Исследование функции фоторецепторного белка рековерина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СЕНИН ИВАН ИВАНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ ФОТОРЕЦЕПТОРНОГО БЕЛКА

РЕКОВЕРИНА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена в отделе энзимологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор П.П. Филиппов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Гусев кандидат химических наук, В.М. Петров

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится 29 октября 1996 г. в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д.053.05.47 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Лабораторный корпус "А", Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 27 сентября 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Ионы Са2+ и процессы фосфорилировапия/ дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных впешпих и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фупдаментатьпымЕ биологическими функциями, как клеточная пролиферация и дифферепцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пишент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдупин -цГМФ-фосфодиэстераза послужили прототипами для огромпого числа работ по системам рецептор - в-белок - эффекторпый белок, функционирующим в клетках других типов.

Многие эффекты Са2+ на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+- связывающими белками, мишенями для которых очень часто служат протеинкиназы и протеи нфосфатазы. Са^-с вязываюшим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилировапия/ дефосфорилировапия посвящено огромное число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении - исключение. К настоящему времени ясны общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвопочпых животных, в частности, доказана важность фосфорилировапия родопсина для аттенюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторепепторной клетки. Однако систематическое и интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрапсдукдии у позвоночных животных, в том числе - в регуляции фосфорилирования

зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), бьио начато лишь недавно, во многом благодаря обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина. Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что она в значительной степени заполняет пробел в понимании механизмов Са2+-зависимой ре1уляции фототрансдукции; кроме того, полученные данные важны для выяснения молекулярных оспов патологических состояний фоторецепторной клетки.

Цель работы. Цель настоящей работы - идентификация клеточпой мишени (или мишеней) рековерина и установление его функции в фоторецепторной клетке.

Научная новизна. К моменту начала настоящей работы имелись лишь предварительные указания на способность ионов Са2+ модулировать фосфорилирование родопсина в фоторецепторной клетке; функция обнаруженного 1991 г. нового фоторецепторного Са2+-связывагощего белка рековерина к этому моменту не была установлена. В настоящей работе продемонстрирована и детально исследована Са2+-зависимая регуляция фосфорилирования родопсина в наружных сегментах, палочки (НСП) сетчатки быка и доказано, что ингабирующий эффект ионов Са2+ па фосфорилирование родопсина опосредован рековерином. Установлено, что клеточными мишенями для рековерина могут служить родопсинкиназа, катализирующая фосфорилирование родопсина, и протеинфосфатаза 2А, отвечающая за дефосфорилирование фосфоопсина; эти данные, полученные in vitro, говорят о том, что рековерин in vivo может выполнять функцию "кальциевого сенсора" для указанных ферментов. Показано, что эффективность рековерипа как Са2+-зависимого ингибитора значительно

выше в реакции фосфорилироваиия "темпового", чем фотоактивированного родопсина; высказана оригинальная гипотеза, предполагающая, что одна из функций рековерина в фоторецепторпой клетке - предотвращение нежелательной реакции фосфорилироваиия "темнового" родопсина и тем самым создание благоприятных условий для выполнения родопсипкипазой ее основной функции - фосфоршшровапие фотовозбужденного родопсина. Получены рекомбннаптный немиристоилнрованнып и миристоилированный рековерин и показано, что 1Ч-концевое миристоилирование рековерина увеличивает его ингабирующую эффективность в реакции фосфорилироваиия родопсина родопсипкипазой.

Практическая ценность. Установление клеточных мишеней и функции рековерина в фоторецепторпой клетке нобходимы для понимания механизмов зрительной трансдукппи и выяснения молекулярных основ зрепия. Полученпые результаты важпы и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания устройства других сигнальных систем с участием сопряженных с О-бслками рецепторов, нарушение функционирования которых служит причиной разнообразных патологических состояний клетки.

Апробация работы состоялась на семинаре отдела энзнмологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 20 сентября 1996 г. н на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ 25 сентября 1996 г.

Материалы работы докладывались па конференции ФЕБО по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994 г.), на 1-ом Российско-Турецком симпозиуме по биотехнологии (Анкара, 1995 г.) и Международной конференции, посвященной 90-летию А.Н. Белозерского (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _

страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (176 ссылок). Диссертация иллюстрирована 40 рисунками и 4 таблицами.

