Структурно-функциональное исследование субстратов экзоэнзима C3 зрительных систем позвочных и беспозвоночных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

О^А

•■ " РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ 6ИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

УДК 577.1

ПЕТРОВ ВАСИЛИИ МИХАИЛОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СУбСТРАТОВ ЭКЗОЭНЗИМА С3 ЗРИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ПОЗВОНОЧНЫХ И 6ЕСП03В0Н0ЧНЫХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии иы. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Липкин В.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Филиппов П.П.

Ведущая организация:

кандидат химических наук Костина М.Б.

ВНИИ Биотехнологии Министерства медицинской и микробиологической промышленности.

Защита диссертации состоится 1995 г. в /¿Г час.

У

на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/ Ю.

С' диссертацией можно ознакомиться/в библиотеке Института биоорганической химии. •

Автореферат разослан "ЛЯ " гПгЛт'СбиЛ 1995 г.

~7 /

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Несмеянов В.А

Актуальность проблемы.

В процессе регуляции внутриклеточных функций и передаче трансмембранного сигнала важное место занимают GTP-связывающие белки. Эта обширная группа включает многие десятки белков, имеющих сходство как в структуре, так и в механизме действия. Хорошо исследованы так называемые G-белки - гетеротримерные GTp-азы, опосредующие передачу сигнала с рецептора на эффек-ториый белок.

Другой обширной группой GTp-связывающих белков в клетке являются ras-подобные белки. В семейство ras-подобных белков входят GTP-азы с молекулярной массой 20-30 кДа, обладающие различной степенью гомологии между собой и а-субъединицами G-белков . Подобно G-белкам некоторые из них служат субстратами для ADP-рибозилтрансфераз. В отличие от G-белков ras-подобные белки - мономеры, обладают значительно меньшей GTP-азной активностью и требуют дополнительного белка для ее усиления. Ras-подобные белки принимают участие в регулировке многих клеточных процессов, таких как дифференцировка, организация цитоскелета, передача трансмембранного сигнала, везикулярный транспорт и секреция.

Различные ras-подобные белки обнаружены во многих эукарио-ческих организмах и практически во всех тканях млекопитающих Точный механизм их действия еще только начинает проясняться, не известны и белки эффекторы. Однако уже ясно, что в процессе функционального цикла эти белки могут находится в gdp-связанном "неактивном" и gtp-связэнном "активном" состоянии. Показано , что цикличность этих gtp-эз между gtp-СВЯЗаННЫМ и gdp-связэнньш состояниями

регулируется тремя классами белков: активаторами gtp-эзы (gaps), ингибиторами диссоциации gdp (gdis) и активаторами

обмена gtp/gdp (gdss) . Последние два типа регуляторных белков способны также модулировать взаимодействие

низкомолекулярных gtp-эз с мембраной.

Для исследования g-белков и низкомолекулярных gtp-эз сегодня широко применяют различные бактериальные токсины, действующие на эукариотичсск.ую клетку через

adp-рибозилирование регуляторных белков. Линии сип Clostridium botulinum продуцируют adp-рибозилтрансферазу, названную экзоэнзпмом СЗ . Этот фермент в присутствии nad+ adp-рибозилирует по остатку Asn-4i некоторые ras-подобше белки, относяшеся к семейству rho, е частности rho a, rho в, rho с, raci и гас2 . Субстраты СЗ были обнаружены во всех исследованных клетках эукариот. В ряде работ указывается на важную роль белков этого семейства в процессах клеточной дифференцировки и построении цитоскелета .

Цель работы.

Данная работа является частью комплексного исследования белков зрительной системы, проводимого в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Работа посвящена поиску и характеристике низкомолекулярных gtp-связывэ-ющих белков- субстратов экзоэнзима СЗ в фоторецепторных клетках кальмара юидо pacificus и в НСП сетчатки быка.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В фоторецепторных мембранах быка и кальмара обнаружены низ-комолекулярше gtp-связывающие белки с молекулярными массами 20-30 кДа.

Исследован состав и клеточная локализация субстратов ботули-нической ADP-рибозилтрансферазы С3 (С3) в фоторецепторных клет-

ках кальмара и НСП сетчатки быка. Показано, что в мембранах кальмара Апр-рибозилируются полипептиды с молекулярными массами 22, 24, 30, 45 и 80 кДа, а в мембранах НСП - 22, 24 и 60 кДа. Цитоплазматическая фракция НСП содержит субстраты С3 с м.м. 22, 24, 28 и 36 кДа.

Произведено частичная хроматографическая очистка субстратов 22 и 24 кДа из фоторецепторных мембран быка и кальмара и показано влияние гуаниловых нуклеотвдов и ионов мд2+ на процесс их Аор-рибозилирования.

