Ca2+/рековерин-зависимая регуляция фототрансдукции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СЕНИН ИВАН ИВАНОВИЧ Са2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФОТОТРАНСДУКЦИИ

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2008

003170011

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А Н Белозерского МГУ имени М В Ломоносова

Официальные оппоненты.

доктор химических наук, академик РАН, профессор Мирошников Анатолий Иванович

доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация Институт молекулярной биологии имени

В А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 3 июня 2008 г в 16 часов на заседании совета Д501 001 41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени MB Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А H Бечозерского МГУ, аудитория 501

С диссертациеи можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан 2 мая 2008 г

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Ионы кальция и процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фундаментальными биологическими функциями, как клеточная пролиферация и дифференцировка, иммунитет, транспорт Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - грансдуцин -сОМР-фосфодиэстерала послужили прототипами для огромною числа работ по системам рецептор - О-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов

Многие эффекты Са2+ на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+-связывающими белками, мишенями для которых очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы Са2*"-связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования/дефосфорилирования посвящено огромное число работ, фоторецепторная клетка в этом отношении была исключение К моменту начала настоящей работы были ясна общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвоночных животных, в частности, доказана важность фосфорилирования родопсина для аттенюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторецепторной клетки Однако систематическое и интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе - в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато благодаря обнаружению в 1991 году Са2+ -связывающего белка реховсрина, функция которого к моменту начала настоящей работы не была установлена

Рековерин - родоначальник белков семейства нейрональных Са2+-сенсоров,

как и остальные представители этого семейства, содержит на 1^-конце

миристоильныи остаток В свободном от Са2+ состоянии миристоильныи остаток

рековерина погружен в гидрофобный "карман" белка, вследствие чего рековерин

находится в растворимой фазе В присутствии Са2+, благодаря экспонированию

3

\ /

у

миристоильного остатка из гидрофобного "кармана", рековерин транслоцируется из раствора на мембрану Этот механизм, получивший название Са2+-миристоильного переключателя, впервые описан для рековерина и позднее - также для других нейрональных Са2+-сенсоров

Актуальность данной работы обусловлена тем, что к моменту начала работы отсутствовала информация о (i) функции рековерина в фоторецепторных клетках и (и) механизме Са2+-миристоильного переключателя рековерина и других представителей семейства нейрональных Са2+-сенсоров и о роли каждого Са2+-связывающего центра белка в работе этого механизма

Цель н задачи исследования Цель настоящей работы - изучение рековерина из фоторецепторных клеток быка В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи

1 Идентификация клеточной мишени (или мишеней) рековерина и установления его функции в фоторецепторной клетке

2 Исследование механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина Научная иовизна В настоящей работе продемонстрирована и детально исследована Са2+ -зависимая регуляция фосфорилирования родопсина в наружных сегментах палочки (НСП) сетчатки быка и доказано, что ингибирующий эффект ионов кальция на фосфорилирование родопсина опосредован рековерином Установлено, что клеточной мишенью для рековерина служит родопсинкиназа, эти данные говорят о том, что рековерин т vivo выполняет функцию «кальциевого сенсора» для родопсинкиназы Показано, что эффективность рековерина как Са2+ -зависимого ингибитора значительно выше в реакции фосфорилирования «темнового», чем фотоактивироваиного родопсина, высказана оригинальная гипотеза, предполагающая, что одна из функций рековерина в фоторецепторной клетке -предотвращение нежелательной реакции фосфорилирования «темнового» родопсина и тем самым создание благоприятных условий для выполнения родопсинкиназой ее основной функции - фосфорилирование фотовозбужденного рековерина Показано, что N-концевое миристоилирокание рековерина увеличивав! ею ин1 ибирующую эффективность в реакции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой Наши данные также показывают, что холестерин, входящий в состав фоторецепторных мембран, способствует связыванию рековерина с мембранами и усиливает ингибирование родопсинкиназы посредством сдвига полумаксимального эффекта

4

ингибирования родопсинкшшы в сторону низких значений концентраций свободного кальция и рековерина

Установлена специфическая роль каждого из двух функционирующих в рековерине Са2'-связывающих центров (ЕР2 и ЕГЗ) в механизме его Са2*-миристоилыгого переключателя Получены прямые экспериментальные доказательства последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерина ионами кальция Обнаружено, что для функционирования механизма последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерин должен быть миристоилирован Определены кинетические параметры, характеризующие взаимодействие рековерина с искусственными липидными мембранами Впервые продемонстрировано, что Са2+-связывающий центр ЕР2 рековерина непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка, а также Са2+ -зависимое ингибировапие родопсинкиназы рековерином Методом рентгено-структурного анализа охарактеризована пространственная структура мутанта рековерина с выключенным ЕР2, что позволило выявить последовательность структурных перестроек в молекуле белка, сопутствующие процессу экспонирования миристоильного остатка при последовательном заполнении кальцием Са2+-связывающих центров рековерина

Выявлена роль функционального четвертого Са2+-связывающего центра рековерина Установлена функция реконструированного Са2+-связывающего центра ЕР4 в процессе связывания рековерина с фоторецепторной мембраной и в процессе ингибирования фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой Получены прямые экспериментальные доказательства того, что активный Са2+-связывающий центр ЕР4 в молекуле рековерина может функционально компенсировать отсутствие связывания ионов кальция в третьем, но не во втором Са2+-связывающем центре Получено независимое доказательство гипотезы о том, что второй Са2+-связывающий центр молекулы рековерина контролирует время нахождения белка на мембране, а следовательно и Са2+ -зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином

Показано, что нарушение регуляции рековерином фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой может лежать в основе молекулярных

механизмов патогенеза таких заболеваний сетчатки, как пигментный ретинит и паранеоготастическая ретинопатия Практическая значимость работы

Установление клеточных мишеней и механизма функционирования рековерина в фоторецепторной клетке необходимы для понимания механизмов зрительной трансдукции и выяснения молекулярных основ зрения Полученные результаты важны и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка стужит удобной моделью для понимания устройства других сигнальных систем с участием сопряженных с G-белками рецепторов, нарушение функционирования которых служит причиной разнообразных патологических состояний клетки Апробация работы Результаты работы были доложены на семинарах НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ (НИИФХБ МГУ) и отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, а также на конференции ФРКО по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994), 1-ом Российско-Турецком симпозиуме по биотехнологии (Анкара, 1995), Международной конференции, посвященной 90-летию А Н Белозерского (Москва, 1995), на Международной конференции «Retinal proteins» (Япония, 1998), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001 и 2002), на III съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 6-ой Международной конференции по молекулярной биологии памяти В А Энгельгардта (Санкт-Петербург - Москва, 2003), 8-м Европейском симпозиуме по Са2+-связывающим белкам в норме и при патологии (Великобритания, 2004) Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 стагья в рецензируемых журналах

Структура и объем работы Диссертация изложена на 239 страницах машинописного текста, содержит 81 рисунок и 8 таблиц Диссертация состоит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы Библиографический указатель включает 317 цитированных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I Действие рековерина в реакции фосфорилирования фотовозбужденного

родопсина, катализируемой родопсинкиназой

Первоначально предполагалось, что функция рековерина в фоторецепторной клетке состоит в Са2'-зависимой активации гуанилатциклазы (Dizhoor et а!, 1991, Lambrecht and Koch, 1991) Однако к моменту начала настоящей работы было установлено, что эта точка зрения ошибочна (Hurley et al, 1993, Gorodovikova and Phihppov, 1993) Предварительные данные, полученные в нашей лаборатории, указывали на то, что возможной мишенью для рековерина в НСП является родопсинкиназа (Gorodovikova andPhilippov, 1993), об этом же говорили результаты японских авторов (Kawamura, 1993), которые исследовали функцию гомолога рековерина, S-модулина, в фоторецепторах лягушки Поэтому наша работа была начата с выяснения вопроса, влияет ли рековерин на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой

II Изучение влияния рековерина на фосфорилирование фотовозбужденного

родопсина в суспензии НСП Установлено, что уровень фосфорилирования светоактивированного родопсина (Rho*) в суспензии НСП зависит от концентрации свободных ионов кальция ([Ca2+]f) он понижается при возрастании [Ca2+]f от 0 1 до 100 мкМ (рис 1), при этом полумаксимальный эффект приходился на [Са2+]г= 15-2 мкМ

Влияние Са2+ на включения фосфата в Rho* в суспензии НСП практически полностью подавляется в результате преинкубации реакционной смеси в присутствии антител (AT) против рековерина, при этом фракция иммуноглобулинов, полученных от неиммунизированного животного, влияния не оказывает (таблица 1)

Отсюда можно сделать вывод, что наблюдаемый эффект Са2+ на фосфорилирование Rho* в суспензии НСП (рис 1) опосредован присутствующим в суспензии "эндогенным" рсковерином Заметим, что в отсутствие Са2+добавленный извне рековерин не оказывал влияния на реакцию фосфорилирования, тогда как в присутствии Са2+ "экзогенный" рековерин значительно уменьшал уровень фосфорилирования Rho* в среднем в присутствии 5 мкМ рековерина величина включения фосфата в Rho* снижалась в 2 раза (данные не представлены)

¡-

О

|Са2+]Г, мкМ

Рис.1. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от [Са'^ в суспензии НСП

Таблица 1 Влияние антител против рсковерина на фосфорилирование родопсина в суспензии НСП

№ Добавки Включение 3*Р(срм) в присутствии [Са2+], 1 нМ 5,6 мкМ Эффект кальция'"' Д %

1 2115±80 1080±110 1035 100(,)

2 Контрольная сыворотка 2050±60 1170±60 880 85

3 АТ к рековерину 2170±40 1980±70 190 18

Перед проведением реакции аликвогы суспензии НСП инкубировали в реакционной смеси для определения родопсинкиназной активности в темноте в течение 10 мин при 0°С в присутствии 0 05 мг АТ к рековерину или контрольной сыворотки (фракция иммуноглобулинов, полученная от неиммунизированных животных), затем еще 2 мин при 25°С, реакцию начинали световой вспышкой (100% обесцвечивания родопсина) и добавлением АТФ

а) Разница (Д) между уровнями включения ИР в родопсин в присутствии 1 нМ и 5 6 мкМ [Са2+]г обозначена как "эффект кальция",

61 за 100% принято значения кальциевого эффекта в отсутствии добавок

Таким образом, результаты экспериментов, приведенных на рис 1 и в табл 1, говорят о том, что Са2+ ипгибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой в суспензии НСП и этот эффект опосредован рековерином 1.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование родопсина в

реконструированной системе Результаты, полученные в предыдущем разделе, свидетельствуют в пользу того, что рековерин способен Са2+-зависимым образом ингибировать фосфорилирование родопсина в суспензии ПСП Однако этот факт не исключал той возможности, что для проявления эффекта рековерина необходим дополнительный фактор (или факторы), присутствующий в суспензии Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть эту возможность, мы изучили способность рековерина ингибировать фосфорилирование родопсина в реконструированной системе, состоящей из фоторецепторных мембран, содержащих родопсин, и очищенных препаратов родопсинкиназы и рековерина

Оказалось, что в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, фосфорилирование Юта* чувствительно к уровень включения 32Р в К1ю*

уменьшался в 5 раз с увеличением [Са2+]г от 0 1 до 200 мкМ, полумаксимальный эффект проявлялся при [Са2+]ь равной 2 мкМ (рис 2А)

Рис 2Б демонстрирует зависимость фосфорилирования Шю* родопсинкиназой от количества присутствующего в реконструированной системе рековерина Видно, что (1) в отсутствие рековерина уровень фосфорилирования Юю* не зависит от концентрации Са2+, (2) в отсутствие Са2+ уровень фосфорилирования Шю* максимален и не зависит от концентрации рековерина, (3) в присутствии Са2+ степень ингибирования фосфорилирования Шю* возрастает по мере повышения концентрации рековерина с полумаксимальным эффектом при концентрации рековерина, равной 6 мкМ

Поскольку в отсутствие рековерина >ровень фосфорилирования родопсина был максимален, а с увеличением концентрации рековерина наблюдалось прогрессивное ингибирование реакции, можно сделать вывод, что (1) в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, рековерин обладает способностью Са2,-зависимым образом ингибировать фосфорилирование Шю* и (2) что для проявления ингибирующего эффекта рековерина не требуется каких-либо

ICaiT|fi мкМ рековерин], мкМ

Рис 2. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от (А) [Ca2+]f в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу (70 нМ), в присутствии (•) или в отсутствие (о) 20 мкМ рековерина, (Б) концентрации рековерина в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин), родопсинкиназу (70 нМ), рековерин, а также < 1 нМ (о) или 5 6 мкМ (•) [Ca2+]f дополнительных факторов

Следует, однако, иметь в виду, что даже при использовании реконструированной системы взаимодействие рековерина и родопсинкиназы происходит в присутствии фоторецепторной мембраны, которая представляет собой липидный матрикс с включенными в него белками, представленными на 95% родопсином (Ovchinmkov, 1982) Существуют основания полагать {Kuhn, 1980), что большинство, а возможно и все процессы, имеющие прямое отношение к фототрансдукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране, образно говоря, в "двумерном пространстве", а не в цитоплазме Поэтому в основе обнаруженной нами способности рековерина ингибировать родопсинкиназпую активность может лежать как прямое взаимодействие рековерина с родопсинкиназой, так и более сложные механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану, в свою очередь фоторецепторная мембрана может участвовать в этих механизмах либо только своим липидным матриксом, либо только родопсином, либо обоими этими компонентами Приводимые ниже эксперименты указывают на то, что рековерин способен взаимодейс!вовагь одновременно как с родопсинкиназой, так и с фоторецепторными мембранами

13 Влияние N-концевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы

Известно, что для связывания рековерина с фоторецепторными мембранами необходимо присутствие N-концевого миристоилирования, удаление которого сопровождается потерей способности рековерина взаимодействовать с мембраной Са2+ -зависимым образом (Dizhoor, 1993) Поэтому мы провели исследование влияния N-концевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы

Нами была разработана схема экспрессии гена рековерина в клетках Е coli В результате удалось получить рекомбинантные формы немирисгоилированного и миристоилированного рековерина с чистотой более чем 99% и выходом более 5 мг/мл культуралыюй среды Рекомбинантный миристоилированный рековерин по ряду своих функциональных характеристик был близок к природному белку, в частности, в реакции фосфорилирования Rho* были получены близкие величины Kso по отношению к Са2+ (2 мкМ в обоих случаях) и по концентрации рековерина (6 и 5 4 мкМ для природного и рекомбинантното препаратов, соответственно) (данные не представлены)

Как следует из рис ЗА, кривые зависимости относительной активности родопсинкиназы от [Ca2+]f дают одну и ту же величину К50, равную 2 мкМ, для миристоилированного и немиристоилированного препаратов рековерина В случае миристоилированного белка наблюдалась кооперативность по Са2+ (коэффициент Хилла равен 1 7), которая отсутствовала в случае немиристоилированного белка (п=0 9) Однако, как следует из рис ЗБ, миристоилированный рековерин обладает большей ингибируюгцей эффективностью по сравнению с пемиристоилировапным белком величины К50 по рековерину составляли 5 4 и 19 мкМ, соответственно

Таким образом, результаты экспериментов, представленных в настоящей главе, говорят о том, что N-концевое миристоилирование рековерина придает ему кооперативное поведение по отношению к ионам Са2+ и увеличивает его эффективность как ингибитора родопсинкиназы

По литературным данным (Dizhoor, 1993), N-концевое миристоилирование

Рис 3. Зависимость относитетьной активности родопсинкиназы от (А) в

реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу (70 нМ), в присутствии 100 мкМ немистоилированного (•) или миристоилированного (о) рековерина, (Б) концентрации миристоилированного (•) или немистоилированного (о) рековерина в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин), родопсинкиназу (70 нМ), рековерин, а также

200 мкМ [Са2*]г_

рековерина необходимо для его Са -зависимого связывания с фоторецепторной

мембраной В тоже время, как мы указывали выше, присутствие М-миристоильного

остатка не есть необходимое условие для взаимодействия рековерина с

родопсинкиназой Сопоставление этих двух фактов в свете обнаруженного нами

усиления ингибирующей способности рековерина в результате его №ацилирования

позволяет предполагать, что фоторецепторная мембрана, с которой рековерин

предпочтительно взаимодействует с помощью своего ацилированного М-конда,

важна для функционирования системы, состоящей из родопсина (субстрата),

родопсинкиназы (фермента, регулирующего активность фотовозбужденного

родопсина и, соответственно, передачу сигнала в каскаде Ию*—>трансдуцин—

>ФДЭ) и рековерина (кальциевого сенсора родопсинкиназы)

1 4 Влияние содержания л о честерина фоторецепторных мембран на

взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования

родопсина

Мембрана фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сегментах палочки, имеет следующий фосфолипидный состав фосфатидилэтаноламин (40%),

фосфатидилсерип (14%), фосфатидилхолин (40%) и фосфатидшшнозит (2,5%) (Fliesler and Anderson, 1983) Кроме того, обнаружена проегранственная гетерогенность содержания холестерина в мембранах дисков НСП Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится подавляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% ог общего количества липидов, в то время как па диски у окончания НСП (апикальные диски) - всего лишь 5% (Boesze-Battaglia et al, 1990) Изменение содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран оказывает существенное влияние на кинетику передачи светового сигнала в фосфодиэстеразном каскаде увеличение содержания холестерина ингибирует активность сОМР-фосфодиэстеразы и препятствует образованию фотовозбужденного родопсина (Boesze-Baltagha et al, 1990) Эти данные указывают на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП Так, автором работы (Schnapf 1983) обнаружено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую амплитуду, нежели ответ, регистрируемый у его основания Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина Однако какие-либо экспериментальные данные о возможном влиянии содержания холестерина на процесс выключения зрительного каскада, а именно фосфорилирование светоактивированного родопсина родопсинкиназой и Са2+-зависимую регуляцию этого процесса рековерином, к моменту начала данной работы в литературе отсутствовали

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования Rho* были получены фоторецепторные мембраны с различным содержанием холестерина от 4,1 до 29,6%, при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина.

Установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество миристоилированного рековерина, связанного с мембранами НСП, повышалось в 3-4 раза (рис 4)

Мы также исследовали зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от концентрации миристоилированного рековерина при различных концентрациях

о 20 40 60 80 100

[Родопсин], мкМ

Рис. 4. Связывание миристоилированного рсковсрина с фоторецепторными мембранами, содержащими различное количество холестерина

холестерина в мембранах НСП в условиях постоянной концентрации Полумаксимальная величина ингибирования (1С50) родопсинкиназы составляла 6,6 цМ рековерина в присутствии необработанных мембранах НСП (14% холестерина) Положение Ю50 сдвигалась в сторону более высоких значений при понижении содержания холестерина в мембранах НСП (рис 5А)

На рис 5Б представлен график зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Са2+ при различном содержании холестерина в мембранах, из которого следует, что при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величина 1С50 сдвигается в область более низких значений Са2+, а именно уменьшается от 4,31 цМ до 0,82 цМ

Наши результаты предполагают, что высокая концентрация холестерина способствует связыванию рековерина с мембранами В одной из последних работ (Йпме/, 2005) обнаружены факты, указывающие на наличие градиента рековерина в НСП, причем большая его часть находится в базальной части этой структуры Таким образом, градиент рековерина соответствует градиенту холестерина в НСП, что подтверждает наши результаты о влиянии холестерина на способность рековерина взаимодействовать с мембранами Кроме того, повышение концентрации холестерина усиливает ингибирующую способность рековерина в отношении

14

Рис 5 Зависимость относительной активности родопсинкиназы от концентрации миристоилированного рековерина (Л) и от концентрации Ca1* (Б) при различном содержании

холестерина в мембранах_

родопсинкиназы Это происходит в результате сдвига полумаксимального эффекта

ингибирования родопсинкиназы в сторону низких концентраций свободного Са2+ и

рековерина

В настоящее время в литературе широко обсуждается явление светозависимой транслокации сигнальных белков в мембранах дисков НСП (Sokolov et al, 2002) Возможность транслокации связывают с существованием особых мембранных доменов, нерастворимых в детергенте, или, так называемых, рафт-структур Рафт-структуры, обнаруженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина, сфинголипидов и фосфолипидов с длинными ненасыщенными жирнокислотными остатками (Martin et al, 2005) Светозависимая транслокация в рафт-структуры была продемонстрирована для трансдуцина (Seno et al, 2001), cGMP-фосфодиэстеразы (Liu et al, 2003) и сплайс-варианта аррестина р44 (Nair et al, 2002) Наши данные указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур

В соответствии с хорошо описанным градиентом холестерина в НСП (для базальных дисков до 30%, для апикальных - до 5%) регуляция родопсинкиназнои активности посредством рековерина также является гетерогенным процессом, а именно, в базалыюй части НСП эффективность ингибирующего действия рековерина выше Полученные нами результаты т vitro объясняют опубликованные ранее

(iSchnapf, 1983) наблюдения m vivo о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП являегся более длительным процессом по сравнению с таковым в их апикальной части

2. Сравнение влияния рековерина на фосфорилирование "темпового" и фотовозбуяеденного родопсина

Исследование фосфорилирования родопсина при низких (<0 01%) уровнях обесцвечивания родопсина в максимально нативных НСП лягушки выявило, что стехиометрия включения фосфата на одну молекулу Rho* может достигать 1000 -1500, что во много раз превосходит количество остатков серина и треонина в молекуле родопсина (Binder et al, 1990) Этот феномен, получивший название "фосфорилирование с высоким выходом", объясняется именно тем, что наряду с фосфорилированием фотовозбужденного родопсина, происходит также фосфорилирование "темпового" родопсина

Мы показали, что в присутствии Са2+ рековерин ингибирует фосфорилирование Rho* В настоящем разделе мы исследовали влияние рековерина на фосфорилирование "темнового" родопсина и сравнили эффективность рековерина как Са2+ -зависимого ингибитора родопсинкиназы в реакциях фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина

21 Определение соотношения фосфородопсин/фосфоопсин при различных

уровнях обесцвечивания родопсина

Рис 6 демонстрирует, что в реконструированной системе, содержащей

отмытые мочевиной мембраны НСП и родопсинкиназу, общее включение 32Р в

родопсин падает при уменьшении количества обесцвеченного родопсина, при этом

относительное включение фосфата (Pi/Rho*) минимально и равно 2 при 100%-ном

обесцвечивании, максимальная стехиометрия (Pi/Rho*=90) наблюдается при 0 005%-

ном обесцвечивании родопсина Мы провели также прямое определение

соотношения количества фосфорилированного Rho* (фосфоопсина) и "темнового"

родопсина (фосфородопсипа) в реконструированной системе при различных уровнях

обесцвечивания родопсина, используя способность фосфоопсина более прочно

взаимодействовать с гидроксиаппатитом по сравнению с фосфоопсином, и показали,

л

Уровень обесцвечивания родопсина, %

Рис. 6 Зависимость относительного включения ,2Р в родопсин от уровня обесцвечивания родопсина в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу(100 нМ)

что соотношение фосфородопсин фосфоопсин возрастает более чем в 10 раз при понижении уровня обесцвечивания пигмента от 15 до 1% (данные не представлены)

Таким образом, понижение уровня обесцвечивания родопсина в реакционной смеси приводит к предпочтительному фосфорилированию "темнового" родопсина по сравнению с фотовозбужденным пигментом

2 2 Сравнение ингибирующей эффективности рековерина в реакции фосфорилировапия "темнового" и фотовозбужденного родопсина в

реконструированной системе Рис 7 демонстрирует, что в реакции фосфорилировапия родопсина величина К^о ингибирующего эффекта рековерина уменьшается с понижением уровня обесцвечивания родопсина, причем максимальное значение К50 принимает при 100%-ном обесцвечивании и соответствует 5 мкМ концентрации рековерина, минимальное значение К5о имеет место при 0 03%-ном обесцвечивании пигмента и составляет 0 81 0 мкМ Те в условиях [шзкого обесцвечивания родопсина, когда фосфорилирование "темнового" родопсина преобладает над фосфорилированием Шю*, эффективность рековерина как ингибитора активности родопсинкиназы возрастает в 5-6 раз

Прямое определение количеств фосфоопсина и фосфородопсина (рис 8), образовавшихся в процессе реакции в отсутствие или в присутствии рековерина, показало, что рековерин ингибирует фосфорилирование Rho* на 45%, тогда как уровень фосфорилирования "темнового" родопсина падает на 90%, те и здесь рековерин более эффективно ингибирует родопсинкиназу в реакции фосфорилирования "темнового" родопсина по сравнению с фосфорилированием Rho*

Итак, в реконструированной системе рековерин более эффективно ингибирует фосфорилирование "темнового", чем фотовозбужденного родопсина Далее аналогичное сравнение было проведено с использованием суспензии НСП

Мы нашли, что максимальное "фосфорилирование с высоким выходом", равное 35 Pi/Rho*, наблюдается при 0 2% обесцвечивании родопсина, тогда как минимальный уровень фосфорилирования, равный 1 4 Pi/Rho*, обнаруживается при полном обесцвечивании пигмента (данные не приведены) Поскольку максимальное количество участков, которые могут быть модифицированы родопсинкиназой в Rho* равно 9, то, очевидно, что при 0 2% обесцвечивании по крайней мере 26 фосфатных остатков включается в "темновой" родопсин Следовательно, в суспензии НСП, как и реконструированной системе, при низком уровне освещения происходит фосфорилирование не только Rho*, но и "темнового" родопсина.

В присутствии Са2+ величина К5о ингибирующего эффекта рековерина на активность родопсинкиназы понижается от 7 мкМ (в случае полного обесцвечивания родопсина) до 2 5 мкМ (при 0 2%-ном обесцвечивании), как и в реконструированной системе, эффект рековерина более ярко выражен при низком, чем при высоком обесцвечивании родопсина (данные не представлены)

Таким образом, можно заключить, что в суспензии НСП, как и в реконструированной системе, рековерин с большей эффективностью ингибирует фосфорилирование «темнового» родопсина, чем фосфоричирование Rho* На этом основании мы высказали гипотезу о том, что указанный феномен можег использоваться в условиях m vivo для предотвращения нежелательного фосфорилирования необесцвеченного родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии в комплексе с фотовозбужденным родопсином

2 5

£

Я 4

X

К

а, и

0 3 а

а с.

1 2

ч о

Ш

у

1

о

0,01 0,1 1 10 100 Уровень обесцвечивания родопсина, %

Рис. 7. Зависимость К50 для эффекта рековерина в реакции фосфорилирования родопсина при различных уровнях обесцвечивания пигмента в реконструированной системе.

6

5 -

■о Ч

1 4£

а л в и т

2 2

ч 2

X «

1 -

о

12 3 4

Фосфоопсин Фосфородопсин

Рис. 8. Влияние рековерина на образование фосфородопсина и фосфоопсина в реакции фосфорилирования родопсина в условиях 3%-ного обесцвечивания пигмента в реконструированной системе. Столбцы I и 3 - образование фосфоопсина и фосфородопсина, соответственно, в отсутствие рековерина; столбцы 2 и 4 - образование фосфоопсина и фосфородопсина, соответственно, в присутствии 4,4 мкМ рековерина^_

3. Изучение механизма Са2+-миристоильного переключателя на примере

рековерина

Молекула рековерина содержит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3), способны связывать ионы кальция N-конец рековерина ацилирован (преимущественно мирисшилирован) в результате посттрансляционной модификации Связывания ионов кальция с рековерином приводит к экспонированию его N-концевого миристоильного остатка из так называемого гидрофобного "кармана" бежа в раствор, в результате чего рековерин становится способным взаимодействовать с фоторецепторными мембранами (Zozulya and Stryer, 1991) Этот механизм получил название Са2+-миристоильного переключателя (calcium-myristoyl switch)

Нами были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из работающих в рековерине Са2+-связывающих центров Это - мутант RcE85Q (EF-2), у которого не функционирует EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85-м положении на остаток глутамина, и мутант RcEI2IQ (EF-3), у которого не функционирует EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении Мы использовали эти мутанты для исследования механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина

3.1 Исследование механизма связывания ионов кальция с рековерином Для характеристики Са2+-связывающих свойств рековерина и его мутантов RcE8SQ и

rch121q

мы использовали радиоактивный изотоп кальция - 45Са2+, свободную концентрацию ионов кальция варьировали в диапазоне от 20 нМ до 500 мкМ

Как видно из рис 9А и таблицы 2, немиристоилированная форма рековерина связывает 2 иона кальция, и что характерно - некооперативно Величины Kq для двух его Са2+- связывающих центров при этом составляют 0,21 мкМ и 6,2 мкМ Поскольку не было известно, какому именно Са2+-связывающему центру - EF2 или EF3 - соответствует высокоаффинная константа, а какому - низкоаффинная, мы попытались ответить на этот вопрос, используя немиристоилированные мутанты рековерина по второму (мутант EF-2) и третьему (мутант EF-3) Са2+- связывающим центрам

Мы установили, что немиристоилированный мутант EF-2, у которого не функционирует Са2+-связывающиий центр EF2, связывает только 1 ион кальция с Kd,

равной 0,26 мкМ (рис 9Б и таблица 2) Поскольку этот мутант содержит модифицированный ЕР2 и нативный ЕРЗ, очевидно, это связывание происходит именно за счет ЕРЗ и, следовательно, Са2+-связывающиий центр ЕРЗ в этом мутанте связывает ионы кальция с Ко = 0,26 мкМ Эта константа практически совпадает со значением Ко = 0,21 мкМ, которое мы получили для высокоаффинного центра в немиристоилированном рековерине Следовательно, можно сделать вывод, что высокоаффинным центром связывания Са2+ в немиристоилированном рековерине является ЕРЗ

Немиристоилированный мутант рековерина ЕЬ-З, у которого модифицирован Са2+-связывающий центр ЕРЗ, способен связывать один ион Са2<" на молекулу рековерина с Ко = 8,2 мкМ (рис 9В и таблица 2) Поскольку Ко = 8,2 мкМ практически совпадает с Ко = 6,2 мкМ, определенной нами для низкоаффинного центра в немиристоилированном рековерине, можно заключить, что ЕБ2 в немиристоилированном рековерине представляет собой низкоаффинный центр связывания ионов кальция

Таким образом, наши результаты, полученные при исследовании связывания ионов кальция с немиристоилированными формами рековерина, позволяют сделать вывод о том, что в немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр ЕРЗ является высокоаффинным (К0 = 0,21 мкМ), а ЕР2 - низкоаффинным (Кс = 6,2 мкМ) Таким образом, наши результаты, полученные при исследовании связывания ионов кальция с немиристоилированными формами рековерина, позволяют сделать вывод о том, что в немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр ЕРЗ является высокоаффинным (К0 = 0,21 мкМ), а Е¥2 - низкоаффинным (К0 = 6,2 мкМ) Результаты исследования Са2+ -связывающих свойств миристоилированных форм рековерина представлены на рис 9 и в таблице 2 Видно, что миристоилированный рековерин так же, как и его немиристоилированная форма, связывает 2 иона кальция Однако в случае миристоилированного рековерина связывание Са2+ происходит кооперативно с коэффициентом Хилла 1,9 и Ки, равной 17,6 мкМ Следовательно, миристоилирование понижает аффинноегь рековерина к ионам кальция и придает процессу связывания катиона кооперативный характер

Из рис 9Б и таблицы 2 также следует, что миристоилированныи мутант ЕР-2, в котором присутствует единственный нативный Са2+-связывающий центр ЕГЗ,

|с.2*|( »кМ |С12+|Г мкМ

|С*2,"|г, мкМ

Рис. 9 Связывание 45Са2+ с миристоилированными формами рековерина и мутантов ЕР-2 ( КсЕ,!0) и ЕР-З (КсЕ12'°) (• - немиристоилированная форма, о - миристоилированная форма)_

Таблица 2. Стехиометрия связывания и константы диссоциации Са2+ для рековерина и его мутантных форм.___г~—I__

№ Форма рековерина Стехиометрия связывания Са моль на моль белка Ко', мкМ Ко2, мкМ Коэффициент Хилла

1 пКс* 2 0,21 6,2 -

2 пЕР-2 1 0,26 - -

3 пЕР-З 1 - 8,2 -

4 тЯс 2 17,6 1,9

5 шЕР-2 1 34, - -

б тЕР-З - - - -

"Сокращения пНс - немиристоилированный рековерин дикого типа, пЕР-2 -немиристоилированная мутантная форма рековерина КсЕ8Я', пЕР-З - немиристоипированная мутантная форма рековерина Кс^ , тИс - миристоилированный рековерин дикого типа, шЕР-2 - миристоилированная мутантная форма рековерина Яс""4, тЕР-З миристоилированная мутантная форма рековерина ЯсЕ12^_

