Структурно-функциональное исследование субстратов экзоэнзима C3 зрительных систем позвочных и беспозвоночных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Петров, Василий Михайлович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1995 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Структурно-функциональное исследование субстратов экзоэнзима C3 зрительных систем позвочных и беспозвоночных»
 
Автореферат диссертации на тему "Структурно-функциональное исследование субстратов экзоэнзима C3 зрительных систем позвочных и беспозвоночных"

О^А

•■ " РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ 6ИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

УДК 577.1

ПЕТРОВ ВАСИЛИИ МИХАИЛОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СУбСТРАТОВ ЭКЗОЭНЗИМА С3 ЗРИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ПОЗВОНОЧНЫХ И 6ЕСП03В0Н0ЧНЫХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии иы. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Липкин В.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Филиппов П.П.

Ведущая организация:

кандидат химических наук Костина М.Б.

ВНИИ Биотехнологии Министерства медицинской и микробиологической промышленности.

Защита диссертации состоится 1995 г. в /¿Г час.

У

на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/ Ю.

С' диссертацией можно ознакомиться/в библиотеке Института биоорганической химии. •

Автореферат разослан "ЛЯ " гПгЛт'СбиЛ 1995 г.

~7 /

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Несмеянов В.А

Актуальность проблемы.

В процессе регуляции внутриклеточных функций и передаче трансмембранного сигнала важное место занимают GTP-связывающие белки. Эта обширная группа включает многие десятки белков, имеющих сходство как в структуре, так и в механизме действия. Хорошо исследованы так называемые G-белки - гетеротримерные GTp-азы, опосредующие передачу сигнала с рецептора на эффек-ториый белок.

Другой обширной группой GTp-связывающих белков в клетке являются ras-подобные белки. В семейство ras-подобных белков входят GTP-азы с молекулярной массой 20-30 кДа, обладающие различной степенью гомологии между собой и а-субъединицами G-белков . Подобно G-белкам некоторые из них служат субстратами для ADP-рибозилтрансфераз. В отличие от G-белков ras-подобные белки - мономеры, обладают значительно меньшей GTP-азной активностью и требуют дополнительного белка для ее усиления. Ras-подобные белки принимают участие в регулировке многих клеточных процессов, таких как дифференцировка, организация цитоскелета, передача трансмембранного сигнала, везикулярный транспорт и секреция.

Различные ras-подобные белки обнаружены во многих эукарио-ческих организмах и практически во всех тканях млекопитающих Точный механизм их действия еще только начинает проясняться, не известны и белки эффекторы. Однако уже ясно, что в процессе функционального цикла эти белки могут находится в gdp-связанном "неактивном" и gtp-связэнном "активном" состоянии. Показано , что цикличность этих gtp-эз между gtp-СВЯЗаННЫМ и gdp-связэнньш состояниями

регулируется тремя классами белков: активаторами gtp-эзы (gaps), ингибиторами диссоциации gdp (gdis) и активаторами

обмена gtp/gdp (gdss) . Последние два типа регуляторных белков способны также модулировать взаимодействие

низкомолекулярных gtp-эз с мембраной.

Для исследования g-белков и низкомолекулярных gtp-эз сегодня широко применяют различные бактериальные токсины, действующие на эукариотичсск.ую клетку через

adp-рибозилирование регуляторных белков. Линии сип Clostridium botulinum продуцируют adp-рибозилтрансферазу, названную экзоэнзпмом СЗ . Этот фермент в присутствии nad+ adp-рибозилирует по остатку Asn-4i некоторые ras-подобше белки, относяшеся к семейству rho, е частности rho a, rho в, rho с, raci и гас2 . Субстраты СЗ были обнаружены во всех исследованных клетках эукариот. В ряде работ указывается на важную роль белков этого семейства в процессах клеточной дифференцировки и построении цитоскелета .

Цель работы.

Данная работа является частью комплексного исследования белков зрительной системы, проводимого в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Работа посвящена поиску и характеристике низкомолекулярных gtp-связывэ-ющих белков- субстратов экзоэнзима СЗ в фоторецепторных клетках кальмара юидо pacificus и в НСП сетчатки быка.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В фоторецепторных мембранах быка и кальмара обнаружены низ-комолекулярше gtp-связывающие белки с молекулярными массами 20-30 кДа.

Исследован состав и клеточная локализация субстратов ботули-нической ADP-рибозилтрансферазы С3 (С3) в фоторецепторных клет-

ках кальмара и НСП сетчатки быка. Показано, что в мембранах кальмара Апр-рибозилируются полипептиды с молекулярными массами 22, 24, 30, 45 и 80 кДа, а в мембранах НСП - 22, 24 и 60 кДа. Цитоплазматическая фракция НСП содержит субстраты С3 с м.м. 22, 24, 28 и 36 кДа.