Разработана схема хроматографической очистки субстрата С3 36 кДа, при помощи которой этот белок был выделен в гомогенном состоянии.

Показано влияние света на процесс дор-рибозилирования субстратов С3 22 и 24 кДа быка и кальмара. Обнаружено взаимодействие этих бежев с фотоактивированным родопсином кальмара, что предполагает их участие в передаче зрительного сигнала.

Выделение и характеристике субстратов экзоэнзима С3 фоторе-цепторных клеток позволяют продолжить исследования по определенна их первичной структуры и выяснению роли этих белков в зрительном процессе.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи, материалы диссертации докладывались на 5 Международном симпозиуме по ретиналь-со-держащим белкам ( Париж ), на I и 2 конференциях по направлению "Белковая инженерия" ( Москва ).

Объем работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного гаБ-по-добным белкам, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

Содержание работа. Выделение фоторецепторных мембран из глаз быка и кальмара

Выделение фоторецепторных мембран НСП из глаза быка проводили по модифицированной методике Papermaster , заключающейся в : разрушении зрительных клеток при энергичном встряхивании в растворе сахарозы,- отделении НСП с помощью центрифугирования,-осмотческом шоке НСП в воде,- разделении цигоплазматической и мембранной фракций НСП центрифугированием.

Для выделения фоторецепторных мембран из глаз кальмара мы использовали модификацию метода Hubberd and St.George . ИСХОДНЫМ материалом служили предварительно замороженные глаза кальмара Longo pad ficus. Части глаз, содержащие сетчатку, отделялись и размораживались в нейтральном буфере с 4% Naci Рабдомальный слой-отделялся от других слоев сетчатки энергичным всряхиванием и центрифугированием. Раствор, содержащий наружные сегменты фоторецепторных клеток, пигментные гранулы и опорные клетки после дополнительного встряхивания гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. После этой процедуры наружный слой сетчатки окончательно диспергирует на рабдомы. В дальнейшем полученную суспензию гомогенизировали в буферном растворе с 40V (w/v) сахарозой и центрифугировали для окончательного удаления примесей из сетчатки. Для получения фоторецепторных мембран рабдомы разрушали осмотическим шоком, быстро сникая концентрацию сахарозы до 20% и осаждая мембраны центрифугированием.

Окончательная очистка рабдомальных мембран проводилась ультрацентрифугированием ресуспендированного осадка в градиенте сахарозы. При этом фоторецепторгые мембраны располагались в слое между 20% и 30% сахарозой. полученные мембраны отмывались

нейтральным буфером и хранились в 50% глицерине при -20° С в течение нескольких месяцев без заметной структурной деградации. Было замечено так же, что способность субстратов экзоэнзима сз к рибозилированию в течение этого времени практически не изменяется.

Поиск низкомолекулярных gtp-связывающих белков е фоторецепторных мембранах быка и кальмара.

В настоящее время не вызывает сомнения, что процесс фототранс-дукции у позвоночных и беспозвоночных начинается с активации gtp-связыващих бежоЕ фотоактивированными родопсинами. Каскад усиления зрительного сигнала : родопсин/трансдуцин/фосфодиэсте-раза в НСП позвоночных уже достаточно хорошо изучен. В ряде работ было показано, что в фоторецепторных клетках позвоночных g-белок опосредует влияние света на синтез четырех вторичных мессенджеров: cgmp, ip3, са2+и dag, каждый из которых взаимодействует со своим эффекторным белком.

В фоторецепторах беспозвоночных свет также вызывает увеличение катионной проницаемости мембран и их деполяризацию. Однако, в отличие от позвоночных, механизм усиления светового сигнала исследован в значительно меньшей степени. Многочисленные биохимические и электрофизиологические эксперименты на насекомых и головоногих показали участие gtp-связывающих белков в процессе фототрансдукции. Основным G-белком зрительной системы позвоночных является трансдуцин . Спектр зрительных gtp-эз беспозво-беспозвон<~^ных по-видимому шире. С использованием различных биог>яческих подходов Робинсон и др. показали наличие несколь-ч/.1 g-белков в фоторецепторах атлантического кальмара Longo peaiei. Авторы предполагают участие найденых g-белков в различ-

них светоактивируемых ферментативных каскадах с участием ip3 и

cGMP.

