, моно- и бимолекулярных слоев полимер-коллоидных композиций, лецитина и (со)полимеров;

• выявление возможности заполнения везикулярных структур на основе лецитина и сополимеров лекарственным препаратом на примере доксорубицина (ДР);

• разработка методики визуального контроля агрегативной устойчивости везикул лецитина методом атомной силовой микроскопии.

Научная новизна

Определены значения поверхностной Уь и межфазной У^у энергии

Гиббса, их полярной и дисперсионной составляющих Ys(w)i , У s{w)i (со)полимеров стирол (Ct)-Nbwiim пиррол идон (ЫВПД), Ст-4винилпиридин

21 усихниа М С , К) Д Семчиков, Ю Ю Гущина, А А Волков, Н Б Мельникова //Высокомолск сод А 2005 Т 47 №7, С 1220-1224

Уг{«У

(4ВП), Ст-метакриловая кислота (МАК) различного состава. Отношение ——

У¡{«/У

предложено в качестве параметра, отражающего липофильно-гидрофильное соотношение. В качестве компонента липид-полимерной мембраны предложены

амфифильные (со)полимеры с минимальными значениями (Ст-ЫВПД

ш2=0.5, Ст-4ВП т2=0.9).

Впервые показано, что малые и сверхмалые добавки амфифильных сополимеров приводят к существенной гидрофилизации мембраны, образованной лецитиновым бислоем, и увеличению удельной площади лецитинового монослоя. Оба явления связаны с локализацией двумерных макромолекул на границе раздела.

Методом атомной силовой микроскопии показано, что малые добавки амфифильных сополимеров приводят к значительному увеличению агрегативной устойчивости лецитиновых везикулярных структур (100-300нм). Экспериментально доказано включение онкологического вещества ДР, как во внутреннюю полость везикул, так и на поверхность бислоя. Практическая значимость работы

Результаты исследований мономолекулярных слоев лецитина в присутствии амфифильных статистических сополимеров могут быть использованы для нахождения оптимальных условий формирования монослоев с большой удельной поверхностью и ячеистой структурой («нано-размерные окна»), увеличивающей проницаемость биологически активных веществ, а также, с применением техники Ленгмюра-Блоджетт, пористых полимолекулярных слоев.

Стабилизация везикул статистическими амфифильными сополимерами позволяет улучшить фармакологические свойства липосомальных лекарственных средств и представляет большой интерес для специалистов в области фармации и медицины.

Методологический подход к оценке сродства ВМС к липофильным и гидрофильным поверхностям на основе расчета составляющих поверхностной и

межфазной энергии Гиббса может быть использован при получении материалов с заданными функциональными свойствами. Апробация работы

Результаты работы докладывались на Третьей Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры 2004» (г.Москва); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы химии и химической технологии» (г.Саратов, 2003); VII Нижегородской сессии молодых ученых. «Голубая Ока» 2002, 2004г; научной конференции «Химия и медицина» (г.Уфа, 2005). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и списка печатных трудов. Первая глава работы содержит обзор литературы, в котором основное внимание уделено формированию ленгмюровских мономолекулярных слоев, термодинамике смачивания, проблеме биосовместимости (в коллоидно-химическом аспекте); известным формам самоорганизации липидов, в том числе везикулам. Рассмотрены конформационные изменения макромолекул при их переходе из объемной фазы на границу раздела, а также некоторые примеры самоорганизации. В заключении рассмотрена возможность повышения агрегативной устойчивости везикул. Сделан вывод, что использование полимеризуемых липидов позволяет получить достаточно устойчивую липидную мембрану, однако направление, связанное с использованием композиций липиды - синтетический полимер, явно недостаточно развито. Вторая глава работы посвящена описанию методик эксперимента: получение монослоев, везикул, синтез сополимеров, аналитические методики.

В третьей главе диссертации представлены и обсуждены -экспериментальные данные. Путем измерения углов смачивания, рассчитаны термодинамические характеристики поверхности сополимеров с учетом действия полярных и дисперсионных сил. Охарактеризовано влияние малых добавок сополимеров на природу поверхности тонкой пленки лецитина. Методом

Ленгмюра, с использованием пленочных весов, охарактеризованы молекулярные параметры монослоя лецитина и сополимеров на границе раздела фаз. Методом атомно-силовой микроскопии показано увеличение агрегативной устойчивости лецитиновых везикул в присутствии малых добавок сополимеров. Методом Гиббса количественно охарактеризована адсорбция доксорубицина на поверхности сополимера; путем диализа доказана его концентрирование внутри везикул вследствие эффекта Донана. Работа изложена на ¿¿/страницах, включая . рисунков, таблиц и литературных ссылок. Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были использованы статистические сополимеры стирола с N-винилпирролидоном (Ст-МВПД), 4-винилпиридином (Ст-4ВП), метакриловой кислотой (Ст-МАК); яичный лецитин (фосфатидилхолин); лекарственный препарат доксорубицин гидрохлорид (ДР) (фирма «Феррейн»).

Радикальную сополимеризацию стирола с МАК и №ЗПД проводили в массе при 60°С до 7% конверсии в присутствии ДАК.

Состав сополимеров Ст-МАК определяли по содержанию карбоксильных групп кислоты методом кондуктометрического титрования, состав сополимеров Ст-ЫВПД - по содержанию азота методом Кьельдаля. Сополимер Ст-4ВП являлся коммерческим продуктом, фирмы "ALDRICH chemical сотр. inc". Значения ММ сополимеров Ст—4ВП и Ст-МАК определяли вискозиметрическим методом. В первом случае характеристическая вязкость составляла 2.40 л/г (хлороформ, 291 К). Использование коэффициентов уравнения Марка-Куна-Хаувинка для поли -4винилпиридина применительно к данному сополимеру, содержащему 90 мол.% звеньев 4ВП , привело к Мп- 1.16x10б. В случае сополимера Ст-МАК после предварительного метилирования диазометаном значения [т)]=0.520 дл/г и Мп~ 1.69x105. ММ сополимера Ст - №}ПД (т2=0.5) была измерена осмометрическим методом и равна 1.7x105.

Лецитин получали из желтков куриных яиц, выделяли 1-олеил-2-папьмитоил-вп-глицерилфосфатидилхолин реацилированием в виде комплекса с хлоридом кадмия и дополнительно очищали многократным растворением в петролейном эфире и переосаждением ацетоном в среде аргона.

Монослои лецитина и его смесей с (со)полимерами исследовали на оригинальной автоматической установке, включающей пленочные весы Ленгмюра, снабженные ИК-датчиком3. Точность измерения поверхностного давления п была не менее 0.05мН/м, погрешность определения молекулярной площади по стандарту - арахиновая кислота - составляла не более 2-5%. Размеры тефлоновой ванны 200-137-2(мм). Условная скорость сжатия (на молекулу или звено) при указанных размерах ванны Ленгмюра составляла ~1.2А~/мин-молекула(звено). Сжатие тонких пленок на водной субфазе осуществлялось в дискретном режиме две минуты сжатия с последующей двухминутной остановкой.

Измерение вязкости раствора полимера Ст^ВПД, лецитина и их смесей проводили на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0.56мм. Поправка на кинетическую энергию течения составляла менее 1.5% и поэтому при расчете приведенной вязкости %Д/С (л/г) не учитывалась (г)ул - удельная вязкость, С -концентрация полимера в растворе (г/л)).

Величину г|уд определяли как = г|отм - 1, где г|,ш| = т/т0, т и т0 - время истечения растворов лецитина (или Ст-ЫВПД) и хлороформа, соответственно.

Электронные спектры поглощения растворов полимера и его смесей с лецитином в области 240нм - 800нм были получены на приборе «Bio line Specord S 100» фирмы Analytik Jena AG, толщина кварцевой кюветы 10мм.

