Кристаллизация мембранных белков: родопсин сетчатки глаза быка и реакционные центры из Chloroflexus aurantiacus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи ЮРКОВА ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ: РОДОПСИН СЕТЧАТКИ ГЛАЗА БЫКА И РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ ИЗ СЫогоПехш; аигагтасш

02.00.10 Бнсорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии имени МАШемякина АН ОХР

Научный руководитель - кандидат биологических наук Демин В.В.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор Харитоненков ИР.

кандидат химических наук, Барсуков Л.И.

Ведущая организация - Институт кристаллографии

им. А.В.Шубникова АН СССР

Защита состоится

/о / в _час. на заседании специализированного совета Д.00235.01

при Институте биоорганической химии им. М-МШемякина АН СССР

по адресу: 117871, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоор-ганичесхой химии АН СССР.

Автореферат разослан ^ ^ &гС-бС^-Ял о 3 О-

Ученый секретарь /' *] ^

специализированного совета ИБХ АН СССР ..-' //} *

/ ^

кандидат хкмичесшх наук | ; В-А-Несмеянов

V С-"'

Актуальность проблемы. Современный уровень развития физико - химической биологии и биотехнологии характеризуется выраженной потребностью в получении биологически-активных макромолекул в кристаллическом состоянии. Наличие таких кристаллов позволяет методами рентгеноструктурного анализа установить пространственную структуру образующих его молекул вплоть до определения пространственных координат каждого атома. Точная структурная информация позволяет не только приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования биологически активных макромолекул, но и создает возможность для конструирования структурных аналогов этих молекул с целью модификации их свойств. Это открывает также принципиально новые возможности для индустрии: создание лекарственных препаратов, вакцин и тл.

Вторым важнейшим аспектом проблемы кристаллизации биополимеров является то, что в последние годы резко интескфицировались исследования возможности применения биологических макромолекул и особенно их кристаллов в качестве элементов технических устройств, например, для восприятия, передачи или хранения информации. Использование принципов функционирования ' и структурной организации макромолекул в кристаллах открывает новые возможности в конструировании электронных устройств.

С уетсм изложенного выше не вызывает сомнения, что в ближайшем будущем кристаллы биополимероз найдут самое широкое примейение в различных областях человеческой деятельности.

Особые усилия в настоящее время направлены на изучение мембранных белков, которые участвуют т; тагах ключевых процессах жизнедеятельности как перенос через мембрану, фоторецепция и тл. Вместе с

тем, в отличие от глобулярных белков, серьезное исследование физико - химических особенностей кристаллизации мембранных белков начинаются только сейчас.

Цель работы. Настоящая работа посвящена исследованию физико-химических особенностей кристаллизации таких' мембранных белков как родопсин сетчатки глаза быка и фотосинтетических реакционных центров зеленых бактерий СЫогоЯехиз аигапиасиэ и является частью комплексной программы структурно-функционального изучения этих мембранных белков, проводимой в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР.

Научная новизна и практическая значимость работы. Определены условия кристаллизации и исследовано влияние различных параметров на рост кристаллов мембранных белков родопсина сетчатки глаз быка и реакционных центров из С1огоПехи5 аигапйасиэ. В настоящее время, когда закристаллизовано еще небольшое число мембранных белков, каждая новая успешная кристаллизация ценна не только потому, что открывает возможности определения структуры данного белка, но и потому, что вносит вклад в исследование физико-химических особенностей образования кристаллов. Подходы к определению условий образования кристаллов и результаты работы могут применяться при кристаллизации других мембранных белков.

