Взаимодействие амфифильных полимеров с природными и модельными липидными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

0030530Э1 ДЕМИНА

Татьяна Васильевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ С ПРИРОДНЫМИ И МОДЕЛЬНЫМИ ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения по химическим наукам 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2007

003053091

Работа выполнена в лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук

Гроздова Ирина Дмитриевна кандидат химических наук Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Паписов Иван Михайлович доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Ведущая организация: Институт химической физики

им. Н Н Семенова Российской академии наук

Защита состоится 28 февраля 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им М.ВЛомоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан "2Ь" января 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к. х. н.

Долгова А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Устойчивость опухолей к действию лекарственных препаратов, возникающая в процессе химиотерапии, представляет собой серьезное препятствие для успешного лечения онкологических больных. Исследования последних лет показали, что для решения этой проблемы могут быть полезны синтетические амфифильные блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) состава (ЭО)„ 2(ПО)т(ЭО)г„2 - плюроники. Оказалось, что они способны восстанавливать чувствительность раковых клеток, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (MDR-клетки), к противоопухолевым антибиотикам. Благодаря этому свойству и низкой токсичности плюроники были использованы при создании лекарственной формы SP 1049с противоопухолевого антибиотика доксорубицина (DOX), которая в настоящее время проходит клинические испытания за рубежом.

Молекулярный механизм действия плюроников на опухолевые клетки до сих пор непонятен, хотя в. последнее время и в этом направлении достигнуты существенные успехи. Было установлено, что плюроники ингибируют выброс лекарств, осуществляемый белками-транспортерами Р-гликопротеином (P-gp) и MRP (Multidrug Resistance Protein), вызывают уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ и освобождение антибиотиков из внутриклеточных везикул. Взаимодействуют ли плюроники непосредственно с белками-транспортерами или действие полимеров обусловлено влиянием на структуру клеточных мембран, пока неясно. Показано, что встраивание плюроников в модельные липидные бислои вызывает увеличение подвижности липидов и повышение проницаемости бислоя по отношению к лекарству. Причем, активны не мицеллы, а единичные молекулы блок-сополимера, и эффективность их действия зависит от гидрофильно-липофильного баланса макромолекулы. Однако остается неизвестным, какие именно особенности структуры плюроников и входящих в него мономеров определяют его биологическую активность. В связи с этим актуально изучение взаимосвязи между структурой действующего блок-сополимера и его влиянием на свойства природных и модельных лигшдных мембран

Целью работы являлось выявление структурных параметров амфифильных сополимеров, определяющих их способность возмущать структуру мембран и снижать устойчивость MDR-клеток к действию лекарств. Для этого необходимо было решить следующие задачи.

- на липосомах количественно оценить влияние блок-сополимеров с разной структурой гидрофобного и гидрофильного блоков на подвижность липидных молекул в бислое и проницаемость мембраны для БОХ;

- выявить структурные параметры, определяющие способность амфифильных блок-сополимеров влиять на свойства липидной мембраны;

- исследовать влияние блок-сополимеров на токсичность Б ОХ для ШЖ-клеток;

- изучить влияние полимеров на внутриклеточную локализацию и выброс БОХ из ШЖ-клеток с использованием методов конфокальной микроскопии и спектрофлуорометрии.

Научная новизна. В работе впервые количественно охарактеризована способность блок-сополимеров увеличивать трансбислойную подвижность липидов и проницаемость искусственных липидных мембран. Установлено, что эта способность блок-сополимеров зависит от их гидрофобности и объема гидрофобного блока. При близких значениях этих параметров эффект сополимера зависит от структуры гидрофильного блока: новые блок-сополимеры, содержавшие разветвленный блок полиглицерина, были эффективнее по сравнению с плюрониками, гидрофильный блок которых представлен линейной цепью полиэтиленоксида. Обнаружено, что блок-сополимеры на основе пропиленоксида и глицерина (ПГЛ) усиливают токсичность ООХ для МГЖ-клеток, причем эффективность их действия определяется структурой полимера. Выявлен новый блок-сополимер РС2, действующий на МЖ-клегки сильнее, чем плюроник Ь61, который входит в состав противоопухолевого препарата БР 1049с. Показано, что Рй2 ингибирует выброс ООХ из МЖ-клеток и вызывает его перераспределение из цитоплазмы в ядро. Впервые продемонстрировано, что взаимосвязь между структурой блок-сополимеров и их способностью снижать устойчивость опухолевых клеток к лекарствам качественно описывается теми же закономерностями, что и воздействие сополимеров на искусственный липидный бислой.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют большое значение для понимания молекулярного механизма взаимодействия полимеров с клеточными мембранами, могут быть полезны для целенаправленного синтеза полимеров, подавляющих лекарственную устойчивость опухолевых клеток, а также свидетельствуют о правомерности использования липосом для отбора полимеров с потенциальной биологической активностью.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-2003", Москва, 2003 год; на 49-м Ежегодном съезде американского биофизического общества, Лонг Бич, США, 2005; на совместном 30™ конгрессе Европейской федерации биохимических обществ (РЕВБ) и 9ой конференции Международного союза биохимии и прикладной биологии (ГОВМВ), Будапешт, Венгрия, 2005 год; на совместном Европейском биофизическом конгрессе (150м Международного союза чистой и прикладной биофизики (ШРАВ) и 50м Европейской ассоциации биофизических обществ (ЕВвА)), Монпелье, Франция, 2005 год.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 14 печатных работах, из них 4 статьи и 10 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задач, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из ¿¿^ссылок. Диссертация изложена на/^страницах машинописного текста, содержит ^рисунков и ^таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Взаимодействие синтетических полимеров с искусственными липидными мембранами

В работе были использованы нейтральные амфифильные блок-сополимеры, которые мы разделили для удобства анализа на 7 групп (Табл. 1). Полимеры разных групп различались природой или длиной гидрофобного блока. Внутри группы полимеры имели одинаковый или близкий размер гидрофобного блока, но различались длиной гидрофильного. Группы I - Ш - коммерческие препараты плюроников (Рис. 1 А). Группы IV и V - полимеры, недавно синтезированные в лаб. проф. X. Фрая (г. Майнц, Германия). Их гидрофильный блок, в отличие от плюроников, состоит из звеньев глицерина (ГЛ). Гидрофобный блок полимеров IV группы представляет собой статистический сополимер, содержащий 30 звеньев ПО и 6 звеньев ЭО (Рис. 1 Б), а у полимеров V группы - алкильный радикал (Рис. 1 В). Группа VI (Вгц) - моноалкиловые эфиры олигомеров ЭО, отличающиеся, таким образом, от плюроников природой гидрофобной части (Рис. 1 Г).