Кроме гетеротримерных gtp-эз ( g-белков ) в клетках эукариот присутствуют низкомолекулярные gtp-эзы ( smg ) с м.м. 20-30 кДа, которые принимают участие в ключевых процессах жизнедеятельности клетки, в т.ч. в передаче трансмембранного сигнала . На первом этапе работы мы провели идентификацию низкомолекулярных gtp-связывающих белков в фоторецепторных мембранах быка и кальмара. Использовалась способность smg связывать gtp даже после sds электрофореза и электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, впервые описанная Булларом и Хасламом . В отличие от smg а-субъединицы g-белков такой способностью не обладают из-за необратимого нарушения конформации в денатурирующем детергенте. Фоторецепторные мембраны быка и кальмара растворяли в буфере с 1% sds и разделяли в 12 % ПААГ. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану , которую затем тщательно отмывали от sds в буфере с 0,3 % Tween 20. При этом происходила ренатурация smg и восстановление их gtp-связывающих свойств. После инкубации в том же буфере с [32p]gtp (mci/mi) мембрану отмывали от радиоактивности, сушили и автографировали. Время инкубации с [32p]gtp и время отмывки от радиоактивной метки подбиралось нами экспериментально и составило 1,5 ч и 15 мин соответственно. Более длительная инкубация при неизменной эффективности специфического связывания gtp усиливает неспецифический фон. Увеличение же времени отмывки приводит к ослаблению сигнала , по-видимому из-за разрушения комплекса smg-gtp. Из рис. I видно, что в диапазоне молекулярных масс 20-26 кДа в фоторецепторных мембранах кальмара присутствуют, как минимум, два , а в мембранах быка - три белка, связывающие gtp в описанных условиях. Поэтому очевидно , что составы низ-

комолекулярных gtp-эз в фоторецепторах позвоночных и беспозвоночных различаются.

кДа

30 -20 -

Рисунок I. Белки фоторецепторных мембран быка и кальмара, связывающие gtp после sDs-электрофореза и переноса на нитроцеллю-лозную мембрану (авторадиограмма)Л-мембраны НСП сетчатки быка; 2-фоторецепторные мембраны кальмара.

Идентификация субстратов экзоэнзима СЗ в зрительных клетках

быка и кальмара.

Для исследования g-белков и некоторых ras-подобных белков в настоящее время широко применяются различные бактериальные adp-рибозилтрансферазы, которые модифицируют о-субъединицы всех типов бежа, gq, gs, трансдуцин, а так же некоторые ras-подобные белки. Линии сип Clostridium botulinum продуцируют эк30-энзим сз, который в присутствии nad+ ADp-рибозилирует по остатку Asn-4i низкомолекулярные gtp-эзы семейств rho и гас. Субстраты СЗ были обнаружены во всех исследованных клетках эукариот. В ряде работ указывается на важную роль этих бежов в процессах клеточной ди®реренцировки, построении цитоскелета и в передаче

трансмембранного сигнала.

Мы провели идентификацию субстратов СЗ в фоторецепторных отделах зрительных клеток быка и кальмара, для чего использовались цитоплрзматические и мембранные фракции НСП и рабдом. Из рис. 2 видно, что при инкубации мембранных фракций НСП с [32p]nad+ и экзоэнзимом СЗ происходит включение радиоактивной метки в полипептиды с молекулярными мэссамй 22, 24 кДа, которые связывали gtp при перенесении на нитроцеллюлозную мембрану ( рис. I). Субстраты СЗ с похожими мол. массами были ранее описаны в других типах клеток млекопитающих и была показана их принадлежность к семействам rho и гас. Это позволило нам предположить, что субстраты СЗ 22 и 24 кДа в мембранах НСП являются rho ( 22 кДа ) и гас ( 24 кДа ) белками. При увеличении времени экспозиции ра-радиоавтографа мы обнаружили включение радиоактивной метки еще в один белок мембран НСП ( мол. масса 60 - 5 кДа ). Такая величина не характерна для низкомолекулярных gtp-аз , и исследование этого бежа в настоящее время проводится в нашей лаборатории.

кДа -.v . .. ,

94 - '1

67 - }

43- f j

5

< * |

30 - „„ -й л

* 1 "i.1 > ¿j л

20 - - ZtZ--->

1 2 3 4 ь

32

Рисунок 2. [ р]adp-рибозилирование экзоэнзимом (^белков фоторецепторных клеток быка и кальмара. Приведена авторадиограмма: ци-топлазматической (I) и мембранной (2) фракций рабдом кальмара; мембранной (3) и цитоплазматической (4) фракций НСП быка; мембран клеток hl-60 (5).