Апробация полученных данных. Результаты работы доложены на сим позиуме " Ретиналь содержащие белки" ( Иркутск, 1986 ) и на симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции", Швейцария-СССР ( НашательД990)

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в б печатных работах. Список публикаций приведен в конце реферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 91 наименование. Она изложена на 131 страницах, включая 32 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Особенности кристаллизации мембранных белков Юбзор

литературы)

В обзоре рассмотрены основные принципы структурной организации мембранных белков, суммированы сведения о строении и основных свойствах детергентов, солюбилизации ими мембранных белков. Также рассмотрены возможные типы кристаллов мембранных белков. Кристаллы, ПО' лученные за счет кристаллизации белок-детергентных комплексов, являются наиболее перспективными, с точки зрения пригодности для изучения пространственной структуры белковых молекул. Поэтому подробно рассмотрены условия и методы их получения. Особое внимание уделено проблеме разделения фаз в кристаллизации мембранных белков.

2. Кристаллизация родопсина сетчатки глаза быка.

Родопсин, светочувствительный пигмент фоторецепторных клеток сетчатки глаза - типичный интегральный мембранный белок. Из-за своего мембранного характера он нерастворим в водных буферных растворах и поэтому требует солюбилизации детергентом. Для солюбилизации белка Еыбраны несколько детергентов, в которых, как установлено экспериментально, родопсин стабилен по крайней мере 3 недели. Поскольку известно, что степень очистки белкового препарата от примесных компонент, в том числе и лкпидкой природы, зависит от концентрации в нем детергента, исследована эффективность очистки с помощью афиннок хроматографии на конканавалин А-сефарозе для всех выбранных детергентов.

На основании результатов выбраны такие концентрации детергентов, при которых содержание липидов в выделенном белке не должно превышать 1 молехулы на молекулу родопсина. Значения концентраций детергента приведены в табл.1. Очищенный белок характеризовался соотношением поглощения света при 280 нм к поглощению при 500 нм не более 1.9.

Исследовано влияние на рост кристаллов из растворов каждого из детергентов таких переменных как концентрация детергента и концентрация белка, рН раствора и его температура. Опробованы также осади-тели различной природы: солк - сульфат аммония, фосфат натрия, цитрат натрия, полиэтиленгликоли различной степени полимеризованности, а также 2 -метил-2,4-метилпентадиол (ШЮ). Установлено, что кристаллизация родопсина наблюдается только в присутствии октил-полиок-сиэтилена (о-РОЕ). При использовании других детергентов, приведенных в табл.1, или их смесей образование кристаллов не наблюдается. Критичным является также и природа осадителя. Органический осадитель МРР оказался непригоден, так как при концентрациях выше 10% вызывает обесцвечивание родопсина в течение нескольких часов. Полиэтиленгликоли приводят к образованию аморфного осадка. Формирование кристаллов родопсина наблюдается при использовании в качестве осадителей неорганических солей.

Кристаллы родопсина могут быть получены в довольно широком диапазоне рН (5,5-7,5) и концентраций белка (0,4-15 мг/мл). Другим важным параметром, влияющим на кристаллообразование, является количество молекул детергента в расчете на одну молекулу белка. Установлено, что для большинства закристаллизованных мембранных белков значение этого параметра лежит в интервале 50 - 300. В отличие от этого кристаллы родопсина могут бьггь получены в диапазоне мольных отношений

Таблица 1. Детергенты, использованные при выделении и поисках условий кристаллизации родопсина сетчатки быка

детергент

Мол.вес. (Да)

CMC *) (мМ)

Название фирмы

октил-вО-глюкопи-ранозид (OG)

292,4

17,4

SERVA

октил-полиоксиэ-тилен (о-РОЕ)

350,0 ")

6,6

OXYL

N^-диметилдоде-циламиноксид (LDAO)

229,4

1Д

OXYL

нонаноил-Н-метил-глюкамид (NMG)

335,5

22^

OXYL

*) CMC - критическая концентрация мицеллообразования

**) средний молекулярный вес

детергент/белок от 800 до 3000. Оптимальные значения составляют 1100 -2000.