Произведено частичная хроматографическая очистка субстратов 22 и 24 кДа из фоторецепторных мембран быка и кальмара и показано влияние гуаниловых нуклеотвдов и ионов мд2+ на процесс их Аор-рибозилирования.

Разработана схема хроматографической очистки субстрата С3 36 кДа, при помощи которой этот белок был выделен в гомогенном состоянии.

Показано влияние света на процесс дор-рибозилирования субстратов С3 22 и 24 кДа быка и кальмара. Обнаружено взаимодействие этих бежев с фотоактивированным родопсином кальмара, что предполагает их участие в передаче зрительного сигнала.

Выделение и характеристике субстратов экзоэнзима С3 фоторе-цепторных клеток позволяют продолжить исследования по определенна их первичной структуры и выяснению роли этих белков в зрительном процессе.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи, материалы диссертации докладывались на 5 Международном симпозиуме по ретиналь-со-держащим белкам ( Париж ), на I и 2 конференциях по направлению "Белковая инженерия" ( Москва ).

Объем работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного гаБ-по-добным белкам, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

Содержание работа. Выделение фоторецепторных мембран из глаз быка и кальмара

Выделение фоторецепторных мембран НСП из глаза быка проводили по модифицированной методике Papermaster , заключающейся в : разрушении зрительных клеток при энергичном встряхивании в растворе сахарозы,- отделении НСП с помощью центрифугирования,-осмотческом шоке НСП в воде,- разделении цигоплазматической и мембранной фракций НСП центрифугированием.

Для выделения фоторецепторных мембран из глаз кальмара мы использовали модификацию метода Hubberd and St.George . ИСХОДНЫМ материалом служили предварительно замороженные глаза кальмара Longo pad ficus. Части глаз, содержащие сетчатку, отделялись и размораживались в нейтральном буфере с 4% Naci Рабдомальный слой-отделялся от других слоев сетчатки энергичным всряхиванием и центрифугированием. Раствор, содержащий наружные сегменты фоторецепторных клеток, пигментные гранулы и опорные клетки после дополнительного встряхивания гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. После этой процедуры наружный слой сетчатки окончательно диспергирует на рабдомы. В дальнейшем полученную суспензию гомогенизировали в буферном растворе с 40V (w/v) сахарозой и центрифугировали для окончательного удаления примесей из сетчатки. Для получения фоторецепторных мембран рабдомы разрушали осмотическим шоком, быстро сникая концентрацию сахарозы до 20% и осаждая мембраны центрифугированием.

Окончательная очистка рабдомальных мембран проводилась ультрацентрифугированием ресуспендированного осадка в градиенте сахарозы. При этом фоторецепторгые мембраны располагались в слое между 20% и 30% сахарозой. полученные мембраны отмывались

нейтральным буфером и хранились в 50% глицерине при -20° С в течение нескольких месяцев без заметной структурной деградации. Было замечено так же, что способность субстратов экзоэнзима сз к рибозилированию в течение этого времени практически не изменяется.

Поиск низкомолекулярных gtp-связывающих белков е фоторецепторных мембранах быка и кальмара.

В настоящее время не вызывает сомнения, что процесс фототранс-дукции у позвоночных и беспозвоночных начинается с активации gtp-связыващих бежоЕ фотоактивированными родопсинами. Каскад усиления зрительного сигнала : родопсин/трансдуцин/фосфодиэсте-раза в НСП позвоночных уже достаточно хорошо изучен. В ряде работ было показано, что в фоторецепторных клетках позвоночных g-белок опосредует влияние света на синтез четырех вторичных мессенджеров: cgmp, ip3, са2+и dag, каждый из которых взаимодействует со своим эффекторным белком.

В фоторецепторах беспозвоночных свет также вызывает увеличение катионной проницаемости мембран и их деполяризацию. Однако, в отличие от позвоночных, механизм усиления светового сигнала исследован в значительно меньшей степени. Многочисленные биохимические и электрофизиологические эксперименты на насекомых и головоногих показали участие gtp-связывающих белков в процессе фототрансдукции. Основным G-белком зрительной системы позвоночных является трансдуцин . Спектр зрительных gtp-эз беспозво-беспозвон<~^ных по-видимому шире. С использованием различных биог>яческих подходов Робинсон и др. показали наличие несколь-ч/.1 g-белков в фоторецепторах атлантического кальмара Longo peaiei. Авторы предполагают участие найденых g-белков в различ-

них светоактивируемых ферментативных каскадах с участием ip3 и

cGMP.