но

А

НО- (Снр^ 0)гД- (снсн^о)ю- (ci^ci^ о)^

В

'ОН

1IJC-(CH^

н

но но^/

JifX-^

\ но

но-

>н

но

Б НзСО^НСН2о\[сН2СН2о|-^

и

\ н9

г

«W И4°<СН2СН2°>П-Н

НС?

Рис. 1. Общие структурные формулы исследованных блок-сополимеров.

Группа VÍI - гидрофильные гомополимеры ЭО или ГЛ. Таким образом, использованный набор блок-сополимеров позволял оценить значение химической структуры и размеров гидрофобного и гидрофильного блоков для способности полимеров влиять на свойства липидного бислоя.

На липосомах было исследовано влияние всех соединений, указанных в табл. 1, на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флоп) и проницаемость липосом для DOX. Моноламеллярные липосомы получали из яичного лецитина обработкой ультразвуком. Средний гидродинамический диаметр липосом составлял около 100 нм.

1.1. Влияние блок-сополимеров на скорость трансбислойной миграции

Скорость флип-флопа изучали на липосомах, содержавших на внутреннем монослое флуоресцентную метку [(Ы-7-нитробенз-2-окси-1,3-диазол-4-ил)-дипальмитоил]-фосфатидилэтаноламин (МЮ-ФЭ). Такие асимметрично меченные везикулы инкубировали с исследуемым полимером и через определенные промежутки времени определяли долю ЫЕЮ-ФЭ, перешедшего на внешний монослой мембраны за время инкубации. Для этого к липосомам добавляли дитионит натрия, который способен гасить флуоресценцию МЮ-ФЭ, но только на поверхности липосом, поскольку он не проникает сквозь липидный бислой.

В отсутствие полимера спонтанный переход ЫВО-ФЭ на внешнюю поверхность липосом происходил достаточно медленно: равновесное распределение меченого липида между монослоями мембраны достигалось через

липидов (флип-флоп)

2,5-3 часа (рис. 2, кривая 1). В присутствии 3,5 мкМ Рв2 скорость флип-флопа заметно возрастала, и равновесие устанавливалось уже через 40 мин (рис. 2, кривая 2). Наличие плато на кинетической кривой свидетельствует о том, что даже при 2-3 часовой инкубации и концентрации вплоть до 100 мкМ полимер не вызывал образования перфораций в липидной мембране. В противном случае дитионит натрия проникал бы внутрь липосом, и тогда доля восстановленного нефлуоресцирующего МЮ-ФЭ превышала бы 50%.

Полученные зависимости (рис. 2) хорошо описывались уравнением псевдопервого порядка. Начальный участок каждой кривой мы аппроксимировали линейной зависимостью, по тангенсу угла наклона которой определяли начальную скорость флип-флопа в присутствии полимера (Ур) или в его отсутствие (Уо) (рис. 2). Влияние полимера на флип-флоп оценивали по соотношению Ур/Уо- С увеличением концентрации полимера в растворе величина Ур/Уо возрастала

а?50; §40-

Рис. 2. Кинетические кривые флип-флопа ЫВБ-ФЭ в отсутствие полимера (1) и в присутствии 3,5 мкМ РСг2 (2). Липосомы, 0.15 мг липида/мл, асимметрично меченные ФЭ, инкубировали при 30°С в 10 мМ Тш-НС! буфере, рН 7.0.

40 80 120 160 Время, мин

(рис. 3).

О 2 4 6 8 10 12 14 Концентрация Рв2, мкМ

ускорения флип-флопа под действием полимера Рв2 от его концентрации. Липосомы, асимметрично меченные МШ-ФЭ, инкубировали с полимером 5 мин при 30°С.

Рис. 3.

Зависимость

Начальный участок зависимости Ур/Уо от концентрации полимера, когда доля флип-флопа не превышала 15-20 %, хорошо описывался линейным уравнением

На рис. 3 приведен пример такой линейной аппроксимации для PG2.

Аналогичный характер зависимости эффекта полимера от его концентрации мы наблюдали у всех соединений, и для каждого из них было рассчитано значение ßf.f (табл. 1). Параметр ßf.f (мкМ"') не зависит от концентрации полимера и показывает, во сколько раз ускоряется флип-флоп в присутствии 1 мкМ данного полимера, т.е. является своего рода удельной «флипазной активностью» (1 мкМ) соединения.

Сравнение значений ßf.f различных полимеров позволило нам провести систематическое исследование взаимосвязи между структурой полимера и его способностью ускорять флип-флоп.

Анализ значений ßf.f полимеров, гидрофобный блок которых образован полипропиленоксидом (ППО) разной степени полимеризации (табл. 1, группы I-IV), показал, что при одинаковом содержании ЭО увеличение гидрофобного блока ППО значительно усиливает эффект блок-сополимера. Так, например, при т=50 (рис. 4) для полимера группы IV (30 звеньев ПО) и плюроников групп I, II и III (30, 40, 50 звеньев ПО) параметры ßf.f равны 0.04,0.15, 0.53 и 2, соответственно.

= l + ß/-/C0

2 з,01

Iii (п=50) -1

Рис. 4. Зависимость

флипазной активности блок-сополимеров групп 1-ГУ от степени полимеризации

гидрофильного блока т.

е

0 50 100 150 200 250 300 Количество гидрофильных звеньев, m

1

Проведя перпендикуляр в любой точке /и=сопз1, можно оценить влияние степени полимеризации ППО на /?/./ при данном значении т.

