Метилтрансферазы ЕсоRII и Mval: особенности механизмов взаимодействия с ДНК, аффинная модификация тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА 3 ^ ^ ^ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

? 7 П'-З н-7

На правах рукописи УДК 547.563.3

БРЕВНОВ Максим Германович

МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ЕсоШ И МунЬ ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК, АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных

веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Е .С. Громова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

С.Н. Кочетеов

доктор биологических наук В.П. Вейко

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится 28 января 1997 года в 16 часов на заседании Диссертационного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ. Автореферат разослан "_" декабря 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологическое метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами, является процессом, играющим важную роль в жизнедеятельности как прокариотических, так и эукариотических организмов. В прокариотических организмах ДНК-метилтрансферазы входят в состав систем рестрикции-модификации и совместно с сопряженными эндонуклеазами осуществляют функцию защиты клетки от проникновения чужеродной ДНК. Акптно изучаемые в настоящее время ДНК-метилтрансферазы типа II прокариотичееки.х организмов узнают короткие последовательности ДНК и катализируют перенос ме-тильной группы от кофактора - З-аденозил-Ь-метионшга (Ас!оМс1), донора ме-тильиой группы, на остатки аденина или цитозина узнаваемой последовательности ДНК, образуя Ыб-метиладенин, С5-метилцитозин или Ы4-метилцитозин. Наиболее хорошо изученным классом ДНК-метилтрансфераз являются С5-метилазы, для которых предложен общий механизм катализа, и для одного из ферментов имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплекса с ДНК. При этом обнаружено полное выведение метилируемого остатка цитозина из состава двойной спирали Возможно, этот механизм является общим для всех ДНК-метилтрансфераз. Однако прямые экспериментальные данные о механизмах образования специфических ДНК-белковых контактов и о динамике переходных состояний пока отсутствуют. Класс метилаз, метилирующих экзоциклические амингаруппы остатков цитозина (\;4-метилазы), изучен крайне мало. Малоизученной является роль кофактора в регуляции взаимодействия метилаз с ДНК. Актуальной задачей является также разработка новых методов изучения взаимодействий метилаз с ДНК, позволяющих идентифицировать группы как в ДНК, так и в белке, отвечающие за образование дискриминационных ДНК - белковых контактов.

В настоящей работе изучались метилазы ЕсоКII (С5-метилаза) и Л/га! (N4-метнлаэа), которые узнают в ДНК одну и ту же пятизвенную последовательность 5'...ССЛ/гСО...З' и метилируют внутренние остатки цитозина в этой последовательности. Молекулярные механизмы их взаимодействия с ДНК и строение фермент - субстратных комплексов являются практически не изученными.

Целью настоящей работы явилось выяснение особенностей узнавания ДНК метилазами ЕсоЯН (М.ЕсоЯН) и Мт\ (М.Мга1), зондирование возможных структурных перестроек субстрата при взаимодействии с этими ферментами, а также

разработка нового типа аналогов субстратов с реакционноспособными группами для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа данных по взаимодействию метилаз £coRII и Mval с субстратами, содержащими модификации в различных положениях участка узнавания, выявлены некоторые группы атомов участка узнавания, необходимые для специфического взаимодействия M.EcoRÍÍ и M.A/raJ с ДНК. Установлено, что при взаимодействии с M.£cí>R¡I и M.Mval двойная спираль ДНК участка узнавания претерпевает значительные структурные перестройки, направленные на обеспечение доступности остатка ци-тозина в процессе метилирования, но реализуемые в случае двух ферментов по-разному.

Для метилазы Мval показано, что роль кофактора в процессе взаимодействия с ДНК не ограничивается ролью донора метальной группы. В присутствии кофактора в большой степени повышается сродство ферментов к каноническим субстратам.

Предложен новый тип реагентов для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз на базе ДНК-дуплексов, содержащих остаток 1-(Р-0-галактопирано-зил)тимина, цис-диольная группа которого превращается в реакционноспособную диальдегидную группу в процессе периодатного окисления. Это впервые позволило вводить активную диальдегидную группу в заданные положения олигонуклеотидной цепи, входящей в состав ДНК-дуплекса - субстрата метилаз.

Показано, что метилазы способны специфично и с большими выходами ковалентно присоединяться к таким реакционноспособным аналогам субстрата.

Полученные результаты позволяют рекомендовать реагенты данного типа в качестве эффективного и гибкого инструмента для изучения широкого спектра ДНК-белковых взаимодействий.

В ходе работы была разработана оригинальная методика тестирования степени метилирования каждой из цепей ДНК-дуплекса, что позволило эффективно решать поставленные задачи.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на III-ем симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК" (Вильнюс, Литва, 1994), международном симпозиуме стипендиатов научного фонда Медицинского института

Говарда Хьюза стран Балтии, Центральной Европы и бывшего Советского Союза (Прага, Чешская республика, 1996), конференции FASEB "Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты" (Вермонт, США, 1996), Десятом симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Трест Касгл, Чешская республика, ¡996).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на_страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: обзор литературы (посвящен механизмам функционирования ДНК-мстилтрансфераз типа 11), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( ссылок), содержит 15 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В работе использовали препарат метилазы Mval производства "Fermentas МВ1" (Литва) и препарат ДНК-метилтрансфсразы £coRH, выделенный А.В.Репи-ком (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН).