Кроме гетеротримерных gtp-эз ( g-белков ) в клетках эукариот присутствуют низкомолекулярные gtp-эзы ( smg ) с м.м. 20-30 кДа, которые принимают участие в ключевых процессах жизнедеятельности клетки, в т.ч. в передаче трансмембранного сигнала . На первом этапе работы мы провели идентификацию низкомолекулярных gtp-связывающих белков в фоторецепторных мембранах быка и кальмара. Использовалась способность smg связывать gtp даже после sds электрофореза и электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, впервые описанная Булларом и Хасламом . В отличие от smg а-субъединицы g-белков такой способностью не обладают из-за необратимого нарушения конформации в денатурирующем детергенте. Фоторецепторные мембраны быка и кальмара растворяли в буфере с 1% sds и разделяли в 12 % ПААГ. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану , которую затем тщательно отмывали от sds в буфере с 0,3 % Tween 20. При этом происходила ренатурация smg и восстановление их gtp-связывающих свойств. После инкубации в том же буфере с [32p]gtp (mci/mi) мембрану отмывали от радиоактивности, сушили и автографировали. Время инкубации с [32p]gtp и время отмывки от радиоактивной метки подбиралось нами экспериментально и составило 1,5 ч и 15 мин соответственно. Более длительная инкубация при неизменной эффективности специфического связывания gtp усиливает неспецифический фон. Увеличение же времени отмывки приводит к ослаблению сигнала , по-видимому из-за разрушения комплекса smg-gtp. Из рис. I видно, что в диапазоне молекулярных масс 20-26 кДа в фоторецепторных мембранах кальмара присутствуют, как минимум, два , а в мембранах быка - три белка, связывающие gtp в описанных условиях. Поэтому очевидно , что составы низ-

комолекулярных gtp-эз в фоторецепторах позвоночных и беспозвоночных различаются.

кДа

30 -20 -

Рисунок I. Белки фоторецепторных мембран быка и кальмара, связывающие gtp после sDs-электрофореза и переноса на нитроцеллю-лозную мембрану (авторадиограмма)Л-мембраны НСП сетчатки быка; 2-фоторецепторные мембраны кальмара.

Идентификация субстратов экзоэнзима СЗ в зрительных клетках

быка и кальмара.

Для исследования g-белков и некоторых ras-подобных белков в настоящее время широко применяются различные бактериальные adp-рибозилтрансферазы, которые модифицируют о-субъединицы всех типов бежа, gq, gs, трансдуцин, а так же некоторые ras-подобные белки. Линии сип Clostridium botulinum продуцируют эк30-энзим сз, который в присутствии nad+ ADp-рибозилирует по остатку Asn-4i низкомолекулярные gtp-эзы семейств rho и гас. Субстраты СЗ были обнаружены во всех исследованных клетках эукариот. В ряде работ указывается на важную роль этих бежов в процессах клеточной ди®реренцировки, построении цитоскелета и в передаче

трансмембранного сигнала.

Мы провели идентификацию субстратов СЗ в фоторецепторных отделах зрительных клеток быка и кальмара, для чего использовались цитоплрзматические и мембранные фракции НСП и рабдом. Из рис. 2 видно, что при инкубации мембранных фракций НСП с [32p]nad+ и экзоэнзимом СЗ происходит включение радиоактивной метки в полипептиды с молекулярными мэссамй 22, 24 кДа, которые связывали gtp при перенесении на нитроцеллюлозную мембрану ( рис. I). Субстраты СЗ с похожими мол. массами были ранее описаны в других типах клеток млекопитающих и была показана их принадлежность к семействам rho и гас. Это позволило нам предположить, что субстраты СЗ 22 и 24 кДа в мембранах НСП являются rho ( 22 кДа ) и гас ( 24 кДа ) белками. При увеличении времени экспозиции ра-радиоавтографа мы обнаружили включение радиоактивной метки еще в один белок мембран НСП ( мол. масса 60 - 5 кДа ). Такая величина не характерна для низкомолекулярных gtp-аз , и исследование этого бежа в настоящее время проводится в нашей лаборатории.

кДа -.v . .. ,

94 - '1

67 - }

43- f j

5

< * |

30 - „„ -й л

* 1 "i.1 > ¿j л

20 - - ZtZ--->

1 2 3 4 ь

32

Рисунок 2. [ р]adp-рибозилирование экзоэнзимом (^белков фоторецепторных клеток быка и кальмара. Приведена авторадиограмма: ци-топлазматической (I) и мембранной (2) фракций рабдом кальмара; мембранной (3) и цитоплазматической (4) фракций НСП быка; мембран клеток hl-60 (5).