Краевые углы смачивания измеряли гонеометрически. Величину 0 рассчитывали, исходя из 20 опытов. Полимер наносили на стеклянную подложку путем погружения пластинки в вертикальном положении в раствор полимера.

3 Мельникова Н Б , Волков А А , Куликов М В , Гуляев ИВ// Известия Вузов Химия и химическая технология

Т 47 В 9, 2004, с 22-26

Везикулы готовили по методу обращения фаз, инжекцией и набуханием на подложке. Топографию везикул исследовали на сканирующем зондовом микроскопе "Solver Bio NT-MDT" (Зеленоград) в неконтактном режиме. Образцы готовили нанесением эмульсии везикул из микрошприца на предметное стекло (толщина 1 мм) с последующим высушиванием под вакуумом.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты работы и их обсуждение

1. Смачивание и термодинамические свойства тонких пленок амфифильных (со)полимеров и их смесей с лецитином

Из приведенной формулы лецитина видно, что это соединение содержит как ионогенные, так и неполярные группы, т.е. является амфифильным.

"O-fH,

- -о—сн о

1 II

CHj- -О-Р—о-

сг

СН3(СН2)7СН = СН(СН2)7-^

о

I II III IV

I - жирнокислотные остатки, П - остаток глицерина, Ш - фосфатная группа, IV - холин.

1-олеил-2-пальмитоил-5п-фосфатидилхолина

Исходя из этого для включения в фосфолипидную мембрану были использованы амфифильные сополимеры (Ст-ЫВПД, Ст-4ВП, Ст-МАК). Выбор оптимального из них был сделан путем оценки сродства как к полярным, так и к неполярным средам, исходя из соответствующих составляющих межфазной и поверхностной энергии Гиббса. Поэтому существенная часть данной работы связана с оценкой гидрофильно-липофильного сродства сополимеров, а также, учитывая целевое назначение последних, с их совместимостью с биологической среде.

1.1. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса как мера

сродства ВМС к полярным и липофильным средам

Под совместимостью полимерного материала с биологической средой, например плазмой крови и ее заменителями, водными растворами лекарств, понимается межфазное взаимодействие на границе раздела полимер - водная среда. Количественной мерой данного межфазного взаимодействия является термодинамическая работа адгезии на границе раздела полимер - водная среда. В свою очередь, величина работы адгезии СМШГ) характеризуется значениями поверхностной и межфазной энергии Гиббса (у5, у^). Согласно теории Джирифалко-Гуда-Фоукса4, на межфазной границе раздела можно

представить как аддитивную величину, включающую полярную и неполярную составляющие,

Поскольку в качестве среды выбрана полярная жидкость - вода, полярная ахмавляющая которой намного превышает дисперсионную (у'' = 51 в.иДж м'2, ,'{ - 22 2 мДж • к '), то работа адгезии главным образом обусловлена величиной молярной составляющей межфазной энергии Гиббса: тем больше, чем

меньше у',.

Расчет у, и у,; осуществлен при использовании термодинамической теории равновесных углов смачивания 0. Измерения 9 были проведены в условиях нак-кания 0,„ спекания 9Г и избирательного смачивания в среде двух песмешивающихся жидкостей О^, вг(1>, где 1 - смачивающая жидкость или среда. Равновесные жачения краевых углов 9 были выбраны равными значениям 9, соо1вегс1вующим плато кинетических кривых 9=А^т).

(1)

(2)

К Нмю<1 I < оИшс! 1и1ог1(1СС Ьс) ">9, 398 (1977)

Рис.1. Методики анализа краевых углов смачивания 8: а -контакчный угол натекания 0.,; б - контактный угол оттекания 0Г; в - контактный угол натекания меташч избирательного смачивания ва(1>.

Поверхностная энергия у5 , его полярная и дисперсионная составляющие были рассчитаны на основе решения уравнений:

(1 + со5ес.„^) = (Ус^Т + (>-,"„„ у (3)

уНг0(\ + = (У+ (га,о У*)"2 (4),

где 0„1О и 0- углы натекания Н20 и CH2J2 на поверхности полимера,

находящегося в равновесии с насыщенным паром смачивающей жидкости. Рассчитанные термодинамические параметры приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Значения углов смачивания, поверхностной энергии Гиббса и ее составляющих, сополимеров

сополимер Шг (ва±1) град, капля Н20 град, капля сад ^±0.7) мДж/м2 (у/±0.4) мДж/м2 (У*±1.1) мДж/м2

Ст-ЫВПД 0.1 76 24 49.0 3.0 52.0 16.4

0.2 67 12 52.0 6.2 58.0 8.3

0.4 62 15 53.0 8.3 61.3 6.5

0.5 60 12 54.2 10.5 64.7 5.2

Ст-4ВП 0.9 46 26 48 17 65.0 13.4

Ст-МАК 0.35 70 5 13.2 4.3 17.5 26.4

Данные таблицы. 1 показывают, что критерий у^/у^ эффективен для

(со)полимеров с ш2 от 0.1 до 0.5. При большем содержании полярного звена значение этого критерия малоинформативно. С другой стороны, для липидов большое значение имеют (со)полимеры с т2>0.4. В связи с этим, для изучения (со)прлимеров желателен поиск других показателей гидрофильно-липофильного соотношения.

Бислой фосфолипидов в биологической мембране отрицательно заряжен (а0=-0.2Кл-м"2) и способен структурировать воду в тонком слое у поверхности мембраны. В результате между полярными фрагментами липидных молекул возникает взаимодействие, опосредованное слоем структурированной воды и называемое гидратационным. Поэтому поверхностные свойства гидратационного лиггидного слоя сополимеров необходимо было также изучить с учетом неизбежной гидратации в водной фазе.

Расчет равновесных величин полярной Ys(w)w и дисперсионной

У s ( и) w составляющих энергии Гиббса, межфазной энергии У ^(o)w в полярном окружении (среда - вода) выполнены с привлечением методологического подхода Е.Рукенштейна5 по следующим уравнениям:

(У». ÇQSQH.I+Y.-Г.):

4у:

I*

Ys(o)wP = Ф2

(5)

_(-?.(.) cose.,.,+ У.-У.):

I*

Р _

У s(w)w

4у:

(6)

У S(W)M

(У.(„, -T.CQS9,,,, +у,)г

(7),

где символы О, № - октан, вода,

9ц(0) - равновесный краевой угол капли воды в октане,

S Rukenstcin E Lee S H Free interface energy as criterion of biocompatibility // J.Colloid and Interface Sci 19X7 V 120 №1 P 153-161.

У он, у, и 7„ - межфазное натяжение, ут = 51.0 мДж/м2 , и поверхностное

натяжение воды (\у), октана (о), соответственно,

вф») - равновесный краевой угол капли октана в воде,

0„(№) - равновесный угол оттекания (пузырек воздуха в воде).

Ум*)о- неравновесная величина межфазного натяжения гидратированной

полимерной пленки;

Ух*)-* - равновесная величина межфазного натяжения гидратированной полимерной пленки;

Ф - параметр, учитывающий межмолекулярное взаимодействие (Ф=1).