Характерной особенностью кристаллизации родопсина является то,

что она происходит в условиях разделения фаз, состоящих в том, что исходный белок-детергентный раствор в присутствии достаточно высокой концентрации соли делится на две несмешивающиеся фазы, одна из которых содержит практически весь детергент, другая - осадитель. Образование кристаллов происходит в каплях "детергентной" "фазы. Использование добавох: 1,23-гептантртола, глицерина, триэтиламмоний фосфата или фенилаланина, позволяющих в некоторых случаях получать кристаллы мембранных белков без разделения фаз, в случае родопсина не привело к успеху. На фазовой диаграмме (рис.1) линии "Ф" и "К" представляют собой границы появления двух несмешивающихся фаз и кристаллов родопсина, соответственно. Положение границы кристаллизуемости однозначно коррелирует с положением границы разделения фаз. Снижение температуры раствора от комнатной до 4°С повышает минимальные концентрат осадителя, вызывающие разделение фаз, и соответственно этому смещается граница появления кристаллов.

Кристаллизация родопсина в детергентной фазе обуславливает, по-видимому, то, что формирование кристаллов наблюдается в широком диапазоне концентраций белка, так как разделение фаз сопровождается его значительным концентрированием. На рис.2 представлена зависимость концентраций белка в "солевой" и "детергентной" фазах от концентрации осадителя. При разделении фаз практически весь белок, содержащийся исходно в растворе, переходит в "детергентную" фазу. С увеличением концентрации осадителя объем детергентной фазы уменьшается (по-видимому, из-за уменьшения содержания в ней воды) (рис.2), что вызывает дальнейшее постепенное повышение концентрации белка, приводящее к пересыщению раствора, и переходу белка в твердую фазу.

В соответствии с этим кристаллизация родопсина происходит при

1

Рис.1. Фазовая диаграмма родопсина в детергентком растворе 1% о-РОЕ в присутствии сульфата аммония при 21°С Линии "К" и "Ф" -границы, выше которых наблюдается образование кристаллов и разделение раствора на две несмешиваюгциеся фазы, соответственно. Точки А соответствуют начальным, В - конечным условиям двух экспериментов по кристаллизации, один из которых (А^В/) ведет, а другой (А^Дэ) не ведет к образованию кристаллов.

конечных концентрациях осадителя больших, чем те, которые необходимы не только для индуцирования разделения фаз, но и для достижения насыщения белком детергентной фазы. При этом размеры кристаллов, а также их число зависят от начальной и конечной концентрации осадителя. В случае сульфага аммония оптимальная концентрация лежит в диапазоне 1,0 - 1,5 М, что соответствует условиям, близким к насыщению белком детергентной фазы (см. рис.2). С увеличением концентраций

-С 10 СС 8

-----

---

в- <

^-я —В--( 1 ______

т

1С0

30

ю

70 Ц

60

50

40 я

30

20

/С

0 ,

(лж^о*, м

00 1Л , 20

05 15 25

Рис. 2. Зависимости концентрации родопсина в растворе 10% о-РОЕ

до разделения раствора на фазы (В) и после разделения в "де-

тергентной" фазе (А) и "солевой" фазе (О), а также объема

"детёргентной* фазы (X) от концентрации в растворе сульфата

аммония

сульфата аммония до 2 М и выше размеры кристаллов уменьшаются, а затем они исчезают. Оптимальные величины конечных концентраций сульфата аммония лежат вблизи нижней границы кристаллизуемости • (кривая "К" на рис.1). Использование более высоких конечных концентраций осадителя приводит сначала к уменьшению размеров кристаллов, а затем к их исчезновению. Это обусловлено, по-видимому, тем, что при высоких конечных концентрациях в белковом растворе достигается слишком высокая степень перенасыщения, что приводит к увеличению количества зародышей и, как следствие, уменьшению размеров кристаллов. В случае сульфата аммония образование кристаллов происходит в диапазоне концентраций 2,8 - 3,5 М,- при более высоких концентрациях практически весь белок переходит в аморфный осадок.