S f- 1:*

J 1* iL

1 2 3 4 b

В цитоплазматической фракции НСП кроме субстратов 22 и 24 кДа [32р]ыэр-рибозилировались полипептиды с мол.массами 28 и 36 кДа. Белок 36 кДа в дальнейшем был дополнительно очищен и получен в гомогенном состоянии ( см. далее ). Величина субстрата 28 кДа позволяет отнести его к нкзкомолекулярным втр-азам. Его молекулярная масса отличается как от гас, так и от гьо белков, что отчетливо видно при сравнении этого белка с субстратами СЗ из промиелоцитарных клеток лейкемии линии нь-бо (рис. 2 ). Неизвестно, что мембраны этих клеток содержат белей семейства гас, участвующие в процессе дифференцировки. Не исключено, что полипептид 28 кДа является не описанной еще низкомолекулярной стр-азой,характерной для зрительных клеток млекопитающих.

Картина [32р]лор-рибозилирования белков фоторецепторных сегментов кальмара отличается от таковой у быка, хотя здесь так же основными субстратами являются белки с мол.массами 22 и 24 кДа (в них включается более 60% радиоактивной метки). Однако в мембранах кальмара дополнительно [32р]Аг>р-рибозилируются полипептиды с мол. массами 30, 45 и 80 кДа ( рис.2 ). Возможно, что белок 30 кДа ( в него включается около 30% радиоактивной метки ) является новым регуляторным элементом ( низкомолекулярной стт-азой или а-субъединицей с-белка ) в передаче трансмембранного сигнала зрительных клеток беспозвоночных. Полипептид 45 кДа имеет молекулярную массу, сходную с родопсином, и появление полосы на радиоавтографе могло быть результатом неспецифического связывания [32р]ыае> или [32р]атр с родопсином, преобладающим в фоторецепторных мембранах ( около 80% всех мембранных белков ). Однако контрольная инкубация мембран в среде с 132Р1гоо)+ , но без СЗ,показала отсутствие каких либо меченых белков. Кроме того, полипептид 45 КДа связывался с веае-Тоуореаг1 из темнового солю-билизата мембран в 1% растворе а-додецил-п-мальтозида. Родопсин

в этих условиях с ионообменным сорбентом не взаимодействовал. Более того, очищенный родопсин не [32р]АОР-рибозилировался в присутствии СЗ. Эти данные позволили нам предположить, что в фо-торецепторных мембранах кальмара содержится белковый субстрат экзоэнзима СЗ, имеющий молекулярную массу сходную с родопсином, но отличающийся от него физико-химическими свойствами. Необходимо отметить, что электрофоратическая подвижность субстрата 45 кДа сходна с подвижностью «сз (45 кДа) и о^ (41 кДа), которые дор-рибозилируются соответственно холерным и коклюшным токсинами, но не СЗ. Возможно в фоторецепторных мембранах кальмара присутствуют несколько с-бежов, один из которых имеет а-субъедини-цу с м.м. 45 кДа. Это отчасти подтверждают биохимические и имму-нохимические исследования, которые показали, что в зрительных клетках беспозвоночных содержится несколько а-субъединиц о-бел-ков с различными молекулярными массами .

Выделение субстратов С3 из фоторецепторных мембран быка и кальмара.

С целью дальнейшей хроматографической очистки мы попытались избирательно экстрагировать субстраты СЗ из фоторецепторных мембран кальмара и быка. Подобно гетеротримерным в-бежам низкомолекулярные втр-азы подвергаются посттрансляционной модификации остатками некоторых жирных кислот, что способствует взаимодействию этих бежов с мембраной. Например представители семейств гьо и гас модифицированы остатками фарнезиловой ( гьов, г1юс, гас1 и гас2 ) или геранилгераниловой ( г1юа ) кислот по С-концевому суз ( рисунок 3 ).

гко В, тко С, гас 1, гас 2

Н ¿1-ШШШ2

" "Х/сн

Ъ-осн II 3 о

г

гкоА

Рисунок 3. Посттрансляционная модификация гЬо и гас белков.

Известно, что трансдуцин, будучи периферическим мембранным белком, переходит в водную фазу с белками цитоскелета при обработке темновых мембран НСП гипотоническим буфером . В освещенных мембранах образуется комплекс ат с фотоактивированным ро-родопсином, который разрушается в присутствии втр. Основной в-белок зрительных клеток беспозвоночных ( сд ) прочнее ассоциирован с мембраной, но и он может быть экстрагирован из мембраны 2М мочевиной . Однако наши попытки экстрагировать субстраты СЗ из 100 дм стр, 400 шм кс1 или 2м мочевиной успехом не увенчались. Лишь незначительное количество этих белков регистрировалось в растворе, что можно отнести на счет ошибки измкрений. Полученные данные показывают, что субстраты СЗ фоторецептор-ных клеток позвоночных и беспозвоночных прочнее связаны с мембраной, чем в-белки и для их выделения необходимо использование детергентов.

