Новый механизм Ca2+-зависимой регуляции родопсинкиназы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

НОВЫЙ МЕХАНИЗМ Са2+-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ РОДОПСИНКИНАЗЫ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Илья Игоревич

1 0 ш 2-?

005015819

Москва 2012

005015819

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук

Сенин Иван Иванович доктор биологических наук, профессор Филиппов Павел Павлович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Цетлин Виктор Ионович доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

имени В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 29 » мая 2012 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 27 » апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Рецепторы, сопряжённые с в-белками (СРСЯ), играют ключевую роль в межклеточных биохимических взаимодействиях, отвечающих за управление важнейшими физиологическими процессами, включая сердечную и легочную деятельность, пищеварение и воспалительные реакции, а также восприятие внешних сигналов, таких как свет, звук, запахи. Ключевым аспектом регуляции активности представителей семейства сопряжённых с в-белками рецепторов является их десенситизация, которая достигается в процессе их множественного фосфорилирования под действием протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками (СЯК), специфически распознающих и фосфорилирующих только активированные агонистами формы рецепторов. Нарушение регуляции десенсити-зации йРСЯ в настоящее время связывают с развитием таких патологий, как ночная слепота, хроническая сердечная недостаточность, гипертензия, опиатная зависимость, некоторые виды рака.

В большинстве клеток десенситизация ОРСН. является Са2+-чувствительным процессом, что является следствием Са -зависимои регуляции активности СЯК представителями семейства ЕР-Ьапс1-содержащих Са2+-связвывающих белков. Так, специфические для фоторецепторных клеток родоп-синкиназа (011К1) и С11К7 регулируются нейрональным Са2+-сеносором реко-верином, в то время как активность других протеинкиназ из семейства СТ<К (ОЯК2-6) регулируется универсальным медиатором клеточных сигналов кальция кальмодулином. Интенсивные исследования регуляции десенситизации ОРСГ1 в различных типах клеток показали, что Са2+-зависимая регуляция ОКК является намного более сложным процессом, чем считалось ранее и, в частности, может осуществляться одновременно несколькими Са2+-связывающими белками. Так, к моменту начала настоящей работы в литературе имелись сведения о том, что присутствующий в фоторецепторных клетках кальмодулин способен связываться с родопсинкиназой Са2+-зависимым образом. Однако функциональное влияние этого взаимодействия на фосфорилирование родопсина, ка-

тализируемое родопсинкиназой, оставалось неизвестным. В настоящей работе изучались способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы Са2+ -зависимым образом и структурные основы механизма ингибирования родопсинкиназы кальмодулином, а также участие кальмодулина в совместной с рековерином Са2+-зависимой регуляции активности родопсинкиназы.

Актуальность настоящей работы состоит в том, что в ней обнаружена новая функция кальмодулина в фоторецепторной клетке, в значительной степени расширяющая понимание механизмов Са2+ -зависимой регуляции фототрансдук-ции.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение роли кальмодулина в Са2+ -зависимои регуляции родопсинкиназы. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. изучить способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы Са2+-зависимым образом; установить участок связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы

2. исследовать возможность совместной регуляции родопсинкиназы кальмодулином и рековерином

3. изучить роль кальмодулина во взаимодействии родопсинкиназы с родопсином.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые показано участие кальмодулина в регуляции родопсинкиназы: продемонстрирована способность кальмодулина Са2+ -зависимо ингибировать родопсинкиназу и определены параметры этого ингибирования. Установлен участок связывания кальмодулина в родопсинкиназе и показано, что участки для связывания рековерина и кальмодулина в молекуле родопсинкиназы не перекрываются. Впервые изучено совместное действие кальмодулина и рековерина на активность родопсинкиназы и экспериментально доказан факт синергизма в ингибировании родопсинкиназы этими Са2+-связывающими белками. Впервые идентифицирован участок связывания родопсина в молекуле родопсинкиназы и

показано, что участки для связывания кальмодулина и родопсина в родопсинки-назе перекрываются. Предложена модель совместной Са2+-зависимой регуляции кальмодулином и рековерином светозависимого фосфорилирования родопсина под действием родопсинкиназы, основанная на конкуренции между Са2+-связывающими белками и фотоактивированным родопсином за взаимодействие с родопсинкиназой.

Практическая ценность. Установление механизмов десенситизации зрительного пигмента родопсина в фоторецепторных клетках необходимо для понимания механизмов зрительной трансдукции и выяснения молекулярных механизмов зрения. Полученные результаты имеют большое значение и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания регуляции процесса десенситизации других сопряжённых с О-белками рецепторов, которые являются фармакологическими мишенями для значительного количества используемых в терапевтической практике лекарственных препаратов.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждались на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и были доложены на заседании кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ. Отдельные аспекты работы представлялись на XXV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008), 13-й международной конференции по белкам сетчатки (Барселона, Испания, 2008), Европейской конференции по сет-чатке-2009 (Ольденбург, Германия), 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010), 11-й конференции Европейского кальциевого сообщества (Варшава, Польша, 2010). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 -в рецензируемых научных журналах, отвечающих требованиям ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка литературы (185 ссылок).

Содержание работы

1. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы кальмодулином

К моменту начала настоящей работы были получены предварительные сведения, указывающие на способность Са2+-связывающего белка кальмодулина образовывать Са2+-чувствительный комплекс с родопсинкиназой (Levay et al., 1998), однако какие-либо данные о физиологической значимости образования этого комплекса в фоторецепторной клетке в литературе отсутствовали. Поэтому наша работа была начата с выяснения вопроса, влияет ли кальмодулин на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

1.1. Изучение влияния кальмодулина на фосфорилирование родопсина

Установлено, что в реконструированной системе, состоящей из отмытых мочевиной фоторецепторных мембран и очищенных препаратов кальмодулина и родопсинкиназы, уровень фосфорилирования фотовозбуждённого родопсина зависит от концентрации свободных ионов кальция ([Са2+]своб.) - он понижается при возрастании [Са2+]сво6. от 10 нМ до 5 мкМ. Как следует из рис. 1А, Са2+-зависимость ингибирования фосфорилирования родопсина кальмодулином носит кооперативный характер (коэффициент Хилла (п) равен 1,5 ± 0,1), а полумаксимальное ингибирование (IC50) проявляется при [Са ]сво6. = 0,36 ± 0,03 мкМ.