Олигонуклеотиды, содержащие нуклеозиды, модифицированные по остаткам дезоксирибозы и ряд немодифицированных олигонуклеотидов, были синтезированы в лаборатории химии нуклеиновых кислот кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ Т.С. Орецкой, Е.М. Волковым и Е.А. Романовой. Олигонуклеотиды, содержащие 2-аминопурин, были синтезированы С. Шмидт и О.В. Пятраускене в университете им.Гумбольдта (г.Берлин). Олигонуклеотиды, содержащие остатки 1-(Р-0-галактопиранозил)тимина, были предоставлены С.Н. Михайловым (Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта). Остальные олигонуклеотиды являлись коммерческими препаратами.

1. Изучение механизмов функционирования ДНК-метнлтрансфераз ZTcoRII и Мга\.

1.1. Дизайн аналогов субстрата

В основу изучения механизма функционирования метилаэ £roRII и Мval положено исследование их взаимодействия с направленно модифицированными ДНК-дуплексами. При этом преследовались следующие цели:

- для обеих метнлаз, характеризующихся разными типами метилирования ДНК, определить важность тех или иных нуклеозндных остатков и групп атомов участка узнавания для взаимодействия с белком;

- определить роль локальных изменений конформации углеводо-фосфатного остова в процессе ДНК-белкового взаимодействия;

- выявить характер изменения структуры субстрата при метилировании ( в связи с потенциально ожидаемой необходимостью доступности метилируемого остатка цитозина метилирующему агенту).

Дизайн аналогов субстрата был направлен на определение функциональных групп внутри участка узнавания, участвующих в образовании белково-нуклеино-вых контактов, и возможных структурных перестроек субстрата при образовании каталитических комплексов.

В качестве канонических субстратов были использованы следующие ДНК-дуплексы:

5'АССТАССТ6вТССТ 5'СССААССТСССТСТ 51 СССААССТ(ЗССТСТ

З'ТССАТЬ^ССАССА з'сёсттс^ссёАёА з' стссстт6а&сссАёАст

На их основе был сконструирован ряд ДНК-дуплексов (рис.1, табл.1-3),

5'- • •

3" • • *

С

X Ч

ccгrGG

ССАСС

3' 5'

«

т5с

I

0

1

ёсШ

А

в, А

I

X

и.ь N

к

пИС

2АР

го г

ш

хТ

Рис.1. Структурные формулы и схема вве- ■. дения аналогов иук-леозидов в участок узнавания ДНК-метил-трансфераз ЕсоКII и Л/га I.

которые содержат в пределах участка узна» вания аналоги природных нуклеозидов. При этом вносятся локальные нарушения в углеводо - фосфатный остов ДНК, изменяется локальная стабильность системы водородных связей, модифицируются отдельные функциональ-

ные группы гетероциклических оснований, а также удаляются основания.

1.2. Основные методы исследования

Для изучения взаимодействия метилтрансфераз с аналогами субстрата использовали два основных метода: анализ включения тритиевой метки в ДНК-дуплекс, происходящего в процессе переноса метильной группы с [3Н]-А(ЗоМе1 в ходе ферментативной реакции, и исследование связывания метилаз ЕсоКМ и Муо\ с каноническим и модифицированными субстратами при помощи "торможения" в геле в нсдензтурнрующих условиях с использованием '-'Р-меченных ДНК-дуплексов в присутствии или в отсутствие З-аденозилгомоцистеинз (АаоНсу) (раздел 1.5).

1 2 3 4 5 6 7

Тройнпй комплекс [М.£г0К11'ду|1Лекс(1) ■АЛоНсу)

"Свободный" ДНК-дупяехсЦ)

О 00 о* 0$ ,12

1/1-с.кМ-1

а) б)

Рис.2 а) Изучение образования тройного комплекса [М.£соКП • ДНК-дуплекс(1) • А(1оНсу] методом "торможения" в геле. Дорожки 1 - 6 соответствуют увеличению концентрации М.£соКП (дорожка 7 - контроль). Концентрация дуплекса(Сб) 14нМ, концентрация фермента (Ск)6 - 154 нМ, ! мМ Ас1оНсу. Неденатурирующий 6,5°'о -ный ПААГ.

б) Зависимость количества фермент-субстратного комплекса от концентрации фермента (Ел) для системы М.£соШ1-ДНК-дуплекс(12) в присутствии 1мМ

Ас!оНсу в обратных координатах 1/(а[Е8]) от 1/Ео, где а - коэффициент пропорциональности. Си 14нМ.

Константы диссоциации (Кй) ДНК-белкового комплекса определялись с помощью регрессионного анализа, в качестве одного из параметров которого использовали соотношение радиоактивностей зон, соответствующих ДНК-белковому комплексу и ДНК-дуплексу (пример см. рис.2).

В силу того, что обычно используемые методы изучения метилирования основаны на измерении общего числа метильных групп, перенесенных на обе цепи участка узнавания в ДНК, а в нашем случае было необходимо контролировать ме-

тилирование каждой из цепей ДНК-дуплекса, была разработана методика, удовлетворяющая нашим требованиям.

Использовали субстраты, имеющие цепи разной длины (18 и 14 нуклеотид-ных звеньев), после метилирования которых в составе дуплекса они могут быть разделены в 20%-ном ПААГ. В процессе метилирования в остатки цитозина вводилась тритиевая метка. Для идентификации положения цепей в геле и для внутренней стандартизации после метилирования в реакционную смесь добавлялись точно известные количества 32 Р-меченных олигонуклеотидов с той же электрофоретиче-ской подвижностью, что и олигонуклеотиды, составляющие метилированный дуплекс. После электрофоретического разделения в 18- и 14- ти звенных фракциях олигонуклеотидов определялись значения 3Н- и згР-радиоактивности. Полученные величины 3Н-радиоактивности пересчитывались с учетом изменений 32Р-радиоактивности (рис.3). Данная методика была разработана совместно с Е.А.Кубаревой.