Для солюбилизации субстратов СЗ наш отбирались детергенты, в

которых экзоэнзим СЗ сохранял Алр-рибозилтрансферазную активность. Как видно из рисунка 4, подходящими свойствами обладают

с

рибозилирования субстратов 22-24 кДа из мембран НСП быка. ( Использовались 1% растворы детергентов .

Рисунок 4.

Влияние различных детергентов на степень adp-

CHA.PS CfiNe DM OG NP-дэ ROS

detergents

несколько детергентов. Среди них особенно выделяется 3-[(3-хола-мидопропил)диметиламмонио]-i-пропансульфонат ( chaps ). Было показано, что степень adp-рибозилирования субстратов 22-24 кДа эк-зоэнзимом СЗ в 2.5 раза выше в i% chaps,чем в фоторецептсрных мембранах позвоночных и беспозвоночных.Это позволяет эффективнее регистрировать субстраты СЗ в процессе хроматографической очистки.

На первом этапе выделения фоторецепторные мембраны быка или кальмара солюбилизировались в темноте в буфере с i% chaps и с so тм Naci при соотношении белок / детергент i:io (w/w). При этом более 90% мембранных белков переходило в раствор. Солю-билизат В темноте наносили на колонку DEAE-Toyopearl. Элго-ция субстратов СЗ 22-24 кДа фоторецепторов быка и субстратов 22-24, и 30 кДа фоторецепторов кальмара начиналась в 100-120 шм Naci. Субстраты СЗ 45 кДа и 80 кДа не были обнаружены ни в одной фракции. Можно лишь предположить, что низкое содержание этих белков в мембране стало причиной их потери в процессе выделения.

Однако в отдельном эксперименте нами было показано, что субстрат 45 КДа СВЯЗЫВаЛСЯ В ТеМНОТе С DEAE-Toyopearl И ЭЛЮИРОВЭЛСЯ 125 шМ NaCl .

Фракции, содержащие субстраты СЗ концентрировались и наносились на колонку Mono q. Элюцшо белкоз проводили градиентом Nací 100-500 тм . [32р] adp-рибозилирование и электрофоретический анализ полученных фракций показали, что з пике в-5 выходят субстраты 22-24 кДа из мембран быка, а в пике s-4 - субстраты 22-24 и 30 кДа из мембран кальмара ( рисунок 5 В обоих случаях препараты имели примерно 20% чистоту. Таким образом были частично очищены три субстрата зкзоэнзима СЗ из фоторецепторных мембран быка и кальмара.

DEAE-Toyopearl

Mono Q

I 2

Рисунок 5. Хроматографическая очистка субстратов СЗ из фоторецепторных мембран быка (I) и кальмара (2).

Для определения к-концевой аминокислотной последовательности полученные субстраты СЗ разделялись электрофоретически, переносились на поливпнилдифторидную мембрану ( "immobiion" ) и анали-зироЕались в газофазовом секвенаторе. Анализ показал, что н-кон-цевые аминокислоты всех трех белков блокированы. Эти результаты согласуются с данными, что N-концевые аминокислоты всех известных g-белков и низкомолекулярных gtp-эз так же модифицированы.

Выделение субстрата СЗ 36 кДэ из цитозоля НСП быка

Для выделения субсграта СЗ 36 кДа ( Р-36 ) цитоплазматическое содержимое НСП после осмотического шока наносили на колошсу с

Sepharose-Blue. ЭТОТ сорбент бЫЛ ВЫбраН НЭМИ, Т.К. ОН ШИРОКО

используется для разделения нуклеотпдсЕязываюцих белков. Р-36 элюировали 500 пи Nací и после пятикратного разбавления полученной фракции наносили на колонку с DEAE-Toyopeari. Субстрат СЗ при этом оказывался в проскоке, тогда как большая часть других белков сорбировалась. На следующем этапе проскок наносился на колонку с Mono s и проводилась эшоиия белков градиентом Nací 100-1000 гпм. На этой стадии Р-36 был очищен практически до гомогенного состояния ( рисунок 6 ).

Белок Р-36 по электрофоретической подвижности отличается от других описанных субстратов экзоэнзима СЗ семейства ras-подобных белков и сходен с а-субъединицей трансдуцина. Однако, в отличие от последней, Р-36 не рибозилировался коклюшным или холерным токсинами. Кроме того, он не взаимодействовал на иммуноблоте с антителами, полученными на ат и /зт. Также, как и у а-субъедшпщы трансдуцина, N-конец у Р-36 блокирован, однако по данным аминокислотного анализа аминокислотные составы этих белков существен-

Цитоплазматическая фракция НСП быка Sepharose-Blue

Элюция 0.5 М NaCl DEAE-Toyopsar1 (ПрОСКОК)

I

Mono S

AUFS

0.4 0.3 0.2

0.1 .