координирует 1 ион кальция с Кц = 34,6 мкМ Однако миристоилированный мутант ЕГ-З, в котором нативен Са2+ -связывающий центр EF2, лишен способности координировать ионы кальция (рис 9В) Следовательно, модификация EF3 в мирисюилированном рековерине блокирует связывание Са2+ с нативным EF2 В то же время нарушение Са2+-связывающих свойств EF2 в миристошшрованном белке не препятствует связыванию Са2+ с нативным EF3 Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что связывание катиона с миристоилированным рековерином происходит последовательно сначала ионы кальция заполняют Са2+-связывающий центр EF3 и только затем - EF2, при этом заполнение центра EF3 ионами кальция является необходимым условием для последующего связывания катиона в ценгре EF2

Сравнение Са2+-связывающих свойств немиристоилированных и миристоилированных мутантов EF-2 и EF-3 позволяет сделать еще один важный вывод о роли N-концевого миристоилирования рековерина. Мы показали, что миристоилированный рековерин не способен связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF2, когда EF3 в нем не функционален (миристоилированный мутант EF-3), те в миристоилированном рековерине работает механизм последовательного заполнения его Са2+-связывающих центров катионом Однако в немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр EF2 способен координировать ионы кальция, несмотря на то, что EF3 в нем мутирован, и его Са2+-связывающая способность нарушена (немиристоилированный мутант EF-3) Таким образом, необходимым условием для функционирования механизма последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерина ионами кальция является присутствие в его молекуле миристоильного остатка

3.2 Изучение роли Ca2*-связывающих центров рековерина в функционировании его Са2+-миристоильного переключателя

К моменту начала настоящей работы оставалось неизвестным, какую роль играет каждый из двух Са2+-связывающих центров рековерина в раскрытии гидрофобного "кармана", за счет которого рековерин взаимодействует со своей внутриклеточной мишеныо родопсинюшазой, и в экспонировании миристоильного остатка, с помощью которого рековерин связывается с фоторецепторной мембраной

В "этой связи следующим этапом настоящей работы было исследование роли Са2+-связывающих центров ЕР2 и ЕРЗ в указанных процессах 1 2 1 Калъцийзависимое экспонирование гидрофобного "кармана" рековерина

Показателем экспонирования гидрофобного "кармана" рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой (Ро1ат а а1, 1991) Мы использовали это свойство рековерина для выяснения роли его Са2+-связывающих центров ЕР2 и ЕРЗ в экспонировании гидрофобного "кармана" белка Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+] г от 10 нМ до 100 мкМ и степень связывания рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы С помощью этого метода было исследовано связывание с фенилсефарозой миристоилированных и немиристоилированных форм рековерина как дикого типа, так и мутантов ЕР-2 и -3

Из рис 10А видно, что миристоилированный рековерип Са2+-зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, величина К50, характеризующая это взаимодействие, составляет 1,22 мкМ Миристоилированные мутанты ЕР-2 и ЕР-З, у которых, соответственно, не функционируют Са2+-связывающие центры ЕР2 и ЕРЗ, способностью Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой не обладают Этот результат был ожидаем для мутанта ЕР-З, который, как было показано нами выше, вообще не способен связывать ионы кальция Миристоилированный мутант ЕР-2 хотя и связывает Са2+ за счет нативного ЕРЗ, но с фенилсефарозой не взаимодействует Следовательно, заполнение ионами кальция Са2+ -связывающего центра ЕРЗ не приводит к экспонированию гидрофобного "кармана", и можно предположить, что оно зависит от связывания катиона с Са2+-связывающим центром ЕР2 Описанные ниже эксперименты, которые были выполнены нами на немиристоилированных мутантах ЕР-2 и ЕР-З, подтвердили это предположение

Из рис 10Б видно, что немиристоилированный рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимыч образом взаимодействовать с фенилсефарозой Немиристоилированный мутант ЕР-З взаимодействует с фенилсефарозой аналогично рековерину, при этом взаимодействие этого мутанта с носителем происходит в том же диапазоне [Са2^, при котором происходит

Рис. 10 Са24-зависимое связывание миристоилированных (А) и немиристоилированных (Б) форм ш-рековерина и мутантов ЕР-2 и ЕИ-З с фенилсефарозой За 100% пришгго общее количество рековерина в пробе (• — и^-рековерин, о — мутант ЕР-2, р — мутант Ер-З) заполнение катионом нативного Са +-связывающего центра ЕБ2 В огличие ог мутанта ЕР-З, немиристоилированный ЕР-2, несмотря на то, что он связывает ионы кальция за счет нативного ЕБЗ, с фенилсефарозой не взаимодействует

Таким образом, заполнение ионами кальция центра ЕР2, а не ЕГЗ, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой, и, следовательно, координация ионов кальция именно в -связывающем центре ЕР2 необходима для экспонирования гидрофобного "кармана" рековерина 1 2 2 Капьцийзависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином

Как видно из рис 11 А, миристоилированный рековерин ингибирует активность родопсинкиназы Са2+-зависимым образом с полумаксимальным эффектом, равным 2,3 рМ Миристоилированный мутант ЕБ-3 не влияет на ак1ИвноС1Ь родопсинкиназы, чю можег бьпь обьяснено неспособностью этого мутанта связывать ионы кальция Миристоилированный мутант ЕР-2 также не действует на активность родопсинкиназы, хотя он и связывает один катион за счет намвною ЕБЗ Следовательно, способность рековерина ингибировать родопсинкиназу не зависит от заполнения ЕБЗ ионами кальция Отсюда можно

Рис.11. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы миристоилированными (А) и нсмиристоилированными (Б) формами рековерина и мутантов EF-2 и EF-3 За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина (• - wt-рековерин, о - мутанг EF-2, □ -

мутант EF-3)_

предположить, что способность рековерина ингибировать родопсинкиназу зависит от связывания катиона с EF2 Для проверки этого предположения мы использовали немиристоилированные формы рековерина, которые, подобно его миристоилированным формам, ингибируют родопсинкиназу Са2+-зависимым образом [Colvert et al, 1995]

Из рис 11Б следует, что немиристоилированный рековерин, аналогично миристоилированному рековерину, ингибирует родопсинкиназу Са2+-зависимым образом Такое же действие на фермент оказывает и немиристоилированный мутант EF-3, причём ингибирование наблюдается в том же диапазоне Са2+, в котором этот мутант связывает ионы кальция за счет EF2 В отличие от немиристоилированного мутанта EF-3, немиристоилированный EF-2, хотя и координирует Са2+ в EF3, на активность родопсинкиназы не действует Следовательно, способность рековерина ингибировать родопсинкиназу зависит от связывания ионов кальция с центром EF2, но никак не коррелирует с заполнением катионом центра EF3 1 2 3 Калышйзависимое экспонирование миристоильного остатка рековерина

Еще одной важной составляющей механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина является его способность взаимодействовать с мембранами в

результате Са2+- зависимого экспонирования ковалентно связанного с белком миристоильного остатка На следующем этапе работы мы провели изучение способности миристошшрованных форм рековерина и мутантов EF-2 и EF-3 связываться с фоторецепторными мембранами как характеристики экспонирования миристоильного остатка. Исследование немирисгоилированных форм не проводилось, тк они с фоторецепторными мембранами не взаимодействуют (Zozulya and Stryer, ¡991)

Как видно из рис 12, мирисюилированные рсковерин и мутант EF-2 связываются с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом Тогда как количество мутанта EF-3, присутствующего па мембранах, было низким и от концентрации кальция не зависело Очевидно, причиной того, что мутант EF-3 не взаимодействует с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом служит и о неспособность связывать ионы кальция

Взаимодействие с мембранами миристоилированного мутанта EF-2 происходит в два этапа В микромолярном диапазоне концентраций кальция, в котором у мутанта EF-2 заполняется катионом нативный центр EF3, наблюдается частичное связывание этого мутанта с мембранами Следовательно, в этих условиях миристоильный остаток рековерина экспонируется лишь частично При дальнейшем повышении концентрации кальция связывание мутанта EF-2 с фоторецепторными мембранами достигает максимума, аналогичного тому, что имеет место для рековерина Видимо, в милчимодярном диапазоне концентраций ионов кальция происходит связывание ионов кальция с мутированным центром EF2, что и приводит к полному экспонированию миристоильного остатка

Таким образом, наиболее значительные структурные перестройки молекулы рековерина, связанные с функционированием его Са2+-миристоильного перекиочателя, происходят после заполнения ионами кальция Са2+-связывающего центра EF2

[Са2+]г, мкМ

Рис 12. Са7<-зависимое связывание мирисгоилированных форм рековерина и мутантов Яс685' и с фоторецепторными мембранами Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии отмытых мочевиной фоторсцегпорных мембран при различных значениях [Са2+]г За 100% принято общее количество рековерина в пробе (А — М-рековерин, • — мутант ЕР-2, □ - мутант ЕР-З)

3 3 Исследование взаимодействия рековерина дикого типа и его мутантов по кальцийсвязывающим центрам с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса $рес1гоасору)

Для исследования Са2+-миристоильного переключателя рековерина методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса мы разработали систему рековерин - искусственная фосфолипидная мембрана, которая моделирует связывание рековерина с фоторецепторпой мембраной Компоненты модельной системы находились в двух различных фазах Искусственный липидный бислой, идентичный по составу липидам фоторецепторных мембран, образовывал однородную поверхность на чипе и находится в неподвижной фазе в течение хода эксперимента Рековерин присутствовал в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного на чипе липидного бислоя

Сенсограммы, соответствующие связыванию миристошшрованиой формы и(-рековсрина с чипом, показывают, что эта форма способна взаимодействовать с липидным бислоем как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция (данные не представлены) Однако амплитуда связывания (определяется как величина сигнала связывания в течение равновесной фазы) значительно меньше в отсутствие Са2+, чем в его присутствии Иная картина наблюдается при связывании с липидным бислоем немиристоилироваппой формы рсковерина В этом случае амплитуды связывания в присутствии и отсутствие ионов кальция почти одинаковы и равны амплитуде для миристоилированного рековерина в отсутствие Са2+ Следовательно, с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе, Са" -зависимым образом связывается только миристоилированный рековерин В то же время немиристоилированный рековерин с иммобилизованным липидным бислоем практически не взаимодействует, и эффект Са2+ в этом случае выражен слабо

На рис 13 приведены сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных форм рековерина и мутанта ЕР-2 с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе (Исследование связывания мутанга ЕР-З с иммобилизованным липидным бислоем не проводили, поскольку ею взаимодействие с липидным бислоем очень слабое и от присутствия ионов кальция не зависит) Измерения проводили при двух значениях [Са2+]г 1 и 400 мкМ Из рис 13 видно, что при концентрации ионов кальция, равной 400 мкМ, миристоилированный мутант ЕР-2 диссоциирует из комплекса с липидами заметно быстрее, чем рековерин Это означает, что модификация Са2+-связывающего центра №2 в молекуле рековерина уменьшает время его нахождения на поверхности липидного бислоя

При концентрации ионов кальция, равной 1 мкМ, этот эффект не выявляется обе миристоилированные формы диссоциируют из комплекса с липидами примерно с равными скоростями На основании сенсограмм (см рис 13) были рассчитаны константы скорости диссоциации (¿¿), характеризующие процесс диссоциации миристоилированных форм рековерина и мутанта ЕР-2 из комплекса с липидным бислоем В присутствии [Са2+]г, равной 1 мкМ, величина ка для миристоилированного рековерина оценивается как ка > 0,1 са при 400 мкМ [Са2+]< - к^ < 0,01 с"' Хотя определение констант скоростей диссоциации миристоилированных форм рековерина из комплекса с липидами носит оценочный характер, различие указанных

500

э ее

« 400 с; га

х ^

о л г

Т

Ц

(и ш

300 200 100

400 рМ Са2+

рековерин ЕГ-2

1 мМ Са2+

— рековерин ,ЕК-2

200

400 Время, сек

600

800

Рис 13 БРЯ-сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных форм рекове-рина и мутанта ЕР-2 с иммобилизованным липидным бислоем Измерения выполнены при двух значениях [Са2+]г 1 и 400 мкМ Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено

черным) рековерин_

величин к^ составляет как минимум один порядок Следовательно, можно заключить,

что время нахождения миристоюшрованного рековерина на поверхности липидного

бислоя зависит от концентрации ионов кальция В случае миристоилированного

мутанта ЕР-2 различия в скоростях его диссоциации из комплекса с липидами в

зависимости от Са2+ выявлены не были и соответствующие к^ оценены как > 0,1 с'1

В совокупности результаты, представленные на рис 19, позволяют сделать

вывод о том, что время нахождения рековерина на поверхности липидного бислоя

зависит от заполнения ионами кальция Са2+ -связывающего центра ЕР2

Можно предположить, что в физиологических условиях замедление

диссоциации рековерина с поверхности мембран при высоких концентрациях

кальция, т е тогда, когда рековерин дотжен ингибировать родопсинкиназу, может

увеличивать эффективность этого ингибирования, поскольку родопсинкиназа в

условиях т vivo преимущественно (или даже полностью) ассоциирована с поверхностью фоторецепторных мембран

4. Структурные предпосылки механизма Са2+-мириетонлышг о переключателя

Сравнение пространственных структур миристоилированных апоформы (Ames et al, 1995) и Са2+-содержащей формы (Ames el al, 1997) рековерина методом ядерного магнитного резонанса позволило выявить основные структурные перестройки в молекуле белка, сопутствующие процессу экспонирования гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка при заполнении ионами кальция Са2<-связывающих центров рековерина В свободном от кальция состоянии миристоильный остаток рековерина погружен в глубокий гидрофобный "карман" в N-концсвом домене белка. Связывание двух ионов кальция вызывает относительный поворот на 45° N- и С-концевого доменов рековерина вокруг Gly96 и последующий поворот вокруг Gly42 (расположенному в Са2+ -связывающей петле центра EF1), что в конечном счете приводит к экспонированию гидрофобного "кармана" и высвобождению миристоильно1 о остатка Экспонирование гидрофобного "кармана" рековерина делает доступным растворителю значительное количество его гидрофобных остатков, которые становятся способными взаимодействовать с родопсинкиназой - внутриклеточной мишенью рековерина Важно, что структурные перестройки молекулы рековерина, сопровождающие экспонирование гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка, затрагивают N-концевой домен рековерина в гораздо большей степени, чем С-концевой, те основные структурные изменения происходят в окружении центра EF2, который локализован в N-концевом домене рековерина

Каковы структурные предпосылки последовательного механизма связывания ионов кальция с миристоилированным?

Для ответа на поставленный вопрос нами методом рентгеноструктурного анализа была охарактеризована мутантная форма рековерина EF-2, с которой связан один ион кальция за счёт нативного EF3, тогда как EF2 катионом не заполнялся (рис 14Б) Оказалось, что при этом образуется стабильный интермедиат, который по своей структуре отличался как от миристоилированной апоформы рековерина (рис 14А),

так и от миристоилированного и'(-рековерина, содержащего два иона кальция (рис 14В) Структура интермедиата (рис 14Б) представляет собой переходное состояние от апоформы рековерина к его форме, полностью насыщенной ионами кальция При этом структура И-концевого домена интермедиата, содержащего центры ЕР1 и ЕГ'2, больше напоминает безкальциевую структуру рековерина, тогда как структура С-концевого домена (содержит ЕРЗ и ЕР4) сходна с таковой у белка, содержащего 2 иона кальция Этот факт объясняется, видимо, тем, что в интермедиате катион связан именно в С-концевом домене (за счет центра ЕРЗ) Кроме того, было показано, что заполнение центра ЕРЗ катионом, кроме изменений в структуре С-концевого домена рековерина, приводит к повороту на 45° Л- и С-концевых доменов белка друг относительно друга вокруг остатка й1у9б Хотя при этом поворота вокруг Ст1у42, ответственного за экспонирование гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка, не происходит, все же наблюдается частичное экспонирование миристоильного остатка (см рис 14Б) Упомянутый поворот вокруг 01у42, очевидно, происходит после заполнения катионом центра ЕР2

Суммируя результаты наших экспериментов, работу Са2'-миристоильного переключателя рековерина можно представить следующим образом Связывание ионов кальция с рековерином происходит сначала за счет Са2+-связывающего центра ЕРЗ, при этом коцформация белка изменяется таким образом, что Са2+-связывающий центр ЕЕ2 также становится доступным для связывания катиона Рековерин с заполненным Са2+ центром ЕРЗ, но свободным от катиона центром ЕР2, образует стабильное переходное состояние с частично экспонированным миристоильным оетагком, при этом гидрофобный "карман" интермедиата остается неэкспонированным, что и определяет неспособность этой формы ингибировать родопсинкиназу Рековерин полностью экспонирует миристоильный остаток после заполнения катионом Са2+-связывающего центра ЕР2, т е когда оба Са2+-связывающих центра рековерина заполнены ионами кальция Заполнение катионом центра ЕР2 является также необходимым условием для экспонирования гидрофобного "кармана" рековерина и, соответственно, для появления у него способности ингибировать родопсинкиназу Са2+-зависимым образом

Заметим, что аналогичная роль центра EF2 была продемонстрирована для нейрокальцина б - гомолога рековерина из мозга быка (Kumar and Kumar, 1999). Следовательно, весьма вероятно, что выявленный нами механизм экспонирования миристоильного остатка может быть универсальным для нейрональных кальциевых сенсоров, в которых функционирует Са2+-миристоильный переключатель.