14-ти звенник Метилаза СН|Ме ,.м1г.м.

18-ти звешшк [ЗН]-Л<1оМе1 Рн]1Ис

Р2р]П4*тн зеенник

гХгт-п (32р|.|8>тн зеенник 1. Гель электрофорез 2. Радиоавтограф»*

П11]ме Элнжия (4-ти и 18-ти звенмых фракций из геля

1*Н}Ме Н-) — Смет3Н и 32р. радиоактивности

* 1ЧЦМс — Счст^Н и 32р. радиоактивности

Рис. 3. Схема методики для определения метилирования каждой из цепей ДНК -дуплекса.

Кроме того, были использованы синтетические полуметилированные субстраты ДНК-метилаз. Для метилазы £соЯП таким субстратом будет ДНК-дуплекс, имеющий в одной из цепей остаток т5С, а для М.А/га! - остаток пт'С. Проводя реакцию метилирования последовательно с неметилированным исследуемым аналогом субстрата и полуметилированным аналогом субстрата, мы имеем воз-

можность рассчитать уровень метилирования каждой из двух цепей ДНК - дуплекса.

1,3. Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы £со1Ш с модифицированными

субстратами.

Изучение субстратных свойств дуплексов 2-4 (табл.1) показало, что М.£со1Ш толерантна к существенному искажению углеводного фрагмента центра участка узнавания и, следовательно, к конформации, прилегающих к нему фосфатных групп.

Модификация внешнего остатка О и центрального А (дупл. 6, 8, 10; табл.!) приводит к полному блокированию, как метилирования обеих цепей, так и специфического связывания, что свидетельствует о ключевой роли Об атома внешнего остатка гуанина и 6ЫНг группы аденина участка узнавания в образовании дискриминационных контактов, с М.£соЯ11. Модификация центрального остатка Т (дупл. 5) приводит к значительно меньшему нарушению как функции метилирования, так и узнавания. Замена же внутреннего остатка в на остаток 2АР напротив метилируемого С (дупл. 9) не влияет на связывание н практически не влияет на метилирование ^модифицированной цепи. Сохранение функций метилирования и связывания в этом случае и в случае аналогичной модификации остатком Г,2'-дидезокси-рибоэы (дупл. 7) может объясняться тем, что в случае М.£соЯП, как и для, изученной методом рентгеноструктурного анализа М.НЬа! (Климашаускас и др., 1994), в процессе метилирования происходит "выпетливание" остатка С из двойной спирали ДНК, не затрагивающее структуру соседних нуклеотидных пар. Согласно этому механизму, дестабилизация С:С-пары, содержащей метилируемый остаток цитози-на, должна приводить к облегчению такой перестройки. Вместе с тем, ускорения метилирования не происходит, вероятно, потому, что М.£«?ЯП чувствительна к локальным искажениям структуры двойной спирали, которые наряду с дестабилизацией метилируемой С:С-пары неизбежно вносят остатки 2АР и сМЯ.

Взаимодействие М.£со11П с полуметилированными субстратами (дупл. II, 12) протекает более эффективно, чем с неметилированным субстратом, что соответствует тому, что природными субстратами ДНК-метилтрансфераз систем рестрикции-модификации являются полуметилированные ДНК. Возможно, лучшие субстратные свойства полуметилированных ДНК объясняются дополнитель-

ным гидрофобным контактом фермента с метильной группой остатка ш5С. Комплекс MEcoR.II с полностью метилированным дуплексом 13 не образуется. Такой дуплекс является конечным продуктом реакции метилирования; по-видимому, он должен легко отщепляться от фермента по окончании каталитического цикла.

Таблица 1,

Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы ЕсоЛ II _с модифицированными субстратами.__

, № ДНК-дупл екс»> X Относительное метилирование, % « Ка, нМ л-)

1 5'..ССТСС.. У ..СЭЛСС.. - 100 100 96 I

2 5'..ССХСС.. 3'..ССАСС.. ¡и 100 100

3 5'..ССХСС.. 3' . .СО,АСС. . хТ 25 100

4 5' ..ССХСС.. 3'..ССАСС.. Ш Ю 100

5 5'..ССХСС.. 3'..СвАСС.. ёсШ 0 26 0,1

6 5'..ССТСС.. 3' ..ХСАСС.. сМЯ 0 0 0

7 5' . .ССЖ. . 3'..ССАСС.. 0 20 0,1

8 5'..ССТСС.. 3'..ХСАСС.. 2АР 0 0 00

9 5'..ССТСС.. 3' ..СХАСС.. 2АР 74 0 90

10 5'..ССТСС.. 3'..ССХСС.. 2АР 0 0 оо

11 5'..ССТСС.. 3' ..ССАХС.. ш5С 174 0 22

12 5'..СХТСС.. 3'..БСАСС.. ш5С 0 122 70

13 5'..СХТСС.. 3'..ССАХС.. ш^С 0 0 00

а) Показан только фрагмент ДНК-дуплекса

б) Рассчитано относительно степени метилирования соответствующих цепей ДНК-дуплекса (1)

в) Я- отношение выхода нековалентного комплекса аналога субстрата с М.ЕсоКН к выходу комплекса, образованного этой метилазой с каноническим субстратом (1); О15нМ;СеШ0НМ.

Чтобы получить правильные комплексы и исключить метилирование, связывание фермента с субстратом проводили в присутствии 0,1 мМ Ас1оНсу.

Вместе с тем, в случае других ферментов иногда наблюдается слабое связывание с полностью метилированной ДНК. Например, М.А/^1 связывается с полностью ме-

тилированным дуплексом (Ка 4,2» 10бМ). Следует отметить, что как для метилированных дуплексов, так и для других аналогов субстрата, обсуждаемых здесь, сохраняется коррелляция между способностью связываться с М.-ЕсоЯП и метилироваться.

