Определение сульфаниламидов методами ВЭЖХ и спектрофотометрии после сорбционного концентрирования

Кочук, Елена Валентиновна

Определение сульфаниламидов методами ВЭЖХ и спектрофотометрии после сорбционного концентрирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Кочук, Елена Валентиновна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Определение сульфаниламидов методами ВЭЖХ и спектрофотометрии после сорбционного концентрирования»

Автореферат диссертации на тему "Определение сульфаниламидов методами ВЭЖХ и спектрофотометрии после сорбционного концентрирования"

На правах рукописи

КОЧУК ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАНИЛАМИДОВ МЕТОДАМИ ВЭЖХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ПОСЛЕ СОРБЦИОННОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005537791

1 4 НОЯ 2013

Москва-2013

005537791

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Дмитриенко Станислава Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кузнецов Владимир Витальевич Российский химико-технологический

университет имени Д.И. Менделеева

доктор фармацевтических наук, доцент,

профессор кафедры фармацевтической и

радиофармацевтической химии

Эгаптейн Наталья Борисовна

Обнинский институт атомной энергетики

НИЯУМИФИ

Ведущая организация:

Липецкий государственный технический университет

Защита состоится 11 декабря 2013 года в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ^ И.И. Торочешникова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Сульфаниламиды (СА) - производные п-аминобензолсульфокислоты - используют в практической медицине как эффективные антибактериальные средства с середины прошлого века. Благодаря широкому спектру фармакологического действия и низкой стоимости их применяют и в ветеринарии для профилактики и лечения различных заболеваний животных. Кроме того, эти препараты добавляют в корма в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных для повышения продуктивное™ животноводства и птицеводства. Широкое, а зачастую и неконтролируемое применение сульфаниламидов в ветеринарной практике обусловливает потенциальную возможность присутствия остаточных количеств этих препаратов в животноводческой продукции и представляет потенциальную угрозу здоровью людей. В большинстве стран, включая Россию, утверждены предельно допустимые концентрации (Г1ДК) сульфаниламидов в продуктах питания, которые составляют 100 мкг/кг мяса, меда и 100 мкг/л молока. Существует проблема определения сульфаниламидов и в объектах окружающей среды: сточных водах фармацевтических и сельскохозяйственных производств, поверхностных и подземных водах, почвах.

В связи с низкими содержаниями сульфаниламидов в указанных матрицах и сложностью их состава определению этих соединений предшествует обязательная пробоподготовка. Среди различных методов, предложенных в последнее время для выделения и концентрирования сульфаниламидов, по-видимому, наиболее перспективна твердофазная экстракция (ТФЭ), однако большинство опубликованных работ ориентировано на решение чисто прикладных задач; количественные данные, характеризующие сорбционный процесс, практически отсутствуют, а круг используемых сорбентов невелик.

В связи с этим представляется актуальным как расширение круга сорбентов, позволяющих количественно выделять и концентрировать сульфаниламиды, так и поиск новых комбинаций сочетания сорбционного концентрирования этих соединений и их последующего определения. Актуальна и разработка простых методик анализа, позволяющих осуществлять массовый скрининг проб и определять суммарное содержание сульфаниламидов.

Цель работы состояла в систематическом изучении сорбции сульфаниламидов на сорбентах различной природы и разработке методик сорбционного концентрирования этих соединений для их последующего определения в элюате методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) или снекгрофотометрии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить особенности сорбции СА на сорбентах различной природы (сверхсшитом полистироле (ССПС); полимерных сорбентах Strata SDB-L на основе полистирола и Strata-X на основе полистирола, химически модифицированного 1Ч-винил-2-пирролидоном; наноуглеродном материале Таунит; Диасорбе 100-С16Т) в зависимости от условий извлечения и природы сорбатов; сравнить использованные сорбенты по эффективности извлечения аналитов между собой и выбрать наиболее перспективный сорбент для группового концентрирования СА;

• выявить возможность использования сверхсшитого полистирола для прямой сорбции сульфаниламидов из молока;

• исследовать влияние различных параметров на селективность хроматографического разделения сульфаниламидов методом ОФ ВЭЖХ и их определение с использованием УФ- и амперометрического детектирования;

• разработать процедуры сорбционного концентрирования сульфаниламидов, обеспечивающие наименьшие пределы обнаружения при их хроматографическом определении;

• выбрать условия проведения реакции конденсации сульфаниламидов с п-диметиламинокоричным альдегидом и разработать методики их спектрофотометрического определения;

• разработать способ оценки суммарного содержания сульфаниламидов;

• применить полученные результаты для разработки новых методик определения этих соединений в лекарственных препаратах, речной воде и молоке.

Научная новизна. Выявлены особенности сорбционного поведения сульфаниламидов на различных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле; полимерных сорбентах Strata SDB-L на основе полистирола и Strata-X на основе полистирола, химически модифицированного 1Я-винил-2-пирролидоном; наноуглеродном материале Таунит; Диасорбе ЮО-С^Т. Оценено влияние рН водного раствора, природы сорбента и строения сульфаниламидов на их распределение. Установлены взаимосвязи между коэффициентами распределения и гидрофобностью сорбатов. Показана возможность использования ССПС для прямой сорбции сульфаниламидов из молока. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования сульфаниламидов на ССПС с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ. Обнаружено, что в ацетонитриле сульфаниламиды вступают в реакцию конденсации с л-диметиламинокоричным альдегидом. Предложен способ оценки суммарного содержания сульфаниламидов.

Практическая значимость. Продемонстрированы возможности использования изученных сорбентов для сорбционного извлечения сульфаниламидов из водных растворов, выбраны условия концентрирования. Разработана методика хроматографического разделения и определения сульфаниламидов, включающая их сорбционное концентрирование на микроколонке, заполненной ССПС, десорбцию ацетонитрилом и раздельное хроматографическое определение со спектрофотометрическим или амперометрическим детектированием. Разработаны спектрофотометрические методики определения сульфаниламидов в виде окрашенных продуктов конденсации с и-диметиламинокоричным альдегидом. Методики апробированы при анализе лекарственных препаратов, речной воды и молока. Автор выносит на защиту:

• результаты исследования и выявленные особенности сорбции сульфаниламидов на сорбентах различной природы;

• обоснование возможности использования сверхсшитого полистирола для группового сорбционного концентрирования сульфаниламидов из водных растворов и молока;

• условия хроматографического разделения и определения пяти сульфаниламидов методом ОФ ВЭЖХ с использованием УФ- и амперометрического детектирования;

• методики сорбционного концентрирования и определения сульфаниламидов методом ОФ ВЭЖХ;

• обоснование возможности использования и-диметиламинокоричного альдегида для спектрофотометрического определения сульфаниламидов в ацстонитрильном растворе и оценки их суммарного содержания;

• результаты определения сульфаниламидов в лекарственных препаратах, речной воде и молоке.

Апробация работы. Основные результаты доложены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), II Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2007), III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009), Второй Республиканской научной конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика РБ - 2012» (Минск, 2012), 3-ей Научной конференции с международным участием «Химия-2013. Физическая химия. Аналитическая химия. Нанохимия. Теория, эксперимент, практика, преподавание» (Москва, 2013), XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), II Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2013), втором Съезде аналитиков России (Москва, 2013), 20 International Symposium on Electro and Liquid Phase Separation Techniques (Tenerife, Canary Islands (Spain), 2013). ,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (226 наименований). Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков и 30 таблицы. Во введении обосновывается актуальность темы и цель работы, ее новизна и праюгическая значимость. В литературном обзоре систематизированы данные, опубликованные за последние 5 лет, о методах выделения, концентрирования и определения сульфаниламидов в различных объектах: продуктах питания, объектах окружающей среды и лекарственных препаратах. Во второй главе описаны реагенты, аппаратура и методика эксперимента. В третьей главе приведены сведения о структурных характеристиках сорбентов и особенностях сорбции сульфаниламидов на их поверхностях в статическом и динамическом режимах. Четвертая глава посвящена выбору условий разделения и определения сульфаниламидов методом ОФ ВЭЖХ. Там же приведены примеры определения сульфаниламидов в различных объектах без и после сорбционного концентрирования на ССПС. В пятой главе приведены результаты спектрофотометрического определения сульфаниламидов по реакции с и-диметиламинокоричным альдегидом.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования, аппаратура и техника эксперимента

Объектами исследования служили сульфаниламид (САМ), сульфаметоксипиридазин (СМП), сульфаметазин (СМТ), сульфаметоксазол (СМЗ) и сульфахлорпиридазин (СХП) ("Sigma", 98%). Некоторые физико-

химические свойства СА приведены в табл. 1. Исходные 0,01 М растворы готовили растворением точных навесок в ацетонитриле. Рабочие растворы готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием.