Рис. 14. Структуры безкальциевой (A) (Ames et al., 1995) и содержащей 1 (Б) (Weiergraber at al., 2003) и 2 (В) (Ames et al, 1997) иона кальция форм рековерина.

Метод спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса позволил нам обнаружить еще один эффект, который проявляется при заполнении Са2+ -связывающего центра EF2 ионами кальция Оказалось, что при высоких концентрациях ионов кальция vi'í-рековерин диссоциирует с поверхности липидного бислоя, иммобилизованного на чипе, медленнее по меньшей мере на порядок по сравнению с мутантом EF-2, в котором модифицирован центр EF2 Это различие было Са2+-зависимым при низких концентрациях Ca21 рековерин и мутант EF-2 диссоциировали с поверхности липидного бислоя одинаково быстро Можно предположить, что в физиологических условиях замедление диссоциации рековерина с поверхности мембран при высоких концентрациях кальция, те тогда, когда рековерин должен ингибировать родопсинкиназу, может увеличивать эффективность этого ингибирования, поскольку родопсинкиназа в условиях in vivo преимущественно (или даже полностью) ассоциирована с поверхностью фоторецепторных мембран

5. Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Са2+-связывающий центр EF4

Для нормального функционирования многих представителей семейства NCS необходимо наличие активного Са2+-связывающего центра EF4 в структуре молекулы белка, однако, информация об участии четвертого Са2+-связывающего центра в функционировании механизма Са2+-миристоильного переключателя в семействе NCS и, в частности, рековерина отсутствовала Для «восстановления» Са2+ -связывающей способности центра EF4, потребовалось введение пяти точечных мутаций (G160D, К161Е, K162N, D165G и K166Q) Также были получены мутанты рековерина EF-2+4 и EF-3+4, у которых в дополнение к реконструкции центра EF4, была нарушена способность координировать катионы центром EF2 (E85Q) и EF3 (E121Q) соответственно Мы использовали описанные мутанты для изучения влияния реконструированного Са2+-связывающего центра EF4 на функциональные свойства рековерина

5.1 Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Со2 *-связывающему центру.

Как видно из таблицы 3, немирисюилированный мутант ЕБ+4 связывает 3 иона кальция в отличие от рековерина дикого типа, который координирует 2 катиона Из таблицы 3 также видно, что мутант ЕР+4, как и рековерин дикого типа, связывает ионы кальция некооперативно Величины констант диссоциации (Ко), относящиеся к центрам ЕБЗ, ЕР2 и ЕР4 соответственно, составляют Кр1 = 0,21 мкМ, Ко2 = 6,4 мкМ и К03 =1,1 мкМ Сравнение констант диссоциации для Са2+-связывающих центов ЕРЗ и ЕГ2 у немиристоилированного мутанта ЕР+4 показало, что они идентичны соответствующим значениям для немирисгоилированной формы рековерина дикого типа (0,21 мкМ и 6,2 мкМ) В то же время наблюдается дополнительное связывание катиона четвертым Са2+-свяяывающим центром рековерина с К03 =1,1 мкМ

Миристоилированный мутант ЕГ+4, так же как и его немиристоилированная форма, связывает 3 иона кальция (табл 3) Однако связывание катионов, в отличие от немиристоилированного мутанта ЕР+4, в случае его миристоилированной формы происходит кооперативно с коэффициентом Хилла 1,6 и К0 = 12,4 мкМ

Сравнение изученных нами Са2+-связывающих свойств миристоилированного

Таблица 3. Стехиометрия связывания и константы диссоциации Са2+ для мутантных форм рековерина с восстановленным ЕР4

№ Форма рековерина Стехиометрия связывания Са2*", моль на моль белка Ко', мкМ (ЕРЗ) К1Д мкМ (ЕР2) Кс3, мкМ (ЕР4)

1 п!1с+4* 3 0,21 6,4 1,1

2 пЕР-2,+4 2 0,21 - 0,7

3 пЕР-3,+4 2 - 5,7 0,9

4 тИс+4 3 12,4 1,0

5 тЕР-2,+4 2 - 13,0 0,9

6 шЕР-3,+4 2 198,0 - 2,9

'Сокращения пКс+4 - немиристоилированная мутантная форма рековерина с восстановленным ЕР4 (Кс^мокГбшкю^шоммо^ пЕР-2,+4 - немиристоилированная мутантная форма рековерина ксЫЯ^бовк.бшк.им.шискибд „ЬР-3,+4 немиристоилированная мутантная форма рековерина яс«21<>С1б<юх1б1ЕК1б»№1б5С.К1ббд тКс+4 - миристоилированная мутантная форма рековерина с восстановленным ЕР4 (Кс01еоо|С1б1ЕК1б2Мо1б50К1ббо)1 тЕР_21+4 . миристоилированная мутантная форма рековерина КСЕ8500160ПК161ЕК162М0165СК1660> тЕР.3>+4 . миристоилированная мутантная форма рековерина

^сЕ|21ОС160СК161ЕК162КР1б5ОК166О

мутанта ЕР+4 с таковыми рековерина дикого типа (координирует 2 катиона и это взаимодействие носит кооперативный характер с коэффициентом Хилла 1,9 и К0 = 17 мкМ) демонстрирует, что в обоих случаях миристоилирование понижает аффинность центров ЕР2 и ЕРЗ к катиону и придаёт процессу связывания кооперативный характер В то же время, в молекуле этого мутанта не наблюдается кооперативного взаимодействия «восстановленного» центра ЕР4 (Кр3 = 1 мкМ) с Са2+-связывающими центрами ЕР2 и ЕРЗ

Результаты исследования Са* -связывающих свойств как немиристоилированного, так и миристоилированного мутанга ЕР-2+4 представлены в табл 3 Видно, что немиристоилированный мутант ЕР-2+4 связывает два иона кальция с Кр' = 0,21 мкМ и Кп3=0,7 мкМ Величина Ко1, относящаяся к высокоаффинному Са2+-связывающему центру ЕРЗ в этой мутантной форме, соответствует ранее определенному значению для немиристоилированного мутанта ЕР-2, который координирует один катион за счет центра ЕРЗ с Ко - 0,26 мкМ Величина Ко3 практически совпадает со значением Ко = 1,1 мкМ, которое мы определили для центра ЕР4 в немиристоилированном мутанте ЕР+4

Исследование связывания ионов кальция с миристоилированным мутантом рековерина ЕР-2+4 показало, что этот мутант так же, как и его немиристоилированная форма, координирует 2 катиона с константами диссоциации 13 мкМ и 0,9 мкМ (табл 3) Поскольку миристоилированный мутант рековерина ЕР-2 координирует 1 катион за счет нативного центра ЕРЗ с Ко = 34,6 мкМ, сопоставление величин констант диссоциации для Са2+-связывающих центров миристоилированных мутантов ЕР-2+4 и ЕР-2, позволяет нам говорить о том, что в мутанте ЕР-2+4 величина 13 мкМ относиться к центру связывания ЕРЗ, тогда как значение 0,9 мкМ соответствует Ко3 для Са2+-связывающего центра ЕР4 Таким образом, миристоилирование мутанта ЕР-2+4 значительно увеличивает константу связывания для центра ЕРЗ, при этом практически не изменяя константу связывания для центра ЕР4 Следовательно, функциональный центр ЕР4 в миристоилированном мутанте ЕР-2+4 не влияет на Са2+-связывающие свойства третьего Са21-связывающего центра молекулы рековерина (ЕРЗ) Принимая во внимание рассчитанные нами константы связывания с ионами кальция для центров ЕРЗ и ЕР4 в миристоилированном мутанте ЕР-2+4, можно заключить, что при функционировании

дополнительного Са2+-связывающего центра (EF4) в С-концевом домене рековерина не наблюдается кооперативного взаимодеиствия между центрами EF3 и EF4

Из табл 3 следует, что немиристоилированный мутант EF-3+4, у которого не функционирует центр EF3, связывает 2 иона кальция Величины констант диссоциации для его Са2 ^-связывающих центров EF2 и EF4 составляют 5,7 мкМ и 0,9 мкМ соответственно Величины полученных констант свидетельствуют о том, что аффинность у центра EF2 к ионам кальция в немиристоилированном мутанте EF-3+4 такая же, как у рековерина дикого типа (Кц2 = 5,7 мкМ), а константа связывания катиона с центром EF4 совпадает со значением Kd3 = 1,1 мкМ, рассчитанным нами для четвертого Са2'-связывающего центра в немиристоилированном мутанте EF+4

Миристоилированный мутант EF-3+4 так же, как и его немиристоилированная форма, связывает 2 катиона (табл 3) Мы рассчитали константы диссоциации для двух независимых центров связывания ионов кальция в этом мутанте Полученные значения равны 198 мкМ и 2,9 мкМ Величина Кц = 2,9 мкМ может быть отнесена к четвертому Са2+-связывающему центру, поскольку она близка соответствующему значению, определенному нами для центра EF4 в миристоилированном мутанте EF+4 (Kd3 = 1 мкМ) Следовательно, Ко = 198 мкМ должна быть отнесена к центру EF2 в этой мутантной форме Эти результаты существенно отличаются от данных по Са2+-связывающей способности миристоилированного мутанта EF-3, у которого мутирован высокоаффинный центр EF3 Мутант EF-3 не способен связывать катионы даже при высокой концентрации Са2+ из-за того, что в миристоилированном рековерине работает механизм последовательно! о заполнения его Са2+-связывающих центров ионами кальция Таким образом можно заключить, что в мутантной форме рековерина EF-3+4 становится делает возможным связывание ионов кальция с центром EF2

Каковы же структурные предпосылки феномена связывания ионов кальция миристоилированным мутантом ЕГ-3+4 при том, что у миристоилированного мутанта EF-3 отсутствует такая способность7 Как показано в работе (Yap et al, 1999), структура миристоилированного рековерина является очень компактной При этом Са2+-связывающий центр EF2 располагается глубоко внутри глобулы, а центры EF3 и EF4 находятся на ее поверхности, что, по-видимому, и служит причиной того, что С-концевой домен, а следовательно центры EF3 и EF4, более доступны ионам кальция

по сравнению с центром EF2 После связывания катиона с центром EF3 происходит перестройка структуры миристоилированного рековерина, что делает центр EF2 также доступным ионам кальция В то же время, четвертый Са2+-связывающий центр молекулы рековерина претерпевает структурные изменения, подобные тем, что происходят в центре EF3 Следовательно, можно говорить о том, что реконструированный Са2+-связывающий центр EF4 в рековерине, в котором из-за модификации 3-й Са2+ -связывающий центр не способен связывать ионы кальция, функционально компенсирует отсутствие Са2+-связывающей способности центра EF3

5.2 Са2*~-зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру, с фоторецепторными мембранами.

Модификация Са2+-связывающего центра EF4 в молекуле рековерина мало влияет на его способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами (данные не приведены) Величина К5о, характеризующая взаимодействие мутанта EF+4 с фоторецепторными мембранами, составляет 4 мкМ, как и в случае рековерина дикого типа По всей видимости, это связано с тем, что Са2+-связывающие свойства центров ЕГ2 и EF3 в данной мутантной форме не изменяются при «восстановлении» четвертого Са2+-связывающего центра

Взаимодействие миристоилированного мутанта EF-2+4, как и мутанта EF-2, с фоторецепторными мембранами происходит в два этапа (рис 15 А) В микромолярном диапазоне концентраций ионов кальция у мутанта EF-2 происходит заполнение третьего Са2+-связывающего центра, что приводит к частичному экспонированию миристоильного остатка белка Поскольку введение дополнительного центра EF4 не влияет на заполнение ионами кальция трегьего Са2+-связывающего центра молекулы, то, можно утверждать, чго чаегь кривой, соответствующая микромолярному диапазону концентраций ионов кальция, отражает заполнение катионами центра EF3 и, соответственно, частичное экспонирование миристоильного остатка у мутанта EF-2+4 Дополнительное связывание мутанта EF-2+4 с фоторецепторными мембранами, наблюдаемое в миллимолярном диапазоне концентраций ионов кальция, можно объяснить только лишь заполнением катионами мутированного второго Са2+-связывающего центра

Из рис 15Б видно, что мутант ЕР-3+4, в отличие от мутанта ЕР-З, оказывается способным взаимодействовать с фоторсцепторными мембранами Са2+-зависимым образом, несмотря на то, что в нем отсутствует функционирующий третий Са2+-связывающий центр Мутант ЕР-З с мембранами практически не взаимодействует и лить в миллимолярном диапазоне концентраций ионов кальция наблюдается его незначительное связывание Отсутствие у мутанта ЕР-З способности взаимодействовать с мембранами обусловлено тем, что в нем нарушен процесс последовательною заполнения катионами его Са -связывающих центров, который предполагает, что в миристоилированном рековерине центр ЕР2 может координировать катионы только при условии заполнения ионами кальция центра ЕРЗ Способность мутанта ЕР-3+4 взаимодействовать с фоторецепторной мембраной может быть объяснена данными, полученными пами при исследовании связывания ионов кальция с этим мутантом Следует подчеркнуть, что в микромолярном диапазоне концентраций ионов кальция наблюдается частичное связывание мутанта ЕР-3+4 с фоторецепторными мембранами когда, как было сказано выше, заполняются ионами кальция Са2+-связывающие центры ЕЕ4 и ЕР2 Однако при высоких (миллимолярных) концентрациях ионов кальция наблюдается досвязывание мутанта с мембранами, что можно объяснить заполнением катионом мутированного центра ЕРЗ, который также вносит свой вклад в экспонирование миристоильного остатка

РЧрНМ

Рис 15 Са2+-зависимое связывание с фоторецепторными мембранами мутантов ЕР-2+4 , ЕР-2 (А) и мутантов ЕР-3+4, ЕР-З (Б)_

5 3. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса. Исследование мутанта ЕБ+4 показало, что варьирование концентраций ионов кальция и белка вызывает изменение амплитуды сигнала связывания, но не оказывает заметного влияния на кинетику ассоциации мутантов рековерина с иммобилизованным липидным бислоем Однако кинетика диссоциации мутанта ЕБ+4 из комплекса с липидным бислоем варьирует в зависимости от концентрации катиона Поскольку нас прежде всего интересовал механизм Са2+-зависимого взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с искусственным липидным бислоем, далее мы более детально исследовали влияние ионов кальция на этот процесс

Измерения проводили при двух значениях [Са2+]г 1 мкМ и 400 мкМ Из рисунка видно, что при концентрации ионов кальция, равной 400 мкМ, мутант Р,Р+4 диссоциирует из комплекса с иммобилизованным липидным бислоем значительно медленнее, чем при [Са2+]г, равной 1 мкМ На основании полученных сенсограмм нами были рассчитаны константы скорости диссоциации (К/), характеризующие процесс диссоциации мутанта ЕР+4 из комплекса с липидным бислоем при двух указанных значениях [Са21"^ (константы носят оценочный характер, поскольку точные значения не могли быть рассчитаны из-за ограничений метода) Величина константы скорости диссоциации при низкой концентрации ионов кальция (1 мкМ), оцененная как к^ > 0,1 с"1, характеризует быструю фазу диссоциации мутанта из комплекса с липидным бислоем При высокой концентрации катиона (400 мкМ) значение кс1 оценено как к,1 > 0,01 с"1, что соответствует медленной фазе вышеуказанного процесса Сопоставляя полученные значения кл, можно заключить, что различие указанных величин составляет как минимум один порядок Это означает, что время нахождения миристоилированного мутанта ЕР+4 на поверхности иммобилизованного липидного бислоя зависит от концентрации катиона Следует добавить, что рассчитанные константы описывают 2-х фазный процесс диссоциации мутанта ЕР+4 из комплекса с липидным бислоем в зависимости от концентрации ионов кальция и совпадают с соответствующими константами, определенными нами для рековерина дикого типа