Экспериментальная часть

НСП выделяли по методу Шнеткампфа (Schnetkamp et al., 1982).

Рековерин из НСП получали как описано в работе (Dizhoor et al., 1991) с некоторыми изменениями, рекомбинантные формы - согласно работе (Заргаров и др., 1996).

Родопсинкиназу выделяли как онисаио Пальчевским с соавт. (Palczewski et al., 1991) с модификациями.

Активность родопсинкиназы в суспензии НСП определяли согласно работе (Kawamura, 1993), в реконструированной системе - как описано в (Palczewski et al., 1991) с некоторыми изменениями.

Количественное определение фосфородопсина и фосфоопсина проводили в соответствии с работой (Dean, Akhtar, 1993).

Результаты и обсуждение

Глапа 1. Действие рековерина в реакции фоефоршшрования фотовозбуждеиного родопсина, катализируемой родопстпашазой

Первоначально предполагалось, что функция рековерина в фоторесенторной клетке состоит в Са2+-зависимой активации хуанилатциклазы (Dizhoor et al., 1991; Lambrecht, Koch, 1991). Однако к моменту начала настоящей работы было установлено, что эта точка зрения ошибочна (Hurley et al., 1993; Gorodovikova, Philippov, 1993). Предварительные данные, полученные в нашей лаборатории, указывали па то, что возможной мишенью для рековерина в НСП является рсдопсинкиназа (Gorodovikova, Philippov, 1993); об этом же говорили результаты японского автора (Kawamura, 1993), который исследовал функцию гомолога рековерина, S-модулнна, в фоторецепторах лягушки. Поэтому наша работа была начата с выяснения вопроса, влияет ли рековерин на фосфорилировапне родопснпа, катализируемое родопсинкиназой.

1.1. Изучение влияния реконерина на фосфорилирование фотовозбуждеиного родопсина в суспензии НСП

Установлено, что уровень фоефоршшрования светоактивированнош родопсина в суспензии НСП зависит от концентрации свободных ионов кальция ([Ca2+]f): он понижается при возрастании [Ca2+]f от 0.1 до 10 мкМ (рис. 1), при этом нолумаксимальный эффект проявляется при [Ca2+]f, равной 0.9 - 1.0 мкМ.

Влияние Са2+ на включения фосфата в фотовозбужденный родопсин (Rho*) в суспензии НСП практически полностью подавляется в результате

Рис. 1. Зависимость фосфорплирования родопсина от [Са2*^ (показаны средние значения (п=3)).

преипкубации реакционной смеси в присутствии антител (АТ) против рековсрииа, при этом фракция иммуноглобулинов, полученных от непммунизированного животного, влияния не оказывает (таблица 1).

Отсюда можно сделать вывод, что наблюдаемый эффект Са2+ на фосфорилирование родопсина в суспензии НСП опосредован присутствующим в суспензии "эндогенным" рековерином. Заметим, что в отсутствие Са2+ добавленный извне рековерин не оказывал влияния на реакцию фосфорилировапня, тоща как в присутствии Са2+ "экзогеппый" рековерин значительно уменьшал уровень фосфорплирования родопсина: в среднем добавление 5 мкМ рековерппа уменьшало включение фосфата в родопсин в 2 раза.

Таким образом, результаты экспериментов, приведенных па рис. 1 и в таблице 1, говорят о том, что ионы Са2+ пнгибируют фосфорилирование родопсина в суспензии НСП и этот эффект опосредован рековерином.

Таблица 1. Влияние антител против рсковерина на фосфорилировшше спетоактивировашюго родопсина в суспензии НСП.

Перед проведением реакции аликвоты суспензии НСП инкубировали в реакционной смеси для определения родопеинкиназной активности в темноте в течение 10 мин при 0 С в присутствии 0.05 мг ЛТ к рековерипу или контрольной сыворотки (фракция иммуноглобулинов, полученная от неиммунизпроватшх животных), затем еше 2 шт при 25 С; реакцию начинали световой вспышкой (100% обесцвечивания родопсина) и добавлением ЛТФ.

Добавки Включение 32Р в Шю* (ерм) в присутствии [Са2+]г = Кальциевый эффект(а)

1 нМ 5.6 мкМ А %

Контрольная сьшоротка 2050 1480 570 100(6)

АТ к рековерину 2120 2080 40 7

а) Разница (Д) между уровнями включения 33Р в Шю* в присутствии 1 нМ и 5.6 мкМ [Са2+]{ обозначена как "кальциевый эффект";

6> за 100% принято значения кальциевого эффекта в присутствии контрольной сыворотки.