Вне зависимости от конкретных условий эксперимента кристаллы родопсина имели иглообразную форму и характерный для родопсина красный цвет (см.рисЗ). Максимальные размеры не превышали 70 х 70 х х 100 мкм. Такие размеры кристаллов не позволили провести их исследование с помощью рентгеновской дифракции. Однако, определенную информацию об их структуре удалось получить с помощью методов электронной микроскопии. Были подобраны условия получения мелких кристаллов родопсина, пригодных для электронно-микроскопического исследования. Профильтрованное изображение такого кристалла, представляющее собой одну из проекций, приведено на рис.4. Проекция относится к двусторонней плоской группе симметрии р21. Элементарная

0 ° /\Л о

ячейка имеет параметры а = 50 А, b = 72 А, Т = 90 и содержит один пик белковой плотности площадью 15 нм , что соответствует, по-видимому, двум молекулам родопсина.

3. Кристаллизация реакционных центров из Chloroflexus aurantiacus

Фотосинтетические реакционные центры (Rc) - класс интегральных мембранных белков, включенный в процесс превращения световой энергии в энергию химических связей в биосинтезе высших растений и фотосин-тезирующих бактерий.

К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа опре-

о

делена с разрешением 3 А пространственная структура Rc пурпурных бактерий Rh. viridis, а затем и Rh. sphaeroides .

Реакционные центры зеленой бактерии Cloroflexus aurantiacus, обладающие сходными функциональными свойствами, отличаются от Rc пурпурных бактерий тем, что содержат две полипептидные цепи. Их аминокислотная последовательность определена в Институте биоорганичес-

РисЗ. Кристаллы родопсина сетчатки быка

Рис.4. Проекция структуры трехмерных кристаллов родопсина, полученная цифровой обработкой электронно-микроскопического изобра-

кой хямшг АН СССР. Несмотря на различия, Rс различных организмов выполняют одинаковые функции. Со структурно функциональной точки зрения представляется интересным определение пространственной организации молекулы Rc Cloroflexus aurantiacus, являющейся простейшей из всех известных сегодня Rc, и сравнить ее с уяе известными структурами.

После заключительной стадии о-тиши чистоту белкового препарата оценивали по соотношению поглощения при длинах волн 280 и 860 нм, которое обычно составляло 1Д -

Предварительный выбор видов детергентов, осадителей, а также области pH, в которой целесообразно производить поисх условий кристаллизации, сделан на основе анализа условий, в которых получены кристаллы реакционных центров из других источников, а именно Rh. viridis и Rh. sphaeroides Поэтому первоначальные поиски условий кристаллизации Rc проводили из детергентных растворов октл-вГ)-гяюкопиранозида (OG) и LDAO в широком диапазоне pH (5 - 9) в присутствия в качестве осадителей сульфата аммония или полиэтиленглихоля (PEG) совместно с NaCJ.

Кристаллизация в LDAO и OG. Для определения условий кристаллизации Rc, солюбилизированного в одном из детергентов OG или LDAO, был поставлен ряд экспериментов, в которых варьировали концентрацию оса-дителя, pH и температуру. Поиск условий проводили методом диффузии через газовую фазу.

Rc образуют кристаллы в обоих данных детергентах в присутствии осадителей класса PEG совместно с NaCL Попытки кристаллизации с использованием в качестве осадителей неорганических солей не дали положительных результатов.

При использования ШЛО кристаллы В.с образуются а диапазоне р] 7,5 • 9Д. На рис 5д. представлена фазовая диаграмма кристаллизации Яс в этом детергенте при 22*С Также как н в случае родопсина граница христаллизуемоста находится выше границы фазового разделения. Кристаллы образуются в каплях детергентной фазы. Они имеют гексагональную форму и характерную коричнево-зеленоватую окраску. Размеры кристаллов не превышают 20 х 20 х 50 мкм, что делает их непригодными для изучения рентгенострухтурным анализом.

В детергенте ОС кристаллы получены не были ни при каких концентрациях осаднтезей ж значениях рН. Модификация свойств детергентной системы добавлением 3% 1ДЗ-гешантрлола позволил получить кристаллы 5 диапазоне рН 7,5 - 9,0 в присутствии 18-25% РЕО 4000. Однако, кристаллы кмеля вид слоистых плоских пластинок, плохо воспроизводились н были неприпикы для рентгеновских исследований.