В качестве сорбентов использовали сверхсшитый полистирол (Диапак П-3, ЗЛО «БиоХимМак СТ»), поверхностно-модифицированный сополимер стирола и дивинилбензола Strata-X («Phenomcnex»), сополимер стирола и дивинилбензола Strata SDB-L («-Phenomenex»), углеродный наноматериал Таунит (ООО «НаноТехЦентр», Тамбов) и Диасорб-100-С16Т (ЗАО «БиоХимМак СТ»).

Параметры пористой структуры образцов - удельную поверхность (Syl¿, объем пор (F„) и средний диаметр нор (dn) - определяли методом низкотемпературной адсорбции азота на установке ASAP 2010 N («Micromeritics», США). Характеристики пористой структуры сорбентов, рассчитанные по изотермам низкотемпературной адсорбции азота приведены в табл. 2. Исследование микроструктуры образцов сорбентов проводили на сканирующем электронном микроскопе с автоэмиссионным источником LEO SUPRA 50VP {«Carl Zeiss», Германия).

Хромаю графическую часть работы выполняли на жидкостном хроматографе «Цвет-Яуза-04» со спектрофотометрическим (>. = 280 нм) и амперометрическим (Е = 1.2 В, стеклоуглеродный электрод) детекторами. Разделение проводили в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хроматографические колонки Luna 5u С 18(2) (150 х 3.0 мм, 5 мкм), Gemini 5u С18 (150 * 4,6 мм, 5 мкм) и Диасфер-110-С16 (150 * 4.0 мм, 6 мкм). В качестве подвижной фазы использовали водно-ацетонитрильные и водно-метанольные смеси с добавлением фосфорной или уксусной кислот. Объем пробы составлял 20 мкл, ввод пробы осуществляли с помощью петли дозатора. Скорость потока составляла 0.4 мл/мин. Дистиллированную воду для приготовления элюента дополнительно очищали с помощью системы очистки воды Millipore. Элюент дегазировали в ультразвуковой ванне Bransonic 1510R-DTH (США).

Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре СФ-103 («Аквилон», Россия), значения рН контролировали на мономере «Эксперт 001» (Россия).

Для изучения сорбции СА в статическом режиме точные навески сорбентов (0.010 ± 0.001 г) помещали в пробирки с притертыми пробками, добавляли 5 мл раствора исследуемого вещества и встряхивали на электромеханическом вибросмесителе до установления сорбционного равновесия. После этого сорбент отделяли от раствора декантацией, фильтрованием через складчатый бумажный фильтр и определяли концентрацию исследуемого соединения в равновесной водной фазе спектрофотометрическим методом по их собственному поглощению в УФ области.

Для изучения сорбции в динамическом режиме использовали концентрирующие микроколонки, заполненные 40 и 100 мг ССПС, и перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М (Россия). Перед использованием колонки промывали 3 мл ацетонитрила и 6 мл дистиллированной воды. Скорость пропускания раствора через колонку составила 0.8 мл/мин. После проведения сорбции и десорбции колонку промывали 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды. Кроме того, использовали картриджи, заполненные 30 мг сорбентов.

Таблица 1. Перечень и некоторые физико-химические свойства изученных сульфаниламидов . ■ О

Н2М—4 V—Б—N4—Я V-/ й

Соединение Заместитель (R-rpynna) Мол. масса lgP* РК*яД

Сульфаниламид (САМ) II 172 -0.72 1.85 10.10

Сульфаметоксипиридазин (СМП) N=N -'°СНз 280 0.32 2.18 7.19

Сульфаметазин (СМТ) СН3 N=< -Q СН3 278 0.80 1.95 7,45

Сульфаметоксазол (СМЗ) N'O 253 0.89 1.39 5.81

Сульфахлорпиридазин (СХП) N=N 285 1,02 1.36 5.90

♦Параметры гидрофобности lgP и значения pK„i и рК^ рассчитаны с помощью стандартного пакета программ @ACD, Toronto, Canada.

Таблица 2. Характеристики пористой структуры сорбентов, рассчитанные по изотермам низкотемпературной адсорбции азота

Сорбент ССПС Strata-X Strata SDB-L Диасорб-100-C|6T УНМ Таунит

Syд, мг/г 912 575 567 204 139

V„, см3/г 0.53 1.06 1.06 0.49 0.20

dm А 23.3 73.5 45.1 95.5 56.8

Доля, % (рассматриваемый диаметр пор 1.7 - 300 нм)

Макропоры (более 50 нм) 10 7 34 0.3 21

Мезопоры (от 2 до 50 нм) 79 91 62 99.7 78

Микропоры (менее 2 нм) 11 2 4 0 1

Выбор сорбента для концентрирования сульфаниламидов

Сорбция в статических условиях. На выбранных сорбентах изучена сорбция сульфаниламидов в зависимости от времени контакта фаз, рН раствора и концентрации извлекаемых соединений и проведено сравнение их сорбционного поведения. В качестве примера на рис. 1 приведены экспериментальные зависимости для сульфаметоксазола. Для остальных СА они аналогичны. Установлено, что на всех изученных сорбентах сорбционное равновесие устанавливается за 15 - 20 мин (рис. 1, а). Изученные сульфаниламиды находятся в растворе в виде трех форм: катионной СА+ (при рН < рХаи), анионной СА" (при рН > рКа,2) и нейтральной СА°. Характер зависимости степени извлечения от рН (рис. 1, б) свидетельствует о том, что С А сорбируются в молекулярной форме; сорбция максимальна в интервале pKL,, < рН < рА'а,2. Из сравнения изотерм сорбции видно, что максимальной емкостью по отношению к сульфаниламидам обладает ССПС (рис. 1, в).

к,*

100 f-'

О 20 40

Рис. 1. Зависимости степеней извлечения сульфометоксазола на ССПС (7), Strata-X (2), Strata SDB-L (5), УНМ 'Гаунит (4) и Диасорб-100-С!6Т (5) от времени контакта фаз (а), рН раствора (б) и изотермы его сорбции (в). 7= 5 мл, Шоорв = 0.010 ± 0.001 г, ссмз = 1 * Ю"4 М (а, б), рН ~ 6 (а, в).

Сопоставление степеней извлечения и коэффициентов распределения (табл. 3, рис.

2) показывает, что на эффективность сорбции сульфаниламидов влияют два фактора: гидрофобность сульфаниламидов и природа сорбента.

На всех изученных сорбентах коэффициенты распределения СА возрастают с увеличением их параметров гидрофобности. Между логарифмом коэффициента распределения (lg£>) и параметром гидрофобности (1&Р) сорбируемого СА наблюдается линейная зависимость (в скобках указаны квадраты коэффициентов корреляции, Л2):

Рис. 2. Зависимости логарифмов коэффициентов распределения сульфаниламидов (lgD) на ССПС (i), Strata SDB-L (2), Strata-X (3) УНМ Таунит (4) и Диасорб-100-C16T(J)0TlgP.

ССПС: lgD = 0.8267 \gP + 3.1821 (0.9883);

Strata-X: lgD = 0.7811 IgP +2.6991 (0.9816);

Strata SDB-L: lgD = 0.8184 lgP + 2.6779 (0.9837);

УНМТаунит: lgD = 0.5984 lgP + 2.5135 (0.9728);

Диасорб-100-С!6Т: lgD = 0.3779 lgP + 2.1134 (0.9654).

Для всех изученных CA сорбция возрастает в ряду: Диасорб 100-С16Т < УНМ Таунит < Strata SDB-L, Strata-X < ССПС. Наибольшие степени извлечения достигаются на сверхсшитом полистироле. В исследуемых условиях все изученные СА, за исключением сульфаниламида, сорбируются на ССПС на 87 — 96%. По аналогии с литературными данными можно предположить, что при сорбции СА на ССПС наряду с гидрофобными взаимодействиями реализуются и зт-тг-взаимодействия с я-электронной системой ароматических колец сверхсшитого полистирола.