Одпако на основании получеппых экспериментальных данных нельзя однозначно сказать, связан ли наблюдаемый эффект с Са2+-зависимьм ипгибированием родопсинкиназы рековерином или же с активацией этим белком протеинфосфатазы 2А, которая отвечает в фоторецепторпой клетке за дефосфорилирование фосфоопсина (РакгечузК а1., 1989).

Рис. 2. Зависимость включения 32Р в родопсин от времепи в суспензии НСП в условиях 0.2% обесцвечивания в присутствии 50 мМ NaF (1) или без него (т). Каждая точка соответствует среднему значению (п=3).

На рис. 2 видно, что первоначальное возрастание включения фосфата в родопсин через некоторое время сменяется уменьшением этого уровня; ингибитор протеипфосфатазы 2А, ИаР, полностью подавляет дефосфорилирование родопсина. Из рис. 2 также следует, что наблюдаемые скорости фосфорилирования и дефосфорилирования родопсина в суспензии НСП сопоставимы, так что обнаруженный эффект рековерина на уровень фосфорилирования родопсина может быть в равной степени обусловлен как его действием на активность родопсинкиназы, так и иротеинфосфатазы 2А.

Для выяснения вопроса о том, на какой из упомянутых процессов -фосфорилирование или дефосфорилирование родопсина - действует рековерин, мы провели эксперимент, в котором фосфорилировапие родопсина измерялось в присутствии 50 мМ Кар, т. е. в условиях, где фосфатазная активность была полность подавлепа (рис. 3). Видно, что в

[Рековерин], мкМ

Рнс. 3. Зависимость включения 33Р в родопсин от концентрации рековерина в суспензии НСП в условиях 100% обесцвечивания родопсина в приезтетвии 50 мМ Кар. Каждая точка соответствует среднему значению (п=3), в присутствии 200 мкМ [Са2+]г (]) или без пего (ш).

отсутствие Са2+ рековерин не влияет па процесс фосфорилирования, тогда как в присутствии Са2+ наблюдается иншбирование включения фосфата в родопсин тем большее, чем выше копцептрация "экзогенного" рековерина в реакционной смеси; величина К50 для рековерина составляет 6.5 мкМ.

Исследование влияния рековерина на активность фосфатазы 2Л показало, что в присутствии Са2+ "экзогенный" рековерпн в концентрации 7 мкМ в 2 раза увеличивает скорость дефосфорилирования фосфоопсина экстрактом НСП, содержащим протеинфосфатазу 2А (рис. 4).

Таким образом, мы установили, что рековерин обладает способностью Са2+ -зависимым образом ингибпровать фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкипазой, и активировать дефосфорилирование фосфоопсина под действием протеипфосфатазы 2А в суспензии НСП.

Ш

Рис. 4. Влияние рсковсрина на реакцию дсфосфоршшровшша фосфоопсина в суспензии НСП. Сходные значения (1) были получены в случаях, когда реакционная смесь содержала: а) < 1 нМ [Са ^ + 7 мкМ рековерин, 6) 0.5 мМ СаОг в отсугствие рсковсрина и в) < 1 нМ [Са2']( в отсутствие рековерина; (п) - реакционная среда содержала 0.5 мМ СаС12 + 7 мкМ рековерин.

Поскольку основной интерес для нас представлял механизм Са2+-зависимой регуляции передачи сигнала в фоторецепторной клетке, а родопсипкиназа представляет собой один из главных белков, участвующих в регуляции фототранедукции, в дальнейшей работе мы сосредоточили свое внимапне на исследовании Са2+-зависимого действия рековерина на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

1.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование родопсина в реконструированной системе

Результаты, полученные в предыдущем разделе, говорят о том, что рековерин способен Са2+-зависимым образом ингибировать фосфорилирование родопсина в суспензии НСП. Однако этот факт не

Рис. 5. Зависимость активности родопсинкнназы от в реконструированной

системе, содержащей отмьггые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсип), родопеишшназу ( 70 нМ) в присутствии (1) 10 мкМ рековерина пли без него (т). Каждая точка соответствует среднему значению (п=2).