Кристаллизация в оЗОЕ. Раствор детергента о-РОЕ подвергается разделению фаз при больших концентрациях осадителей РЕО/ЫаСЗ, чем детергенты СХЗ и ЫЭАО. Поэтому о-РОЕ выбран для дальнейших поисков усш кристаллизации Ис.

Фазовая диаграмма кристаллизации Кс в этом детергенте представлена. на рис. 5Д Кристаллы образуются при конечных условиях эксперимента, соответспдощкх точкам, лежащим на диаграмме выше кривой "К*. Наибольшие размеры кристаллов получены в условиях, близких к кривой границы крясхаллнзуемосге. С удалением от' нее размеры кристаллов уменьшаются.

Граница крястатязуемоспа располагается па диаграмме ниже границы разделения фаз (кривая 'Ф' на рис 5), что означает формирование кристаллов в условиях монодислгрсиого раствора. Возможно, именно это

Рис.5. Фазовые диаграммы кристаллизации реакционных центров в ЦЭАО (а) и о-РОЕ (б). Кривые "Ф" и "К" - границы фазового разделения и христаялизуемости, соответственно

позволило получить кристаллы больших размеров, пригодные для рентгеновского изучения.

Положение границы крисгаллизуемости коррелирует с положением границы фазового разделения. Так, при уменьшении температуры кривая разделения фаз в растворе о-РОЕ сдвигается на диаграмме вверх. Кривая крисгаллизуемости также сдвигается в ту же сторону. Тот же эффект наблюдается при замене PEG 4000 на PEG с большей степенью поли-меризованности, а именно PEG 8000 и PEG 20000.

Для определения влияния содержания детергента в белковом растворе на образование кристаллов поставлена серия опытов по кристаллизации методом микроанализа, позволяющим легко контролировать концентрацию детергента в образце в течение кристаллизации. Концентрация. о-РОЕ в пределах 0,4 - \fl % практически не сдвигает границу крисгаллизуемости. В то же время граница разделения фаз сдвигается значительно в сторону больших концентраций осадителя. В этом случае зона между кривыми "К" и "Ф" увеличивается. Это обстоятельство облегчает подбор таких условий кристаллизации, которые позволяют получить кристаллы без разделения фаз.

Фазовая диаграмма кристаллизации не зависит от рН раствора в диапазоне рН 5,0 - 9,0 , однако форма образующихся кристаллов Rc за- . висит от рН. При рН 5,0 - 7,0 кристаллы имеют ромбическую форму, при рН 7,5 - 9,0 - гексагональную. В промежутке рН 7,0 - 7,5 в растворе наблюдается присутствие кристаллов обеих форм.

Размеры наилучших полученных кристаллов обеих форм составляли 0,2 х 0,2 х 0,5 мм, что позволило провести их рентгеновское исследование. Предварительные рентгеиоструктурные исследования кристаллов провели для обеих кристаллических форм Rc, полученных в присутствии

о-РОЕ. Кристаллы, выращенные при рН 8,0 - 9,0, принадлежат гексагональной пространственной группе P6S22 (возможно Р622) с параметрами

с с

элементарной ячейки а = 141,9 A, b = с = 1303 А (Рис.бд.). Симметрия этих пространственных групп предполагает число молекул в элементарной ячейке кратное 12. Для минимально возможного числа молекул величина параметра Мэтьюза для белковой молекулы равно 2,48 А5/ Да, что попадает в интервал, характерный для большинства белковых молекул.

Кристаллы, выращенные при рН 6,0 - 7,0 принадлежат орторомби-

о

ческой пространственной группе Р222 с параметрами ячейки а = 120,0 А, в р

b = 116,5 А, с = 111,0 А (Рис.6,б). По известному молекулярному весу и объему элементарной ячейки вычислен параметр Мэтьюза, равный

о 3

2, 7 А /Да в предположении, что на элементарную ячейку приходится 8 молекул белка, т.е. 2 молекулы на независимую часть ячейки.