Таким образом, сравнение сорбционных свойств сорбентов показало, что для группового сорбционного концентрирования сульфаниламидов наиболее перспективен ССПС. Наименьшую эффективность в отношении сульфаниламидов проявил Диасорб ЮО-С^Т.

Таблица 3. Степени извлечения (Д, %) сульфаниламидов на изученных сорбентах в статических условиях (сса = 1ХЮ'4 М, У= 5 мл, <*ясорб = 0.010 г, / - 30 мин, п = Ъ,Р~ 0.95)

Соединение ССПС Strata-X Strata SDB-L УНМ Таунит Диасорб-100-С16Т

Сульфаниламид 43 ±2 20±3 18±3 18±4 13±3

Сульфаметоксипиридазин 87 ±3 70 ±5 70±4 57±3 23±4

Сульфаметазин 92± 3 78 ±2 81 ±6 64±4 32±5

Сульфаметоксазол 94 ±2 82 ±2 82 ±3 70±2 38±4

Сульфахлорпиридазин 96 ±4 87 ±5 84 ±2 73±4 41±4

Сорбция в динамических условиях. При оптимизации условий динамического сорбционного концентрирования СА на микроколонке, заполненной ССПС, варьировали массу сорбента, объем анализируемого раствора, концентрацию СА, природу и объем элюента. Для минимизации объема элюента оказалось целесообразным использование микроколонки (10><6 мм), заполненной 0.030 г ССПС. В интервале концентраций от 0.04 до 2.0 мкг/мл из 25 мл водного раствора сульфаниламид сорбируется на такой колонке на 85 - 90 % , а остальные СА-на98 -100 %.

Элюирование СА проводили метанолом или ацетонитрилом. Перед элюированием колонку промывали 1 мл дистиллированной воды. Установлено, что при пропускании через колонку 1 мл метанола или ацетонитрила сульфаниламиды десорбируются на 95 - 98 % и 92 - 96 % соответственно, а увеличение объема элюента до 2 мл позволяет десорбировать эти соединения на 99 %. Степени выделения сульфаниламидов из 25 и 100 мл водного раствора в метанольный или ацетонитрильный элюаты объемом 1 мл приведены в табл. 4.

Таблица 4. Степени выделения сульфаниламидов из 25 и 100 мл водного раствора на микроколонке, заполненной ССПС (п=3, Р=0,95)

Соединение Д, %

(элюент - метанол) (элюент - ацетонитрил)

У= 25 мл У= 100 мл У =25 мл К= 100 мл

Сульфаниламид 88 ±4 83 ±6 86 ±5 81 ±6

Сульфамегоксипиридазин 94 ±5 93 ±7 94 ±6 93 ±7

Сульфаметазин 96 ±5 94 ±6 93 ±5 91 ±6

Сульфаметоксазол 93 ±6 92 ±7 90 ±6 89 ±7

Сульфахлорпнридазин 96 ±5 93 ±6 97 ±5 94 ±7

Сорбция из молока. Основные проблемы, с которыми сталкиваются при определении сульфаниламидов в молоке, связаны с одной стороны - с низким содержанием этих соединений, а с другой - со сложным, многокомпонентным составом молока. В большинстве случаев определение сульфаниламидов в молоке проводят после длительной пробоподготовки, основанной на осаждении белков. Метод осаждения белков реже используют как самостоятельный метод подготовки пробы, и чаще - в качестве промежуточной стадии для других методов, таких, например, как ТФЭ. Белки осаждают добавлением к пробе молока органических растворителей (ацетонитрил, метанол), неорганических солей или сильных кислот с последующим центрифугированием. Поиск более эффекгавных и экспрессных методов выделения сульфаниламидов из молока по-прежнему является актуальным.

Цель этой части работы заключалась в изучении возможносга использования ССПС для прямой сорбции сульфаниламидов из молока. Основанием для постановки такого исследования послужили литературные данные по применению этого сорбента для сорбции соединений из цельной крови и плазмы, а также в качестве гемосорбента для очистки крови.

Эксперименты по изучению сорбции сульфаниламидов из молока проводили по следующей методике. В пробирку с притертой пробкой помещали навеску ССПС (активированного несколькими каплями ацетонитрила) массой 0.01 - 0.03 г, добавляли от 5 до 25 мл цельного молока, или молока, разбавленного водой в соотношении 1:1 и всгряхивали в течение 30 мин на механическом вибросмесителе. Сорбент отделяли от маточного раствора центрифугированием и промывали водой (4 раза по 10 мл). Сульфаниламиды десорбировали 2 мл ацетонитрила и определяли в ацетонитрильном элюате спектрофотометрическим методом по реакции с и-диметиламинокоричным альдегидом. На примере сульфаметоксазола оптимизированы условия сорбции СА из молока, путем варьирования массы сорбента и объема анализируемого раствора. Как видно из данных, приведенных на рис. 3, степень выделения СМЗ из молока, разбавленного водой (1:1), возрастает с 84 до 94 % при увеличении массы сорбента от 10 до 20 мг, и не изменяется при дальнейшем увеличении до 30 мг. Степень выделения СМЗ из 5 и 10 мл одинакова и составляет 94 - 95 %, а при увеличении объема до 20 мл наблюдается ее уменьшение до 82%. Степени выделения СМЗ из 10 мл разбавленного и цельного молока не различаются и составляют 94 ± 8 и 92 ± 9 % соответственно.

III

0Я1 ош одз т. г

Рис. 3. Выбор условий сорбционного выделения сульфаметоксазола из молока в зависимости от массы ССГ1С (а), объема раствора (б) и разбавления (в).

В одинаковых условиях (тсспс= 0-02 г, V — 10 мл, время контакта фаз - 30 мин) изучена сорбция из неразбавленного молока остальных СА. Как видно из данных, приведенных в табл. 5, в выбранных условиях степени выделения изученных СА, за исключением сульфаниламида, равны 89 - 93%.

Таблица 5. Степени выделения сульфаниламидов из неразбавленного молока (сСА = 0.5 мкг/мл, V= 10мл, тсспс= 0.02 г, « = 3, Р = 0.95)

Соединение R, %

Сульфаниламид 46 ±5 0.04

Сульфаметоксипиридазин 89 ±8 0.04

Сульфаметазин 91 ±7 0.03

Сульфаметоксазол 92 ±9 0.04

Сульфахлорпиридазин 93 ±6 0.03

Концентрирование и определение сульфаниламидов методом ВЭЖХ

При выборе условий хроматографического разделения и определения СА варьировали природ}' неподвижной фазы, состав подвижной фазы и способ детектирования.

Влияние неподвижной фазы исследовали с использованием колонок Диасфер-110-С16, Luna 5u С 18(2) и Gemini С18. Установили, что природа изученных неподвижных фаз не оказывает влияния на порядок выхода СА, но заметно влияет на их селективность разделения. Ряды селективности для изученных неподвижных фаз приведены на рис. 4. Использование гибридной фазы Gemini С18 позволило улучшить асимметрию пиков и увеличить эффективность разделения СА.

В качестве элюентов использовали водно-метанольные и водно-ацетонитрильные смеси с различным содержанием уксусной или фосфорной кислот. Установлено, что введение кислот в подвижную фазу позволило сократить

і 10 35

R.% ICO

ас аз (0

2D 0

молоко-вода неразбаэл. (1:1) молоко

-Gemini CIS —M—LunaClS —Дивсфсц-ИО-Сіб

гл _и_г

ООО OSO 100 І .SO 2.00 2.SO 3.00 3.SO -l.OQ -e .SO S.OO 5.SO 6.00

Рис. 4. Ряды селективности для неподвижных фаз Gemini С18, Luna С 18(2) и Диасфер-110-С16. рН подвижной фазы 3.5. 1 - сульфаниламид; 2 - сульфаметазин; 3 - сульфаметоксипиридазин; 4 - сульфахлорпиридазин; 5 - сульфаметоксазол.

время анализа с 36 до 29 мин. При использовании фосфорной кислоты удалось добиться лучшего разделения пиков сульфаметазина и сульфаметоксипиридазина, чем в присутствии уксусной кислоты. Установлено, что при одинаковом содержании модификатора в подвижной фазе эффективность разделения СА выше при использовании ацетонитрила (табл. 6). Удерживание СА уменьшается по мере увеличения содержания ацетонитрила в подвижной фазе.