S f- 1:*

J 1* iL

1 2 3 4 b

В цитоплазматической фракции НСП кроме субстратов 22 и 24 кДа [32р]ыэр-рибозилировались полипептиды с мол.массами 28 и 36 кДа. Белок 36 кДа в дальнейшем был дополнительно очищен и получен в гомогенном состоянии ( см. далее ). Величина субстрата 28 кДа позволяет отнести его к нкзкомолекулярным втр-азам. Его молекулярная масса отличается как от гас, так и от гьо белков, что отчетливо видно при сравнении этого белка с субстратами СЗ из промиелоцитарных клеток лейкемии линии нь-бо (рис. 2 ). Неизвестно, что мембраны этих клеток содержат белей семейства гас, участвующие в процессе дифференцировки. Не исключено, что полипептид 28 кДа является не описанной еще низкомолекулярной стр-азой,характерной для зрительных клеток млекопитающих.

Картина [32р]лор-рибозилирования белков фоторецепторных сегментов кальмара отличается от таковой у быка, хотя здесь так же основными субстратами являются белки с мол.массами 22 и 24 кДа (в них включается более 60% радиоактивной метки). Однако в мембранах кальмара дополнительно [32р]Аг>р-рибозилируются полипептиды с мол. массами 30, 45 и 80 кДа ( рис.2 ). Возможно, что белок 30 кДа ( в него включается около 30% радиоактивной метки ) является новым регуляторным элементом ( низкомолекулярной стт-азой или а-субъединицей с-белка ) в передаче трансмембранного сигнала зрительных клеток беспозвоночных. Полипептид 45 кДа имеет молекулярную массу, сходную с родопсином, и появление полосы на радиоавтографе могло быть результатом неспецифического связывания [32р]ыае> или [32р]атр с родопсином, преобладающим в фоторецепторных мембранах ( около 80% всех мембранных белков ). Однако контрольная инкубация мембран в среде с 132Р1гоо)+ , но без СЗ,показала отсутствие каких либо меченых белков. Кроме того, полипептид 45 КДа связывался с веае-Тоуореаг1 из темнового солю-билизата мембран в 1% растворе а-додецил-п-мальтозида. Родопсин

в этих условиях с ионообменным сорбентом не взаимодействовал. Более того, очищенный родопсин не [32р]АОР-рибозилировался в присутствии СЗ. Эти данные позволили нам предположить, что в фо-торецепторных мембранах кальмара содержится белковый субстрат экзоэнзима СЗ, имеющий молекулярную массу сходную с родопсином, но отличающийся от него физико-химическими свойствами. Необходимо отметить, что электрофоратическая подвижность субстрата 45 кДа сходна с подвижностью «сз (45 кДа) и о^ (41 кДа), которые дор-рибозилируются соответственно холерным и коклюшным токсинами, но не СЗ. Возможно в фоторецепторных мембранах кальмара присутствуют несколько с-бежов, один из которых имеет а-субъедини-цу с м.м. 45 кДа. Это отчасти подтверждают биохимические и имму-нохимические исследования, которые показали, что в зрительных клетках беспозвоночных содержится несколько а-субъединиц о-бел-ков с различными молекулярными массами .

Выделение субстратов С3 из фоторецепторных мембран быка и кальмара.

С целью дальнейшей хроматографической очистки мы попытались избирательно экстрагировать субстраты СЗ из фоторецепторных мембран кальмара и быка. Подобно гетеротримерным в-бежам низкомолекулярные втр-азы подвергаются посттрансляционной модификации остатками некоторых жирных кислот, что способствует взаимодействию этих бежов с мембраной. Например представители семейств гьо и гас модифицированы остатками фарнезиловой ( гьов, г1юс, гас1 и гас2 ) или геранилгераниловой ( г1юа ) кислот по С-концевому суз ( рисунок 3 ).

гко В, тко С, гас 1, гас 2

Н ¿1-ШШШ2

" "Х/сн

Ъ-осн II 3 о

г

гкоА

Рисунок 3. Посттрансляционная модификация гЬо и гас белков.

Известно, что трансдуцин, будучи периферическим мембранным белком, переходит в водную фазу с белками цитоскелета при обработке темновых мембран НСП гипотоническим буфером . В освещенных мембранах образуется комплекс ат с фотоактивированным ро-родопсином, который разрушается в присутствии втр. Основной в-белок зрительных клеток беспозвоночных ( сд ) прочнее ассоциирован с мембраной, но и он может быть экстрагирован из мембраны 2М мочевиной . Однако наши попытки экстрагировать субстраты СЗ из 100 дм стр, 400 шм кс1 или 2м мочевиной успехом не увенчались. Лишь незначительное количество этих белков регистрировалось в растворе, что можно отнести на счет ошибки измкрений. Полученные данные показывают, что субстраты СЗ фоторецептор-ных клеток позвоночных и беспозвоночных прочнее связаны с мембраной, чем в-белки и для их выделения необходимо использование детергентов.