Экспериментальные значения краевых углов 0, а также общая характеристика рассчитанных энергетических параметров представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Количественные характеристики межфазного взаимодействия на границе

раздела «пленка сополимера - среда»

сополимер ш2 9у(\р<)> (±1) град (±1) град. (±1) град. „р Г (±0.05) мДж/м2 У (±0.05) мДж/м2 Т ю (±0.06) мДж/м2

Ст-ЫВЦД 0.1 49 23 49 1.2 6.2 22.7 5.2

0.2 66 49 66 0.85 4.5 14.9 5.3

0.4 59 73 59 0.59 3.2 6.6 5.4

0.5 70 80 37 0.11 5.3 2.0 48

Ст-4ВП 0.9 30 55 30 0.1 0.3 12 3

Ст-МАК 0.35 45 78 50 0.3 1.5 21 5

Согласно теории Джирифалко-Гуда-Фоукса, величины у^)» и урж определяют сродство сополимера к гидрофильной и олеофильной среде - чем меньше данные величины, тем больше сродство к соответствующей среде. Из таблицы 2 видно, что наилучшим образом первому условию отвечают сополимер Ст-ЫВПД (Ш2=0.5) и сополимер Ст-4ВП, однако последний значительно уступает первому в отношении Поэтому сополимер Ст^ВПД

(гп2=0.5) следует признать оптимальным для модификации фосфолипидных мембран, как возможный компонент полимер-коллоидного комплекса.

По мере развития представлений о коллоидно-химической природе биосовместимости, в качестве ее критерия были предложены поверхностная и межфазная энергии Гиббса, дисперсионная и полярная их составляющие. В соответствии с упомянутым выше подходом, именно их минимальные значения соответствуют максимальной биосовместимости. Оценивая данные таблиц 1, 2, следует обратить внимание на существенно меньшие значения поверхностной энергии сополимера Ст-МАК по сравнению с другими сополимерами, а также наименьшие значения полярной и дисперсионной составляющий межфазной энергии Гиббса в полярной и липофильной средах для сополимеров Ст^ВПД (1ть=0.5) и Ст-4ВП (т2=0.9). Таким образом, именно эти три сополимера были в дальнейшем использованы для модификации липидных мембран.

Из данных таблицы 2 следует, что отношение у^^^/у^ц*)* резко возрастает для эквимолярного сополимера. Предположительно, это может указывать на достижение оптимального гидрофильно-липофильного соотношения сополимера при данном соотношении звеньев. Однако, проверить это предположение не представлялось возможным из-за частичной растворимости сополимера с большим содержанием винилпирролидона.

1.2. Смесевые пленки «лецитин - ВМС». Зависимость краевого угла смачивания от состава, химической природы ВМС и рН

Для выявления оптимального относительного содержания статистического амфифильного сополимера в липидной мембране нами изучена зависимость краевого угла смачивания от состава смесевой пленки.

Измерение углов смачивания смесей разного состава выявило экстремальную зависимость (рис.2). Область минимума смещена в область малого (Ст-КВПД) и очень малого (Ст-4ВП, Ст-МАК) относительного содержания сополимеров и соответствует максимальной гидрофилизации поверхности, обусловленной, по-видимому, оптимальной ориентацией полярных звеньев

сополимера к воде. Смещение минимума зависимости (М(Свмс) в область малых и сверхмалых концентраций добавок для ионогенных сополимеров по сравнению с неионогенными, но включающими гидрофильные звенья ВПД, свидетельствует о большей степени гидратируемости ионогенных полярных групп по сравнению с неионогенными. Следует заметить, что эффект влияния сверх малых добавок наиболее ярко выражен для сополимера Ст-МАК, обладающего наименьшими значениями поверхностной энергии Гиббса, что исходя из упомянутого выше критерия, должно соответствовать наилучшей адсорбируемости. Повышение относительного содержания сополимера приводит к постепенному увеличению угла смачивания.

Влияние рН среды на гидрофильно - гидрофобные и кислотно-основные взаимодействия было изучено на основе изменения смачиваемости тонких пленок полимеров и их смесей с лецитином под действием капли буферного раствора в широком интервале рН (рис. 3).

1 М(-ЧИ-

2.00 5 50 100

Рис.2. Зависимость угла смачивания (натекания) 0а от содержания сополимера в смеси с лецитином : 1- Ст-МАК (га2=0.35), 2 - Ст-ЫВПД (ш2=0.5), 3 - Ст-4ВП (ш2=0.9).

Свмс, мас.%

Низкие значения углов смачивания, а также характер влияния рН указывают на достаточно высокую полярность поверхности. Уменьшение углов смачивания как при низких, так и при высоких значениях рН, связано с увеличением степени диссоциации ионогенных групп лецитина. Аналогичный эффект имеет место для пленок, образованных сополимерами с основной и

кислотной группами. Естественно, что в данном случае углы смачивания уменьшаются лишь в одной области рН.

Смесевая пленка лецитин - сополимер (Ст-4ВП) оказалась подверженной влиянию рН по отношению к смачиваемости только лишь в области больших значений рН, поскольку основные группы сополимера препятствуют дополнительной ионизации основной группы лецитина в кислой среде. Поскольку смачивание определяет межмолекулярное взаимодействие в поверхностном слое, то полученные результаты свидетельствуют о существенном изменении природы Поверхности лецитина в присутствии малых добавок ВМС.

0а, Град.

80 -

40

Рнс.З. Изотерма смачивания 0=Г(рН): 1 - лецитин; 2 - Ст-МАК; 3 - Ст-4ВП; 4 - 98% лецитина + 2% Ст-4ВП

рН

2. Физико-химические закономерности формирования и свойства ленгмюровских монослоев амфифильных сополимеров и их смесей с лецитином на воде

Метод поверхностного сжатия мономолекулярного слоя нерастворимых и нелетучих молекул (метод Ленгмюра) позволяет получить изотермы сжатия я-А, отражающие состояние «двумерного газа». В идеальном случае (неионогенные ПАВ) такие изотермы соответствуют известным уравнениям идеального и реального газов, с той разницей, что давление заменяется на площадь. По аналогии с агрегатными состояниями обычного вещества мономолекулярные пленки можно разделить на три типа: газообразные, жидкие и твердые. Газообразные пленки могут неограниченно расширяться, не претерпевая фазовых изменений, постоянные контакты между молекулами отсутствуют. В жидких

пленках эти контакты, обусловленные межмолекулярным взаимодействием, возникают. Различают растянутые и конденсированные жидкие пленки. В последних большие оси молекул ориентируются перпендикулярно поверхности. Твердые пленки характеризуются строго линейными зависимостями л-А. Сжимаемость таких пленок мала и близка к сжимаемости твердого вещества, что указывает на плотную упаковку углеводородных цепей.

На рис. 4 а, б, в приведены изотермы поверхностного сжатия л=А[Ао) для монослоя яичного лецитина и его смесей с сополимерами Ст-ЫВПД и Ст-4ВП. Экстраполяция на я=0 позволяет оценить молекулярную площадь лецитина Ао=0.54нм2 (рис.4в). Теоретический расчет площади, занимаемой двумя плотно-упакованными гидрофобными цепями лецитина (модель щетки), дает величину Ао=0.41нм2. Однако, в реальных условиях молекула лецитина в монослое содержит адсорбированную воду в своей полярной части и А0 является равной 0.52-0.56 нм2.

а б.

Рис.4.а,б,в. Изотермы сжатия монослоя лецитина и смесей при массовом соотношении компонентов 100:3 на водной субфазе при Т=298К; 1 - лецитин-Ст-4ВП: сплошной линией обозначен прямой процесс (сжатие), прерывистой линией - обратный (растяжение); 2 - лецитин-Ст-КВПД (свежеприготовленная смесь); 3 -лецитин- Ст-ЫВПД (выдержанная смесь в течение суток).