Таблица 1. Влияние полимеров на флип-флоп липидов и проницаемость липидной мембраны для БОХ, гидрофобность полимеров (1^°Ргекиш.вода) и рассчитанный объем гидрофобного блока

Полимер Ускорение флип-флопа, ßf.f, мкМ"1 Ускорение транспорта DOX, pDOX, мкМ"1 »-'ь 1 гексаи-вода Объем гидрофобного блока, им3

Группа I Э02П03оЭ02 (L61) ЭО13ПОз0ЭО13 (L64) 3O76nO303O76(F68) 0.66±0.08 0.31±0.07 0.0510.03 0.09610.006 0.02510.005 0.006Ю.0003 -0.24Ю.037 -1.83Ю.27 -3.510.53 9.7 9.7 9.7

Группа П ЭО3ПО40ЭО3 (L81) Э02бП04оЭ026(Р85) ЭО61ПО40ЭО61 (F87) 1.1±0.1 0.56±0.11 0.3Ю.1 0.1410.01 0.06110.003 0.015Ю.001 -0.1110.02 -2.6510.4 -3.1910.48 16.6 14.9 14.9

Группа III Э05П059Э05 (L101) ЭО27ПО61ЭО27 (PI 04) Э0132П05оЭ0132 (Fl 08) 2.5710.2 2±0.3 1.1510.2 0.2910.02 Не определяли 0.12+0.02 0.1110.017 -2.6Ю.4 -3.65Ю.54 26.7 24.7 20.9

Группа IV ПОзоЭОбГЛг (PG2) ПОзоЭОбГЛзо (PG30) ПОзоЭОвГЛ7б (PG76) 1.1510.15 0.09510.017 0.01410.009 0.1510.01 0.010Ю.001 (в^+О^-Ю"1 -0.51Ю.02 -2.45Ю.07 -4.07Ю.16 12.7 12.7 12.7

Группа V С16Н33-ГЛ10 С16Н33-ГЛ64 0.09110.008 0.048Ю.005 0.0310.01 0.004Ю.001 -2.2010.58 -2.9210.11 0.89 0.89

Группа VI Ci2H25E04 (Brij 30) С,2Н25Е024 (Brij 35) С16Н33ЕО10 (Brij 56) 0.0610.01 0.007Ю.001 0.0510.005 Не определяли Не определяли Не определяли 3.2010.61 -1.7910.06.4 2.3210.52 0.6 0.6 0.89

Группа VII ЭО45 ГЛ27 ГЛ8, 0 0 0 0 0 0 Не определяли Не определяли Не определяли -

В то же время, увеличение количества гидрофильных звеньев ЭО при одинаковой длине ППО блока приводит к значительному снижению значений /?/_/ (рис. 4). Блок-сополимеры с высоким содержанием ЭО или глицерина (плюроники F68, F87, F108, PG76), как и гидрофильные гомополимеры ПЭО и полиглицерин (группа VII), не влияли на флип-флоп NBD-ФЭ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что действующим началом полимера, определяющим его активность, является гидрофобный блок. Известно, что при взаимодействии плюроников с липосомами гидрофобный блок ППО встраивается в бислой, а гидрофильные блоки экспонируются в водную фазу. Возможно, ускорение флип-флопа под действием блок-сополимеров происходит вследствие возмущения структуры липидного бислоя, обусловленное встраиванием в него ППО, нарушения упаковки липидов, и, следовательно, увеличения их подвижности. С увеличением степени полимеризации гидрофобного блока, вероятно, увеличивается и площадь дефектной области бислоя, и эффект полимера усиливается.

Известно, что увеличение гидрофильности полимеров снижает эффективность их взаимодействия с бислоем. Это положение согласуется с нашими результатами, которые показывают, что увеличение содержания глицерина, более гидрофильного по сравнению с ЭО, сильнее снижало эффект сополимеров группы IV, чем аналогичное увеличение количества звеньев ЭО в плюрониках группы I (рис. 4, кривые I и IV).

Таким образом, степень воздействия полимера на подвижность липидов определяется его способностью взаимодействовать с липидным бислоем. Очевидно, что одной из первых стадий такого взаимодействия является адсорбция действующего вещества на липосомальной мембране. Поскольку исследованные полимеры не имеют заряда, что движущей силой их адсорбции на мембране должны быть гидрофобные взаимодействия. Поэтому мы определили гидрофобность всех исследованных полимеров, измерив коэффициенты их распределения (Р) в двухфазной системе гексан - вода (табл. 1). Оказалось, что значения Lg Р пропорциональны значениям pf.f, но только для полимеров одной и той же группы. Тогда как при сравнении сополимеров разных групп оказалось, что ПАВ, содержащие алифатический радикал нормального строения (серия VI), будучи более гидрофобными по сравнению с другими соединениями, значительно слабее влияли на флип-флоп. Эти результаты показали, что гидрофобность полимера и, следовательно, его сродство к липидной мембране является необходимым, но недостаточным условием способности ускорять флип-флоп

липидов. Полимер, по-видимому, должен не только встраиваться в бислой, но и уметь возмущать его структуру.

Разумно предположить, что деформация структуры будет увеличиваться с увеличением объема встроенного соединения. Расчет ван-дер-Ваальсового объема гидрофобного блока исследованных соединений показала, что объем V блок-сополимеров, содержащих ППО (группы 1-1У), на порядок больше, чем у ПАВ, содержащих углеводородный радикал (табл. 1). Это навело нас на мысль, что способность полимера ускорять флип-флоп определяется сочетанием двух свойств: его гидрофобностью и объемом гидрофобного блока. Для проверки этого предположения мы исследовали корреляцию между значениями и этими

двумя параметрами (рис. 5).

0,5

0,0

Е-0,5-

сеГ-1,0-О)

-1 -1,5 -2,0 -2,5

Рис. 5. Корреляция между флипазной активностью и линейной комбинацией гидрофобности и объема гидрофобного блока для соединений 1-У1 групп.

-2,0-1,5-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 0.122*1_дР + 0.079*у

Корреляцию искали в виде линейного уравнения с помощью метода наименьших квадратов. Для всех блок-сополимеров уравнение имело вид:

= -1.4 + 0.122(+0.054)-14=Р + 0.079(+0.014) У (1) N=17,11=0.83 Применение этого метода для выборки, включающей только плюроники (группы I - III) и ПАВ группы VI, увеличило коэффициент корреляции:

-1.5 + 0.096(±0.019)Ь§ Р + 0.088(±0.012) V- (2) N=12,11=0.93 Близость значений коэффициентов перед и V говорит о том, что общая гидрофобность полимера и объем его гидрофобного блока вносят практически одинаковый вклад в способность полимера ускорять флип-флоп.