исключал той возможности, что для проявлепия эффекта рековерина необходим дополнительный фактор (или факторы). Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть эту возможность, мы изучили способность рековерина ингибировать фосфорилировапие родопсина в реконструированной системе, состоящей из отмытых мочевиной фоторецепторных мембрап и очищенных препаратов родопсинкнназы и рековерина.

Оказалось, что в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, фосфоршшрование родопсина чувствительно к [Са уровень включения в Шю* уменьшался в 3 раза с увеличением [Са2+]г от 0.1 до 20 мкМ; полумаксимальный эффект проявлялся при [Са2+]^ равной 2 мкМ (рис. 5).

Рис. б демонстрирует зависимость фосфорилирования Шю* родопеннкиназой от количества присутствующего в реконструированной

[Рековерин], мкМ

Рве. 6. Зависимость фосфорилирования родопсина от концентрации рековерина в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП (10 мкМ родопсин), родопеникиназу (50 иМ) и рековерин. < 1 вМ (т) и 5.6 мкМ <1) [Са^й (о) - темновое фосфорилировавие.

системе рековерина. Видно, что (1) фосфорилировапие родопсина в реконструированной системе строго светозавпснмо; (2) в отсутствие рековерина уровень фосфорилирования не зависит от концентрации Са2+; (3) в отсутствие Са2+ уровень фосфорилировапия максимален и пе зависит от концентрации рековерина; (4) в присутствии Са2+ степень ингабироваиия фосфорилирования родопсина возрастает по мере повышения концентрации рековерина с полумаксимальным эффектом при концентрации рековерина, равной б мкМ.

Поскольку в отсутствие рековерина уровень фосфорклировапия родопсина максимален, а с увеличением его концентрации наблюдается прогрессивное ингибированне реакции, можно сделать вывод, что (1) в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, рековерин обладает способностью Са2+-зависимым образом ипгибировать фосфорирование

родопсппа и (2) что для проявления пнгпбирующего эффекта рековерина не требуется каких-либо дополнительных факторов.

В заключение главы, посвященной поиску клеточной мишепи для рековерина, суммируем основные выводы, которые могут быть сделаны из приведенных в пей экспериментов: (1) рековерип способеп ипгибировать родопснпкнназу и активировать протеннфосфатазу 2А; (2) оба эффекта являются Са2+-зависнмыми; (3) присутствие рековерина является необходимым и достаточным условием для проявления Са2+-зависимого ингпбировання фосфорилирования родопсина.

Глава 2. Влияние рековерина на фосфоршшровшше "темпового" и фотовозбужденного родопсина

Исследование фосфорилирования родопсина при низких (<0.01 %) уровнях его обесцвечивания в максимально пативпых НСП лягушки показало, что стехиометрия включения фосфата в родопсин в расчете па одпу молекулу Rho* может достигать 1000 - 1500, что во много раз превосходит количество остатков сернна и треонина в молекуле ппгмепта (Binder at al., 1990). Этот феномен, получивший название "фосфорплировапие с высоким выходом", объясняется тем, что наряду с фосфориляровапием фотовозбужденного родопсина, происходит также фосфорилпрованпе "темпового" ппгмента (Dean, Akhtar, 1993) .

Мы показали, что в присутствии Са2+ рековерип ингнбирует фосфорилировапие фотовозбужденного родопсина (см. рис. 3 и 6). В настоящем разделе мы сравнили эффективность рековерипа как Са -зависимого пгибитора родопсинкиназы в реакциях фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина.

2,1. Определение соотношения фосфородопсин/фосфоопсин при различных уровнях обесцвечивания родопсина

Рис. 7 демонстрирует, что в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП и родопсинкиназу, относительное включение фосфата в родопсин (Р1/Шго*) минимально и равно 2 при 100%-м обесцвечивании пигмента; максимальная стехиометрия (Р1/Шю*=90) наблюдается при 0.005%-м обесцвечивании родопсина. Мы провели также прямое определение соотношения количества фосфорилированного Шю* (фосфоопсина) и "темнового" родопсина (фосфородопсина) в реконструированной системе при различных уровнях обесцвечивания родопсина, используя способность фосфородопсина более прочно взаимодействовать с гидроксианатитом по сравнению с фосфопсином, и показачи, что соотношение фосфородопсишфосфоопсин возрастает более чем в 10 раз при понижении уровня обесцвечивания пигмента от 15 до 1%.

