Взаимодействие водорастворимых полимеров с липидными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИМЕРОВ С ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ

02 00 06 - высокомолекулярные соединения по химическим наукам

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА - 2007

003071625

Работа выполнена в лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Паписов Иван Михайлович

доктор химических наук, профессор Зайцев Сергей Юрьевич

доктор химических наук Еремеев Николай Леонидович

Ведущая организация Институт проблем химической физики

Российской академии наук (г Черноголовка)

Защита состоится 30 мая 2007 г в 'у часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 60 по химическим наукам при Московском государственном университете им M В Ломоносова по адресу 119992, г Москва, Ленинские Горы, МГУ им M В Ломоносова, д1, стр 3, Химический факультет, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Автореферат разослан апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, к х н

Долгова А А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В последнее десятилетие наука о полимерах претерпевает бурное развитие, связанное с появлением новых методов контролируемой полимеризации В частности, развитие таких методов, как ионная полимеризация, радикальная полимеризация с переносом атома или полимеризация в условиях обратимой передачи цепи позволяют синтезировать макромолекулы с заранее заданной молекулярной архитектурой, степенью полимеризации и характеризующиеся узким молекулярно-массовым распределением Количество работ, посвященных синтезу новых полимерных материалов с необычными свойствами, растет по экспоненциальному закону При этом многие из вновь синтезированных полимеров растворимы в воде и могли бы с успехом использоваться в разработке новых лекарственных средств Однако широкое использование новых полимерных конструкций в биомедицинских исследованиях тормозится недостаточным пониманием физико-химических аспектов взаимодействия синтетических полимеров с липидными мембранами и мембранами клеток Известно, что в ряде случаев встраивание полимерных макромолекул в липидный бислой или их адсорбция на поверхности мембраны могут вызывать существенные изменения в ее структуре Эти изменения могут приводить к изменению различных свойств биологической мембраны, таких как ее проницаемость, микровязкость или скорость миграции липидных молекул Эти явления приводят, как правило, к значительным изменениям состояния клетки, вызывая активацию или ингибирование ферментов, влияя на клеточный гомеостаз и даже экспрессию генов В то же время физико-химические предпосылки влияния полимеров на свойства мембран остаются неисследованными Остается неизученной взаимосвязь между строением полимера и его способностью влиять на свойства бислоя Неизвестно также как влияет липидный состав биологической мембраны на ее способность взаимодействовать с полимерными молекулами

Цель работы состояла в выявлении общих закономерностей, определяющих способность водорастворимых полимеров взаимодействовать с липидными мембранами, влиять на их барьерные свойства и изменять подвижность мембранных компонентов Среди разнообразия водорастворимых полимеров и сополимеров было выделено 3 важнейших группы полимеров, способных взаимодействовать с биологическими мембранами электронейтральные амфифильные полимеры, поликатионы и полианионы Необходимо было получить количественные характеристики их связывания с мембранами, локализации в пределах липидного бислоя и способности влиять на подвижность его компонентов Проницаемость биологических мембран является их важнейшей характеристикой, поэтому одна из наиболее существенных задач настоящей работы состояла в исследовании воздействия полимеров на проникновение лекарственных соединений через модельные липидные мембраны Наконец, достижение

главной цели работы потребовало выявления взаимосвязи между структурой водорастворимых полимеров и их способностью вызывать изменение свойств липидных мембран

Научная новизна В работе впервые количественно охарактеризовано связывание амфифильных сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (плюроников или проксанолов) с липидными мембранами и клетками, причем продемонстрировано, что их сродство к липидным мембранам значительно меньше, чем у ПАВ, содержащих углеводородные радикалы Впервые с помощью малоуглового нейтронного рассеяния изучено влияние плюроников на толщину липидных мембран и получены оценки размеров полимерного клубка, встроенного в липидный бислой Впервые обнаружена способность амфифильных сополимеров изменять микровязкость биологических мембран, ускорять трансбислойную миграцию липидов и мембранный транспорт противоопухолевого антибиотика доксорубицина установлено, что воздействие сополимеров на свойства мембран увеличивается с ростом их общей гидрофобности, а для сополимеров с близкой гидрофобностью -растет с объемом гидрофобного блока Впервые показано, что связывание амфифильных сополимеров с биологическими и липидными мембранами уменьшается с ростом микровязкости бислоя, которая определяется его липидным составом Установлено, что взаимодействие поликатионов с противоположно заряженными липидными мембранами приводит к увеличению их проницаемости по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину Способность поликатионов ускорять транспорт лекарства через мембраны увеличивается с ростом его молекулярной массы и, в еще большей степени, с повышением плотности заряда на полимере Впервые показано, что полиэлектролитные комплексы, образованные доксорубицином с полианионами, могут взаимодействовать с липидными мембранами, образуя тройные комплексы «полимер-лекарство-мембрана» Дальнейшая эволюция структуры этого комплекса зависит от свойств конкретной системы и в некоторых случаях может приводить к частичной диссоциации комплекса и проникновению высвободившегося лекарства через мембрану

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют большое значение для понимания молекулярного механизма взаимодействия полимеров с клеточными мембранами Обнаруженные в работе закономерности были использованы в разработке способа повышения эффективности действия фотосенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии [Иванов А В и др «Способ повышения эффективности тетрапиррольных фотосенсибилизаторов для лечения патологических изменений кожи методом фотодинамической терапии » // Заявка на патент РФ № 2006120475 от 13 06 2006]

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения

ключевых экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 15 отечественных и международных научных конференциях, в том числе, на Симпозиуме по дисперсным системам в Москве в 1999 г, на II симпозиуме биофизиков России в 1999 г, на Бунзеновском семинаре «Взаимодействие биополимеров с модельными мембранами» в г Галле (Германия) в 1999 г, на Конференции по Полимерным Материалам - 2000 в г Галле (Германия), на Российско-Германском семинаре в Дубне в 2001 г, на Российско-Украинском Симпозиуме по высокомолекулярным соединениям в Донецке в 2001 г, на Европейском Полимерном Конгрессе в Стокгольме в 2003 г, на (II Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2004», на 4 международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» в Санкт-Петербурге в 2005 г, на 49 международном биофизическом конгрессе в США в 2005 г, на XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» Марий-Эл в 2005, на 5 международном симпозиуме «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» в Санкт-Петербурге в 2005 г, на 30 Съезде Европейских Биохимических обществ в Будапеште в 2005 г и на 5 международном биофизическом конгрессе в Монпелье (Франция) в 2005 г

Публикации Автор имеет более 90 научных публикаций, из которых 54 -по теме диссертации, включая 30 оригинальных статей, 2 обзорные статьи и 22 тезисов докладов на российских и международных конференциях

Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задач, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 595 ссылок Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, содержит 117 рисунков и 12 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Взаимодействие нейтральных амфифильных полимеров с липидными мембранами 1 1 Связывание блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида с

биологическими и модельными мембранами Среди огромного разнообразия амфифильных сополимеров, синтезируемых в настоящее время в промышленных масштабах, наиболее широко известны блок-сополимеры на основе полиалкиленоксидов -этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) Из приведенного в работе обзора литературы следует, что эти сополимеры (плюроники или проксанолы) обладают относительно низкой токсичностью и вызывают разнообразные эффекты в биологических системах Это открывает широкие перспективы их использования в медицине и фармакологии Поэтому исследование способности этих сополимеров взаимодействовать с биологическими мембранами представляет большой интерес

Наиболее прямой способ определения количества связанного с мембранами полимера состоит в отделении образовавшегося комплекса от свободного полимера и определении содержания обоих компонентов в полученном образце Для определения параметров связывания полиалкиленоксидов с мембранами мы синтезировали препараты, меченные атомами трития, что позволило измерять количество связанного полимера по его радиоактивности Введение атомов трития путем бомбардирования образца полимера атомами 3Н в тонком слое проводилось к х н , доцентом ГА Бадуном ( кафедра радиохимии Химического факультета МГУ) Полученный препарат очищали от легко обмениваемого трития и продуктов радиолиза с помощью хроматографии в этаноле на сефадексе LH-20

Для того, чтобы исследовать влияние структуры полимеров на их способность связываться с клетками различных типов мы определили связывание с клетками пяти амфифильных сополимеров, содержащих полипропиленоксид (ППО) в составе гидрофобных блоков, но различающихся по своему блочному строению и природе гидрофильного блока ( рис 1) Плюроники L61 и Р85, имеющие трехблочное строение, различались по соотношению гидрофобных и гидрофильных блоков в макромолекуле Сополимер REP, характеризующийся соотношением ЭО/ПО близким к ллюронику Р85, имел двублочное строение Сополимеры ППО и глицерина имели также двублочное строение, но при этом отличались от плюроников разветвленностью гидрофильной части

Н0-(СН2-СН20)п-(СН-СН2ЧЭ)т-(СН2-СН2-0)„-Н но- (СН- СН2-0)24- (СН2- сн2- 0)19 -сн3 СН3 СПj

плюроники L61 п=2 т=30 Дву6лочный СОПОЛимер REP

Р85 п=26, 1X1=40

но нЧ_он

но-/1 ) Двублочные сополимеры

а) х~°он полиалкиленоксидов и

н,с^¿нсн2о\(сн2с,ьсU^6 сверхразветвлённого глицерина,

" 4 Тч^о^он содержащие 2 (ПГ2) и 30 (ПГЗО) 9 звеньев глицерина

но

Рис.1 Структуры амфифильных сополимеров, связывание которых с клетками человека и мыши было исследовано в настоящей работе

Связывание полимеров с клетками Чтобы исследовать способность сополимеров взаимодействовать с клетками разных типов мы использовали нормальные клетки (эритроциты и лимфоциты человека, а также мышиные спленоциты) и опухолевые клетки (клетки мышиной миеломы линии ЗР2/0, человеческой эритролейкемии К 562 и карциномы молочной железы МСР7) Известно, что плюроники способны повышать чувствительность1 раковых

клеток, устойчивых к химиотерапии ( клетки, проявляющие множественную лекарственную устойчивость, МЛУ-клетки) к действию лекарств Поэтому в настоящей работе были также исследованы три клеточные линии, обладающие МЛУ-фенотипом, а именно клетки сублинии К 562/4, любезно предоставленные проф А Н Саприным ( Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии МЗ России), и клетки сублиний К562/1-39 и МСР7/Я, полученные от проф А А Штиля ( Российский Онкологический Научный Центр РАМН)

Кинетика взаимодействия полимеров с клетками при 4 °С описывается моноэкспоненциальной кривой с выходом на насыщение в течение двух часов При 37°С кинетика описывается биэкспоненциальной кривой, те вначале происходит быстрое связывание полимеров с клеточной поверхностью, а затем, по-видимому, происходит более медленный эндоцитозный захват адсорбированных молекул

Изотермы связывания всех сополимеров с клетками различных типов имеют вид линейных зависимостей, причем предела связывания полимера с клетками в исследованном нами концентрационном интервале не наблюдается (рис 2) Это указывает на то, что связывание плюроников с клетками характеризуется низкой константой связывания при очень большом количестве связывающих центров При 37°С изотермы имеют аналогичный вид

05 10 15 [Р1]0, мкМ

Рис 2 Изотермы связывания 3Н-плюроников Р85 (А) и 1.61 (Б) с клетками 1 миелома ЭР2/0, 2 спленоциты мыши, 3 лимфоциты человека, 4 эритроциты человека, (4°С, среда йМЕМ, 2 ч инкубации)

Определение равновесных констант связывания плюроников с клетками практически невозможно вследствие изменчивости самих клеток, низкого сродства и большого количества связывающих центров Поэтому для количественной характеристики связывания мы использовали тангенс угла наклона полученных зависимостей, нормированный на количество клеток в образце Эту характеристику в дальнейшем мы будем называть удельной

эффективностью связывания \ь, которая определяется как доля полимера связанного с клетками, нормированная на количество клеток

с = [Р1]"' > т

где [Р1]0 - концентрация внесенного в пробу полимера, [Р1]СВяз- концентрация связанного полимера, а Мкл - количество клеток в образце Данные по удельной эффективности связывания для всех изученных клеток и полимеров представлены в табл 1 Оказалось, что эта величина, имеет порядок 10 3, т е 1 миллион клеток связывает не более нескольких десятых процента от внесенного в клеточную среду полимера 1

Табл 1 Удельная эффективность связывания амфифильных полимеров с клетками (1000х£ь, миллионы клеток1)

Клетки Р85 L61 REP ПГ2 ПГЗО

4°С | 37°С 4°С | 37°С 4°С | 37°С 37°С 37°С

Первичные культуры клеток

Лимфоциты 015 + 001 0 20+0 03 042 + 002 0 50 ± 0 04 0 85±0 06 -

Эритроциты 0 067 + 0 003 0 062 ±0 01 0 11 ± 0 02 0 11 ±0 01 - - -

Спленоциты 046 ±0 02 047 + 0 02 0 43 ±0 01 0 59 ± 0 04 - -

Линии опухолевых клеток

SP2/0 0 32 ± 0 02 0 62 ± 0 03 058 + 003 1 21 ±0 8 - -

К562 - - 3 2±0 6 615±0 37

K562/IS9 - -- 3 4±0 6 7 1+0 5

К562/4 2 0±0 1 - 6 8±06 14 2±0 8 2 4+0 1

MCF7 - - - 1 52±0 14 6 05+04

MCF7/R - - - 2 71±0 14 8 80+03

Гидрофобность полимера во многом определяет его способность взаимодействовать с клетками Так, более гидрофобный плюроник L61 связывается почти со всеми клетками приблизительно вдвое эффективнее плюроника Р85 Сополимеры на основе полиглицерина также подчинялись этой закономерности более гидрофобный сополимер ПГ2 связывался с клетками К562/4 почти в 6 раз более эффективно, чем сополимер ПГЗО

Блочное строение сополимеров также влияет на их сродство к клеткам двублочный сополимер REP, по своей валовой гидрофобности ¡близкий к плюронику Р85, связывался с лимфоцитами почти вчетверо более эффективно, чем плюроник Р85, и в 1 7 раз сильнее, чем более гидрофобный плюроник L61 Аналогично, двублочный сополимер ПГ2, по своей гидрофобности близкий к плюронику L61, связывался с клетками К562/4 в 2 раза эффективнее, чем трехблочный плюроник L61

Природа клеток Удельная эффективность связывания плюроников с эритроцитами человека в несколько раз меньше эффективности связывания с клетками других типов Яркие отличия наблюдались также и при сопоставлении эффективности связывания сополимеров с нормальными и опухолевыми клетками Амфифильные сополимеры взаимодействовали с опухолевыми клетками при 37°С существенно эффективнее, чем с

нормальными Эти различия достигают 2-3 раз для клеток мышиной миеломы SP2/0 и увеличиваются почти до 10 раз для клеток К562 и MCF7 Приобретение МЛУ-фенотипа увеличивает эффективность связывания полимеров в 1 5 раза (ср MCF7 и MCF7/R)

Повышенное связывание плюроников с клетками при 37°С может объясняться либо увеличением скорости их эндоцитозного захвата, либо может быть связано с усилением их взаимодействия с клеточными мембранами при физиологической температуре Для выявления вклада эндоцитоза в температурную зависимость связывания полимеров с клетками мы изучили взаимодействие плюроника Р85 с мембранами микросом печени мыши, в которых процессы эндоцитоза отсутствуют, а средний состав мембраны соответствует составу мембран живых клеток

Связывание полимеров с микросомальными мембранами Микросомальные мембраны выделяли из печени мышей BALB/c путем фракционного центрифугирования Полученный препарат представлял собой везикулы размером 300-600 нм, содержащие фрагменты плазматической мембраны, эндоплазматического ретикулума и митохондрий В отличие от клеток, взаимодействие полимеров с микросомами не осложнено процессами эндоцитоза, поэтому сравнение связывания при 4°С и 37°С позволяет оценить, влияет ли температура на связывание полимеров с мембранами Оказалось, что связывание плюроника Р85 с микросомами не зависит от температуры Из этого следует, что повышенное связывание полимеров с опухолевыми клетками при 37°С объясняется большей интенсивностью эндоцитоза в этих клетках

Методом конкурентного радиолигандного анализа было показано отсутствие специфических рецепторов на микросомах, связывающих плюроник Р85 Это показывает, что связывание полимера с биологическими мембранами обусловлено неспецифическим взаимодействием с гидрофобной областью биологической мембраны Поэтому на следующем этапе мы определили коэффициент распределения плюроника между водой и мембраной искусственных липидных везикул - липосом

Взаимодействие плюроников с липосомами исследовали метом равновесного диализа Низкомолекулярные плюроники (например, L61, MW 1890), способны свободно проходить через поры диализной мембраны, непроницаемой для липосом (размер 100 нм) После установления равновесия в системе содержание [3Н]-меченого плюроника L61 определяли в обоих отсеках диализной ячейки Варьируя концентрацию липосом при фиксированной концентрации плюроника, мы получили гиперболическую зависимость количества связанного с мембранами полимера от концентрации липосом (рис 3) Коэффициент распределения плюроника L61 между водной и липидной фазами, составил 45±7 Эта величина почти на 2 порядка меньше коэффициентов распределения большинства ПАВ между водой и липидными мембранами Полученные данные позволили рассчитать средний состав «комплекса» плюроника с липосомами Оказалось, что при концентрации

-10- I

липосом 1 мг/мл и концентрации плюроника 20 мкМ (4 10"3%) с одной липосомой связывается в среднем около 20 молекул плюроника 1

А

Рис 3. Зависимость концентрации плюроника L61, связанного с липосомами из яичного лецитина, от концентрации липосом Концентрация плюроника [L61]0=7 1 мкМ (1 4 10"3%), Буфер — i 10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCI, рН 7 4, 30°С !

Интересно, что определенный аналогичным методом коэффициент распределения двублочного сополимера REP оказался выше и составил 78±17 Поскольку REP гидрофильнее плюроника L61, более высокое его сродство к липидной мембране нельзя объяснить различиями в составе сополимеров Можно предположить, что эти различия определяются расположением блоков в макромолекулах сополимеров

Тем не менее, оба сополимера ЭО и ПО характеризовались коэффициентами распределения на 1-2 порядка меньшими, чем коэффициенты распределения амфифилов, содержащих углеводородные остатки в гидрофобной части Так, известное из литературы значение КР Тритона Х-100 составляет 3900, а для ПАВ ряда Brij - варьирует в пределах 500 - 15000 Таким образом, наши результаты показывают, что сополимеры, гидрофобные фрагменты которых сформированы | блоками полипропиленоксида, обладают значительно более низким сродством к липидным мембранам, чем сополимеры, содержащие углеводородные радикалы

I

1 2 Изучение локализации полиалкиленоксидов в бислойных мембранах методом малоуглового рассеяния нейтронов

Для установления механизма взаимодействия полимеров с мембранами необходимы данные об их локализации в пределах бислоя Эту информацию мы получили в экспериментах, проведенных методом малоуглового рассеяния нейтронов в лаборатории физики нейтронов им ИМ1 Франка в Объединенном Институте Ядерных Исследований в Дубне на импульсном реакторе ИБР-2 с использованием спектрометра ЮМО Измерения проводили канд ф -мат наук А X Исламов и А И Кукпин под руководством канд ф -мат наук А И Горделия

8-

\ 6

- 4-

РЗ

о:

ш «

о 2

0 00 0 05 0 10

С , г/мл

липил

о

0

1 ш

S

0

1 0) S

н-

I

0 01

1Е-4

0 01

Q, А

0 1

Рис. 4. Спектр нейтронного рассеяния раствора

плюроника [_61 (12 5 мг/мл)

(1), суспензии липосом из яичного лецитина (10 мг/мл)

(2) и смеси липосом (10 мг/мл) и плюроника 1.61 (10 мг/мл) (3)

Рисунок 4 показывает зависимость интенсивности рассеяния нейтронов от величины волнового вектора для суспензии липосом из яичного лецитина (1) и раствора плюроника (2) Видно, что в отсутствие липосом раствор плюроника характеризуется очень низкой интенсивностью рассеяния, хотя плотность рассеяния плюроника и липида, определяемая содержанием в молекуле различных атомов, одинакова

Рассеяние на чистых лецитиновых липосомах характеризовалось кривой типичной для рассеяния на везикулах Известно, что такой спектр может быть аппроксимирован приближенной функцией Кратки-Порода

У„ехр(-^)

I(Q) =:

(2)

где 10 - интенсивность рассеяния при нулевом угле, Q - волновой вектор рассеяния, а R - радиус гирации, связанный с толщиной мембраны dm соотношением

dm = äV12 , (3)

что дает возможность определять толщину липосомальной мембраны по наклону прямых в координатах ln(IQ2)-Q2 Квадрат радиуса гирации лецитиновых везикул оказался равен R2=124 4±6 5 А2, а везикул из синтетического липида димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) - 95 2+5 1 А2 что соответствует толщине мембраны везикул 38 0+1А и 33 8±1 А, соответственно

Добавление плюроника к липосомам несколько изменяло спектр рассеяния, увеличивая интенсивность при малых значениях Q (рис 4, кривая 3) Этот результат не может быть объяснен появлением в растворе мицелл, поскольку при концентрациях менее 1% интенсивность рассеяния раствором плюроника почти на 3 порядка меньше рассеяния суспензией везикул

34

Е тз

32 30 28 26

ООО 0 05 0 10 0 15 Мольная доля плюроника в мембране, X

PI

0 00 0 05 0 10 0 15 Мольная доля плюроника

в мембране, Хр| j

Рис 5 Зависимость средней толщины бислоя малых моноламеллярных везикул, построенных из яичного лецитина ( { А) и димиристоилфосфатидилхолина ( Б) от мольной доли плюроника L61, связанного с липосомами Кривые построены путем аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнению (6) |

Таким образом, полученный результат указывает на изменение^ структуры бислоя под действием плюроника Обработка спектров рассеяния везикул в присутствии плюроника в координатах Кратки-Порода показала, что по мере повышения концентрации полимера в растворе толщина бислоя заметно уменьшается (рис 5) Добавление плюроника в концентрации 1 % (масс) к липосомам из природного лецитина (рис 5А) и синтетического ДМФХ (рис 5Б) приводило к уменьшению средней толщины мембраны почти на 6 I

Встраивание полимера в мембрану, сопровождающееся снижением ее средней толщины, может быть описано двумя альтернативными моделями, показанными на рис 6 Согласно первой модели, полимерные клубки могут встраиваться в бислой в виде отдельных включений ( рис 6A)J а вторая модель предполагает перемешивание полимерной цепи с липидными молекулами с образованием полимерно-липидных структур (рис 6Б)

А

Я°!Wfi

! h ! )!> п I 1

ЪШоЯ(01с

ООО0

Рис 6 Модели встраивания полимера в мембрану предполагающая несмешиваемость полимера и липидов Б полимерной цепи с липидами и взаимопроникновение остатков молекул липида из противоположных монослоев

модель, перемешивание жирнокислотных

-13В первом случае (рис 6А) площадь, занимаемая полимером в мембране, должна быть равна или меньше размеров невозмущенного полимерного клубка, т е должна соответствовать раствору полимера в 0-условиях или в плохом растворителе В случае реализации второй модели (рис 6Б), площадь, занимаемая полимером в мембране, должна превышать размеры невозмущенного клубка, рассчитываемые по модели свободно-сочлененной цепи, которая для плюроника L61 дает величину 27 5 А

Для того, чтобы попытаться оценить размеры полимерного клубка в мембране мы представили объем мембраны как сумму объемов, занимаемых плюроником и липидом

У. = У,, + У,^»пУГ1+п1У1 , (4)

где пР| и nL - количество молекул плюроника и липида в везикуле, a VPL° и VL° - объемы, занимаемые плюроником и липидом, соответственно Тогда толщину мембраны можно выразить как отношение объема мембраны к ее площади (5) Далее, выражая объем, занимаемый каждым из компонентов, через его поперечный размер (DP! и DLl соответственно для плюроника и липида) и площадь, занимаемую им в плоскости мембраны, SPL° и SL°, соответственно, получаем

j = V"' = n"v» = l1nDnsn

Тогда, разделив числитель и знаменатель на сумму количества молекул плюроника и липида в липосоме, переходим к выражению в мольных долях плюроника, хР|, в составе мембраны (6)

d = х11риУ;1Л-(\-\11)Р,К; ^

+(!-*„)•<>;•

В этом выражении DL=38 А для яичного лецитина и 34 А - для ДМФХ, a SL° = 70 А2 - для лецитина и 62 А2 - для ДМФХ Это выражение мы использовали для оценки размеров полимерной молекулы в мембране Кривые на рис 5 обрабатывали с помощью нелинейного метода наименьших квадратов, находя из каждой кривой SP|° и DPI Оказалось, что размеры полимерного клубка составляют SP|°=262±112A2 и DP!=22±12A - для плюроника в лецитиновой мембране, и SP|°=322±212A2 и DPt=17±7A - для плюроника в мембране ДМФХ Несмотря на очень большие разбросы, по всей видимости, определяемые неизбежными аппаратурными погрешностями при измерении малоуглового рассеяния нейтронов, видно, что диаметр клубка плюроника L61 в плоскости мембраны составляет 19 0±4 1 А для лецитиновых липосом и 21 ±7 А - для липосом из ДМФХ, что меньше размеров невозмущенного клубка полимера - 27 5 А

Полученные данные позволяют заключить, что плюроник встраивается в мембрану в виде полимерного клубка, который не смешивается с окружающим его липидом (рис 6А), причем размеры этого клубка заметно меньше, чем предсказываемые по модели свободно-сочлененной цепи Это означает, что полимерная цепь в мембране принимает более компактную

конформацию, чем в ©-растворителе, т е липидный бислой является «плохим» растворителем для полиалкиленоксидов Данный вывод был подтвержден при исследовании встраивания в мембрану других плюроников, имеющих большие размеры гидрофобных и гидрофильных блоков |

Итак, полученные нами результаты впервые выявили, что встроенный в мембрану полимер испытывает воздействие со стороны бислоя Можно предполагать, что и структура бислоя может меняться при встраивании в него плюроника Исследованию этого вопроса мы посвятили следующий раздел

1 3. Влияние полимеров на свойства липидных мембран Влияние плюроников на микровязкость мембран. Исследуя влияние полимеров на биологические мембраны, мы изучили в первую очередь их влияние на среднюю микровязкость бислоя, которую можно оценить по анизотропии флуоресценции (<г>) 1,3,5-дифенилгексатриена (ДФГТ), встроенного в гидрофобную область бислоя Микровязкость (т), Пз) рассчитывали из значений анизотропии флуоресценции по уравнению Перрена, используя известные из литературы параметры флуоресценции ДФГТ

<Г> А

25°С, гель-фаза

0 2 о 1 00

50°С

Жидко-кристаллическая _фаза_

00 01 02 [Р1]0, мкМ

В

, ? Н-ф ь

р

* + 1.61 *

10 [Р1]0, мкМ

100 0 00

0 1

[Р1]0, мкМ

Рис 7 Влияние плюроника на анизотропию флуоресценции ДФГТ в мембранах из дипальмитоилфосфатидилхолина (А), в мембранах микросом печени мыши (Б) и клетках мышиной миеломы БР2/0 (В) Данные, показанные на графике (А) получены при 25°С и 50°С, а на панелях (Б) и (В) - при 37°С

Оказалось, что микровязкость мембран липосом, состоящих из яичного лецитина, очень мала и составляет 0 5-0 7 Пз, что значительно меньше микровязкости природных мембран из различных источников Добавление плюроника к таким мембранам не влияло на их микровязкость Вероятно, это объясняется высокой степенью ненасыщенности природного лецитина, которая приводит к уменьшению плотности упаковки липидного бислоя В результате встраивание полимера в мембраны не приводит к дополнительному ускорению вращения зонда

Действительно, оказалось, что липосомы, построенные из полностью насыщенного липида, дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), характеризовались значительно более высокой анизотропией флуоресценции при 25°С (рис 7А) Это свидетельствовало о более плотной упаковке липида В этих условиях плюроники также не влияли на микровязкость мембраны В этих условиях ДПФХ существует в состоянии гель-фазы, в которой латеральная подвижность липидных молекул сильно заторможена Можно предположить, что в этом случае отсутствие влияния плюроников на микровязкость объясняется невозможностью их встраивания в мембрану, находящуюся в состоянии гель-фазы В самом деле, нагревание липосом до температуры, превышающей температуру фазового перехода ДПФХ (35°С) приводило к снижению анизотропии флуоресценции зонда, и при этом добавление плюроника 1.61 приводило к заметному снижению анизотропии флуоресценции зонда вплоть до значений меньших <г> в мембранах липосом из природного лецитина (рис 7А)

Полученные результаты указывают на то, что встраивание полимера в модельные липидные мембраны приводит к возмущению упаковки липидных молекул, в результате чего ускоряется подвижность встроенного в бислой мембранного зонда Аналогичные результаты, но уже при физиологической температуре были получены на мембранах микросом печени мыши (рис 7Б) и клетках мышиной миеломы БР2/0 (рис 7В) Таким образом, взаимодействие плюроников с модельными и биологическими мембранами вызывает изменения структуры бислоя, проявляющиеся в увеличении подвижности его компонентов

В состав клеточных мембран входят в основном белки и липиды Согласно данным литературы, плюроники не образуют комплексов с белками в физиологических условиях Поэтому их влияние на мембраны связано, по всей видимости, с воздействием именно на липидную компоненту Учитывая эти соображения, 8 дальнейшем мы исследовали воздействие полимеров на подвижность липидов и проницаемость модельных мембран

Влияние амфифильных сополимеров на трансбислойную миграцию липидов в модельных мембранах Скорость флип-флопа изучали на липосомах, содержавших на внутреннем монослое флуоресцентную метку [(Ы-7-нитробенз-2-окси-1,3-диазол-4-ил)-

дипальмитоил]-фосфатидилэтанол-амин (МВО-ФЭ) Такие асимметрично меченные везикулы инкубировали с исследуемым полимером и через определенные промежутки времени определяли долю МВЭ-ФЭ, перешедшего на внешний монослой мембраны за время инкубации Для этого к липосомам добавляли дитионит натрия, который восстанавливал ЫВО-ФЭ до нефлуоресцирующего продукта Поскольку дитионит не способен проникать через бислой, модификации подвергается только МВЭ-ФЭ, находящийся на внешнем монослое мембраны липосом

В отсутствие полимера спонтанный переход МВО-ФЭ на внешнюю поверхность липосом происходил достаточно медленно равновесное

распределение меченого липида между монослоями мембраны достигалось через 10-15 часов при 25°С (рис 8А, кривая 1) и через 2,5-3 часа| при 30°С Добавление плюроника L61 приводило к значительному ускорению трансбислойной миграции липида (рис 8А, кривые 2, 3), причем эффективная константа скорости флип-флопа возрастала от 0 21 до 0 51 ч"1 в присутствии 5 мкМ плюроника L61 и до 1 28 час"1 в присутствии 20 мкМ плюроника L61 При этом плато кинетической кривой соответствует переходу около половины всех молекул меченого липида с внутреннего монослоя -на внешний Это означает, что плюроник не влияет на распределение липидов между монослоями мембраны, а лишь только увеличивает скорость установления равновесного распределения липидов в бислое Полученные данные также показывают, что плюроник не вызывал повышение проницаемости мембраны по отношению к дитиониту натрия, поскольку, в противном случае, в присутствии плюроника конечный уровень (плато) кинетических кривых превышал бы уровень плато, наблюдаемый в отсутствие полимера

Б v /v

Ф шп-ф 1<>Л ш 10 чип % р 0

50

. 40Н С

о

^ 30

•ес 20 © 10

0 1

i

О 20

■I, 15

10

s: а

ег* в

о Г/Г * 6

----

ф*

20

15

10

5 10 15

Время, час

20

80 100

0 20 40 60

[L61]0, мкМ

Рис 8. (А) Зависимость доли NBD-ФЭ, претерпевшего флип-флоп в липосомах от времени в отсутствие плюроника (1) и в присутствии 5 мкМ (2) и 20 мкМ плюроника L61 (3) (Б) Зависимость доли НБД-ФЭ, претерпевшего флип-флоп за 10 мин инкубации (левая ось ординат), и относительного ускорения, вызванного добавлением плюроника L61 (правая ось ординат), от концентрации полимера Липосомы из яичного лецитина с добавкой 0 5% NBD-ФЭ, 0 15 мг/мл, 10 мМ Трис, 150 мМ холинхлорид, 1 мМ ЭДТА, рН 7 0, 25°С

Вызываемое

плюроником

ускорение флип-флопа было

пропорционально концентрации добавляемого полимера зависимость описывается линейным уравнением

— = 1 + Р, ,<•.