Из полученных данных следует, что в случае М.£соЯП прослеживается различная функциональная значимость отдельных чуклеотидных пар участка узнавания. Роль внешних С:С-пар и А:Т-пары состоит, главным образом, в образовании дискриминационных кошактов с ферментом, а внутренние С:С-пары, кроме того, участвуют во взаимодействиях, направленных на выведение метилируемого остатка цитозина из двойной спирали.

Метилаза £с«ГШ представляет собой мономерный белок. Представляется важным понять: с одной или двумя цепями ДНК взаимодействует М.£"соЛП в рамках одного каталитического акта. За исключением дупл. 5 и 8 (табл.1), когда блокировалось метилирование обеих цепей, введение модификаций в субстрат \l.ixoRfI приводит к частичному или полному ингибировапию метилирования тон цепи ДНК-дуплекса, где находится данная модификация(табл.1, рис.4). Можно предположить, что большинство специфических ДНК-белковых контактов осуществляется с той цепью, которая в данный момент метилируется.

1.4. Взаимодейс! кис ДНК-метнлтрансфсразм М\п\ с модифицированными

субстргиами.

Так же, как и мепшаза £«'КП, метилаза Л/га! толерантна к локальным искажениям углеводофосфагного остова, вызванным введением Ш. хТ и Ш (дупл. 24, табл.2).

Характерной особенностью М.Л/г«1 по сравнению с М.£а)ЯН является от-носшельная равноценное^ контактов с внешним и внутренним остатками в участка узнавания. Ни одна из модификаций (дупл. 5, 7-9; табл.2) данных остатков не блокирует метилирование обеих цепей ДНК-дуплексов, хотя обычно значительно \\\дшае1 метилирование модифицированной цепи (исключается контакт с 60 атомом гуанина). Это же справедливо при замене остатка Т на с!сЩ (дупл.6). Только модификация остатка центрального А (дупл. 10) приводит к полному блокированию процесса метилирования при сохранении эффективного связывания, что свидетельствует о взаимодействии М.А/м! с 6\Нг группой адеипна участка узнавания.

Введение 2АР вместо любого из О (дуплексы 8, 9) приводит к увеличению эффективности метилирования немодифицированной цепи. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что в процессе образования каталитически-компетентного комплекса

Таблица 1.

Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы МуЛ

с модифицированными субстратами. *>

№ ДНК-дуплекс X: Относительное метилирование. % Ка, нМ Л

1 5'..ССТСС.. 3'..ССАСС.. - 100 100 43 1

2 5' ..ССХСС.. 3'..ССАСС.. Ш 90 90

3 5'..ССХСС.. 3'..ССАСС.. хТ 30 90

4 5' .-ССХСС.. 3'..ССАСС.. Ш 30 80

5 5'..ССТСС.. 3' .. ХСАСС.. с)с!Я 32 0 0,2

6 5' ..ССХвС. . 3'..ввлсс.. дет 24 48 0,9

7 5' . .ССТХС.. 3' ..ССАСС.. сМЯ 0 60 0,2

8 5'..ССТСС.. 3'..ХСАСС.. 2АР 204 9 29

9 5'..ССТСС.. 3'..СХАСС.. 2АР 138 8 31

10 5'..ССТСС.. 3' ..ССХСС.. 2АР 0 0 30

II 5'..ССТСС.. 3' ..ССАХС.. ш^С 60 0 140

12 5' ..СХТСС.. 3'..вСАСС.. ш5С 0 60 37

13 5'..СХТвС.. 3' ..ССАХС.. ш5С 0 0 00

14 5'..ССТСС.. 3' ..ССАХС.. ш4С 192 0 75

15 5' ..СХТСС.. 3' ..ССАСС.. ш4С 0 228 62

16 5' ..СХТСС.. 3'..СвАХС.. т4С 0 0 58

*) Сокращения, условные обозначения, а также условия проведения экспериментов

аналогичны приведенным в табл.1.

происходит структурная перестройка субстрата, и что ослабление системы поло-родных связей ей способствует. Тот факт, что улучшение метилирования происходит при замене как внутреннего, так и внешнего остатка в участка узнавания, позволяет сделать вывод, что структурная перестройка затрагивает, по меньшей мере, две С:С-пары. По-видимому, процесс метилирования происходит п составе частично "открытой" двойной спирали участка узнавания.

Существенное увеличение эффективности метилирования ^модифицированной цепи в составе т4С-полуметилированных дуплексов 14 и 15 (табл.2) подтверждает образование "открытого" комплекса: введение остатков т4С вместо С приводит к локальной дестабилизации двойной спирали. Вместе с этим, метилирование т5С - полуметилированных дуплексов 11 и 12, "неродных" для М.Л/м!, протекает менее эффективно, чем немодифицированных субстратов, и при этом метилируются только неметилированные остатки цитозина. Этот факт также может быть объяснен с точки зрения образования в процессе метилирования "открытого" комплекса: известно, что введение остатков т5С вместо С оказывает локальное стабилизирующее действие на двойную спираль.

М.Л/га! не метилирует и не связывается с полностью т-'С-мешлнрованным аналогом субстрата (дупл. 16). Следовательно, "дометилирования" остатков ш^С не происходит, как это предполагалось ранее (Климашаускас и др. 1983).

Интересен факт совершенно разного отношения двух ферментов к "родному" метилированию: М.ЯсоЯП не связывается с полностью т'С-метнлированным субстратом, а М.ЛАгЛ связывается с полностью т4С-метилированным субстратом столь же эффективно, как и с неметилированным субстратом (дупл. 16).