Для солюбилизации субстратов СЗ наш отбирались детергенты, в

которых экзоэнзим СЗ сохранял Алр-рибозилтрансферазную активность. Как видно из рисунка 4, подходящими свойствами обладают

с

рибозилирования субстратов 22-24 кДа из мембран НСП быка. ( Использовались 1% растворы детергентов .

Рисунок 4.

Влияние различных детергентов на степень adp-

CHA.PS CfiNe DM OG NP-дэ ROS

detergents

несколько детергентов. Среди них особенно выделяется 3-[(3-хола-мидопропил)диметиламмонио]-i-пропансульфонат ( chaps ). Было показано, что степень adp-рибозилирования субстратов 22-24 кДа эк-зоэнзимом СЗ в 2.5 раза выше в i% chaps,чем в фоторецептсрных мембранах позвоночных и беспозвоночных.Это позволяет эффективнее регистрировать субстраты СЗ в процессе хроматографической очистки.

На первом этапе выделения фоторецепторные мембраны быка или кальмара солюбилизировались в темноте в буфере с i% chaps и с so тм Naci при соотношении белок / детергент i:io (w/w). При этом более 90% мембранных белков переходило в раствор. Солю-билизат В темноте наносили на колонку DEAE-Toyopearl. Элго-ция субстратов СЗ 22-24 кДа фоторецепторов быка и субстратов 22-24, и 30 кДа фоторецепторов кальмара начиналась в 100-120 шм Naci. Субстраты СЗ 45 кДа и 80 кДа не были обнаружены ни в одной фракции. Можно лишь предположить, что низкое содержание этих белков в мембране стало причиной их потери в процессе выделения.

Однако в отдельном эксперименте нами было показано, что субстрат 45 КДа СВЯЗЫВаЛСЯ В ТеМНОТе С DEAE-Toyopearl И ЭЛЮИРОВЭЛСЯ 125 шМ NaCl .

Фракции, содержащие субстраты СЗ концентрировались и наносились на колонку Mono q. Элюцшо белкоз проводили градиентом Nací 100-500 тм . [32р] adp-рибозилирование и электрофоретический анализ полученных фракций показали, что з пике в-5 выходят субстраты 22-24 кДа из мембран быка, а в пике s-4 - субстраты 22-24 и 30 кДа из мембран кальмара ( рисунок 5 В обоих случаях препараты имели примерно 20% чистоту. Таким образом были частично очищены три субстрата зкзоэнзима СЗ из фоторецепторных мембран быка и кальмара.

DEAE-Toyopearl

Mono Q

I 2

Рисунок 5. Хроматографическая очистка субстратов СЗ из фоторецепторных мембран быка (I) и кальмара (2).

Для определения к-концевой аминокислотной последовательности полученные субстраты СЗ разделялись электрофоретически, переносились на поливпнилдифторидную мембрану ( "immobiion" ) и анали-зироЕались в газофазовом секвенаторе. Анализ показал, что н-кон-цевые аминокислоты всех трех белков блокированы. Эти результаты согласуются с данными, что N-концевые аминокислоты всех известных g-белков и низкомолекулярных gtp-эз так же модифицированы.

Выделение субстрата СЗ 36 кДэ из цитозоля НСП быка

Для выделения субсграта СЗ 36 кДа ( Р-36 ) цитоплазматическое содержимое НСП после осмотического шока наносили на колошсу с

Sepharose-Blue. ЭТОТ сорбент бЫЛ ВЫбраН НЭМИ, Т.К. ОН ШИРОКО

используется для разделения нуклеотпдсЕязываюцих белков. Р-36 элюировали 500 пи Nací и после пятикратного разбавления полученной фракции наносили на колонку с DEAE-Toyopeari. Субстрат СЗ при этом оказывался в проскоке, тогда как большая часть других белков сорбировалась. На следующем этапе проскок наносился на колонку с Mono s и проводилась эшоиия белков градиентом Nací 100-1000 гпм. На этой стадии Р-36 был очищен практически до гомогенного состояния ( рисунок 6 ).

Белок Р-36 по электрофоретической подвижности отличается от других описанных субстратов экзоэнзима СЗ семейства ras-подобных белков и сходен с а-субъединицей трансдуцина. Однако, в отличие от последней, Р-36 не рибозилировался коклюшным или холерным токсинами. Кроме того, он не взаимодействовал на иммуноблоте с антителами, полученными на ат и /зт. Также, как и у а-субъедшпщы трансдуцина, N-конец у Р-36 блокирован, однако по данным аминокислотного анализа аминокислотные составы этих белков существен-

Цитоплазматическая фракция НСП быка Sepharose-Blue

Элюция 0.5 М NaCl DEAE-Toyopsar1 (ПрОСКОК)

I

Mono S

AUFS

0.4 0.3 0.2

0.1 .