Радиационная стойкость кристаллов зависит от температуры. Уменьшение температуры до 12°С позволяет регистрировать рефлексы до 9 А разрешения. Поэтому, весьма вероятно, что дальнейшее понижение температуры и использование более мощного рентгеновского излучения способно увеличить разрешение кристаллов и позволит провести их структурное исследование. 4. Заключение

Исследование физико-химических особенностей кристаллизации мембранных белков на примере родопсина сетчатки быка и реакционных центров из Chloroflexus aurantiacus , а также сопоставление результатов с известными данными о других мембранных белках, позволяют выделить некоторые факторы, оказывающие важное влияние на процессы кристаллизации.

(б)

Рис.6. Кристаллы реакционных центров и прецессионные рентгеновские снимки с них. Кристаллы выращены из растворов о-РОЕ при рН 5,0 - 7,0 (а) и при рН 8,0 - 9,0 (б)

Кристаллы мембранных белков могут быть получены в широком диапазоне условий, как в условиях разделения, так и без разделения фаз. Накопленный опыт показывает, что наилучшие кристаллы, обладающие большими размерами и более совершенной структурой, получены из монодисперсных растворов. Действительно, в случае изученных в данной работе реакционных центров подбор условий кристаллизации в отсутствие разделения фаз позволил получить кристаллы, пригодные для рентге-ноструктурного изучения.

Одним из факторов, определяющих возможность получения кристаллов из монодисперсного раствора, является выбор детергента, в котором представляется возможным достижение необходимой для образования кристаллов степени перенасыщения белка при таких концентрациях оса-дителя, которые еще не приводят к разделению раствора на фазы. В самом деле, выбор детергента о-РОЕ, подвергающегося разделению фаз при больших концентрациях осадителя, чем другие опробованные детергенты, позволил получить кристаллы реакционных центров из монодисперсного раствора.

Для ряда мембранных белков отмечено, что кристаллизация происходит в условиях, близких к условиям, вызывающим разделение фаз. Результаты, лолученые нами для К с, подтверждают это правило. Кристаллы образуются в ряде детергентов, и в каждом из них граничные концентрации христаллизуемости и фазового разделения различаются на несколько процентов. Близость граничных условий кристаллизуемости и разделения фаз обуславливает возможность изменения свойств раствора так, чтобы кристаллизация мембранного белка происходила в монодисперсном растворе.

На положение границы разделения фаз влияют такие параметры, как

температура раствора или степень полимеризованности осадителя PEG. Однако, как выяснилось в ходе исследования, изменение этих параметров не может привести к получению кристаллов без разделения фаз, так как вызывает одновременно синхронное движение границы кристаллизуе-мости.

Другой возможный способ влияния на положение границы разделения фаз - добавление веществ, изменяющих коллоидное поведение раствора. Так, например, известно, что присутствие в растворе соединений: глицерина, пролина, 1,2,3-гептантриола и тд. в растворе бактериородоп-сина в OG привело к возможности кристаллизации в монодисперсном растворе и, как следствие, улучшению качества кристаллов. В случае изучаемых в данной работе Rc зеленых бактерий добавление 1,23-геп-тантриола к OG также позволило получить кристаллы, в то время как без добавки они в этой детергентной системе не формировались. Хотя кристаллы в данном случае оказались невысокого качества, налицо бла-. готворное влияние присутствия амфифильной добавки на кристаллизацию.

В отличие от большинства закристаллизованных мембранных белков кристаллизация родопсина сетчатки быка происходит при таких концентрациях осадителя, которые значительно выше концентраций, вызывающих разделение фаз. Изучение растворимости белка в детергентной фазе показывает, что даже при концентрациях сульфата аммония, вызывающих разделение фаз, раствор родопсина не достигает требуемой степени перенасыщения, и при дальнейшем росте концентрации осадителя концентрация белка в детергентной фазе продолжает расти.