Так же, как и для М.ЕсоШГ, представляется важным оценить: с одной или двумя цепями ДНК взаимодействует односубъединичная молекула М.Л/ггП в рамках одного каталитического акта. Данные, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в случае большинства аналогов субстрата введение в какую-либо цепь модифицированного нуклеозидного остатка сопровождается блокированием метилирования этой цели(рис.4). На основании этого можно предположить, что подавляющее большинство специфических контактов осуществляется с той цепыо, которая в данный момент метилируется.

1.5. Влияние А(1оНсу на образование фермент - субстратных комплексов.

С целью выяснения возможной регуляторной роли кофактора образование фермент - субстратных комплексов исследовали в присутствии и в отсутствие аденозилгомоцистенна (А(ЗоНсу), продукта превращения кофактора реакции -аденозилметионина в процессе метилирования. АёоНсу является конкурентным ингибитором Ас1оМе1 и может служить аналогом кофактора при изучении стабильности комплексов метилаза-ДНК.

Для метилазы EcoR.II было показано, что в отсутствие Ас1оНсу комплекс фермента с каноническим субстратом не образуется.

Таблица 3

Влияние А(1оНсу на стабильность комплекса М.Л/га! - ДНК-дуплекс.»)

№ ДНК-дуплекс X V Ка.пМ АйоНсУ Отн. метилирование, %

+ -

1 5'..ССТСв.. 3'..ССАСС.. 43 оо 100

8 5'..ССТСС.. 3'..ХвАСС.. 2АР 29 1900 111

8а 5'..СХТСС.. 3'..ХвАСС.. 2АР пт<С 2400 00 9

9 5'..ССТСС.. 3'..СХАСС.. 2АР 31 2100 69

9а 5' . .СХТСС.. 3' . .СХАСС. . 2АР ш4С 51 50 0

10 5'..ССТСС.. 3'..ССХСС.. 2АР 30 45 0

10а 5'..СХТСС.. 3'..ССХСС.. 2АР ш4С 920 910 0

II 5'..ССТСС.. 3'..СвАГС.. ш'С 140 со 30

12 5'..СХТСС.. 3'..ССАСС.. т5С 37 3700 30

13 5'..СТСТСС.. 3'..ССАХС.. т5С со оо 0

14 5'..ССТСС.. 3'..СвАУС.. пт'С 75 850 96

15 5'..СХТСС.. 3'..ССАСС.. ш4С 62 3200 114

16 5' . .СХТСС.. 3' . .ССАХС.. га'С 58 95 0

а) Сокращения, условные обозначения, а также условия проведения экспериментов аналогичны приведенным в табл.1.

Это свидетельствует о том, что кофактор необходим в этом случае не только, как донор метальной группы, но и для структурной перестройки фермента, повышающей его сродство к каноническому субстрату.

Более подробно была исследована роль кофактора в случае М.Л/ш1. Как следует из да иных табл.3, канонический субстрат (I) не образует комплекс с М.Л/гсЛ в отсутствие АёоНсу. В отсутствие АёоНсу М.Л/га1 крайне плохо или совсем не связывается с теми аналогами субстратен, которые способны хорошо метилироваться (дуплексы 8,9, И, 12, 14 и 15). Полученные данные позволяют сделать вывод: присутствие кофактора, как и в случае М.ЕсоЯН, необходимо для структурной перестройки, повышающей специфичность к "правильным" субстратам и сопровождающей образование каталитически компетентного фермент-субстратного комплекса.

В случае неметилирующихся дуплексов присутствие АйоЫсу не влияет па устойчивость образуемых комплексов (дупл. 8а, 9а,10, 10а, 13 и 16). Эффективное связывание М.А/га\ как в присутствии, так и в отсутствие аналога кофактора с рядом модифицированных субстратов (дуплексы 9а, 10, 16) позволяет предположить, что в этом случае, происходит образование прочного, но неспецифического и, следовательно, каталитически не компетентного комплекса, для существования которого Ас1оНсу не нужен. Итак, можно предположить, что кофактор в случае М.Л/|гЛ, кроме непосредственной функции донора метилыюй группы, является также дополнительным "регулятором специфичности" фермента к ДНК.

2.6. Сравнительная характеристика ДНК-метилтрансфераз Есо1Ш и Д/гя1.

Исходя из изложенных выше фактов по связыванию и метилированию мети-лазами и Л/т1 направленно-модифицированных аналогов субстрата, мо-

жет быть предложена гипотетическая схема взаимодействия этих ферментов с участком узнавания в ДНК. На рис. 4 представлена схема возможных контактов мсти-лаз £<-<>Ш1 и Мга\ с гетероциклическими основаниями участка узнавания, а на рис. 5 - схема возможных структурных перестроек субстрата в процессе метилирования.

Как было сказано выше, мстилазы ЕсоЧП и Мт\ являются мономерными белками и узнают одну и ту же нуклеотидную последовательность. Метилазы ¿'соЯП и Д-/го1 в процессе специфического взаимодействия с ДНК образуют контакты с обеими ее цепями. Вместе с тем, оба фермента, в особенности М.А/га1, основную часть дискриминационных контактов образуют с метилируемой цепью. Для обоих ферментов продемонстрирована ключевая роль 6ЫНг группы остатка

аденина и атомов 60 остатков гуанина участка узнавания при формировании фермент-субстратных комплексов. Принципиальным моментом является различный характер взаимодействия ферментов с внутренними и внешними С:С-парами участка узнавания.