Принципиально иной характер имеют изотермы сжатия смесей лецитин -сополимер (рис.4а,б). На соответствующих кривых п=А[Ао) можно отметить две области, разделенные плато, что особенно ярко выражено для смеси лецитина с сополимером Ст-4ВП (рис.4а). В последнем случае экстраполяционные величины А(, (л=0) в I и во II областях равны (1.1 ±0 15)нм2 и (0.90±0.05)нм2, соответственно. Рассчитанные величины параметров сжимаемости

позволяют рассматривать фазовые состояния монослоев как «жидко-твердые» пленки, т.е. пленки, содержащие воду, связанную водородными связями с полярными группами сополимера. Переходная область, соответствующая двумерному фазовому переходу (т.е. переходу к плотно упакованному мономолекулярному слою), сопровождаемому вытеснением части гидратационной воды, более четко выражена для смесей лецитина с сополимером Ст-4ВП (рис.4а).

Следует отметить, что эффективная молекулярная площадь Ао в I и II областях значительно увеличивается по сравнению с Ао для лецитинового монослоя. Отсюда следует, что макромолекулы иммобилизуются упомянутым слоем. На это же указывают заметно меньшие величины поверхностного давления, отвечающего коллапсу (разрушению) мономолекулярного слоя лецитина при малых добавках сополимера.

Состояние монослоев смесей лецитина и сополимеров при массовом соошошении компонентов 100:3 практически не зависит от условий формирования монослоя на водной субфазе. В области поверхностных давлений от 0 до ЗОмН/м практически отсутствует гистерезис сжатия, что следует из практического совпадения кривых сжатия и обратного ему растяжения.

В данной серии экспериментов было обнаружено необычное явление. I (оказано, что при уменьшении концентрации сополимера Ст-ЫВПД (Ш2=0.5) его раем пора, наносимого на субфазу, существенно возрастает удельная площадь ВМС в монослое - от 0.34 до 30.5 нм2/звено (рис.5).

' А А>|л\1ин1 Фи шчискля химия поверхностей М Мир|979.С88

Рис.5. Изотермы сжатия я=('(/%,) монослоев сополимера Ст-ЫВПД на волной субфазе при Т=298К Концентрации сополимера в хлороформных растворах, из которых формируется монослой: а) С=1.00г/л, У=10мкл; б) С=0.5г/л, У=10мкл: в) С=0.011 /.I. У=100мкл.

Для объяснения этого явления были проведены дополнительные эксперименты. Измерена вязкость растворов сополимера Ст^ВПД двух составов в широком диапазоне концентраций. Это означает, что вязкость растворов полимеров становится меньше вязкости растворителя. При концентрации полимера 0.05 - 0.5г/л найдены отрицательные и крайне низкие значения приведенных вязкостей: 7„,/С(0.051-г"1) = -0 47-г"'; ;/„,/С(0 57 ) = -0 04 / .

Подобные явления хорошо изучены в 80-е годы. Природа этого эффекта связана с разворачиванием макромолекул и их ориентацией по потоку, что способствует переходу от турбулентного течения к ламинарному. Визуализация процесса растекания раствора сополимера на поверхности воды при формировании мономолекулярного слоя показала, что раствор лецитина растекается ровным фронтом, а растворы сополимеров сверхмалых концентраций растекаются нестабильным фронтом с неравномерной и периодически меняющейся скоростью соседних участков. Это можно связать с локальной ориентацией и разворачиванием макромолекул по потоку, что приводит к возрастанию скорости растекания в данной области. Процесс разворачивания макромолекул в потоке термодинамически невыгоден, поскольку при лом теряется конфигурационная энтропия. В какой-то степени эти потери могут бы гь компенсированы образованием локальных ассоциатов частично вытянугых и

ориентированных макромолекул за счет гидрофобного взаимодействия последовательностей стирольных звеньев. В результате, после испарения хлороформа на границе раздела, наряду с одиночными макромолекулами, присутствуют их агрегаты из вытянутых в той или иной степени макромолекул, в которых последовательности стирольных звеньев, связанных гидрофобным взаимодействием, чередуются с гидратированными последовательностями гидрофильных звеньев Ст-ЫВПД. Наличие гидратированных областей придает этим образованиям ячеистый характер, что вызывает увеличение удельной площади мономолекулярного слоя.

И, от« ед

2 VI

......... /' V2

Г\у 3 \

/ V4

270

310

длина волны, нм

Рис.6. Электронные спектры поглощения реакционной смеси лецитина со Ст-КВПД (ш2=0.5). Состава: лецитина-1.45-10'5М; Ст-^ПД-2мг/л. 1-теоретический спектр смеси; 2-

свежеприготовленная смесь; 3-раствор исходного компонента смеси-лецитин С=1.45-10"5М; 4-раствор исходного компонента смеси - Ст-ШПД С=2мг/л; 5-выделжанная смесь.

На рис.6 приведены электронные спектры растворов смеси лецитина с сополимером Ст-ЫВПД. Отмечено увеличение коэффициента, характеризующего <л ношение оптических плотностей поглощения при Х=243нм - полосы поглощения фосфатидилхолиновой группы липида и Х=259нм - реперной полосы фунны ^ПД, к=024}/[3259 07 0-96 до 1.5 при хранении в течение суток (рис.6, кривые 2,5). Вероятно, это свидетельствует о донорно-акцепторном 1и,1имодсйс»зии между компонентами, что в конечном счете может привести к обраюианию полимер-коллоидных комплексов между полимером и лецитином.

3. Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул

К везикулам относят полые наночастицы, имеющие форму сферы или эллипсоида, с замкнутой оболочкой из липидной мембраны (одно- или многослойной), внутри которых находится вода. Основной проблемой создания везикулярных частиц является их невысокая термодинамическая (агрегативная) и кинетическая устойчивость.

В настоящей работе рассмотрена возможность стабилизации везикулярных структур введением в липиды амфифильных сополимеров, поскольку совокупность рассмотренных выше данных указывает на иммобилизацию амфифильных сополимеров би- и монослой лецитина. Из данных, полученных методом атомной силовой микроскопии видно, что в ряду изученных (со)полимеров наилучшие результаты были достигнуты с использованием сополимера Ст-4ВП (ш2=0.9), в отсутствие сополимера наблюдаются следы слияния везикул. В присутствии малого количества сополимера в смесевой пленке, близкого к тому, что соответствует минимуму на кривых зависимости 0а~А[СВмс), следы слияния везикул практически отсутствуют, размер частиц колеблется в пределах 100-300нм, т.е. находится в «нано» диапазоне. Можно полагать, что в данном случае фрагменты ламелей лецитина армированы цепями амфифильных сополимеров, как это было постулировано для полимер-коллоидных комплексов синтетических ПАВ с полиэлектролитами7.

Следует также отметить, что независимо от метода формирования (метод ^ обращения фаз, инжекция или набухание на подложке) преимущественно образуются везикулы с размерами от

ОМв О ОН О ""г

о "" 0.1 до О.Змкм (малые и большие).

ЦкАХи-сХон

о Ан Исследование механизма введения

лекарственного вещества в полимерсодержащие

Доасорубицин мцххлсрт (ДР)

7 Отдельною М.В, Захарова Ю.А , Ивлева Е.М., Касаикин В А , Кабанов В А //Высокомспск со I А.2003 Т 45 №9, С. 1524.

везикулы для снижения токсичности лекарства было выполнено на примере противоопухолевого антибиотика - доксорубицина гидрохлорида (ДР).

Рис.7. Микрофотографии везикулярных структур, а. - лецитин; б -лецитин-Ст-4ВП (97:3%)

Была изучена адсорбция из водных растворов ДР на поверхности тонкой пленки сополимера Ст^ВПД (ш2=0.5) и на поверхности подложки с липид-полимерными везикулами.

Исследование адсорбции ДР на поверхности тонкой пленки Ст-ЫВПД было проведено на основе анализа зависимости у={(Сд.) в растворе до и после адсорбции (рис.7). Равновесная (текущая) концентрация ДР определялась по установленному значению поверхностного натяжения после 12 часов выдержки Ст-ЫВПД в растворе.

а.

б.