Рис. 1Б демонстрирует зависимость фосфорилирования родопсина родопсинкиназой от концентрации кальмодулина в реконструированной системе. Видно, что (1) в отсутствие кальмодулина фосфорилирование родопсина не чувствительно к концентрации Са2+; (2) в присутствии EGTA уровень фосфорилирования родопсина максимален и не зависит от концентрации кальмодулина; (3)

А

Б

б

о

i fi

• 200 мкМ Са2' о 1 мМ EGTA

0,01 0,1 1 10 100 Концентрация свободного Са2'*, мкМ

0,01 0,1 1 10 100 Концентрация кальмодулина, мкМ

10 100

Рисунок 1. Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы кальмодулином в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине фоторсцепторныс мембраны и родопсинкиназу. А. Зависимость активности родопсинкиназы от [Са2+]Своб. в присутствии 30 мкМ кальмодулина (•) или в его отсутствие (о). Б, Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации кальмодулина при насыщающей концентрации [Са2+]СВоб (200 мкМ, •) или в присутствии 1 мМ EGTA (о). Точки на графиках вычислены как среднее ± стандартное отклонение по данным трёх независимых экспериментов.

в присутствии Са2+ уровень ингибирования фосфорилирования родопсина возрастает по мере повышения концентрации кальмодулина с полумаксимальным эффектом при концентрации кальмодулина, равной 14,1 ± 0,9 мкМ.

Таким образом, мы установили, что кальмодулин способен Са2+-зависимым образом ингибировать фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой, и что для проявления ингибирующего эффекта кальмодулина не требуется каких-либо дополнительных белковых факторов.

1.2. Выявление участков связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы

В предыдущем разделе было показано, что кальмодулин способен ингибировать родопсинкиназу Са2+-зависимым образом. С учетом полученных нами результатов и литературных данных об образовании Са2+-зависимого комплекса между кальмодулином и родопсинкиназой можно ожидать, что ингибирование фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой, происходит благодаря взаимодействию кальмодулина с участком(-ами) родопсинкиназы, от-ветственным(-и) за выполнение ферментом своей функции - фосфорилирования

фотовозбужденного родопсина. Поэтому далее мы провели поиск участков свя-

А

120 100 ¿80 5 60

5 40

20 0

В

120

100

¿80

§60 X

40 20 0

Ы-ЯК

С-КК

.100 | 75

б 50 I 25

5 0

1Ч-ЯК с-ик

120

100

о 80

с 60

X

о 40

20

0

ы-як

.100 | 75 I 50 х 25 6 О

ЧЛ N N

* V Л

100 200 300 Время, сек

О

200 300 Время, сек

400 500

О

125-175

100-150

с-100 ™ 75

I 50

I 25 О о

100 200 300 400

500

Рисунок 2. Сенсограммы спектроскопии вРИ, отражающие взаимодействие кальмодулина с рекомбинантными фрагментами родопсинкиназы, иммобилизованными на поперхности биосенсора: (А) М-концевой (М-ЮК., М1-0183) и С-концевой (С-МС, 1455-8561) регуляторные участки родопсинкиназы; (Б) 1Ч-КК. и его фрагменты, соответствующие остаткам М1-Ы02 и Ы02-0183; (В) Ы-ЯК и его фрагменты, соответствующие последовательностям 0100-У150 и Р125-К175. Полоса над сенсограммами Время, сек обозначает период времени, в течение ко-

торого в подвижной фазе отсутствовал (не закрашено) или присутствовал (закрашено черным) кальмодулин в концентрации 60 мкМ. Вставки в правом верхнем углу показывают относительную величину сигнала связывания, пропорциональную количеству связавшегося с фрагментами родопсинкиназы кальмодулина.

зывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы. Для решения поставленной задачи мы получили набор рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы и исследовали их способность взаимодействовать с кальмодулином с помощью биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса (БРЯ).

Из рис. 2А следует, что во взаимодействии с кальмодулином принимает участие только Ы-концевой (М1-0183) регуляторный участок родопсинкиназы. При этом, в указанном регуляторном участке родопсинкиназы содержатся низко- и высокоаффинный сайты для связывания кальмодулина, расположенные в пределах аминокислотных последовательностей МЫЛ02 и Ь102-0183, соответственно (рис. 2Б). С использованием перекрывающихся фрагментов Э100-У150 и Р125-К175 мы показали, что расположенный внутри последовательности

| 80 га а?

0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Концентрация кальмодулина, мкМ

Рисунок 3. Определение кажущихся констант диссоциации (I<D) комплексов кальмодулина с полноразмерным N-концевым регуляториым участком родоисинкиназы (N-RK, •) и с его фрагментами M1-L102 (Д), L102-G183 (■) и F125-K175 (V) методом SPR-спектроскопии. Через проточные ячейки SPR-биосенсора, на которые были иммобилизованы указанные фрагменты, пропускали растворы кальмодулина в различных концентрациях (от 10 до 150 мкМ) и регистрировали амплитуды SPR-сигнапа связывания в стационарном состоянии. Измеренные амплитуды были нормированы и нанесены на график в зависимости от концентрации кальмодулина в подвижной фазе. Полученные значения KD приведены в табл. 1.

L102-G183 высокоаффинный участок связывания кальмодулина ограничен последовательностью 150-175 N-концевого домена родопсинкиназы (рис. 2В). Стоит отметить, что все перечисленные фрагменты родопсинкиназы, подобно полноразмерной молекуле фермента, взаимодействовали с кальмодулином только в присутствии Са2+ (данные не приведены).

Для количественной характеристики термодинамических параметров взаимодействий фрагментов родопсинкиназы с кальмодулином мы определили равновесные константы диссоциации (KD) комплексов кальмодулина с теми фрагметами родопсинкиназы, которые продемонстрировали к нему значииель-ное сродство (рис. 3, табл. 1). Как видно из таблицы 1, значения KD комплексов кальмодулина с различными фрагментами N-концевого регуляторного участка родопсинкиназы уменьшаются с размером фрагмента. На основании полученных данных можно заключить, что в составе полноразмерного N-концевого регуляторного участка родопсинкиназы сайт связывания кальмодулина менее доступен для взаимодействия с кальмодулином, чем в составе короткого фрагмента

125-175.