На рис 16 приведены сенсограммы, отражающие связывание мутантов ЕР-2+4 и ЕР-3+4 с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе (в этом случае измерения проводили только при [Са2+]г = 400 мкМ поскольку при концентрации катиона, равной 1 мкМ, эффект взаимодействия этих мутантов с липидным бислоем не выявляется) Из приведенных на рисунке сенсограмм видно, что мутант ЕР-2+4 диссоциирует из комплекса с липидным бислоем заметно быстрее, чем мутант ЕР-3+4 Это означает, что модификация Са2+-связывающего центра ЕР2 в молекуле рековерина уменьшает время его нахождения на поверхности иммобилизованного липидного бислоя На основании сенсограмм нами были рассчитаны константы скорости диссоциации мутантов ЕР-2+4 и ЕР-3+4 из комплекса с липидным бислосм В случае мутанта ЕР-2+4 определена одна константа, соответствующее значение которой оценено как £ 0,1 с'1 Следовательно, кинетика диссоциации мутанта ЕГ-2+4 характеризуется только быстрой кинетической составляющей Миристоилированный мутант ЕР-3+4 диссоциирует из комплекса с липидным бислоем с бифазной кинетикой

0 200 400 600 800

Время сск

Рис 16 ЗРЯ-сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных мутантных форм рековерина ЕР-2+4 и ЕР-3+4 с иммобилизованным липидным бислоем Измерения выполнены при [Са2+]г . 400 мкМ Концентрация белка составляла 15 мкМ Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) мутантная форма рековерина_

Константы скорости диссоциации в случае мутанта ЕР-3+4 оценены как ка > 0,1 с 1 и кл < 0,01 с1 Таким образом, кинетика скорости диссоциации мутанта ЕР-3+4 из комплекса с иммобилизованным липидным бислоем характеризуется быстрой (к,/ > 0,1 с'1) и медленной (ка > 0,01 с') компонентами Из этого следует, что при высоких концентрациях ионов кальция происходит замедление процесса диссоциации мутанта ЕР-3+4 из комплекса с липидным бислоем

На основании полученных результатов можно заключить, что а) время нахождения рековерина на поверхности липидного бислоя зависит от его способности связывать ионы кальция вторым Са2+-связывающим центром и б) реконструкция четвертого Са2+-связывающего центра рековерина в мутанте ЕР-3+4, у которого отсутствует способность координировать катионы за счет центра ЕРЗ, позволяют этому мутанту диссоциировать с поверхности липидного бислоя подобно рековерину дикого типа

Результаты, представленные в настоящей работе, позволяют сделать вывод о том, что функциональный четвертый Са2*-связывающий центр молекулы рековерина в значительной степени способен компенсировать нарушение Са2+-связывающей способности в третьем, но не во втором Са2+ -связывающем центре Также нами было получено независимое доказательство гипотезы о том, что среднее время нахождения рековерина на мембране определяется функционированием его второго связывающего центра Этот шаг важен для понимания механизма ингибирования родопсинкиназы рековерином при высоких концентрациях ионов кальция Нами было непосредственно продемонстрировано, что миристоилированный мутант ЕР-3+4 ингибирует родопсинкиназу (данные не приведены), в то время как мутант ЕР-З не оказывает влияние на активность фермента Проведенные нами исследования имеют большое значение для изучения процесса функционирования Са2+-связывающих белков, которые опосредуют эффект ионов кальция на протеинкиназы О-белок-сопряженных рецепторов, поскольку они регулируют активность ферментов Са2+-зависимым образом

6 Са247рековерин-завис1шая регуляция фототранедукции и патологии зрения.

Под термином "пигментный ретинит" (ПР) объединяют группу дегенеративных заболеваний сетчатки глаза, вызванных мутациями во многих генах,

42

при этом мутации в гене зрительного рецептора родопсина являются наиболее частой причиной болезни На сегодняшний день обнаружено более чем 150 мутаций в гене родопсина, ассоциированных с ПР Столь значительное количество патогенных мутаций рецептора указывает на критическую важность правильной трехмерной структуры родопсина для его функционирования, и говорит об оптимальности дизайна молекулы рецептора достигнутой в процессе эволюции

К настоящему моменту некоторое количество мутантов родопсина, ассоциированных с ПР, было получено и охарактеризовано, однако многие мутанты, ассоциированные с ПР до сих пор находились вне поля зрения исследователей Один из аминокислотных остатков, замены которого достаточно часто встречаются у пациентов с пигментным ретинитом - R135, локализованный в цитоплазматическом окончании третьей трансмембранной а-спирали родопсина На сегодняшний день выявлено три мутации в этом положении (R135L, R135G и R135W), ассоциированные с ПР Мутации R135 связаны с наиболее серьезной формой ПР Так, клинический фенотип заболевания, вызванного заменой R135L, отличался более тяжелым течением, чем ПР, вызванный, например, мутацией Р23Н в трансмембранной части молекулы или мутацией С-концевого цитоплазматического Р347

Нами был получен и охарактеризован мутанг родопсина R135L, ассоциированный с ПР Как видно из рис 17 гиперфосфорилирование в случае мутанта родопсина R135L менее эффективно ингибируется Са2 +/рековерином, чем в случае родопсина дикого типа Это указывает на участие Са2+/рековерина в молекулярном механизме, в соответствии с которым, мутация родопсина R135L оказывает патогенный эффект, являясь причиной дегенерации фоторецепторной клетки Полученный результат вносит существенные дополнения к существующим молекулярным механизмам пигментного ретинита, впервые указывая на важность правильного и своевременного выключения родопсина, регулируемого Са2+/рековериноч Предложенный нами механизм может являться дополнением к результатам недавнего исследования, где деградация фоторецепторной клетки, вызванная мутацией R135L, объяснялась ослаблением эндоцитозной активности в отношении мутированного белка Отметим, что до настоящей работы, непосредственное участие рековерина в развитии IIP не выявлялось

[Рековсрнн|, мкМ

Рис 17 Зависимость фосфорилирования родопсина (•) и его мутантной формы Я135Ь (о) от концентрации рековерина в реконструированной системе

ВЫВОДЫ

1. Функциональной мишеимо для рековерина в фоторецепторных клетках служит родоисинкиназа

2 Рековерин Са2+-зависимым образом ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой

3. К-концсвос миристоилирование рековерина увеличивает его эффективность как ингибитора родоиеинкиназы

4. Холестерин выступает в роли фактора, оказывающего влияние на функциональные свойства рековерина' высокая концентрация холестерина повышает сродство рековерина к фоторецепторным мембранам и усиливает иигибирование родопсинкиназы рековерпном

5 Рековерин более эффективно ингибирует родопсинкиназу в реакции фосфорилирования «темнового» родопсина, чем в реакции фосфорилирования фотовозбужденного пигмента; высказана гипотеза о том, что одной ш функций рековерина в фоторецепторпой клетке является предотвращение нежелательного фосфорилирования «темнового» родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии

6 В немиристоилированном рсковсрнне Са2+-связывакнцни центр ЕРЗ является высокоаффинным (Ко'-0,21 мкМ), ЕР2 -низкоаффинным (Кв2=6,2 мкМ)

7. В миристоилированном рековерине заполнение Са2+-связывающих участков ионами кальция происходит последовательно* сначала заполняется 3-й участок, и лишь затем 2-й, при этом заполнение ионами кальция центра ЕРЗ является необходимым условием для последующего связывания катиона в центре ЕР2. Миристоильный остаток является важной деталью последовательного механизма заполнения Са2+-связывающнх участков в молекуле рековерина, поскольку он блокирует связывание кальция с ЕР2 до того, как произойдёт заполнение кальцием с ЕГО

8. Заполнение ионами кальция Са2+-связывающего центра ЕРЗ сопровождается частичным экспонированием мирнстоильного остатка рековерина, полное экспонирование последнего происходит в результате последующего связывания ионов кальция с ЕР2.

9. Экспонирование гидрофобного «кармана» рековерина н, соответственно, его способность Са2+-зависимым образом взанмоденствовать с фосфолипндными мембранами, и ингнбнровать родопепнкпназу непосредственно зависит от заполнения ионами кальция Са2+-связывающего центра ЕР2.

10. Скорость диссоциации рековерина с поверхности фосфолипидных мембран зависит от заполнения ионами кальция его Са2+-связывающего центра ЕР2

11 Реконструкция 4-го Са2+-связывающего центра в рековерине, в котором 3-й Са2*-связывающий центр ЕРЗ модифицирован и не способен связывать ионы кальция, функционально компенсирует отсутствие связывания ионов кальция в Са2+-связывающем центре ЕРЗ.

12. Нарушение регуляции рековерином фосфорилирования родопсина, катализируемого родопепнкиназой может лежать в основе молекулярного механизма патогенеза такого заболевания сетчатки, как пигментный резинит.

Список публикаций по теме диссертации

1 Gorodovikova Е N , Gimelbrant А А , Semn 11. Phihppov Р Р Recovenn mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine renna rod cells // FEBS Lett, 1994, v 349, p 187-190

2 Gorodovikova E N , Semn 11. Phihppov P P Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recovenn II FEBS Lett, 1994, v 353, p 171-172

3. Semn 11. Zargarov A A, Alekseev A M, Gorodovikova E N , Lipkin V M , Phihppov P P N-Myristoylation of recovenn enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase II FEBS Lett, 1995, v 376, p 87-90

4. Заргаров A A, Сенин И И. Алексеев А М, Шульга-Морской С В , Филиппов П П, Липкин В М Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина в клетках Е coll и сравнение их функциональной активности // Биоорган Химия, 1996, т 22, №7, с 483-488

5 Semn 11, Dean К R, Zargarov А А, Akhtar М, Phihppov Р Р Recovenn inhibits the phosphorylation of dark-adapted rhodopsin more than it does that of bleached rhodopsin A possible mechanism through which rhodopsin kinase is prevented from participation in a side-reaction II Biochem J, 1997, v 321, p 551-555

6 Semn 11. Zargarov A A, Akhtar M , Phihppov P P (1997) Rhodopsin phosphorylation m bovine rod outer segments is more sensitive to the inhibitory action of recovenn at the low rhodopsin bleaching than it is at the high bleachmg // FEBS Lett, 1997, v 408, p 251254

7 Alekseev A M , Shulga-Morskoy S V, Zinchenko D V, Shulga-Morskaya S A, Suchkov D V , Vaganova S A , Semn 11. Zargarov A A, Lipkin V M , Akhtar M, Phihppov P P Obtaining and characterization of EF-hand mutants of recovenn // FEBS Lett, 1998, v 440, p 116-118

8 Пермяков С E , Сенин И И , Уверский В II, Черская А М , Шульга-Морской С В , Зинченко Д В , Алексеев А М, Заргаров А А, Липкин В М , Филиппов П П , Пермяков ЕА Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина I Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров // Биооргап химия, 1999, т 25, ,№ , с 742-746

9 Уверский В Н , Пермяков С Е , Сепии И И . Черская А М , Шульга-Морской С В , Зинченко Д В , Алексеев А М, Заргаров А А, Липкин В М , Филиппов П П , Пермяков ЕА Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющич центров рековерина II Необычное поведение белка при взаимодействии с ионами кальция // Биоорган химия, 2000, т 26, ,№, с 173-178

10 Пермяков С Е, Уверский В Н , Черская А М, Шульга-Морской С В , Зинченко Д В , Алексеев А М, Зерний Е Ю , Заргаров А А, Сенин И И . Липкин В М , Филиппов П П, Пермяков Е А Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина III Мутант с четвертым реконструированным Ca2f-связывающим центром // Биоорган химия, 2000, т 26, ,№ , с 275-283

11 Permyakov S E , Cherskaya A M , Senin 11. Zargarov A A , Shulga-Morskoy S V , Alekscev A M , Zinchenko D V , Lipkm V M , Philippov P P , Uversky V N , Permyakov E A (2000) Effects of mutations m the calcium-binding sites of recoverin on its calcium affinity evidence for successive filling of the calcium binding sites // Protein Eng, 2000, v 13, p 783-790

12. Bazhm A V , Shifnna О N , Savchenko M S , Tikhomirova N К, Goncharskayj M A , Gorbunova V A , Senin 11. Chuhalin A G, Philippov P P Low titre autoantibodies against recoverin in sera of patients with small cell lung cancer but without a loss of vision // Lung cancer, 2001, v 34, p 99-104

13 Комолов К E, Сенин И И. Филиппов П П Влияние протеолитического отщепления С-концевого фрагмента родопсина на его способность активировать зрительный каскад //Биооргии химия, 2002, т 28,№,с 16-22

14 Senin II. Koch K-W, Akhtar M, Philippov PP Ca2+-Dependent Control of Rhodopsin Phosphorylation Recoverin and Rhodopsm Kinase // Adv Exp Med Biol,

2002, v 514, p 69-99

15 Fisher T, Senin 11. Philippov P P, Koch К -W Application of different lipid surfaces to monitor protein-membrane interaction by surface plasmon resonance spectroscopy // Spectroscopy, 2002, v 16, p 271-279

16 Senin 11. Fisher T, Komolov К E, Zinchenko D V, Philippov P P , Koch К -W Ca2"-mynstoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2t-binding sites // J Biol Chem , 2002, v 277, № 52, p 50365-50372

17. Зериний E Ю , Тихомирова II К , Филиппов П П , Сенин И И Обнаружение аннексина IV в палочках сетчатки быка // Биохимия, 2003, т 68, № 1, с 154-160

18 Pennyakov S Е, Cherskaya А М , Wasserman L А , Khokhlova ТI, Senin 11, Zargarov А А , Zinchenko D V, Zernn Е Yu, Lipktn V М , Philippov Р Р , Uversky V N, Permyakov E A Recoverin Is a Zinc-Binding Protein // J Proteome Res , 2003, v 2, № 1, p 51-57

19 Weiergraber О H , Senin 11 . Philippov P P, Granzin J , Koch K-W Impact of N-terminal myristoylation on the Ca2+-dcpendent conformational transition in recoverin // J Biol Chem, 2003, v 278, № 25, p 22972-22979

20 Senin 11, Vaganova S A , Weiergraber О H , Ergorov N S , Philippov P P , Koch K-W Functional restoration of the Ca2+-mynstoyl switch in a recoverin mutant // J Mol Biol,

2003, v 330, № 2, p 409-418

21 Комолов К E , Сенин И И ■ Филиппов П П Зрительная транедукция и кальций // Биофизика, 2004, т 49, №2, с 265-77

22. Zernn Е Yu , Tikhomirova N К, Hellman U , Philippov P P and Senin 11 Annexins in bovine photoreceptors // Annexins, 2004, v 1, № 1, p 63-69

23 Senin 11. Hoeppner-Heitmann D , Polkovmkova О О , Churumova V A , Tikhomirova N К, Philippov P P , and Koch К W Recoverin and rhodopsin kinase activity m detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments // J Biol Chem, 2004, v 279, № 47, p 48647-48653

24. Тихомирова НК, Гончарская МА, Сенин ИИ Получение и характеристика Са2+-зависимых моноклональных антител против рековерина // Биохимия, 2004, т 69, №12, с 1360-1364

25. Komolov К Е, Zmchenko D V, Churumova V А, Vaganova S А, Weiergraber О Н, Senin 11. Philippov P P , and Koch К W One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase // Biol Chem, 2005, v 386, № 3, p 285-289

26 Komolov К E, Semn 11. Philippov P P, and Koch К W Surface plasmon resonance study of G-protein/receptor coupling m a lipid bilayer-free system // Anal Chem , 2006, v 78, № 4, p 1228-1234

27 Senin 11. Bosch L , Ramon E , Zernn E Yu, Manyosa J, Philippov P P, and Garnga P Ca2+/recovenn dependent regulation of phosphorylation of the rhodopsin mutant R135L associated with retinitis pigmentosa II Biochem Biophys Res Commun, 2006, v 349, № l,p 345-352

28. Weiergraber О H, Senin 11. Zernn E Yu Churumova V A , Kovaleva N A, Nazipova A A, Permyakov S E, Permyakov E A, Philippov P P , Granzin J , and Koch К W Tuning of a Neuronal Calcium Sensor IIJ Biol Chem, 2006, v 281,№,p 37594-37602

29. Gensch T, Komolov К E, Senin 11. Philippov P P , and Koch К W Ca2+-dependent conformational changes m the neuronal Ca2+-sensor recoverin probed by the fluorescent dye Alexa647 // Proteins, 2007, v 66, № 2, p 492-499

30 Ramon E, Cordomi A, Bosch L, Zernn E Yu, Semn 11. Manyosa J , Philippov P P, Perez J J, and Garriga P Critical Role of Electrostatic Interactions of Ammo Acids at the Cytoplasmic Region of Helices 3 and 6 in Rhodopsin Conformational Properties and Activation IIJ Biol Chem, 2007, v 282, №, p 14272 - 14282

31. Senin 11. Churumova V A , Philippov P P, Koch К W Membrane binding of neuronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus II BMC Biochem, 2008, v 8, p 24-29

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@.stpnnt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 29 04 2008 г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая схема фототрансдукции.