Таблица 6. Хроматографические параметры удерживания сульфаниламидов в зависимости от состава подвижной фазы. Колонка Gemini 5u С18, скорость потока подвижной фазы - 0.4 мл/мин, X = 280 нм

Соединение Ацетонитрил:2%- ный водный раствор СН3СООН (20:80, рН 3.2) Метанол:2%-ный водный раствор СНзСООН (20:80, рН 3.2) Ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3Р04 (20:80; рН 3.5)

к' N к' N к' N

Сульфаниламид 0.22 32200 - — 0.16 37800

Сульфаметазин 1.70 49400 3.12 36200 1.18 44400

Сульфаметоксипиридазин 1.92 40300 4.0 39200 1.55 41500

Сульфахлорпиридазин 3.62 53900 5.40 56900 3.35 60000

Сульфаметоксазол 4.84 41000 — — 4.64 51200

На примере пятикомпонентной модельной смеси, содержащей сульфаниламид, сульфаметазин, сульфаметоксипиридазин, сульфахлорпиридазин и сульфаметоксазол, проведено сопоставление чувствительности

спекгрофотометрического и амнерометрического детекторов. Из сравнения пределов обнаружения (табл. 7, рис. 5) видно, что более чувствительным оказался амперометрический детектор. В зависимости от природы сульфаниламидов пределы обнаружения варьируют от 50 до 100 нг/мл для УФ-детектора и от 6 до 10 нг/мл для амперометрического.

О», нг/мп

САМ СМТ СМП СХЛ СМЗ

Рис. 5. Сопоставление пределов обнаружения сульфаниламидов при использовании УФ и амперометрического детекторов.

Таблица 7. Уравнения градуировочных зависимостей (площадь пика - с, мкг/мл) при определении СА с использованием спектрофотометрического и амперометрического детекторов. Подвижная фаза ацетонитрил : 0.1 %-ный водный раствор Н3Р04 (20:80, рН 3.5)

Соединение Детектор

УФ (1 = 280 нм) Амперометрический (Е= 1.2 В)

Сульфаниламид у= 116.54* (Я2 =0.9971) с . =0.1 мкг/мл mm = 821.61т (if =0.9981) с . - 0.006 мкг/мл mm

Сульфамегазин у = 166.68 х (R =0.9711) с . = 0.06 мкг/мл mm у = 436.58 х (R =0.9675) с . =0.01 мкг/мл mm

Сульфаметоксипиридазин у» 138.82 x(R =0.9996) с . =0.07 мкг/мл mm у = 461.93 х(/гг= 0.9987) с . = 0.01 мкг/мл mm

Сульфахлорпиридазин у = 201 Ах (R =0.993) с . = 0.05 мкг/мл mm >• = 657.99 х (Л =0.9911) с . = 0.008 мкг/мл nun

Сульфаметоксазол у — 207.58 х (R =0.987) с . = 0.05 мкг/мл mm у = 791.49 х (R =0.9918) с = 0.006 мкг/мл mm

С применением ССПС разработана методика группового сорбционного концентрирования СА из водных растворов и их последующего хроматографического определения. Определения проводили в следующих условиях: колонка - Gemini 5u CI 8; скорость потока подвижной фазы - 0.4 мл/мин; элюент - ацетонитрил : 0.1% водный раствор Н3РО4 (20:80, рН 3.5); детекторы -ультрафиолетовый и амперометрический. Как видно из данных, приведенных в табл. 8, сочетание предварительного сорбционного концентрирования из 25 мл раствора позволило снизить пределы обнаружения СА более чем в 30 раз. Следует отметить, что достигнутые пределы обнаружения лимитируются объемом пробы, используемой на стадии концентрирования, и могут быть снижены за счет ее увеличения.

Таблица 8. Характеристика методик определения СА методом ВЭЖХ после сорбционного концентрирования на микроколонке, заполненной 100 мг ССПС, из 25 мл водного раствора (рН ~ 6, v = 0.7 мл/мин)

Соединение Амперометрический детектор УФ-детектор

ДОС, нг/мл стіп, нг/мл ДОС, нг/мл Стіп, нг/мл

Сульфаниламид 0.5-40 0.2 10-40 3

Сульфаметазин 0.9-40 0.3 5-40 2

Сульфаметоксипиридазин 0.9-40 0.3 5-40 2

Сульфахлорпиридазин 0.7-40 0.2 5-40 2

Сульфаметоксазол 0.7-40 0.2 4-40 1

Методика применена для анализа модельных растворов, приготовленных на основе речной воды (табл. 9) и молока (табл.10). Хроматограммы модельной смеси С А после концентрирования из 25 мл речной воды и 10 мл молока приведены на рис.5,6.

Таблица 9. Результаты хроматографического определения СА в речной воде (р. Яуза) методом «введено-найдено» (п = Ъ\Р = 0.95)

Найдено, нг/мл Найдено*,

Соединение Введено, М Введено, нг/мл

нг/мл Амп. УФ- нг/мл (*)

детектор детектор

Сульфаниламид 0 0 0 0 0

10 10 і 3 6 ± 4 2.0 2.3 ± 0.3

(0.11) (0.24) (0.05)

Сульфаметазин 0 0 0 0 0

10 7 ± 5 8 ±4 2.0 2.5 ± 0.7

(0.29) (0.20) (0.11)

Сульфаметокси- 0 0 0 0 0

пиридазин 10 8 ± 2 8 ± 5 2.0 3 ± 1

(0.09) (0.23) (0.15)

Сульфахлор- 0 0 0 0 0

пиридазин 10 11 ± 7 9±6 2.0 2.9 ±0.8

(0.27) (0.29) (0.11)

Сульфаметок- 0 0 0 0 0

сазол 10 9 ± 2 9±2 2.0 2.8 ± 0.7

(0.07) (0.08) (0.10)

♦Определение проводили с амперометрическим детектором

Таблица 10. Результаты хроматографического определения С А в молоке «Домик в деревне» методом «введено-найдено», после их сорбционного выделения на ССПС в статических условиях. (Уыолока = 10 мл, тсспс= 0.02 т,п = 3,Р= 0.95)

Соединение Введено, мкг/мл Амперометрический детектор УФ-детектор

Найдено, мкг/мл 5 г Найдено, мкг/мл 5 г

Сульфаметазин 0 0.10 0 0.11 ±0.01 0.04 0 0.12 ±0.03 0.09

Сульфахлорпиридазин 0 0.10 0 0.10 ±0.01 0.05 0 0.11 ±0.02 0.08

Сульфаметоксазол 0 0.10 0 0.10 ± 0.01 0.05 0 0.12 ±0.04 0.14

а б

* і 1» и и 16 1) » И к м ц г» зі я

Рис. 6. Хроматограммы речной воды после сорбционного концентрирования на ССПС без (а, б) и с добавлением сульфаниламидов (в, г, д, е). сСА = 0.01 (в, г) и 0.002 (д, е) мкг/мл, Элюент: ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3Р04 (20:80; рН 3.5). I - сульфаниламид; 2 - сульфаметазин; 3 -сульфаметоксипиридазин; 4 - сульфахлорпиридазин; 5 - сульфаметоксазол. УФ-детектор: а, в, г, Амперометрический детектор: б, г, е.

^_ДО

I 1! 1} 14 15 1« 1

I 14 15 1« 17 и 1» 10 31 1» И

I с,

11 ! 11/

I 9 18 и и 11 14 15 1« 1' 1* 1» » И :

1 : з 4 7 ( * и и 1: и 14 15 и 1М1 в м и я в у

1 2 3 4 5 6 т I 9 II 11 12 1? 14 II 1« 17 И И 21 'Л II 23 24 а

Рис. 7. Хроматограммы образцов молока после сорбционного концентрирования на ССПС без (а, б) и с добавлением сульфаниламидов (в, г, д, е).

ССА = 0.1 (в, г) и 0.5 (д, е) мкг/мл. Элюент: ацетонитрил - 0.1%-ный водный раствор Н3РО4 (20:80; рН 3.5). 1 - сульфаметазин; 2 - сульфахлорпиридазин; 3 -сульфаметоксазол. УФ-детектор: а, в, д. Амперометрический детектор: б, г, е.