Таблица 1. Равновесные константы Ранее нами было показано, что

родопсинкиназа образует Са2+-чувствительный комплекс с Са2+-связывающим белком рековерином, и в этом взаимодействии принимают участие аминокислотные остатки фермента, расположенные в последовательности 1-25 родопсинкиназы (КопнЯоу е1 а1., 2009). Поскольку фрагмент 1-102 родопсинкиназы оказался способен взаимодействовать и с кальмодулином (рис. 2Б), то можно было ожидать, что низкоаффинный участок связывания кальмодулина перекрывается с таковым для рековери-на, что приводило бы к конкуренции между двумя этими белками за связывание с мишенью. Для подтверждения или опровержения этой гипотезы, мы изучили способность кальмодулина взаимодействовать с рековерин-связывающим участком родопсинкиназы. Из рис. 4 следует, что в отличие от рековерина, кальмодулин не способен взаимодействовать с рекомби-нантным фрагментом родопсинкиназы 1-25. Таким образом, участки связывания кальмодулина и рековерина в ро-допсинкиназе не перекрываются.

Подводя итог текущему разделу настоящей работы можно заключить, что кальмодулин образует Са2+-чувствительный комплекс с родопсинкиназой посредством двух различных сайтов в молекуле фермента: низкоаффинного (К0 =

диссоциации комплексов кальмодулина

с фрагментами родопсинкиназы.

Фрагмент KD, мкМ

M1-G183 (N-RK) 63 ±3

M1-L102 54 ±2

L102-G183 23 ±2

F125-K175 17,0 ± 1,5

Кажущиеся равновесные константы диссоциации (Кп) были определены с помощью равновесного анализа как концентрации кальмодулина, необходимые для полунасыщения сигнала связывания.

Время, сек Рисунок 4. Сенсограммы SPR, отражающие взаимодействие кальмодулина (СаМ) и рековерина (Re) с иммобилизованным на сенсорном чипе фрагментом родопсинкиназы M1-S25. Измерения выполнены при [Са2+]Своб. = 2 мМ. Концентрация Са2+-связывающих белков составляла 40 мкМ. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствовали (не закрашено) или присутствовали (закрашено черным) рековерин или кальмодулин.

54 мкМ) и высокоаффинного (KD =17 мкМ), которые локализованы в последовательностях 26-102 и 150-175 в N-концевом регуляторном домене родопсинки-назы. Поскольку KD для низкоафинного участка связывания более чем в 5 раз превышает физиологическую концентрацию кальмодулина в фоторецепторных клетках (около 10 мкМ), в дальнейшем мы не рассматривали этот участок ро-допсинкиназы как имеющий физиологическую значимость в контексте Са2+-зависимой регуляции фермента.

В заключение главы, посвященной выяснению механизма Са2+/кальмодулин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, суммируем основные выводы, которые могут быть сделаны на основе приведенных экспериментов: кальмодулин ингибирует родопсинкиназу Са2+-зависимым образом; в молекуле родопсинкиназы, помимо сайта для связывания рековерина, присутствуют низкоаффинный и высокоаффинный сайты для связывания кальмодулина, при этом сайты для связывания кальмодулина и рековерина не перекрываются, что даёт основание предположить, что оба этих Са2+-связывающих белка могут одновременно взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибиро-вать её активность.

2. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы рековерином и каль-модулином

В предыдущей главе мы показали, что в присутствии Са2+ кальмодулин ингибирует фосфорилирование родопсина, при этом участки связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы не перекрываются с сайтом для связывания другого Са2+ -чувствительного ингибитора фермента - рековерина. В настоящем разделе мы изучили совместное влияние кальмодулина и рековерина на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

2.1. Изучение Са2*-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина в присутствии кальмодулина и рековерина

Рис. 5А демонстрирует, что в реакции фосфорилирования родопсина эффективность ингибирования родопсинкиназы эквимолярной смесью кальмо-дульна и рековерина выше по сравнению с эффективностью отдельно взятых белков: значения 1С50 для эквимолярной смеси кальмолулина и рековерина, а также кальмодулина и рековерина по отдельности составили 4,6 ± 0,2, 14,1 ± 0,9 и 5,8 ± 0,7 мкМ, соответственно. Полученный результат можно объяснить тем, что кальмодулин и рековерин связываются с различными участками родопсинкиназы, и ингибирование фермента происходит без конкуренции между связывающими белками, что создает условия для проявления синергизма при ингибировании фосфорилирования родопсина.

Рисунок 5Б показывает Са2+-зависимость совместного действия кальмодулина и рековерина на активность родопсинкиназы. Как следует из результатов эксперимента, кальмодулин оказывает ингибирующее действие при более низких концентрациях свободного Са2+, чем рековерин. Полумаксимальное ингибирование родопсинкиназы кальмодулином достигалось при 0,36 ± 0,03 мкМ концентрации

Са2+, в то время как ингибирующий эффект рековерина был полумаксимальным при 1,4 ± 0,1 мкМ Са2+. Совместное ингибирование родопсинкиназы 30 мкМ смесью кальмодулина и рековерина наблюдалось при полумаксимальной концентрации Са2+, равной 1,07 ± 0,15 мкМ, что близко к таковой для рековерина. Следует отметить, что профиль кривой Са2+-зависимости совместного ингибирования родопсинкиназы кальмодулином и рековерином также оказался близок по форме к

Са2+ -зависимости ингибирования родопсинкиназы одним рековерином (см. рис. 5Б). Этот факт свидетельствует о том, что Са2+-чувствительность совместного действия эквимолярной смеси кальмодулина и рековерина на родопсинкиназу ограничивается нижней границей Са2+-чувствительности рековерина.