1.1. Строение глаза, сетчатки и фоторецепторных клеток.

1.2. Морфология и состав наружных сегментов палочек.

1.3. Передача зрительного сигнала.

1.4. Восстановление темнового состояния.

2. Родопсинкиназа.

2.1. Ген и тканевая локализация родопсинкиназы.

2.2. Характеристика доменов родопсинкиназы и посттрансляционные модификации.

2.3. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и ее активация.

2.4. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой.

2.5. «Фосфорилирование родопсина с высоким выходом».

3. Молекулярные механизмы Са2+-зависимой регуляции ф ототр анс дукции.

3.1. Светозависимое изменение концентрации кальция в НСП.

3.2. Ионы кальция и гуанилатциклаза.'.

3.3. Ионы кальция и аденилатциклаза.

4. Белки семейства нейрональных Са2+ сенсоров.

4.1. Общая характеристика семейства нейрональных Са2+ сенсоров.

4.2. Рековерин.

4.2.1. Тканевая и клеточная локализация.

4.2.2. Ген и первичная структура.

4.2.3. Т^-концевое ацилирование.

4.2.4. Са2+-связывающие центры рековерина.

4.2.5. Пространственная структура и модель Са -миристоильного пер еключателя.

4.3. вСДР-белки.

4.4. Визининподобные белки.

4.5. Фреквенины.

4.6. КСЫР-белки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Действие рековерина в реакции фосфорилирования фотовозбужденного родопсина, катализируемой родопсинкиназой.

1.1. Изучение влияния кальция на фосфорилирование родопсина в суспензии НСП.

1.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование родопсина в реконструированной системе.

1.3. Изучение роли Ы-концевого миристоилирования рековерина на его физико-химические и функциональные свойства.

1.3.1. Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина.

1.3.2. Влияние ТЧ-концевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы.

1.4. Влияние содержания холестерина фоторецеторных мембран на взаимодействие рековерина с фоторецепторнымимембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

1.4.1. Исследование влияния холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами.

1.4.2. Влияние содержания холестерина на Са /рековерин зависимую регуляцию фосфорилирования родопсина.

1.5. Сравнение влияния рековерина на фосфорилирование "темнового" и фотовозбужденного родопсина.

1.5.1. Определение соотношения фосфородопсин/фосфоопсин при различных уровнях обесцвечивания родопсина.

1.5.2. Сравнение ингибирующей эффективности рековерина в реакции фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина в реконструированной системе.

1.5.3. Сравнение ингибирующей эффективности рековерина в реакциях фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина в суспензии НСП.

1.6. Изучение механизма Са2+/рековерин - зависимой регуляции родопсинкиназы.

1.6.1. Выявление участков родопсинкиназы, вовлеченных во взаимодействие с рековерином.

1.6.2. Изучение влияния рековерина на процесс фосфорилирования светоактивированного родопсина, катализируемый родопсинкиназой.

1.6.2.1. Изучение влияния рековерина на образование комплекса между светоактивированным родопсином и родопсинкиназой.

1.6.2.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование С-концевого пептидного фрагмента родопсина.

1.6.2.3. Изучение функциональных свойств рековеринсвязывающего участка родопсинкиназы.

ВЫВОДЫ

глава 1).

2. Изучение механизма Са2+-миристоилыюго переключателя на примере рековерина.

2.1. Исследование механизма связывания ионов кальция с рековерином.

2.2. Изучение роли Са2+-связывающих центров рековерина в функционировании его Са2+ -миристоильного переключателя.

2.2.1. Кальцийзависимое экспонирование гидрофобного "кармана" рековерина.

2.2.2. Кальцийзависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином.

2.2.3. Кальцийзависимое экспонирование миристоильного остатка рековерина.

2.2.4. Исследование взаимодействия рековерина дикого типа и его мутантов по кальцийсвязывающим центрам с иммобилизованным липидным бислоем методом БРЯ-спектроскопии.

2.2.4.1. Характеристика метода ЭРЫ-спектроскопии применительно к связыванию рековерина с липидным бислоем, иммобилизованным на БРЯ-чипе.

2.2.4.2. Определение сродства миристоилированных форм АЛ^-рсковерина и мутанта ЯсЕ85СЗ к липидному бислою, иммобилизованному на 8РЫ-чипе.

2.2.4.3. Исследование кальцийзависимого экспонирования миристоильного остатка рековерина методом ЭРЫ-спектроскопии.

2.2.4.4. Кинетика диссоциации миристоилированных форм \\Ф-рековерина и мутанта 11сн85(3 из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на БРЯ-чипе.

2.3. Структурные предпосылки механизма Са2+-миристоильного переключателя (обсуждение результатов главы 2).

ВЫВОДЫ

глава 2).

3. Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный 4 Са2+-связывающий центр ЕР4.

3.1. Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са -связывающему центру.

3.2. Са2+-зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру, с фоторецепторными мембранами.

3.3. Са -зависимое ингибирование родопсинкиназы мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са -связывающему центру.

3.4. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом ЗРЯ-спектроскопии.

3.4.1. Применимость метода SPR-спектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековерина EF+4 с иммобилизованным липидным бислоем.

3.4.2. Кинетика диссоциации мутантов EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на SPR-чипе.

ВЫВОД

глава 3).

4. Са /рековерин - зависимая регуляция фототрансдукции и патологии зрения.

Ионы кальция и процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фундаментальными биологическими функциями, как клеточная пролиферация и дифференцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с С-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - сОМР-фосфодиэстераза послужили прототипами для большого числа работ по системам рецептор - С-белок -эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Многие эффекты Са2+ на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+-связывающими белками, мишенями для которых часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са2+-связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования/ дефосфорилирования посвящено большое число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении - была исключение. К моменту начала настоящей работы была ясна общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвоночных животных, в частности, доказана важность фосфорилирования родопсина для атгенюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторецепторной клетки. Однако систематическое и интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе - в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато благодаря обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина, функция которого к моменту начала настоящей работы не была установлена.

Рековерин - родоначальник белков семейства нейрональных Са2+-сенсоров, как и остальные представители этого семейства, содержит на 1ч[-конце миристоильный остаток. В свободном от Са2+ состоянии миристоильный остаток рековерина погружен в гидрофобный "карман" белка, вследствие чего рековерин находится в растворимой фазе. В присутствии Са2+, благодаря экспонированию миристоильного остатка из гидрофобного "кармана", рековерин транслоцируется из раствора на

VI мембрану. Этот механизм, получивший название Са -миристоильного переключателя, впервые описан для рековерина и позднее - также для других нейрональных Са2+-сенсоров.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что к моменту начала работы отсутствовала информация о (1) функции рековерина в фоторецепторных клетках и (и) механизме Са2+ -миристоильного переключателя рековерина и других представителей семейства нейрональных Са2+-сенсоров и о роли каждого Са2+-связывающего центра белка в работе этого механизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С учетом результатов, полученных в настоящей работе, суммируем основные сведения по ключевым механизмам фототрансдукции по состоянию на сегодняшний день.

Темновое состояние фоторецепторной клетки: компоненты каскада (родопсин, трансдуцин, ФДЭ) находятся в неактивированном состоянии; [cGMP] высокая и катионные каналы в плазматической мембране

94открыты; [Са ]f высокая, поэтому: (i) кальмодулин а) способствует поддержанию cGMP-зависимых катионных каналов в открытом состоянии и б) активир-ует аденилатциклазу, что - через активацию РКА и ингибирова-ние фосдуцина - предотвращает ингибирование трансдуцина; (ii) АГЦ 1 и 2 не активируют гуанилатциклазу, синтез cGMP гуанилатциклазой идет с низкой скоростью; (iii) рековерин находится в комплексе с родопсинкиназой и предотвращает фосфорилирование родопсина. Поглощение кванта света приводит к активации компонентов каскада, падению цитоплазматического уровня cGMP, закрыванию cGMP-завиеимых катионных каналов, гиперполяризации плазматической мембраны НСП и электрофизиологическому ответу; [Ca2+]f и функциональное состояние Са2+ -связывающих белков (кальмодулина, АГЦ 1 и 2, рековерина) то же, что и в темновом состоянии.

Возврат фоторецепторной клетки к темновому состоянию (recovery): в дополнение к понижению цитоплазматической [cGMP] происходит падение [Ca2+]f, в результате: (i) кальмодулин а) диссоциирует из комплекса с cGMP-завиеимыми катионными каналами, что способствует связыванию cGMP с каналами и их открыванию и б) диссоциирует из комплекса с аденилатциклазой, что приводит к снижению ее активности и затем - через уменьшение уровня сАМР и активности РКА - к прекращению фосфорилирования фосдуцина, что создает условия для ингибирования трансдуцина фосдуцином; (ii) АГЦ 1 и 2 активируют гуанилатциклазу, синтез cGMP ускоряется, что сопровождается повышением концентрации cGMP и открыванием cGMP-зависимых катионных каналов; (iii) рековерин диссоциирует из комплекса с родопсинкиназой.

Особого рассмотрения требует вопрос о том, на какую из реакций -фосфорилирование "темнового" или фотовозбужденного родопсина -направлено ингибирующее действие рековерина.

Большинство результатов по Са2+ -зависимому ингибированию фосфорилирования родопсина рековерином было получено в условиях in vitro: на суспензии НСП или в реконструированной системе. Если, однако, принять, что эти результаты могут быть экстраполированы к физиологическим условиям и что функция рековерина (или по крайней мере одна из его функций) в фоторецепторной клетке состоит в зависимой регуляции родопсинкиназы, то, с учетом наших данных о способности рековерина ингибировать фосфорилирование как фотовозбужденного, так и "темнового" родопсина, следует рассмотреть следующие возможные механизмы его действия in vivo: (1) рековерин ингибирует родопсинкиназу только в реакции фосфорилирования фотовозбужденного родопсина, тем самым обеспечивая кальциевый контроль передачи сигнала в зрительном каскаде родопсин - трансдуцин -ФДЭ; (2) рековерин Са -зависимым образом ингибирует родопсинкиназу только в реакции фосфорилирования темнового родопсина, но не действует на фосфорилирование Rho* и, соответственно, на передачу сигнала в каскаде; (3) в фоторецепторной клетке реализуются обе указанные возможности (1) и (2). Если функция рековерина в фоторецепторной клетке действительно заключается в

Са2+

-зависимом ингибировании фосфорилирования "темнового" родопсина, или, иначе говоря, "фосфорилирования с высоким выходом", то возникает вопрос, каков может быть физиологический смысл описанного явления?

Ответ на этот вопрос указывают следующие весьма специфические характеристики палочек сетчатки: а) концентрация родопсина в фоторецепторной мембране составляет величину порядка ЗмМ, что совершенно беспрецедентно для мембранных рецепторов; б) палочка способна работать в режиме счетчика квантов, когда насыщение ее электрофизиологического ответа достигается при фотовозбуждении всего лишь нескольких десятков молекул родопсина на НСП. Вследствие этого концентрация Rho в НСП в физиологических условиях может на много порядков превышать концентрацию Rho*.

Огромное число данных по киназам, фосфорилирующим сопряженные с G-белками рецепторы (к ним относится также и родопсин), указывает на то, что их функция заключается в фосфорилировании и тем самым в "выключении" (в англ. литературе используется термин down-regulation) активированного рецептора (в нашем случае - фотовозбужденного родопсина). В большинстве клеток концентрация мембранных рецепторов ничтожно мала, и благодаря высокой специфичности киназ в отношении активированных рецепторов, по сравнению с неактивированными, вероятность побочной реакции фосфорилирования нестимулированного рецептора невелика. Иное дело -палочка сетчатки, где в норме концентрация активированного рецептора (Rho*) на порядки ниже, чем концентрация нестимулированного рецептора (Rho), а это создает условия для конкуренции "темнового" родопсина с фотовозбужденным пигментом за родопсинкиназу, концентрация которой в НСП более чем на 2 порядка ниже концентрации родопсина, и тем самым для ее участия в "паразитной" реакции фосфорилирования Rho.

Если это так, то схему функционирования рековерина в палочке сетчатки можно представить следующим образом:

Л ,

- в темноте, когда [Са ^ в цитоплазме НСП высока, родопсинкиназа находится в комплексе с рековерином;

- свет вызывает появление Шю* и передачу сигнала в каскаде Шю* - трансдуцин - ФДЭ;

94- затем начинается снижение [Са в цитоплазме, как следствие, комплекс родопсинкиназа-рековерин диссоциирует, родопсинкиназа связывается с Шю*, активируется им и фосфорилирует его;

- фосфорилирование Шю* (в совокупности с некоторыми другими механизмами, функционирующими в НСП) выключает передачу сигнала в каскаде, при этом в цитоплазме НСП повышаются концентрации свМР и, что особенно важно в данном контексте, - [Са ;

- с увеличением числа фосфатных остатков, включенных в молекулу Шю*, сродство киназы к Шю*-Р снижается, она диссоциирует из комплекса, но фосфорилировать присутствующие в избытке (по отношению к Шю*) молекулы Шю не может, т.к. вновь связывается с рековерином и переходит в неактивную форму, - клетка вернулась к исходному "темновому" состоянию.

Таким образом, согласно нашей гипотезе, одной из функций рековерина в фоторецепторной клетке может быть предотвращение нежелательного фосфорилирования "темпового" родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии после ее диссоциации из комплекса с фотовозбужденным родопсином.

1. Филиппов П.П., Аршавский В.Ю., Дижур A.M. (1987). Биохимия зрительной рецепции. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, т.26.

2. Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. (2003). Передача и кодирование сигнала в сетчатке глаза. От нейрона к мозгу, гл.19.

3. Philippov, Р. (2000). Phototransduction and calcium. Membr. Cell. Biol. 13, p. 195206.

4. Ostroy SE. (1977). Rhodopsin and the visual process. Biochim Biophys Acta., 463(1), p. 91-125.

5. Chabre, M. (1985). Trigger and amplification mechanisms in visual phototransduction. Ann. Rev. Biophys. Chem. 14, p. 331-360.

6. Абдулаев, Н.Г. и Артамонов, И.Д. (1984). Биоорганическая химия Биохимия зрительного процесса. Биол. мембраны. 1, с. 775-793.

7. Dratz, Е.А. and Hargrave, P.А. (1983). The structure of rhodopsin and the rod outer segment disk membrane. Trends Biochem. Sci. 8, p. 128-131.

8. Hamm, H.E. and Bownds, M.D. (1986). Protein complement of rod outer segments of frog retina. Biochemistry 25, p. 4512-4525.

9. Schwartz, E.A. (1981). First events in vision: the generation of responses in vertebrate rods. J. Cell Biol. 90, p. 271-278.

10. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

11. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and active site studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, 261-264.

12. Ovchinnikov, Y.A., Abdulaev, N.G. and Bogachuk, A.S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. 230,1-5.

13. Yamazaki, A., Hayashi, F., Tatsumi, M., Bitensky, M.W. and George, J.S. (1990). Interactions between the subunits of transducin and cyclic GMP phosphodiesterase in Rana catesbiana rod photoreceptors. J. Biol. Chem. 265, 11539-11548.

14. Kuhn, H. (1980). Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.

15. Bennett, N. and Dupont, Y. (1985). The G-protein of retinal rod outer segments (transducin). Mechanism of interaction with rhodopsin and nucleotides. J. Biol. Chem. 260, 4156-4168.

16. Stryer, L. (1985). Molecular design of an amplification cascade in vision. Biopolymeres 24, 29-47.

17. Stryer, L., Hurley, J.B. and Fung, B.K. (1981). First stage of amplification in the cyclic nucleotide cascade of vision. Trends Biochem. Sci. 6, 245-247.

18. Hurley, J.B. (1992). Signal transduction enzymes of vertebrate photoreceptors. J. Bioenerg. and Biomemb. 24, 219-226.

19. Arshavsky, V.Y., Dizhoor, A.M., Shestakova, I.K. and Philippov, P.P. (1985). The effect of rhodopsin phosphorylation on the light-dependent activation of phosphodiesterase from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 181, 264-266.

20. Baehr, W., Delvin, M.J. and Applebury, M.L. (1979). Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine ROS. J. Biol. Chem. 254, 11669-11677.

21. Hurley, J.B. and Stryer, L. (1982). Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, 11094-11099.

22. Florio, S.K., Prusti, R.K and Beavo, J.A. (1996). Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 8 subunit. J. Biol. Chem. 271, 24036-24047.

23. Palczewski, K. and Saari, J.C. (1997). Activation and inactivation steps in the visual transduction pathway. Curr. Opin. Neurobiol., 7, 500-504.