Удаленность границы кристаллизуемосгти от границы разделения фаз, по-видимому, объясняет неэффективность влияния присутствия веществ, изменяющих коллоидное поведение детергентов на кристаллизацию этого

белка. Смена детергента также не дает желаемого результата. Кристаллы получены только в одном из опробованных детергентов.

По всей видимости, родопсин сетчатки быка относится к таким мембранным белкам, кристаллы которых могут образовываться только после разделения раствора на фазы, что может приводить к ряду осложнений при кристаллизации. Так, рост кристаллов в мелкодисперсной фазе может приводить к ограничению их размеров, а также х частичной денатурации белка. Поэтому представляется важным изучение физико-химических особенностей поведения белка и процессов кристаллизации в условиях разделения раствора на фазы, а также поиск возможностей получения в нем больших, хорошо упорядоченных кристаллов.

Очевидно, что различия в поведении таких мембранных белков как родопсин и реакционные центры, обусловлены особенностями их строения.

В случае мембранных белков кристалл образуется за счет взаимодействий двух типов: полярных между гидрофильными частями белковых молекул и коллоидных между их внутримембранными частями, "покрытыми" детергентом. Взаимодействия первого типа специфичны и, очевидно, необходимы для правильной ориентации молекул в кристалле. Роль таких взаимодействий однозначно подтверждается влиянием рН на образование кристаллов. Так, изменение рН приводит к получению кристаллов Ис из зеленых бактерий, относящихся к различным пространственным группам.

В случае белков с обширной гидрофильной частью между ними возможно образование большого числа полярных взаимодействий, обладающих достаточной силой для поддержания кристаллической структуры. В таком случае для образования кристалла не является необходимым участие

сильных коллоидных взаимодействий, приводящих в конечном счете к разделению раствора на фазы, и образование кристаллов происходит в условиях монодисперсного детергентного раствора.

Для белковых молекул с относительно малой гидрофильной частью, содержащей небольшое число центров межбелковых взаимодействий, их сила недостаточна для удержания молекул в кристалле. Для его образования требуется усиление коллоидных взаимодействий, которому сопутствует фазовое разделение. Поэтому в данном случае кристаллизация протекает в детергентной фазе.

Таким образом, условия образования кристаллов определяются структурой белок-детергентных мицелл, которая зависит как от белка, так и от природы и размеров молекул детергента. В некоторых случаях при солюбилизации мембранного белка молекулы детергента, особенно если они имеют относительно большие размеры, могут закрывать собой часть гидрофильной белковой поверхности. Экранирование при этом возможных центров взаимодействия белковых молекул уменьшает их число и влечет за собой необходимость фазового разделения для образования кристаллов. Так, Яс в растворе детергента о-РОЕ, по-видимому, имеют достаточно много свободных потенциальных центров связывания, что позволяет провести кристаллизацию, избежав разделения фаз. Более того, в этом детергенте образуются кристаллы, относящиеся к двум разным пространственным группам. В области рН 6,0 - 7,0 образуются ромбические кристаллы, в области рН 8,0 - 9,0 - гексагональные. Это свидетельствует о наличии центров связывания, участвующих в образовании кристаллов обоих типов. Два другие, использованные для кристаллизации Лс детергенты, по-видимому, экранируют некоторые из существующих центров связывания. Это приводит, во-первых, к получению

кристаллов только одной гексагональной пространственной группы, а во -вторых, к тому, что кристаллизация происходит в условиях фазового разделения. Тем не менее, следует подчеркнуть, что Ис имеют довольно большую гидрофильную часть, содержащую согласно оценкам их аминокислотной последовательности около 60% аминокислотных остатков . Возможно, что именно это обуславливает хорошую кристаллизуемость этого белка, приводящую к получению кристаллов в ряде детергентов. Другой исследованный белок, а именно родопсин сетчатки быка, характеризуется тем, что кристаллизуется гораздо труднее. Это и не удивительно, так как по оценкам, вытекающим из анализа аминокислотной последовательности этого белка, вне мембраны находится только 40% его остатков. Таким образом, гидрофильная часть родопсина заметно меньше, чем у 11с.