Корреляцию в уравнении (1) «ухудшали» ПАВ, которые содержали остатки глицерина (группа IV и V) (рис. 5). Причина такого поведения заключается, очевидно, в химической природе гидрофильного блока этих соединений -полиглицерине. Сравнение эффектов соединений с одинаковым гидрофобным

блоком (ППО или С15Н33- ), но с различной гидрофильной частью (ПЭО или полиглицерин), показало, что глицерин-содержащие ПАВ сильнее ускоряют флип-флоп. Так, например, эфир гексадецилового спирта и разветвленного полиглицерина (С16Н33-ГЛ10) был почти в 2 раза эффективнее, чем Brij 56 (Ci6H33-ЭОю), содержащий линейный гидрофильный блок, что, по-видимому, обусловлено дополнительным возмущением структуры липидного бислоя разветвленным блоком полиглицерина.

Поскольку возмущение структуры липидного бислоя и ускорение трансбислойной миграции липидов может приводить к увеличению проницаемости мембраны по отношению к низкомолекулярным веществам, на следующем этапе исследования мы изучили влияние амфифильных блок-сополимеров и ПАВ на барьерные свойства мембраны.

1.2. Влияние блок-сополимеров на проницаемость липосом

Влияние полимеров на проницаемость липидной мембраны для DOX было изучено на липосомах, заполненных буферным раствором pH 4.0 и суспендированных в среде с pH 7.0. При рН°7 около 2% молекул DOX находится в незаряженной форме (рКашх 8,6) и может диффундировать через липидный бислой. В липосомах при pH 4 практически все молекулы DOX протонируются и остаются внутри везикул. За кинетикой транспорта незаряженных молекул DOX следили, используя его флуоресцентные свойства. При концентрации DOX более 50 мкМ (2-3 молекулы DOX в липосоме диаметром 50-70 мк) происходит самотушение его флуоресценции. Поэтому по мере его диффузии в липосомы уменьшается общая интенсивность излучения в пробе (рис. 6, кривая 1). Добавление блок-сополимера PG2 ускоряло аккумуляцию DOX в липосомах, причем, как и в случае флип-флопа NBD-ФЭ, влияние полимера усиливалось с увеличением его концентрации (рис. 6, кривые 2,3 и 4).

Кинетика проникновения DOX в липосомы описывается уравнением псевдопервого порядка и характеризуется константой скорости к. Влияние полимера на скорость транспорта DOX оценивали по соотношению констант в присутствии полимера, кр, и в его отсутствие, ко- Величина к/к0 показывала, во сколько раз исследуемое соединение ускоряло транспорт антибиотика.

1 - без полимера, к0=0 52 min' 2-44 мкМ PG2, кр=0 75 min'1

3 - 8.8 мкМ PG2, кр=0 8 min1

4 - 22 мкМ PG2; кр=1.4 min'1

кривые

флуоресценции ООХ в отсутствие (1) и в присутствии 4,4 мкМ (2), 8,8 мкМ (3) и 22 мкМ Рй2 (4).

Рис. 6. Кинетические

снижения

0 1 2 3 4 5 6 7 Время, мин

Зависимость отношения А^Дя от концентрации полимера хорошо описывалась линейным уравнением аналогичным уравнению для флип-флопа:

где параметр Роох показывает, во сколько раз увеличивается скорость аккумуляции ООХ в липосомах при добавлении 1 мкМ полимера.

Значения рВОх были определены для всех полимеров, которые вызывали значительное ускорение флип-флопа (табл. 1).

Анализируя влияние полимеров на два исследованных нами процесса, мы обнаружили, что варьирование структуры полимеров сопровождается однонаправленными изменениями значений роох и /?/./. Построив зависимость Роох от Рм для всех исследованных блок-сополимеров, мы обнаружили очень хорошую / корреляцию (11=0.988) между этими параметрами (рис. 7).

0.35-

кр

— = 1 + РдоуС, > Ко

со.

0,10

0,30 0,25 х 0,20

0,050,00-0,05-

Рис. 7. Корреляция между способностью полимеров ускорять транспорт БОХ (Роох) и их флипазной активностью

-0,5 0,0 0,5 1,0. 1,5 2,0 2,5 3,0

м

Это означает, что увеличение трансбислойной подвижности липидов и ускорение проникновения ООХ в липосомы под действием исследованных соединений обусловлены, по-видимому, одинаковыми причинами -взаимодействием полимеров с липосомальной мембраной и возмущением структуры липидного бислоя.

2. Взаимодействие блок*сополимеров с клетками

На клетках была исследована способность новых блок-сополимеров ПГЛ подавлять множественную лекарственную устойчивость в сравнении с плюроником Ь61 и ингибиторами Р-§р. Влияние полимеров было изучено на 5 линиях раковых клеток: чувствительных клетках эритролейкемии человека (К562) и карциномы молочной железы (МСБ7) и их МЖ-сублиниях: К562Л-89, К562ЛЮХ и МСР7/ООХ.

2.1. Цитотоксичность блок-сополимеров

Токсичность полимеров для клеток оценивали путем культивирования клеток в присутствии различных концентраций полимера и определения его максимальной концентрации, при которой выживало 80-100% клеток (максимальная толерантная доза, МТД). Было обнаружено, что цитотоксичность каждого из тестируемых полимеров была практически одинаковой для всех исследованных клеток, независимо от их происхождения, уровня устойчивости к лекарству и происхождения этой устойчивости. В то же время МТД разных полимеров варьировала в широком диапазоне от 7 и до 2000 мкМ в зависимости от их структуры и в группе полимеров-гомологов росла с увеличением гидрофильного блока.

2.2. Влияние полимеров на чувствительность клеток к ООХ

Клетки инкубировали в среде, содержавшей различные концентрации БОХ и тестируемый полимер в нетоксичной концентрации, и затем определяли долю выживших клеток. Влияние полимера оценивали по концентрации ООХ, при которой выживало 50% клеток (Ю™х), по сравнению со значением Ю"'х в отсутствие полимера.

При добавлении полимеров к чувствительным клеткам К562 и МСР7 кривые цитотоксичности ООХ (рис. 8 А) и определенные по ним значения (табл.°2) бьши такими же, как и в отсутствие полимеров. Это означает, что полимеры не влияли на токсичность БОХ для чувствительных клеток.

■ РйЗО ♦ (РС2)2 Р02

без полимера

*120

Ю 100

X 80 X

Э 60 а

I 40 & 20 § 0

О ......