РнС. 7. Зависимость относительного включения 32Р в родопсин от уровня его обесцвечивания в реконструированвой системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу (100 нМ).

Таким образом, понижение уровня обесцнечивапия родопсина в реакционной смеси приводит к предпочтительному фосфоршшровапию "темпового" родопсина по сравпепию с фотовозбуждеппым пигментом.

2.2. Сравнение иншбирующей эффективности - рсконсрина в реакции фосфорилировашш "темпового" и фотовозбужденнЪго родопсина

Рис. 8 демонстрирует, что р. реакции фосфорилировапня родопсина величина К50 ингибирующего эффекта рековерина уменьшается с понижением уровня обесдвечивапия родопсина, причем максимальное значение К50 принимает при 100%-м обесцвечивании и соответствует 5 мкМ концентрации рековерина; мипимальпое значение К50 имеет место при 0.03%-ном обесцвечивании пигмента и составляет 0.8-1.0 мкМ. Т.е. в условиях низкого обесцвечивания родопсина, когда фосфорилнрование

Рис. 8. Зависимость К50 для эффекта рековерина в реакции фосфорилировання родопсина при различных уровнях обесцвечивания пигмента в реконструированной системе. Каждая точка прел стаял ела как среднее значение в трех независимых экспериментах (п=3).

т

4

Фосфоопсин ФОСФОРОДОПСШ!

Рис. 9. Влияние рековерипа па образование фосфородопсина и фосфоопсина в реакции фосфорилирования родопсина в условиях 3%-пого обесцвечивания пигмента в реконструированной системе. Столбцы 1 и 3 - образование фосфородопсина и фосфоопсина, соответственно, в отсутствие рсковерина; столбцы 2 и 4 - образование фосфоопсина и фосфородопсина, соответственно, в присутствии 4.4 мкМ рековерипа.

"темпового" родопсина преобладает над фосфорилироваяием Мю*, эффективность рековерипа как ингибитора активности родопсинкиназы возрастает в 5-6 раз.

Прямое определение количеств фосфоопсина и фосфородопсина (рис. 9), образовавшихся в процессе реакции в отсутствие или в присутствии рековерина, показало, что рековерин ингибирует фосфорилирование Шю* на 45%, товда как уровень фосфорклнрования "темнового" родопсина падает на 90%; т.е. и здесь рековерин болег эффективно ингибирует рододсинкиназу в реакции фосфорилирования "темнового" родопсина по сравнению с фосфоршшрованием Шю*.

Рис. 10 демонстрирует, что через 40 мин после начала реакции рековерин вызывает 50%-ное шгибирование фосфорилирования родопсина

Л

Время реакции, мин

Б

Время реакции, мин

Рис. 10. Влияние рековерина на кинетику фосфорилирования родопсина при 100%-м (А) и 0.2%-м (Б) обесцвечивании родопсина в присутствии (1) 5 мкМ рековерина или без него (та).

при полном обесцвечивании пигмента (А), тогда как при низком его обесцвечивании активность родопсипкипазы уменьшается на 90% (Б). Существенно, что на начальном этапе реакции (первые 2 мин) при обоих уровнях обесцвечивания родопсина ингибирующая эффективность рековерина практически одинакова, а различие в степени ингибирования проявляется позднее. Поскольку известно (Dean, Akhtar, 1994), что скорость фосфорилирования "темыового" родопсина родопсинкиназой примерно на два порядка ниже, чем скорость фосфорилирования Rho*, можно заключить, что при низком уровне обесцвечивания па начальном этапе реакции предпочтительно фосфорилируется Rho* и только позднее наблюдатся также и значительное фосфорилирование "темнового" родопсина; соответственно, ингабирующий эффект рековерина, слабо выраженный в начале реакции, усиливается со временем по мере возрастания доли "темнового" родопсина в реакционной смеси.

Итак, мы показали, что в реконструированной системе, содержащей отмьпые мочевиной мембраны НСП и очищенпую родопсинкиназу, рековерин более эффективно ингабирует фосфорилирование "темнового" родопсина по сравнению с таковым фотовозбуждеппого родопсина.

Далее аналогичное сравнение было проведено с использованием суспензии НСП.