(рис

8Б) Эта (6)

где Чр/Ч0 - соотношение начальных скоростей флип-флопа в присутствии и в отсутствие полимера, С0 - концентрация полимера, выраженная в мкМ, а (Зм , мкМ"1, - концентрационно-независимая способность полимера ускорять флип-флоп Этот параметр зависит только от структуры полимера, температуры и

состава липосом, но, в отличие от урЛ/0, не зависит от концентрации полимера

Таким образом, полученные данные показывают, что встраивание плюроника 161 в мембрану вызывает значительное ускорение трансбислойной миграции липидных молекул Этот результат имеет большое значение для понимания механизма действия плюроников в клетках, поскольку биологические мембраны характеризуются ярко выраженной асимметрией распределения липидов между поверхностным и внутренним монослоями мембраны При этом мембранная асимметрия поддерживается ферментами (флипазами), переносящими аминофосфолипиды с внешней стороны мембраны на внутреннюю Асимметричное расположение липидов в биологических мембранах имеет большое регуляторное значение, и его изменение оказывает влияние на состояние клеток Таким образом, плюроник может рассматриваться как искусственная флипаза, способствующая выравниванию градиента концентрации липидов между монослоями мембраны

Какие же структурные особенности плюроников обусловливают их влияние на скорость трансбислойной миграции липидов? Для ответа на этот вопрос мы исследовали способность 17 амфифильных сополимеров, различающихся природой и размерами гидрофобных и гидрофильных блоков, ускорять флип-флоп в липидных мембранах (рис 9)

HO-tCHj-CHiO^-tCH-CHjO^-iCHs-CHCH3(CH2)IlblO—<сн;сн20)п-н

сн,

РяД 1 Ряд II

Ппюроники (Pluronlc®) Полиэтоксилированные

но ноу ,'jh спирты (Brij®)

ни HV40H

^ /~0' он н. ■ ' 4

Г V . ^

-он

_0

л

-СИ, . , . Л ¿Л-

/ 4 ' ------/7 * ' \ г-

Н3СМСЩ» НО 11,ССИСНСН ,0;fCII,C'II,dr-il нг

ls - \ " *Ь " * и -- ,0 jL_ '-'Н

ни-

-Л

но' Ряд III Ряд IV

Метилированные полиглицерины, Сополимеры полиалкиленоксидов Цетил-ПГ и глицерина, ППО-ПГ

Рис 9 Структура амфифильных сополимеров, влияние которых на скорость флип-флопа в липидных мембранах было исследовано в настоящей работе

Первый ряд полимеров (рис 9, ряд I) состоял из триблок-сополимеров ЭО и ПО (плюроников), различающихся длиной гидрофобного и гидрофильных блоков В это семейство вошли 3 группы сополимеров,

гидрофобный блок которых содержал около 30, 40 и 50( звеньев пропиленоксида При этом длина блоков этиленоксида варьировала внутри каждой из групп от четырех до более ста звеньев Второй ряд сополимеров включал моноалкиловые эфиры полиэтиленоксида, т е состоял из сополимеров родственных плюроникам, но содержащих в гидрофобном блоке вместо пропиленоксида, углеводородные радикалы (рис 9, ряд II)

Таблица 2. Некоторые физико-химические характеристики амфифильных сополимеров, исследованных в работе, и значения параметров Рм и р00х для этих сополимеров, измеренные при 30°С |

Сополимеры (торговое название) MW Pf.f, мкМ'1 LQPreKcaH/ вода ^гфб» нм3 pDOXi мкМ'1

Ряд 1 (Плюроники) |

ЕО2РО30ЕО2 (L61) EO13PO30EOi3 (L64) Е076Р03оЕ076 (F68) 2090 2900 8400 0 66±0 08 0 31±0 07 0 05±0 03 -0 2±0 04 -1 8±0 27 -3 5+0 53 97 97 97 0 096+0 006 0 025±0 005 0 006+0 0003

ЕОзРО40ЕОЗ (L81) ЕО26РО40ЕО26 (Р85) ЕОв1РО40ЕО6, (F87) 2750 4500 7700 1,1+0 1 0 56±0 11 0 3±0 1 -0 1±0 02 -2 7+0 4 -3 2±0 2 166 13 9 13 9 014±0 01 0 061±0 003 0 015±0 001

ЕО5РО59ЕО5 (L101) ЕОз7Р056ЕОЗ7 (РЮ5) |E0132P05oE0132(F108) 3800 6500 14600 2 6±0 2 2 0±0 3 1 15±0 2 0 1±0 02 -2 6+0 4 -3 65±05 26 7 23 7 20 9 0 29+0 02 н/о 012±0 02

j Ряд II (ПАВ серии Brij) |

С12Н25Е04 (Brij 30) С12Н25Е024 (Bnj 35) С16Н33ЕО10 (Bnj 56) 345 1225 700 0 06±0 01 0 007±0 001 0 05±0 005 3 20±06 -1 79±0 06 2 32±0 52 0 74 0 74 0 89 н/о н/о н/о

Ряд III (Блок-сополимеры пропиленоксида и глицерина)

PO30EO6G2 (ПГ2) P03oEOeG3o (ПГЗО) PO30EO6G76 (ПГ76) 2267 3601 7760 1 15+015 0 095+0 017 0 014±0 009 -0 51±0 02 -2 45+0 07 -4 07+0 16 12 7 127 127 0 15+0 01 0 010+0 001 (8 5±0 9) 10 "

Ряд IV (Цетилированные полиглице рины) I

C16H33-G10 (Цетил-ППО) C16H33-G&4 (Цетил-ПГ64) 981 5000 0 091±0 008 0 048±0 005 -2 20±0 58 -2 92±0 11 0 89 0 89 0 03±0 01 j 0 004±0 001

Наконец, III и IV ряды состояли из двухблочных сополимеров, гидрофильный блок которых состоял из сверхразветвленного полиглицерина, а гидрофобный блок состоял из 30 звеньев пропиленоксида и 6 звеньев этиленоксида, статистически распределенных по полимерной цепи или гексадецильного (цетильного) радикала (рис 9) Последние две группы сополимеров были недавно синтезированы в лаб проф X Фрая (Университет г Майнц, Германия)

Добавление большинства исследованных сополимеров к асимметрично меченым липосомам не вызывало повышения проницаемости мембран по отношению к дитиониту натрия в исследованной области концентраций, что дало возможность измерять их влияние на скорость флип-флопа в мембранах с помощью дитионитного метода Значения этого параметра для всех исследованных сополимеров представлены в таблице 2

Использованный в настоящей работе набор сополимеров позволил выявить вклады гидрофобного и гидрофильного блоков в способность сополимеров ускорять флип-флоп в липидных мембранах Увеличение степени полимеризации гидрофильных блоков во всех случаях уменьшало способность полимеров ускорять флип-флоп (рис 10), что, по всей видимости, обусловлено уменьшением связывания полимеров с мембранами п,

степень полимеризации гидрофильного блока

Рис 10 Зависимость

способности амфифильных сополимеров ускорять флип-флоп в липидных мембранах от степени полимеризации гидрофильного блока

Напротив, увеличение длины гидрофобного блока в составе сополимеров

приводило к увеличению значения рм Так, например, увеличение степени полимеризации ППО от 30 до 40 и 50 приводило к повышению параметра рм при всех значениях степени полимеризации гидрофильного блока п Это означает, что при одной и той же степени полимеризации гидрофильного блока рост длины гидрофобного блока приводил к увеличению воздействия полимеров на флип-флоп

Сравнение параметров р(( плюроников (Табл 2, ряд I) и алкильных эфиров полиэтиленоксида (ряд II) позволяет выявить роль химической структуры гидрофобного блока Оказалось, что ПАВ ряда Вгд обладали лишь незначительной способностью ускорять флип-флоп в липидных мембранах, хотя они обладают в десятки раз большим сродством к мембранам, чем плюроники По всей видимости, их низкая способность ускорять флип-флоп обусловлена малыми размерами их гидрофобных блоков

Можно предполагать, что степень воздействия полимеров на скорость флип-флопа определяется его сродством к бислою и способностью возмущать его структуру Поэтому для выявления структурных факторов, определяющих степень воздействия сополимеров на флип-флоп в мембранах, необходимо независимо учитывать связывание полимеров с бислоями

Описанный выше метод равновесного диализа, использовавшийся ранее для определения связывания плюроника 161 с липидными везикулами, неприменим для большинства сополимеров использованных в нашей работе ввиду более высокой молекулярной массы большинства образцов1 (Таблица 2) Поскольку основной движущей силой взаимодействия сополимеров с мембранами являются гидрофобные взаимодействия, можно полагать, что степень связывания полимеров с мембранами будет пропорциональна их гидрофобности В данной работе в качестве меры гидрофобности сополимеров мы использовали измеренные напрямую коэффициенты распределения в двухфазной системе гексан/вода (см значения 1_дР в табл 2) I

Оказалось, что значения ЬдР пропорциональны значениям рг.г) но только для полимеров одной и той же группы В то же время сравнение сополимеров разных групп показывает, что ПАВ, содержащие алифатический радикал нормального строения (ряд II), будучи более гидрофобными по сравнению с другими соединениями, значительно слабее влияли на флип-флоп Эти результаты показали, что гидрофобность полимера и, следовательно, его сродство к липидной мембране является необходимым, но недостаточным условием способности ускорять флип-флоп липидов Полимер, по-видимому, должен не только встраиваться в бислой, но и «уметь» возмущать его структуру |

Разумно предположить, что искажение структуры мембраны будет увеличиваться с увеличением объема встроенного соединения Расчет ван-дер-Ваальсового объема гидрофобного блока исследованных соединений показал, что объем V блок-сополимеров, содержащих ППО (групп1| 1-1У), на порядок больше, чем у ПАВ, содержащих углеводородный радикал (табл 2) Это навело нас на мысль, что способность полимера ускорять флип-флоп увеличивается с ростом объема гидрофобного блока, а для макромолекул с близким значением этого параметра - увеличивается с ростом их гидрофобности Для проверки этого предположения мы исследовали корреляцию между значениями 1д ]3Г 1 и линейной комбинацией этих двух параметров(рис 11)

Корреляцию искали в виде линейного уравнения с помощью метода наименьших квадратов Для всех блок-сополимеров уравнение имело вид

Ьдрм = -1 4 + (0 122+0 054) 1_д Р + (0 079+0 014) V (N=17, Я=0 83) (7) Применение этого метода для выборки, включающей только плюроники и ПАВ серии Вгу (ряды I и II), увеличило коэффициент корреляции )

1_дР,., = -1 5 + (0 096+0 019) 1_д Р + (0 088+0 012) V (N=12, 13=0 93) (8) Корреляцию в уравнении (8) «ухудшали» ПАВ, содержащие остатки глицерина (рис 11) Причина этого заключается, очевидно, в химической природе гидрофильного блока этих соединений - полиглицерине Сравнение эффектов соединений с одинаковым гидрофобным блоком (ППО или цетил), но с различной гидрофильной частью (ПЭО или полиглицерин), показало, что глицерин-содержащие ПАВ сильнее ускоряют флип-флоп Так, например,

Цетил-ППО был почти в 2 раза эффективнее, чем Вщ 56 (С16Н33-ЭО10), содержащий линейный гидрофильный блок, что, по-видимому, обусловлено дополнительным возмущением структуры липидного бислоя разветвленным блоком полиглицерина

Рис 11. Корреляция между флипазной активностью и линейной комбинацией гидрофобности и объема гидрофобного блока для соединений приведенных в табл 2

Поскольку возмущение

структуры липидного бислоя и ускорение трансбислойной

миграции липидов может приводить увеличению проницаемости

0 5-,

0 0-

-0 5-

ц!.

С2. -1 0

С1

_1 -1 5-

-2 0

-2 5-

-20 -1 5 -1 0 -05 0 0 0 5 1 0 0 122 1_дР + 0 079 V

1 5

мембраны по отношению к низкомолекулярным веществам, на следующем этапе мы изучили влияние амфифильных блок-сополимеров и ПАВ на барьерные свойства мембраны

Влияние полимеров на проницаемость мембран по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину Доксорубицин (синоним адриамицин) относится к группе антрациклиновых антибиотиков Он был открыт в 1967 г в грибах Б^ерЬтусев реисе&ив, и до настоящего времени остается одним из наиболее широко применяемых противоопухолевых лекарств Доксорубицин обладает характерной флуоресценцией в видимой области спектра, что дает удобный и высокочувствительный метод его регистрации в растворе и позволяет следить за его проникновением через липидные мембраны

Доксорубицин (ООХ) состоит из полициклического антрациклинового ядра (агликона) и углеводного остатка даунозамина, который содержит аминогруппу Антрациклиновая часть доксорубицина способна взаимодействовать с ДНК, встраиваясь в малый желобок двойной спирали Вследствие этого

добавление доксорубицина к клеткам приводит к ,,¿4 - / даунозамин

его накоплению в ядре, которое и является биологической мишенью данного лекарства Движущей силой проникновения доксорубицина в клетки является высокое сродство антибиотика к ДНК Способность ООХ взаимодействовать с двухцепочечной ДНК и его слабоосновные свойства мы использовали для исследования кинетики транспорта ООХ через липидные мембраны Известно, что ООХ может проникать через биологические мембраны по механизму распределения-диффузии, которая включает в себя (1) быструю стадию распределения вещества между водной фазой и мембраной, (2) скорость-лимитирующую

стадию переноса соединения в незаряженной форме с внешнего монослоя мембраны на внутренний и (3) быстрое установление равновесия между внутренним монослоем и водной фазой внутри липосом |

Поскольку равновесие между водной и мембранной фазами, как правило, устанавливается гораздо быстрее, чем происходит трансмембранный перенос слабой кислоты или основания, то в условиях стационарности обе стадии распределения могут рассматриваться как равновесные При этом эффективная константа скорости транспорта] к0 будет выражаться через константы элементарных стадий согласно уравнению (9)

л, л,, к:

О)

К [//'1

Транспорт DOX через липидные бислойные мембраны мы исследовали, создавая трансмембранный градиент химического потенциала DOX Для этого использовали две модельные системы, одна из которых была основана на липосомах, заполненных раствором ДНК, а другая - на рН-градиентных липосомах |

а) Липосомы, заполненные раствором ДНК Высокое сродство DOX к двухцепочечной ДНК, а также тушение флуоресценции антрациклина при его встраивании в двойную спираль было предложено использовать для создания модельной системы, позволяющей изучать транспорт DOX через1 бислой [Speelmans et al Biochemistry (1994) 33, 13761] Для этого получают липосомы, заполненные раствором ДНК Проникновение DOX в такие везикулы приводит к тушению его флуоресценции, причем кинетика изменения интенсивности флуоресценции DOX в такой системе соответствует кинетике его накопления в везикулах |

б) рН-градиентные липосомы Движущей силой транспорта| DOX в данной системе является градиент рН между внутренней и внешней средой липосом рН 4 0 - внутри, рН 7 0 - снаружи (рис 4) Благодаря наличию аминогруппы (рКа=8 6), DOX может обратимо связывать протон Незаряженная форма DOX переносится из внешней среды через липидный бислой по механизму растворения-диффузии, а протонирование молекулы внутри липосомы препятствует ее выходу во внешнюю среду Проникающий в липосомы DOX накапливается во внутреннем объеме, что приводит к тушению его флуоресценции вследствие эффекта внутреннего фильтра [Harrigan et al Biochim Biophys Acta (1993) 1149 329] Вследствие этого за кинетикой транспорта можно следить по снижению флуоресценции DOX

Добавление плюроника L61 к липосомам, заполненным раствором ДНК (рис 12А), или рН-градиентным липосомам (рис 12 Б) приводит к увеличению скорости транспорта DOX через бислой При этом положение стационарного участка кинетических кривых не меняется в присутствии плюроника, что свидетельствует о том, что плюроник не влияет на количество DOX, проникшего в везикулы

Ускорение транспорта йОХ в присутствии плюроника может быть вызвано образованием пор в мембране или ускорением трансбислойной миграции антибиотика В первом случае трансмембранный градиент рН в системе должен размываться Чтобы проверить это предположение мы получили использовали рН-градиентные липосомы, заполненные буфером, содержащим рН-индикатор пиранин Оказалось, что добавление плюроника к рН-градиентным липосомам не приводило к заметному изменению флуоресценции пиранина Таким образом, ускорение транспорта ЭОХ под действием плюроника не связано с образованием пор в мембране, а объясняется ускорением трансбислойной миграции антибиотика за счет возмущения структуры бислоя под действием встраивающегося полимера д мин

Время, мин Время, мин

Рис 12 Кинетика транспорта ООХ в липосомы заполненные раствором ДНК (А) и в рН-градиентные липосомы (Б) в отсутствие плюроника (1) и в присутствии 20 мкМ плюроника 161 (2) На вставках показана линеаризация кривых в полулогарифмических координатах (Липосомы из яичного лецитина, 1 6 мг/мл, 30°С)

Вызываемое плюроником ускорение транспорта увеличивалось с ростом концентрации полимера в растворе (рис 13, нижняя ось абсцисс) Зависимость отношения кр/к0 от концентрации полимера хорошо описывалась линейным уравнением аналогичным уравнению для флип-флопа

^ = 1+Р,»лС„ (10)

где параметр рВОх показывает, во сколько раз увеличивается скорость аккумуляции ООХ в липосомах при добавлении 1 мкМ полимера При этом ускорение транспорта ООХ в липосомы, заполненные раствором ДНК (рис 12А) и в рН-градиентные липосомы (рис 12Б) было практически одинаковым Таким образом, влияние плюроника на скорость проникновения доксорубицина через липосомальную мембрану не зависит от способа создания трансмембранного градиента химического потенциала и определяется свойствами и структурой полимера

Полученные ранее количественные характеристики связывания 1.61 с липосомами позволили нам рассчитать количество плюроника, адсорбированного на поверхности везикул при соответствующем содержании полимера в растворе (рис 13, верхняя ось абсцисс) Видно, что вызываемое плюроником увеличение проницаемости бислойной мембраны по отношению к ЭОХ пропорционально количеству адсорбированного на л1тосомах полимера При этом 3-х-кратное ускорение транспорта ЭОХ вызывается добавлением 20 мкМ плюроника, адсорбирующегося на липосомах со средней

плотностью 10-11 молекул/липосому Полагая, плоскости мембраны занимает площадь около

что молекула 262 А2, то

плю 10

роника в молекул

плюроника на поверхности липосомы занимает не более 1/1000 ее площади

Среднее количество молекул плюроника, адсорбированных на одной липосоме

Рис.13 Сравнение

эффекта плюроника 161 на транспорт доксорубицина (кр/ко) в рН-градиентные липосомы(1) и липосомы, заполненные раствором ДНК (2)

[L61]

60 80 мкМ

Как

видн

из

показанных на рис 13 данных, повышение концентрации полимера в системе приводит к росту числа адсорбированных на мембране молекул, увеличению дефектности бислоя и , как следствие, возрастанию проницаемости бислоя для ООХ Известно, что процессы пассивного транспорта включают стадии

из этих

на

растворения в мембране и диффузии через бислой На какой процессов оказывает влияние плюроник?

Для ответа на этот вопрос мы изучили влияние плюроника коэффициент распределения ЭОХ между водным раствором и липидной мембраной Оказалось, что коэффициент распределения йОХ между водным раствором и липидной мембраной равен 105 и не меняется в присутствии 50 мкМ плюроника 1.61 Это означает, что изменение константы 'скорости транспорта под действием плюроника связано с изменением коэффициента проницаемости РОХ, а величина Роох может рассматриваться как параметр, отражающий влияние полимера на проникновение антибиотика через липидную мембрану

Воспользовавшись этим, мы сравнили способность различных сополимеров вызывать ускорение транспорта ООХ в рН-градиентные липосомы Для этого мы определили значения роох для большинства полимеров, влияние которых на скорость флип-флопа было описано выше (табл 2) Оказалось, что варьирование структуры полимеров сопровождается однонаправленными изменениями значений роох и ри Построив зависимость Роох от /5^ для всех исследованных блок-сополимеров (рис 14), мы обнаружили тесную связь между этими параметрами (коэффициент корреляции Я=0 988)

Это означает, что увеличение трансбислойной подвижности липидов и ускорение проникновения ООХ в липосомы под действием исследованных соединений обусловлены, по-видимому, одинаковыми причинами -взаимодействием полимеров с липосомальной мембраной и возмущением структуры липидного бислоя

Влияние состава и свойств мембраны на взаимодействие с ней полимеров Известно, что состав липидного бислоя влияют на его проницаемость Влияет ли состав мембраны на ее взаимодействие с плюроником? Для ответа на этот вопрос мы использовали двухкомпонентные везикулы, основным компонентом которых всегда был лецитин, составляющий 35-60% мембран животных клеток, а вторым компонентом -исследуемый липид В качестве такового были исследованы основные классы липидов животных клеток глицерофосфолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота и кардиолипин), фосфосфинголипиды (сфингомиелин), гликосфинголипиды (ганглиозид вМ1) и стеролы (холестерин) Эти липиды смешивали с лецитином в разных соотношениях, изменяя долю исследуемого компонента, и получали рН-градиентные липосомы, которые в дальнейшем использовали для изучения скорости транспорта ООХ

Влияние плюроника на проницаемость липидной мембраны сильно зависело от ее состава Введение ганглиозида, фосфатидилэтаноламина и, особенно, холестерина, приводило к увеличению микровязкости бислоя При

1 б-.

Рис 14 Корреляция между способностью полимеров

ускорять транспорт ООХ (Роох) и их влиянием на скорость флип-флопа (р,,)

00 02 04 06 (Зоох, мкМ 1

этом влияние плюроника на транспорт РОХ закономерно уменьшалось Сфингомиелин и кардиолипин, не влиявшие на микровязкость, не меняли и чувствительность бислоя к действию плюроника Введение фосфатидной кислоты уменьшало микровязкость бислоя Добавление плюроника к таким липосомам вызывало дестабилизацию мембраны и образованию в ней пор Эти наблюдения указывали на взаимосвязь между изменениями микровязкости и чувствительности бислоя к действию плюроника при включении в состав мембраны какого-либо липида При этом наЬлюдалась удовлетворительная корреляция между чувствительностью мембраны к действию полимера и ее микровязкостью (коэффициент корреляции 0 9)

Ранее мы показали, что влияние амфифильных сополимеров на флип-флоп и проницаемость бислоя определяется суперпозицией встраивания полимера в мембрану и способности изменять упаковку липидных молекул На какой из этих процессов в первую очередь влияет микровязкость^ бислоя"?

Рис 15 Влияние содержания холестерина в двухкомпонентных липосомах с лецитином на взаимодействия с ними плюроника 1.61 По левой оси в качестве характеристики связывания приведен коэффициент распределения полимера

между водой и бислоем | ) ПоКр правой оси в качестве меры влияния

К50!