Полученный результат можно объяснить, если предположить, что связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой носит последовательный характер и имеет место аллостерическая регуляция родопсинкиназы двумя Са2+-

12

О

1

о

А Кальмодулин + рековерин 1:1 "'I '1 ,гг,"1—.........—........т—

О

а Кальмодулин + рековерии 1:1

ГТТ|.........|.I ' """I-' I -Т-ГПТТТГ

0,01 0,1 1 10 100 Концентрация Саг*-связывающих белков, мкМ

10

100

0,01 0,1 1 10 100 Концентрация свободного Са2*, мкМ

Рисунок 5. Синергическое ингибирование родопсинкиназы кальмодулином и ре-коверином в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине фо-торецепториые мембраны и родопсинкиназу. А. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации кальмодулина (о), рековерина (□) или их эквимолярной смеси (Ж) при насыщающей [Са2+]иов (200 мкМ). Б. Зависимость активности родопсинкиназы в присутствии кальмодулина (о), рековерина (□) или их эквимолярной смеси (А) от [Са2+]св0б- Концентрация каждого Са2+-связывающего белка по отдельности или в смеси составляла 30 мкМ.

связывающими белками: связывание рековерина с родопсинкиназой изменяет конформацию Ы-концсвого домена родопсинкиназы таким образом, что приводит к экспонированию участка для связывания кальмодулина и создает необходимые условия для образования стабильного комплекса. Следует отметить, что одним из подтверждений высказанной гипотезы являются представленные в разделе 1.2. результаты, свидетельствующие об увеличении сродства кальмодулина к фрагменту родопсинкиназы, содержащему высокоаффинный участок связывания кальмодулина, при укорочении этого фрагмента: 63 мкМ для фрагмента 1-183 против 17 мкМ для фрагмента 125-175 (рис. 3 и табл. 1).

Для проверки нашего предположения о наличии аллостерической регуляции при взаимодействии кальмодулина и рековерина с родопсинкиназой, на следующем этапе нашей работы мы провели теоретические расчёты, позволяющие количественно описать механизм совместного ингибирующего действия кальмодулина и рековерина на фосфорилирование родопсина.

2.2. Теоретическая модель механизма последовательного связывания рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой

Представленные в предыдущих разделах работы результаты позволили нам разработать математическую модель совместной регуляции кальмодулином и рековерином Са2+-зависимого фосфорилирования родопсина, в основу которой были положены следующие экспериментально подтвержденные данные: (1) кальмодулин и рековерин имеют неперекрывающиеся между собой участки связывания в молекуле родопсинкиназы, (2) ингибирующая эффективность экви-молярной смеси кальмодульна и рековерина выше по сравнению с эффективностью отдельно взятых белков и (3) Са2+-чувствительность совместного действия эквимолярной смеси кальмодулина и рековерина на родопсинкиназу ограничивается нижней границей Са2+-чувствительности рековерина. С учетом полученных данных схема химических равновесий, описываемых изучаемую систему, может быть представлена следующим образом:

Ккс

як + пяс - ^ые-11сп

+ +

ш СаМ ш СаМ

КСаМ

ЛК-СаМ„ + п Яс • .....СаМ -ЯК-Яс

V"

^с СаМ

СаМ ]*с

11]

„ Са 0 Кс

Яс° + V Са > Яс

к Са [2] СаМ0 + w Са ■ СаМ > СаМ

На представленной схеме Са обозначает ион кальция, 11с и СаМ - Са2+-связанные состояния рековерина и кальмодулина, соответственно, Яс° и СаМ0 — их бескальциевые формы. Каждое из равновесий характеризуется своей собственной равновесной константой ассоциации (см. табл. 2).

Аппрооксимация экспериментальных данных, показанных на рис. 5А и 5В, с использованием модели Хилла для аллостерического связывания лигандов позволила определить значения констант и стехиометрических соотношений на схемах [1] и [2]. Так, константны КЛс и Ксам> характеризующие связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой, соответственно, были приняты

Таблица 2. Параметры равновесий, описывающих взаимодействия между родоп-синкиназой, рековерином, кальмодулином и ионами кальция.

Равновесная константа ассоциации Коэффициент Хилла

Обозначение Значение, М"1 Обозначение Значение

Ккс 1,7-105 п 1,6

КсаМ 7,1-104 ш 1,8

КясСаМ 2,7-105 - -

КсаМ 1*с 1,1-105 - -

V Са ГЧ!с 7,4-105 V 1,66

V Са ^СаМ 2,8-106 V/ 1,5

Параметры схем [1] и [2] были вычислены при аЯРКоксимации уравнением Хилла экспериментальных данных, показанных на рис. 5А и 5Б, за исключением значений параметров ККс сам и КСам яс, которые были оценены при анализе данных, приведённых на рис. 5А, принимая [Яс] = [СаМ] = 2,3 мкМ.

равными 1С50 зависимостей активности родопсинкиназы от концентрации реко-верина и кальмодулина, а стехиометрические коэффициенты пит- как коэффициенты Хилла этих зависимостей (рис. 5А). Аналогично, значения параметров ККсСа и КСамСа> а также стехиометрические коэффициенты уи№, характеризующие связывание ионов кальция с рековерином и кальмодулином, соответственно, были определены из Са2+-зависимостей активности родопсинкиназы в присутствии рековерина и кальмодулина (рис. 5Б).

Основываясь на экспериментальных данных, приведённых на рис. 5А, и приняв равновесные концентрации кальмодулина и рековерина в системе равными 2,3 мкМ, путём комбинации и преобразования математических выражений для констант равновесия мы рассчитали значения констант Кяс СаМ и КСам яс из схемы [1] (табл. 2). Согласно проведённым расчётам, связывание Са2+/рековерина с родопсинкиназой способствует последующему связыванию этого комплекса с Са2+/кальмодулином, что выражается в повышении значения константы равновесия Ксам яс по сравнению с КСаМ в 1,55 раза (табл. 2). Таким образом, результаты наших расчётов подтверждают, что рековерин и кальмоду-лин могут действовать согласованным образом, взаимно усиливая ингибирова-ние родопсинкиназы.

Подводя итог второму разделу настоящей работы, можно сделать вывод, что кальмодулин и рековерин синергически связываются с родопсинкиназой и ингибируют её активность, при этом взаимодействие родопсинкиназы с этими Са2+-связывающими белками носит последовательный характер: на первой стадии связывается рековерин, что способствует дальнейшему связыванию с образующимся комплексом кальмодулина.