2.3. Сравнение ингабирующей эффективности рековерина в реакциях фосфорилирования "темпового" и фотовозбужденного родопсииа в суспензии НСП

Выше уже указывалось, что в суспензии НСП присутствует фосфатазная активность, которая оказывает существенное влияние на включение фосфата в родопсин, поэтому в описанных ниже экспериментах при изучении влияния рековерина на активность родопсинкиназы

Рис. 11. Зависимость включения 32Р в родопсин от Еоцептрации рековерина в условиях 100% (гп) и 0.2% (1) обесцвечивания пигмента в суспензии НСП, содержащей 50 мМ Гчцр и 200 мкМ Са2+. За 100% принят уровень включения 32Р в родопсин в отсутствие "экзогенного" рековерина.

реакционная система содержала 50 мМ Кар для подавления фосфатазной активности.

Мы нашли, что максимальное "фосфорплироваиие с высоким выходом", равпое 35 Р1/Юю*, наблюдается при 0.2% обесцвечивании родопсппа в суспепзии, тогда как минимальпын уровепь фосфорилирования, равный 1.4Р1/Шю*, обнаруживается при полном обесцвечивании пишепта. Поскольку максимальное количество участков, которые могут быть модифицированы родопсинкиназой в Шю*, равно 9, то, очевидно, что при 0.2% обесцвечивании по крайней мере 26 фосфатных остатков включается в "темновой" родопспп. Следовательно, в суспепзии НСП, как и в реконструированной системе, при низком уровне освещения преобладает фосфоршшрование "темпового" родопсппа.

На рис. 11 видно, что в присутствии Са2+ величина К50 ингибирующего эффекта рековерина па активность родопсинкиназы понижается от 7 мкМ в случае полного обесцвечивания родопсина, т.е. в условиях, эде преобладает фосфорилирование Rho*, до 2.5 мкМ при 0.2% обецвечивании, т.е. в условиях, где преобладает фосфорилирование необеспеченного пипиента.

Таким образом, можно заключить, что в суспензии НСП, как и в реконструированной системе, рековерин с большей эффективностью ингибирует фосфорилирование "темнового" родопсина, чем фосфорилирование Rho*.

На этом основании и с учетом литературных данных об отсутствии влияния и АТФ-зависимой стадии в нисходящей фазе электрофизиологического ответа фоторецепторной клетки, мы высказали гипотезу о том, что указанный феномен может использоваться в условиях in vivo для предотвращения нежелательного фосфорилирования необесцвеченного родопсина и тем самым - создания условий для выполнения родопсинкиназой ее основной функции - фосфорилирование фотовозбужденного родопсина.

Глава 3. Влияние N-концевого миристоилирования рековерина на его эффективность как иншбитора родопсинкиназы

Несмотря на интенсивное исследования в целом ряде лабораторий, какие-либо данные по механизму ингибирующего действия рековерина в реакции фосфорилировапия родопсина, в частности, о роли N-концевого миристоилирования белка в этой реакции, в литературе отсутствовали. Поэтому мы провели сравнение ингибирующей эффективности рекомбинант-ных немиристоилированноп и мпристоишроваппой форм рековерина.

Нами была разработана схема экспрессии гена рековерина в клетках Е. coli. Удалось получить рекомбипазтные формы пемиристоилированного

Рис. 12. Зависимость акгавност родопсиикиназы от [Са2+]г в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП, родопсинкпназу и рекомбинантный мирстоияпрованный (1) илп пе;лкристонллровгнпий (о) рековерип. Концентрации миристоилированного и немиристоилнрованного рекомбинантного рсковерипа составляют 10 п 20 мкМ, соответственно; (т) - активность родопскпкипазы в отсутствие рековерина. Каждая точка соответствует среднему значению п=2-3; результаты представлены за вычетом "темповой" активности родопеинхидазы, которая не чуствительна к [Са2+];.

н миристоилированного рековерипа с чистотой более чем 99% и выходом свыше 5 мг/мл культуральпой среды. Рекомбинантный миристошгаровапный рековерин по ряду своих функциональных характеристик был близок к природному белку; в частности, в реакции фосфорнлирования родопсипа были получены близкие величины К50 по отношению к Са2+ (2 мкМ в обоих случаях) и но концентрации рековерина (1.3 п 0.9 мкМ для природного и рекомбинантного препаратов, соответственно).