о

KaCl(Mol)

. T

Lo.u i

10.3

г |0.2 I! o.i

0

Рисунок 6. Схема хроматографической очистки Р-36. На электро-фореграше приведены: элюат С Sepharose-Blue (1); проскок с DEAE-Toyopearl (2); ПИК 3 С Mono S (3).

£

но различаются ( таблица I ).

Известно, что низкомолекулярные стр-азы, в т.ч. субстраты СЗ присутствуют в клетке и в водорастворимом и в мембраносвязанном состоянии, причем их клеточная локализация динамична и регулируется специальными белками . Р-36 был обнаружен нами только в ци-топлазматической фракции НСП быка и отсутствовал в мембранах НСП и рабдомах кальмара. В настоящее время в группе регуляторных белков инозитидного цикла ИБХ совместно с нашей лабораторией ведется работа по структурно-функциональной характеристике белка Р-36. Полученные данные помогут ответить на Еопрос: является ли обнаруженный субстрат СЗ новым членом семейства стр-связывающих белков и какова его роль в восприятии зрительного сигнала у позвоночных.

Таблица I. Сравнение аминокислотных составов Р-36 и «Т.

P-36 aT P-36 aT

Asp 37 25 Ser 17 23

Asn - 15 Val 35 17

Thr 19 20 Met 9 11

Trp - 2 lie 18 25

Cys - 8 Leu 18 30

Glu 15 25 Tyr 9 10

Gln - 15 Phe 12 15

Pro 12 7 His 7 8

Gly 30 23 Lys 23 24

Ala 31 22 Arg 9 17

Влияние гуаниловых нуклеотидов и ионов мд2+ на adp-рибозилирование мембранных субстратов СЗ.

К сожалению низкое содержание субстратов СЗ в фоторецепторных мембранах быка и кальмара не позволило нам выделить эти белки в количествах, достаточных для их структурной характеристики методами белковой химии. По оценкам разных авторов даже в наиболее богатых этими белками клетках мозга их содержание не более о.оо5% - o.oi% от общего количества мембранных белков. Основываясь на литературных данных мы предположили, что субстраты 22-24 кДа являются ras-подобными белками семейств rho и гас. Для под-тверздения этого предположения было решено проверить у выделенных субстратов СЗ свойства, характерные для всех описанных белков этих семейств из других тканей:

- способность связывать gtp на мембране после sds-электрофореза;

- зависимость степени adp-рибозилирования от присутствия гуани-

ловых нуклеотидов И ИОНОВ Ма2+.

При помощи описанного выше метода нами было показано, что белки 22-24 кДа из фракций в-5 и в-4 сохраняли способность сеязывэть

[32р]стр после перенесения на нитроцеллюлозную мембрану. Однако субстрат 30 кДа из фоторецепторных мембран кальмара такой способностью не обладал.

Влияние гуаниловых нуклеотидов на процесс дор-рибозилирова-ния было показано для всех атр-связывающих субстратов бактериальных токсинов. Конформационные изменения, происходящие в белке при связывании втр или сор по-видимому изменяют доступность комплекса "рибозилтрансфераза^АЛ+" к аминокислотному остатку, который подвергается модификации. Так, например, взаимодействие трансдуцина с фотоактивированным родопсином приводит к диссоциации комплекса ат-сор. При этом степень рибозилирования трансдуцина коклюшным токсином резко снижается, т.к. предпочтительным субстратом для рибозилтрансферазы является трансдуцин в сбр-связанной форме. Ингибировадие является обратимым и может быть снято при добавлении в реакцию вор, в то время как стр или его негидролизуемые аналоги усиливают эффект .

Рисунок 7.

Влияние гуаниловых нуклеотидов на уровень АБР-ри-бозилирования субстратов СЗ 22-24 кДа фоторецепторных мембран быка и кальмара .

ЕЗ гг-гяко* ьоу. СИ 77 24-:;» ад. ' ' эоноа яа

В наших экспериментах было показано, что ыэр-рибозилирование субстратов СЗ 22-24 кДа из мембран НСП быка и субстратов 22-24, 30 кДа из фоторецепторных мембран кальмара изменяется в присутствии сбр, втр и стртз. Добавление в реакционную среду атр не влияло на уровень рибозилирования этих бежов (рисунок 7 ). Как было показано в ряде работ, подобным образом гуаниловые нук-леотида влияли на мэр-рибозилирование гьо белка из мозга быка.