Рис.4. Влияние модификации отдельных нуклео-зидных звеньев участка узнавания на метилирование каждой из цепей ДНК М.£соЯИ (а) и М.Мга! (б). Толщина стрелок условно

пропорциональна степени ингибиро-вания метилирования при модификации данного основания. В кружках над стрелками указаны группы атомов, возможно, контактирующих с ферментом.

По всей видимости, субстрат в процессе взаимодействия с М.£со1111 и М.А/га! претерпевает различные типы структурных перестроек, необходимых для преодоления стерической недоступности остатка цитозина при метилировании. В комплексе с М.£соШ1 структурная перестройка, скорее всего, затрагивает только нуклеотидную пару, содержащую метилируемый остаток С, который, согласно предложенному для ш5С-метилаз общему механизму, может выходить из состава двойной спирали. Увеличение эффективности метилирования M.Mval аналогов субстрата (дупл. 8,9,14 и 15; табл. 2), содержащих модификации, дестабилизирующие систему водородных связей, позволяет сделать вывод о том, что структурная перестройка субстрата в этом случае происходит с разрушением

комплементационных взаимодействий и затрагивает несколько нуклеотидных пар (рис. 5).

Рис. 5. Схема возможных структурных перестроек участка узнавания ДНК при взаимодействии с М.£со1Ш (а) и М .Мга\ (б).

Обе метилазы проявили практически одинаковое отношение к А(2оНсу, моделирующему кофактор метилирования. В его присутствии на несколько порядков повышается сродство ферментов к метилируемой последовательности ДНК. Данный факт хорошо согласуется с тем, что для всех ДНК-метил-трансфераз (т5С, т4С, т6А) показана высокая степень гомологии фрагмента полипептидной цепи, образующего АсЬМеЬсвязывающий домен белка.

2. Новый метод аффинной модификации ДНК-четилтрансфераз ЯсоИН и Муп\.

Ковалентное присоединение белка к НК является методом, позволяющим локализовать район в белке, отвечающий за взаимодействие с нуклеиновой кислотой. Он заключается в том, чго с помощью модификации одного нз компонентов белково-нуклеинового комплекса или добавления "сшивающего" агента к нему, белок ковалентно и специфично присоединяют к НК. Затем ковалентно-связанный белок гидролизуют протеиназами или химическими реагентами и определяют аминокислотный состав пептида, присоединенного к НК. Главное требование к способу ковалентного присоединения белка к НК - создание оптимальных условий для белково-нуклеинового узнавания. При этом вводимые модификации не должны достаточно серьезно искажать структуру компонентов комплекса, нарушая тем самым процесс узнавания аналогов НК НК-специфичными белками.

В данной работе был предложен новый тип реагентов для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз. Эти реагенты являются синтетическими аналогами субстратов с реакциошюспособными диальдегидными группами, которые могут быть введены в любую строго определенную позицию олигонуклеотида. Преимущества таких реагентов заключаются в их специфичности, в первую очередь, к первичным аминогруппам сближенных остатков лизина и способностиобразовы-

вать прочные ковалентные комплексы после химического восстановления прдук-тов пришивки. Примечательно,что ДНК-дуплексы с диальдегидными группами в середине олигонуклеотидной цепи не использовались ранее для ковалентного присоединения к ДНК-связывающим белкам.

3.1. Дизайн и свойства аналогов субстрата для аффинной модификации метилаз

EcoH.ll и Мча1.

Для региоспецифического введения реакционноспособной диальдегидной группы в субстрат метилаз fcoR.II и Мга\ было предложено использовать олиго-пуклеотиды, в которых остатки тимидина участка узнавания ферментов или ближайшие к нему замещены на остатки 1-(Р-0-галактопиранозил)тиминаП^а1) (рис.6). Остатки Т^а! вводились в центр участка узнавания М.ЕсоЯП и М.А/уй1, а также рядом с ним(рис.б).

Рис.6. ДНК-дуплексы, применявшиеся для аффинной модификации М.ЕсоЯН и

Такие соединения содержат цис-диольную группу, после окисления которой периода-том натрия можно получить олигонуклеоти-ды с диальдегидной группой С^а!*) в любой небходимой нам позиции олигонуклеотидной цепи. Данные соединения вводятся в реакцию с белком. Предполагается, что реагенты с диальдегидной группой, в основном реагируют с остатками лизина в белке (рис.7), образуя либо основание Шиффа (1), либо дигидроксиморфолиновое производное (2). Следующим этапом является восстановление полученного коныогата боргидридом натрия.

У-СССААССЖЗОСТСТ Г-СССТТетАСГСАСА

5-- сссАхсствогтст

У- СССТАвСАСССЛСА

5'- ссс мсстотсхст

V. СССТТСКАСССАСА

{ { {

17, Х=Т8а1 П*. Х=Т£а1*

18, Х=Тр1 18*. Х=Т£а1*

19, Х=Т£а1 19', Х=Т£а1*

Теа1

Т£а1'

Рис.7. Схема образования продуктов ковалентного присоединения мети-лаз EcoR.II и М\а\ к аналогам субстрата, содержащим диальдсгиднос производное.

Было показано (табл.4), что введение Тда1 в состав 14-ти звенно-го ДНК-дуплекса (1) приводит к частичной дестабилизации двойной спирали, величина которой зависит от локализации модифицированного остатка в олигонуклеотидс.