о

KaCl(Mol)

. T

Lo.u i

10.3

г |0.2 I! o.i

0

Рисунок 6. Схема хроматографической очистки Р-36. На электро-фореграше приведены: элюат С Sepharose-Blue (1); проскок с DEAE-Toyopearl (2); ПИК 3 С Mono S (3).

£

но различаются ( таблица I ).

Известно, что низкомолекулярные стр-азы, в т.ч. субстраты СЗ присутствуют в клетке и в водорастворимом и в мембраносвязанном состоянии, причем их клеточная локализация динамична и регулируется специальными белками . Р-36 был обнаружен нами только в ци-топлазматической фракции НСП быка и отсутствовал в мембранах НСП и рабдомах кальмара. В настоящее время в группе регуляторных белков инозитидного цикла ИБХ совместно с нашей лабораторией ведется работа по структурно-функциональной характеристике белка Р-36. Полученные данные помогут ответить на Еопрос: является ли обнаруженный субстрат СЗ новым членом семейства стр-связывающих белков и какова его роль в восприятии зрительного сигнала у позвоночных.

Таблица I. Сравнение аминокислотных составов Р-36 и «Т.

P-36 aT P-36 aT

Asp 37 25 Ser 17 23

Asn - 15 Val 35 17

Thr 19 20 Met 9 11

Trp - 2 lie 18 25

Cys - 8 Leu 18 30

Glu 15 25 Tyr 9 10

Gln - 15 Phe 12 15

Pro 12 7 His 7 8

Gly 30 23 Lys 23 24

Ala 31 22 Arg 9 17

Влияние гуаниловых нуклеотидов и ионов мд2+ на adp-рибозилирование мембранных субстратов СЗ.

К сожалению низкое содержание субстратов СЗ в фоторецепторных мембранах быка и кальмара не позволило нам выделить эти белки в количествах, достаточных для их структурной характеристики методами белковой химии. По оценкам разных авторов даже в наиболее богатых этими белками клетках мозга их содержание не более о.оо5% - o.oi% от общего количества мембранных белков. Основываясь на литературных данных мы предположили, что субстраты 22-24 кДа являются ras-подобными белками семейств rho и гас. Для под-тверздения этого предположения было решено проверить у выделенных субстратов СЗ свойства, характерные для всех описанных белков этих семейств из других тканей:

- способность связывать gtp на мембране после sds-электрофореза;

- зависимость степени adp-рибозилирования от присутствия гуани-

ловых нуклеотидов И ИОНОВ Ма2+.

При помощи описанного выше метода нами было показано, что белки 22-24 кДа из фракций в-5 и в-4 сохраняли способность сеязывэть

[32р]стр после перенесения на нитроцеллюлозную мембрану. Однако субстрат 30 кДа из фоторецепторных мембран кальмара такой способностью не обладал.

Влияние гуаниловых нуклеотидов на процесс дор-рибозилирова-ния было показано для всех атр-связывающих субстратов бактериальных токсинов. Конформационные изменения, происходящие в белке при связывании втр или сор по-видимому изменяют доступность комплекса "рибозилтрансфераза^АЛ+" к аминокислотному остатку, который подвергается модификации. Так, например, взаимодействие трансдуцина с фотоактивированным родопсином приводит к диссоциации комплекса ат-сор. При этом степень рибозилирования трансдуцина коклюшным токсином резко снижается, т.к. предпочтительным субстратом для рибозилтрансферазы является трансдуцин в сбр-связанной форме. Ингибировадие является обратимым и может быть снято при добавлении в реакцию вор, в то время как стр или его негидролизуемые аналоги усиливают эффект .

Рисунок 7.

Влияние гуаниловых нуклеотидов на уровень АБР-ри-бозилирования субстратов СЗ 22-24 кДа фоторецепторных мембран быка и кальмара .

ЕЗ гг-гяко* ьоу. СИ 77 24-:;» ад. ' ' эоноа яа

В наших экспериментах было показано, что ыэр-рибозилирование субстратов СЗ 22-24 кДа из мембран НСП быка и субстратов 22-24, 30 кДа из фоторецепторных мембран кальмара изменяется в присутствии сбр, втр и стртз. Добавление в реакционную среду атр не влияло на уровень рибозилирования этих бежов (рисунок 7 ). Как было показано в ряде работ, подобным образом гуаниловые нук-леотида влияли на мэр-рибозилирование гьо белка из мозга быка.