Образование кристаллов родопсина в о-РОЕ означает, что в этом детергенте белок имеет открытые центры полярных взаимодействий, что является необходимым условием упорядочивания молекул в кристалле. Однако, кристаллизация протекает в условиях разделения фаз. Это указывает на недостаточную эффективность гидрофильных взаимодействий в кристалле, вытекающую из относительно небольшого числа потенциальных центров связывания. Возможно, что родопсин сетчатки глаз быка является одним из представителей мембранных белков с очень малой гидрофильной частью, обладающей небольшим числом потенциальных центров межмолекулярных взаимодействий. По-видимому, для этих белков выбор даже такой детергентной системы, в'которой останутся свободными все центры, не приведет к возможности их кристаллизации в условиях монодисперсного раствора.

ВЫВОДЫ

1. На примере двух интегральных мембранных белков - родопсина сетчатки глаза быка и реакционных центров из Chloroflexus aurantiacus - исследованы физико-химические особенности их поведения

в экспериментах по кристаллизации.

2. Установлено, что наиболее эффективно кристаллизация происходит в условиях монодисперсных растворов. При этом ключевыми параметрами, определяющими возможность такой кристаллизации, являются природа детергентной системы, концентрация детергента и присутствие соединений, препятствующих фазовому разделению.

3. Предположено, что существуют мембранные белки (такие как родопсин), для которых состояние пересыщения детергентных растворов достигается только в условиях разделения фаз и, соответственно, формирование кристаллов происходит в детергент-белковой фазе.

4. Найдены оптимальные условия кристаллизации реакционных центров из их монодисперсных растворов. Получены две кристаллические формы, принадлежащие различным пространственным группам и проведено их предварительное рентгеноструетуркое исследование.

5. Получены кристаллы родопсина сетчатки глаза быка, структура которых охарактеризована методом электронной микроскопии.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

l.V.VDemin, E.V.Yurkova, AP.Kuzin, AXBarnakov, N.GAbdulaev. " Crystallization of bovine retina rhodopsin". In: Retinal Proteins. Proceedings of an International Conference. Irkutsk (Lake Baikal), USSR, 22-28 July, 1986. (YuA.Ovchinmcov,ed.) VNU Science Press,

Utrecht, The Netherlands

2. В.ВДемин, Е.В.Юркова, АЛ.Кузин, А.Н.Барнаков, НГАбдула-ев. Тезисы докладов Международной конференции "Ретиналь содержащие белки", 22-28 июля 1986 г, Иркутск (о.Байкал), стр. 72-73

3. В-ВДемин, ЕВЛОркова, АЛ.Кузин, А.Н.Барнаков, Н.ГАбдула-ев. "Кристаллизация родопсина сетчатки быка'.Труды международной конференции по ретиналь содержащим белкам (Иркутск, 1986), Наука, 1989, стр. 291-295

4. E.V. Yurkova, LN.Tsygannic, A.GJZargarov, A.S.ZoIotarev, N. GAbdulaev, V.VJDemin. Crystallization of photosynthetic reaction centres from Chloroflexus aurantiacus. FEBS Lett, 1989, v256, N.1,2 , p.167-169

5. E.V.Yurkova, V.VDemin. Crystallization of membrane proteins. Bovine rhodopsin and reaction centres from Chloroflexus aurantiacus.- Abstracts of the Switz - USSR Symposium on Biological Membranes: Functions and Structure, Neuchatel, Switzerland, 1990.

6. E.V.Yurkova, V.VDemin, N.GAbdulaev. Crystallization of membrane proteins. Bovine rhodopsin.- Biomed. Sci, 1990, v. И , N.6, p.

.. Подписано к печати

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 Производственном комбинате Объек п.л. Литературного фонда СССР Зак. /о Тир. 100