Р

40 30 20

10

¥

©

©

©

к /к

р о

20

1 5

1 0

00 01 02 03 04 Мольная доля холестерина

в мембране

полимера приведена величина ускорения транспорта ООХ в

присутствии 20 мкМ полимера кР/к0 (О)

Для ответа на этот вопрос мы исследовали связывание плюроника 161 с двухкомпонентными липосомами из фосфатидилхолина и холестерина Оказалось, что по мере увеличения содержания холестерина в липидной мембране уменьшалось связывание полимеров с липосомами ( рис 15) Введение холестерина сопровождалось увеличением микровязкости мембран, что указывало на уменьшение подвижности липидных Молекул в бислое По-видимому, такая ограниченность подвижности липидов затрудняла встраивание полимера Отнесение эффектов, вызываемых сополимерами, к концентрации связанных с мембраной макромолекул показало, что воздействие единичной макромолекулы, связанной с мембраной, практически не зависело от содержания в мембране холестерина |

Таким образом, нам удалось показать, что воздействие плюроника 161 на проницаемость липидной мембраны определяется двумя независимыми друг друга свойствами полимера 1) способностью внедряться в бислой и 2) способностью внедренной макромолекулы возмущать жидко-кристаллическую структуру мембраны При этом связывание полимера зависит от температуры и микровязкости мембраны, а, следовательно, от ее состава, а также от

структуры полимера Способность возмущать липидный бислой определяется химической природой и блочной архитектурой полимера, но, по нашим данным, практически не зависит от свойств самой мембраны

Физико-химические предпосылки возмущающего действия амфифильных полимеров на свойства мембран Итак, мы показали, что встраивание амфифильных полимеров в липидные мембраны вызывает существенное разупорядочивание упаковки бислоя Применение корреляционного анализа позволило выявить, что способность полимеров возмущать бислой определяется двумя их структурными параметрами -общей гидрофобностью и объемом его гидрофобного блока Это закономерность выполняется, по крайней мере, для гидрофобных блоков двух типов - алифатических углеводородов и полипропиленоксида Как мы уже отмечали выше, общая гидрофобность полимера служит мерой его сродства к липидному бислою, а объем гидрофобного блока, по-видимому, - отражает способность полимера возмущать липидную структуру

Рассмотрим возможные причины изменения упаковки липидных молекул при встраивании в бислой инородной по химической структуре цепной молекулы Для этого рассмотрим процессы, происходящие при встраивании амфифильного сополимера в мембрану

Движущей силой встраивания амфифильных полимеров являются гидрофобные взаимодействия, т е увеличение энтропии воды, высвобождающейся из ледоподобных кластеров, существующих вблизи гидрофобных фрагментов растворенного в воде амфифильного полимера Изменение свободной энергии всей системы может быть представлено как суперпозиция следующих вкладов (1) изменение свободной энергии воды за счет встраивания гидрофобных блоков в липидную фазу (ААСвода), (2) формирование в липидной фазе полости достаточной по размеру, чтобы вместить гидрофобный полимерный блок (~ЮПолость), (3) образование ван-дер-Ваальсовых контактов между полимером и липидами (ААСПоттер.Липид), (4) изменение конформационной энтропии полимерной цепи вследствие ее встраивания в липидную фазу (ААСПопимер), (5) изменение упаковки липидных молекул вследствие адсорбции полимера (ААБлипид) Полагая, что рассматриваемая нами система является закрытой, те не обменивается веществом и энергией с окружающей средой, а также считая, что равновесие между полимером и мембраной установилось, можно считать, что общее изменение свободной энергии система равно О

Липид полость полимер + 4АЗЛипид (11)

Поскольку в настоящем разделе мы рассматриваем амфифильные полимеры, способные встраиваться в бислой за счет гидрофобных взаимодействий, первый член в этом выражении определяет сродство полимера к мембране, и, поэтому имеет большую величину относительно других членов и отрицателен по знаку

Изменение энтальпии системы за счет образования взаимодействий полимера с липидом очевидно компенсируется разрывом аналогичных по

своей природе контактов между молекулами липидов Известно, что тепловой эффект встраивания полимера в липидный бислой невелик, и, в | основном, определяется изменением количества водородных связей в воде Поэтому второй член в этом выражении мал относительно других слагаемых

Свободная энергия образования полости в мембране попасть требует затрат энергии и поэтому имеет положительный знак Этот член прямо пропорционален объему гидрофобного блока и зависит от его конс^ормации Внедрение полимера в гидрофобную область бислоя может пэиводить к ограничению его конформационной подвижности В этом случае ААСПорииер>0 Если же встраивание полимера не приводит к ограничению конформационной подвижности, этот член близок к О

Последний член в уравнении 11 (ААСЛип„е) отражает изменение структуры бислоя и подвижности его компонентов, вызванное внедрением в мембрану полимера Если адсорбция полимера влияет на плотность упаковки липидов, можно полагать, что основной вклад в этот член вносят изменения энтропии бислоя (ТЛАБвиспоя) Если встраивание полимера вызывает увеличение плотности мембраны, ее энтропия должна снижаться ШЗБиспоя<0), вызывая повышение свободной энергии мембраны (ААОПипид>0) Напротив, если амфифил вызывает разупорядочивание мембраны, ее энтропия будет повышаться, и ААСЛипид<0 Чем более отрицательна ААОЛиШ1д, тем более выражено влияние полимера на скорость флип-флопа или проницаемость мембраны по отношению к лекарствам Таким1 образом, ускорение полимером динамических процессов в мембране определяется знаком члена ААСПипиа, а степень этого воздействия определяется 'величиной ААСЛипид Ускорение флип-флопа и ускорение транспорта ООХ должно проявляться только, если ААСЛигП1д<0 |

Поскольку мы изначально предположили, что система находится в равновесном состоянии и ААС=0, знак величины ААСЛипид определяется балансом между отрицательным членом ААСвода и положительной суммой ААвПолость+ААвПопииер Величина и знак ААСПп,шд будет определяться критерием 5, который задается соотношением (12)

| ддсп....... +ддо„,„н,„, I

I дд<;,„„ I

Если величина 8 больше 1, полимер возмущает упаковку липидных молекул и ускоряет динамические мембранные процессы, а если меньше 1, напротив, замедляет их

Если гибкая полимерная цепь встраивается в плотный липидный бислой, естественно ожидать существенного ограничения конформационной подвижности полимера (ААЗконф <0) и ААОПоПимеР>0 Аналогично, если полимер имеет большой гидрофобный блок и поэтому АЛСПопость»0, числитель в соотношении (6) увеличивается, а значит, полимер также увеличивает подвижность мембраных компонентов

(12)

Обсуждение процессов встраивания амфифильных полимеров в липидный бислой в термодинамических терминах приводит еще к одному важному соотношению Уменьшение гидрофобности полимера (ААЗВода) должно уменьшать сродство полимера к мембране, но при этом величина 5 увеличивается' Важность этого фактора подтверждается сравнением плюроников и ПАВ серии Вгц

Термодинамическое рассмотрение влияния амфифильных сополимеров на липидные бислойные мембраны позволило нам сформулировать несколько требований к структуре полимера, которые необходимы для того, чтобы он воздействовал на структуру мембраны Во-первых, такой полимер должен быть гибким Во-вторых, его гидрофобный блок должен иметь значительный объем, чтобы обеспечить высокое значение величины ЛЛОпопость И, наконец, его гидрофобность не должна быть очень высока, чтобы выполнялось неравенство \ААСВода\<\ААвПопимер+ААвполость\, и величина 5 была бы >1 Следует отметить, что полипропиленоксид в качестве гидрофобного блока отвечает всем этим требованиям

Соотношение между структурой сополимера и его способностью возмущать структуру бислоя, показанное в настоящей работе, может иметь существенное значение для обнаружения новых водорастворимых полимеров, способных модифицировать свойства липидных мембран Можно надеяться что критерии, сформулированные в настоящей работе, помогут в разработке стратегии синтеза новых фармакологически активных полимеров

2 Взаимодействие поликатионов с липидными мембранами

Известно, что поликатионы способны с высокой эффективностью адсорбироваться на поверхности противоположно заряженного бислоя, и при этом происходит латеральная сегрегация заряженных липидов в мембране с образованием новой микрофазы Стимулированные этими результатами модельные исследования позволили выявить механизмы латеральной сегрегации липидных молекул в бислойных мембранах и значение химической природы полиэлектролита и заряженного липида для структуры и размера доменов, формирующихся под действием поликатионов

Для этого мы использовали несколько поликатионов, формулы которых приведены на рис 16

В то же время ряд существенных вопросов, связанных с воздействием поликатионов на проницаемость липидных мембран остался неисследованным В частности, неизвестно, какие структурные параметры поликатионов имеют наибольшее значение для их воздействия на проницаемость, и какое влияние оказывает состав мембраны на степень ее чувствительности к полимеру В данной части работы мы постараемся ответить на эти вопросы

ojc III 6

О'/ CH* . ^ 100

J L61 - n-2, m=30

CH,

H»C

CH,

I

f P85 - n=26, m=40 N

н?с' CH,

N F127 - n=65, m=100 HiC''^ch,

H,N-f N—(CH,b N—( Vch.BI* ¿н,В

CH.

CH2)4j-NH, ' n

H-|o'

■ic f '4i

26 CH3

IV

jk /26

V

н

CH3

\н

N —N4N-(CH2);N —(CHj)4.I-N

\i...D0 i. . RP i

CH3E

CH3'

VI

Bp

N

Л\ /N

N—'

CI

-r CH '

,\OH

Рис 16 Структура поликатионов использованных в работе I - поли-(М-этил-4-винилпиридиний бромид) - ПЭВП, II - полилизин, III - |поли-(1М,1М-диметиламино-этилметакрилат) - пДМАЭМА, IV - сополимеры ДМАЭМА и плюроников L61, Р85 и F127, V - полиионен-2,4, VI - сополимер полиионена-2,4 и плюроника Р85

2.1. Влияние поли-(Ы-этил-4-винилпиридина) на проницаемость липосомальных мембран по отношению к доксорубицину

Ранее в целом ряде работ было обнаружено, что взаимодействие поликатионов с клетками приводит к образованию в мембранах пор, проницаемых не только для малых ионов, но и для крупных Молекул В настоящей работе мы исследовали, меняется ли под действием поликатионов проницаемость мембраны по отношению к веществам, проникающим через бислой по механизму распределения-диффузии j

кардиолипина (КЛ), их внутреннюю полость заполняли кислым буферным раствором, а внешний буфер заменяли нейтральным раствором

Кинетику транспорта DOX мы исследовали, используя прйнцип рН-индуцированного транспорта, описанный выше Липосомы готовили из смеси нейтрального фосфатидилхолина и отрицательно заряженного липида

На первом этапе работы мы исследовали воздействие поли-(Ы-этил-4-винилпиридинй бромида) (рис 16, I) на скорость транспорта ООХ через мембраны отрицательно заряженных липосом

Оказалось, что добавление ПЭВП приводило к заметному ускорению транспорта ООХ При этом характер действия поликатионов кардинально отличался от описанного выше действия амфифильных полимеров В этом случае зависимость эффекта от концентрации полимера имела колоколообразный вид, причем наибольший эффект наблюдался при добавлении в систему полимера в количестве эквивалентном всему содержащемуся в системе кардиолипину Дальнейшее увеличение количества добавленного полимера приводило к снижению скорости транспорта (рис 17)

Рис. 17 Ускорение транспорта ООХ через мембрану липосом, содержащих 1% (1), 10% (2) и 30% (3) кардиолипина (КЛ) при добавлении ПЭВП определятся соотношением положительно заряженных групп ПЭВП и отрицательно заряженных групп КЛ 2+,. =[ПЭВП+]/%[КЛ21, к0 константа скорости транспорта ООХ в отсутствие полимеров, а кр - в присутствии

поликатиона

Ускорение транспорта, вызываемое добавлением полимера, заметно возрастало при увеличении доли анионного липида в составе липосом Так для липосом, содержащих 1% КЛ эффект поликатиона вообще не проявлялся, для липосом, содержащих 10 % заряженного липида транспорт ускорялся лишь на 30-40%, а для липосом, содержащих 20% анионного липида -наблюдалось трехкратное ускорение транспорта ООХ

Зависит ли степень ускорения транспорта ООХ, вызываемого поликатионами, от их молекулярной массы и химической структуры? Какие структурные параметры поликатионов существенны для этого эффекта?

2 2. Влияние молекулярной массы и химической структуры поликатиона на его способность ускорять транспорт доксорубицина через отрицательно заряженные липидные мембраны

ПЭВП является сильным полиэлектролитом с высокой линейной плотностью заряда (рис 16, I) Вызывают ли другие поликатионы аналогичные эффекты? Для ответа на этот вопрос мы исследовали влияние полилизина

(рис 16, II) на скорость транспорта DOX через мембраны отрицательно заряженных липосом, состоящих из 20% КП и 80% яичного лецитина

Как можно видеть на рис 18, наибольшее воздействие на [транспорт DOX полилизин оказывает при добавлении в количестве вдвое меньшем, чем содержание анионного липида в системе (Z=0 5) По всей видимости, это различие объясняется тем, что, в отличие от ПЭВП, полилизин не1 вызывает миграции анионных липидов с внутреннего монослоя мембраны на внешний [Yaroslavov et al Biochim Biophys Acta 2002,1560,14] Именно поэтому ПЭВП образует электростатические контакты со всеми молекулами кардиолипина, присутствующими в мембране, а полилизин способен взаимодействовать только с молекулами кардиолипина, находящимися на поверхности липосом, те лишь с половиной содержащегося в системе анионного липида Таким образом, оба полимера вызывают максимальный эффект при концентрации, соответствующей нейтрализации поверхностного заряда липосом

kp/ko 1 81 4 1 О!

00 05 1 0 1 5 20 25 30

+/-

к /к 2 2 р о

1 8

1 4

1 0

10 100 гп

1000

Рис 18 Ускорение транспорта доксорубицина внутрь отрицательно заряженных липосом под действием полилизина (М\Л/ 30000) в зависимости от молярного соотношения заряженных групп полимера и липосом 7. +/. =[ПЛ+]/(2[КЛ2"] (А) Зависимость максимального ускорения транспорта ООХ под действием полилизина при 7. +/.=0 5 от его молекулярной 1^ассы ( Б) Липосомы 80% лецитина, 20% кардиолипина

Влияние полилизина на проницаемость мембран по отношению к ООХ изменялось при варьировании степени полимеризации полимера (рис 18Б) При этом полимеры со степенями полимеризации 6 и 15 практически не влияли на транспорт ООХ, однако при дальнейшем росте длины ¡полимера вплоть до 107 наблюдалось постепенное усиление его воздействия на мембрану Однако дальнейшее повышение степени полимеризации, напротив, приводило к некоторому снижению скорости транспорта ООХ

Неспособность гексализина и пентадекализина ускорять транспорт ООХ может быть вызвана невысоким сродством этих соединений к мембранам Однако оценка полноты адсорбции гексализина на отрицательно заряженных

липосомах показала, что в условиях эксперимента около 70% добавленного олиголизина связывается с липосомами Таким образом, резкое снижение эффекта поликатиона на проницаемость мембран при снижении его молекулярной массы нельзя объяснить понижением его способности адсорбироваться на липидных везикулах

Известно, что короткоцепочечные олигомеры лизина, в отличие от высокомолекулярных препаратов, не вызывают микрофазового разделения Если предполагать, что влияние поликатиона на проницаемость мембраны по отношению к DOX связано с микрофазовым разделением в мембране, тогда обнаруженная нами неспособность гексализина и пентадекализина ускорять транспорт DOX становится понятной При этом закономерный рост эффекта с ростом степени полимеризации полилизина вплоть до 100-150 также согласуется с этой гипотезой

Менее очевидно объяснение снижения эффективности действия полилизинов при повышении степени полимеризации выше 150 Известно, что полилизин является жестким полимером, причем при образовании комплекса с мембраной он приобретает вторичную структуру и переходит в конформацию бета-листа или альфа-спирали, в зависимости от природы анионного липида, с которым он взаимодействует Можно предполагать, что в условиях эксперимента более высокомолекулярный полимер не может образовать достаточно компактные домены в мембране При этом высокомолекулярные поликатионы в большей степени склонны вызывать образование крупных липосомальных агрегатов, вследствие чего мембранный транспорт может замедляться

Таким образом, на примере полилизина мы исследовали влияние молекулярной массы поликатиона на эффекты, оказываемые им на транспорт DOX через липидные мембраны В то же время сопоставление эффективности действия ПЭВП (Рп=1000) и полилизина (Рп=1070) показывает, что химическая структура катионного полимера также существенна для его способности влиять на проницаемость липидных мембран В целях дальнейшего исследования этого вопроса мы сравнили воздействие на мембраны поликатионов другой химической природы - поли-(М,М-диметиламиноэтилметакрилата) (рис 16, III) и полиионена-2,4 (рис 16, V)

Эти полимеры сильно отличаются от описанных нами выше ПЭВП и полилизина Один из них, пДМАЭМА, характеризуется довольно низким значением рК0 (8 5) и поэтому в нейтральной среде заряжен приблизительно на 30% Другой поликатион - полиионен - напротив, содержит четвертичные атомы азота в основной цепи, но при этом характеризуется большей гибкостью основной цепи, в сравнении с ПЭВП [Zelikin et al J Phys Chem В 2004, 108, 490]

2 5 2 0 > 1 5 1 0 0 5

00 05 10 15 20 +/-

Рис 19 Зависимость эффекта, оказываемого (1) ионеном 2,4 (Р„= 40), (2) полилизином ( ^„=36) и (3) пДМАЭМА ( Рп=95) на скорость транспорта ООХ в ли|юсомы из яичного лецитина и кардиолипина (8 2) от мольного 'отношения ионогенных групп поликатиона и липида Концентрация | липида 1 мг/мл, буфер 20 мМ НЕРЕЭ, 5 мМ Трис, рН 7 0,25°С

Данные, показанные на рис 19 свидетельствуют о том, что полиионен-2,4 вызывал заметное ускорение транспорта ООХ, превосходящее по величине эффект, оказываемый полилизином, сходной степени полимеризации При этом пДМАЭМА со степенью полимеризации около 100 практически не влиял, а будучи добавленным в концентрации, соответствующей даже замедлял транспорт ООХ С чем связаны такие

различия?

Как видно из данных, показанных на рис 20, не только степень полимеризации полимера, но и его химическая структура и , в частности, расстояние между его заряженными группами существенно ¡злияет на взаимодействие с мембранами Так, наибольшую способность ускорять транспорт ООХ проявлял ПЭВП, в котором среднее расстояние между заряженными группами наименьшее (!-с~4А), менее активный ионен-2,4 характеризовался средним расстоянием между зарядами 1_с~6 А Еще менее активный полилизин характеризуется межзарядным расстоянием I. С~7А, а пДМАЭМА, вообще не увеличивающий проницаемость бислоя, характеризуется 1_с~13 5 А

Обнаруженная закономерность может объясняться тем, что полимеры с высокой плотностью положительного заряда в большей мере склонны вызывать латеральную сегрегацию липидов в мембране По всей видимости, с уменьшением плотности положительного заряда способность полимеров вызывать латеральную сегрегацию липидов снижается, а в случае пДМАЭМА □ и вовсе исчезает

Значительное увеличение эффективности действия полимеров на мембранный транспорт ООХ мы наблюдали, присоединяя плюроник Р 85 к катионному блоку полиионена-2,4 Это приводило к многократному увеличению скорости транспорта ООХ при добавлении к липосо^ам даже небольших количеств полимера Как видно из данных, показанных на рис 20, эффекты, оказываемые такими сополимерами, были значительно выше

эффектов, вызываемых другими поликатионами, и быстро увеличивались с ростом степени полимеризации катионного блока (звездочки на рис 20) 5-

а> х х

ф ^

о- й о О

3 О >>

4-

ф о

X -О

п; и

г ^

о ^

го

II ■

о ;

V/

«о- .'

1,1С=3,9А

5, ¿_Г=6Л

3,4, 1_Г=14,6А

10

100

|дрг

1000 10000

Рис 20 Зависимость максимального ускорения транспорта ООХ через мембраны, состоящие из яичного лецитина и кардиолипина (8 2), вызываемого ПЭВП(1), полилизином (2), пДМАЭМА (3) и его сополимерами с плюрониками (4), ионеном 2,4 (5) и сополимерами ионена-2,4 с плюроником Р85 (6), от степени полимеризации катионного блока

По всей видимости, в данном случае в качестве основного действующего начала в составе сополимера выступал плюроник, а функция поликатиона состояла лишь в увеличении его адсорбции на мембране везикул Как было показано выше, сродство плюроников к липидной фазе невелико Именно поэтому присоединение к ним катионного блока приводит к заметному увеличению их воздействия на бислой

2 3. Причины воздействия поликатионов на проницаемость липидных мембран

Электростатически адсорбируясь на мембране, поликатион вызывает латеральную сегрегацию отрицательно заряженного липида, т е образование липидных микродоменов Индуцированное поликатионами образование таких доменов подтверждается обширными данными литературы Известно, что плотность упаковки липидов на границе таких микродоменов существенно ниже, чем плотность упаковки в пределах самой фазы Поэтому границу фаз можно рассматривать как дефектную область, диффузия через которую существенно облегчена, по сравнению с диффузией через невозмущенный бислой (рис 21) Именно дефектность этой зоны может объяснить ускорения проникновения ООХ через отрицательно заряженную мембрану под влиянием поликатионов

-36-

'хтм

■кардиолипин ■ лецитин

+ПОЛИКАТИОН

Рис 21. Схематическое представление влияния поликатионов на скорость транспорта йОХ через мембрану, состоящую из яичного лецитина и анионного липида кардиолипина

Обнаруженные в настоящей работе закономерности дают возможность целенаправленно конструировать катионные полимеры, предназначенные для увеличения проницаемости биологических мембран

3. Влияние полианионов на транспорт доксорубицина через липидные мембраны

Биологические мембраны, как правило, заряжены отрицательно, поэтому анионные полимеры не связываются с клетками и не оказывают влияния на их свойства В то же время взаимодействие полианионов с катионными лекарствами или белками крови может существенно влиять на их функции и представляет значительный интерес с точки зрения фармакологического использования полианионов В настоящем разделе, используя описанную в двух предыдущих главах модельную систему, мы исследовали влияние полианионов на проникновение доксорубицина через липосомальные мембраны

3.1 Влияние полиакриловой кислоты и ее производных на скорость транспорта доксорубицина через липидную мембрану

Влияние полианионов на транспорт доксорубицина мы исследовали с использованием полиакриловой кислоты и продуктов ее частичной модификации гексанолом, додеканолом и октадеканолом (рис 22)

Рис 22 Полианионы, использованные

НО^О

ПАК

нсДо66 о^о

ПАК 6/6 п=6 с„н2„., ПАК 12/6 п=12 ПАК 18/6 п=18

в работе поликислоты статистически гидрофобных звеньев

Модифицированные

содержали

6%

распределенных

Оказалось, что при добавлении ПАК к рН-градиентным липосомам в концентрации сравнимой с концентрацией БОХ (50 мкМ) или превышающей ее наблюдалось изменение вида кинетических кривых

Как показано на рис 23А, в присутствии ПАК наблюдалось снижение начального уровня флуоресценции по сравнению с контрольным образцом (кривая 1) В ходе процесса флуоресценция увеличивалась, достигала максимума и далее уменьшалась, выходя на плато При этом начальный

уровень флуоресценции и высота максимума уменьшались с ростом концентрации ПАК, а время т, требуемое для выхода кривой на плато -увеличивалось (рис 23Б) Это означает что, изменяя концентрацию ПАК в системе, можно манипулировать скоростью транспорта ООХ, при этом количество проникшего внутрь везикул ООХ практически не зависит от исходной концентрации ПАК в системе

30

§ 20

X (о

-г- 10

4 6 8 10 12 14 Время, мин

3 0

X о 2 5

м

X о 2 0

с 1 5

1 0

2 4 6 8 10 [ПАК]/[ООХ]

Рис 23 (А) Зависимость интенсивности флуоресценции ООХ после добавления рН-градиентных липосом к раствору ООХ в отсутствие (1) и в присутствии ПАК (2-5) от времени РС)Х]=50 мкМ, [ПАК]/[РОХ]=1 6 (2), 3 (3), 10 (4), 50 (5) (Б) Влияние ПАК на время накопления ООХ в липосомах т, отнесенное ко времени накопления в отсутствие полимера т0 Буфер 20 мМ НЕРЕБ, 5 мМ Трис, 0 3 М сахароза, 25°С

Введение анионных липидов в состав мембран, проведение эксперимента в присутствии физиологической концентрации №С1 и даже добавление анионного белка (альбумина) качественно не влияло на кинетику транспорта ООХ в присутствии поликислот При этом использование гидрофобизованных полианионов увеличивало характерное время транспорта ООХ почти в 1 5 раза

Таким образом, влияние ПАК на транспорт ООХ кардинально отличалось от эффектов, оказываемых амфифильными полимерами и поликатионами Поскольку ПАК не взаимодействует с липидной мембраной в нейтральной среде, наиболее вероятно, что замедление мембранного транспорта ООХ объясняется формированием полимер-коллоидных комплексов между ООХ и поликислотами

3.2 Комплексообразование полиакриловой кислоты с доксорубицином

Характеристическое значение рКа карбоксильных групп ПАК равно 4 8, а ООХ содержит первичную аминогруппу с рКа=8 6 Формирование комплексов в системе ПАК-ООХ было изучено при рН 7, когда молекулы лекарства и

полимера несли противоположные по знаку заряды Добавление ПАК к раствору ООХ сопровождалось уменьшением интенсивности флуоресценции ООХ и сдвигом максимума в спектре поглощения ЭОХ в красную область на 10 нм Такие изменения указывают на формирование ассоциатов ООХ на полимерной матрице за счет стэкинг-взаимодействий между Молекулами антибиотика

Добавление низкомолекулярного электролита (ЫаС1) к раствору комплекса приводило к увеличению флуоресценции ООХ, что свидетельствовует о появлении в системе свободного (не связанного с ПАК) антибиотика Полная диссоциация комплекса достигалась при концентрации №С1 равной 04 М Добавление в систему этанола также увеличивало флуореценцию ООХ, свидетельствую об участии гидрофобных взаимодействий в стабилизации комплекса Гидрофобизация ПАК остатками гексанола, додеканола и октадеканола (рис 22) приводила к заметному повышению стабильности комплексов в присутствии физиологической концентрации соли Так, если комплексы, образованные немодифицированной ПАК, диссоциировали при физиологической ионной силе на 80%, то комплексы, образованные ПАК 6/6 - на 70%, ПА^ 12 /6 - на 62%, а ПАК 18/6 - лишь на 27%

По данным квазиупругого светорассеяния комплексоооразование сопровождалось появлением частиц, размер которых мог достигать нескольких сотен нанометров Так, при соотношении [ПАК]/[ООХ] = 0 3 ■■- 5 гидродинамический диаметр частиц составлял 600-900 нм

Состав комплексов был определен с помощью метода ультрафильтрации Растворы, содержащие ПАК и ООХ в разных соотношениях, пропускали через фильтры с диаметром пор 5 нм

Рис. 24 Зависимость концентрации не связанных в комплекс ООХ (1) и ПАК (2) от соотношения [ПАК]/[ООХ] РОХ]=40 мкМ, буфер 20 мМ НЕРЕБ, 5 мМ Трис, рН 7, 25° С

1 2 3 4 5 [ПАК]/[ООХ]

Молекулы ПАК и ООХ свободно проходили через такие фильтры, в то время как крупные частицы комплекса фильтрами удерживались Зависимости концентраций ООХ и ПАК в прошедших через фильтры растворах от соотношения <р=[ПАК]/[ООХ] представлены на рис 24

Видно, что по мере возрастания величины <р концентрация ООХ в фильтратах линейно убывала и затем достигала своего наименьшего значения (рис 24, кривая 1) Связывание ООХ в комплекс с ПАК завершалось при ср = фо Параллельные измерения концентрации ПАК в фильтратах

показали, что не связанная с ООХ поликислота обнаруживается лишь при ср > Фо (рис 24, кривая 2) Из этих наблюдений следовало, что в избытке ООХ с1 ним связывалась вся добавленная ПАК При этом только часть молекул ООХ связывалась с полианионом, формируя комплекс характеристического состава ф0 с максимальным количеством ионных контактов Очевидно, комплексообразование сопровождалось нейтрализацией зарядов макромолекул ПАК, что в свою очередь приводило к потере стабильности и агрегации частиц комплекса Значение ф0 для комплекса характеристического состава, определенное из данных рис 24, оказалось равным 1 6

3 3 Взаимодействие комплексов ПАК-ООХ с малыми электронейтральными липосомами

Ранее было показано, что свободный ООХ встраивается в липосомальную мембрану таким образом, что его часть, представленная системой конденсированных ароматических колец, погружается в гидрофобную часть липидного бислоя, а первичная аминогруппа экспонирована в водный (водно-солевой) раствор (С Неу\л/апд е1 а1 , 1998 ВюрЬуэ J 75, 2368) Можно было ожидать, что если ООХ, изначально включенный в комплекс с ПАК, будет встраиваться в липосомальную мембрану, то он будет располагаться в ней аналогичным способом Такое перераспределение, очевидно, должно сопровождаться нарушением стэкинг-взаимодействий между молекулами ООХ и увеличением интенсивности флуоресценции раствора

Действительно, при добавлении комплексов ПАК-ООХ к суспензии безградиентных липосом интенсивность флуоресценции возрастала и через несколько минут достигала своего максимального значения Возрастание концентрации липосом в системе приводило к заметному увеличению доли перешедшего в липосомальную мембрану РОХ

Что происходит с ПАК после перераспределения ООХ остается ли она связанной с ООХ или высвобождается во внешний раствор7 С помощью ультрафильтрационного подхода мы показали, что взаимодействие комплексов с безградиентными липосомами приводит к формированию тройных комплексов ПАК-ООХ-липосома Комбинацией методов квазиупругого светорассеяния и ультрафильтрации было показано, что средний размер частиц в системе после добавления липосом к раствору комплекса ПАК-ООХ уменьшается

Таким образом, частицы комплекса ПАК-ООХ при контакте с липосомами претерпевает существенные структурные перестройки Молекулы ЭОХ встраиваются в липосомальную мембрану, сохраняя при этом ионные контакты с макромолекулами ПАК (рис 25, I) Образующийся в результате тройной комплекс ПАК-ООХ-липосома стабилизирован гидрофобными взаимодействиями ООХ с липидной мембраной и электростатическими взаимодействиями ПАК и ООХ

3 4. Взаимодействие комплексов ПАК-йОХ с рН-градиентными лилосомами

Эволюцию комплексов при контакте с рН-градиентными везикулами мы также исследовали с помощью ультрафильтрационного подхода, описанного выше Образцы, в которых процесс накопления ООХ в липосомах вышел на стационарный уровень, были подвергнуты фильтрованию через мембраны с диаметром пор 5 нм, проницаемые для несвязанных в комплекс ООХ и ПАК Оказалось, что в полученном фильтрате обнаруживалось около 70% ПАК, введенной в систему, а йОХ полностью удерживался в составе комплекса с липосомами

Как следует из кинетических кривых, приведенных выше на рис 23А, увеличение соотношения [ПАКЭДООХ] в составе комплекса сопровождается увеличением конечного уровня флуоресценции ООХ в системе Полученные результаты показывают, что это связано с уменьшением количества антибиотика, проникшего в липосомы (рис 23А, кривые 3-5)

Долю проникшего в липосомы ООХ в отсутствие и присутствии ПАК можно оценить, основываясь на зависимости интенсивности флуоресценции ООХ от его концентрации в растворе Оказалось, что в отсутствие полимера в липосомы попадает около 91% введенного в систему ООХ, а в присутствии 1 6-кратного избытка ПАК (что соответствует характеристическому составу комплекса) количество проникшего в липосомы антибиотика снижается до 70% Остальные 30 % молекул ООХ в этом случае остаются сорбированными на мембране везикул Увеличение содержания полианиона в растворе до 50-кратного избытка по отношению к ООХ снижает долю проникшего в' липосомы антибиотика до 62% Следовательно, даже в присутствии избытка поликислоты большая часть ООХ способна проникать через мембрану (рис 25, II)

Таким образом, весь процесс можно рассматривать как конкуэенцию за взаимодействие с ООХ между полиакрилатным полианионом и кислым буферным раствором, разделенными в пространстве полупроницаемой липидной мембраной Довольно слабое влияние концентрации ПАК на количество проникшего в везикулы ООХ указывает на больше^ сродство антибиотика к кислому буферному раствору, находящемуся внутри липосом, по сравнению с полиакрилатным анионом |

Приводит ли образование тройного комплекса ПАК-ООХ-мембрана к возмущению липидного бислоя? К сожалению, наши данные не Дозволяют ответить на этот вопрос Скорее всего, глубина, на которую связанный с полимером ООХ погружается в липидную мембрану, недоста|гочна для значительного изменения ее структуры Однако тот факт, что даже, несмотря на высокое сродство к полимеру, значительная часть лекарства все же переходит внутрь липосом по градиенту концентрации незаряженюй формы свидетельствует о значительном взаимном влиянии мембраны V полимер-коллоидного комплекса

Рис 25 Схематическое представление событий, происходящих в системе ПАК-ООХ- липосомы

Полученные нами данные показывают, что электростатические комплексы полимера с низкомолекулярным лекарством отличаются высокой лабильностью и способны изменяться при взаимодействии с биологическими структурами Мы полагаем, что обнаруженные нами закономерности могут быть в дальнейшем использованы для создания« умных» полимерных конструкций, меняющих свою структуру в ответ на стимулы внешней среды

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида обладают в десятки раз меньшим сродством к липидным мембранам, чем полиэтоксилированные ПАВ, содержащие углеводородные радикалы в гидрофобной части Методами радиолигандного анализа впервые показано, что связывание сополимеров с клетками определяется составом клеточной мембраны и структурой полимера

2 Впервые установлено, что встраивание блока полипропиленоксида в липидную мембрану сопровождается компактизацией макромолекулы, те мембрана является «плохим» растворителем для полипропиленоксида

3 Впервые обнаружено, что встраивание блок-сополимеров в липидные мембраны приводит к уменьшению микровязкости бислоя и увеличению его проницаемости по отношению к слабым кислотам и основаниям, включая противоопухолевый антибиотик доксорубицин

4 Показано, что встраивание нейтральных амфифильных сополимеров в липидные мембраны приводит к резкому ускорению трансбислойной миграции (флип-флопа) липидных молекул Способность полимеров ускорять флип-флоп увеличивается с ростом гидрофобности полимера и размером его гидрофобного блока

-425 Впервые установлено, что взаимодействие амфифильных сополимеров на основе полипропиленоксида с искусственными липидными мембранами зависит от их состава и, в первую очередь, от микровязкости Полимеры имеют большее сродство к мембранам с более низкой микровязкостью Эта же закономерность выполняется и для клеточных мембран

6 Обнаружено, что адсорбция поликатионов на отрицательно заряженной липидной мембране приводит к увеличению ее проницаемости по отношению к незаряженной форме доксорубицина Возмущающее действие поликатионов на упаковку липидных молекул в мембране увеличивается с уменьшением среднего расстояния между заряженными группами на полимере, с увеличением степени полимеризации поликатиона и увеличением содержания анионных компонентов в мембране |

7 Впервые показано, что полиэлектролитные комплексы, полианионами и катионными лекарствами, способны взаимодействовать с ^ипидными мембранами, образуя тройные комплексы «полимер-лекарство-мембрана» Дальнейшая эволюция структуры этого комплекса зависит от свойств конкретной системы и в некоторых случаях сопровождается диссоциацией комплекса и проникновением высвободившегося лекарства через мембрану

Основные результаты автора по теме диссертации опублн следующих печатных работах

Обзорные статьи.