поверхностного натяжения -/={(Сдр); 1 - до адсорбции; 2 -после адсорбции.

Рнс.7.

Изотермы

о

2

4

6 8

Сд. ЮЧкиа/л

Величина эффективной адсорбции А,фф=ГДР, вычислялась по формуле (8) Она оказалась равна (3.7±0.1)-10"'°моль/см2.

г - л - ~ Д'1 ^' ^ гв\.

гт =А*м=-~А--(8)>

где С°„, и См - начальная и текущая молярная концентрации, А - площадь; V - объем пробы (л).

Второй способ был основан на измерении углов смачивания пленки сополимера (Ст-ЫВПД) растворами ДР различной концентрации.

Удельная адсорбция Гиббса на межфазной границе Г5.| была рассчитана, используя уравнение Юнга (9):

сое = (9)

и фундаментальное адсорбционное уравнение Гиббса для разбавленного раствора, содержащего одно поверхностно активное вещество (10):

(10),

"' <1С ЯТ У

где С - равновесная концентрация ДР; Я - универсальная газовая постоянная, Я=8.31 Дж/К-моль; Т-температура, К.

Принимая во внимание, что при смачивании полимеров <1у

у8.у=соп51 и '" =0, с учетом уравнения (9) адсорбционная изотерма (10) ¿С

принимает вид:

г =с1(у,.усо&в) С </С ЯТ

Графическое решение уравнения (11) в координатах усо50=Г(1пСВ|<) (рис.8) позволило рассчитать Г8.,=(4.0±0.1)10'10 моль/см2.

Близкие значения рассчитанных величин Г5.| и А ,фф говорят о незначительном влиянии состояния поверхности Ст-ЫВПД на характер адсорбции.

Адсорбцию ДР на поверхности липид-полимерного везикулярного слоя, изучали следующим образом. Везикулы состава липид-полимер 1:1 получали методом обращения фаз и наносили на стеклянную подложку

инжектированием через хроматографический шприц. Высушенные подложки погружали в растворы ДР на несколько часов. В данном случае использование зависимостей (рис.7) для определения концентрации ДР не представлялось возможным ввиду возможного перехода лецитина в раствор, поэтому концентрацию ДР определяли спектральным методом, используя калибровочный график по реперным полосам ДР 480нм и 500нм.

Величина эффективной удельной адсорбции Гд^Азфф на поверхности липид-полимерной пленки, рассчитанная по формуле (8), равна

0.83(±0.2)10~'"моль/см2. Предварительными опытами установлено, что адсорбция ДР на лецитине ничтожно мала (T^A^^O.OI 'Ю^моль-см"2).

Концентрацию ДР внутри везикул (заполняемость или «загруженность» везикул) устанавливали по анализу диализованного раствора ДР. Диализ осуществляли с использованием мембран из целлюлозы (ММ=10000) при ионной силе 0.1-0.2. В качестве электролита были использованы растворы хлорида натрия, фосфатный буферный раствор. Концентрацию НС1 и ДР оценивали титриметрически и методом электронной спектроскопии, соответственно.

у COS©,

1пС„„

Рис.8. Графическое решение уравнения (11).

Отношение протонированных форм доксорубицина гидрохлорида внутри и снаружи везикулы рассчитано по формуле:

При [ДР]|П=0.9610'3моль/л и [ДР]ог=1.И0Л|Оль/л, а~1-103, этот результат совпадает с литературными данными* и отвечает практически 100% "загруженности" везикул.

1. Выполнен комплекс физико-химических исследований по модификации липидных мембран синтетическими амфифильными сополимерами, применительно к «наноконтейнерной» технологии транспорта лекарственных средств.

2. Осуществлен первичный выбор статистических сополимеров, как возможных компонентов липидных мембран методом смачивания. Измерены углы натекания и оттекания на поверхности раздела пленок сополимеров стирола с М-винилпирролидоном, 4-винилпиридином, метакриловой кислотой с воздухом, водой, ненолярными жидкостями, найдены значения поверхностной и межфазной энергии Гиббса, и\

полярной и дисперсионной составляющих Т^,,), ^»ъ У л») ■ В соответствии с коллоидно-химическими критериями биосовместимости, в качестве оптимальных были выбраны сополимеры Ст->ГОПД (ш2=0.5), Ст-4ВП (т2=0.9) и Ст-МАК

(т2=0 35) с минимальными значениями У*!{><.), , .

3. Методом смачивания и поверхностного сжатия монослоя ( анали) я-А изотерм с использованием пленочных весов Ленгмюра) изучены свойства тонких

ВЫВОДЫ

Бабак В Г Коллоидная химия в технологии микрокапсулирования Свердловск. Ии Урал хп-тл. 1991,172с.

пленок лецнтин-(со)полимерных композиций. Впервые выявлено два взаимосвязанных эффекта, вызванного малыми (1-5%) и сверхмалыми (0.1-1%) добавками амфифильных (со)полимеров:

• значительное повышение гидрофильности липидного бислоя;

• увеличение эстраполяционной величины удельной площади (я=0) липид-полимерного слоя по сравнению с липидным; Л()(лецитин)=0.54±0.02 нм2; А0(лецитин-(со)полимер) в I и во II областях соответственно равны (1.1±0.15)нм2 и (0.90±0.05)нм2. Высказана гипотеза, что оба явления связаны с локализацией на границе раздела двумерных макромолекулярных клубков.

4. Показана принципиальная возможность заполнения везикул лецитина, армированных амфифильным сополимером Ст-ЫВПД (гп2=0.5), противоопухолевым лекарственным препаратом за счет эффектов сорбции на (со)полимере и эффекта Донана.

Методом Гиббса, а также сочетанием методов Гиббса и смачивания, измерена величина эффективной А,фф и гиббсовской адсорбции на межфазной границе пленка-раствор Г5.|. Найдены близкие значения А^,ф=(3.7±0.1)-10"|0моль-см"2, П,|=(4.0±0.1)10'10 моль/см2.

С использованием данных электронной спектроскопии по реперной полосе доксорубицина Х=480нм рассчитано отношение концентрации лекаре I венного препарата, вовлеченного внутрь везикул к его концентрации во внешнем растворе после диализа, которое оказалось близким к 103.

5. Методом атомной силовой микроскопии доказано, что амфифильные (со)полимеры приводят к существенному возрастанию агрегативной усгойчиности лецитиновых везикул. Так везикулы, полученные методом (¡¡вучивания водного раствора лецитин - (со)полимер Ст-4ВП (Шг=0.9) с 3% добавкой (со(полимера, имели размер в пределах 100-300нм и оставались а) регат ивно устойчивыми в течении недели. В отсутствии (со)полимера в (ечение указанного срока произошла практически полная коалесценция (слияние) нсмикул.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ ТРУДОВ

1. Н.Б. Мельникова, М.С. Гусихина, A.A. Туршатов, Ю.Д. Семчиков Энергетические свойства тонких пленок статистических сополимеров как критерий их биосовместимости с онкологическими препаратами // Известия ВУЗов. Сер. "Химия и химическая технология"; 2004. Вып.8, -С. 101-109.

2. М.С. Гусихина, Ю.Д. Семчиков, Ю.Ю. Гущина, A.A. Волков, Н.Б. Мельникова. Влияние амфифильных сополимеров на свойства ламеллярных и везикулярных структур лецитина. // Высокомолек. соед., Сер. А.-2005, - Т.47,-№7, -С. 1220-1224.

3. М.С.Гусихина, Ю.Д.Семчиков, О.В.Бирюкова, Н.Б.Мельникова Влияние малых и сверхмалых добавок сополимера Ст^ВПД на состояние монослоев лецитина. // Известия ВУЗов. Сер. «Химия и химическая технология»; 2005. Вып.9, -С. 110-115.