3. Изучение роли кальмодулин-связывающего участка в функционировании родопсинкиназы

На основании первичной структуры и гомологии с другими протеинкина-зами из семейства вЯК в молекуле родопсинкиназы выделяют три функциональных домена: центральный каталитический домен, и фланкирующие его Ы- и С-концевой регуляторные домены. Несколько ранее опубликованных работ показали, что регуляторные домены родопсинкиназы могут быть вовлечены в распознавание этим ферментом своего субстрата - фотовозбуждённого родопсина. Однако, несмотря на интенсивное исследование механизмов фосфорилирования родопсина родопсинкиназой, до сих пор точно не установлены конкретные аминокислотные остатки, формирующие сайт для связывания родопсина в родоп-синкиназе. Представленные в разделе 1.2. результаты по связыванию кальмодулина с Ы-концевым регуляторным доменом родопсинкиназы позволили предположить, что механизм ингибирования фосфорилирования родопсина кальмо-дулином может состоять в конкуренции между кальмодулином и фотовозбуждённым родопсином за связывание с Ы-концевым регуляторным участком родопсинкиназы. Чтобы проверить высказанное предположение, мы провели сравнение способности различных фрагментов родопсинкиназы взаимодействовать с фотовозбуждённым родопсином, использовав метод спектроскопии вРЯ.

Как следует из рис. 6, среди фрагментов родопсинкиназы, охватывающих Ы-концевой (Ы-ЯК, М1-0183), каталитический (СаМИС, Е184-0454) и С-концевой (С-ЯК, 1455-8561) функциональные домены родопсинкиназы, взаимодействовать с фотовозбуждённым родопсином способен только фрагмент М-ЯК, содержащий участок связывания кальмодулина. Для дальнейшей локализации

участка связывания родопсина в N-концевом домене родопсинкиназы нами была получена серия фрагментов этого домена и изучена их способность взаимодействовать с родопсином методом спектроскопии SPR.

Рис. 7А демонстрирует, что связывание фотовозбуждённого родопсина происходило в значительной степени только с фрагментом L102-G183, а связывание с фрагментом MILI 02 было незначительным. Следовательно, именно фрагмент 102-183, содержащий кальмодулин-связывающий участок, отвечает за связывание родопсинкиназы с фотовозбуждённым родопсином. Изучение способности взаимодействовать с родопсином перекрывающихся фрагментов D100-VI50 и F125-K175, охватывающих последовательность 102-183, показало (рис. 7Б), что из этих двух фрагментов только последний взаимодействует с родопсином. Все изложенные выше результаты были также подтверждены альтернативным методом - с помощью светозависимого аффинного соосаждения солюбили-зированного родопсина и фрагментов родопсинкиназе на глутатионсефарозе (данные не приведены).

Следует также отметить, что в выявленной нами последовательности родопсинкиназы F150-K175, узнающей фотовозбуждённый родопсин, содержится большая часть аминокислотных остатков Y167, Q173, W174 и LI77. Мутации по аналогичным остаткам в протеинкиназах GRK5 и GRK6, гомологичных родопсинкиназе, как недавно было показано (Baameur et al., 2010), приводят к потере

Время, сек

Рнсунок 6. Сенсограммы спектроскопии вРИ, отражающие взаимодействие фотопозбуждснпого родопсина с Х-копцевым (1Ч-ШС, М1-С183), каталитическим (СаМЖ, Е184-Ц454) и С-концевым (С-ЯК, 1455-8561) функциональными доменами родопсинкиназы. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствовали (не закрашено) или присутствовали (закрашено черным) фрагменты, родопсинкиназы.

300

250

<В 200

о. 150

с

га

X 100

s

О 50

0

-50

N-RK

102-183

.1-102

-50

50 100 Время, сек

150

зоо ■

250 ■

_ 200 ■

5 150 • х

100 ■ 50 0

200 -50

о

О

N-RK 125-175

100-150

50 100 Время, сек

150

200

Рисунок 7. Сенсограммы спектроскопии SPR, отражающие взаимодействие фотовозбуждённого родопсина с фрагментами N-концевого регуляторного участка ро-допсинкиназы. Приведены зависимости резонансного сигнала связывания от времени, полученные при пропускании 6,5 мкМ солюбилизированного фотовозбуждённого родопсина через проточные ячейки с иммобилизованными N-концевым регуляторным участком родопсинкиназы (N-RK, аминокислотные остатки M1-G183) и его фрагментами M1-L102 и L102-G183 (А) и D100-V150 и F125-K175 (Б). Сигнал с контрольной поверхности, покрытой GST, был вычтен из сигналов с остальных дорожек. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствовал (не закрашено) или присутствовал (закрашено черным) родопсин.

способности этих ферментов фосфорилировать активированные рецепторы. Поэтому с учётом литературных данных и представленных в настоящем разделе результатов можно заключить, что аминокислотные остатки родопсинкиназы Y167, Q173, W174 и L177 принимают участие во взаимодействии родопсинкиназы с фотовозбуждённым родопсином.

Таким образом, на основании результатов, представленных в настоящей главе, можно сделать вывод о том, что высокоаффинный участок связывания кальмодулина, расположенный в молекуле родопсинкиназы со 150 по 175 аминокислотные остатки, принимает участие во взаимодействии фермента с родопсином.

Выводы

1. Кальмодулин Са2+-зависимым образом ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

2. Участки связывания рековерина и кальмодулина в родопсинкиназе не перекрываются и расположены в пределах 1-25 и 150-175 аминокислотных остатков фермента, соответственно.

3. Связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой происходит последовательно: сначала образуется комплекс родопсинкиназы с рекове-рином, с которым затем происходит связывание кальмодулина.

4. Кальмодулин и рековерин синергически ингибируют фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

5. Участки связывания родопсинкиназы с родопсином и кальмодулином перекрываются и локализованы в пределах последовательности 150-175 аминокислотных остатков фермента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Komolov К.Е., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M.P., Churumova V.A., Grigoriev I.I.. Akhtar M., Philippov P.P., Koch K.W. (2009) Mechanism of rho-dopsin kinase regulation by recoverin. J. Neurochem,, 110, 72-79.

2. Сенин И.И., Тихомирова Н.К., Чурюмова В.А., Григорьев И.И.. Колпакова Т.В., Зинченко Д.В., Филиппов П.П., Зерний Е.Ю. (2011) Последовательности двух иммунодоминантных эпитопов рековерина принимают участие в Са2+/рековерин-зависимом ингибировании фосфорилирования родопсина. Биохимия, 76, 406-413.