1 Melik-Nubarov N S . Krylova О О / The control oj membiane pt оретеs polymers // Chapter 5, In Advances in Planar Bilayers and Liposomes Lcitmannova and H T Tien Eds ) Elsevier. 2005 V 2. P 122-166

2 Yaroslavov. A A Melik-Nubarov NS Menger ГМ / Polvmei-Induced Biomembranes Acc Chem Res 2006 V 39. №10 P 702-710

кованы в

bv synthetic (A Ottova-

Fhp-Flop in

A S Melik-S Kdbanov

Оригинальные статьи.

Kabanov A V . Chekhonin V P . Alakhov V Yu Batrakova Г V Lebedev Nubarov,N S , Arzhakov S A I.evashov A V Moro/ov G V Sevenn Г VA / The neuroleptic activity of lialopeiidol inci eases aftei its solubilization in surfactant micelles Micelles as mici ocontainei s joi ch ¡it; toileting /'lT.BkLett 1989 V 258, № 2, P 343-345

Kabanov A V , Batrakova E V , Melik-Nubarov N b Г cdoseev N A Dorodnich Г Yu . Aldkhov V Yu , Chekhonin V P. Ndzarova I R . Kabanov V A / А нем class of chug earners micelles of poly(oxyethylene)-poly(oxypiop\lenc>l block copolymei s microcontamerifor drug targeting f> от blood m hi am // I Contr Release №22 P 141-158

Kdbanov A V Slepnev V 1 . Kuznetzova L h Batrakova Г V . Alakhov V Nubarov N S . Sveshnikov P G . Kabanov V A / Plutonic micelles as a tool foi Ion-molecular compound vector delivery into a cell effect of Staphylococcus aureus enleroloxtn В on sell loading with micelle mcoi pen cited fluoi escent the /' Biochemistry International 1992 V 26. № 5. P 1035-1042

Высоких M Ю , Гончарова H lO Журавлева А А Зорова Jl Д . Крас Кузьмииова А Е , Меликов К Ч . Мелик-HvGapoB Н С Самсонов А 1?

1992

as V 22

Yu . Melik-

иикои Ь Ф. Ьелоусоп

-43ВВ, Пршцепова АЕ, Зороп ДБ / Бечковые комплексы митохондриачьных контактных сайтов // Биохимия 1999 I 64 №4 С 390-398

7 Melik-Nubarov NS, Kozlov М Yu Evaluation ol partition coelficicnts ol low molecular weight solutes between water and micelles ol block copolymer ol ethylene oxide based on dialysis kinetics and fluorescence spectroscopy Colloid Polymer Sci 1998. V 276. №5 P 381-387

8 Mehk-Nubarov NS, FCo/lov M Yu / Investigation of Polyalkyle/ie Oxides Block Copolymer's Micelles Structure with Fluorscent Pi obes //Russian Polymer News 1998 V 4. № 3, P 30-37

9 Melik-Nubarov N S Рота/ О О Dorodnych I Yu Badun G Л Ksenofontov A L . Schemchukova О В . Arzhakov S A / Interaction of tumoi and noi ma I blood celh и nh ethylene oxide andpt opylene oxide block copolymers // 1-EBS Lett 1999 V 446. № 1 P 194-198

10 Ko7lova NO. Bruskovskaya IB Melik-Nubarov NS Yaroslavov Л A. Kabanov VA / Catalytic properties and confoi motion of Inchophohizcd a-clnmoti\psin mcoi pot cited into a bilayer lipid membrane // Б LBS Lett 1999 V 461. № 3 P 141144

11 Ko/lov M Yu . Melik-Nubarov N S . Batrakova E V Kabanov Л V / Relationship between pluronic Block Copolymer Slructwe cilticcil micellizotion concentration and partitioning coefficients of low molecular mass solutes // Macromoltcules 2000 V 33 №9. P 3305-3313

12 Kozlova N О , Bruskovskaya 1 В Okuneva 1 В . Melik-Nubarov N S Yaroslavov Л Л Kabanov V A . Menger Г M / Jntei action of a caltomc pohmei with negatnelv charged ptoteoliposomes //Biochim Biophys Acta2001 V 1514.№1.P 139-151

13 Lrukova V Yu. Krylova OO. Antonenko Yu N Melik-Nubarov NS / Effect of ethylene oxide and propylene oxide block copolymei s on the permeabtlih of bilayei lipid membranes to small solutes including doxoiubicin //Biochim Biophys Acta 2000 V 1468 № 1-2 P 73-86

14 Крылова О О Демина 1 В Мелик-11убаров НС / Вшяпие бюк-сопочимероь an к ипеноксидоа на проницаемость пипидпых мембран возможные причины биочогической активности //Доклады Академии 11аук Химия 2001 I 380 №3 С 267-271

15 Antonenko YN, Bonsenko V, Melik-Nubarov NS. Kotova Б A Woolley G A / Polyamons decelerate the kinetics of positively chai ged gramicidin channels as shown by sensitized photoinactivation //Biophys J 2002 V 82. №3 P 1308-1318

16 Yaroslavov A A , Udalykh О Yu . Mehk-Nubarov N S Kabanoy V A hrmakov Y A A/ov VA. Monger ГМ / Conventional and gemim suifaclanls embedded мilhm bilayer membranes contrasting hehavioi //Chemistry A European I 2001 V 7. № 22 P 4835-4843

17 Мальцева LA Антоненко Ю H Мелик-Нубаров 11 С . Ягужииский Jl С / Вшяпие синтетических амфифильных по.шапионоь на транспорт ионос, через пчоскую бисчойную чипидную мембрану // Биочо! ические мембраны 2002, Г 19 № 5 С 347-350

18 Krylova О О Melik-Nubarov N S Badun GA Kscnolontov A L, Menger E M. Yaroslavov A A / Pluronic L61 accelerates flip-flop and tiansbilaxer doxoiubicin permeation //Chemistry A European Journal 2003 V 9 № 16 P 3930-3936

19 Yaroslavov A A. Kuchenkova О Ye. Okuneva IB Melik-Nubarov NS. Ko/lova NO Lobyshev VI Menger БМ Kabanoy VA / Effect of polylysme on

// Biochim

ibarov N S / 2003 V 125.

/ Membrane 16 P 6796-

Doxorubicm-

transformations and permeability of negative vesicular membranes Biophys Acta 2003 V 1611 №1-2 P 44-54

20 Menger Г M Seredyuk V A Kitaeva M V Yaroslavov Л A . Mclik-N Migration of Poly-L-lysme through a Lipid Bdaver // J Am Chem Soc № 10 P 2846-2847

21 Kitaeva M V , Melik-Nubarov N S Menger. F M Yaroslavov. Л A Transport of a Polyacid-Tied Doxorubicin // Langmuir 2004 V 20. № 6799

22 Kitaeva M V Melik-Nubarov N S Menger Г M Yaroslavov A A / Polyfacrylic acid) Complexes Interaction with Liposomes // Langmuir 2004, V 20 № 16, P 6575-6579

23 Deirnnd T, Grozdova 1, Krylova О Zhirnov A lstralo\ V I re> H Kautz H Melik-Nubarov N / Relationship between the structure of ampliiphilic topohmers and their ability to disturblipid bilayers //Biochemistry 2005 V 44 № 10 P 4042-4054

24 Китаева MB, Мелик-Нубаров НС Ярославов АЛ / Мембранный транспорт доке орубицина включенного в состав компчексоь с гиОрофогп13ованиыми ио/шаниоиемш//Биологические мембраны 2005 Т 22 № 2 С 118-125

25 Беркович А А , Мелик-Нубаров НС/ Взаимодействие потакриловс бислойпыми мембранами из фосфатидилхочипа (, аабокиа Биологические мембраны 2005, Г 22 № 4 Р 370-377

26 Соловьева А Б , Мелик-Нубаров Н С , Аксенова II А 1 лаютсв Н I ГВ. Бугрин ВС, Лузгина ВН, Ольшевская В А Бслкова Г В триптофана порфириновыми фотосенсбилизаторами соиобилиЗ> мицеччах ппюроников //Ж физич химии 2006 Т 80 №1.С 124-131

27 Pashkovskaya Л Л , Lukashev Е Р Antonov Р Е Finogenova ОЛ E-makov Y А Melik-Nubarov N S, Antoncnko YN / Grafting of polvhsme with pohethyleiwxidc prevents demixing of O-pyromellitylgi amitidm in lipid memhi anes h liioclum Biophvs Acta 2006 V 1758, № 10, P 1685-1695

28 Valeeva Y К , Dorodnykh T Y , Alexandrova N A Zubin L M kalhalova A V Volkov E M Gottikh M В , Melik-Nubarov N S / Block copolymer of poly-(2-dimethylamino+ethyl melhacnlate) for dehveiy of oligonucleotide tells //) Drug Deliv Sci Technol 2006 V 16 №4.P 245 -251 I

29 Pavlov D N . Alexandrova N A , Krylova О О Pohl P Melik-Nubarov N S / Effect of block architecture on the ability ofpohalkvlene oxides to overcome multidrug resistance of tumor cells //J Drug Deliv Sci 'lechnol 2006 V 16 №4 P 259-265

30 Zhirnov А С , Demina Г V Krylova О О Grozdova I D Melik-NubarcW N S / Lipid composition determines interaction of liposome membranes with Plw Biochim Biophys Acta 2005 V 1720 № 1-2 P 73-83

31 Жирпов AC. Павлов ДН Демина Г В Бадуп Г"А Грозлова Пубаров НС / Влияние строения бчок-сопочимеров лтц>

и кисчоты с loii среде //

, Веювский

/ Окисление оваиными л

Pluronics and s into tumor

ionic L61 //

-1Д Мелик-lenokcuda и

пропиленоксида на их взаимодействие с биологическими меиорана\т Высокомолек соед Серия А 2006 Т 48 № 11 С 2023-2033 32 Бугрин ВС, Козлов МЮ, Баскип ИИ Мечик-Н\баров НС Межмолекулярные взаимодействия опредечяющие сочюбилизшрпЬ полиалкиленоксидных ПАВ II Высокомолек Соеч Серия А 2007. 12

//

/

б мицепеп 49 №4 С 1-

Тезисы докладов

33 Melik-Nubarov N S Kozlov MYu / Role of hydiogen bonding in the interaction о/ hydroxyl-contaimng substances with pluronic copolymer micelles II Proceedings ol Symposium on Lipid and Surlactant Dispersed Systems. Moscow 1999. September 2628 P 71-72

34 Korobova N О , Bruskovskaya 1 В . Melik-Nubarov N S . Yaroslavov A A / The interaction of polycations with protein-containing liposomes II Proceedings ol Symposium on Lipid and Surfactant Dispersed Systems Moscow 1999 September 2628 P 75-76

35 Pomdz OO, Melik-Nubarov NS Dorodnych Л Yu Ar/hakov S A / Inteiaction о/ ethylene oxide and propylene oxide block copolymers mill lipid bilcnei membianes II Proceedings of Symposium on Lipid and Surlactant Dispersed Systems Moscow 1999 September 26-28, P 77-78

36 7orov D В Vyssokych M Yu Dobrov F 1 /huravleva Л V Zorova L D lsa|cv N К Krasnikov В Г . Kuzminova А П Melik-Nubarov N S Polyakova I Л Prischepova Л E / Interaction of polvamons with mitochondria 11 Abstracts of The II Symposium ol Rissians Biophysiuans. Moscow. 1999 p 237-238

37 Krylova О О Erukova V Yu .Antoncnko Yu N Melik-Nubarov N S / Polyalkylcneoxides block copolymers (pluronics) increase permeability ol bilayers to doxorubicin Int Bunsen Discussion Meeting "Interactions ol biopolymeis with model membranes' I lalle (Germany) 2000 Abstracts P 48

38 N О Kozlova. 1 В Bruskovskaya I В Okuneva N b Melik-Nubaro\ А Л Yaroslavov

Adsorption ol the synthetic polycation onto protein-containing and protein-lrcc liposomes . Int Bunsen Discussion Meeting 'Interactions ol biopolymers with model membranes Halle (Germany) 2000. Abstracts. P 48

39 Melik-Nubarov N S , Krylova О О . Kozlo\a N О . Okuneva 1 В . Demina T V . Kitaeva MV Yaroslavov A A and Menger Ь M International Conlerence Polymerwerkstolle 2000 (Halle/Saalc, 25-27 September, 2000) Lllect of water-soluble synthetic polymers on the permeability of liposome membranes l agungsband, I' 508

40 N S Melik-Nubarov, A H Islamov. О О Krylova TV Demina GN Boborykina Л1 Kuklin, Yu N Antonenko V 1 Gordeliy / Influence of Ethylene Chide and Propylene Oxide Block Copolymers on the Permeability and Striicluial Oi conization о/ Lipid Membranes IIRussian-German Meeting, 4 Dubna Apnl 21-23 2001

41 Кугрии ВС Козлов МЮ Мелик-Пубаров НС / Рои. <,одоро<)ны\ связей дчя со мобилизации низкомопекулярных соединений a viiuenax тюроникоа // Россииско-Украипскии Симпозиум по высокомолекулярным соединениям 27-30 октября 2001 г . Донецк

42 Окунева И Б Жирнов А Е Козлова Н О Ярославов А А Мслик-Нубаров Н С / Вчияние поликатионов на транспорт доксорубнцина через моОечыпчо чшгиОтю мембрану II Российско-Украинскии С импошум но высокомолекулярным соединениям, 27-30 октября 2001 i Донецк

43 Demina I , Alexandrova N , Grozdova I Krylova О , Melik-Nubarov N Istratov V Pohl P Kautz H and Frey H / Polyglycerol-Based Copolymers ¡netease the Permeability of Model Lipid Membranes and Cause Chemosensitization of Multi-Drug esistant Tumour Cells //Furopolymer Congress, Stockholm Sweden lune 23-28 2003

-4644 Bugrin V S . Krylova О О . Kozlov M Yu Melik-Nubarov N S / Effect of Pluronii L6I on the permeation of amino acid derivative's through mode! lipid membranes i ole of H-honding ability of the permeant II Europolymcr Congress Stockholm Sweden. June 2328 2003

45 Жирнов AF, Мелик-Нубаров НС / Вчияние тюроиика ни проницаемость модечьной мембраны в зависимости от ее типичного состава // Тезисы 111 Всероссийской Каргинской конференции «Г1олимеры-2004» i Москва. 27 январи - I февраля 2004 года Том 2, cip 264

46 Павлов ДН, Черникова ЬВ. Мелик-1 Кбаров ПС / Почучепие приьитых сопочимеров проксаноча и акрнчамида методом RAFT-no шмеризииш) и их вчияние ни проницаемость липидных мембран //4 Международная конференция Химия высокоорганизованных веществ и научные основы панотечнолщ ии С-Петербур! Россия, июнь 28 - июль 2 2004

47 Kyi рип ВС Козлов МЮ Мелик-Нубаров ПС / Со'иоби ппаиия плюроника вклад различных типа/, \ю тскутярных ьзашюдейс Международная конференция Химия высокоорганизованных вещееiи и научные основы нанотехночогии С-Пе1ербур| Россия июнь 28 - июль 2 2004'

48 Ьугрин ВС Мелик-Нубаров НС / Причины повышения проницаемости чипидного бис поя в присутствии тюроников II 4 Международная конференция Химия высокоорганизованных bciuccib и научные основы папою Петербур!. Россия, июнь 28 - июль 2 2004

49 Demina TV Krylova ОО, Kaut/ H , Melik-Nubarov N S I re\ II 14 copolymei induced МЛУ reversal leuilt of facilitated c\tostahca tiarv

б иицеччих пыт h 4

ноло! ии С -

hi P / Block iport through

Relationship to cause е;исы 49-го

ucul with

membianes or of increased ion petmeability? // Гсзисы 49-го международною биофизическо! о конгресса Лонг Бич США 2005

50 Demina TV Melik-Nubarov N S . Slill A A I re\ H Pohl P Pohll I , between structure of amphiphihc copolymers and their abilit cliemosensitizcition of multi-drug lesistant turnout cells 4 международного биофизического кош pecca Лош Ьич США 2005

51 Беркович АК, Мелик-Нубаров НС / Intei action of pol\aci\lic phosphatidylcholine liposomes in slightly acidic milieu // I e ¡исы 5-ю международного симпозиума "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems Россия. Санкт-Петербург, 20-24 июня 2005 г

52 Беркович АК, Мелик-Нубаров НС / Природа взаимодействия по шинионоь с мембранами построенными из фосфатидичхошна /у 1 езисы XII Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем Россия республика Марий-Эл 27 июня -1 июля 2005 i

53 Zhirnov AC Demina TV. Krylova OO. Gio/do\a ID Melik-fjJubarov NS Influence ol lipid membrane composition on its interaction with Pluronii // Abstracts book ol 30th FEBS Congress - 9th IIJBMB Conleicnie. Budapest lluneary 2nd-7th July. 2005.1 hBS Journal 272 (si) 244-245

54/.lurnov At. Demina TV, Melik-Nubarov NS Gro/dova ID / МетЫапе Composition Influences Pluromc-mduced TranspoiI of Antitiimoiii Diu^s //Abstracts book ol I5lh IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress /jugust 27th -September 1st 2005, Montpellicr. Trance. Luropean Biophysics lournal with Biophysics I cltcrs 34 (6) 809

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 177 Тираж 300 экз

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура и основные физические характеристики липидных мембран.

2.1.1. Развитие представлений и современные взгляды на структуру и функции биологических мембран.

2.1.2. Структура липидных молекул и фазовые равновесия в мембранах.

2.1.3. Модели биологических мембран.

2.1.4. Кривизна бислоя и свободная энергия его деформации.

2.1.5. Дефекты в биологических мембранах.

2.1.5.1. Классификация дефектов.

2.1.5.2. Свободный объем мембраны как количественная мера степени дефектности.

2.1.5.3. Дефекты в мембранах как области повышенной чувствительности к действию инородных компонентов.

2.1.6. Домены в липидных мембранах.

2.1.7. Подвижность липидных молекул в мембранах.

2.1.7.1. Латеральная диффузия.

2.1.7.2. Трансбислойная миграция (флип-флоп).

2.1.7.3. Изменение скорости флип-флопа липидов под действием природных и синтетических эффекторов.

2.1.8. Микровязкость мембранных структур.

2.1.8.1. Использование флуоресцентных зондов для исследования физического состояния биологических мембран.

2.1.8.2. Изменение микровязкости мембран под действием экзогенных эффекторов.

2.1.9. Электрические свойства липидных мембран.

2.1.10. Проницаемость мембран.

2.1.10.1. Проницаемость мембран для незаряженных соединений.

2.1.10.2. Ионная проницаемость мембран.

2.2. Взаимодействие водорастворимых полимеров с биологическими мембранами„.

2.2.1. Нейтральные гидрофильные полимеры.

2.2.1.1. Полиэтиленоксид: конформация в растворе и взаимодействие с мембранами.

2.2.1.2. Гидрофильные поливиниламиды и полиакриламид.

2.2.1.3. Полимеры, содержащие гидроксильные группы (поливиниловый спирт, декстраны и фруктаны): взаимодействие с липидными мембранами и клетками.

2.2.2. Амфифильные гомо- и сополимеры.

2.2.2.1. Амфифильные производные гидрофильных полимеров, содержащие статистически или равномерно распределенные короткие гидрофобные радикалы.

2.2.2.2. Биогенные амфифильные интерполимерные комплексы поли-Я-З-окси-бутирата и полифосфата: биологическая функция, структура и влияние на проницаемость мембран.

2.2.2.3. Поверхностно-активные вещества, состоящие из гидрофильных полимеров и углеводородов.

2.2.2.4. Амфифильные полиалкиленоксиды.

2.2.2.4.1.Синтез, номенклатура и физико-химические свойства полиалкиленоксидов.

2.2.2.4.2.Взаимодействие плюроников с белками.

2.2.2.4.3. Взаимодействие плюроников с липидными структурами.

2.2.2.4.3.1. Связывание плюроников с бислойными мембранами и их локализация в бислое

2.2.2.4.3.2. Влияние плюроников на проницаемость липидных мембран.

2.2.2.4.4. Медицинское применение плюроников.

2.2.2.4.4.1. Использование плюроников в медицине в качестве эмульгаторов.

2.2.2.4.4.1. Использование плюроников в медицине в качестве эмульгаторов.

2.2.2.4.4.2. Использование антиадгезивных свойств плюроников для гидрофилизации полимерных поверхностей.

2.2.2.4.4.3. Влияние плюроников на распределение латексных частиц и низкомолекулярных соединений между различными органами.

2.2.2.4.4.4. Взаимодействие плюроников с компонентами иммунной системы.

2.2.2.4.4.5. Влияние плюроников на функции биологических систем.

2.2.2.4.4.6. Использование надмолекулярных ассоциатов плюроников для доставки лекарственных препаратов к очагу поражения.

2.2.2.4.4.7. Множественная лекарственная устойчивость опухолей и ее преодоление с помощью плюроников.

2.2.3. Полиэлектролиты.

2.2.3.1. Закономерности адсорбции полиэлектролитов на мембранах.

2.2.3.1.1. Адсорбция полиэлектролитов на твердых поверхностях и липидных везикулах, находящихся в гель-фазе.

2.2.3.1.2. Взаимодействие полиэлектролитов с липидными мембранами, находящимися в жидко-кристаллической фазе.

2.2.3.1.2.1. Взаимодействие полиэлектролитов с мультиламеллярными липосомами.

2.2.3.1.2.2. Взаимодействие полиэлектролитов с мембранами преформированных малых и больших везикул.

2.2.3.1.2.3. Взаимодействие полиэлектролитов с гигантскими липосомами.

2.2.3.1.2.4. Взаимодействие полиэлектролитов с мембранами, содержащими белок.

2.2.3.2. Влияние полиэлектролитов на динамические процессы в мембранах.

2.2.3.3. Биологические эффекты полиэлектролитов и их использование в био-медицинских исследованиях.

2.2.3.3.1. Взаимодействие поликатионов с биологическими мембранами.

2.2.3.3.2. Биологические эффекты, вызываемые полианионами.

2.2.3.3.3. Использование полиэлектролитов как носителей для доставки лекарств.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Взаимодействие нейтральных амфифильных полимеров с биологическими и липидными мембранами.

4.1.1. Связывание полимеров с биологическими и липидными мембранами.

4.1.1.1. Получение полимеров, меченых тритием.

4.1.1.2. Связывание полимеров с клетками.

4.1.1.2.1. Выделение клеток.

4.1.1.2.2. Кинетика связывания.

4.1.1.2.3. Оценка количественных параметров связывания полимеров с клетками.

4.1.1.3. Связывание полимеров с микросомамальными мембранами.

4.1.1.3.1. Выделение микросомальных мембран печени мыши.

4.1.1.3.2. Определение количественных параметров связывания плюроника Р85 с микросомальными мембранами.

4.1.1.4. Связывание полимеров с липидными везикулами (липосомами).

4.1.1.5. Изучение локализация полиалкиленоксидов в бислойных мембранах методом малоуглового рассеяния нейтронов.

4.1.2. Влияние полимеров на свойства липидных мембран.

4.1.2.1. Влияние полимеров на микровязкость клеточных и модельных мембран.

4.1.2.2. Влияние плюроника L61 на скорость флип-флопа в модельных липидных мембранах.

4.1.2.3. Взаимосвязь между структурой амфифильных сополимеров и их способностью ускорять флип-флоп в липидных мембранах.

4.1.2.2.4. Влияние плюроников на транспорт ионов через липидные мембраны.

4.1.2.2.5. Влияние амфифильных сополимеров на проницаемость липидных мембран по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину.

4.1.2.2.5.1. Определение количественных параметров взаимодействия доксорубицина с

ДНК и липидными мембранами.

4.1.2.2.5.2. Кинетика транспорта доксорубицина через мембраны моноламеллярных липосом.

4.1.2.2.5.3. Влияние плюроника L61 на транспорт доксорубицина через мембраны липосом

4.1.2.2.5.4. Взаимосвязь между структурой амфифильных полимеров и их воздействием на транспорт доксорубицина через модельные мембраны.

4.1.2.2.6. Влияние плюроника на транспорт различающихся по своей структуре соединений.

4.1.2.2.7. Влияние состава липидного бислоя на его чувствительность к возмущающему действию плюроника.

4.1.2.3. Физико-химические предпосылки возмущающего действия амфифильных полимеров на свойства мембран.

4.2. Поликатионы.

4.2.1. Влияние поли-(1Ч-этил-4-винилпиридина) на проницаемость липосомальных мембран по отношению к доксорубицину.

4.2.2. Влияние молекулярной массы и химической структуры поликатиона на его способность ускорять транспорт доксорубицина через отрицательно заряженные липидные мембраны.

4.2.3. Зависимость вызываемого поликатионами увеличения проницаемости мембран, от содержания в них анионных липидов.

4.2.4. Влияние низкомолекулярного электролита на оказываемое поликатионом ускорение мембранного транспорта доксорубицина.

4.2.5. Влияние природы анионных компонентов мембраны на ее взаимодействие с поликатионами.

4.2.5.1. Взаимодействие поли(Ы-этил-4-вининилпиридиний бромида) с липидными везикулами, содержащими ганглиозид GM1.

4.2.5.2. Взаимодействие поли(Ы-этил-4-вининилпиридиний бромида) с липидными везикулами, содержащими искусственно гидрофобизованный а-химотрипсин.

4.2.6. Причины воздействия поликатионов на проницаемость липидных мембран.

4.3. Полианионы.

4.3.1. Влияние полиакриловой кислоты на транспорт доксорубицина через липидную мембрану.

4.3.2. Связывание полиакриловой кислоты с доксорубицином.

4.3.2.1. Изменение свойств доксорубицина при взаимодействии с полиакриловой кислотой.