(3 0,01 0,1 1 10 100 1000

Концентрация ООХ, мкг/мл

^ 120 О

& 100

X 5

3

ш

5 £ 3 в к с о с£

рвзо

(Р02)2 Рв2 1.61

без полимера

0,1 1 10 100 1000 Концентрация ООХ, мкг/мл

Рис. 8. Зависимость доли выживших чувствительных клеток МСБ7 (А) и устойчивых клеток МСР7/ООХ (Б) от концентрации доксорубицина в среде в отсутствие и в присутствии блок-сополимеров ПГЛ и плюроника Ь61. Полимеры добавляли в концентрации МТД.

В то же время, исследованные блок-сополимеры значительно увеличивали токсичность ООХ для МЖ-клеток (рис. 8 Б, табл. 2). Так, гибель 50% клеток МСР7/ООХ в отсутствие полимеров наблюдалась при 113,2 мкг/мл ООХ, а в присутствии 6,6 мкМ Рв2 - при 3,3 мкг/мл ООХ, т.е. добавление полимера снижало ЮЩ?* в 34 раза! Относительное снижение устойчивости (Я) МЖ-клеток

под действием полимеров рассчитывали по формуле: ^т)~7£>5° ^т-+полимеР).

/£>50 (\ ст) - /Д0 (чувств) Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что в ряде случаев полимеры снижали устойчивость МОЫ-клеток на 78-97%, придавая им чувствительность, близкую к таковой исходной клеточной линии. Максимальное действие блок-сополимеров наблюдалось, когда их добавляли в концентрации МТД.

Влияние полимеров на значение Ю™х было сопоставлено с действием известного ингибитора Р-гликопротеина - верапамила. Оказалось, что в случае клеток МСР7/ООХ эффект полимеров был сопоставим с действием верапамила, а на клетках К562Л-89 и К562ЯЮХ они были даже более эффективны.

Таблица 2. Значения Ю™х, мкг/мл, для чувствительных (К562, МСР7) и устойчивых линий клеток в отсутствие и в присутствии блок-сополимеров или верапамила, концентрация которых указана в скобках. Я - относительное снижение устойчивости МРЯ-клеток._

Клеточная линия

К562 К562/1-89 К562ЛЮХ МСЕ7 МСЖ7Л)ОХ

тгюх Ююх 50 Я ювох 50 Н Ююх Ююх Я

без полимера 0,8±0,1 3,5±0,5 16,2±3,2 0,54±0,06 113,2±13,6

РС2 0,58±0,06 (15,4) 1,4±0,1 (И) 78% 3,1±0,4 (15,4) 85% 0,52±0,09 33±0,7 (6,6) 97%

4,1±0.4 (4,4) 78%

(РС2)2 0,8±0,2 (4,5) 0,93±0,07 (4,5) 95% Не опр. Не опр. 0,5±0,06 (12,5) 4,7±0,9 (12,5) 96%

8,0±2,0 (6,6) 93%

РвЗО 0,74±0,06 (97,2) 1,5±0,08 (97,2) 74% 5,2±0,5 (97,2) 71% 0,5±0,07 (833) 6,4±1,5 (83,3) 95%

53±12 (6,6) 53%

Ь61 0,8±0,15 (16,7) Не опр. Не опр. 5,3±0,8 (16,7) 70% Не опр. 5,5±1,3 (22) 95%

2,3±0.6 (47,8) 90% 27,7±6,6 (6,6) 76%

Вера-памвл 0,57±0,12 (20) 2±0,15 (20) 55% 6,3±1 (20) 64% Не опр. 6,1±1,8 (20) 95%

Сравнение эффектов полимеров при одинаковой молярной концентрации позволило оценить влияние структуры полимера на его эффективность. На рис. 9. приведена концентрация БОХ, вызывающая гибель 50% клеток (Ю™*), в отсутствие полимеров и в присутствии блок-сополимеров ПГЛ или плюроника Ь61. Эти соединения имеют одинаковое количество звеньев ПО, но различную структуру (ПО или ГЛ), состав (количество звеньев) и взаимное расположение (ди-или триблок-сополимер) гидрофильных звеньев.

без полимера

1 Гидрофобность блок-сополимера

PG30 [

MCF7 (PG2)2 PG2 L61 т

MCF7/D0X

Рис. 9. Влияние блок-сополимеров, содержащих полиглицерин, и плюроника Ь61 на токсичность БОХ. Устойчивые клетки МСР7ЛЗОХ инкубировали с полимерами, взятыми в одинаковой концентрации - 6,6 мкМ. На рисунке они расположены в порядке возрастания гидрофобности. Слева показано значение Ю™>: для чувствительных клеток МСР7.

Видно, что значения Ю%>х уменьшались в присутствии полимеров по мере увеличения их гидрофобности. Этой зависимости не подчинялся плюроник L61. Будучи более гидрофобным по сравнению с PG2 и (PG2)2, L61 снижал устойчивость клеток к лекарству менее эффективно, чем его аналоги, содержащие полиглицерин, и значения , полученные в присутствии L61, оказались выше. Таким образом, соединения, содержащие в своем составе разветвленный полиглицерин, оказывали на устойчивые клетки больший эффект, чем плюроники с линейным ПЭО, что, вероятно, указывает на важность структуры гидрофильного блока при взаимодействии полимеров с устойчивыми клетками.

5.3. Влияние полимеров на внутриклеточное накопление доксорубицина

Известно, что токсичность DOX пропорциональна его количеству в ядрах клеток. Используя метод конфокальной микроскопии, мы изучили влияние полимеров на внутриклеточное накопление и локализацию DOX. О содержании антибиотика судили по интенсивности его флуоресценции.

В отсутствие полимеров добавление DOX к чувствительным клеткам MCF7 приводило к его аккумуляции в ядрах, тогда как его накопление в устойчивых клетках MCF7/DOX было ничтожно мало (рис. 10, «без добавок»). Добавление блок-сополимеров ПГЛ значительно увеличивало количество DOX в MDR-клетках, особенно в их ядрах. При концентрации полимеров равной МТД интенсивность флуоресценции DOX в ядрах MDR-клеток достигала уровня чувствительных клеток. В то же время, при добавлении полимеров в одинаковой молярной концентрации их эффекты зависели от структуры действующего соединения (рис. 10).

| jРис. 10, Интенсивность

iфлуоресценции DOX в ядрах

|устойчивых MCF7/DOX и

о. gчувствительных MCF7 клеток в

¡Eотсутствие и в присутствии

"9" . 80"полимеров или верапамила (VER),

t qПолимеры тестировали в

| и 401одинаковой концентрации 22 мкМ.