Как. следует из рис. 12, кривые зависимости относительной активности родопсинкипазы от [Са2+^ дают одну н ту же величину К50, равную 2 мкМ, для миристоилнровапного и пемирнстоялированного препаратов рековерина. В случае миристоилированного рековерина наблюдалась кооперативность по

£

Рис. 13. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина в реконструированной системе, содержащей отмьпые мочевиной мембраны НСП, родоисишшназу и указанное на рисунке количество иемиристоилированиого ф или миристоилированного (о) рскомбинангаого рековерина при насыщающей мкМ. Каждая точка соответствует среднему значению п=2-3; результаты представлены за вычетом "темновой" активности родопсинкиназы, которая не чустантельна к [Са2*]^

Са2+ (коэффициент Хилла равен 1.7), которая отсутствовала в случае неми-ристоилированного белка (п=0.9). Характер зависимости ингибирующего эффекта рековерина на активность родопсинкиназы от его концентрации оказался различным в случае миристоилированного и немпристолированного препаратов (рис. 13), соответствующие величины по рековерину составляли 0.9 и 6.5 мкМ,

Таким образом, можно сделать вывод, что К-концевое мнристошшрованЕе рековерина увеличивает его эффективность как Са2+-зависимого ингибитора родопсинкиназы.

Выводы

1. Устаповлепо, что фупкцпопальпымп мтнепями для рековерппа

в НСП быка могут сложить родопсппкппаза и протсппфосфатаза 2А.

2+

2. Рсковерпп Са -залиспмым образом ипгпбпрует фосфорили-ропаппе родопсина, катализируемое родопепнкпназой.

3. Рековсрин Са2+-завнснмьм образом активирует дефосфорили-рование фосфоопсппа, катализируемое протеппфосфатазой 2А.

4. Рековерин более эффекгпвпо ингибпрует родопсинкиназу п реакции фосфорплировапия "темпового" родопсина, чем в реакции фосфорнлпровапия фотовозбужденного пигмента; высказана гипотеза о том, что одной из функций рековерппа в фоторецеиторпой клетке может быть предотвращение нежелательного фосфорплпрованпя "темпового" родоиспна родопеннкппазоп, находящейся в активированном состоянии.

5. Получены рекомбтшптпые - пемнрнстоалпроваппаз и мпрпс-тоилпровапная - формы рековерииа и показано, что 1Ч-копцевое мнрнстоплпроваппе рековерииа придает ему кооперативное поведение по отношению к попам Са2+ и увеличивает его эффективность как ингибитора родопепнкипазы.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Р.Р. Philippov, E.N, Gorodovikova, А.А. Gimelbrant, LI. Senin. Investigation of the function of a calcium-binding protein p26 or recoverin in bovine retina rod cell. Proceedings of FEBS special meeting "Biological membranes", Helsinki -Espoo, Finland, 1994, p. 555.

2. E.N. Gorodovikova, A.A. Gimelbrant, I.I. Senin, P.P. Philippov. Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cell. FEBS Lett. (1994), 349, 187-190.

3. E.N. Gorodovikova, I.I. Senin, P.P. Philippov. Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in reconstituted system consisting of photoreceptor membrane, rhodopsin kinase and recoverin. FEBS Lett. (1994), 353, 171-172.

4. I.I. Senin, A.A. Zargarov, A.M. Alekseev, E.N. Gorodovikova, V.M. Lipkin, P.P. Philippov. N-Myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. FEBS Lett. (1995), 376, 87-90.

li. AA. Zargarov, V.M. Lipkin, A.M. Alekseev, S.V. Shulga-Morskoy, P,P, Philippov, I.I. Senin, E.N. Gorodovikova. Functional studies of recoverin, calcium-binding protein from bovine rod outer segment, by the expression of the corresponding gene in E.coli. Euroasian symposium on current trends in biotechnology. Abstracts. Ankara, Turkey, 1995, p. 177.

6. P.P. Philippov, E.N. Gorodovikova, I.I. Senin, G.A. Belova, I.V. Mesyanzhinova, A.A. Zargarov. The function of recoverin in retina rod cell. Vlth International Conference: Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology. The Legasy of Audrey Belozersky. Abstracts. Moscow, Russia, 1995.

7. A.A. Заршров, И.И. Сеиин, A.M. Алексеев, C.B. Шулъга-Морской, П.П. Филиппов, В.М. Липкин. Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рековерина в клетках E.coli и сравнение их функциональной активности. Биоорганическая химия (1996) 22, 483-488.