4.3.2.2. Состав комплексов доксоорубицина с полиакриловой кислотой.

4.3.2.3. Стабильность комплексов.

4.3.2.4. Стабилизация комплексов за счет гидрофобной модификации поликислоты.

4.3.3. Взаимодействие комплексов доксорубицина и полиакриловой кислоты с липосомами.

4.3.3.1. Взаимодействие комплексов с безградиентными липосомами.

4.3.3.2. Механизм взаимодействия комплексов с рН-градиентными везикулами.

4.3.4. Влияние комплексов полиакриловой кислоты и доксорубицина на ионную проницаемость липидных мембран.

Липидные мембраны играют ключевую роль в регуляции биохимических процессов, происходящих в живых организмах [1]. Поэтому исследование структурной организации липидных мембран и факторов, влияющих на их свойства, вызывают неослабевающий интерес. Известно, что при взаимодействии некоторых водорастворимых белков с биологическими мембранами происходит пермеабилизация мембран, латеральная сегрегация их компонентов, а иногда и слияние мембран [2]. Для выяснения физико-химической основы этих процессов большое значение имеют модельные работы, суть которых состоит в изучении взаимодействий в более простых системах с контролируемым составом [3]. В качестве одной из таких моделей часто исследуется взаимодействие бислойных мембран, построенных из синтетических или очищенных природных липидов, и синтетических полимеров, обладающих известным строением.

Взаимодействие водорастворимых полимеров с биологическими мембранами представляет и самостоятельный интерес. Во-первых, за последние два десятка лет предложен целый ряд подходов, открывающих перспективы использования водорастворимых полимеров в медицине и биотехнологии. Так, свойство некоторых полиэлектролитов усиливать иммунный ответ нашло применение при создании искусственных вакцин [4, 5]. Способность поликатионов образовывать прочные комплексы с нуклеиновыми кислотами и облегчать их проникновение в клетку нашло применение при конструировании реагентов для трансфекции [6-8]. Наконец, способность некоторых амфифильных сополимеров ингибировать мембранные переносчики и облегчать проникновение лекарств в живые клетки, нашла применение для создания новых лекарственных форм хемотерапевтических препаратов, эффективных против опухолей, проявляющих множественную лекарственную устойчивость [9, 10]. Наконец, «инертные» водорастворимые полимеры предлагается использовать в качестве носителей для создания «умных» конструкций для контролиуемого введения лекарственных препаратов [10-12].

Вторая область, обусловливающая большой интерес к исследованию взаимодействия полимеров с липидными мембранами находится в сфере наук о материалах. Развитие нанотехнологий, имеющих своей целью конструирование электротехнических устройств молекулярных размеров, стимулировало исследование липидных мезофаз и монослоев как природной высоко ориентированной среды, которую можно использовать для организации молекулярных ансамблей, выполняющих специфические функции. Адсорбция водорастворимых полимеров на таких липидных плёнках позволяет создавать структуры, которые рассматриваются как прообразы «нанопроводов» [13-14] и других устройств молекулярных размеров.

Еще одна практическая область, требующая всестороннего изучения закономерностей взаимодействия водорастворимых полимеров с липидными мембранами, лежит в области анализа. Оказалось, что ориентированные липидные моно- или бислои, сформированные на твердых подложках, могут быть удобной основой для создания датчиков, способных определять концентрацию веществ в омывающей их среде. Так же, как и в предыдущем случае, данные по взаимодействию полимеров с липидными мембранами могут позволить конструировать молекулярные ансамбли на поверхности электрохимических сенсоров [15].

К настоящему времени накоплен значительный материал, касающийся взаимодействия полимеров с липидными бислоями. Так, подробно исследованы закономерности образования комплексов полиэлектролитов с противоположно заряженными липидными мембранами. Исследованы структурные перестройки в мембранах, сопровождающие адсорбцию на их поверхности полиэлектролитов, и изменения в конформации полимеров, происходящие при образовании таких комплексов [16-19]. Исследовано взаимодействие некоторых полимеров с клеточными мембранами и изучены некоторые биохимические феномены, сопровождающие адсорбцию полимера [6, 9-10]. Обсуждаются различные пути взаимодействия биополимеров с мембранами и механизмы их воздействия на проникновение нуклеиновых кислот в клетки [7, 8]. Методы молекулярной динамики, бурно развивающиеся в последнее время, вслед за повышающимся уровнем вычислительных средств, позволяют по-новому взглянуть на процессы взаимодействия полимеров с мембранами [20]. В то же время остается ряд существенных вопросов, не получивших развития в литературе.

Несмотря на то, что закономерности, управляющие адсорбцией поликатионов на биологических мембранах, исследованы достаточно подробно, остается неизвестным по отношению к каким из компонентов биологических мембран, анионным липидам или белкам, поликатионы проявляют большее сродство.

Известно, что адсорбция поликатионов на противоположно заряженных липидных мембранах приводит к значительным структурным перестройкам в бислое, однако существенного воздействия на ионную проницаемость мембран эти перестройки не оказывают [18,19]. В то же время остается неисследованным вопрос, влияют ли изменения в латеральной организации мембран на их проницаемость по отношению к незаряженным соединениям, способным проникать через бислой по механизму растворения-диффузии.

Воздействие амфифильных блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (плюроииков) с биологическими мембранах приводит к увеличению накопления лекарства в клетках. Показано, что этот эффект достигается за счет ингибирования белковых переносчиков, осуществляющих выброс лекарства из клеток. В то же время вопрос о взаимодействии полимера с липидной частью биологической мембраны остается неисследованным. В частности, отсутствуют количественные данные о связывании этих полимеров с липидными мембранами, и неизвестно, приводит ли адсорбция полимера к структурным изменениям в липидной части биологической мембраны.

Известно, что многие амфифильные сополимеры Снеионные ПАВ) сильно различаются по своему воздействию на липидные мембраны. В то же время причины различий в действии различных амфифилов и взаимосвязь между их структурой и степенью воздействия на барьерные свойства мембран остаются до сих пор не ясными.

Неизвестной остаётся также и взаимосвязь между составом липидной мембраны и сродством полимеров к такой мембране.

Полиэлектролитные комплексы полианионов с биологически активными соединениями активно исследуются в медицине и фармакологии как лекарственные формы для пролонгирования действия медицинских препаратов. Неисследованными остаются вопросы, могут ли такие комплексы взаимодействовать с липидными мембранами, и может ли лекарство, включенное в состав таких конструкций, проникать через мембрану.

Для ответа на эти вопросы в настоящей работе будет рассмотрено взаимодействие водорастворимых полимеров с бислойными липидными мембранами. Такое взаимодействие возможно за счет зарядовых, гидрофобных, водородных или дипольных взаимодействий. Бислойная мембрана, построенная из фосфолипидов и стеролов, представляет собой жидкокристаллическую структуру с пространственно разделенными гидрофобной областью (областью остатков жирных кислот - рис. 1 (3)), областью, содержащей протоноакцепторные группы (область глицериновых остатков - рис. 1 (2)) и областью, содержащей заряженные группы (область полярных головок - рис. 1 (1)).

Кардиолипин рис. ]. формулы фосфолипидов р®

Фосфатидилхолин и схематическое изображение липидного бислоя. Стрелками показаны три области липидного бислоя: 1 - область остатков жирных кислот; 2 - область глицериновых остатков; 3 область полярных головок.

Введете

Можно ожидать, что полимеры, обладающие гидрофобными группами, будут заглубляться в область остатков жирных кислот, а катионные полимеры будут взаимодействовать с полярными головками анионных липидов. Наконец, анионные полимеры, не взаимодействующие с отрицательно заряженным бислоем в нейтральной среде, могут образовывать комплексы с лекарствами, влияя тем самым на их проникновение. Исходя из этого, в настоящей работе мы остановимся на рассмотрении трех основных групп водорастворимых полимеров. При этом будут рассмотрены закономерности, управляющие адсорбцией этих полимеров на липидных мембранах, и вызываемые этими полимерами структурные перестройки в бислое. Помимо этого, будет рассмотрено влияние этих полимеров на проницаемость липидных мембран по отношению к малым ионам и незаряженным соединениям.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы заряженными группами на полимере, с увеличением степени полимеризации поликатиона и увеличением содержания анионных компонентов в мембране.

7. Впервые установлено, что полимер-коллоидные комплексы, образуемые полианионами и катионными лекарствами, способны взаимодействовать с липидными мембранами, претерпевая при этом ряд структурных перестроек, которые приводят к уменьшению размеров коллоидных частиц. В случае использования рН-градиентных липидных везикул, обеспечивающих большой трансмембранный градиент химического потенциала, контакт комплекса с мембраной приводит к его диссоциации, причем лекарство проходит через мембрану, а полимер мигрирует во внешний раствор.

Заключение коформационной подвижности полипропиленоксидного блока, встроенного в липидный бислой, приводит к компенсаторному повышению энтропии мембраны, что выражается в понижении ее микровязкости, увеличении скорости трансбислойной миграции липидов (флип-флопа) и повышению проницаемости по отношению к слабым кислотам и основаниям. В том числе, показано, что полимеры увеличивают проницаемость мембран по отношению к противоопухолевым антибиотикам. При этом даже небольших количеств встроенного в мембрану полимера оказывается достаточно, чтобы вызвать многократное увеличение подвижности мембранных компонентов. Оказалось, что сродство полимера к мембране и его способность нарушать мембранную структуру зависит от состава бислоя и, в первую очередь, его микровязкости. Корреляционный анализ взаимосвязи между структурой полимера и его способностью ускорять флип-флоп показал, что активность полимера определяется его общей гидрофобностью, определяющей сродство липида к мембране, и объемом гидрофобного блока, который является мерой способности полимера нарушать упаковку липидных молекул. Полученные результаты не только показывают, что механизм действия амфифильных полимеров связан с компактизацией полимерного клубка при его встраивании в мембрану, но также позволили сформулировать требования к структуре полимера, существенные для его способности разупорядочивать липидную упаковку мембраны.

Исследование влияния поликатионов на проницаемость отрицательно заряженных липидных мембран по отношению к противоопухолевому антибиотику доксорубицину показало, что и эти полимеры ускоряют его транспорт. При этом степень воздействия поликатиона сильно возрастала с увеличением содержания анионного компонента в мембране и сильно зависела от молекулярной массы и химической структуры поликатиона. Зависимость влияния поликатиона от его степени полимеризации была подробно исследована на примере полилизина, и имела сложный характер: полимеры с низкой степенью полимеризации вообще не влияли на транспорт антибиотика, а дальнейшее увеличение степени полимеризации от 15 до 100 приводило к плавному росту эффективности действия полимера. Сравнение катионных полимеров различной химической природы позволило установить, что их воздействие на транспорт доксорубицина через отрицательно заряженные мембраны сильно возрастает с уменьшением расстояния между заряженными группами в полимере. Данный результат позволяет предполагать, что способность поликатионов облегчать транспорт нуклеиновых кислот в клетки должна увеличиваться с повышением плотности катионных групп в макромолекуле.

Исследуя воздействие полианионов на мембранный транспорт доксорубицина, мы обнаружили, что катионные лекарства образуют комплексы с полианионами, которые способны адсорбироваться на липосомальных мембранах. В результате такого взаимодействия размер коллоидных частиц комплекса уменьшается, а докосрубицин встраивается в липидную мембрану. В том случае, если внутрь липосом помещается кислый буферный раствор, что способствует накоплению катионного антибиотика внутри везикул, взаимодействие комплекса с такими везикулами приводит к его частичной диссоциации. Свободный полианион при этом высвобождается во внешний раствор, а антибиотик попадает внутрь везикул. Таким образом, использование модельной системы, основанной на рН-градиентных липосомах, позволило выявить существенные аспекты взаимодействия полимер-коллоидных комплексов с липидными мембранами. Полученные результаты открывают перспективы для направленного синтеза анионных носителей для лекарственных соединений и получения стимул-чувствительных полимерных конструкций.

Таким образом, результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что синтетические полимеры являются удобным инструментом, позволяющим целенаправленно влиять на свойства липидных мембран, изменяя их проницаемость, микровязкость, латеральную и трансмембранную организацию. При этом сформулированные в работе требования к структуре макромолекул открывают перспективы для целенаправленного синтеза полимеров, способных модулировать активность лекарственных соединений.

1. Sackmann E.IBiological Membranes Architecture and Function. //In.: Handbook of Biological Physics, Ed. by R. Lipowsky and E. Sackmann, V. 1, Elsevier S.cience, 1995. P. 1-64.

2. Leabu M. / Membrane fusion in cells: molecular machinery and mechanisms ILL Cell Mol. Med. 2006. V.10. P.423-427.

3. Lentz B.R., Lee J.K. / Polyethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?// Mol. Membr. Biol. 1999. V.16. P.279-296.

4. Kabanov V.A. / Synthetic membrane active polyelectrolytes in design of artificial immunogenes and vaccines. //Makromol. Chem. Macromol. Symp. 1986. V.l. P. 101-124.

5. Kabanov A.V., Kabanov V.A JDNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells.// Bioconjug. Chem. 1995. V. 6. P. 7-20.

6. Behr J.P., Demenix В., Loeffer J.-P., Perez-Mutul J. / Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6982-6986.

7. Kabanov A.V., Batrakova E.V., Alakhov V.Yu JPluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer.// Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 759-779.

8. Kabanov A.V., Batrakova E.V./ New technologies for drug delivery across the blood brain barrier.// Curr. Pharm. Des. 2004. V. 10. P. 1355-1363.

9. Galaev I.Y., Mattiasson B. / 'Smart' polymers and what they could do in biotechnology and medicine. // Trends Biotechnol. 1999. V.l7. P. 335-340.

10. Alexander CJTemperature- and pH-responsive smart polymers for gene delivery.!7 Expert Opin. Drug Deliv. 2006. V. 3. P.573-581.

11. Hannah К. C., Armitage B. AJDNA-Templated Assembly of Helical Cyanine Dye Aggregates: A Supramolecular Chain Polymerization.!7Acc. Chem. Res. 2004. V. 37. P. 845853.

12. Banerjee S., Dan A., Chakravorty D./ Synthesis of conducting nanowires. //J. Mat. Sci. 2002. 37. 4261 -4271.

13. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D.J./ Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective.!I Biochem. Cell Biol. 1998. V. 76. P. 452-464.

14. Knoll W., Schmidt G., Rotzer H., Henkel Т., Pfeiffer W., Sackmann E., Mittler-Neher S„ Spinke J.I Lateral order in binary lipid alloys and its coupling to membrane functions.!! Chem. Phys. Lipids. 1991. V. 57. P. 363-374.

15. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Kabanov V .A./Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/Resorption of the polycation. II Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1560. P. 14-24.

16. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Ermakov Y.A., Kabanov V.A./Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation. //Membr. Cell Biol. 1997. V. 10. 683-688.

17. Divet F., Danker G., Misbah C. /Fluctuations and instability of a biological membrane induced by interaction with macromolecules.il Phys. Rev. E Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 2005. V. 72 (4 Pt 1). P. 041901.

18. Геннис P. /Биомембраны. Молекулярная структура и функции. // Москва. Мир. 1997. -627с.

19. Overton Е./ Ueber die allgemeinen osmotischen Eigenschaften der Zelle, ihre vermutlichen Ursachen und ihre Bedeutungfur die Physiologie.lFVjschr. Naturforsch. Ges. Zurich. 1899. B. 44. S. :88-98.

20. Osterhaut W.J.V.// Some Fundamental Properties of Cellular Physiology., Yale University Press. New Haven. 1927.

21. Langmuir I. / The constitution andfundamental properties of solids and liquids. II. Liquids.// J. Am. Chem. Soc. 1917. V. 39. P. 1848-1906.

22. Gorter Е., Grendel F. I On Biomolecular Layers of Lipid on the Chromacytes of the Bloodll J. Exp. Med. 1925. V. 41. P.439-434.

23. Danielli J. F., Davson, H J A contribution to the theory ofpermeability of thin films.lli. Cell Сотр. Physiol. 1935. V. 5. P. 495-508.

24. Singer S.J., Nicholson G.L./ The fluid mosaic model of cell membranes.!! Science. 1972. V. 175. P. 720-731.

25. Spector A.A., Yorek M.A. /Membrane lipid composition and cellular function. Hi. Lipid Res. 1985. V. 26. P.1015-1035.

26. Subczynski W.K., Wisniewska A./ Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions.// Acta Biochim. Pol. 2000. V. 47. P. 613-625.

27. Murase K, Fujiwara T, Umemura Y, Suzuki K, lino R, Yamashita H, Saito M, Murakoshi H, Ritchie K, Kusumi hJUltrafine membrane compartments for molecular diffusion as revealed by single molecule techniques./1В\офу>. J. 2004. V. 86. P. 4075-4093.

28. Tocanne J.-F., Teissie J. /Ionization of phospholipids and phospholipids-supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems!ГО>\ос\\\т. Biophys. Acta. 1990. V. 1031. P. 111-142.

29. Baldassare J.J., Rhinehart K.B., Silbert D.F./Modification of membrane lipid: physical properties in relation to fatty acid structure.!fBiochem\stry. 1976. V. 15. P. 2986-2994.

30. Petrache H.I., Tristram-Nagle S., Nagle J.F./Fluid phase structure of EPC and DMPC bilayers.ll Chem. Phys. Lipids 1998. V. 95. P. 83-94.

31. Gawrisch K., Parsegian V.A. /Energetics of a Hexagonal-Lamellar-Hexagonal-Phase Transition Sequence in Dioleoylphosphatidylethanolamine Membranes? // Biochemistry. 1992. V.31. P. 2856-2864.

32. Larsson K. /Cubic Llpid-Water Phases: Structures and Biomembrane Aspects.H J. Phys. Chem. 1989. V. 93. P. 7304-7314.

33. Miller R., Yavin E. /The effect of interactions in the head groups on monolayer structure and permeability II Bioelectrochem. Bioenerg. 1988. V.19. P. 557-567.

34. Olofsson L.G.M., Edvardsson M.E.M., Delsing P., Kasemo В./ Vesicle and bi-layer kinetics at surfaces measured by electrical transmission. // Sensors and Actuators B: Chemical. 2004. V. 97. P. 313-318.

35. Shapovalov V., Tronin A. / Interaction of hydrophobic ions with a Langmuir monolayer of dioctadecyldimethylammonium bromide.ll. Langmuir. 1998. V.13. P.:4870-4875.

36. Shapovalov V.L., Kotova E.A., Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N. I Effect of gramicidin A on the dipole potential of phospholipid membranes.il Biophys. J. 1999. V. 77. P. 299-305.

37. Vermette P., Gauvreau V., Pezolet' M. Laroche G. I Albumin andfibrinogen adsorption onto phosphatidylcholine monolayers investigated by Fourier transform infrared spectroscopy// Coll. Surf. B: Biointerfaces 2003. V. 29. P. 285-295.

38. Kriiger P., Baatz J.E., Dluhy R.A., Losche M./ Effect of hydrophobic surfactant protein SP-C on binary phospholipid monolayers. Molecular machinery at the air/water interfacell Biophys Chem. 2002. V. 99. P. 209-228.

39. Brezesinski G, Mohwald Н. /Langmuir monolayers to study interactions at model membrane surfaces.// Adv Colloid Interface Sci. 2003. V. 100-102. P. 563-584.

40. Chizmadzhev Y.AJThe mechanisms of lipid-protein rearrangements during viral infection.// Bioelectrochemistry. 2004. V. 63. P. 129-136.

41. Tien H.Ti , Ottova A.LJ The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes //J. Membr. Sci. 2001. V.189. P. 83117.

42. Dynarowicz-Latka P, Dhanabalan A, Oliveira ON Jr. /Modern physicochemical research on Langmuir monolayers.// Adv Colloid Interface Sci. 2001. V. 91. P. 221-293.

43. Hianikn T. / Electrostriction and dynamics of solid supported lipid films. // Reviews in Molecular Biotechnology. 2000, V. 74, P. 189-205.

44. Deme В., Zemb Т. /Measurement of sugar depletion from uncharged lamellar phases by SANS contrast variation. //. Appl. Cryst. 2000. V. 33. P. 569-573.

45. Andreoli Т.Е. /Planar lipid bilayer membranes.//Methods, Enzymol. 1974. V. 32 (Part B). P.513-539.

46. Coronado R. /Recent advances in planar phospholipid bilayer techniques for monitoring ion channels //Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1986. V. 15. P. 259-277.

47. Mirzabekov, T.A., Silberstein A.Y., Kagan B.L. / Use ofplanar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compoundsJ/Methods Enzymol. 1999. V. 294. P. 661674.

48. New R.R.C./ Liposomes: a practical approach. IRL Press, Oxford-New York-Tokyo, 1990, p. 95.

49. Banerjee R.K., Datta A.G./ Proteoliposome as the model for the study of membrane-bound enzymes and transport proteins.//Mol. Cell Biochem. 1983. V. 50. P. 3-15.

50. Perkins W.R., Minchey S.R., Ahl P.L., Janoff A.S. /The determination of liposome captured volume.//Chem. Phys. Lipids. 1993. V. 64. P. 197-217.

51. Helfrich W. /Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.//Z. Naturforsch. С. 1973. V. 28. P. 693-703.

52. Petrov A.G. /Liquid Crystal Physics and the Physics of Living Matter //Mol.Cryst.Liq.Cryst. 1999. V. 332. P. 577-584.

53. Farsad K., De Camilli P. /Mechanisms of membrane deformation//Current Opinion in Cell Biology. 2003. V. 15. P. 372-381.

54. Leikin S., Kozlov M.M., Fuller N.L., Rand R.P. / Measured effects of diacylglycerol on structural and elastic properties of phospholipid membranes. //Biophys J. 1996. V. 71. P. 2623-2632.

55. Szule A., Fuller N.L., Rand R.P. / The Effects of Acyl Chain Length and Saturation of Diacylglycerols and Phosphatidylcholines on Membrane Monolayer Curvature// Biophys. J. 2002. V. 83. P. 977-984.

56. Fuller N., Benatti C.R., Rand R.P. / Curvature and bending constants for phosphatidylserine-containing membranes. //Biophys. J. 2003. V. 85. P.1667-1674.

57. Chen Z., Rand R.P. /Comparative study of the effects of several n-alkanes on phospholipid hexagonal phases.// Biophys. J. V. 74. P. 944-952. 1998.

58. Chen Z., Rand R.P. /The influence of cholesterol on phospholipid membrane curvature and bending elasticity.//Biophys. J. 1997. V. 73. P. 267-276.

59. Fuller N., Rand R.P. /The Influence of Lysolipids on the Spontaneous Curvature and Bending Elasticity of Phospholipid Membranes// Biophys. J. 2001. V. 81. P. 243-254.

60. Kooijman E.E., Chupin V., Fuller N.L., Kozlov M.M., de Kruijff В., Burger K.N.J., Rand P.R./ Spontaneous Curvature of Phosphatide Acid and Lysophosphatidic Acid // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 2097-2102.

61. Kang S.Y., Seong B.S., Han Y.S., Jung H.T. / Self-organization of amphiphilic polymer in vesicle bilayers composed of surfactant mixtures. // Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 360365.

62. Gebhardt C., Gruler H., Sackmann E. / On domain structure and local curvature in lipid bilayer and biological membranes. // Z. Naturforsch. 1911 N. 32C, P. 581-596.

63. Mouritsen O.G., Jorgensen К ./A new look at lipid-membrane structure in relation to drug research.// Pharm. Res. 1998. V. 15. P. 1507-1519.

64. Risbo J., Jorgensen K., Sperotto M.M., Mouritsen O.G. / Phase behavior and permeability properties of phospholipid bilayers containing a short-chain phospholipid permeability enhancer.// Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1329. P. 85-96.

65. You Han X., Gietzen K., Galla H.-J., Sackmann EJ A simple assay to study protein mediated lipid exchange by fluorescence polarization // Biochem. J. 1983. V. 209. P. 257-260.

66. Angelova M.I., Hristova N., Tsoneva I. /DNA-induced endocytosis upon local microinjection to giant unilamellar cationic vesicles. // Eur. Biophys. J. 1999. V. 28. P. 142-150.

67. Holopainen J.M., Angelova M.I., Kinnunen P.K.J. /Vectorial Budding of Vesicles by Asymmetrical Enzymatic Formation of Ceramide in Giant Liposomes. // Biophys. J. 2000. V. 78. P. 830-838.

68. Bemporad D., Luttmann C., Essex J. W ./Computer simulation of small molecule permeation across a lipid bilayer: dependence on bilayer properties and solute volume, size, and cross-sectional area// Biophys. J. 2004. V. 87. P. 1-13.

69. Волошин В.П., Алинченко М.Г., Медведев Н.Н., Жедловский П., Рабинович A.JI. / Исследование структуры межмолекулярных полостей в липидном бислое// Структура и динамика молекулярных систем. Т. 10. Часть 2. Стр. 150-155. Яльчик, 2003.

70. Almeida P.F.F., Vaz W.L.C./ Lateral Diffusion in Membranes Chapter 6. //In.: Handbook of Biological Physics, Ed. by R. Lipowsky and E. Sackmann, V. 1. Elsevier Science. 1995. P. 305-357.

71. McMullen, T.P.W., McElhaney R.N. / Physical studies of cholesterol-phospholipid interactions. II Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996. V. 1. P. 83-90.

72. Tu K., Klein M.L., Tobias D.J. / Constant-Pressure Molecular Dynamics Investigation of Cholesterol Effects in a dipalmitoylphosphatidylcholine Bilayer. I I Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2147-2156.

73. Grainger, D.W., Reichert A., Ringsdorf H., Salesse C. / Chiral solidification of a phospholipid monolayer// FEBS Lett. 1989. V. 252. P. 73-82.

74. Nuscher В., Kamp F., Mehnert Т., Odoy S., Haass C., Kahle P.J., Beyer K. / a-synuclein has a high affinity for packing defects in a bilayer membrane: a thermodynamics study.// J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 21966-21975.

75. Ring A. / Gramicidin channel-induced lipid membrane deformation energy: influence of chain length and boundary conditions.!I Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1278. V.l47-159.

76. Longo M.L., Waring A.J., Hammer D.A. / Interaction of the influenza hemagglutinin fusion peptide with lipid bilayers: area expansion and permeation. II Biophys. J. 1997. V. 73. P.1430-1439.

77. Epand R.M. / Fusion peptides and the mechanism of viral fusion.// Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1614. P. 116-121.

78. Xiang Т., Anderson B.D. / Influence of a transmembrane protein on the permeability of small molecules across lipid membranes.// J. Membr. Biol. 2000. V. 173. P.l 87-201.

79. Soderlund Т., Lehtonen J. Y., Kinnunen P. K. /Interactions of cyclosporin A with phospholipid membranes: effect of cholesterol.// Mol. Pharmacol. 1999. V. 55, P. 32-38.

80. Гринштейн С. В., Кост О. А. / Структурно-функциональные особенности мембранных белков И Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 77-104.

81. Tocanne, J.F., Cezanne,. L., Lopez, A., Piknova, В., Schram, V., Tournier, J.F., Welby, M./ Lipid domains and lipid/protein interactions in biological membranes.// Chem. Phys. Lipids. 1994.V. 73. P.139-158.

82. Clerc S.G. / Thompson ТЕ. Permeability of dimyristoyl phosphatidylcholine/dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer membranes with coexisting gel and liquid-crystalline phases. Biophys. J. 1995. V. 68. P. 2333-2341.

83. Webb, M.S., Hui S.W., Steponkus, P.L. /Dehydration-induced lamellar-to-hexagonal-11 phase transitions in DOPE/DOPC mixtures. II Biochim. Biophys. Acta. 1993.V. 1145. P. 93104.

84. Mason J.T. / Mixing behavior of symmetric chain length and mixed chain length phosphatidylcholines in two-component multilamellar bilayers: evidence for gel and liquid-crystalline phase immiscibilityll Biochemistry. 1988. V. 27. P.4421-4429.

85. Ruiz-Argiiello M. В., Basanez G., Goni F.M., Alonso A. / Different effects of enzyme-generated ceramides and diacylglycerols in phospholipid membrane fusion and leakage. И J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 26616-26621.

86. Schaffer E, Thiele U. / Dynamic domain formation in membranes: Thickness-modulation-induced phase separation II. Eur Phys J E Soft Matter. 2004. V. 14, P. 169-175.

87. Batenjany M.M., O'Leary T.J., Levin I.W., Mason J.T. / Packing characteristics of two-component bilayers composed of ester- and ether-linked phospholipids.// Biophys. J. 1997. V. 72. P. 1695-1700.

88. Crane J.M., Tamm L.K. / Role of Cholesterol in the Formation and Nature of Lipid Rafts in Planar and Spherical Model membranes. II Biophys. J. 2004. V. 86. P. 2965-2979.

89. Horejsi V. / The roles of membrane microdomains (rafts) in T cell activation.il Immunol. Rev. 2003. V. 191. P. 148-164.

90. Prior I.A., Muncke C., Parton R.G., Hancock J.F. / Direct visualization of Ras proteins in spatially distinct cell surface microdomains. II J. Cell Biol. 2003. V. 160. P. 165-170.

91. Garrigues A., Escargueil A.E., Orlowski S. / The multidrug transporter, P-glycoprotein, actively mediates cholesterol redistribution in the cell membrane. I! Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, V. 99. P. 10347-10352.