0Интенсивность флуоресценции а; определяли с помощью программы

1 MCF7/DOX MCF7 ImageJ.

Следует отметить, что взаимосвязь между структурой полимера и его эффектом оказалась такой же, как и при изучении воздействии этих соединений на токсичность ЭОХ для МОЯ-клеток: в ряду блок-сополимеров ПГЛ более гидрофобные соединения были более эффективными, а Рв2 действовал сильнее, чем 1,61 (рис. 10). Отметим также, что исследованные полимеры даже при добавлении их в концентрации МТД не оказывали влияния на накопление ООХ в чувствительных клетках (рис. 10),

Одним из основных способов защиты клетки от ксенобиотиков является их удаление из цитоплазмы во внеклеточное пространство. Поэтому мы исследовали методом спектрофлуорометрин, как протекает этот процесс в присутствии полимеров.

г

х* о

Q

0,46 0,40 0,36 0,30 0,26 0,20 0,15 0,100,05

KS62/DOX без добавок K562/DOX * PG2 л K562/OOX + VER

Рис. 11. Кинетические кривые выброса DOX из клеток K562/DOX, предварительно нагруженных антибиотиком, в отсутствие добавок и в присутствии 15,4mkMPG2 или 20 мкМ VER.

20 40 60 80 100 120

Время, мин

Анализ количества DOX выброшенного из MDR-клеток, предварительно нагруженных антибиотиком, показал, что в отсутствие блок-сополимеров концентрация DOX во внешней среде в течение часа увеличивалась более чем в 4 раза. В присутствии PG2 выброс ÜOX наблюдался только в первые 30 мин, но затем он прекращался, и кривая зависимости флуоресценции DOX от времени

MCF7/DOX MCF7

160140-

¡1005 80-| 60-= 40-

выходила на плато (Рис. 11). Такое же действие оказывали и низкомолекулярные ингибиторы Р-гликопротеина - верапамил (Рис. 11) и циклоспорин А. Эти результаты мы подтвердили методом конфокальной микроскопии на ШЖ-клетках, оценив выброс ООХ из клеток по уменьшению его количества в ядрах. Таким образом, исследованный нами блок-сополимер Р02 увеличивал токсичность БОХ для МЖ-клеток, ингибируя его выброс.

Методом конфокальной микроскопии было также исследовано изменение локализации ООХ в клетках под действием полимера. В МОЯ-клетках, нагруженных ООХ, интенсивная флуоресценция наблюдалась в цитоплазматических гранулах, тогда как в ядрах содержание ООХ было очень низким. Добавление Рв2 приводило к значительному увеличению интенсивности флуоресценции ООХ в ядрах клеток. Таким образом, увеличение токсичности ООХ для МОИ-клеток, вызываемое полимером, по-видимому, связано с транслокацией антибиотика из цитоплазмы в ядро, где он достигает мишень своего действия -ядерную ДНК.

Таким образом, изучение взаимодействия блок-сополимеров с чувствительными и устойчивыми к лекарству клетками показало, что все исследованные полимеры в концентрации, близкой к МТД, увеличивали токсичность ООХ для МОЯ-клеток практически до уровня чувствительных аналогов. Причиной этого, по-видимому, является замедление выброса ООХ из МОЯ-клеток под действием полимера, а также транслокация антибиотика из цитоплазмы в ядро. Впервые исследованный блок-сополимер Рв2 оказался эффективнее, чем плюроник Ь61 и низкомолекулярные модуляторы Р-гликопротеина - верапамил и циклоспорин А. В то же время исследованные полимеры не влияли на внутриклеточное накопление и токсичность ООХ для чувствительных клеток.

В ряду блок-сополимеров на основе пропиленоксида и глицерина их эффект увеличивался с ростом гидрофобности. Однако гидрофобность не является единственным параметром, определяющим эффективность полимера. Большое значение имеет и структура гидрофильного блока, который может вносить дополнительный вклад в эффективность взаимодействия полимера с модельными и клеточными мембранами.

Важно отметить, что закономерности, выявленные нами на искусственных мембранах, сохранялись при испытании полимеров и на живых клетках. Этот результат указывает, во-первых, на возможность использования липосом для

первичного скрининга потенциально активных ПАВ и, во-вторых, на важность взаимодействия полимера с мембраной в механизме его действия на ШЖ-клетки.

Выводы

1. Впервые установлено, что способность амфифильных блок-сополимеров ускорять флип-флоп липидов в искусственном липидном бислое и увеличивать его проницаемость для доксорубицина зависит от их гидрофобности и объема гидрофобного блока.

2. Показано, что при близких значениях гидрофобности и объема гидрофобного блока эффект сополимера зависит от структуры гидрофильного блока: новые блок-сополимеры, содержавшие разветвленный блок полиглицерина, были эффективнее по сравнению с аналогичными по строению плюрониками с линейным блоком полиэтиленоксида.

3. Впервые обнаружено, что блок-сополимеры на основе пропиленоксида и глицерина увеличивают токсичность противоопухолевого антибиотика доксорубицина для клеток, устойчивых к действию лекарства, причем блок-сополимер, содержащий 2 остатка глицерина (Р02) действует сильнее, чем плюроник Ь61, который входит в состав противоопухолевого препарата, прошедшего к настоящему времени 2 фазы клинических испытаний.

4. Установлено, что увеличение токсичности доксорубицина для устойчивых опухолевых клеток в присутствии Рв2 обусловлено ингибированием выброса лекарства из клеток и внутриклеточным перераспределением доксорубицина из цитоплазмы в ядро, где он достигает мишень своего действия - ядерную ДНК.

5. Впервые показано, что взаимосвязь между структурой блок-сополимеров и их способностью снижать устойчивость опухолевых клеток к лекарствам качественно описывается теми же закономерностями, что и воздействие сополимеров на искусственный липидный бислой. Это свидетельствует о важности взаимодействия полимера с мембраной в механизме его действия на клетки, а также указывает на целесообразность использования липосом для отбора полимеров с потенциальной биологической активностью.

Основные результаты диссертационной работы Дёминой Т.В. изложены в следующих публикациях:

1. Дёмина Т.В., Крылова О.О. Влияние сополимеров этиленоксида и пропиленоксида на транспорт доксорубицина через бислойную липидную мембрану. //Тезисы VII Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 1999». Москва. 1999. С. 103.