3. Zernii E.Y., Komolov К.Е., Permyakov S.E., Kolpakova Т., Dell'orco D., Poetzsch A., Knyazeva E.L., Grigoriev I.I.. Permyakov E.A., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.W. (2011) Involvement of recoverin C-terminal segment in recognition of the target enzyme rhodopsin kinase. Biochem. J., 435, 441-450.

4. Grigoriev I.I.. Senin I.I., Tikhomirova N.K., Komolov K.E., Permyakov S.E., Zernii E.Y., Koch K.W., Philippov P.P. (2012) Synergetic effect of recoverin and calmodulin on regulation of rhodopsin kinase. Front. Mol. Neurosci., 5, 28.

5. Григорьев И.И., Ковалева H.A., Комолов K.E., Чурюмова В.А., Тихомирова Н.К., Сенин И.И. Роль N-концевого домена родопсинкиназы в механизме ее функционирования. Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», подсекция «Цикл наук о живом», стр. 268.

6. Komolov К.Е., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I.. Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15- 19, 2008, p.101.

7. Konstantin E. Komolov, Ivan I. Senin, Nadezda A. Kovaleva, Mathias Christoph, Valeriya A. Churumova, Ilva I. Grigoriev. Pavel P. Philippovm Karl-Wilhelm Koch. Turning off light-activated rhodopsin in rod cells - critical role of a ternary protein complex. European Retina Meeting 2009, October 8-10, Oldenburg, Germany. SP2-P09.

8. Ковалева H.A., Григорьев И.И.. Чурюмова B.A., Сенин И.И., Филиппов П.П. Изучение функциональных свойств рековеринсвязывающего участка родопсинкиназы. 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция молодых учёных «Биология — наука XXI века», апрель 2010, Пущино. Сборник тезисов, т.1., стр. 32.

9. Т.В. Колпакова, Е.Ю. Зерний, ЕЛ. Князева, С.Е. Пермяков, Е.А. Пермяков, Д.В. Зинченко, И.И. Григорьев. И.И. Сенин, П.П. Филиппов. С-концевой сегмент в регуляции функционирования нейронального кальциевого сенсора рековерина. 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», апрель 2010, Пущино. Сборник тезисов, т.1., стр. 33.

Ю.Ковалева Н.А., Чурюмова В.А., Григорьев И.И. Механизм действия рековерина в реакции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсин-киназой. Материалы Международного молодежного научного форума «Ло-

моносов-2010», секция «Биоинженерия и биоинформатика», подсекция «Физико-химическая биология».

П.Колпакова Т.В., Зерний Е.Ю., Григорьев И.И.. Сенин И.И., Зинченко Д.В., Пермяков С.Е., Князева E.JI. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина. Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010», секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнологии».

12.Tatiana V. Kolpakova, Evgeni Yu. Zernii, Konstantin E. Komolov, Sergei E. Permyakov, Ekaterina L. Knyazeva, Dimitri V. Zinchenko, Ilya I.Grigoriev. Eugene A. Permyakov, Ivan I. Senin, Karl-W. Koch, Pavel P. Philippov. C-terminal segment of recoverin as a built-in modulator of neuronal calcium sensor functioning. 11th Meeting of the European Calcium Society, Warsaw, Poland, September 6th-9th, 2010. Abstracts. Session 4: Calcium signaling. P4.22

Заказ № 154-П/04/2012 Подписано в печать 25.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

¿ГЧ\ "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

, ^,)) л\>\т>. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

61 12-2/417

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Илья Игоревич

НОВЫЙ МЕХАНИЗМ Са2+-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ

РОДОПСИНКИНАЗЫ

02.00.10 - биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук Сенин Иван Иванович доктор биологических наук, профессор

Филиппов Павел Павлович

Москва 2012

Оглавление

Список сокращений......................................................................................6

Введение.........................................................................................................8

1. Обзор литературы: «Родопсинкиназа как представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками»...................................10

1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками, и их протеинкиназы.....10

1.1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками...................................10

1.1.2. Десенситизация рецепторов, сопряжённых с О-белками.....13

1.1.3. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками...........................................................................................................16

1.2. Экспрессия вИК в различных клетках и тканях..........................17

1.3. Структурная организация протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками................................................................................18

1.4. Устройство генов, кодирующих протеинкиназы О-белок-сопряжённых рецепторов.................................................................................23

1.5. Внутриклеточная локализация протеинкиназ О-белок-сопряжённых рецепторов.................................................................................24

1.6. Механизм активации протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками, активированными рецепторами...................................................26

1.7. Регуляция активности протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками...........................................................................................................33

1.7.1. Аутофосфорилирование и фосфорилирование под действием других протеинкиназ.....................................................................................34

1.7.2. Са2+-зависимая регуляция.........................................................38

1.7.3. Другие механизмы регуляции активности ОМС....................41

1.8. Родопсинкиназа и фосфорилирование родопсина........................41

1.8.1. Общая схема фототрансдукции...............................................41

1.8.2. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и его фосфорилирование........................................................................................44

1.8.3. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой... 47

1.8.4. Рековерин как Са -сенсор родопсинкиназы..........................48

2. Материалы и методы..............................................................................53

2.1. Использованные материалы и бактериальные штаммы..............53

2.2. Приготовление Са -буферных растворов.....................................54

2.3. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки.....................55

2.4. Получение фоторецепторных мембран, отмытых мочевиной или гипотоническим буфером.................................................................................55

2.5. Очистка родопсинкиназы из наружных сегментов палочек........56

2.6. Очистка кальмодулина из мозга быка............................................57

2.7. Приготовление химически компетентных бактериальных клеток .............................................................................................................................58

2.8. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК..........59

2.9. Выделение плазмидной ДНК..........................................................59

2.10. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка рекомбинантного рековерина...........................................................................60

2.11. Определение активности родопсинкиназы.................................62

2.12. Получение рекомбинатных фрагментов родопсинкиназы........63

2.12.1. Конструирование генов, кодирующих фрагменты родопсинкиназы в виде химерных белков с глутатион 8-трансферазой. 63

2.12.2. Отбор клонов............................................................................64

2.12.3. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка химерных белков 08Т-МС..............................................................................................65

2.13. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса..........67

2.13.1. Иммобилизация рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы на поверхности сенсорного чипа....................................67