Концентрирование и епектрофотометрическое определение сульфаниламидов

В качестве реагента для спектрофотометрического определения сульфаниламидов предложено использовать и-диметиламинокоричный альдегид (ДМАКА). Установлено, что в среде метанола или ацетонитрила этот реагент вступает в реакцию конденсации с сульфаниламидами с образованием интенсивно окрашенных продуктов конденсации:

H3N

н*

(ch,)jN-

-сн=св—сн =

Взаимодействие сульфаниламидов с ДМАКА в ацетонитриле изучено более детально. При выборе ацетонитрила учитывали, что этот растворитель часто используют на этапе пробонодготовки пищевых продуктов для извлечения сульфаниламидов, а также в качестве элюента в твердофазной экстракции.

С целью выбора оптимальных условий реакции конденсации изучено взаимодействие сульфаниламидов с ДМАКА при варьировании природы сульфаниламида, концентрации компонентов (ДМАКА, HCl), а также содержания воды. Для всех изученных сульфаниламидов максимальные значения оптических плотностей достигались в растворах, содержащих 5 - 10 % воды; увеличение содержания воды до 60 % приводило к уменьшению оптической плотности. Установлено, что на выход продуктов конденсации оказывает влияние концентрации соляной кислоты и ДМАКА. Максимальный выход продуктов конденсации наблюдается в интерзале концентрации HCl, равном 0.020 - 0.025 М при постоянной конце1гграции ДМАКА, равной 5-!0"3 М. При выборе оптимальной концентрации ДМАКА учитывали, что величина контрольного опыта заметно увеличивается при увеличении концентрации реагента от МО" до 1,5-10"2 М.

На основании проведенных исследований выбраны оптимальные условия реакции конденсации

сульфаниламидов с ДМАКА в среде ацетонитрила: cHci= 0.02 М, сДМАКА = 5'10' 3 М, 5% об. Н20, время развития окраски продукта 10 мин. На рис. 7 приведены спектры поглощения продуктов конденсации сульфаниламидов с ДМАКА, из сравнения которых видно, что спектральные характеристики продуктов конденсации практически не различаются: максимумы поглощения находятся при 540 нм, а значения молярных коэффициентов поглощения равны (3,7 -

440 460 480 500 520 540 560 580 61

Рис. 8. Спектры поглощения продуктов конденсации САМ (I), СМЗ (2), СМП (3), СХП (4) и СМТ (5) с ДМАКА в ацетонитриле.

ССЛ = 8-1 (Г М, Сдмакд =

0.02 М, 5% Н20.

5 10' М, сНс1 =

5,1)-Ю .

На,посновднии ,выпрдненн|>щ исследований разработаны два варианта определения СА спектрофотометрическим методом: без (вариант I) и с сорбционным концентрированием на ССПС (вариант И). Спекгрофотометрическая методика определения в'юпЬчала проведение реакции конденсации СА с ДМАКА в ацстонитрильном растворе и измерение оптической плотности в максимуме поглощения. Сорбцйоїшо-спектрофотометрическая методика с сорбционным концентрированием на ССГІС включала сорбцию СА на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом, десорбцию их ацетонитрилом, проведение реакции конденсации с ДМАКА в ацетонитрилыгом элюате и измерение оптической плотносги в максимуме поглощения.

Характеристики спектрофотометрической методики определения сульфаниламидов без и с предварительным сорбционным концентрированием на ССПС приведены в табл. 11. На примере сульфаметоксазола проведена оценка селективности методики. Установлено, что определению не мешают сопоставимые количества триметоприма и антибиотиков других классов: окситетрациклина, неомицина, ампициллина и эритромицина.

Для оценки возможности практического применения спектрофотометрической методики проведено определение сульфаметоксазола в лекарственном препарате «Бисептол» и сульфаметазина в препарате «Зинаприм». Препарат «Зинаприм» применяется в ветеринарии. Было показано, что триметоприм, входящий в состав препаратов, не вступаег в реакцию конденсации с л-диметиламинокоричным альдегидом.

Таблица 11. Характеристика спектрофотометрической методики определения сульфаниламидов без (I) и после концентрирования на микроколонке, заполненной ССПС 01). Г= 50 мл, рН - 6, V = 0/7 мл/мин, тССпс = 0 040 г

Соединение ДОС, м кг/мл стіп, мкг/мл

I II I II

Сульфаниламид 0.07-2 0.02-0.2 0.02 0.007

Сульфаметоксазол 0.1-3 0.06-0.3 0.04 0.004

Сульфаметоксипиридазин 0.2-3 0.02 - 0.3 0.05 0.006

Сульфахлорпиридазин 0.1-3 0.01 -0.3 0.04 0.004

Сульфаметазин 0.1-3 0.01 - 0.3 0.03 0.004

Лекарственную форму (таблетку «Бисептола», 0,7 г) измельчали и растворяли в 100 мл ацетонитрила. Для определения брали аликвотную часть этого раствора. Методом добавок найдено, что в лекарственном препарате содержится 405 ± 60 мг сульфаметоксазола (зг= 0,06), что согласуется с данными, заявленными производителем (400 мг в 1 таблетке).

Лекарственный препарат «Зинаприм», который представляет собой раствор для инъекций, разбавляли и определяли сульфаметазин методом градуировочного графика. Найдено, что в препарате содержится 190 ± 20 мг (вг = 0,04), что также согласуется с указанным на упаковке (200 мг/мл).

Оценка суммарного содержания сульфаниламидов

Интегральные показатели используют при анализе объектов окружающей среды, пищевых продуктов, медицинских и сельскохозяйственных объектов. При контроле объектов окружающей среды используют такие показатели как химическое (ХПК) и биохимическое (БПК) потребление кислорода, общий органический углерод, общее содержание летучих органических веществ, фенольный индекс, суммарное содержание тяжелых металлов и др. В настоящей работе предложен подход к оценке суммарного содержания сульфаниламидов.

Как было показано выше, продукты конденсации сульфаниламидов с ДМАКА образуются в одинаковых условиях. Кроме того, из сравнения спектров поглощения (рис. 7) видно, что положения максимумов в спектрах различаются незначительно, а коэффициенты чувствительности в уравнениях градуировочных зависимостей примерно одинаковы (табл. 12). Все это позволило предположить, что диметиламинокоричный альдегид можно использовать для спектрофотометрического определения суммарного содержания сульфаниламидов.

Таблица 12. Метрологические характеристики спекгрофотометрической методики определения индивидуальных сульфаниламидов и их суммы

Соединение Уравнение градуировочной зависимости (мкг/мл) К2 ДОС, мкг/мл мкг/мл

Сульфаниламид у = 0.430 х 0.9904 0.07-2 0.02

Сульфаметоксазол у = 0.229 х 0.9995 0.1-3 0.04

Сульфаметоксипиридазин у = 0.223 х 0.9875 0.1-3 0.03

Сульфахлорпиридазин у = 0.222 х 0.9909 0.1-3 0.04

Сульфаметазин у = 0.200 х 0.9985 0.2-3 0.05

Сульфаметоксазол, сульфахлорпиридазин, сульфаметазин (с1=с2=сз) у = 0.215 х 0.9984 0.2-3 0.05

Спекгрофотометрическое определение суммарного содержания СА проводили на примере модельных смесей, содержащих разные количества сульфахлорпиридазина, сульфаметоксазола, и сульфаметазина (табл. 13). Согласно литературным данным, эти СА чаще всего встречаются в объектах окружающей среды и продуктах питания. С целью выбора стандартного вещества, позволяющего определять суммарное содержание СА с минимальной погрешностью, в качестве Хст использовали как индивидуальные СА, входящие в состав модельных растворов, так и их смесь в соотношении 1:1:1. Как видно из данных, приведенных в табл. 13, ожидаемая и максимальная относительная погрешность наблюдается для смеси №1, суммарное содержание С А в которой было меньше нижней границы определяемых содержаний. Для всех остальных смесей максимальная, но всегда положительная относительная погрешность (15.4-4.2%) наблюдалась, если пересчет вели на сульфаметазин; для этого СА

Таблица 13. Результаты определения" суммарного содержания сульфаниламидов в их модельных смесях с разным содержанием сульфаметоксазола (СМЗ), сульфахлорпиридазина (СХП) и сульфаметазина (СМТ).

' № Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл (Относительная погрешность, %)

смеси Состав смеси СА (с,мкг/мл) Суммарное содержание а* б* в* г*

1 СМЗ (0.033) 0.10 0.13 0.12 0.13 0.14

СХП (0.033) (30.4) (22.5) (26.0) (39.8)

СМТ (0.033)

2 СМЗ (0) 0.90 0.904 0.85 0.87 0.97

СХП (0.30) (0.4) (-5.7) (-3.0) (7.6)

СМТ (0.60)

3 СМЗ (0.30) 0.90 0.89 0.84 0.85 0.95

СХП (0) (-1.2) (-7.1) (-4.5) (6.0)

СМТ (0.60)

4 СМЗ (0.60) 0.90 0.97 0.91 0.94 1.04

СХП (0.30) (7.6) (1.1) (4.0) (15.4)

СМТ (0)

5 СМЗ (0.30) 0.90 0.92±0.08 0.86 0.89 0.98

СХП (0.30) ҐЛ=0.03) (-4.2) (-1.5) (9.3)

СМТ (0.30) (2.0)

6 СМЗ (0.60) 1.20 1.28 1.20 1.24 1.37

¡СХП (0.30) (6.7) (0.3) (3.1) (14.4)

СМТ (0.30)

7 СМЗ (0.30) 1.20 1.26 1.18 1.21 1.35

СХП (0.60) (4.8) (-1.5) (1.2) (12.3)

СМТ (0.30)

8 СМЗ (0.30) 1.20 1.28 1.20 1.24 1.37

СХП (0.30) (6.7) (0.3) (3.1) (14.4)

СМТ (0.60)

9 СМЗ (0.90) 1.50 1.56 1.46 1.50 1.67

СХП (0.30) (3.7) (-2.6) (0.2) (11.2)

СМТ (0.30)

10 СМЗ (0.30) 1.50 1.55 1.46 1.50 1.66

СХП (0.90) (3.4) (-2.8) (-0.1) (10.8)

СМТ (0.30)

11 СМЗ (0.50) 1.50 1.46 1.37 1.41 1.56

СХП (0.50) (-2.8) (-8.7) (-6.1) (4.2)

СМТ (0.50)

12 СМЗ (0.30) 1.80 1.77 1.67 1.71 1.90

СХП (0.30) (-1.4) (-7.4) (-4.8) (5.7)

СМТ (1.20)

13 СМЗ (0.30) 1.80 1.78 1.68 1.72 1.91

СХП (0.60) (-0-9) (-6.9) (-4.3) (6.2)

СМТ (0.90)

* В качестве Хст использовали : а - смесь СМЗ:СХП:СМТ=1:1:1; б - СМЗ; в - СХП; г-СМТ

коэффициент чувствительности сильнее всего отличался от среднего значения. Минимальная погрешность, величина которой, в зависимости от состава смеси изменялась от -2.8 до 7.6%, наблюдалась, если пересчет вели на смесь С А. Относительная погрешность изменялась от -8.7 до 0.3% и от -6.1 до 4.0%, если пересчет вели на сульфаметоксазол или сульфахлорпиридазин соответственно. Таким образом, проведенное исследование показало, что в качестве стандартного вещества для оценки суммарного содержания СА с минимальной погрешностью следует использовать смесь сульфаниламидов.

д Для оценки возможности практического

применения спектрофотометрической

методики в сочетании с сорбционным концентрированием на ССПС было проведено определение сульфаметоксазола и суммарного содержания сульфаниламидов (на примере сульфаметоксазола, сульфахлорпиридазина и сульфаметазина) в молоке.

Пробоподготовку образцов молока без и с добавками сульфаниламидов проводили по методике, описанной выше. Десорбцию проводили 2 мл ацетонитрила. К каждому элюату добавляли последовательно по 0.25 мл 0.4 М раствора соляной кислоты, 2.5 мл 0.01 М раствора ДМАКА в ацетонитриле и ацетонитрил до 5 мл. Растворы выдерживали в течение 10 мин, после чего измеряли оптическую плотность растворов при 540 им.

На рис. 8 приведены спектры поглощения продуктов конденсации смеси сульфаметоксазола, сульфахлорпиридазина и сульфаметазина с и-диметиламинокоричным альдегидом в ацетонитрильном элюате, после

Рис. 9. Спектры поглощения продуктов конденсации смеси СМЗ, СХП и СМТ с ДМАКА в ацетонитрильном элюате, после сорбционного выделения из молока на сверхсшитом полистироле.

cica, мкг/мл: 0(1); 0,2 (2); 0,9 (3), сдмлка=5-10-3 М, сна=0.02 м, 5%

н2о.

сорбционного выделения на сверхсшитом полистироле. Результаты определения, представленные в табл. 14, указывают на то, что спектрофотометрическая методика может быть использована для быстрого скрининга проб молока на содержание СА.

Таблица 14. Результаты спектрофотомегрического определения сульфаметоксазола и смеси сульфаметоксазола, сульфахлорпиридазина и сульфаметазина в молоке («Домик в деревне», 3,5%) методом «введено-найдено».

Анализируемый объект Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл ■ Sr .

Молоко, разбавленное водой (1:1) с добавками сульфаметоксазола 0 1.0 0 0.7 ± 0.3 0.14

Неразбавленное молоко с добавками сульфаметоксазола 0 0.20 0 0.22 ±0.05 .0.10

Неразбавленное молоко с добавками сульфаметоксазола, сульфахлорпиридазина и сульфаметазина 0 0.20 0.9 0 0.24 ±0.08 1.2 ±0.4 0.10 . 0.12

выводы

1. Проведено систематическое изучение сорбции сульфаниламидов на разных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле, полимерных сорбентах Strata-X и Strata SDB-L, углеродном наноматериале Таунит и Диасорбе 100Ci6T. Даны объяснения особенностей сорбции в зависимости от природы и концентрации сульфаниламидов, кислотности раствора И структурных характеристик сорбентов.

2. Показано, что сверхсшитый полистирол можно использовать для группового концентрирования сульфаниламидов в динамическом режиме. Степени выделения сульфаниламидов из 25 и 100 мл водных растворов с использованием микроколонки, заполненной 30 мг сорбента, и ацетонитрила в качестве элюента составили 90 - 98 %.

3. Для сорбционного выделения сульфаниламидов из молока предложено использовать сверхсшитый полистирол. Разработан новый вариант пробоподготовки молока перед хроматографическим или спектрсфотометрическим определением сульфаниламидов, исключающий стадию депротеинизации.

4. Выбраны условия разделения и определения сульфаниламидов методом ОФ ВЭЖХ (хроматограф «Цвет-Яуза-04»; колонка Gemini 5u С18; подвижная фаза: смесь ацетонитрил - 0.1% водный раствор Н3РО4 (20:80; рН 3.5). Показано, что в выбранных условиях за 30 мин достигалось разделение сульфаниламида, сульфаметоксипиридазина, сульфаметазина, сульфахлорпиридазина и сульфаметоксазола.

5. Проведено сопоставление чувствительности спектрофотометрического и амперометрического детекторов. Установлено, что более чувствительным детектором при ВЭЖХ-определении сульфаниламидов является амперометрический. Пределы обнаружения составляют 50- 100 (УФ-детектор, 280 нм) и 6 - 10 (амперометрический детектор, Е=1.2 В) нг/мл.

6. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ. При концентрировании из 25 мл пределы обнаружения достигают 1 - 3 (УФ-детекгор, 280 нм) и 0.2 - 0.3 (амперометрический детектор, Е=1.2 В) нг/мл для всех соединений. Правильность определения подтверждена методом "введено-найдено" в речной воде и молоке.

7. В качестве реагента для спектрофотометрического определения сульфаниламидов предложен и-диметиламинокоричный альдегид. Показано, что в ацетонитриле этот реагент вступает в реакцию конденсации с сульфаниламидами с образованием окрашенных продуктов. Найдены оптимальные условия проведения реакции. Разработана методика спектрофотометрического определения сульфаниламидных веществ с пределами обнаружения п-10"2 мкг/мл. Проведено определение сульфаметоксазола и сульфаметазина в лекарственных препаратах.