92. Leckband D.E., Helm, С. A., Israelachvili J. / Role of calcium in the adhesion and fusion of bilayers. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1127-1140.

93. Wilschut J., Diizgunes N., Papahadjopoulos D. / Calcium/magnesium specificity in membrane fusion: kinetics of aggregation and fusion of phosphatidylserine vesicles and the role of bilayer curvature Л Biochemistry. 1981. V. 20. P. 3126-3133.

94. Ortiz A., Killian J. A., Verkleij A.J., Wilschut J. / Membrane Fusion and the Lamellar-to-Inverted-Hexagonal Phase Transition in Cardiolipin Vesicle Systems Induced by Divalent Cations И Biophys. J. 1999. V. 77. P. 2003-2014.

95. Меликян Г.Б., Черномордик Jl.M., Абидор И.Г., Чайлахян Л.М., Чизмаджев Ю.А.// Вызываемое слияние бислойных липидных мембран, не содержащих растворителя II ДАН СССР. 1983. Т. 269. С. 1221-1225,

96. Meyer H.W. / Lipid domain structures in biological membranes. // Exp. Pathol. 1983. V. 23, P. 3-26.

97. Haverstick D.M., Glaser M. / Visualization of Ca2+-inducedphospholipid domains. II Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84, P. 4475-4479.

98. Ermakov Yu.A., Averbakh A.Z., Sukharev S.I. / Lipid and cell membranes in the presence of gadolinium and other ions with high affinity to lipids. 1. Dipole and diffuse components of the boundary potential. II Membr. Cell Biol. 1997.V. 11. P. 539-554.

99. Smith B.A., McConnell H.M. / Determination of molecular motion in membranes using periodic pattern photobleaching. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 2759-2763.

100. Vaz W.L.C., Derzko I., Jacobson K.A. I Photobleaching measurements of the lateral diffusion of lipids and proteins in artificial phospholipid bilayer membranes.il Cell Surface Reviews. 1982. V. 8. P. 84-128,

101. Devaux P., McConnell H.M. I Lateral diffusion in spin-labeled phosphatidilcholine multilayers.// J. Amer. Chem. Soc. 1972. V. 94. 4475-4481.

102. McCown J.T., Evans E., Diehl S., Wiles H.C. /Degree of hydration and lateral diffusion in phospholipid multibilayers// Biochemistry. 1981. V. 20, P. 3134-3138.

103. Cullis P.R. (1976) / Lateral diffusion rates of phosphatidiylcholine in vesicle membranes: Effects of cholesterol and hydrocarbon phase rtansition.// FEBS Lett. 1976. V. 70, P. 223228.

104. Kuo A.-L., Wade C.GJ Lipid lateral diffusion be pulsed nuclear magnetic resonance.II Biochemistry. 1979. V. 17. P. 2300-2308.

105. Hemminga M.A. / An ERS study of the mobility of the cholestane spin label in oriented lecithin-cholesterol multibilayers.// Chem. Phys. Lipids. 1975. V. 14. P. 141-173.

106. Filippov A, Oradd G, Lindblom G. / The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. И Biophys J. 2003. V. 84. P. 3079-3086.

107. O'Leary T. / Lateral diffusion of lipids in complex biological membranes II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 429-433.

108. Kornberg R.D., McConnell H.M. / Inside-outside transition of phospholipids in vesicle membranes.//Biochemistry. 1971. V. 10. P. 1111-1120.

109. Bhamidipati S.P., Hamilton J.A. / Interactions of lyso-l-palmitoylphosphatidilcholine with phospholipids: a ,3CandnPNMR study// Biochemistry. V. 34. P. 5666-5677. 1995.

110. Buton X., Morrot G., Fellman P., Seigneuret M. Ultrafast glicerophospholipid-selective transbilayer motion mediated by a protein in the endoplasmic reticulum membrane.// J. Biol. Chem. 1996. M.271. P. 6651-6657.

111. Cabral D.J., Small D.M., Lilly H.S., Hamilton J.A. / Transbilayer movement of bile asids in model membranes. //Biochemistry. 1987. 26. 1801-1804.

112. Barsukov L.I., Kulikov V.I., Bergelson L.D. / Cytochrome P-450 facilitate phosphatidylcholine flip-flop in proteoliposomes. И FEBS Lett. 1982, V. 144, P. 337-340.

113. Jain M.K., Jahagirdar D.V., Linde M.V., Roelofsen В., Eibl H. / Solute-induced acceleration of transbilayer movement and its implications on models of blood-brain barrier.ll Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 818. P. 356-364.

114. Lentz B.R., Talbot W., Lee J.K., Zheng L-X. / Transbilayer lipid redistribution accompanies polyfethylene glycol) treatment of model membranes but is not induced by fusion. // Biochemistry. 1997, V. 36. P. 2076-2083.

115. Serra M.V., Kamp D., Haest C.W. Pathways for flip-flop of mono- and di-anionic phospholipids in the erythrocyte membrane.ll Biochim. Biophys. Acta. 1996, 1282, 263-273.

116. Mclntyre J.C. Sleight R.G. /Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry.// Biochemistry. 1991. V. 30. P. 11819-11827.

117. Greenhut S.F., Roseman M.A. / Cytochrome b5 induced flip-flop of phospholipids in sonicated vesicles.// Biochemistry, V. 24, P.1252-1260,1985.

118. Matsuzaki K., Murase O., Fujii N., Miyajima K./ An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation. //Biochemistry. 1996. V. 35. P.l 1361-11368.

119. Matsuzaki К., Yoneyama S., Murase О., Miyajima К./ Transbilayer transport of ions and lipids coupled with mastoparan X translocation.// Biochemistry. 1996. V. 35. P. 8450-8456.

120. Bai J. Pagano R.E. / Measurement of spontaneous transfer and transbilayer movement of BODIPY-labeled lipids in lipid vesicles.// Biochemistjy. 1997. V. 36. P. 8840-8848.

121. Haest C.W.M, Oslender A., Kamp D./ Nonmediated flip-flop of anionic phospholipids and long-chain amphiphiles in the erythrocyte membrane depends on membrane potential.// Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10885-10891.

122. Shaw J.M., Thompson Т.Е. / Effect of phospholipid oxidation products on transbilayer movement of phospholipids in single lamellar vesicles.// Biochemistiy. 1982. V. 21. P. 920927.

123. Buton X., Morrot G., Fellmann P., Seigneuret M. / Ultrafast glycerophospholipid-selective transbilayer motion mediated by a protein in the endoplasmic reticulum membrane. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 6651-6657.

124. Gallet P.F., Zachowski A., Julien R., Fellman P., Devaux P., Maftah A. / Transbilayer movement and distribution of spin-labelled phospholipids in the inner mitichondrial membrane Л Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1418. P. 61-70.

125. Rohtman J.E., Kennedy Е.Р. / Rapid transmembrane movement of newlysynthesized Phospholipids during membrane assembly. II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 1821-1825.

126. Hrafnsdottir S., Nichols J.W., Menon А.К./ Transbilayer movement of fluorescent phospholipids in Bacillus megaterium membrane vesicles. II Biochemistry. 1997. V. 36. P. 4969-4978.

127. Middelkoop E., Lubin B.H., Op den Kamp J.A., Roelofsen B. / Flip-flop rates of individual molecular species of phosphatidylcholine in the human red cell membrane.il Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 855. P. 421-424.

128. Bishop J.M., Bell R.M. iAssembly of the endoplasmic reticulum phospholipid bilayer: The phosphatidylcholine transporterII Cell. 1985. V. 42. P. 51-60. v

129. Basse F., Sainte-Marie J., Maurin L., Bienvenue A. / Effect of benzyl alcohol on phospholipid transverse mobility in human erythrocyte membrane.il Eur. J. Biochem. 1992. V. 205. P. 155-162.

130. Devaux P. /Protein involvement in transmembrane lipid assimetry.// knm. Rev. Biophys. Boimol. Struct. 1992, V. 21. P. 417-439.

131. Stier A., Finch S.A.E., Bosterling B. / Non-lamellar structure in rabbit liver microsomal membranes: a31P-NMRstudy. //FEBS Lett. 1978. V. 91. P. 109-112.

132. Барсуков Л.И., Куликов В.И., Бахманова Г.И., Арчаков А.И., Бергельсон Л.Д. . Быстрая трансбислойная миграция фосфатидилхолина под действием цитохрома Р450. // Биохимия. 1982, Т. 47. С. 2055-2065.

133. Henseleit U., Plasa G., Haest C.W. / Effect of divalent cations on lipidflip-flop in the human erythrocyte membrane. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1029. P. 127-135.

134. Bevers Е.М., Comfurius P., Dekkers D.W., Zwaal R.F. / Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells //.Biochim Biophys Acta. 1999. V. 1439. P. 317-330.

135. Schwichtenhovel C., Deuticke В., Haest C.W. / Alcohols produce reversible and irreversible acceleration of phospholipid flip-flop in the human erythrocyte membrane. И Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1111. P. 35-44.

136. Basse F., Sainte-Marie J., Maurin L., Bienvenue A. / Effect of benzyl alcohol on phospholipid transverse mobility in human erythrocyte membrane. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 205. P. 155-162.

137. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Гидродинамика. M.: Наука, 1986.

138. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоесцентные зонды в исследовании биологических мембран. Москва: Наука, 1980.

139. Lentz B.R. / Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers. II Chem. Phys. Lipids. 1993. V. 64. P. 99-116.

140. Marsh D., Kurad D., Livshits V.A. / High-field electron spin resonance of spin labels in membranes.il Chem. Phys. Lipids. 2002. V. 116. P. 93-114.

141. Cribier S., Morrot G., Zachowski A. / Dynamics of the membrane lipid phase.// Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 1993. V. 48. P. 27-32.

142. Sherbet G.V. /Membrane fluidity and cancer metastasis. //Exp. Cell Biol. 1989. V. 57. P. 198-205.

143. Флайгер У. IIСтроение и динамика молекул, т. 1. М. Мир, 1982. с. 22.

144. Лакович Дж. //Принципы флуоресцентной спектроскопии, М., Мир, 1986, с. 145

145. Lentz B.R., Barenholtz Y., Thompson Т.Е. / Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 1. Single component phosphatidylcholine liposomes. //Biochemistry. 1976. T. 15. C. 4521-4528.

146. Lentz B.R., Barenholtz Y., Thompson Т.Е. / Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 2. Two-component phosphatidylcholine liposomes. //Biochemistry. 1976. V. 15. P. 4529-4537.

147. Kinosita K.Jr., Kataoka R., Kimura Y., Gotoh O., Ikegami A. / Dynamic structure of biological membranes as probed by l,6-diphenyl-l,3,5-hexatriene: a nanosecond fluorescence depolarization study.// Biochemistry. 1981. V. 20. P. 4270-4277.

148. Shinitzky М., Inbar М. / Microviscosity parameters and protein mobility in biological membranes. II Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 433. P. 133-149.

149. Roosemond R.C., Urli D.C. / Lipid composition and microviscosity of subcellular fractions from rabbit thymocytes. Differences in the microviscosity of plasma membranes from subclasses of thymocytes. H Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 556. P. 17-37.

150. Shinitzky МУ Membrane fluidity and cellular functions, physiology of membrane fluidity. // CRC Press, Boca Raton. 1984. P. 1-51.

151. Neibylski G.D., Petty H.R. Cyclosporine A induses an early transient rigification of lymphocyte membranes. // J. Leukoc. Biol. 1991. V. 49. P. 407-415.

152. Kleinfild A.M., Dragsten P., Klansner R.D., Pjura W.J., Matayoshi E.D. / The lack of relationship between fluorescence polarisation and lateral diffusion in biological membranes. //Biochim. Biophys. Acta. 1981, V. 649. P. 471-480.

153. Portoles M.T., Pagani R., Diaz-Laviada I., Muchicio A.M. / Effect of Escherichia coli lipopolysaccharide on the microviscosity of liver plasma membranes and hepatocyte suspensions and monolayers. //Cell Biochem. Funct. 1981. V. 5. P. 55-61.

154. Viti V., Cicero R., Callari D., Guidoni L., Billitteri A., Sichel G. / Effect of lipophilic31vitamins on the erythrocyte membrane. P-NMR and fluorescence studies. // FEBS Lett. 1983. V. 158, P. 36-40.

155. Frangopol P.T. /Interactions of some local anesthetics and alcohols with membranes., Colloid and Surfaces £://Biointerfaces. 2001. V. 22, P. 3-22.

156. Nie S.Q., Majarais I., Kwan C.J., Epand R.M. I Pyrazine derivatives affect membrane fluidity of vascular smooht muscle microsomes in relation to their biological activity.// Eur. J. Pharmacol. 1993. V. 224. P. 15-19.

157. Nie S.Q., Majarais I., Kwan C.J., Epand R.M. / Analogues of tetramethylpyrasine affect membrane fluidity of liposomes: relationship to their biological activities. / Eur. J. Pharmacol. 1994. V. 266. P. 11-18.

158. Andelman D. / Electrostatic Properties of membranes: the Poisson-Boltzmann theory // V. 1, Chapter 12 in Handbook of Biological Physics (R. Lipowsky and E. Sackmann Eds.), Elsevier, Amsterdam. 603-641.1995.

159. McLaughlin S. Experimental tests of the assumptions inherent in Gouy-Chapmen theory of the aqueous diffuse double layer! In: Physical Chemistry of transmembrane ion motions (G. Spach, Ed.) Elsevier, Amsterdam, P. 69-76, 1983.

160. Winiski, A.P., McLaughlin, A.C., McDaniel, R.V., Eisenberg, M., McLaughlin, S./ An experimental test of the discreteness-of-charge effect in positive and negative lipid bilayers, //Biochemistry. 1986. V. 25. P. 8206-8214.

161. Hartsel S.C., Cafiso, D.S./ A test of discreteness-of-charge effects in phospholipids vesicles: measurements using paramagnetic amphiphiles II Biochemistry. V. 25, P. 8214-8219. 1986.

162. McLaughlin S., / Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces, II Current Topics in Membrane Transport, V. 9. P. 71-144. 1977.

163. Brockman H. / Dipole potential of lipid membranes //Chem. Phys. Lipids. 1994. V. 73. P. 57-79.

164. Clarke R. J. / The dipole potential of phospholipids membranes and methods for its detection!I Adv. Colloid Interface Sci. 2001. V. 89-90. P. 263-281.

165. Либерман Ю.А., Топалы В.П. / Проницаемость бимолекулярных фосфолипидных мембран для жирорастворимых ионов. II Биофизика. 1969. Т. 14. С. 452-461.

166. Haydon D.A., Myers V.B. / Surface charge, surface dipoles and membrane conductance.11 Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 307. P. 429-443.

167. Muderhwa J.M., Brockman H.L. / Lateral lipid distribution is a major regulator of lipase activity. Implication for lipid-mediated signal transduction. II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24184-24192.

168. Smaby J.M., Brockman H.L. / Surface dipole moments of lipids at the argon-water interface. Similarities amongglycerol-ester-based lipids. II Biophys. J. 1990. V. 58. P. 195-204.

169. Lamarche F., Techy F., Aghion J., Leblank R.M./ Surface pressure, surface potential and ellipsometric study of Cytochrome с binding to dioleoylphosphatidylcholine monolayer at the air-water interface. II Colloids Surf. 1988. V. 30. P. 209-222.

170. Henckl W.M., Thompson M., Mohwald H. / Fluorescence and electron microscopic study lectinpolysaccharide and immunochemical aggregation at phospholipids Langmuir-Blodgett monolayers II Langmuir. 1989. V. 5. P. 390-394.

171. Трубецкая M.B., Антоненко Ю.Н., Тропша A.E., Ягужинский Л.С.// Иод-содержащие гормоны как дипольные модификаторы липидных мембран, // Биофизика. 1984. Т. 29. С.801-805.

172. Antonenko Y.N., Rokitskaya T.I., Kotova E.A. / Effect of dipole modifiers on the kinetics of sensitized photoinactivation of gramicidin channels in bilayer lipid membranes. // Membr. Cell Biol. 1999. V. 13. P. 111-120.

173. Peterson U., Mannock,D.A., Lewis R.N., Pohl P., McElhaney R.N., Pohl E.E. / Origin of membrane dipole potential: contribution of the phospholipid fatty acid chains./! Chem. Phys. Lipids. 2002. V. 17. P. 19-27.

174. Pohl E.E., Peterson U., Sun J., Pohl P. / Changes of intrinsic membrane potentials induced by flip-flop of long-chain fatty acids. II Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1834-1839.

175. Gross E., Bedlack R.S. Jr, Loew L.M. / Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. И Biophys J. 1994. V. 67. P. 208-216.

176. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М.:Мир. 1980. с.188-197

177. Walter A., Gutknecht J. / Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes. Hi. Membr. Biol. 1986. V.90. P. 207-217.

178. Simonyan R.A., Skulachev V.P. / Thermoregulatory uncoupling in heart muscle mitochondria: involvement of the ATP/ADP antiporter and uncoupling protein. IIFEBS Lett. V. 436. P. 81-84. 1998.

179. Skulachev V.P. / Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling. II J. Bioenerg. Biomembr. 1999. V. 31. P. 431-445.

180. Tarasiuk J., Garnier-Suillerot A. / Kinetic parameters for the uptake of anthracycline by drug-resistant and drug-sensitive K562 cells. II Eur J Biochem. 1992. V. 204. P. 693-698.

181. Xiang T.X., Anderson B.D. / Influence of chain ordering on the selectivity of dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes for permeant size and shape.ll Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2658-2671.

182. Bemporad D., Luttmann C., Essex J. W. / Computer Simulation of Small Molecule Permeation across a Lipid Bilayer: Dependence on Bilayer Properties and Solute Volume, Size, and Cross-Sectional Area. II Biophys. J. 2004. V. 87. P. 1-13.

183. Parsegian A. / Energy of an ion crossing a low dielectric membrane: solutions to four relevant electrostatic problems. //Nature. 1969. V. 221. P.844-846.

184. Bordi F., Cametti С., Motta A. I Ion Permeation Across Model Lipid Membranes: A Kinetic Approach, Hi. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 5318-5323.

185. Paula S, Volkov A.G., Van Hoek A.N., Haines Т.Н., Deamer D.WJ Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. II Biophys. J. 1996. V. 70. P. 339-348.

186. Paula S., Volkov A.G., Deamer D.W. / Permeation ofhalide anions through phospholipid bilayers occurs by the solubility-diffusion mechanism J/Biophys. J. V. 74. P. 319-327,1998.

187. Sandre O., Moreaux L., Brochard-Wyart F. / Dynamics of transient pores in stretched vesicles И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 10591-10596.

188. Wilson M.A., Pohorille A. / Mechanism of unassisted ion transport across membrane bilayers Hi. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 6580-6587.

189. Pohorille A., Wilson M. A. / Unassisted and assisted ion transport across membranes: insights from computer stimulations II Cell. Biol. Mol. Lett. 2001. V. 6. P. 369-373.

190. Syganov, A., von Kitzing, E. / (Invalidity of the Constant Field and Constant Currents Assumptions in Theories of Ion Transport I I Biophys. J. 1999. V. 76. P. 768-781.

191. Чизмаджев Ю.А., / Как сливаются биологические мембраны //Сор. Общеобразов. Ж. 2001. Т. 7. С. 4-9.

192. Chernomordik L.V., Melikyan G.B., Chizmadzhev Y.A. / Biomembrane fusion: a new concept derived from model studies using two interacting planar lipid bilayers. II Biochim. Biophys. Acta, 1987. V. 906. P. 309-352.

193. Smith K.C., Neu J.C., Krassowska W. / Model of creation and evolution of stable electroporesfor DNA delivery. I I Biophys. J. 2004. V. 86. P. 2813-2826.

194. Melikov K.C., Frolov V.A., Shcherbakov A., Samsonov A.V., Chizmadzhev Y.A., Chernomordik L.V. / Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer. H Biophys. J. 2001. V. 80. P. 1829-1836.

195. Marrink S.J., Jahnig F., Berendsen H.J. / Proton transport across transient single-file water pores in a lipid membrane studied by molecular dynamics simulations. 11 Biophys. J. 1996. V.71.P. 632-647.

196. Jansen M., Blume A. IA comparative study of diffusive and osmotic water permeation across bilayers composed of phospholipids with different head groups and fatty acyl chains.// Biophys. J. 1995. V. 68. P. 997-1008.

197. Lipowsky R. / Bending of Membranes by Anchored Polymers. II Europhys. Lett. 1995. V. 30. P. 197-202.

198. Briscoe В., Luckham P., Zhu S. / On the effects of water solvency towards non-ionic polymers. II Proc. Royal Soc. (London) A. 1999. V. 455. P. 737-756.

199. Aray Y., Marquez M., Rodryguez J., Vega D., Simon-Manso Y., Coll S., Gonzalez C., Weitz D.A. / Electrostatics for exploring the nature of the hydrogen bonding in polyethylene oxide hydration//. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 2418-2424.

200. Corrigan O.I., Healy A.M. / Surfactants in pharmaceutical products and Systems, II In: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Marcel Dekker, 2002.

201. Tirosh O., Barenholz Y., Katzhendler J., Priev A. / Hydration of Polyethylene Glycol-Grafted Liposomes // Biophys. J. 1998. V.74. P. 1371-1379.

202. Garbuzenko O., Zalipsky S., Qazen M., Barenholz Y. / Electrostatics of PEGylated micelles and liposomes containing charged and neutral lipopolymers. И Langmuir. 2005. V. 21, P. 2560-2568.

203. Brackman J.C., van Os N.M., Engberts J.B.F.N. / Polymer-nonionic micelle complexation. Formation of poly(propylene oxide)-complexed n-octyl thioglucoside micelles II Langmuir. 1988. V. 4. P. 1266-1269.

204. Johnsson B, Lindman B, Kronberg B, Holmberg K./ Surfactants and Polymers in Aqueous Solution. Wiley, New York, 1998.

205. Nemethy G., Scheraga H.A. / Structure of water and hydrophobic bonding in proteins. 1. A model for the thermodynamic properties of liquid water. II J. Chem. Phys. 1962. V. 36. P. 3382-3400.

206. Tanford C. / The hydrophobic effect and the organization of living matter.!I Science. 1978. V. 200. P. 1012-1018.

207. Arakawa Т., Timasheff S. N. / Mechanism of polyethylene glycol interaction with proteins. Biochemistry. 1985. V. 24. P. 6756-6762.

208. Gabizon A.A. / Stealth liposomes and tumor targeting: one step further in the quest for the Magic Bullet П Clin. Cancer Res. 2001. V. P. 223-225.

209. Moghimi S.M., Szebeni J. / Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties.!! Prog. Lipid Res. 2003. V. 42. P. 463-478.

210. Xu Z, Marchant RE. / Adsorption of plasma proteins on polyethylene oxide-modified lipid bilayers studied by total internal reflection fluorescence. // Biomaterials. 2000. V.l. P. 10751083.

211. Efremova N.V., Bondurant В., O'Brien D.F., Leckband D.E. / Measurements of Interbilayer Forces and Protein Adsorption on Uncharged Lipid Bilayers Displaying Poly(ethylene glycol) Chains II Biochemistry. 2000. V. 39. P. 3441-3451.

212. Torchilin V.P., Trubetskoy V.S., Whiteman K.R., Caliceti P., Ferruti P., Veronese F.M. / New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo. U J. Pharm. Sci. 1995. V. 84. 1049-1053.

213. Kuleshova L.L., Shaw J.M., Trounson A.O. / Studies on replacing most of the penetrating cryoprotectant by polymers for embryo cryopreservation. 11 Cryobiology. 2001. V. 43. P. 2131.

214. Koster K.L., Lei Y.P., Anderson M., Martin S., Bryant G. / Effects of vitrified and nonvitrified sugars on phosphatidylcholine fluid-to-gel phase transitions. H Biophys. J. 2000. V. 78. P. 1932-1946.

215. Fleischer W., Reimer K. / Povidone-iodine in antisepsis-state of the art. I/ Dermatology. 1997. V. 195. Suppl. 2. P. 3-9.

216. Кирш Ю.Э. / Поли-Ы-виншпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды. Синтез и физико-химические свойства. II, Москва, Наука, 1998. 252 стр.

217. Kirsh Yu.E.,. Yanul N.A Kalninsh К./ Structural transformations and water associate interactions in poly-N-vinylcaprolactam-water system. / Eur.Polymer J. 1999. V. 35, P. 305316.

218. Anrather D., Smetazko M., Saba M., Alguel Y., Schalkhammer T. / Supported membrane nanodevices. II J. Nanosci. Nanotechnol. 2004, V. 4, P. 1-22.

219. Grohmann F.L., Szogyi М., Csempesz F. / Interaction of lipid membranes and neutral polymers by differential scanning calorimetry (DSC)// Acta Pharm. Hung. 1997. V. 67. P. 267-272.

220. Jin Т., Pennefather P., Lee P.I. / Lipobeads: a hydrogel anchored lipid vesicle system. // FEBS Lett. 1996. V. 397. P. 70-74.

221. Takeuchi H., Yamamoto H., Niwa Т., Hino Т., Kawashima Y. / Mucoadhesion of polymer-coated liposomes to rat intestine in vitro. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1994. V. 42. P. 1954-1956.

222. Takeuchi H., Yamamoto H., Niwa Т., Hino Т., Kawashima Y. / Enteral absorption of insulin in rats from mucoadhesive chitosan-coated liposomes. // Pharm. Res. 1996. V. 13. P. 896901.

223. Cansell M., Parisel C., Jozefonvicz J., Letourneur D. / Liposomes coated with chemically modified dextran interact with human endothelial cells. // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V. 44. P. 140-148.

224. Vereyken I.J., Chupin V., Islamov A., Kuklin A., Hincha D.K., de KruijffB. / The Effect of Fructan on the Phospholipid Organization in the Dry State // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 3058-3065.

225. Vereyken, I. J., Chupin V., Demel, R. A. Smeekens S. C., de Kruijff. B. / Fructans insert between the headgroups of phospholipids. Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1510, P. 307320.

226. Liu, X.M, Wang L.S., Wang L,., Huang, J., He, C. / The effect of salt and pH on the phase transition behaviors of temperature-sensitive copolymers based on N-isopropylacrylamide.H Biomaterials. 2004. V. 25. P. 5659-5666.

227. Uchiyama, S., Matsumura Y., de Silva, A.P., Iwai, КJ Fluorescent molecular thermometers based on polymers showing temperature-induced phase transitions and labeled with polarity-responsive benzofurazans. // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 5926-5935.

228. Hayashi H, Kono K, Takagishi T. / Temperature-controlled release property of phospholipid vesicles bearing a thermo-sensitive polymer. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1280. P. 127-134.

229. Meyer O., Papahadjopoulos D., Leroux J.C. // Copolymers of N-isopropylacrylamide can trigger pH sensitivity to stable liposomes. // FEBS Lett. 1998. V. 421. P. 61 -64.

230. Kim J.C., Bae S.K., Kim J.D. / Temperature-sensitivity of liposomal lipid bilayers mixed with poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) JI J. Biochem. (Tokyo). 1997. V. 121. P. 15-19.

231. Thomas J., Devlin B.P., Tirrell D.A. / Kinetics of membrane micellization by the hydrophobic polyelectrolyte poly-(2-ethylacrylic acid) H Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1278. P. 73-78.

232. Thomas J.L., Tirrell D.A. / Polymer-induced leakage of cations from dioleoylphosphatidylcholine andphosphatidylglycerol liposome. II J. Control. Release. 2000. V.67. P. 203-209.

233. Chung J.C., Gross D.J., Thomas J.L., Tirrell D.A., Opsahl-Ong L.R. / pH-Sensitive, Cation-Selective Channels Formed by a Simple Synthetic Polyelectrolyte in Artificial Bilayer Membranes. П Macromolecules. 1996. V. 29. P. 4636-4641.

234. Poirier Y. / Polyhydroxyalknoate synthesis in plants as a tool for biotechnology and basic studies of lipid metabolism. //Prog. Lipid Res. 2002. V. 41. P. 131-155.

235. Ройш P.H. / Трансмембранный транспорт ионов комплексами полифосфата и поли-(К)-3-гидроксибутирата. II Биохимия. 2000. Т. 65. С. 280-295.

236. Corkill J.M., Goodman J.F., Harrold S.P. / Thermodynamics of micellization of non-ionic detergents II Trans. Faraday Soc. 1964. V. 60. P. 202-207.

237. Shinoda K., Yamanaka Т., Kinoshita K. / Surface Chemical Properties in Aqueous Solutions of Non-ionic Surfactants Octyl Glycol Ether, a-Octyl Glyceryl Ether and Octyl Glucoside IIJ. Phys. Chem. 1959. V. 63. P. 648-650.

238. Rosen M.J. / Surfactants andInterfacial Phenomena, Wiley, New York, 1987.

239. K. Meguro, Y. Takasawa, N. Kawahashi, Y. Tabata, M.Ueno / J. Colloid Interface Sci. 1981. V. 83. P. 50-59.

240. Lange H. / Kolloide und naturliche Makromolekttle Untersuchungen iiber adsorbierte und gespreitete monomolekulare Schichten // Kolloid Z. 1965. V. 201. P. 131-136.

241. Li М., Rharbi Y., Winnik M.A., Hahn K.G. Jr. / Aggregation behavior of nonionic surfactants Synperonic A7 and A50 in aqueous solution II J. Colloid Interface Sci. 2001. V. 240. P. 284-293.