2. N.S. Melik-Nubarov, O.O. Krylova, N.O. Kozlova, LB. Ohmeva, T.V. Demina, M. V. Kitaeva, A.A. Yaroslavov, F.MMenger. Effect of water-soluble synthetic polymers on the permeability of liposome membranes. //International conference "Polymerwerkstoffe 2000". Halle/Saale. Germany. September 2000. Tagungsband. P.508.

3. Крылова O.O., Дёмина T.B., Мелик-Нубаров H.C. Влияние блок-сополимеров алкиленоксидов на проницаемость липидных мембран: возможные причины биологической активности.//ДАН. 2001. Т.380. С.267.

4. Дёмина Т.В. Влияние блок-сополимеров алкиленоксидов (плюроников) на проницаемость липидных мембран: зависимость эффекта от структуры полимера. //Тезисы Российско-Украинского симпозиума по высокомолекулярным соединениям, Донецк, 2001. С.89.

5. Дёмина Т.В. Влияние блок-сополимеров пропиленоксида и глицерина на проницаемость модельных и клеточных мембран. //Тезисы X Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 2003». Москва. 2003. С.110.

6. Т. Demina, N. Alexandrova, I. Grozdova, О. Krylova, V. Istratov, N. Melik-Nubarov, P. Pohl, H. Kautz, H. Frey. Polyglycerol-Based Copolymers Increase the Permeability of Model Lipid Membranes and Cause Chemosensitization of Multi-Drug Resistant Tumour Cells. //Abstract book of Europolymer Congress. Stockholm. Sweden. June 23-28. 2003. P.87.

7. Demina Т., Grozdova 1., Krylova O., ZhirnovA., Istratov V, FreyH., Kautz H., Melik- Nubarov N. Relationship between the structure of amphiphilic copolymers and their ability to disturb lipid bilayers. //Biochemistry. 2005. V.44. №10. P.4042.

8. A.E. Zhirnov, T.V. Demina, O.O. Krylova, I.D. Grozdova, N.S. Melik-Nubarov. Lipid composition determines interaction of liposome membranes with Pluronic L61. //Biochim. Biophys. Acta. 2005. V.1720. №1-2. P.73.

9. Demina T.V., Melik-Nubarov N.S., Still A. A., FreyH., Pohl P., Pohl E.E. Relationship between structure of amphiphilic copolymers and their ability to cause chemosensitization of multi-drug resistant tumour cells. //Biophys. J. Abstracts Issue of 49,Jl Annual Meeting. Long Beach. USA. February 2005. P.2923-Pos.

10. Krylova О, Démina T., Kautz H, Melik-Nubarov N, Frey H, Pohl P. Block copolymer induced mdr reversal: result of facilitated cytostatica transport through membranes or of increased ion permeability? //Biophys. J. Abstracts Issue of 49th Annual Meeting. Long Beach. USA. February 2005. P.2054-Pos.

11. T.V. Démina, I.D. Grozdova, NS Melik-Nubarov. Relationship between structure of amphiphilic copolymers and their ability to cause chemosensitization of multi-drug resistant tumour cells. //Abstracts book of 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress, Montpellier, France, August 2005. Eur. Biophys. J. with Biophys. Lett. V.34. №6. P.800.

12. A E. Zhirnov, TV. Démina, ID Grozdova, N.S Melik-Nubarov Membrane composition influences Pluronic-induced transport of antitumour drugs. //Abstracts book of 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. Montpellier. France. August 2005. Eur. Biophys. J. with Biophys. Lett. V.34. №6. P.809.

13. A E. Zhimov, T. V Démina, O.O. Krylova, ID. Grozdova and N.S Melik-Nubarov. Influence of lipid membrane composition on its interaction with Pluronic. //Abstracts book of 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, July 2-7, 2005, FEBS J. V.272. №sl. P.244.

14. A.E Жирное, Д.H. Павлов, ТВ Демина, Г.А. Бадун, И.Д. Гроздова, Н.С Мелик-Нубаров Влияние строения блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида на их взаимодействие с биологическими мембранами. //Высокомолек. соед. 2006. Сер.А. Т.48. №11. С.2023.

Принято к исполнению 23/01/2007 Исполнено 24/01/2007

Заказ № 47 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Основные физико-химические свойства плюроников.

2.2. Искусственные липидные бислои и взаимодействие плюроников с ними.

2.3. Влияние синтетических соединений на флип-флоп липидов.

2.4. Влияние полимеров на проницаемость мембран.

2.5. Применение плюроников в медицине.

2.6. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток и способы ее преодоления.

2.6.1. Основные механизмы множественной лекарственной устойчивости.

2.6.2. Строение и механизм действия Р-гликопротеина.

2.6.3. Использование плюроников для подавления МЛУ.

2.7. Синтез и физико-химические свойства полиглицеринов.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Определение концентрации полимеров.

4.2. Определение коэффициента распределения полимеров в системе н-гексан - вода.

4.3. Кинетика проникновения доксорубицина в липосомы с градиентом рН.

4.4. Измерение скорости флип-флопа липидов в липосомальных мембранах.

4.5 Культивирование клеток.

4.6. Определение белка.

4.7. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

4.8. Определение цитотоксичности доксорубицина и полимеров.

4.9. Влияние полимеров на цитотоксичность доксорубицина.

4.10. Исследование клеток методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ).

4.11. Изучение выброса доксорубицина из клеток К562ЯЮХ методом спектрофлуорометрии.

4.12. Связывание 3Н-меченых полимеров с клетками К562/ООХ.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Взаимодействие синтетических полимеров с модельными липидными мембранами.

5.1.1. Влияние синтетических блок-сополимеров на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флоп).

5.1.2. Влияние синтетических блок-сополимеров на проницаемость модельной липидной мембраны.

5.2. Взаимодействие синтетических полимеров с клетками.

5.2.1. Характеристика клеток.

5.2.2. Цитотоксичность полимеров.

5.2.3. Влияние полимеров на токсичность доксорубицина.

5.2.4. Влияние полимеров на внутриклеточное накопление доксорубицина.

5.2.5. Влияние полимеров на выброс доксорубицина из клеток.

Выводы.

Список сокращений.

Синтетические амфифильные блок-сополимеры в последние годы находят все более широкое применение в медицине и фармакологии. К числу таких соединений относятся и блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, называемые также плюрониками. Обладая низкой токсичностью по сравнению с другими ПАВ, плюроники входят в состав композиций искусственных заменителей крови, выполняя роль стабилизаторов перфторуглеродных эмульсий [1], применяются в технологиях низкотемпературного консервирования органов и тканей [2], в иммунотерапии в качестве адъювантов [3, 4].