Однако подобное влияние нуклеотидов проявлялось в отсутствие или при низких концентрациях ( <ю им ) ионов мд2+. При большем содержании эти ионы сами активировали процесс дор-рибозпли-рования, нивелируя действие гуаниловых нуклеотидов. Активация рибозилирования субстратов 22-24 и 30 кДа достигала максимума при концентрациях мд2+ юо дм-боо дм . При увеличении концентрации ионы магния начинали сникать уровень гше-рибозилирования до 20% от исходного. Влияние ионов магния на уровень рибозилирования экзоэнзимом СЗ было описано и для йо и гас бежов, выделен-выделенных из других тканей млекопитающих. Такой эффект предполагает наличие у бежов этих семейств центра связывания мд2+, функциональная роль которого пока не ясна.

Таким образом полученные данные показали, что субстраты СЗ 22-24 и 30 кДа из фоторецепторных мембран позвоночных и беспозвоночных по своим свойствам близки к бежам семейств гьо и гас.

Влияние света на дор-рибозилирование субстратов СЗ

При изучении механизма усиления зрительного сигнала у позвоночных было показано, что рибозилирование аТ коклюшным токсином ингибируется при освещении НСП. При инкубации в ярком свете уровень включения [32р] мр-рибозы в ат снижался на 90% . Мы проверили, существует ли подобный эффект светозависимого м>р-ри-бозилирования фоторецепторных мембран быка и кальмара экзоэнзи-

мом СЗ. Подобно влиянию на рибозилирование трансдуцина, в наших экспериментах свет снижал степень рибозшшрования белков 22-24 кДа в мембранах НСП быка. При интенсивном освещении мембран в присутствии СЗ и [32р]ыао+ уровень включения радиоактивной метки в эти белки снижался на 60-70 % ( рисунок 8 ). При этом степень дор-рибозилирования субстрата СЗ 60 кДа в темновых и освещенных мембранах оставалась одинаковой. Нужно отметить, что эффект влияния света на степень рибозилирования субстратов СЗ в НСП исчезал при увеличении концентрации ионов мд2+ в инкубационной среде до юо-боо цм .

Известно, что снижение уровня Аор-рибозилирования трансдуцина является следствием взаимодействии ат в сир-связанной форме с освещенным родопсином, после чего на а-субъединице происходит обмен сбр на стр. Трансдуцин в промежуточном состоянии, свободном от нуклеотида и в стр-связанной форме является плохим субстратом для коклюшного токсина. Полученные данные по влиянию света на уровень рибозилирования субстратов СЗ в НСП позвоночных позволяют предположить, что также происходит прямое или опосредованное взаимодействие этих белков с фотоактивированным родопсином.

В наших экспериментах действие света на Алр-рибозшшрование фоторецепторных мембран кальмара экзоэнзимом СЗ оказалось прямо противоположным влиянию на НСП быка. Как показано на рисунке 8 , при интенсивном освещении мембран кальмара в присутствии экзо-энзима СЗ и [32р]включение радиоактивной метки в белки 22-24 к 30 кДа увеличивалось примерно на 30% . Изменения уровня аб?-рибозилирования субстратов 45 и 80 кДа нам зарегистрировать не удалось. Таким образом у кальмара, в отличие от быка, свет гктнЕирозал процесс дор-рибозилирования фоторецепторных мембран.

Светозависимость рибозилирования низкомолекулрных стр-связывающих белков , подобно гетеротримерным в-белкам, дает основание предположить их участие в передаче зрительного сигнала. Однако,

срт (тоизапаз) _

Рисунок 8. Влияние света на уровень мэр-рибозилирования субстратов СЗ в фоторецеп-торных мембранах быка (I) и кальмара (2).

аагк пдт

122-24 кРа ьс™ СШ22-24 кОа ач СИ 30 кОа а

30 20

■ " 'Я

1 й

1 - - 1

ь о а ь

И-сЗагк L-light

по-видимому, у позвоночных и беспозвоночных белковые субстраты СЗ участвуют в различных светоиндуцируемых ферментативных каскадах. По современным представлениям зрительные системы позвоночных и беспозвоночных различаются на всех уровнях передачи светового сигнала: регуляторные белки в этих организмах принадлежат к разным типам с-белков; поглощение света фоторецепторами приводит к активации различных эффекторов: фосфодиэстеразы циклического эир у позвоночных и фосфолипазы С у беспозвоночных; различия существуют и на уровне вторичных мессенджеров и их мишеней. Таким образом различия в микроокружении субстратов СЗ в фоторецепторных мембранах позвоночных и беспозвоночных могут быть причиной различного действия света на их АБР-рибозилирование.