242. Elworthy P.H., MacFarlane C.B. / The physical chemistry of some non-ionic detergents II J. Pharm. Pharmacol. 1962. V. 17. P. 65-82.

243. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.// Справочник биохимика, М., Мир, 1991. С. 478.

244. Ghosh S.K., Khatua Р.К., Bhattacharya S.Ch. / Characterization of micelles of polyoxyethylene nonylphenol (Igepal) and its complexation with 3,7-diamino-2,8-imethyl-5-phenylphenazinium chloride II J. Colloid Interface Sci. 2004. V. 275. P. 623-631.

245. Aoudia M., Zana R. / Aggregation Behavior of Sugar Surfactants in Aqueous Solutions: Effects of Temperature and the Addition of Nonionic Polymers II J. Colloid Interphase Sci. 1998. V. 206. P. 158-167.

246. Brenner-Hennaf C., Valdor J.-F., Plusquellec D., Wroblewski H., / Synthesis and characterization of N-octanoyl-beta-D-glucosylamine, a new surfactant for membrane studies II Anal. Biochem. 1993. V. 212. P. 112-127.

247. Burczyk В., Wilk K.A., Sokolowski A. Sypery L. / Synthesis and Surface Properties ofN-Alkyl- N-methylgluconamides and N-Alkyl- N-methyllactobionamides II J. Colloid Interface Sci. 2001, V. 240. P. 552-558.

248. Drummond C.J., Wells D. / Nonionic lactose and lactitol based surfactants: comparison of some physico-chemical properties II Colloids Surf., A. 1998. V. 141. P. 131-142.

249. Haque M.E., Das A.R., Moulik S.P. / Mixed Micelles of Sodium Deoxycholate and Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate (Tween 80) //J. Colloid Interface Sci. 1999. V. 217. P. 1-7.

250. Chaudier Y., Barthe Ph., Pucci B. / Synthesis and preliminary assessments of hybridhydrocarbon-fluorocarbon anionic and non-ionic surfactants II Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 3583-358.

251. Chlebicki J., Majtyka P. / Effect of Oxypropylene Chain Length on the Surface Properties of Dialkyl Glycerol Ether Nonionic Surfactants. II J. Colloid Interface Sci. 1999. V. 220. P. 5762.

252. Chlebicki J. / Effect of Polyoxybutylene Chain Length on the Surface Activity of Butylene Oxide-Ethylene Oxide Block Copolymers II J. Colloid Interface Sci. 1998. V. 206. P. 77-82.

253. Istratov V., Kautz H., Kim Y.-K., Schubert R., Frey H. / Linear-dendritic nonionic poly(propylene oxide)-polyglycerol surfactants, Tetrahedron. 2003. V. 59. P. 4017-4024.

254. Folmer B. / Sterol surfactants: from synthesis to applications. II Adv.Colloid Interface Sci. 2003. V. 103. P. 99-119.

255. Wang, Z., Li, G., Zhang, X., Wang, R., Lou A. I A Quantitative structure-property relationship study for the prediction of critical micelle concentration of non-ionic surfactants. II Colloids and Surfaces A. 2002. V. 197. P. 37-45.

256. Saunders R.A., Platts J.A. / Correlation and prediction of critical micelle concentration using polar surface area and LFER methods. II J. Phys. Org. Chem. 2004. V. 17. P. 431 -438.

257. Aveldano M.I. / Phospholipid Solubilization during Detergent Extraction of Rhodopsin from Photoreceptor Disk Membranes II Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 324. P. 331-343.

258. Kim J.G., Kim J.D. / Vesicle to micelle transitions of egg phosphatidylcholine liposomes induced by nonionic surfactants, poly(oxyethylene) cetyl ethers. II J. Biochem. (Tokyo) 1991. V. 110. P. 436-442.

259. Pantaler E., Kamp D., Haest C.W. / Acceleration ofphospholipid flip-flop in the erythrocyte membrane by detergents differing in polar head group and alkyl chain length.ll Biochim. Biophys. Acta, 2000. V. 1509. P. 397-408.

260. Heerklotz H., Seelig J. / Correlation of membrane/water partition coefficients of detergents with the critical micelle concentration. II Biophys. J. 2000. V. 78. P. 2435-2440.

261. Heerklotz H, Seelig J. / Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization. II Biochim Biophys Acta. 2000. V. 1508. P. 69-85.

262. Wenk M.R, Alt Т., Seelig A., Seelig J. / Octyl-beta-D-glucopyranoside partitioning into lipid bilayers: thermodynamics of binding and structural changes of the bilayer II Biophys J. 1997. V. 72. P. 1719-1731.

263. Lasch J. / Interaction of detergents with lipid vesicles И Biochim.Biophys. Acta, 1995, V. 1241. P. 269-292.

264. Kragh-Hansen U., le Maire M., Muller J.V. / The mechanism of detergent solubilization of liposomes and protein-containing membranes. // Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2932-2946.

265. Simon S. A., Stone W. L., Busto-Latorre P. / A thermodynamic study of the partition of n-hexane into phosphatidylcholine and phosphatidylcholine/cholesterol bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 468. P. 378-388.

266. De Young L.R., Dill K.A. / Solute Partitioning into Lipid Bilayer Membranes. II Biochemistry. 1988. V. 27. P. 5281-5289.

267. Kim Y.W., Sung W. / Membrane curvature induced by polymer adsorption. II Phys. Rev. E. 2001. V. 63. P. 041910-1-041910-5.

268. Balgavy P, Devinsky F. / Cut-off effects in biological activities of surfactants. II Adv. Colloid Interface Sci. 1996. V. 66. P. 23-63.

269. M. Kadi, P. Hansson, M. Almgren / Determination of Isotherms for Binding of Surfactants to Vesicles Using a Surfactant-Selective Electrode. II J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. N 22, P. 7344-7351.

270. Ara M., Partearroyo N., Alonso A., Lix F., Goni M., Tribout I.M., Paredes S. / Solubilization of Phospholipid Bilayers by Surfactants Belonging to the Triton X Series: Effect of Polar Group Size II J. Colloid. Interface Sci. 1996. V. 178. P. 156-159.

271. Przestalski S., Sarapuk J., Kleszczynska H., Gabrielska J., Hadyszowski J., Trela Z., Kuczera J. / Influence of amphiphilic compounds on membranes. // Acta Biochim. Polonica. 2000. V. 47. P. 627-638.

272. Bandyopadhyay S., Shelley J.C., Klein M.L. / Molecular Dynamics Study of the Effect of Surfactant on a Biomembrane. II J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 5979-5986.

273. Schmolka I.R J A review of block polymer surfactants. //J. American Oil Society. 1977. P. 110-116.

274. Bohdana М. Discher,. В.М., Won Y.-Y.,. Ege D.S., Lee J.C.-M., Bates F.S., Discher, D.S. Hammer D.A. / Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers // Science. 1999.V. 284. P. 1143-1146.

275. Fraaije J.G.E.M., van Sluis C.A., Kros A., Zvelindovsky A.V. Sevink G.J.A. / Design of chimaericpolymersomes. II Faraday Discuss. 2005. V. 128. P. 355-361.

276. Soni, S.S., Sastry, N.V. George, J., Bohidar, H.B. / Surface Active and Association Behavior of Oxybutylene-Oxyethylene and Oxyethylene-Oxybutylene-Oxyethylene Copolymers in Aqueous Solutions//Langmuir. 2003. V. 19. P. 4597-4603.

277. Yang Y.-W., Ali-Adib, Z., McKeown, N. В., Ryan, A. J., Attwood, D., Booth, C. / Effect of Block Architecture on the Gelation of Aqueous Solutions of Oxyethylene/Oxybutylene Block Copolymers /I Langmuir. 1997. V. 13. P. 1860-1861.

278. Yu, K., Eisenberg, A. / Multiple Morphologies in Aqueous Solutions of Aggregates of Polystyrene-block-poly(ethylene oxide) Diblock Copolymers И Macromolecules. 1996. V. 29. P. 6359-6361.

279. Castro E., Taboada P., Mosquera V. / Behavior of a Styrene Oxide-Ethylene Oxide Diblock Copolymer/Surfactant System: A Thermodynamic and Spectroscopy Study II J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109. P. 5592-5599.

280. Park, S. Y., Han, D. K., Kim, S. C. / Synthesis and Characterization of Star-Shaped PLLA-PEO Block Copolymers with Temperature-Sensitive Sol-Gel Transition Behavior II Macromolecules. 2001. V. 34. P. 8821-8824,.

281. Li S. M., Rashkov I., Espartero J.L., Manolova N., Vert M. / Synthesis, Characterization, and Hydrolytic Degradation of PLA/PEO/PLA Triblock Copolymers with Long Poly(L-lactic acid) Blocks II Macromolecules. 1996. V. 29. P. 57-62.

282. Stoenescua R, Meierab W. / Vesicles with asymmetric membranes from amphiphilic ABC triblock copolymers. //Chem. Commun. 2002. P. 3016-3017.

283. Andersen J.H., Rasmussen P., Fredenslund A. / Phase Equilibria of Polymer Solutions by Group Contribution. 1. Vapor-Liquid Equilibria // Ind. Eng. Chem. Res. 1987. V. 26. P. 1382-1390.

284. Saeki S., Kuwahara N., Nakata M., Kaneko M. / Upper and lower critical solution temperatures inpolyfethylene glycol) solutions. II Polymer. 1976. V. 17. P. 685-689.

285. Tani Н., Kamidate Т., Watanabe Н. / Aqueous micellar Two-phase systems for rotein separation.//Analytical Sciences. 1998. V. 14. P. 875-888.

286. Wanka G., Hoffman H., Ulbricht W. / Phase Diagrams and Aggregation Behavior of Poly(oxyethylene)-Poly(oxypropylene)-Poly(oxyethylene) Triblock Copolymers in Aqueous Solutions //Macromolecules. 1994. V. 27. P. 4145-4159.

287. Bryskhe K., Schillen K., Lofroth J.-E., Olsson U. / Lipid-block copolymer immiscibility // Phys. Chem. Chem. Phys. 2001. V. 3. P. 1303-1309.

288. Bahadur P. / Block copolymers their microdomain formation (in solid state) and surfactant behaviour (in solution). II Cur. Sci. 2001. V. 80. P. 1002-1006.

289. Mortensen K., Brown W. / Polyethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymers in Aqueous Solution. The Influence of Relative Block Size // Macromolecules. 1993. V. 26. P. 4128-4135.

290. Marcos J.I., Oriandi E., Zerbi G. / Poly(ethylene oxide)-poly(methyl methacrylate) interactions in polymer blends: an infra-red study. II Polymer. 1990. V. 31. P. 1899-1909.

291. Guo C., Liu H., Wang J., Chen J. / Conformational structure of triblock copolymers by FT-Raman andFTIR spectroscopy II J. Colloid Interface Sci. 1999. V. 209. P. 368-373.

292. Hvidt S., Trandum C., Batsberg W. / Effects of Poloxamer Polydispersity on Micellization in Water II J. Colloid Interface Sci. 2002. V. 250. P. 243-250.

293. Linse P. / Micellization of Poly(ethylene oxide)-Poly(propylene oxide) BlockCopolymer in Aqueous Solution: Effect of Polymer Impurities //Macromolecules. 1994. V. 27. P. 26852693.

294. Alexandridis P., Athanassiou V., Fukuda S., Hatton T.A. / Surface Activity of Poly(ethylene oxide)-block-Poly(propylene oxide)-block-Poly(ethylene oxide) Copolymers. II Langmuir. 1994. V. 10. P. 2604-2612.

295. Batrakova E.V., Lee S., Li S., Venne A., Alakhov V.Y., Kabanov A.V. / Fundamental relationships between the compositionof Pluronic block copolymers and their hypersensitisation effect in MDR cancer cells. II Pharm. Res. 1999. V. 16. P. 1373-1379.

296. Lopes J.R., Loh W. / Investigation of self-assembly and micelle polarity for a wide range of ethylene oxide-propylene oxide-ethylene oxide block copolymers in water. //Langmuir. 1998. V. 14. P.750-756.

297. Mortensen K., Pedersen J.S. / Structural Study on the Micelle Formation of Polyethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymer in Aqueous Solution II Macromolecules. 1993. V. 26. P. 805-812.

298. Alexandridis P., Nivaggioli Т., Hatton T.A. / Temperature Effects on Structural Properties of Pluronic® P104 and F108 PEO-PPO-PEO Block Copolymer Solutions II Langmuir. 1995. V. 11. P. 1468-1476.

299. Nagarajan R. / Solubilization of Hydrocarbons and Resulting Aggregate Shape Transitions in Aqueous Solutions of Pluronic® (PEO-PPO-PEO) Block Copolymers. II Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1999. V. 16. P. 55-72.

300. Hurter P.N., Scheutjens J.M.H.M., Hatton T.A. / Molecular Modeling of Micelle Formation and Solubilization in Block Copolymer Micelles. 1. A Self-Consistent Mean-Field Lattice Theory. //Macromolecules. 1993. V. 26. P. 5592-5601.

301. Hurter P.N., Scheutjens J.M.H.M., Hatton T.A. / Molecular Modeling of Micelle Formation and Solubilization in Block Copolymer Micelles. 2. Lattice Theory for Monomers with Internal Degrees of Freedom. //Macromolecules. 1993. V. 26. P. 5030-5040.

302. Su Y.-L., Wang J., Liu H.-Z. / Melt, hydration, and micellization of the PEO-PPO-PEO block copolymer studied by FTIR spectroscopy. II J. Colloid Interface Sci. 2002. V. 251. P. 417^123.

303. Liu Y., Chen S.-H., Huang J.S. / Light-Scattering Studies of Concentrated Copolymer Micellar Solutions. // Macromolecules. 1998. V. 31. P. 6226-6233.

304. Zipfel J., Lindner P., Tsianou M., Alexandridis P., Richtering W. / Shear-induced formation of multilamellar vesicles ("onions") in block copolymers. II Langmuir. 1999. V. 15. P. 25992602.

305. Mel'nikova Y.S. / Vesicles formed from a poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymer in dilute aqueous solution. I I Macromolecules. 1999. V. 32. P.6885-6888.

306. Bryskhe K., Jansson J., Topgaard D., Schillen K., Olsson U. / Spontaneous Vesicle Formation in a Block Copolymer System. Hi. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 9710-9719.

307. Altinok Н., Yu G.-E., Nixon S.K., Gorry P.A., Attwood D., Booth C. / Effect of Block Architecture on the Self Assembly of Copolymers of Ethylene Oxide and Propylene Oxide in Aqueous Solution. //Langmuir. 1997. V. 13. P. 5837-5848.

308. Alexandridis J.F., Holzwarth P. / Differential Scanning Calorimetry Investigation of the effect of salts on aqueous solution properties of an amphiphilic block copolymer (Poloxamer) //Langmuir. 1997. V. 13. P. 6074-6082.

309. Aswal V.K., Goyal P.S, Kohlbrecher J, Bahadur P. / SANS study of salt-induced micellization in PEO-PPO-PEO block copolymers. H Chem. Phys. Lett. 2001. V. 349. P. 458-462.

310. Liu K.-J. / Nuclear magnetic resonance studies of polymer solutions. V. Cooperative effects in the ion-dipole interaction between potassium iodide and polyfethylene oxide). // Macromolecules. 1968. V. 1. P. 308-311.

311. Annis В. K., Badyal Y. S., Simonson J. M. / Neutron-Scattering Determination of the Lf Environment in an Aqueous Poly(Ethylene Oxide) Solution II J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 2554-2556.

312. Levins R.J., Ikeda R.M. / Direct Potentiometric Titration of Polyethylene Glycols and Their Derivatives with Sodium Tetraphenylboron. //Anal. Chem. 1965. V. 37. P. 671-675.

313. Liu Т., Xie Y„ Liang D., Zhou S., Jassal C., McNabb M., Hal С. 1, Chuang C.-L., Chu B. / Formation of a Salt-Polymer Complex in L64/Water/CdCh Systems. II Langmuir. 1998. V. 14. P. 7539-7542.

314. Liu L.-Z., Wan Q., Liu Т., Hsiao B.S., Chu B. / Salt-induced polymer gelation and formation of nanocrystals in a polymer-salt system /Langmuir. 2002. V. 18. P. 10402-10406.

315. Higuchi A., Sugiyama K., Yoon B.O., Sakurai M., Нага M., Sumita M., Sugawara S., Shirai T. / Serum protein adsorption and platelet adhesion on pluronic-adsorbed polysulfone membranes. II Biomaterials. 2003. V. 24. P. 3235-3245.

316. Bohner M., Ring T.A., Rapoport N., Caldwell K.D. / Fibrinogen adsorption by PS latex particles coated with various amounts of a PEO/PPO/PEO triblock copolymer. II J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2002. V. 13. P. 733-746.

317. Kidane A., McPherson Т., Shim H.S., Park K. / Surface modification of polyethylene terephthalate using PEO-polybutadiene-PEO triblock copolymers. // Colloids Surf В Biointerfaces. 2000. V. 18. P. 347-353.

318. Freij-Larsson С., Jannasch P., Wesslen В. / Polyurethane surfaces modified by amphiphilic polymers: effects on protein adsorption.!1 Biomaterials. 2000. V.21. P. 307-315.

319. Alaerts J.A., De Cupere V.M., Moser S., Van den Bosh de Aguilar P., Rouxhet P.G. / Surface characterization of polyfmethyl methacrylate) microgroovedfor contact guidance of mammalian cells. II Biomaterials. 2001. V. 22. P. 1635-1642.

320. Hoffman T.L., Canziani G., Jia L., Rucker J., Doms R.W. /А biosensor assay for studying ligand-membrane receptor interactions: binding of antibodies and HIV-1 Env to chemokine receptors. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P.l 1215-11220.

321. Li J.-T., Caldwell K.D. / Plasma protein interactions with Pluronic™-treated colloids. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1996. V.7. P. 9-22.

322. Green, R.J., Davies, M.C., Roberts, C.J., Tendler, S.J.B. / A surface plasmon resonance study of albumin adsorption to PEO-PPO-PEO triblock copolymers. II J. Biomed. Mater. Res. 1998. V. 42. P. 165-171.

323. Топчиева И.Н., Ефремова H.B., Снитко Л.Э., Хворов Н.В. / Термоиндуцированное комплексообразование между а -химотрипсином и амфифтьным блок-сополимером. И ДАН СССР 1994. Т. 339. С. 498-502.

324. Топчиева И.Н., Сорокина Е.И., Курганов Б.И., Жулин В.М. / Комплексообразование между а-хшотрипсином и блок-сополимерами на основе окиси этилена и окиси пропилена, индуцируемое действием высоких давлений. //Биохимия. 1996. Т. 61. С. 1041-1045.

325. Lojewska Z., Loew L.M. / Insertion of amphiphilic molecules into membranes is catalyzed by a high molecular weight nonionic surfactant.11 Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 899. P. 104-112.

326. Топчиева И.Н., Осипова C.B., Банацкая М.И., Валькова Л.А. / Мембранотропные свойства блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена. II ДАН СССР 1989. Т. 308. С. 910-913.

327. Firestone M.A., Seifert S. / Interaction of nonionic PEO-PPO diblock copolymers with lipidbilayers. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2678-2687.

328. Jamshaid M., Farr S. J., Kearney P. Kellaway I.W. / Poloxamer sorption on liposomes: comparison with polystyrene latex and influence on solute efflux. // Int. J. Pharm. 1988. V. 48. P. 125-131.

329. Kostarelos К., Tadros Th.F., Lusckham P.F. / Physical conjugation of (tri-)block copolymers to liposomes toward the constration of sterically stabilized vesicle systems. II Langmuir. 1999. V. 15. P. 369-376.

330. Johnsson M., Silvander M., Karlsson G., Edwards K. / Effect of PEO-PPO-PEO triblock copolymers on structure and stability of phosphatidylcholine liposomes. II Langmuir. 1999. V. 15. P.6314-6325.

331. Krylova O.O, Pohl P. / Ionophoric activity of pluronic block copolymers II Biochemistry. 2004. V. 43. P. 3696-3703.

332. Wu G., Majewski J., Ege C., Kjaer K., Weygand M.J., Lee K.Y.C. / Lipid Corralling and Poloxamer Squeeze-Out in Membranes. II Phys. Rev. Lett. 2004. V. 93. P. 028101-1-0281014.

333. Chandaroy P., Sen A., Hui S.W. / Temperature-controlled content release from liposomes encapsulating Pluronic F127. //J. Control Release. 2001. V. 76(1-2). P. 27-37.

334. Bergstrand N., Edwards K. / Effects of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-polyfethylene oxide) triblock copolymers on structure and stability of liposomal dioleoylphosphatidylethanolamine. II J. Colloid Interface Sci. 2004. V. 276. P. 400-407.

335. Moghimi S.M., Hunter A.C. / Poloxamers andpoloxamines in nanoparticle engineering and experimental medicine, II Trends Biotechnol. 2000. V. 18. P. 412-420.

336. Lowe K.C., Armstrong F.H. / Oxygen-transport fluid based on perfluorochemicals: effects on liver biochemistry. //Adv. Exp. Med. Biol. 1990. V. 277. P. 267-276.

337. Bentley P.K., Johnson O.L, Davis S.S., Lowe K.C., Washington C. / Purification of pluronic F68 for perfluorochemical emulsification. II J. Pharm. Pharmacol. 1989. V. 41. P. 661-663.

338. Иваницкий Г.Р., Белоярцев Ф.Ф. / Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфториованныхуглеводородов. //Пущино, С.1-350, 1983.

339. Gever R.P. / Perfluorochemicals as oxygen transport vesicles. II Artif. Cells Artif. Organs. 1988. V. 16. P. 31-49.

340. Omyanagi H., Uchida Т., Saitoh Y., Watanabe M., Yamanouchi K., Yokoyama K., Mitsuno T. / Exended use of Fluosol emulsion on acute myocardial ishemia treatment. II Biomater., Artif. Cells & Immobiliz. Biotechnology. 1992. V. 20. P. 941-949.

341. Forman М.В., Ingram D.A., Murray J.J. / Role of perfluorochemical emulsions in the treatment of myocardial reperfusion injury. //American Heart J. 1992. V. 124. P. 1347-1357.

342. Babbitt D.G., Forman M.B., Jones R., Bajaj A.K., Hoover R.L. / Prevention of neutrophil-mediated injury to endothelial cells by perfluorochemical. II American J. Pathol. 1990. P. 136. V. 451-459.

343. Justicz A.G., Farnsworth W.V., Soberman M.S., Tuvlin M.V., Bonner G.D., Hunter R.L., Martino-Saltzman D. / Reduction of myocardial infarct size by poloxamer 188 and mannitol in a canine model. II American Heart J. 1991. V. 122. P. 671-680.

344. Carr M.E., Rowers R., Jones M.R. / Effects of poloxamer 188 on the assembly structure and dissolution of fibrin clots. II Thrombosis & Haemostasis. 1991. P. 565-568.

345. Segel L.D., Minten J.M., Schweighardt F.K. / Fluorochemical emulsion APE-LM substantially improves cardial preservation. II American J. Physiology. 1992. V. 263. P. 730739.

346. Detrait E., Lhoest J.B., Bertrand P., van den Bosch de Aguilar P. / Fibronectin-pluronic coadsorption on a polystyrene surface with increasing hydrophobicity: relationship to cell adhesion. Hi. Biomed. Mater. Research. 1999. V. 45. P. 404-413.

347. Ilium L., Davis S.S. / Effect of nonionic surfactant Poloxamer 338 on the fate and desposition polystyrene microspheres following intravenous administration. II J. Pharmaceutical Sci. 1983. V. 72. P. 1086-1089.

348. Ilium L., Davis S.S. / The organ uptake of intravenously administrated colloidal particles can be altered using nonionic surfactant (Poloxamer 338). FEBS Lett. 1984. V. 167. P. 7982.

349. Allison A.C., Byars N.E. / An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and of cell-mediated immunity. // J. Immunol. Methods. 1986. V. 95. P. 157-168.

350. Hunter R., Strickland F., Kezdy F. / The adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants. I. The role of hydrophile-lipophile balance. //J. Immunol. 1981. V. 127. P. 1244-1250.

351. Howerton D.A., Hunter R.L., Ziegler H.K., Check l.J. / Induction of macrophage I-a expression in vivo by a synthetic block copolymer L81. II J. Immunol. 1990. V. 144. P. 15781584.

352. Zhang Z., al-Rubeai M., Thomas C.R. / Effect of Pluronic F-68 on the mechanical properties of mammalian cells. //Enzyme Microb. Technol. 1992. V. 14. P. 980-983.

353. Togo Т., Alderton J.M., Bi G.Q., Steinhardt R.A. / The mechanism of facilitated cell membrane resealing. // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 719-731.

354. Paustian P.W., McPherson J.C., Haase R.R., Runner R.R., Plaoman K.M., Ward D.F., Nguyen F.H. / Intravenous Pluronic F127 in early burn wound treatment in rats. // Burns 1993. V. 19. P. 187-191.

355. Schmolka I.R. / Artificial skin. I. Preparation and properties of pluronic F-127 gels for treatment of burns. //J. Biomed. Mater. Res. 1972. V. 6. P. 571-582.

356. Nalbandian R.M., Henry R.L., Balko K.W., Adams D.V., Neuman N.R. / Pluronic F-127 gel preparation as an artificial skin in the treatment of third-degree burns in pigs. II J. Biomed. Mater. Res. 1987. V. 21. P. 1135-1148.

357. Greenebaum В., Blossfield K., Hannig J., Carrillo C.S., Beckett M.A., Weichselbaum R.R., Lee R.C. / Poloxamer 188 prevents acute necrosis of adult skeletal muscle cells following high-dose irradiation. //Burns. 2004. V. 30. P. 539-547.

358. Hannig J., Zhang D., Canaday D.J., Beckett M.A., Astumian R.D., Weichselbaum R.R., Lee R.C. / Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. // Radiat Res. 2000. V. 154. P. 171-177.

359. Lowe К.С, Anthony P., Davey M.R., Power J.B. / Beneficial effects of Pluronic F-68 and artificial oxygen carriers on the post-thaw recovery of cryopreserved plant cells. II Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2001. V. 29. P. 297-316.

360. Anthony P., Lowe K.C., Davey M.R., Power J.B. / Enhanced post-thaw viability of cryopreserved cells by oxygenated perfluorocarbon or Pluronic F-68. // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1998. V. 26. P. 27-33.

361. Maruyama I., Hasegawa Т., Yamamoto Т., Momose K. / Effects of pluronic F-127 on loading of Fura 2/AM into single smooth muscle cells isolatedfrom guinea pig taenia coli. II J. Toxicol. Sci. 1989. V. 14. P. 153-163.

362. Owen C.S. / Quantitation of lymphocyte intracellular free calcium signals using indo-1. // Cell Calcium. 1988. V. 9. P. 141-147.

363. Amorino G.P., Fox M.H. / Intracellular Na+ measurements using sodium green tetraacetate with flow cytometry. 11 Cytometry. 1995. V. 21. P. 248-256.

364. Clarke M.S., McNeil P.L. / Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol. II J. Cell Sci. 1992. V. 102. P. 533-541.

365. Waldman A.S., Waldman B.C. / Stable transfection of mammalian cells by syringe-mediated mechanical loading of DNA. //Anal. Biochem. 1998. V. 258. P. 216-222.

366. Comai K., Sullivan A.C. / Antiobesity activity of pluronic L-101. И Int. J. Obes. 1980. V. 4. P. 33-42.

367. Johnston T.P., Palmer W.K. / Effect of poloxamer 407 on the activity of microsomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase in rats. II J. Cardiovasc. Pharmacol. 1997. V. 29. P. 580-585.

368. Доборджгинидзе JI.M., Грацианский H.A. / Дислипидемии: липиды и липопротеины, метаболизм и участие в атерогепезе. // Русский медицинский журнал. 2000. Т. 8. С. 269-276.

369. Nutting D., Hall J., Barrowman J.A., Tso P. / Further studies on the mechanism of inhibition of intestinal chylomicron transport by Pluronic L-81. II Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 1004. P. 357-362.

370. Black D.D. / Effect of intestinal chylomicron secretory blockade on apolipoprotein synthesis in the newborn piglet. II Biochem. J. 1992. V. 283. P. 81-85.1. Список литературы

371. Hussain М.М., Kedees М.Н., Singh К., Athar H., Jamali N.Z. / Signposts in the assembly of chylomicrons. II Front. Biosci. 2001. V. 6. P. 320-331.

372. Abe Т., Sasaki M., Nakajima H., Ogita M., Naitou H., Nagase A., Taguchi K., Miyazaki S. / Evaluation of Pluronic F127 as a base for gradual release of anticancer drug. II Gan to Kagaku Ryoho 1990. V. 17. P. 1546-1550.

373. Morishita M., Barichello J.M., Takayama K., Chiba Y„ Tokiwa S., Nagai T. / Pluronic F-127 gels incorporating highly purified unsaturated fatty acids for buccal delivery of insulin. //Int. J. Pharmacol. 2001. V. 212. P. 289-293.

374. Bromberg L.E. / Interactions among proteins and hydrophobically modified polyelectrolytes. //J. Pharm. Pharmacol. 2001. V. 53. P. 541-547.