В процессе работы были отработаны условия окисления олиго-нуклеотидов, содержащих галактопиранозу, которое проводилось в 50 мМ растворе Ыа1С>4 в течение 1,5-2,5 часов при 37 °С. Структура окисленных производных была подтверждена селективным расщеплением фосфодиэфирной связи, соседней с окисленным остатком 1-(Р-В-галактопиранозил)тимина, при обработке соединений 1М анилин-ацетатным буфером (рН 4,5). Выход окисленного продукта по данным такого расщепления составлял 40-60%. Ввиду деструкции олигонуклеотндов, содержащих окисленный остаток галактопиранозы, при нагревании, точное определение Тпл. дуплексов 17*-19*(табл.4) затруднено. По косвенным данным понижение Тпл. этих дуплексов по отношению к дупл.1 не превышает 15°С. Дальнейшие эксперименты проводились в условиях, при которых дуплексы 17*-19* термодинамически стабильны.

3.2. Взаимодействие метилаз ЕсоКН и Л1га1 с аналогами субстрата, содержащими

остатки Теа1 и Tgal*.

Использование ДНК-дуплексов с реакционноспособными диальдегидными группами в качестве реагента для специфической "пришивки" к М.ЕсоЯП и М.Л/гя1 требует определить их способность специфически связываться с ферментами и метилироваться. Были изучены субстратные свойства аналогов субстрата,

Таблица 4.

Физико-химические и субстратные свойства Tgal и Tgal*- содержащих ДНК-дуплексов.

M.£coRII M.A/val

№ ДНК-дуплекс а> Тпл, oC6> отн.мстилирова-ние,% »> Rr> OTH.метилирование,% •> Rf)

1 5' GCCAACCTGGCTCT 3' CGGTTGGACCGAGA 64 100 1 100 1

17 ..ACCXGGCT.. ..TGGACCGA.. 52 0 4

18 ..XCCTGGCT.. ..AGGACCGA.. 55 15 30 •

19 ..ACCTGGCX.. ..TGGACCGA.. 58 75 70

17* ..ACCXGGCT.. ..TGGACCGA.. 0 0,7 1 1

18* ..YCCTGGCT.. ..AGGACCGA.. 14 0.1 15 0,1

19* . .ACCTGGCY.. ..TGGACCGA.. 26 1 20 1

а) X=Tgal; Y=Tgal*.

б) Са 106М.

в) Рассчитано относительно степени метилирования ДНК-дуплекса (1)

г) R- отношение выхода нековалентного комплекса реагента с метилазами к выходу комплекса, образованного этой метилазой с каноническим субстратом (I); СсЫ5нМ;Се*100 нМ.

Чтобы получить правильные комплексы и исключить метилирование, связывание фермента с субстратом проводили в присутствии 0,1 мМ AdoHcy.

содержащих как неокисленные, так и окисленные остатки Tgal (табл.4). ДНК-дуплексы, содержащие остаток Tgal* непосредственно рядом с участком узнавания ферментов (дупл. 18*) и отделенный от него одним нуклеозидным остатком (дупл. 19*), достаточно эффективно метилируются обоими ферментами (табл.4). ДНК-дуплекс, содержащий остаток Tgal* в центре участка узнавания не метилируется M.EcoRIl и слабо метилируется M.A/val. Все три реагента (17*-19*) использовались для пришивки к M.£coRII и M.A/val.

Процесс ковалентного присоединения был оптимизирован и представлял из

себя инкубацию фермента с ДНК-дуплексом, содержащим диальдегидную группу в условиях образования нсковалентного комплекса в течение 5 мин. при комнатной температуре и 15 мин. при 0°С с последующим восстановленим, образовавшегося комплекса боргидридом натрия с конечной концентрацией 7,5 мМ в течение 1 часа. Образование ковалентного комплекса идентифицировалось при помощи 8% -ного ПААГ. содержащего 803 (рис.8). Выходы ковалентных комплексов М./я-оЯИ п М..\/га1 с реагентами 17*49* коррелируют с их способностью образовывать соответствующие нековалентные комплексы (табл. 4, 5) и повышаются при увеличении концентрации фермента (рис.8).

ковалентнын комплекс

Рис.8. Ковалентное присоединение М.£со1Ш к 19* (1-5: увеличение концентрации фермента: 0.35, 0.7, 1.58, 3.16,4.74 рМ); Са 2.3-Ю-7 М; С(Ас1оНсу)0.1 мМ; С(ЫаВН4) 3.75 мМ

Для М ЯсуЖН максимальные выходы ковалентного комплекса (30®») были получены при использовании реагента 19*, когда диальдегндная группа отделена от участка узнавания одним нуклеозидным остатком (табл. 5). Реагент 17* не метилируется М.£о;ГШ, но оказался способным эффективно образовывать ковалентнын комплекс с ферментом(табл. Б). Ковалентный комплекс М.СсоГШ с реагентом 18* не образовывался (данные не приводятся).

В случае \i.Mval образование ковалентных комплексов было обнаружено также только для реагентов 17* и 19*. Выходы ковалентных комплексов для М.Л/га! были несколько меньшими, чем для М.ЕгоШ! (табл. 5).

Для доказательства специфичности ковалентного присоединения были проведены эксперименты по проведению реакции в присутствии различных концентраций ДНК-дуплексов как содержащих участок узнавания (дупл. Ь), так и не содержащих его (дупл.табл. 5). В первом случае наблюдалось падение выхода продукта пришивки уже при низких концентрациях конкурентного ДНК-дуплекса,

тогда как ДНК-дуплекс, не содержащий участка узнавания, заметно подавлял процесс ковалентного присоединения лишь при больших собственных концентрациях (табл. 5).

Таблица 5.