24. Yamazaki, A., Hayashi, F., Tatsumi, M., Bitensky, M.W. and George, J.S. (1990). Interactions between the subunits of transducin and cyclic GMP phosphodiesterase in Rana catesbiana rod photoreceptors. J. Biol. Chem. 265, 11539-11548.

25. Lipkin, V.M., Dumler, I.L., Muradov, K.G., Artemyev, N.O. and Etingof, R.N. (1988). Active sites of the cyclic GMP phosphodiesterase gamma-subunit of retinal rod outer segment. FEBS Lett. 234, 287-290.

26. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87-119.

27. Cook, N.J., Hanke, W. and Kaupp, U.B. (1987). Identification, purification and functional reconstitution of the cyclic GMP-dependent channel from rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 585-589.

28. Yau, K.-W. and Baylor, D.A. (1989). Cyclic GMP-activated conductance of retinal photoreceptor cells. Annu. Rev. Neurosci. 12, 289-327.

29. Fesenko, E.E., Kolesnikov, S.S. and Lyubarsky, A.L. (1985). Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segments. Nature 313, 310-313.

30. Дижур, A.M., Аршавский, В.Ю., Шестакова, И.К. и Филиппов, П.П. (1984). Влияние фосфорилирования родопсина на светозависимую активацию фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов из наружных сегментов палочек сетчатки быка. Биологич. мембраны 10, 1051-1056.

31. Pfister, С., Chabre, M., Plouet, J., Tuyen, V.V., De Kozak, Y., Faure J.P. and Kuhn, H. (1985). Retinal S antigen identified as the 48K protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods. Scince 228, 891-893.

32. Kuhn, H. and Wilden, U. (1987). Deactivation of photoactivated rhodopsin by rhodopsin kinase and arrestin. J. Recept. Res. 7, 283-298.

33. Hargrave, P.A. and McDowell, J.H. (1992). Rhodopsin and phototransduction: a model system for G protein-linked receptors. FASEB Journal 6, 2323-2331.

34. Gurevich, V.V. and Benovic, J.L. (1992). Cell-free expression of visual arrestin. Truncation mutagenesis identifies multiples domains involved in rhodopsin interaction. J. Biol. Chem. 267, 21919-21923.

35. Arshavsky, V.Y. and Bownds, M.D. (1992). Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature 357, 416-417.

36. Faurobert, E. and Hurley, J.B. (1997). The core domain of new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,2945-2950.

37. Chen, C.-K., Wieland, T. and Simon, M.I. (1996). RGS-r, a retinal specific RGS protein, binds an intermediate conformational of transducin and enchances recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12885-12889.

38. He, W., Cowan, C.W. and Wensel, T.G. (1998). RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction. Neuron 20, 95-102.

39. Tsang, S.H., Burns, N.E., Calvert, P.D., Gouras, P., Baylor, D.A., Goff, S.P. and Arshavsky, V.Y. (1998). Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science 282,117-121.

40. Cote, R.H., Bownds, M.D. and Arshavsky, V.Y. (1994). cGMP binding sites on photoreceptor phosphodiesterase: role in feedback regulation of visual transdaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4845-4849.

41. Yamazaki, A., Bondarenko, V.A., Dua, S., Yamazaki, M., Usukura, J. and Hayashi, F. (1996). Possible stimulation of retinal rod recovery to dark state by cGMP release from a cGMP phosphodiesterase non catalytic site. J. Biol. Chem. 51, 32495-32498.

42. Lee, R.H., Lieberman, B.S. and Lolley, R.N. (1987). A novel complex from bovine visual cells of a 33,000-dalton phosphoprotein with beta and gamma transducin: purification and subunit structure. Biochemistry 28, 3983-3990.

43. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinas rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

44. Arshavsky VY. (2002). Rhodopsin phosphorylation: from terminating single photon responses to photoreceptor dark adaptation. Trends Neurosci. 25(3), p. 124-6.

45. Kohout TA, Lefkowitz RJ. (2003). Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63(1), p. 9-18.

46. Lee SJ, Xu H, Montell C. (2004). Rhodopsin kinase activity modulates the amplitude of the visual response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 101(32), p. 11874-9.

47. Maeda T, Imanishi Y, Palczewski K. (2003). Rhodopsin phosphorylation: 30 years later. Prog Retin Eye Res.22(4), p. 417-34.

48. Konstantin Levay, Daulet K. Satpaev, Alexey N. Pronin, Jeffrey L. Benovic, Vladlen Z. Slepak. (1998). Localization of the Sites for Ca2+-Binding Proteins on G Protein-Coupled Receptor Kinases. Biochemistry, 37, p. 13650-13659.

49. Palczewski K, Carruth ME, Adamus G, McDowell JH, Hargrave PA. (1990). Molecular, enzymatic and functional properties of rhodopsin kinase from rat pineal gland. Vision Res.;30(8), p. 1129-37.

50. Kunapuli P, Gurevich YY, Benovic JL. (1994). Phospholipid-stimulated autophosphorylation activates the G protein-coupled receptor kinase GRK5. J Biol Chem., 269(14), p. 10209-12.

51. Firsov D, Elalouf JM. (1997). Molecular cloning of two rat GRK6 splice variants. Am J Physiol., 273(3 Pt 1), p. C953-61.

52. Cassill, J.A., Whitney, M., Joazeiro, C.A., Becker, A., Zuker, C.S., (1991). Isolation of Drosophila genes encoding G protein-coupled receptor kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, p. 11067-11070.

53. Kikkawa, S., Yoshida, N. Nakagawa, M., Iwasa, T., Tsuda, M. (1998). A novel rhodopsin kinase in octopus photoreceptor possesses a pleckstrin homology domain and is activated by G protein betagamma-subunits. J. Biol. Chem. 273, p. 7441-7447.

54. Mayeenuddin, L.H., Mitchell, J. (2001). cDNA cloning and characterization of a novel squid rhodopsin kinase encoding multiple modular domains. Vis. Neurosci. 18, p. 907-915.

55. Brown, N.G., Fowles, C., Sharma, R., Akhtar, M. (1992). Mechanistic studies on rhodopsin kinase. Light-dependent phosphorylation of C-terminal peptides of rhodopsin. Eur. J. Biochem. 208, p. 659-667.

56. Dean, K.R., Akhtar, M. (1996). Novel mechanism for the activation of rhodopsin kinase: implications for other G protein-coupled receptor kinases (GRK'S). Biochemistry 35, p. 6164-6172.

57. McCarthy, N.E., Akhtar, M. (2002). Activation of rhodopsin kinase. Biochem. J. 363, p. 359-364.

58. Dean, K.R. and Akhtar, M. (1993). Phosphorylation of solubilized dark-adapted rhodopsin. Insights into the activation of rhodopsin kinase. Eur. J. Biochem. 21, p. 881-890.

59. Hisatomi, O., Matsuda, S., Satoh, T., Kotaka, S., Imanishi, Y., Tokunaga, F. (1998). A novel subtype of G-protein-coupled receptor kinase, GRK7, in teleost cone photoreceptors. FEBS Lett. 424, p. 159-164.

60. Chen, C.K., Zhang, K., Church-Kopish, J., Huang, W., Zhang, H., Chen, Y.J., Frederick, J.M., Baehr, W. (2001). Characterization of human GRK7 as a potential cone opsin kinase. Mol. Vis. 7, p. 305-313.

61. Zhao, X., Huang, J., Khani, S.C., Palczewski, K. (1998). Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). J. Biol. Chem. 273, p. 5124-5131.

62. Sears, S., Erickson, A., Hendrickson, A. (2000). The spatial and temporal expression of outer segment proteins during development of macaca monkey cones. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, p. 971-979.

63. Lyubarsky, A.L., Chen, C., Simon, M.I., Pugh Jr., E.N. (2000). Mice lacking g-protein receptor kinase 1 have profoundly slowed recovery of cone-driven retinal responses. J. Neurosci. 20, p. 2209-2217.

64. Ho, A.K., Somers, R.L., Klein, D.C. (1986). Development and regulation of rhodopsin kinase in rat pineal and retina. J. Neurochem. 46, p. 1176-1179.

65. Somers, R.L., Klein, D.C. (1984). Rhodopsin kinase activity in the mammalian pineal gland and other tissues. Science 226, p. 182-184.

66. Zhao, X., Haeseleer, F., Fariss, R.N., Huang, J., Baehr, W., Milam, A.H., Palczewski, K. (1997). Molecular cloning and localization of rhodopsin kinase in the mammalian pineal. Vis. Neurosci. 14, p. 225-232.

67. Wilden U., Kuhn H. (1982). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin: number of phosphorylation sites. Biochemistry, 21, p. 3014-3022.

68. Premont, R.T., Inglese, J., Lefkowitz, RJ. (1995). Protein kinases that phosphorylate activated G protein-coupled receptors. Faseb J. 9 (2), p. 175-182.

69. Palczewski, K., Buczylko, J., Lebioda, L., Crabb, J.W., Polans, A.S. (1993). Identi.cation of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its interaction with rhodopsin. J. Biol. Chem. 268, p. 6004-6013.

70. Siderovski, D.P., Hessel, A., Chung, S., Mak, T.W., Tyers, M. (1996). A new family of regulators of G-protein-coupled receptors? Curr. Biol. 6, p. 211-212.

71. He, W., Cowan, C.W., Wensel, T.G. (1998). RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction. Neuron 20, p. 95-102.

72. Ross, E.M., Wilkie, T.M. (2000). GTPase-activating proteins for heterotrimeric g proteins: regulators of G protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. Annu. Rev. Biochem. 69, p. 795-827.

73. Lorenz W., Inglese J., Palczewski K., Onorato JJ, Caron MG, Lefkowitz RJ.1991). The receptor kinase family: primary structure of rhodopsin kinase reveals similarities to the beta-adrenergic receptor kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 88(19), p. 8715-9.

74. Inglese, J., Glickman, J.F., Lorenz, W., Caron, M.G., Lefkowitz, RJ. (1992a). Isoprenylation of a protein kinase. Requirement of farnesylation/alpha-carboxyl methylation for full enzymatic activity of rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 267, p. 1422-1425.

75. Inglese, J., Koch, W.J., Caron, M.G., Lefkowitz, RJ. (1992b). Isoprenylation in regulation of signal transduction by G-proteincoupled receptor kinases. Nature 359, p. 147-150.

76. Palczewski K, Buczylko J, Van Hooser P, Carr SA, Huddleston MJ, Crabb JW.1992). Identification of the autophosphorylation sites in rhodopsin kinase. J Biol Chem., 267(26), p. 18991-8.

77. Buczylko J, Gutmann C, Palczewski K. (1991). Regulation of rhodopsin kinase by autophosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A., 88(6), p. 2568-72.

78. Palczewski K, Ohguro H, Premont RT, Inglese J. (1995). Rhodopsin kinase autophosphorylation. Characterization of site-specific mutations. J Biol Chem., 270(25), p. 15294-8.

79. Satpaev DK, Chen CK, Scotti A, Simon MI, Hurley JB, Slepak VZ. (1998). Autophosphorylation and ADP regulate the Ca2+-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase. Biochemistry, 37(28), p. 10256-62.

80. Palczewski, K., McDowell, J.H., Hargrave, P.A., 1988a. Purification and characterization of rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 263, p. 14067-4073.

81. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, p. 179-191.

82. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and activesite studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, p. 261-264.

83. Ovchinnikov, Y. A., Abdulaev, N. G. and Bogachuk, A. S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. P. 230,1-5.

84. Palczewski K, McDowell JH, Hargrave PA. (1988). Rhodopsin kinase: substrate specificity and factors that influence activity. Biochemistry, 27(7), p. 2306-13.

85. Pulvermuller A, Palczewski K, Hofmann KP. (1993). Interaction between photoactivated rhodopsin and its kinase: stability and kinetics of complex formation. Biochemistry, 32(51), p. 14082-8.

86. McCarthy NEM. (1998) Mechanistic studies on rhodopsin kinase: a farnesylated protein. PhD Thesis. Southampton University, Southampton.

87. Pullen N, Akhtar M. (1994). Rhodopsin kinase: studies on the sequence of and the recognition motif for multiphosphorylations. Biochemistry, 33(48), p. 14536-42.

88. Frank RN, Buzney SM. (1975). Mechanism and specificity of rhodopsin phosphorylation. Biochemistry, 14(23), p. 5110-7.

89. McDowell JH, Kuhn H. (1977). Light-induced phosphorylation of rhodopsin in cattle photoreceptor membranes: substrate activation and inactivation. Biochemistry, 16(18), p. 4054-60.

90. Fowles C., Sharma R., Akhtar M. (1988). Mechanistic studies on the phosphorylation of photoexcited rhodopsin. FEBS Lett., 238, p. 56-60.

91. Arshavsky, V.Y. and Bownds, M.D. (1992). Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature 357,416-417.

92. Palczewski, K., Buczylko, J., Kaplan, M.W., Polans, A.S., Crabb, J.W. (1991). Mechanism of rhodopsin kinase activation. J. Biol.Chem. 266, p. 12949-12955.

93. Langen, R., Cai, K., Altenbach, C., Khorana, H.G., Hubbell, W.L. (1999). Structural features of the C-terminal domain of bovine rhodopsin: a site-directed spin-labeling study. Biochemistry 38, p. 7918-7924.

94. Филиппов П.П. (1998) Как внешние сигналы передаются внутрь клетки // Соросовский Образовательный Журнал. № 3. С. 28-34.

95. Buczylko, J., Saari, J.C., Crouch, R.K., Palczewski, К. (1996). Mechanisms of opsin activation. J. Biol. Chem. 271, p. 20621-20630.

96. Shi, W., Osawa, S., Dickerson, C.D., Weiss, E.R. (1995). Rhodopsin mutants discriminate sites important for the activation of rhodopsin kinase and Gt. J. Biol. Chem. 270, p. 2112-2119.

97. Thurmond, R.L., Creuzenet, C., Reeves, P.J., Khorana, H.G. (1997).

98. Structure and function in rhodopsin: peptide sequences in the cytoplasmic loops of rhodopsin are intimately involved in interaction with rhodopsin kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, p. 1715-1720.

99. Karnik, S.S., Ridge, K.D., Bhattacharya, S., Khorana, H.G. (1993). Palmitoylation of bovine opsin and its cysteine mutants in COS cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, p. 40-44.

100. Hargrave, P.A. (2001). Rhodopsin structure, function, and topography the friedenwald lecture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, p. 3-9.

101. McDowell, J.H., Nawrocki, J.P., Hargrave, P.A. (1993). Phosphorylation sites in bovine rhodopsin. Biochemistry 32, p. 4968-4974.

102. Ohguro, H., Palczewski, K. (1995). Separation of phospho- and nonphosphopeptides using reverse phase column chromatography. FEBS Lett. 368, p. 452—454.

103. Papac, D.I., Oatis Jr., J.E., Crouch, R.K., Knapp, D.R. (1993). Mass spectrometric identi.cation of phosphorylation sites in bleached bovine rhodopsin. Biochemistry 32, p. 5930-5934.

104. Mendez, A., Burns, M.E., Roca, A., Lem, J., Wu, L.W., Simon, M.I., Baylor, D.A., Chen, J. (2000). Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites. Neuron 28, p. 153-164.

105. Senin, I.I., Zargarov, A.A., Alekseev, A.M., Gorodovikova, E.N., Lipkin, V.M. and Philippov, P.P. (1995). N-myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. FEBS Lett. 376, p. 87-90.

106. Ostroy, S.E. (1977). Characterization of carbohydrate-binding protein p33/41. FEBS Lett. 148, p. 179-191.

107. Binder, B.M., OConnor, T.M., Bownds, M.D., Arshavsky, V.Y. (1996). Phosphorylation of non-bleached rhodopsin in intact retinas and living frogs. J. Biol. Chem. 271, p. 19826-19830.

108. Kuhn, H. and Wilden, U. (1987). Deactivation of photoactivated rhodopsin by rhodopsin kinase and arrestin. J. Recept. Res. 7, 283-298.

109. Lagnado, L. and Baylor, D.A. (1994). Calcium controls light-triggered formation of catalytically active rhodopsin. Nature 367, 273-277.

110. Hsu, Y.-T. and Molday, R.S. (1993) Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell by calmodulin. Nature 361, 76-79.

111. Woodruff, M.L. and Bownds, M.D. (1979). Regulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell. J. Gen. Physiol. 73, 629-653.

112. Hackos, D.H. and Korenbrot, J.I. (1997). Calcium modulation of ligand affinity in the cyclic GMP-gated ion channels of cone photoreceptors. J. Gen. Physiol. 110, 515-528.