2.13.2. Изучение взаимодействия фрагметов родопсинкиназы с кальмодулином и родопсином.....................................................................68

2.13.3. Определение констант диссоциации комплексов кальмодулина с фрагментами родопсинкиназы.........................................69

2.14. Метод аффинного соосаждения....................................................70

2.15. Аналитические процедуры............................................................71

2.15.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле....................................71

2.15.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия........................................................72

2.15.3. Иммуноблоттинг......................................................................72

2.15.4. Измерение концентрации белков...........................................73

3. Результаты и обсуждение.......................................................................75

3.1. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы кальмодулином......75

3.1.1. Изучение влияния кальмодулина на фосфорилирование родопсина.......................................................................................................75

3.1.2. Выявление участков связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы.............................................................................................78

3.1.2.1. Изучение взаимодействия 1\Г- и С-концевого регуляторных доменов родопсинкиназы с кальмодулином.................81

3.1.2.2. Изучение взаимодействия фрагментов ]Ч-концевого домена родопсинкиназы с кальмодулином............................................82

3.1.2.3. Изучение взаимодействия кальмодулина с рековерин-связывающим участком родопсинкиназы..............................................86

3.2. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы рековерином и кальмодулином..................................................................................................88

3.2.1. Изучение Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина в присутствии кальмодулина и рековерина.............................88

3.2.2. Теоретическая модель механизма последовательного связывания рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой...................92

3.3. Изучение роли кальмодулин-связывающего участка в функционировании родопсинкиназы..............................................................96

3.4. Заключение.....................................................................................105

Выводы.......................................................................................................107

Приложение...............................................................................................108

Список литературы...................................................................................112

Список сокращений

нкс нсп

ПЦР Трис АТР АСС

Нейрональные кальциевые сенсоры Наружный сегмент палочки Полимеразная цепная реакция Трис(гидроксиметил)-аминометан Аденозинтрифосфат Суперсемейство протеинкиназ А, О и С

5,5'-дибромо- 1,2-бис(о-амино-5-бромофенокси)этан-^К,К',1Ч'-

ВАРТА

[Са ]Своб.

БМ

БТТ

ЕБС

ЕБТА

ЕвГА

С-белок

Са

Сру

СРСЯ

СЯК

С8Т

СТР

НЕРЕ8

1С50

1РТС

Кв

п

N118

2+

тетрауксусная кислота Концентрация свободного Сах Додецил-Р-Б-мальтозид Дитиотреит

1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид К,М,№,№-этилендиаминтетрауксусная кислота Этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир)-1М,К,]Ч',М'-

тетрауксусная кислота

Белок, связывающий гуаниловые нуклеотиды

а-субъединица й-белка

(Зу-субъединицы О-белка

Рецепторы, сопряжённые с в-белками

Протеинкиназы рецепторов, сопряжённых с О-белками

Глутатион Э-трансфераза

Гуанозинтрифосфат

4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота

Концентрация полумаксимального ингибирования

Изопропил-Р-Б-тиогалактозид

Равновесная константа диссоциации

Коэффициент Хилла

]М-гидроксисукцинимид

РН-домен PIP2 PMSF RH-домен

Rho

Rho*

RK

SPR

TEMED

Домен гомологии с плекстрином (англ. Pleckstrin Homology)

Фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат

Фенилметилсульфонилфторид

Домен гомологии с белками-регуляторами сигналов, передаваемых G-белками (англ. 'Regulator of G Protein Signaling Homology') Родопсин

Фотовозбуждённый родопсин Родопсинкиназа

Поверхностный плазмонный резонанс 1Ч^,]\[',1чГ-тетраметилэтилендиамин

Введение

Ключевые аспекты функционирования нейронов, начиная от передачи нервного импульса и заканчивая экспрессией генов, регулируются за счёт изменения концентрации свободного кальция. Эффекты кальция на различные внутриклеточные процессы опосредуются Са2+-связывающими белками, принадлежащими преимущественно к суперсемейству ЕБ Иапё-содержащих белков. Важнейшим свойством этих белков является способность изменять свою конформацию при связывании катиона, что придаёт им способность связываться с различными белками-мишенями и регулировать их активность, тем самым передавая сигнал Са2+ различным эффекторным молекулам. Среди последних можно выделить семейство протеинкиназ рецепторов, сопряженных с в-белками (ОМС), функция которых состоит в фосфорилировании агонист-связанных форм в-белок-сопряжённых рецепторов, за счет чего инициируется выключение передачи сигнала от рецептора к в-белку.

В клетках большинства тканей эффекты Са2+ опосредуются, в основном, повсеместно представленным универсальным кальциевым сенсором кальмодулином. Однако в нейронах экспрессируются дополнительные Са -чувствительные белки, которые принадлежат к семейству нейрональных кальциевых сенсоров (НКС). Эти белки регулируют различные аспекты функционирования нейронов, в том числе высвобождение нейромедиаторов, регуляцию ионных каналов и рецепторов, контроль транскрипции генов, рост и выживание нейронов. НКС обеспечивают тонкую настройку регуляторных механизмов, запускаемых изменениями в уровне кальция в нейронах, в то время как кальмодулин работает больше как универсальный сенсор сигналов кальция.

Некоторые из белков-мишеней являются общими и для кальмодулина, и для белков из семейства НКС, и в ряде случаев было показано, что они конкурируют за одни и те же сайты связывания в молекулах-мишенях. Поскольку концентрация кальмодулина в нейронах сопоставима с уровнем экс-

прессии белков семейства НКС, кальмодулин и НКС могли бы конкурировать между собой за взаимодействие с эффекторными молекулами. В этом случае одним из возможных механизмов, лежащих в основе эффективного функционирования НКС, может быть различное сродство НКС и кальмоду-лина к ионам кальция, позволяющее кальмодулину и НКС регулировать определенные белки-мишени в различных диапазонах цитоплазматической концентрации кальция. В дополнение к конкурентной регуляции, основанной на различной Са -чувствительности, эффективное функционирование НКС и кальмодулина может осуществляться за счет их взаимодействия с белками-мишенями посредством различных участков связывания.

Типичным представителем семейства нейрональных кальциевых сенсоров является рековерин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки. Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции активности родопсинкиназы (вЯЮ или МС) - фермента, который осуществляет быстрое выключение фотоактивированного родопсина путём его множественного фосфорилирования. Са2+-зависимое ингиби-рование фосфорилирования родопсина происходит при непосредственном взаимодействии родопсинкиназы и рековерина.