Исследования последних лет показали, что плюроники могут быть полезны для решения актуальной проблемы современной онкологии - преодоления устойчивости раковых клеток к широкому кругу лекарственных препаратов. Это явление, получившее название множественной лекарственной устойчивости, возникает в процессе химиотерапии и представляет собой серьезное препятствие для успешного лечения онкологических больных. Оказалось, что плюроники способны восстанавливать чувствительность таких клеток, устойчивых к противоопухолевым антибиотикам, а иногда даже делают их более чувствительными по сравнению с исходными опухолевыми клетками. Лекарственная форма SP1049C, содержащая плюроники и антибиотик доксорубицин, в настоящее время проходит клинические испытания за рубежом [5].

Молекулярный механизм действия плюроников на опухолевые клетки до сих пор непонятен, хотя в последнее время и в этом направлении достигнуты существенные успехи. Было установлено, что плюроники ингибируют выброс лекарств, осуществляемый белками-транспортерами Р-гликопротеином (P-gp) и MRP (Multidrug Resistance Protein) [6-8], вызывают уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ [9, 10] и освобождение антибиотиков из внутриклеточных везикул [11, 12]. Взаимодействуют ли плюроники непосредственно с белками-транспортерами или действие полимеров обусловлено влиянием на структуру клеточных мембран, пока неясно. Показано, что встраивание плюроников в искусственные липидные мембраны вызывает увеличение подвижности липидов и повышение проницаемости бислоя по отношению к лекарству [13]. Причем, активны не мицеллы, а единичные молекулы блок-сополимера, и эффективность их действия зависит от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) макромолекулы [14]. В то же время до сих пор остается неизвестным, какие именно особенности структуры плюроников и входящих в него мономеров определяют их биологическую активность. Поняв молекулярные причины воздействия плюроников на структуру мембраны, можно целенаправленно конструировать полимеры, способные воздействовать на определенные процессы в биологических мембранах.

Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия амфифильных блок-сополимеров, различающихся по структуре их гидрофобного и гидрофильного блоков, с модельными липидными мембранами и живыми клетками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. Цель работы состояла в выявлении структурных параметров сополимеров, обусловливающих их способность возмущать структуру мембран и снижать устойчивость опухолевых клеток к действию лекарств.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Впервые установлено, что способность амфифильных блок-сополимеров ускорять флип-флоп липидов в искусственном липидном бислое и увеличивать его проницаемость для доксорубицина зависит от их гидрофобности и объема гидрофобного блока.

2. Показано, что при близких значениях гидрофобности и объема гидрофобного блока эффект сополимера зависит от структуры гидрофильного блока: новые блок-сополимеры, содержавшие разветвленный блок полиглицерина были эффективнее по сравнению с аналогичными по строению плюрониками с линейным блоком полиэтиленоксида.

3. Впервые обнаружено, что блок-сополимеры на основе пропиленоксида и глицерина увеличивают токсичность противоопухолевого антибиотика доксорубицина для клеток, устойчивых к действию лекарства, причем блок-сополимер, содержащий 2 остатка глицерина (Р02) действует сильнее, чем плюроник Ь61, который входит в состав противоопухолевого препарата, прошедшего к настоящему времени 2 фазы клинических испытаний.

4. Установлено, что увеличение токсичности доксорубицина для устойчивых опухолевых клеток в присутствии Рв2 обусловлено ингибированием выброса лекарства из клеток и внутриклеточным перераспределением доксорубицина из цитоплазмы в ядро, где он достигает мишень своего действия - ядерную ДНК.

5. Впервые показано, что взаимосвязь между структурой блок-сополимеров и их способностью снижать устойчивость опухолевых клеток к лекарствам качественно описывается теми же закономерностями, что и воздействие сополимеров на искусственный липидный бислой. Это указывает на важность взаимодействия полимера с мембраной в механизме его действия на клетки, а также свидетельствует о правомерности использования липосом для отбора полимеров с потенциальной биологической активностью.

1. Bentley PK, Davis SS, Johnson OL, Lowe KC, Washington C. Purification of pluronic F-68 for perfluorochemical emulsification. J Pharm Pharmacol 1989; 41 (9):661-663.

2. Segel LD, Minten JM, Schweighardt FK. Fluorochemical emulsion APE-LM substantially improves cardiac preservation. Am J Physiol 1992; 263(3 Pt 2):H730-H739.

3. Allison AC, Byars NE. Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects. Mol Immunol 1991; 28(3):279-284.

4. Hunter RL, Bennett B. The adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants. II. Antibody formation and inflammation related to the structure of triblock and octablock copolymers. J Immunol 1984; 133(6):3167-3175.

5. Danson S, Ferry D, Alakhov V, Margison J, Kerr D, Jowle D et al. Phase I dose escalation and pharmacokinetic study of pluronic polymer-bound doxorubicin (SP1049C) in patients with advanced cancer. Br J Cancer 2004; 90(11):2085-2091.

6. Kabanov AV, Batrakova EV, Alakhov VY. Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54(5):759-779.

7. Miller DW, Batrakova EV, Kabanov AV. Inhibition of multidrug resistance-associated protein (MRP) functional activity with pluronic block copolymers. Pharm Res 1999; 16(3):396-401.

8. Kabanov AV, Batrakova EV, Miller DW. Pluronic block copolymers as modulators of drug efflux transporter activity in the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55(1):151-164.

9. Batrakova EV, Li S, Elmquist WF, Miller DW, Alakhov VY, Kabanov AV. Mechanism of sensitization of MDR cancer cells by Pluronic block copolymers: Selective energy depletion. Br J Cancer 2001; 85(12): 1987-1997.

10. Batrakova EV, Li S, Li Y, Alakhov VY, Kabanov AV. Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters. Pharm Res 2004; 21(12):2226-2233.

11. Venne A, Li S, Mandeville R, Kabanov A, Alakhov V. Hypersensitizing effect of pluronic L61 on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug-resistant cells. Cancer Res 1996; 56( 16):3626-3629.

12. Rapoport N, Marin A, Luo Y, Prestwich GD, Muniruzzaman MD. Intracellular uptake and trafficking of Pluronic micelles in drug-sensitive and MDR cells: effect on the intracellular drug localization. J Pharm Sci 2002; 91(1): 157-170.13.