8. Разработана методика определения суммарного содержания сульфаниламидов после их сорбционного выделения и концентрирования на сверхсшитом полистироле, десорбции ацетонитрилом и спектрофотометрическом определении в ацетонитрилыюм элюате по реакции с и-диметиламинокоричным альдегидом. Разработанная методика апробирована при анализе молока.

Автор выражает благодарность акад. Ю.А. Золотову за постоянное внимание к работе; к.х.н., доц. Е.Н. Шаповаловой, к.х.н., н.с. В.В. Апяри и В.В. Толмачевой за помощь в работе.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Клокова (Кочук) Е.В., Дмитриенко С.Г. Спектрофотометрическое определение сульфаниламидов по реакции конденсации с и-диметиламинокоричным альдегидом. // Вестн. Моск. ун-та. 2008. Сер. 2. Т. 49. № 5. С. 339 -343.

2. Кочук Е.В., Дмитриенко С.Г. Сорбция сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле. // Ж. физ. химии. 2011. Т. 85. № 1. С. 95 - 98.

3. Дмитриенко С.Г., Кочук Е.В., Толмачева В.В., Апяри В.В., Золотов Ю.А. Сравнение сорбентов для концентрирования сульфаниламидов из водных растворов перед их определением методом ВЭЖХ. // Ж. аналит. химии. 2013. Т. 68. № 10. С. 966 - 974.

4. Клокова (Кочук) Е.В. Использование и-диметиламинокоричного альдегида для спектрофотометр ического определения сульфаниламидов. / Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», Москва, 8-11 апреля 2008. С. 37.

5. Клокова (Кочук) Е.В., Дмитриенко С.Г. Спектрофотометрическое определение сульфаниламидов по реакции конденсации с и-диметиламинокоричным альдегидом. / Материалы II Международного форума «Аналитика и аналитики», Воронеж, 22 - 26 сентября 2008. С. 499.

6. Клокова Е.В. (Кочук), Кудринская В. А., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А Сорбционное извлечение сульфаниламидов полимерами с молекулярными отпечатками этих соединений и сверхсшитым полистиролом. / Материалы И Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 7-12 октября 2007. С. 214.

7. Кочук Е.В., Дмшриенко С.Г., Золотов Ю.А. Динамическое сорбционное концентрирование сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле с последующим спектрофотомегрическим определением. / Материалы III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 27 сентября - 3 октября 2009. С. 179.

8. Кочук Е.В., Дмитриенко С.Г., Апяри В.В., Золотов Ю.А. Сорбционное концентрирование сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле и их последующее определение методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. / Материалы Второй Республиканской научной конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика РБ - 2012», Минск, 14-15 мая 2012. С. 60.

9. Кочук Е.В., Удалова А.Ю., Дмитриенко С.Г. Особенности разделения сульфаниламидов и окситетрациклина методом высокоэффективной ВЭЖХ на колонке LUNA 5uC 18(2). / Тезисы докладов на 3-ей Научной конференции с международным участием «Химия-2013. Физическая химия. Аналитическая химия. Нанохимия. Теория, эксперимент, практика, преподавание», Москва, 14-16 марта 2013 г. С. 50.

10. Кочук Е.В., Толмачева В.В. Новый способ выделения сульфаниламидов из молока перед их определением методом ВЭЖХ. / Материалы XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013», секция «Химия», Москва, 8-12 апреля 2013. С. 59.

11. Кочук Е.В., Удалова A.IO, Толмачева В.В., Дмитриенко С.Г. Особенности разделения сульфаниламидов и окситеграциклина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ после сорбционного концентрирования на сверхсшигом полистироле. / Материалы II Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26-31 мая 2013. С. 113.

12. Кочук Е.В., Толмачева В.В., Дмитриенко С.Г., Апяри В.В., Золотов Ю.А. Оценка суммарного содержания сульфаниламидов в молоке после их сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле. / Второй Съезд аналитиков России, Москва, 23 - 27 сентября 2013. С. 107.

13. Kochuk Е„ Apyari V., Tolmacheva V., Dmitrienko S. Determination of total sulfonamides in milk using solid-phase extraction on hypercrosslinked polystyrene coupled with off-line derivatization and spectrophotometric detection. / ITP-2013-20 International Symposium on Electro and Liquid Phase Separation Techniques, Tenerife, Canary Islands (Spain), October 6-9, 2013. P. 165.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495)939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 07.11.2013 г.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Кочук, Елена Валентиновна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

04201365484

КОЧУК ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАНИЛАМИДОВ МЕТОДАМИ ВЭЖХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ПОСЛЕ СОРБЦИОННОГО

КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д. х. н., проф. Дмитриенко С. Г.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 Глава 1. Методы выделения, концентрирования и определения

сульфаниламидов 11

1.1. Общие сведения 11

1.2. Методы выделения и концентрирования сульфаниламидов 16

1.2.1. Продукты питания 16

1.2.2. Корма 27

1.2.3. Объекты окружающей среды 28

1.2.4. Лекарственные препараты и биологические объекты 29

1.3. Методы определения сульфаниламидов 30

1.3.1. Хроматографические методы 32

1.3.2. Капилярный электрофорез 37

1.3.3. Скрининговые методы 3 8

1.3.4. Другие методы 41

1.4. Формулирование задач исследования 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46 Глава 2. Объекты исследования, аппаратура и методика эксперимента 46

2.1. Исходные вещества и реагенты 46

2.2. Аппаратура и методика эксперимента 46

2.3. Спектрофотометрическое определение сульфаниламидов по их собственному поглощению в УФ области 50

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 54

Глава 3. Выбор сорбента для концентрирования сульфаниламидов 54

3.1. Структурные характеристики сорбентов, изученных в работе 54

3.2. Сорбция сульфаниламидов в статических условиях 60

3.2.1. Влияние времени контакта фаз 60

3.2.2. Влияние рН водной фазы 60

3.2.3. Влияние строения сульфаниламидов и природы сорбента 63

3.3. Сорбция сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле в динамическом режиме 66

3.4. Сорбция сульфаниламидов из молока 67

Глава 4. Концентрирование и определение сульфаниламидов методом ВЭЖХ 72 4.1. Выбор условий разделения и определения сульфаниламидов методом

обращенно-фазовой ВЭЖХ 72

4.1.1. Выбор неподвижной фазы 72

4.1.2. Влияние природы и состава подвижной фазы на разделение 77 сульфаниламидов

4.1.3. Выбор условий детектирования 85

4.1.4. Способы повышения экспрессности анализа 89 4.2. Определение сульфаниламидов в реальных объектах методом ВЭЖХ 94

4.2.1. Определение сульфаниламидов в речной воде 96

4.2.2. Определение сульфаниламидов в молоке 98 Глава 5. Концентрирование и определение сульфаниламидов

спектрофотометрическим методом 100

5.1. Выбор условий проведения реакции конденсации сульфаниламидов с 101 п-диметиламинокоричным альдегидом

5.2. Спектрофотометрическое определение сульфаниламидов после 104 сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле

5.3. Оценка суммарного содержания сульфаниламидов 106

5.4. Определение сульфаниламидов в реальных объектах 110 спектрофотометрическим методом

5.4.1. Определение в лекарственных препаратах 110

5.4.2. Определение в молоке после сорбционного выделения на 111 сверхсшитом полистироле

ВЫВОДЫ 113

ЛИТЕРАТУРА 115

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

СА - сульфаниламиды;

САМ - сульфаниламид;

СМП - сульфаметоксипиридазин;

СМТ - сульфаметазин;

СМЗ — сульфаметоксазол;

СХП - сульфахлорпиридазин;

ССПС - сверхсшитый полистирол;

УНМ - углеродный наноструктурный материал;

ПДК - предельно допустимая концентрация;

ТФЭ - твердофазная экстракция;

Я - степень извлечения;

Б - коэффициент распределения;

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; ДОС - диапазон определяемых содержаний; стЫ - предел обнаружения.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Сульфаниламиды (СА) - производные п-аминобензолсульфокислоты - используют в практической медицине как эффективные антибактериальные средства с середины прошлого века. Благодаря широкому спектру фармакологического действия и низкой стоимости их применяют и в ветеринарии для профилактики и лечения различных заболеваний животных. Кроме того, эти препараты добавляют в корма в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных для повышения продуктивности животноводства и птицеводства. Широкое, а зачастую и неконтролируемое применение сульфаниламидов в ветеринарной практике обусловливает потенциальную возможность присутствия остаточных количеств этих препаратов в животноводческой продукции и представляет потенциальную угрозу здоровью людей. В большинстве стран, включая Россию, утверждены предельно допустимые концентрации (ПДК) сульфаниламидов в продуктах питания, которые составляют 100 мкг/кг мяса, меда и 100 мкг/л молока. Существует проблема определения сульфаниламидов и в объектах окружающей среды: сточных водах фармацевтических и сельскохозяйственных производств, поверхностных и подземных водах, почвах.