В то время как активность протеинкиназ ОЫК1 и ОЛК7 регулируется Са /рековерином, активность других незрительных протеинкиназ из семейства ОЛК регулируется Са /кальмодулином. При этом к моменту начала настоящей работы в литературе имелись сведения о том, что кальмодулин спо-

о а-

собен Са -зависимым образом связываться с родопсинкиназой. Однако информация о влиянии кальмодулина на функциональную активность родопсинкиназы, то есть на способность фермента фосфорилировать фотоактивированный родопсин, отсутствовала. Настоящая работа посвящена изучению роли кальмодулина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы и исследованию совместной регуляции родопсинкиназы кальмодулином и рековерином.

1. Обзор литературы: «Родопсинкиназа как представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками»

Настоящий обзор описывает имеющиеся на текущий момент в научной литературе сведения о структуре и функции протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками, а также о регуляции их активности и участии белков из этого семейства в различных физиологических процессах.

1.1. Рецепторы, сопряжённые с G-белками, и их протеинкина-зы

Рецепторы, сопряжённые с гетеротримерными G-белками (англ. 'G protein-coupled receptor', GPCR) присутствуют на поверхности практически всех клеток многоклеточных организмов и играют ведующую роль в межклеточной сигнализации. Различные субтипы GPCR отвечают за восприятие как сигналов из внутренней (гормонов, нейротрансмиттеров, хемокинов), так и из внешней (обонятельных, вкусовых и световых стимулов) среды организма. GPCR представляют собой наиболее обширный класс фармакологических мишеней, активность которых призваны модулировать до 40% применяемых в клинической практике лекарственных препаратов. Лекарства, вызывающие активацию GPCR, часто запускают механизмы выключения активности рецепторов, которые ограничивают эффективность действия лекарств, особенно при хроническом лечении. Поэтому существует большой интерес к пониманию того, как регулируется активность GPCR, обусловленный стремлением к разработке лекарственных препаратов, способных избегать этого регулирования.

1.1.1. Рецепторы, сопряжённые с G-белками

Рецепторы, сопряжённые с G-белками - наиболее многочисленное суперсемейство белков-рецепторов клеточной поверхности [1]. В геноме человека в настоящее время насчитывают более 800 генов, кодирующих такие ре-

цепторы [2]. Данные рецепторы служат для восприятия огромного количества биологически активных молекул, таких как биогенные амины (дофамин, норадреналин, серотонин, гистамин), нуклеотидные и аминокислотные ней-ротрансмиттеры (аденозин, глутамат, у-аминомасляная кислота), пептидные и белковые гормоны (опиоиды, тахикинины, нейротензин, соматостатин, хо-лецистокинин и большинство либеринов), хемокины и липидные производные (сфингозин-1-фосфат, лизофосфатидная кислота, эйкозаноиды) [3] [4]. GPCR являются посредниками множества физиологических процессов в различных системах организма, играют фундаментальную роль в восприятии света, запаха, вкуса, а также в регуляции сердечного ритма, кровяного давления, иммунного ответа и метаболизма глюкозы [5].

GPCR характеризуются общей пространственной структурой, включающей семь трансмембранных а-спиралей, соединенных тремя цитоплазма-тическими и тремя внеклеточными петлями, а также N- и С-концевые хвосты (рис. 1). На основании такой топологии рецепторы данного семейства в литературе также часто именуют семи-трансмембранными рецепторами. Когда подходящая молекула-агонист связывается с лиганд-связывающим карманом, расположенным во внеклеточном домене рецептора, внутриклеточный домен рецептора изменяет свою конформацию, формируя с внутриклеточной стороны поверхность для белок-белковых взаимодействий, которая недоступна в неактивном состоянии рецептора [6]. Такой «активированный рецептор» может взаимодействовать с белком, связывающим гуаниловые нуклеотиды (G-белком). G-белки являются гетеротримерами и состоят из а-, (3- и у-субъединиц. а-субъединица отвечает за связывание GDP и GTP и гидролиз GTP, в то время как (3- и у-субъединицы связаны в прочный (Зу-комплекс, который функционирует как единое целое [7]. К настоящему времени установлено, что каждая из этих субъединиц является членом семейства генов; на текущий момент известны 16 а-, 5 |3- и 12 у-субъединиц.

Активированный рецептор инициирует обмен гуаниловых нуклеотидов G-белком, вызывая диссоциацию GDP и связывание GTP, что приводит к

11

Внеклеточное пространство

Цитоплазма

Рисунок 1. Общий вид пространственной структуры рецепторов, сопряжённых с G-Щлками на примере структур 02 - адр ei юр ег / сит ори человека (слева, PDB 2RH!) н родопсина быка (справа. PDB IF88). В виде линии, соединяющей Си-атомы, показан общий ход иолипеитидной цепи белкой. Градиентная окраска от синего к красному символизирует переход от N-конца к С-концу. Атомы связанных с рецепторами а гони сто в (5)-каразолола (слева) и полиостью-транс-ретиналя (справа) показаны в виде ван-дер-Ваальсовых сфер. Серым показано предполагаемое расположение фосфолипидпого бислоя.

диссоциации G-белка на активированную Ga-субъединицу и Gßy-димер. Освобождённые субъединицы G-белка, в свою очередь, регулируют активность одного или нескольких эффекторов: Ga-субъединицы из подсемейства Gas стимулируют аденилилциклазу [8], а белки из подсемейства Gct; её ингиби-руют [9]; активация Ga4 соггряжена с активацией фосфолипазы Cß [10]; некоторые другие а-субъединицы модулируют активность cGMP-фосфодиэстераз, кальциевых ионных каналов [11]. В конечном счёте, изменение активности эффекториых ферментов или ионных каналов изменяет внутриклеточную концентрацию вторичных мессенджеров — молекул или ионов, которые опосредуют клеточный ответ на связывание агониста с

р2-Адренергический рецептор

Клеточный ответ

Рисунок 2. Классический пример передачи сигнала рецептором, сопряжённым с G-белком, па примере ¡И-адренорецептора [5]. В отсутствие аюниста GPCR находится в неактивном сост