Однако подобное влияние нуклеотидов проявлялось в отсутствие или при низких концентрациях ( <ю им ) ионов мд2+. При большем содержании эти ионы сами активировали процесс дор-рибозпли-рования, нивелируя действие гуаниловых нуклеотидов. Активация рибозилирования субстратов 22-24 и 30 кДа достигала максимума при концентрациях мд2+ юо дм-боо дм . При увеличении концентрации ионы магния начинали сникать уровень гше-рибозилирования до 20% от исходного. Влияние ионов магния на уровень рибозилирования экзоэнзимом СЗ было описано и для йо и гас бежов, выделен-выделенных из других тканей млекопитающих. Такой эффект предполагает наличие у бежов этих семейств центра связывания мд2+, функциональная роль которого пока не ясна.

Таким образом полученные данные показали, что субстраты СЗ 22-24 и 30 кДа из фоторецепторных мембран позвоночных и беспозвоночных по своим свойствам близки к бежам семейств гьо и гас.

Влияние света на дор-рибозилирование субстратов СЗ

При изучении механизма усиления зрительного сигнала у позвоночных было показано, что рибозилирование аТ коклюшным токсином ингибируется при освещении НСП. При инкубации в ярком свете уровень включения [32р] мр-рибозы в ат снижался на 90% . Мы проверили, существует ли подобный эффект светозависимого м>р-ри-бозилирования фоторецепторных мембран быка и кальмара экзоэнзи-

мом СЗ. Подобно влиянию на рибозилирование трансдуцина, в наших экспериментах свет снижал степень рибозшшрования белков 22-24 кДа в мембранах НСП быка. При интенсивном освещении мембран в присутствии СЗ и [32р]ыао+ уровень включения радиоактивной метки в эти белки снижался на 60-70 % ( рисунок 8 ). При этом степень дор-рибозилирования субстрата СЗ 60 кДа в темновых и освещенных мембранах оставалась одинаковой. Нужно отметить, что эффект влияния света на степень рибозилирования субстратов СЗ в НСП исчезал при увеличении концентрации ионов мд2+ в инкубационной среде до юо-боо цм .

Известно, что снижение уровня Аор-рибозилирования трансдуцина является следствием взаимодействии ат в сир-связанной форме с освещенным родопсином, после чего на а-субъединице происходит обмен сбр на стр. Трансдуцин в промежуточном состоянии, свободном от нуклеотида и в стр-связанной форме является плохим субстратом для коклюшного токсина. Полученные данные по влиянию света на уровень рибозилирования субстратов СЗ в НСП позвоночных позволяют предположить, что также происходит прямое или опосредованное взаимодействие этих белков с фотоактивированным родопсином.

В наших экспериментах действие света на Алр-рибозшшрование фоторецепторных мембран кальмара экзоэнзимом СЗ оказалось прямо противоположным влиянию на НСП быка. Как показано на рисунке 8 , при интенсивном освещении мембран кальмара в присутствии экзо-энзима СЗ и [32р]включение радиоактивной метки в белки 22-24 к 30 кДа увеличивалось примерно на 30% . Изменения уровня аб?-рибозилирования субстратов 45 и 80 кДа нам зарегистрировать не удалось. Таким образом у кальмара, в отличие от быка, свет гктнЕирозал процесс дор-рибозилирования фоторецепторных мембран.

Светозависимость рибозилирования низкомолекулрных стр-связывающих белков , подобно гетеротримерным в-белкам, дает основание предположить их участие в передаче зрительного сигнала. Однако,

срт (тоизапаз) _

Рисунок 8. Влияние света на уровень мэр-рибозилирования субстратов СЗ в фоторецеп-торных мембранах быка (I) и кальмара (2).

аагк пдт

122-24 кРа ьс™ СШ22-24 кОа ач СИ 30 кОа а

30 20

■ " 'Я

1 й

1 - - 1

ь о а ь

И-сЗагк L-light

по-видимому, у позвоночных и беспозвоночных белковые субстраты СЗ участвуют в различных светоиндуцируемых ферментативных каскадах. По современным представлениям зрительные системы позвоночных и беспозвоночных различаются на всех уровнях передачи светового сигнала: регуляторные белки в этих организмах принадлежат к разным типам с-белков; поглощение света фоторецепторами приводит к активации различных эффекторов: фосфодиэстеразы циклического эир у позвоночных и фосфолипазы С у беспозвоночных; различия существуют и на уровне вторичных мессенджеров и их мишеней. Таким образом различия в микроокружении субстратов СЗ в фоторецепторных мембранах позвоночных и беспозвоночных могут быть причиной различного действия света на их АБР-рибозилирование.