Цель работы состояла в систематическом изучении сорбции сульфаниламидов на сорбентах различной природы и разработке методик сорбционного концентрирования этих соединений для их последующего определения в элюате методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) или спектрофотометрии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить особенности сорбции СА на сорбентах различной природы (сверхсшитом полистироле (ССПС); полимерных сорбентах Strata SDB-L на основе полистирола и Strata-X на основе полистирола, химически модифицированного 14-винил-2-пирролидоном; наноуглеродном материале Таунит; Диасорбе 100-С16Т) в зависимости от условий извлечения и природы сорбатов; сравнить использованные сорбенты по эффективности извлечения аналитов между собой и выбрать наиболее перспективный сорбент для группового концентрирования СА.

• разработать способ оценки суммарного содержания сульфаниламидов;

Научная новизна. Выявлены особенности сорбционного поведения сульфаниламидов на различных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле;

полимерных сорбентах Strata SDB-L на основе полистирола и Strata-X на основе полистирола, химически модифицированного М-винил-2-пирролидоном; наноуглеродном материале Таунит; Диасорбе 100-Ci6T. Оценено влияние рН водного раствора, природы сорбента и строения сульфаниламидов на их распределение. Установлены взаимосвязи между коэффициентами распределения и гидрофобностью сорбатов. Показана возможность использования ССПС для прямой сорбции сульфаниламидов из молока. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования сульфаниламидов на ССПС с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ. Обнаружено, что в ацетонитриле сульфаниламиды вступают в реакцию конденсации с и-диметиламинокоричным альдегидом. Предложен способ оценки суммарного содержания сульфаниламидов.

Практическая значимость. Продемонстрированы возможности использования изученных сорбентов для сорбционного извлечения сульфаниламидов из водных растворов, выбраны условия концентрирования. Разработана методика хроматографического разделения и определения сульфаниламидов, включающая их сорбционное концентрирование на микроколонке, заполненной ССПС, десорбцию ацетонитрилом и раздельное хроматографическое определение со спектрофотометрическим или амперометрическим детектированием. Разработаны спектрофотометрические методики определения сульфаниламидов в виде окрашенных продуктов конденсации с л-диметиламинокоричным альдегидом. Методики апробированы при анализе лекарственных препаратов, речной воды и молока.

Автор выносит на защиту:

• условия хроматографического разделения и определения пяти сульфаниламидов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием УФ-и амперометрического детектирования;

• методики сорбциоиного концентрирования и определения сульфаниламидов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ;

• обоснование возможности использования я-диметиламинокоричного альдегида для спектрофотометрического определения сульфаниламидов в ацетонитрильном растворе и оценки их суммарного содержания;

• результаты определения сульфаниламидов в лекарственных препаратах, речной воде и молоке.

Апробация работы. Основные результаты доложены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), II Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2007), III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009), Второй Республиканской научной конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика РБ - 2012» (Минск, 2012), 3-ей Научной конференции с международным участием «Химия-2013. Физическая химия. Аналитическая химия. Нанохимия. Теория, эксперимент, практика, преподавание» (Москва, 2013), XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), II Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2013), втором Съезде аналитиков России (Москва, 2013), 20th International Symposium on Electro and Liquid Phase Separation Techniques (Tenerife, Canary Islands (Spain), 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов докладов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

3. Дмитриенко С.Г., Кочук Е.В., Толмачева В.В., Апяри В.В., Золотов Ю.А. Сравнение сорбентов для концентрирования сульфаниламидов из водных

I 1 «Í1' ' > ' "' ' ''' ( f , 1 '' „'

растворов перед их определением методом ВЭЖХ. // Ж. аналит. химии. 2013. Т. 68. № 10. С. 966 - 974.

4. Клокова (Кочук) Е.В. Использование n-диметиламинокоричного альдегида для спектрофотометрического определения сульфаниламидов. / Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», Москва, 8-11 апреля 2008. С. 37.

5. Клокова (Кочук) Е.В., Дмитриенко С.Г. Спектрофотометрическое определение сульфаниламидов по реакции конденсации с я-диметиламинокоричным альдегидом. / Материалы II Международного форума «Аналитика и аналитики», Воронеж, 22 - 26 сентября 2008. С. 499.

6. Клокова Е.В. (Кочук), Кудринская В. А., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А Сорбционное извлечение сульфаниламидов полимерами с молекулярными отпечатками этих соединений и сверхсшитым полистиролом. / Материалы II Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 7-12 октября 2007. С. 214.

7. Кочук Е.В., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Динамическое сорбционное концентрирование сульфаниламидов на сверхсшитом полистироле с последующим спектрофотометрическим определением. / Материалы III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 27 сентября - 3 октября 2009. С. 179.

9. Кочук Е.В., Удалова А.Ю., Дмитриенко С.Г. Особенности разделения сульфаниламидов и окситетрациклина методом высокоэффективной ВЭЖХ на колонке LUNA 5uC18(2). / Тезисы докладов на 3-ей Научной конференции с международным участием «Химия-2013. Физическая химия. Аналитическая химия. Нанохимия. Теория, эксперимент, практика, преподавание», Москва, 14-16 марта 2013 г. С. 50.

11. Кочук Е.В., Удалова А.Ю, Толмачева В.В., Дмитриенко С.Г. Особенности разделения сульфаниламидов и окситетрациклина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ после сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле. / Материалы II Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26-31 мая 2013. С. 113.

13. Kochuk Е., Apyari V., Tolmacheva V., Dmitrienko S. Determination of total sulfonamides in milk using solid-phase extraction on hypercrosslinked polystyrene

______tV»

coupled with off-line derivatization and spectrophotometric detection. / ITP-2013-20 International Symposium on Electro and Liquid Phase Separation Techniques, Tenerife, Canary Islands (Spain), October 6 - 9, 2013. P. 165.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Методы выделения, концентрирования и определения

сульфаниламидов

1.1. Общие сведения

Сульфаниламиды - производные сульфаниловой («-

аминобензолсульфоновой) кислоты, являются одним из старейших классов антимикробных лекарственных средств, которые применяют для лечения людей и животных с середины двадцатого века. Сульфаниламиды действуют бактериостатически, то есть обладают химиотерапевтической активностью при инфекциях, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями, а также некоторыми простейшими (возбудителями малярии, токсоплазмоза и др.).

Родоначальником группы лекарственных средств - сульфаниламидов является сульфаниламид (п-аминобензосульфамид), больше известный под названием стрептоцид. Впервые сульфаниламид был синтезирован в 1908 г. и широко использовался в качестве промежуточного вещества в производстве красителей. Антибактериальные свойства сульфаниламидов были обнаружены немецким учёным Г. Домагком в 1935г. В основе бактериостатического действия сульфаниламидов лежит сходство сульфаниламидного фрагмента с п-аминобензойной кислотой (ПАБК), которая участвует в биосинтезе дигидрофолиевой, фолиевой кислот и других веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов. Механизм антимикробного действия СА обусловлен тем, что они блокируют процесс синтеза дигидрофолиевой кислоты на стадии образования дигидроптероиновой кислоты из дигидроптеридина и ПАБК с участием фермента дигидроптероатсинтетазы. Сульфаниламиды конкурируют с ПАБК, в результате чего образуется не дигидрофолиевая кислота, а ее аналог [1]. Этими особенностями механизма действия объясняется тот факт, что к сульфаниламидам проявляют чувствительность только те виды микроорганизмов, которые самостоятельно осуществляют синтез дигидрофолиевой кислоты, а микроорганизмы и клетки, которые утилизируют ее в готовом виде, к действию СА не чувствительны.

К настоящему времени синтезировано более 10000 производных сульфаниламида, из которых в медицинской практике применяется около 40. При синтезе производных сульфаниламида были