375. Morikawa K., Okada F., Hosokawa M., Kobayashi H. / Enhacement of therapeutic effects of recombinant interleukin 2 on a transplantable rat fibrosarcoma by the use of a sustained release vehicle, Pluronic gel. II Cancer Res. 1987. V. 47. P. 37-41.

376. Johnston T.P., Dunjabi M.A., Froelich C.J. / Sustained delivery of interleukin-2 from poloxamer 407 gel matrix following intraperitonal injection in mice. И Pharm. Res. 1992. V. 9. P. 425-434.

377. Batrakova E.V., Han H.Y., Miller D.W., Kabanov A.V. / Effects of pluronic P85 unimers and micelles on drug permeability in polarized BBMEC and Caco-2 cells. // Pharm. Res. 1998. V. 15. P. 1525-1532.

378. Munshi N., Rapoport N., Pitt W.G. / Ultrasonic activated drug delivery from Pluronic P-105 micelles. //Cancer Lett. 1997. V. 118. P. 13-19.

379. Husseini G.A., Myrup G.D., Pitt W.G., Christensen D.A., Rapoport N.Y. / Factors affecting acoustically triggered release of drugs from polymeric micelles. II J. Control. Release. 2000. V. 69. P. 43-52.

380. Marin A., Muniruzzaman M., Rapoport N.Y. / Mechanism of the ultrasonic activation of micellar drug delivery. //J. Control. Release. 2001. V. 75. P. 69-81.

381. Ставровская A.A. / Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. И Биохимия. 2000. Т. 65. С. 112-126.

382. Borst P., Elferink R.O. / Mammalian ABC transporters in health and disease. II Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 537-592.

383. Ambudkar S.V., Kim I.W., Sauna Z.E. / The power of the pump: mechanisms of action of P-glycoprotein (ABCB1). //Eur. J. Pharm Sci. 2006. V. 27. P. 392-400.

384. Lage H. / ABC-transporters: implications on drug resistance from microorganisms to human cancers. II Int. J. Antimicrob. Agents. 2003. V. 22. 188-199.

385. Akiama S. / Molecular basis for resistance to anticancer agents and reversal of the resistance. // Human Cell. 1993. V. 6. P. 1-6.

386. Damiani D., Michieli M., Michelutti A., Melli C., Cerno M., Baccarani M. (1993) / D-verapamil dounmodulates P-170 associated resistance to doxorubicin, daunorubicin and idarubicin. //Anti-cancer Drug. 1993. V. 4. P. 173-180.

387. Hinderburg A.A., Baker M.A., Gleyzer E., Stevart V.J., Case N„ Taub R.N. / Effects of verapamil and other agents on the distribution on antracyclines and of reversal of drug resistance. II Cancer Res. 1987. V. 47. P. 1421-1425.

388. Cornwell M.M., Pastan I., Gottesman M.M. / Certain calcium channel blockers bind specifically to multidrug resistant human KB carcinoma membrane vesicles and inhibit drug binding to P-glycoprotein. II J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 2166-2170.

389. Sedlacek H.H. / Mechanisms of action offlavopiridol. II Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001. V. 38. P. 139-170.

390. Castro A.F., Horton J.K., Vanoye C.G., Altenberg G.A. / Mechanism of inhibition of P-glycoprotein-mediated drug transport by protein kinase С blockers. II Biochem. Pharmacol. 1999. V. 58. P. 1723-1733.

391. Venne A., Li S., Mandeville R., Kabanov A., Alakhov V. Hypersensitizing effect of pluronic L61 on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug-resistant cells. //Cancer Res. 1996. V. 56. P. 3626-3629.

392. Batrakova E.V., Li S„ Li Y„ Alakhov V.Y., Kabanov A.V. / Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters. II Pharm. Res. 2004. V. 21. P. 2226-2233.

393. Miller D.W., Batrakova E.V., Kabanov A.V. / Inhibition of multidrug resistance-associated protein (MRP) functional activity with pluronic block copolymers. II Pharm. Res. 1999. V. 16. P. 396-401.

394. Coon J.S., Knudson W., Clodfelter К., Lu В., Weinstein R.S. / Solutol HS 15, nontoxic polyoxyethylene esters of 12-hydroxystearic acid, reverses multidrug resistance. Cancer Res. 1991, V. 51. P. 897-902.

395. Buckingham L.E., Balasubramanian M., Safa A.R., Shah H., Komarov P., Emanuele R.M., Coon J.S. / Reversal of multi-drug resistance in vitro by fatty acid-PEG-fatty acid diesters. II Int. J. Cancer. 1996. V. 65, P. 74-79.

396. Friche E., Jensen P.B., Sehested M., Demant E.R., Nissen N.N. / The solvents Cremohpor EL and Tween 80 modulate daunorubicin resistance in the multidrag resistant Ehrlich ascites tumor. //Cancer Commun. 1990. V. 2. P. 297-303.

397. Batrakova E.V., Miller D.W., Li S., Alakhov V.Y., Kabanov A.V., Elmquist W.F. / Pluronic P85 enhances the delivery of digoxin to the brain: in vitro and in vivo studies. II J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. V. 296. P. 551-557.

398. Hendrich A.B, Michalak K. / Lipids as a target for drugs modulating multidrug resistance of cancer cells. И Curr. Drug Targets. 2003. V. 4. P. 23-30.

399. G.S. Manning / Simple model for the binding of a polyelectrolyte to an oppositely charged curved Surface. II J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. P. 11485-11490.

400. Meier-Koll A.A., Fleck C.C., von Griinberg H.H.A.A. / The counterion-release interaction. //J. Phys.: Condens. Matter. 2004. V. 16. P. 6041-6052.

401. Akesson, Т., Woodward, C., Jonsson, B.J. / Electric double layer forces in the presence of polyelectrolytes. Hi. Chem Phys. 1989. V. 91. P. 2461-2469.

402. Linse P., / Adsorption of weakly charged polyelectrolytes at oppositely charged surfaces. // Macromolecules. 1996. V. 29. P. 326-336.

403. Brynda M., Chodanowski P., Stoll S. / Polyelectrolyte-particle complex formation. Polyelectrolyte linear charge density and ionic concentration effects. 11 Colloid and Polymer Sci. 2002. V. 280. P. 789-797.

404. Pfau A., Schrepp W., Horn D. / Detection of a single molecule adsorption structure of poly(ethylenimine) macromolecules byAFM. //Langmuir. 1996. V. 15. P. 3219-3225.

405. Сухишвили C.A., Полинский A.C., Ярославов A.A., Чечик О.С., Кабанов В.А. / Об обратимости адсорбции поликатиона на противоположно заряженных латексных частицах. Н ДАН СССР. 1989. Т. 302. С. 848-852.

406. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A. / What happens to negatively charged lipid vesicles upon interacting with polycation species? II J. Control. Release. 2002. V. 78. P. 267-271.

407. Sennerfors Т./ Interfacial Behavior of Polymer-Nanoparticle Complexes: Fundamentals and Applications, II In: Encyclopedia of Surface and Colloid Science, Marcel Decker, 2002.

408. Afshar-Rad Т., Bailey A.I., Luckham P.F., Macnaughtan W., Chapman D. / Forces between poly-L-lysine of molecular range 4000-75000 adsorbed on mica surfaces. II Colloids Surf.1987. V. 25. P. 263-270.

409. Buchhammer H.-M., Petzold G., Lunkwitz K. / Nanoparticles based on polyelectrolyte complexes: effect of structure and net charge on the sorption capability for solved organic molecules. II Colloid Polymer Sci. 2000. V. 278. P. 841-847.

410. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. / A fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers. II Biochim. Biophys. Acta, 1983. V. 820.P. 131-139.

411. Franzin C.M., Macdonald P.M. / Polylysine-induced 2H NMR-observable domains in phosphatidylserine/phosphatidylcholine lipid bilayers. II Biophys. J. 2001, V. 81. P. 33463362.

412. Laroche G., Dufourc E.J., Pezolet M., Dufourcq J. / Coupled changes between lipid order and polypeptide conformation at the membrane surface. A 2H-NMR and Raman study of polylysine-phosphatidic acid systems. II Biochemistry. 1990. V. 29. P. 6460-6465.

413. Laroche G., Carrier D., Pezolet M. / Study of the effect ofpoly(L-lysine) on phosphatidic acid andphosphatidylcholine/phosphatidic acid bilayers by Raman spectroscopy. //Biochemistry.1988. V. 27. P. 6220-6228.

414. Mitrakos P., Macdonald P.M. / Domains in cationic lipid plus polyelectrolyte bilayer membranes: detection and characterization via 2H nuclear magnetic resonance. И Biochemistry. 1997. V. 36. P. 13646-13656.

415. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D. / 2HNMR and polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayers. II Solid State Nucl. Magn. Reson. 2000. V. 16. P. 21-36.

416. Mitrakos P., Macdonald P.M. / Nucleotide chain length and the morphology of complexes with cationic amphiphiles: (31)P-NMR observations. II Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1463. P. 355-373.

417. Mitrakos P., Macdonald P.M. / DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via 2H NMR. II Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1671416722.

418. Lafleur M., Samson I., Pezolet M. / Investigation of the interaction between melittin and dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers by vibrational spectroscopy // Chem. Phys. Lipids. 1991. V. 59. P. 233-244.

419. Nabet A., Boggs J.M., Pezolet M. / Study by infrared spectroscopy of the interaction of bovine myelin basic protein with phosphatidic acid. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 1479214799.

420. Yaroslavov A.A., Yaroslavova E.G., Rakhnyanskaya A.A., Menger F.M., Kabanov V.A. / Modulation of interaction of polycations with negative unilamellar lipid vesicles. II Colloids Surf. B. 1999. V. 16. P. 29-43.

421. Welti R., Glaser M. / Lipid domains in model and biological membranes. // Chem. Phys. Lipids. 1994. V. 73. P. 121-137.

422. Mitrakos P., Macdonald P.M. / Polyelectrolyte molecular weight and electrostatically-induced domains in lipid bilayer membranes. //Biomacromolecules. 2000. V.l. P. 365-376.

423. Hartmann W., Galla H.J. / Binding of polylysine to charged bilayer membranes: molecular organization of a lipid-peptide complex. II Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 509. P. 474490.

424. Roux M., Neumann J.M., Hodges R.S., Devaux P.F., Bloom M. / Conformational changes of phospholipid headgroups induced by a cationic integral membrane peptide as seen by deuterium magnetic resonance. //Biochemistry. 1989. V. 28. P. 2313-2321.

425. Engelking J., Wittemann M., Rehahn M., Menzel H., / UV/Vis spectroscopic monitoring of polyelectrolyte adsorption onto monolayers of azobenzene amphiphiles. // Langmuir. 2000. V. 16. P.3407-33413.

426. Кученкова O.E., Ярославов A.A., Кабанов B.A. / Размер отрицательно заряженных липосом решающим образом влияет на их взаимодействие с полилизином. П Доклады Акад. Наук. 1999. Т. 369. С. 778-780.

427. Kleinschmidt J.H., Marsh D. / Spin-label electron spin resonance studies on the interactions of lysine peptides with phospholipid membranes. II Biophys. J. 1993. V.73. P. 2546-2555.

428. Ikeda Т., Yamaguchi H., Tazuke S. / Phase separation in phospholipid bilayers induced by biologically active polycations. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1026. P. 105-112.

429. Madeira C., Loura L.M., Aires-Barros M.R., Fedorov A., Prieto M. / Characterization of DNA/lipid complexes by fluorescence resonance energy transfer. И Biophys. J. 2003. V. 85. P. 3106-3119.

430. Pawagi А.В., Campbell I.M. / Vesicle surface charge and polylysine modification of ultraviolet absorption by the olefinic bonds in charged lipid. II Can J Biochem. 1981. V. 59. P. 404-411.

431. Carrier D, Pezolet M. / Raman spectroscopic study of the interaction of poly-L-lysine with dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers. II Biophys. J. 1984. V. 46. P. 497-506.

432. Krylov A.V., Antonenko Y.N., Kotova E.A., Rokitskaya T.I., Yaroslavov A.A. / Polylysine decelerates kinetics of negatively charged gramicidin channels as shown by sensitized photoinactivation. IIFEBS Lett. 1998. V. 440. P. 235-238.

433. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. IA fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers. H Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. P. 131-139.

434. Carrier D., Pezolet M. / Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol interactions in model membranes. И Biochemistry. 1986. V. 25. P. 4167-4174.

435. Hartmann W., Galla H.J. / Binding of polylysine to charged bilayer membranes: molecular organization of a lipid-peptide complex. II Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 509. P. 474490.

436. Haest C.W., Oslender A., Kamp D. / Nonmediated flip-flop of anionic phospholipids and long-chain amphiphiles in the erythrocyte membrane depends on membrane potential. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10885-10891.

437. Walter A., Steer C.J., Blumenthal R. / Polylysine induces pH-dependent fusion of acidic phospholipid vesicles: a model for polycation-induced fusion. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 861. P. 319-330.

438. Bondeson J., Sundler R. / Promotion of acid-induced membrane fusion by basic peptides. Amino acid and phospholipid specificities. II Biochim. Biophys. Acta. V. 1026. P. 186-194.

439. Epand RM, Lim W. I Mechanism of liposome destabilization by polycationic amino acids. II Biosci. Rep. 1995. V. 15. P. 151-160.

440. Coakley W.T., Heweison L.A., Tilley D. / Interfacial instability and the agglutination of erythrocytes by polylysine. II Eur. Biophys. J. 1985. V. 13. P. 123-130.

441. Hewison L.A., Coakley W.T., Meyer H.W. / Spatially periodic discrete contact regions in polylysine-induced erythrocyte-yeast adhesion. II Cell Biophys. 1988. V. 13. P. 151-157.

442. Dwyer D.M. / Cell surface saccharides of Trypanosoma lewisi. I. Polycation-induced cell agglutination andfine-structure cytochemistry. Hi. Cell Sci. 1975. V. 19. P. 621-644.

443. Hancock R.E. / The bacterial outer membrane as a drug barrier. II Trends Microbiol. 1997, V. 5, P. 37-42.

444. Kabanov V.A., Petrov R.V., Khaitov R.M. / Artificial antigenes and vaccines based on non-natural polyelectrolytes. II Sov. Sci. Rev. D, Physicochemical Biology. 1984. V.5. P. 277322.

445. Петров P.B., Хаитов P.M. / Исскуственные антигены и вакцины II М., Медицина, 1988.

446. Kabanov V.A. / Synthetic membrane active polyelectrolytes in design of artificial immunogenes and vaccines. II Makromol. Chem., Macromol Symp. 1986. V.l. P. 101-124.

447. Кабанов B.A., Петров P.B., Хаитов P.M. / Новый принцип создания искусственных иммуногенов // Журн. Всесоюз. Хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1982. Т. 27. С. 417424.

448. Santini М.Т., Cametti С., Indovina P.L., Morelli G., Donelli G. / Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells. II J. Biomed. Mater. Res. 1997. V. 35. P. 165-174.

449. Schneeman R., Krogmann D.W. / Polycation interactions with spinach ferredoxin-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reductase. II J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 4965-4971.

450. Sachs J.R. / Soluble polycations and cationic amphiphiles inhibit volume-sensitive K-Cl cotransport in human red cell ghosts. II Am. J. Physiol. 1994. V.266. P. C997-C1005.

451. McEwan G.T.A., Jepson M.A., Hirst B.H., Simmons N.L. / Poly cation-induced enhancement of epithelial paracellular permeability is independent of tight junctional characteristics. II Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1148. P. 51-60.

452. Peterson M.W., Gruenhaupt D. / Protamine increases the permeability of cultured epithelial monolayers. II J. Appl. Physiol. 1990. V.68. P. 220-227.

453. Peterson M.W., Gruenhaupt D. / Protamine interaction with the epithelial cell surface. II J.Appl. Physiol. 1992. V.72. P.236-241.

454. Uchida D.A., Irvin C.G., Ballowe C., Larsen G., Cott G.R. / Cationic proteins increase the permeability of cultured rabbit tracheal epithelial cells: modification by heparin and extracellular calcium II Exp. Lung. Res. 1996. V.22. P.85-99.

455. Elferink J.G., Deierkauf M. / Permeabilization and calcium-dependent activation of rabbit polymorphonuclear leukocytes by poly-L-arginine. II Inflammation. 1989. V. 13. P. 285-294.

456. Katsu Т., Yoshimura S., Fujita Y. / Increases in permeability of Escherichia coli outer membrane induced by polycations. IIFEBS Lett. 1984. V. 166. P. 175-178.

457. Vaara М. / Agents that increase the permeability of the outer membrane. II Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 395-411.

458. Hammes M., Singh A. / Effect of polycations on permeability of glomerular epithelial cell monolayers to albumin. II J. Lab. Clin. Med. 1994. V. 123. P. 437-446.

459. Vehaskari V.M., Root E.R., Germuth F.G. Jr., Robson A.M. / Glomerular charge and urinary protein excretion: effects of systemic and intrarenal polycation infusion in the rat. H Kidney Int. 1982. V. 22. P. 127-135.

460. Hunsicker L.G., Bertolatus J.A. / Charged compounds of the glomerular filter and their role in normal and disorderedpermselectivity. II Artif. Organs. 1987. V. 11. P. 468-477.

461. Hunsicker L.G., Shearer T.P., Shaffer S.J. I Acute reversible proteinuria induced by infusion of the polycation hexadimethrine И Kidney Int. 1981. V. 20. P. 7-17.

462. Andrews P.M., Bates S.B. / Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. //Anat. Rec. 1985, V.212. P. 223-231.

463. Bertolatus J.A., Abuyousef M., Hunsicker L.G. / Glomerular sieving of high molecular weight proteins in proteinuric rats. И Kidney Int. 1987. V. 31. P. 1257-1266.

464. Wang Z., Liu Z., Zhang X., Tan J. / Changes in glomerular polyanions and ultrastructure induced by protamine in rats. II Hua Hsi I Ко Та Hsueh Hsueh Pao. 1992. V. 23. P. 272-275.

465. Konig Т., Kocsis В., Meszaros L., Nahm K., Zoltam S., Horvath 1./ Interaction of a synthetic polyanion with rat liver mitochondria. II Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 462. P. 380-389.

466. Colombini M., Yeung C.L., Tung J., Konig T. / The mitochondrial outer membrane channel, VDAC, is regulated by a synthetic polyanion. II Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 905. P. 279-286.

467. Jones R.A., Cheung C.Y., Black F.E., Zia J.K., Stayton P.S., Hoffman A.S., Wilson M.R./ Poly(2-alkylacrylic acid) polymers deliver molecules to the cytosol by pH-sensitive disruption of endosomal vesicles. И Biochem. J. 2003. V. 372. P. 65-75.

468. Hunter A.C. / Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. II Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. V. 58. P. 1523-1531.

469. Cho Y.W., Kim J.D., Park K. / Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol. И J. Pharm. Pharmacol. 2003. V. 55. P. 721-734.

470. Li H, Qian Z.M. / Transferrin/transferrin receptor-mediated drug delivery. // Med. Res. Rev. 2002. V. 22. P. 225-250.

471. Kircheis R., Wightman L., Wagner E. / Design and gene delivery activity of modified polyethylenimines. //Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 53. P. 341-358.

472. Kircheis R., Blessing Т., Brunner S., Wightman L., Wagner E. / Tumor targeting with surface-shielded ligand-polycation DNA complexes. II J. Control. Release 2001. V. 72. P. 165-170.

473. Lee C.C., MacKay J.A., Frechet J.M., Szoka F.C. / Designing dendrimers for biological applications. //.Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 1517-1526.

474. Dufes C., Uchegbu I.F., Schatzlein A.G. / Dendrimers in gene delivery. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2005. V. 57. P. 2177-2202.

475. Yamamoto H., Miki Т., Oda Т., Hirano Т., Sera Y., Akagi M., Maeda H. / Reduced bone marrow toxicity of neocarzinostatin by conjugation with divinyl ether-maleic acid copolymer.// Eur. J. Cancer. 1990. V. 26. P. 253-260.

476. Zunino F., Pratesi G., Pezzoni G. / Increased therapeutic efficacy and reduced toxicity of doxorubicin linked to pyran copolymer via the side chain of the drug. // Cancer Treat. Rep. 1987. V. 71. P. 367-373.

477. Hirano Т., Ohashi S., Todoroki Т., Ihaba M., Tsukagoshi S. /Antitumor activity ofpolyanion and its application for drug delivery system of antitumor drugs. // Gan To Kagaki Ryoho 1990. V. 17. P. 542-547.

478. Konar N., Kim C.J. / Drug release from drug-polyanion complex tablets: poly (acrylamido-2-methyl-l-propanesulfonate sodium -co- methyl methacrylate). // J. Control. Release. 1999. V. 57. P. 141-150.

479. Zhu G., Oto E., Vaage J., Quinn Y., Newman M., Engbers C., Uster P. / The effect of vincristine-polyanion complexes in STEALTH liposomes on pharmacokinetics, toxicity and anti tumor activity. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1996. V. 39. P. 138-142.

480. Gibaud S., Weingarten C., Andreux J.P., Couvreur P. / Targeting bone marrow with the help of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. // Ann. Pharm. Fr. 1999. V. 57. P. 324-331.

481. Bogush, Т., Smirnova, G., Shubina I., Syrkin, A., Robert, J. / Direct evaluation of intracellular accumulation of free and polymer-bound anthracyclines. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1995. V.35. P. 501-505.

482. Oda Т., Sato F., Maeda H. / Facilitated internalization of neocarzinostatin and its lipophilic polymer conjugate, SMANCS, into cytosol in acidic рН. II J. Natl. Cancer Inst. 1987. V. 79. P. 1205-1211.

483. Gerweck L.E., Seetharaman K. / Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. // Cancer Res. 1996. V. 15. P. 1194-1198.

484. Yokoyama M., Kwon G.S., Okano Т., Sakurai Y., Seto Т., Kataoka K. / Preparation of micelle-forming polymer-drug conjugates. //Bioconjug. Chem. 1992. V. 3. P. 295-301.

485. Kwon G.S., Yokoyama M., Okano Т., Sakurai Y., Kataoka K. / Biodistribution of micelle-forming polymer-drug conjugates.// Pharm. Res. 1993. V. 10. P. 970-974.

486. Oh I., Lee K., Kwon H.Y., Lee Y.B., Shin S.C., Cho C.S., Kim C.K. / Release ofadriamycin from poly(gamma-benzyl-L-glutamate)/ poly(ethylene oxide) nanoparticles. // Int. J. Pharm. 1999. V. 181. P. 107-115.

487. Oh I.; Lee K.; Kwon H.Y.; Lee Y.B.; Shin S.C.; Cho C.S.; Kim C.K. / Release ofadriamycin from poly(gamma-benzyl-L-glutamate)fpoly(ethylene oxide) nanoparticles. // Int. J. Pharm. 1999. V. 181. P. 107-115.

488. Janes K.A., Fresneau M.P., Marazuela A., Fabra A., Alonso M.J. / Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin. // J. Control. Release. 2001. V. 73. P. 255-267.

489. Nakanishi Т., Fukushima S., Okamoto K., Suzuki, M., Matsumura, Y., Yokoyama, M., Okano Т., Sakurai Y., Kataoka K. / Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. //J. Control. Release. 2001. V. 74. P. 295-302.

490. Sims G.E.C., Snape T.J. / A method for the estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions. //Anal. Biochem. 1980. V. 107. C. 60-63.

491. Хейфец Л.Б., Абалкин B.A. / Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл. // Лаб. дело. 1973. Т. 10. С. 579-581.

492. Lowry О.Н., Rosenbrought N.J., Farr A.L., Randall R.J./ Protein mesuarement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

493. Финдлей Дж., Эванз У. Биологические мембраны. Методы. II Москва: Мир, С. 13-56, 1990.

494. Дородных Т.Ю. / Мицеллы блок-сополимеров оксида этшена и оксида пропилена (плюроников) для доставки противораковых цитостатиков и лечения опухолей. II диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, МГУ, 1996.

495. Batrakova E.V., Li S., Li Y., Alakhov V.Y., Elmquist W.F., Kabanov A.V. / Distribution kinetics of a micelle-forming block copolymer Pluronic P85. II J. Control. Release. 2004. V. 100. P. 389-397.

496. Зайцев C.B., Варигин К., Варфоломеев С.Д. / Нейропептидо-морфиновые рецепторы. II Московский Университет, Москва, 278 с. 1992.

497. Lin-Chau Chang L.-C., Lin C.-Y., Kuo M.-W., Gau C.-S. / Interactions of Pluronics with phospholipid monolayers at the air-water interface. //J. Colloid Interface Sci. 2005. V. 285. P. 640-652.

498. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. / Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. // Москва, Наука, 279 с. 1986

499. Plasek Y., Yarolim P. / Interaction of the fluorescent probe l,6-diphenyl-l,3,5~hexatriene with biomembranes. //Gen. Physiol. Biophys. 1987. V. 6. P. 425-437.

500. Boon J. M., Smith B. D. / Facilitated Phosphatidylcholine Flip-Flop Across Erythrocyte Membranes Using Low Molecular Weight Synthetic Translocases. И J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 6221-6226.

501. Sasaki Y., Shukla R., Smith B.D. / Facilitatedphosphatidylserine flip-flop across vesicle and cell membranes using urea-derived synthetic translocases. II Org. Biomol. Chem. 2004. V. 2. P. 214-219.

502. Lambert T.N., Boon J.M., Smith B.D., Perez-Payan M.N., Davis A.P. / Facilitated Phospholipid Flip-Flop Using Synthetic Steroid-Derived Translocases. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 5276-5277.

503. Boon J.M., Lambert, T.N., Sisson A.L., Davis, A.P., Smith B.D. / Facilitated Phosphatidylserine (PS) Flip-Flop and Thrombin Activation Using A Synthetic PS Scramblase IIS. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 8195-8201.

504. DiVittorio K.M., Lambert T.N., Smith B.D. / Steroid-derived phospholipid scramblases induce exposure of phosphatidylserine on the surface of red blood cells. II Bioorg. Med. Chem. 2005. V. 13. P. 4485-4490.

505. Ben Ghoulam M., Moatadid N., Graciaa A., Lachaise J. / Effects of Oxyethylene Chain Length and Temperature on Partitioning of Homogeneous Poly oxyethylene Nonionic Surfactants between Water andIsooctane. II Langmuir. 2002. V. 18. P. 4367-4371.

506. Greenwald H. L., Kice E. В., Kenly M., Kelly J. / Determination of the Distribution of Nonionic Surface Active Agents between Water and Iso-octane. II Anal. Chem. 1961. V. 33. P.465-468.

507. Reiner R. I Antibiotics 11 Editions "Roche" Base, Switzerland, 1982.

508. Neidle S., Sanderson M.R. / The interaction of Daunomycin and Adriamycin with nucleic Acids II In: Molecular Aspects of Anti-cancer Drug Action, Ed. S. Neidle and M.J. Waring, The MacMillan Press Ltd. 1983. P. 35-313.

509. Heywang C., Chazalet M. S.-P., Masson M. C., Bolard J. / Orientation of anthracyclines in lipid monolayers and planar asymmetrical bilayers: a surface-enhanced resonance Raman scattering study. //Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2368-2381.

510. Walter A., Gutknecht J. / Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes. //J. Membrane Biol. 1986, V. 90. P. 207-217.

511. Dalmark M. Storm H. H. / A Fickian diffusion transport process with features of transport catalysis. Doxorubicin transport in human red blood cells // J. Gen. Physiol. 1981. V. 78. P. 349-364.

512. Kamp F., Hamilton J.A. / pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop of un-ionizedfatty acids. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11367-11370.

513. Powell G.L., Hui S.W. / Tetraoleoylpyrophosphatidic acid: a four acyl-chain lipid which forms a hexagonal IIphase with high curvature. II Biophys. J. 1996. V. 70. P. 1402-1406.

514. Soderlund Т., Jutila A., Kinnunen P.K.J / Binding of adriamycin to liposomes as a probe for membrane lateral organisation. II Biophys. J. 1999. V. 76. P. 896-907.

515. Epand R.M., Epand R.F. / Calorimetric detection of curvature strain in phospholipid bilayers // Biophys. J. 1994. V. 66. P. 1450-1456.

516. Pei В., Chen J.-W. / More ordered, convex ganglioside-enriched membrane domains: the effects of GM1 on sphingomyelin bilayers containing a low level of cholesterol. II J. Biochem. 2003. V. 134. P. 575-581.

517. Yaroslavova E.G., Yaroslavov, A.A. Kabanov V.A., Menger F.M. / Negatively charged vesicles coated by poly(oxyethylene) layer: interaction with polycations. II Polymer Preprints. 1997. V. 38. P. 640-641.

518. Huang A., Tsao Y.-S., Kennel S.J., Huang L. / Characterization of antibody covalently coupled to liposomes. II Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 716. P. 140-150.

519. Fields R. / The measurement of amino groups in proteins and peptides. II Biochem. J. 1971. V. 124. P.581-590.

520. Birktoft J.J., Blow D.M. / Structure of crystallinea -chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-chymotrypsin at 2 A resolution // J. Mol. Biol. 1972. V. 68. P. 187-240.

521. Menozzi M., Valentini L., Vannini E., Arcamone F. / Self-association of doxorubicin and related compounds in aqueous solution. // J. Pharm.Sci. 1984. V. 73. P. 766-770.1. Благодарности