4. А.А.Волков, М.С.Гусихина, Ю.Д.Семчиков, С.В.Кононова. Н.Б.Мельникова. Особенности адсорбции доксорубицина на поверхности полимеров, содержащих физиологически активное звено. // Известия ВУЗов. Сер. «Химия и химическая технология»; 2005. Вып.9,-С.85-91.

5. Н.Б. Мельникова, М.С. Гусихина, A.A. Туршатов, Ю.Д. Семчиков. Поверхностные характеристики тонких пленок статистических сополимеров стирола с N-винилпирролидоном и 4-винилпиридином, на границе раздела водных растворов. // III Всеросс. Каргинская . конф.: Тезисы докл.: г. Москва, 27 января-1 февраля, 2004 г., -С. 244

6. A.A. Волков, М.В. Куликов, М.С. Гусихина. Исследование токсичного действия онкологического препарата "доксорубицина" на моделях биосистем физико-химическими методами. // IV Всерос. конференции молодых ученых "Современные проблемы химии и химической технологии": Темсы докл • г.Саратов, 23-25 июня. 2003 г., - С.54

7. М.С. Гусихина, A.A. Волков. Межфазная энергия Гиббса на границе раздела модельной биосистемы и раствора онкологического антибиотика доксорубицина как критерий биосовместимости и проникновения лекарства через мембрану. // УГГ Нижегородская сессия молодых ученых. "Голубая Ока": Тезисы докл.; г.Н.Новгород, 25-30 апреля, 2002 г.,-С.62.

8. A.A. Волков, М.С. Гусихина. Взаимодействие противоопухолевого антибиотика антрахинонового типа с ионами меди в системах, моделирующих биологические среды. // VII Нижегородская сессия молодых ученых. «Голубая Ока»: Тезисы докл.; г.Н.Новгород, 25-30 апреля, 2002 г, -С.63.

9. М.С.Гусихина, А.А.Туршатов, Ю.Д.Семчиков. Поверхностные характеристики тонких пленок статистических сополимеров с природным ПАВ как критерий их биосовместимости. // IX Нижегородская сессия молодых ученых «Голубая Ока»: Тезисы докл.; г.Н.Новгород, 25-30 апреля 2004г., -С.53.

10. М.С.Гусихина, Ю.Д.Семчиков, Н.Б.Мельникова. Стабилизирующий эффект сополимеров на основе Ст-ЫВПД и Ст-4ВП на состояние липосом. П Всеросс. конференция молодых ученых «Химия и медицина»: Тезисы докл.; г.Уфа, 5-8 сентября 2005г.

Подписано в печать 22.11.2005 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2. Заказ № 1584. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского Лиц. ПД № 18-0099 от 4.05.01. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

ч

к

*

V

I »

»2415*

РНБ Русский фонд

2006-4 26326

i

г

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Самоорганизация липидов и липид-(со)полимерных систем.

1.1.1. Самоорганизация липидов на примере лецитина. Строение клеточной мембраны.

1.1.2. Самоорганизация макромолекул на границе раздела фаз.

1.1.3. Полимеризационный липидный монослой.

1.2. Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев.

1.2.1. Метод смачивания.

1.2.2. Термодинамика поверхностного слоя.

1.2.3. Монослои Ленгмюра на основе полимеров и амфифильных сополимеров.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Исходные вещества и методики очистки.

2.1.1.Синтез полимеров и сополимеров.

2.1.2. Синтез фосфатидилхолина (лецитина яичного).

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методика получения монослоев Ленгмюра.

2.2.2. Измерение краевых углов смачивания.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Смачивание и термодинамические свойства тонких пленок амфифильных (со)полимеров и их смесей с лецитином.

3.1.1. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса как мера сродства ВМС к полярным и липофильным биологически системам и средам.

3.1.2. Определение поверхностной энергии Гиббса сополимеров.

3.1.3. Определение межфазной энергии Гиббса и ее составляющих для гидратированных сополимеров.

3.1.4. Смачивание смесевых пленок "лецитин -сополимер".

3.2. Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра.

3.2.1. Монослои амфифштьных сополимеров и их смесей с лецитином на водной субфазе.

3.2.2. Вязкость сильно разбавленных растворов сополимера Ст-МВПД.

3.2.3. Влияние характера растекания растворов на свойства монослоев.

3.2.4. Электронные спектры поглощения.

3.3. Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул (липосом).

3.3.1. Агрегативная устойчивость везикулярных систем.

3.3.2. Изучение адсорбции лекарственного препарата на поверхности.

3.3.3. Механизм введения лекарственного препарата во внутреннюю полость везикул.

ВЫВОДЫ.

выводы

1. Выполнен комплекс физико-химических исследований по модификации липидных мембран синтетическими амфифильными сополимерами, применительно к «наноконтейнерной» технологии транспорта лекарственных средств.

2. Осуществлен первичный выбор статистических сополимеров, как возможных компонентов липидных мембран методом смачивания. Измерены углы натекания и оттекания на поверхности раздела пленок сополимеров стирола с Ы-винилпирролидоном, 4-винилпиридином, метакриловой кислотой с воздухом, водой, неполярными жидкостями, найдены значения поверхностной и межфазной энергии Гиббса, их полярной и дисперсионной составляющих У^), У^м, У^о) • В соответствии с коллоидно-химическими критериями биосовместимости, в качестве оптимальных были выбраны сополимеры Ст-ЫВИД (ш2=0.5), Ст-4ВП т2=0.9) и Ст-МАК (т2=0.35) с минимальными значениями У^), У^0) > % ■

3. Методом смачивания и поверхностного сжатия монослоя ( анализ п-А изотерм с использованием пленочных весов Ленгмюра) изучены свойства тонких пленок лецитин-(со)полимерных композиций. Впервые выявлено два взаимосвязанных эффекта, вызванного малыми (1-5%) и сверхмалыми (0.1-1%) добавками амфифильных (со)полимеров:

• значительное повышение гидрофильности липидного бислоя;

• увеличение эстраполяционной величины удельной площади (я=0) липид-полимерного слоя по сравнению с липидным; А0(лецитин)=0.54±0.02 нм2; Ао(лецитин-(со)полимер) в I и во II областях соответственно равны (1.1±0.15)нм2 и (0.90±0.05)нм2. Высказана гипотеза, что оба явления связаны с локализацией на границе раздела двумерных макромолекулярных клубков.

4. Показана принципиальная возможность заполнения везикул лецитина, армированных амфифильным сополимером Ст-№ЗПД (т2=0.5), противоопухолевым лекарственным препаратом за счет эффектов сорбции на (со)полимере и эффекта Донана.

Методом Гиббса, а также сочетанием методов Гиббса и смачивания, измерена величина эффективной А^,ф и гиббсовской адсорбции на межфазной границе пленка-раствор Г^. Найдены близкие значения А-,фф=(3.7±0.1 )• 10'10моль-см"2, Г5.1=(4.0±0.1)* Ю"10 моль/см2.

С использованием данных электронной спектроскопии по реперной полосе доксорубицина Х=480нм рассчитано отношение концентрации лекарственного препарата, вовлеченного внутрь везикул к его концентрации во внешнем растворе после диализа, которое оказалось близким к Ю3.

5. Методом атомной силовой микроскопии доказано, что амфифильные (со)полимеры приводят к существенному возрастанию агрегативной устойчивости лецитиновых везикул. Так везикулы, полученные методом озвучивания водного раствора лецитин — (со)полимер Ст-4ВП (ш2=0.9) с 3% добавкой (со)полимера, имели размер в пределах 100-300нм и оставались агрегативно устойчивыми в течении недели. В отсутствии (со)полимера в течение указанного срока произошла практически полная коалесценция (слияние) везикул.

1. Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Полимерные монослои и липосомы на основе липидоподобных мономеров // Биологические мембраны. Т.5. -№3. -1988. С.252-257.

2. Чупин В.В., Аникин А.В., Серебренникова Г.А. Полимерные липидные мембраны: получение, свойства и использование // Биологические мембраны.-1993 .-т. 10, №3 .-с.229-251.

3. Флавоновые гликозиды. Методы выделения, очистки, разделения и анализа: Методическая разработка/ ЛХФИ (Сост. Минина С.А., Шимолина Л.Л.).- Л.: Изд-во ЛХФИ, 1991. -28 с.

4. Георгиевский В.П. и др. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений / Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И., Казаков А.Л. Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского университета, 1988.- 144 с.

5. Русанов А.И. Мицелообразование в растворах поверхностно-активных веществ. Санкт-Петербург.: Химия, 1992.

6. Щипунов Ю.А. Самоорганизующиеся структуры лецитина // Усп. хим. 1997. Т.66. №4. С. 328-352.

7. Small D.M. Handbook of lipid research. Physical chemistry of lipids: from alkanes to phospholipids. N. Y.: Plenum, 1986.-308 p.

8. Ter-Minassian-Saraga L. Hydration in two-dimensional systems. Fourth international conference on surface and colloid science, Jerusalem, 5-10 July, 1981 //Pure. And Appl. Chem. 1981. Vol. 53. №11. P. 2149-2166.

9. Hauser H. In water: A comprehensive treatise. / Ed. F. Franks. N.Y.: Plenum, 1975. Vol. 4. P. 209.

10. Общая органическая химия в 12-ти т..- М.: Химия, 1985. Т.9: Кислородсодержащие и серу содержащие и другие гетероциклы. -798 с.

11. Кемертелидзе Э.П., Георгиевский В.П. Физико-химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения.-Тбилиси.: Мецниерева, 1976. -222 с.

12. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. -М.: Высш. школа, 1974. -213 с.

13. Барсуков Л.И. Липосомы.//Соросовский образовательный журнал.-1998. №10. С.2-9.

14. Макашева И.Е., Головкина М.Т. Взаимодействие кверцетина с ионами меди (II) в водно-спиртовых растворах // ЖОХ. 1973. Т. XLIII. Вып. 7. С. 1640-1645.

15. Brown J.Е., Khodr Н., Hider R.C., Rice-Evans С.A. Structural dependence2+of flavonoid interactions with Cu ions: implications for their antioxidant properties // Biochem. J. 1998. Vol. 330. P. 1173-1178.

16. Balogh-Hergovich E., Kaizer J., Speier G. Kinetics and mechanism of the Cu (I) and Си (II) flavonolate-catalyzed oxygenation of flavonol. Functional quercetin 2,3-dioxygenase models // J. Molecular Catalysis A: Chemical. 2000. Vol. 159. P. 215-224.

17. Беликов В.В., Точкова Т.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов // Фенольные соединения и их физиологические свойства: Мат-лы I Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям, 1966 г.-Алма-Ата: Наука, 1973.-С. 168-172.

18. Оганесян Э.Т., Гущин И.С., Першков С.Р., Сараф А.С. Исследование связи структура активность производных флавона, обладающих антиаллергической активностью // Хим.-фарм. журн. 1989. №10. С. 1238-1241.

19. Chu S.C., Hsieh Y.S., Lin J.Y. Inhibitory effects of flavonoids on Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase activit.// J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55. №2. P.179-183.

20. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.М., Сумм Б.Д, Поверхностны явления в белковых системах.М.:Химия, 1988.-239 с.

21. Измайлова В.П., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах.М.: Наука, 1974.-268с.

22. P.Bahadur Block copolymers Their microdomain formation (in solid state) and surfactant behaviour (in solution) // Current Sci. Vol.80, N.8, 25 April 2001.

23. J-F.Nierengarten, J-F Eckert, Y.Rio // J.Am.Chem.Soc. 2001, 123, 97439748.

24. Арсланов В.В. Полимерные слои и пленки Ленгмюра-Блоджетт. Влияние химической структуры полимера и внешних условий на формирование и свойства организованных планарных ансамблей.// Успехи химии. 1994. -т.63, №1. -с.3-38.

25. De Gennes P.G. Scaling Concepts in Polymer Physics. Cornell Univ. Press, New York, 1979.

26. Singer S.J.//J.Chem. Phys., 1948. V.16. P.872.

27. Frisch H.L., Simha R. //J.Chem. Phys., 1957. V.27. P.702.

28. Crisp.D.J. Surface Phenomena in Chemistry and Biology. Pergamon Press, London, 1958.

29. Frysinger G.S., Barnoski A.A., Gaines G.L., Korenovvski G.M. Molecular Arrangement of a Poly (acrylonitdilr-co-4-vinilpyridine) Monolyer on Water // Langmuir, 1994. V.10, №7. P.2277-2280.

30. Goedel W.A., Ouali L., Schadler V., Peyratout C. Laterally Structured Monolayers of a "Polymer Brush". // 2nd International Workshop on Wetting and Self-Organization in Thin Liquid Films. Munich. Germany. - 1998. -Poster №26.

31. А.Адамсон. Физическая химия поверхностей. М.:Мир. 1979.

32. Aveyard R., Binks B.P., Carr N., Cross A.W. // Thin Solid Films, 1990. V.188. P.361.

33. Retting W., Kuschel F. //J.Colloid Interface Sci., 1990. V.140. P. 169.

34. Harkins W.D. The Physical of the Surface Films, Reinoholld, New York, 1952.

35. Goedel W.A., Heger R. Monolayers of a "Polymer Brush". // 2nd International Workshop on Wetting and Self-Organization in Thin Liquid Films. Munich. Germany. - 1998. - Poster №28.

36. In Vitro Methods in Cell Mediated Immunity / Eds Bloom B.R., Glade P.R.N.Y.: Acad. Press, 1971. P.242-243.

37. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J.Biol. Chem., 1951. V.193.№1.

38. Спирин A.C.//Биохимия. 1958. T.23. №4. C.658-662.

39. Чупин B.B., Аникин A.B., Серебренников Г.А. Полимерные липидные мембраны: получение, свойства и использование // Биологические мембраны. Т. 10. - №3. - 1993. С.229-251.

40. J.L.Gardon, Encyclopedia of Polymer Science and Technology (Mark, Gaylord, and Bikales; cds). Interscience, York, 1965. - V.3., P.883.

41. Rukenstein E., Lee S.H. Free interfase energy as criterion of biocompatibility // J.Colloid and Interfase Sci. 1987. V.120. №1. P. 153161.

42. Арсланов B.B. Полимерные монослои и пленки Ленгюра-Блоджетт. Политиофены // Успехи химии. 2000. - Т.69. - №10. - С.963-980.

43. Каргин В.А., Малинский Ю.М., Медведев С.С. Исследование мономолекулярных пленок полиакрилатов // Докл.АН СССР. 1954. -Т.96. - С.307-309.

44. Nakahara Т., Motomura К., Matuura R. Phase transition in poly-n-alkyl methacrylate monolayers 11 Bull.Chem.Soc.Jpn. 1967. - Vol.40. - P.495-501.

45. Elbert R., Laschewsky A., Ringsdorf H. Hidrofilic spacer groups in polymerizable lipid: formation of biomembrane models from bulk polymerized Lipids // J.Am.Chem.Soc. 1985. - Vol.107. - P.4134-4139.

46. Ringsdorf H., Schmidt G., Schneider J. Oriented ultrathin membranes from monomeric and polymeric amphiphiles: monolayers, liposomes and multilayers // Thin Solid Films. 1987. Vol. 152. - P.207-211.