Ковалентное присоединение М.£со1Ш и М.Мга1 к ДНК-дуплексам, _содержащим Тца!*.___

М.£соШ1 М .Муа1

Ковалентное присоединение в присутствии ингибитора Ковалентное присоединение! присутствии ингибитора

ДНК Степень Степень

дуплекс КП,% а> Ингибгор 6) отношенке [ингибитор]/ [субстрат] отн. степень КП КП, % а> Ингибтор 6) отношение [ингибитор]/ [субстрат] отн. степей КП

17* 20 15 Ь Ь 2 20 10 1 0.5 0.08 0.8 13

19* 30 ? 1 0.9 ¡3 (Б 2 1 0.75

и 20 0.1 и 20 0.2

10 1 10 0.4

а) Степень ковалентного присоединения (КП) определялась как отношение радиоактивности ковалентного комплекса к суммарной радиоактивности реакционной смеси.

б) 5' АССТАССТСвТССТ (и) , 5' СССААСССССТСТА (1 м) 3' ТССАТе<ЗАССАССА 3' СССГТСССССАСАТ

Таким образом, впервые с высокими выходами получены ковалентные комплексы метилаз £соЯП и М\>а\ с ДНК-дуплексами, содержащими диальдегидную группу, направленно вводимую в олигонуклеотидную цепь. Показано, что эти ДНК-дуплексы являются эффективными реагентами для аффинной модификации М.ЕсоЯП и М.АА'а1, позволяющими изучать районы белка, сближенные с ДНК в процессе специфического взаимодействия.

ВЫВОДЫ

1. С целью определения функционально-значимых групп атомов участка узнавания и его структурных перестроек при взаимодействии с М.£соЯП и М.Л/гл! проведен анализ связывания и метилирования этими ферментами направленно модифицированных ДНК-дуплексов - аналогов субстрата. Разработана методика определения эффективности метилирования каждой из цепей ДНК-дуплекса.

2. Выявлены группы атомов участка узнавания, необходимые для специфического взаимодействия М.£со1Ш и М.Муа1 с ДНК. Показано, что эти ферменты образуют дискриминационные контакты преимущественно с метилируемой цепью ДНК.

3. М.ЕсоЯН проявляет свойства, хорошо укладывающиеся в механизм предложенный для С5-метилаз: выпетливание метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК без нарушения структуры примыкающих пар нуклеотидов; в случае М.Л/иЛ метилирование субстрата сопровождается нарушением комплементационных взаимодействий в С:С-паре, содержащей метилируемый остаток цитозина, и в соседних с ней нуклеотидных парах.

4. В присутствии аналога кофактора Ас1оНсу на несколько порядков понижается константа диссоциации комплексов ТЛ.Мга\ с каноническим субстратом и теми из его аналогов, которые способны метилироваться.

5. Предложен новый тип реагентов для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз: на базе ДНК-дуплексов, содержащих остаток 1-(Р-0-галактопи-ранозил)тимииа, получен набор аналогов субстратов метилаз EcoR.II и А/«Л с реакционноспособной диальдегидноП группой.

6. Субстратные свойства ДНК-дуплексов, содержащих галактопиранозу и ее окисленное производное, зависят от положения модифицированного углеводного остатка: эффективность метилирования М.ЕсоКН и ЪЛ.МусА увеличивается при его удалении от участка узнавания.

7. Отработаны условия ковалентного присоединения реагентов к метилазам £соЯН и М\а\. Выход продукта реакции зависит от локализации диальдегидной группы в реагенте. Получены с высокими выходами ковалентные комплексы метилаз с ДНК-дуплексами, содержащими диальдегидную группу в центре участка узнавания и во фланкирующей его нуклеотидной последовательности.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. M.G.Brevnov. E.A.Kubareva, E.A.Romanova, E.M.Volkov, A.S.Karyagina, I.I. Nikolskaya, E.S. Gromova. The interaction of Mvaland SsoII DNA-methyitransferases with modified substrates. Third New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Vilnius, Lithuania, 1994, Abstracts, p.91.

2. M.G.Brevnov. E.A.Kubareva, E.A.Romanova, E.M.Volkov, E.S. Gromova,

Modified DNA duplexes as subt rates for Mval and SsoII DNA •methyltransferases.

Third IUBMB Conference on Molecular recognition, Singapore, 1995, Abstract Book, p.116.

3. M.G.Brevnov. E.A.Kubareva, E.A.Romanova, E.M.Volkov, A.S.Karyagina, I.I.Nikolskaya, E.S.Gromova. Interaction of the Mval and SsoII methyltransferases with DNAs altered at the central base pair of the recognition sequence. Gene, 1995, v. 157, N I-2. p. 149-152.

4. М.Г.Бревнов. Е.А.Кубарева, Е.М.Волков, Е.А.Романова, Т.С.Орецкая, Е.С.Громова, З.А.Шабарова. Влияние точечных модификаций углеводофосфатного остова на функционирование эндонуклеазрестрикции EcoRII, Mvalu BstNI. Молекулярная биология, 1995, т.29, N6, с. 1294-1300.

5. E.S.Gromova, M.G.Brevnov. O.M.Gritsenko, S.N.Mikhailov, O.V.Petrauskene, V.N.Tashlitsky. EcoRII restriction - modification enzymes: a kinetic model, novel substrate analogues. 1996 Meeting of Inter.Res.Scholars from the Baltics,Central Europe and the Former Soviet Union, Prague, 1996, Abstracts, p.68.

6. S.N.Mikhailov, E.V.Efimtseva, B.S.Ermolinsky, M.V.Fomicheva, O.M.Gritsenko, M.G.Brevnov. E.S.Gromova, G.Schepers, A. vanAerschot, P.Herdewijn. Regioselective incorporation of reactive dialdehyde groups into synthetic oligonucleotides. Collection Czech.Chem. Comm., 1996, Special Issue, 1996, V.61, p.210-

212.