Взаимодействие субстратов СЗ с фотоактивированным родопсином

Для проверки нашего предположения о взаимодействии низкомолекулярных gtp-эз с фотоактдвирозанным родопсином было решено провести хроматографическуга очистку комплекса "родопсин-субстрат СЗ" С использованием Con A-Sepharose. Известно, что лектин Con А связывается с родопсином, который является гликоцротеином и не взаимодействует с ras-подобными белками. С этой целью солюбили-заты темновых и освещенных фоторецепторных мембран кальмара наносились на колонку с con A-sepharose и проводилась элюция связавшихся белков a-d-метилманнозидом. [32р]лор-рибозилирозание и электрофорез полученных фракций показал, что из темнового солюбилизата с сорбентом связывался и элюировался з основном родопсин, тогда как субстраты СЗ оказывались в проскоке (рис.9 ). После освещения солюбилизата вместе с родопсином с con A-sepha-rose взаимодействовали белки 22-24 кДа, которые уже не регистрировались в проскоке.

Рисунок 9. Светозависимое взаимодействие субстратов СЗ из фоторецепторных мембран кальмара с con л-sepharose. Солюбилизат мембран (I); белки не сорбирующиеся (2) и сорбирующиеся (3) на con A-sepharose из освещенного солюбилизата; белки не сорбирующиеся (4) и сорб1грущиеся (5) на con A-sepharose из темнового солюбилизата. ( Приведена авторадиограмма.)

Аналогичные результаты были получены нами при сорбции солюби-лизированных мембран кальмара на иммуносорбент с антителами к родопсину кальмара . Поликлональные антитела иммобилизовались на protein A-sepharose и полученный сорбент добавлялся к темновому и освещенному солюбилизатам после их [32р]дор-рибозилирования. Белки, связаЕсиеся с иммуносорбентом элюировали буфером с sds и анализировали электрофоретически. Из рисунка 10 видно, что из освещенного солюбклиззта преципитируется значительно больше субстратов СЗ 22-24 кДа, чем из темпового.

Рисунок 10. Взаимодействие субстратов СЗ из фоторецепторных мембран кальмара с антителами к родопсину кальмара в темнота (I) и на свету (2)

Таким образом, полученные результаты подтверждают наше предположение, что при освещении фоторецепторных мембран образуется комплекс родопсина с субстратами СЗ 22-24 кДа . Однако пока не ясно, связываются ли субстраты СЗ непосредственно с фотоактивированным родопсином, или взаимодействие происходит с участием какого-то другого белка.

Выводы

1. В фоторецепторных мембранах быка и кальмара обнаружены низкомолекулярные GTP-связывающие белки с молекулярными массами 2030 КДа. Показано, ЧТО ЭКЗОЭНЗИМОМ Сд ИЗ Clostridium botulinum В в мембранах кальмара дор-рибозилируются полипептиды с молекулярными массами 22, 24, 30, 45 и 80 кДа, а в мембранах НСП - 22, 24 и 60 кДа. Цитоплазматическая фракция НСП содержит субстраты С3 с M.M. 22, 24, 28 И 36 КДа.

2. Произведена частичная хроматографическая очистка субстратов 22 и 24 кДа из фоторецепторных мембран быка и кальмара и изучено влияние гуаниловых нуклеотидов и ионов мд2+ на процесс их ADP-рибозилирования. Установлено, что субстраты Сд с м.м 22 и 24 кДа по своим свойствам близки к белкам семейств rho и гас.

3. Разработана схема хроматографической очистки субстрата С3 33 кДа из цитоплазматической фракции НСП. Белок выделен в гомогенном состоянии и показано его отличие от а-субъеднницы транс-дуцина.

4. Показано, что процесс ADP-рибозилирования субстратов С3 22 и 24 кДа быка и кальмара является светозависимым. Обнаружено взаимодействие этих белков с фотоактивированным родопсином быка и кальмара, что предполагает их участие в передаче зрительного сигнала.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

I. Артамонов И.Д., Петров В.М., Липкин В.М. Исследование белков системы фототрансдукции из сетчатки кальмара. - I Всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Белковая инженерия", Москва 1993, стр. 7.

2. Петров В.М., Артамонов И.Д., Баскаков И.В., Соловьева О.В., Липкин В.М. Ras-годобные белки зрительной системы беспозвоночных и позвоночных. Взаимодействие субстратов э^сзоэнзима СЗ с фотоактивированным родопсином кальмара.- Биоорганическая химия, 1994, том 20, N 5, стр. 498-505.

3. ArtamotovI.D., Petrov V.M., Baskakov I.v. The substrates of exoenzyme C3 in photoreceptor membranes of squid. How many targets ? - 5th International symposium on retinal-binding proteins, Paris, France. Abstracts, 1992, p. 15.

4. Petrov V.M., Artamonov- I.D., Lipkin V.M. Small GTP-bin-ding proteins of squid photoreceptor. Interaction with photoac-tivated rhodopsin.- FEBS Letters, 1994, v.337, p. 274-276.