Взаимодействие субстратов СЗ с фотоактивированным родопсином

Для проверки нашего предположения о взаимодействии низкомолекулярных gtp-эз с фотоактдвирозанным родопсином было решено провести хроматографическуга очистку комплекса "родопсин-субстрат СЗ" С использованием Con A-Sepharose. Известно, что лектин Con А связывается с родопсином, который является гликоцротеином и не взаимодействует с ras-подобными белками. С этой целью солюбили-заты темновых и освещенных фоторецепторных мембран кальмара наносились на колонку с con A-sepharose и проводилась элюция связавшихся белков a-d-метилманнозидом. [32р]лор-рибозилирозание и электрофорез полученных фракций показал, что из темнового солюбилизата с сорбентом связывался и элюировался з основном родопсин, тогда как субстраты СЗ оказывались в проскоке (рис.9 ). После освещения солюбилизата вместе с родопсином с con A-sepha-rose взаимодействовали белки 22-24 кДа, которые уже не регистрировались в проскоке.

Рисунок 9. Светозависимое взаимодействие субстратов СЗ из фоторецепторных мембран кальмара с con л-sepharose. Солюбилизат мембран (I); белки не сорбирующиеся (2) и сорбирующиеся (3) на con A-sepharose из освещенного солюбилизата; белки не сорбирующиеся (4) и сорб1грущиеся (5) на con A-sepharose из темнового солюбилизата. ( Приведена авторадиограмма.)

Аналогичные результаты были получены нами при сорбции солюби-лизированных мембран кальмара на иммуносорбент с антителами к родопсину кальмара . Поликлональные антитела иммобилизовались на protein A-sepharose и полученный сорбент добавлялся к темновому и освещенному солюбилизатам после их [32р]дор-рибозилирования. Белки, связаЕсиеся с иммуносорбентом элюировали буфером с sds и анализировали электрофоретически. Из рисунка 10 видно, что из освещенного солюбклиззта преципитируется значительно больше субстратов СЗ 22-24 кДа, чем из темпового.

Рисунок 10. Взаимодействие субстратов СЗ из фоторецепторных мембран кальмара с антителами к родопсину кальмара в темнота (I) и на свету (2)

Таким образом, полученные результаты подтверждают наше предположение, что при освещении фоторецепторных мембран образуется комплекс родопсина с субстратами СЗ 22-24 кДа . Однако пока не ясно, связываются ли субстраты СЗ непосредственно с фотоактивированным родопсином, или взаимодействие происходит с участием какого-то другого белка.

Выводы

1. В фоторецепторных мембранах быка и кальмара обнаружены низкомолекулярные GTP-связывающие белки с молекулярными массами 2030 КДа. Показано, ЧТО ЭКЗОЭНЗИМОМ Сд ИЗ Clostridium botulinum В в мембранах кальмара дор-рибозилируются полипептиды с молекулярными массами 22, 24, 30, 45 и 80 кДа, а в мембранах НСП - 22, 24 и 60 кДа. Цитоплазматическая фракция НСП содержит субстраты С3 с M.M. 22, 24, 28 И 36 КДа.

2. Произведена частичная хроматографическая очистка субстратов 22 и 24 кДа из фоторецепторных мембран быка и кальмара и изучено влияние гуаниловых нуклеотидов и ионов мд2+ на процесс их ADP-рибозилирования. Установлено, что субстраты Сд с м.м 22 и 24 кДа по своим свойствам близки к белкам семейств rho и гас.

3. Разработана схема хроматографической очистки субстрата С3 33 кДа из цитоплазматической фракции НСП. Белок выделен в гомогенном состоянии и показано его отличие от а-субъеднницы транс-дуцина.

4. Показано, что процесс ADP-рибозилирования субстратов С3 22 и 24 кДа быка и кальмара является светозависимым. Обнаружено взаимодействие этих белков с фотоактивированным родопсином быка и кальмара, что предполагает их участие в передаче зрительного сигнала.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

I. Артамонов И.Д., Петров В.М., Липкин В.М. Исследование белков системы фототрансдукции из сетчатки кальмара. - I Всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Белковая инженерия", Москва 1993, стр. 7.

2. Петров В.М., Артамонов И.Д., Баскаков И.В., Соловьева О.В., Липкин В.М. Ras-годобные белки зрительной системы беспозвоночных и позвоночных. Взаимодействие субстратов э^сзоэнзима СЗ с фотоактивированным родопсином кальмара.- Биоорганическая химия, 1994, том 20, N 5, стр. 498-505.

3. ArtamotovI.D., Petrov V.M., Baskakov I.v. The substrates of exoenzyme C3 in photoreceptor membranes of squid. How many targets ? - 5th International symposium on retinal-binding proteins, Paris, France. Abstracts, 1992, p. 15.

4. Petrov V.M., Artamonov- I.D., Lipkin V.M. Small GTP-bin-ding proteins of squid photoreceptor. Interaction with photoac-tivated rhodopsin.- FEBS Letters, 1994, v.337, p. 274-276.