47. Егоров B.B., Зайцев A.A., Клямкин A.A., Зубов В.П. Рфдикальная полимеризация катионных поверхностно активных мономеров в монослоях на границе вода азот // Высокомолек.сонд., Сер.А. - 1990. - Т.32. - №5. - С.949-954.

48. Кенигсберг Т.П., Арико Н.К., Агабеков В.Е. Свойства мономолекулярного слоя полимер галоген // ЖФХ. - 1996. - Т.70. -№7.-С. 1266-1270.

49. Кенигсберг Т.П., Арико Н.К., Агабеков В.Е. Адсорбция на мономолекулярных слоях поливинилстеарата // ЖФХ. 1996. -Т.71. -№7. - С.324-329.

50. Oguchi К., Yoden Т. Langmuir-Blodgett films of poly(vinyl alcohol)s Thin Solid Films. 1988. - Vol.161. - P.305-309.

51. Teerenstra M.N., Vorencamp E.J., Schouten A.J., Notle R.J. Langmuire-Blodgett mono- and multilayeres of poly(isocyanide)s with diferent side Chains // Thin Solid Films. 1991. - Vol. 196. - P. 153 - 160.

52. Nishikata Y., Kakimoto M., Morikawa A., Imai Y. Preparation and characterization of poly(amide-imide) multilayers films // Thin Solid Film. -1988.- VoU60.-P.15-22.

53. Nakahara H., Nakayama J., Hoshino M., Fukuda K. Langmuir-Blodgett films of oligo and polythiophenes with well-defined structure // Thin Solid Films. - 1988. - Vol. 160. - P.87-93.

54. Bubeck С. Reactions in monolayers and Langmuir-Blodgett films // Thin Solid Films. 1988.-Vol.160. - P.l-22.

55. Fukuda K.,Shibasaki Y., Nakahara H. Polymerizabilities of amphiphilic monomers with controlled arrangements in Langmuir-Blodgett films // Thin Solid Films. 1988. - Vol.160. - P. 43-59.

56. Pethica B.A. Experimental criterial for monolayers studies in relation to the formation of Langmuir-Blodgrtt multilayers // Thin Solid Films. 1987. -Vol.152.-P.3-8.

57. Блинов JI.M. «Ленгмюровские пленки» // Успехи физических наук. — 1988. Т. 155. - С.443-480.

58. Roberts G.G. An applied science of Langmuir-Blodgett films // Advances in Physics. 1985. - Vol.34. - №4. - P.475-512.

59. Гордон А., Форд P. Спутник химика. M.: Химия. 1976. - 541с.

60. Вайсбергер А., Проскауэр Е. Органические растворители. Физические свойства и методы очистки. М.: Химия. 1958. - 518с.

61. Кирш Ю.Э., Карапутадзе Т.М., Шумский В.И. Повышение качества N-винилпирролидона // Физико-фармацевтический журнал. 1980. Т. 14. №1. С. 78-80.

62. Лабораторная техника органической химии / под ред. Кейна Б. (пер. с чешского). М.: Мир. 1966. - 751с.

63. Справочник по химии полимеров / под ред. Липатова Ю.С. и др. Киев: Наукова Думка. 1971. - 535с.

64. Свойства органических соединений. Справочник под ред. Потехина А.А.-Л.: Химия. 1984.517с.

65. Крешков А.П., Быкова Л.Н., Казерян Н.А. Титрование органических и органических соединений в неводных растворах. М.: Высшая школа. 1965.200 с.

66. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. Практическое руководство по биохимии растений. М.: Советская наука, 1951.-388с.

67. Bork J.F. Coleman L.E. "Nitrogen-containing monomers. II. Reactivity ration of N-vinyoxazolidone and N-vinilpyrrolidone with vinyl monomers" // J.Polym.Sci. 1960. - V.28. - P.413-412.

68. Шатенштейн А.И., Вырский Ю.П., Правикова H.A. и др. Практическое руководство по определению молекулярных весов и молекулярно-массового распределения полимеров. М. - Л.: Химия, 1964.-188с.

69. Цянь Ж.Ю. Определение молекулярных весов полимеров: пер. с англ. М.: Иностр. Литература, 1962-236с.

70. Орлова Г.Л., Краснопольский Ю.М., Гольбец И.И. и др. // Химия и технология органических производств. Межвуз. сб. М.: МИХМ. 1979. Т.9, №3. с.86-91.

71. Швец В.И., сенников Г.А., Гольбец И.И. и др. // Фармацевтический журнал. 1977. №4. С.79-81.

72. F.C.Szoka, D.Papahadjopoulos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194 (1978).

73. A.Darszon, C.A.Vanderberg, M.H.Ellisman, M.Montal, J.Cell Biol., 81, 446(1979).

74. D.D.Lasic. J.Colloid Interface Sci., 124, 428 (1988).

75. D.D.Lasic, A.Belic, T.Valentincic. J.Am.Chem. Soc., 110, 970 (1988).

76. Абрамзон A.A., Бочаров В.В., Гаевой Г.М. и др. Поверхностноактивные вещества: Справочник // Под ред. Абрамзона А.А., Гаевого Г.Ь. Л.: Химия, 1979. - 376 с.

77. Ю.А.Ермаков. Равновесие ионов вблизи липидных мембран: электрический анализ простейшей модели. Коллоидный журнал, 2000, том 62, №4, с.437-449.

78. Gruen D.W.R., Marcelja S., Parsegian V. Cell Surface Dynamics / Eds Perelson A.S. et al. New York, Basel: Marcel Dekker, 1984, P. 59-91.

79. Good R.J. Solids: Contact Angles and the Surface Free Energy of Solids. -Book, N.Y., 1978, p.p. 1-28.

80. Some highlights in the field of polymer drag reduction. Hoyt Jack W. "Drag Reduct. 3rd Int. Conf., Bristol. 2-5 July, 1984." Bristol, 1984, I. 1-1/1. 1-8 (англ.).

81. Direct evidence that drag reduction is an effect of the elongation of the polymer molecules. Gyr Albert. "Drag Reduct. 3rd Int. Conf., Bristol. 2-5 July, 1984". Bristol, 1984, В 10/1-B 10/7.

82. Кирш Ю.Э., Батракова M.B., Галаев И.Ю., Аксенов А.И., Карапутадзе Т.М. // Особенности ионизационного равновесия аминогрупп в макромолекулах сополимеров N-виниламидов с аллиламином и виниламином в водном растворе. ВМС. Том (А). 1988. №2. с.365-368.

83. Б.Д.Сумм. Структура поверхностного слоя жидкости (гипотеза «сетки»). Российских химический журнал. 1994, т.38. №6, стр. 19-23.

84. А.П. Каплун, JTe Банг Шон, Ю.М. Краснопольский*, В.И. Швец Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии, №1, 1999.

85. Klibanov A.L., Maruyama К., Torchilin V.V., Huang L. (1990) FEBS Letters., 268, 235-237.

86. Отдельноеа M.B., Захарова Ю.А., Ивлева E.M., Касаикин В.А., Зезнн А.Б., Кабанов В.А. I/ Высокомолек. соед. А. 2003. Т. 45. № 9. С. 1524

87. Сумм Б.Д., Должикова В.Д. и др.//Вестник московского университета, сер. 2, т.29, № 4, стр 398-404, 1988

88. Бабак В.Г. Коллоидная химия в технологии микрокапсулирования. Свердловск, Изд. Урал, ун-та, 172 е., 1991.

89. Выражаю глубокую благодарность за неоценимый вклад в мою профессиональную подготовку и помощь при работе и написании диссертации научным руководителям д.х.н., профессору Юрию Денисовичу Семчикову д.х.н., профессору Нине Борисовне Мельниковой