113. Schnetkamp, P.P.M., Szerencsei, R.T. and Basu, D.K. (1991). Unidirectional Na+, Ca2+ and K+ fluxes through the bovine rod outer segment Na+ -Ca2+-K+-cxchanger. J. Biol. Chem. 266, 198-206.

114. Dean, K.R., Akhtar, M. (1996). Novel mechanism for the activation of rhodopsin kinase: implications for other G protein-coupled receptor kinases (GRK'S). Biochemistry 35, p. 6164-6172.

115. Cervetto, L., Lagnado, L., Perry, R.J., Robinson, D.W. and McNaughton, P.A. (1989). Extrusion calcium from rod outer segments is driven by both sodium and potassium gradients. Nature 337, 740-743.

116. Ratto, G.M., Payne, R., Owen, W.G. and Tsien, R.Y. (1988). The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with Fura-2. J. Neurosci. 8, 3240-3246.

117. McCarthy, N.E., Akhtar, M. (2002). Activation of rhodopsin kinase. Biochem. J. 363, p. 359-364.

118. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebrate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54, 153-175.

119. Duda, T., Goraczniak, R., Surgucheva, I., Rudnicka-Nawrot, M., Gorczyca, W.A., Palczewski, K., Sitaramayya, A., Baehr, W. and Sharma, R.K. (1996). Calcium modulation of bovine photoreceptor guanylate cyclase. Biochemistry 35, 8478-8482.

120. Yang, R.-B. and Garbers, D.L. (1997). Chromosomal localization and genomic organization of genes encoding guanylyl cyclase receptors expressed in olfactory sensory neurons and retina. J. Biol. Chem. 272, 13738-13742.

121. Koch, K.-W. and Stryer, L. (1988). Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature 334, 64-66.

122. Koch, K.-W. (1991). Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 266, 8634-8637.

123. Gorczyca, W.A., Polans, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W. and Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activation protein. J. Biol. Chem. 270, 22029-22036.

124. Dizhoor, A.M., Lowe, D.G., Olshevskaya, E.V., Laura, R.P. and Hurley, J.B. (1994). The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator. Neuron. 12, 13451352.

125. Haeseleer, F., Sokal, I., Li, N., Pettenati, M., Rao, N., Bronson, D., Wechter, R., Baehr, W. and Palczewski, K. (1999). Molecular characterization of a third member of the guanylyl cyclase-activating protein subfamily J. Biol. Chem. 274, 6526-6535.

126. Cuenza, N., Lopez, S. and Kolb, H. (1998). The localization of guanylyl cyclase-activating proteins in the mammalian retina. Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 12431250.

127. Dizhoor, A.M., Lowe, D.G., Olshevskaya, E.V., Laura, R.P. and Hurley, J.B. (1994). The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator. Neuron. 12, 13451352.

128. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1996). Inactivation of EF-hand makes GCAP-2 (p24) a constitutive activator of photoreceptor guanylyl cyclase by preventing a Ca2+ induced activator-to-inhibitor transition. J. Biol. Chem. 271, 19346-19350.

129. Koch, K.-W. (1991). Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 266, 8634-8637.

130. Yang, Z. and Wensel, T.G. (1992). Inorganic pyrophosphatase from bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 267, 24634-24640.

131. Margulis, A., Pozdnyakov, N. and Sitaramayya, A. (1996). Activation of bovine photoreceptor guanylate cyclase by SI00 proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 243-247.

132. Gray-Keller, M.P. and Detwiler, P.B. (1994). Regulation of the cAMP synthesis by calcium in rods. Neuron 13, 846-861.

133. Nicholson, D.G. (1994). Proteins, transmitters and synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 198-239.

134. Walsh, D.A. and Van Patten, S.M. (1994). Multiple pathway signal transduction by the cAMP-dependent protein kinase. FASEB J. 8, 1227-1236.

135. Lee, R.H., Lieberman, B.S. and Lolley, R.N. (1987). A novel complex from bovine visual cells of a 33,000-dalton phosphoprotein with beta and gamma transducin: purification and subunit structure. Biochemistry 28, 3983-3990.

136. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinal rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

137. Herzberg, O. and James, M.N. (1988). Refined crystal structure of troponin С from turkey skeletal muscle at 2.0A resolution. J. molec. Biol. 203, 761-779.

138. Skelton, N.J., Korder, J., Akke, M., Forsen, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature struct. Biol. 1, 239-245.

139. Finn, B.E., Drakenberg, T. and Forsen, S. (1993). The structure of apocalmodulin: a 1H NMR examination of the carboxy-terminal domain. FEBS Lett. 336, 368-374.

140. Nef, P. (1996). Neuron-specific calcium sensors (the NCS subfamily). Guidebook to the calcium-binding proteins. Oxford University Press, New York, 9498.

141. Crivici, A. and Ikura, M. (1995). Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 85-116.

142. Дижур A.M., Некрасова Э.Н., Филиппов П.П. (1991). Новый специфичный для фоторецепторных клеток белок с молекулярной массой 26 кДа, способный связываться с иммобилизованным делипидизированным родопсином. Биохимия 56, 225-229.

143. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B., Stryer, L. (1991). Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251, 915-918.

144. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). Light-dependent phosphorylation a 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 317, 4548.

145. Korf, H.W., White, B.H., Schaad, N.C. and Klein, D.C. (1992). Recoverin in pineal organs and retinae of various vertebrate species including man. Brain Research 595, 57-66.

146. Milam, A.H., Dacey, D.M. and Dizhoor, A. (1993). Recoverin immunoreactivity in mammalian cone bipolar cells. Vis. Neurosci. 10, 1-12.

147. Wiechmann, A.F. and Hammarback, J.A. (1993). Expression of recoverin mRNA in the human retina: localization by in situ hybridization. Exp. Eye Res. 57, 763-769.

148. Nakanishi, S. (1996). Second-order neurones and receptor mechanisms in visual-and olfactory-information processing. Trends Neurosci. 18, 359-364.

149. De Raad, S., Comte, M., Nef, P., Lenz, S.E., Gundelfmger, E.D. and Cox, J.A. (1995). Distribution pattern of three neural calcium-binding proteins (NSC-1, VILIP and recoverin) in chicken, bovine and rat retina. Histochem. J. 27, 524-535.

150. Mo, Y., Campos, B., Mealy, T., Commodore, L., Head, J., Dedman, J.R. and Seaton, B.A. (2003). Interfacial Basic Cluster in Annexin V Couples Phospholipid Binding and Trimer Formation on Membrane Surfaces. J. Biol. Chem. 278, 2437 -2443.

151. Bitto, E., Cho, W. (1998). Roles of individual domains of annexin I in its vesicle binding and vesicle aggregation: a comprehensive mutagenesis study. Biochemistry 37(28), 10231-7.

152. McGinnis, J.F., Stepanik, P.L., Jariangprasert, S. and Lerious, V. (1997). Functional significance of recoverin localization in multiple retina cell types. J. Neurosci. Res. 50, 487-495.

153. Lambert, O., Gerke, V., Bader, M.F., Porte, F. and Brisson, A. (1997). Structural analysis of junctions formed between lipid membranes and several annexins by cryoelectron microscopy. J. Mol. Biol. 272, 42-55.

154. Naka, M., Qing, Z.X., Sasaki, T., Kise, H., Tawara, I., Hamaguchi, S., Tanaka, T. (1994). Purification and characterization of a novel calcium-binding protein, S100C, from porcine heart. Biochim. Biophys. Acta 1223(3), 348-53.

155. Johnsson, N., Nguyen Van, P., Soling, H.D. and Weber, K. (1986). Functionally distinct serine phosphorylation sites of p36, the cellular substrate of retroviral protein kinase; differential inhibition of reassociation with pi 1. EMBO J. 5, 3455 3460.

156. Sudo, T. and Hidaka, H. (1998). Regulation of calcyclin (S100A6) binding by alternative splicing in the N-terminal regulatory domain of annexin XI isoforms. J. Biol. Chem. 273, 6351-6357.

157. Garbuglia, M., Verzini, M. and Donato, R. (1998). Annexin VI binds S100A1 and S100B and blocks the ability of S100A1 and S100B to inhibit desmin and GFAP assemblies into intermediate filaments. Cell Calcium 24, 177-191.

158. Bandorowicz-Pikula, J. and Awasthi, Y.C. (1997). Interaction of annexins IV and VI with ATP. An alternative mechanism by which a cellular function of these calcium- and membrane-binding proteins is regulated. FEBS Lett., 409(2), 300-6.

159. Tzima, E., Trotter, P.J., Orchard, M.A. and Walker, J.H. (2000). Annexin V relocates to the platelet cytoskeleton upon activation and binds to a specific isoform of actin. Eur. J. Biochem. 267, 4720-4730.

160. Dalil-Thiney, N., Bastianelli, E., Pochet, R., Reperant, J. and Versaux-Botteri, C. (1998). Recoverin and hippocalcin distribution in the lamprey (Lampreta fluviatilis) retina. Neurosci. Lett. 247, 163-166.

161. Bazhin, A.V., Poplinskaya, V.A., Tikhomirova, N.K. et al. (2003) Immunochemical localization of calcium-binding protein recoverin in retina of newt Pleurodeles wait. Biol. Bull. (Moscow), (in press).

162. Kim, S.W., Rhee, H.J., Ko, J., Kim, Y.J., Kim, H.G., Yang, J.M., Choi, E.C. and Na, D.S. (2001). Inhibition of Cytosolic Phospholipase A2 by Annexin I. J. Biol. Chem. 276(19), 15712-9.

163. Bastianelli, E. and Pochet, R. (1994). Calbindin-D28k, calretinin, and recoverin immunoreactivities in developing chick pineal gland. J. Pineal. Res. 17, 103-111.

164. Bastianelli, E., Polans, A.S., Hidaka, H. and Pochet R. (1995). Differential distribution of six calcium-binding proteins in the rat olfactory epithelium during postnatal development and adulthood. J. Comp. Neurol. 354, 395-409.

165. Baimbridge, K.G., Celio, M.R. and Greenberg, M.E. (1992). Calcium-binding protein in the neuros system. Trends Neurosci. 15, 303-308.

166. Wiechmann, A.F. and Hammarback, J.A. (1993). Expression of recoverin mRNA in the human retina: localization by in situ hybridization. Exp. Eye Res. 57, p. 763-769.

167. McGinnis, J.F., Stepanik, P.L., Jariangprasert, S. and Lerious, V. (1997). Functional significance of recoverin localization in multiple retina cell types. J. Neurosci. Res. 50, p. 487-495.

168. Dalil-Thiney, N., Bastianelli, E., Pochet, R., Reperant, J. and Versaux-Botteri, C. (1998). Recoverin and hippocalcin distribution in the lamprey (Lampreta fluviatilis) retina. Neurosci. Lett. 247, p. 163-166.

169. Bastianelli, E. and Pochet, R. (1994). Calbindin-D28k, calretinin, and recoverin immunoreactivities in developing chick pineal gland. J. Pineal. Res. 17, p. 103-111.

170. Bastianelli, E., Polans, A.S., Hidaka, H. and Pochet R. (1995). Differential distribution of six calcium-binding proteins in the rat olfactory epithelium during postnatal development and adulthood. J. Comp. Neurol. 354, p. 395-409.

171. Wiechmann, A.F.(1995). Molecular cloning recoverin from human retina. Exp. Eye Res. 58, p. 630-637.

172. Bazhin, A.V., Poplinskaya, V.A., Tikhomirova, N.K. et al. (2008) Immunochemical localization of calcium-binding protein recoverin in retina of newt Pleurodeles wait. Biol. Bull. (Moscow), (in press).

173. Milam, A.H., Dacey, D.M. and Dizhoor, A. (1993). Recoverin immunoreactivity in mammalian cone bipolar cells. Vis. Neurosci. 10, p. 1-12.

174. Wiechmann, A.F. and Hammarback, J.A. (1993). Molecular cloning and nucleotide sequence of a cDNA encoding recoverin from human retina. Exp. Eye Res. 56, 463-470.

175. Wiechmann, A.F., Akots, G., Hammarback, J.A., Pettenati, M.J., Rao, P.N. and Bowden, D.W. (1994). Genetic and physical mapping of human recoverin: a gene expressed in retinal photoreceptors. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 35, 325-331.

176. Korf, H.W., White, B.H., Schaad, N.C. and Klein, D.C. (1992). Recoverin in pineal organs and retinae of various vertebrate species including man. Brain Research 595, p. 57-66.

177. De Raad, S., Comte, M., Nef, P., Lenz, S.E., Gundelfinger, E.D. and Cox, J.A. (1995). Distribution pattern of three neural calcium-binding proteins (NSC-1, VILIP and recoverin) in chicken, bovine and rat retina. Histochem. J. 27, p. 524-535.

178. Ray, S., Zozulya, S., Niemi, G.A., Flaherty, K.M., Brolley, D., Dizhoor, A.M., McKay, D.B., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1992). Cloning, expression, and crystallization of recoverin, a calcium sensor in vision. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 5705-5709.

179. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). Light-dependent phosphorylation a 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 317, p. 45-48.

180. Дижур A.M., Некрасова Э.Н., Филиппов П.П. (1991). Новый специфичный для фоторецепторных клеток белок с молекулярной массой 26 кДа, способный связываться с иммобилизованным делипидизированным родопсином. Биохимия 56, с. 225-229.

181. Wiechmann, A.F., Akots, G., Hammarback, J.A., Pettenati, M.J., Rao, P.N. and Bowden, D.W. (1994). Genetic and physical mapping of human recoverin: a gene expressed in retinal photoreceptors. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 35, p. 325-331.

182. Bourne, Y., Dannenberg, J., Pollmanni, V., Marchot, P. and Pongsi, O. (2001). Immunocytochemical localization and crystal structure of human frequenin (neuronal calcium sensor 1). J. Biol. Chem. 276, p. 11949-11955.

183. Sanada, K., Kokame, K., Yoshizawa, T., Takao, T., Shimonishi, Y. and Fukada, Y. (1995). Role of heterogeneous N-terminal acylation of recoverin in rhodopsin phosphorylation. J. Biol. Chem. 270, 15459-15462.

184. Dean, K.R. and Akhtar, M. (1993). Phosphorylation of solubilized dark-adapted rhodopsin. Insights into the activation of rhodopsin kinase. Eur. J. Biochem. 21, p. 881-890.

185. Johnson, R.S., Ohguro, H., Palczewski, K., Hurley, J.B., Walsh, K.A. and Neubert, T.A. (1994). Heterogeneous N-acylation is a tissue- and species-specific posttranslational modification. J. Biol. Chem. 269,21067-21071.

186. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,11569-11573.

187. Kretsinger, R.H. (1980). Structure and evolution of calcium-modulated proteins. CRC Crit. Rev. Biochem. 8,119-174.

188. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, 709-716.

189. Hisatomi, O., Matsuda, S., Satoh, T., Kotaka, S., Imanishi, Y., Tokunaga, F. (1998). A novel subtype of G-protein-coupled receptor kinase, GRK7, in teleost cone photoreceptors. FEBS Lett. 424, p. 159-164.

190. Hughes, R.E., Brzovic, P.S., Klevit, R.E. and Hurley, J.B. (1995). Calcium-dependent solvation of the myristoyl group of recoverin. Biochemistry 34, 1141011416.

191. Kretsinger, R.H., Rudnick, S.E. and Weissman, L.J. (1986). Crystal structure of calmodulin. J. Inorg. Biochem. 28, 289-302.

192. Babu, Y.S., Bugg, C.E. and Cook, W.J. (1988). Three-dimensional structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution. J. Molec. Biol. 204, 191-204.

193. Ames, J.B., Ishima, R., Tanaka, T., Gordon, J.I., Stryer, L. and Ikura, M. (1997) Molecular mechanics of calcium-myristoyl switches. Nature 389, 198-202.

194. De Castro, E., Nef, S., Fiumelli, H., Lenz, S.E., Kawamura, S. and Nef, P. (1995). Regulation of rhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 216 (1), p. 133-140.

195. Tachibanaki, S., Nanda, K., Sasaki, K., Ozaki, K. and Kawamura, S. (2000) Amino acid residiues of S-modulin responsible for interaction with rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 275, 3313-3319.

196. Ratto, G.M., Payne, R., Owen, W.G. and Tsien, R.Y. (1988). The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with Fura-2. J. Neurosci. 8, 3240-3246.

197. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebrate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54, 153-175.

198. Koch, K.-W. and Stryer, L. (1988). Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature 334, 64-66.

199. Koch, K.-W. (1991). Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 266, 8634-8637.

200. Surgucheva, I., Dizhoor, A.M., Hurley, J.B., Palczewski, K. and Baehr, W. (1997). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, S477.

201. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinas rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

202. Schnetkamp, P.P.M., Basu, D.K. and Szerencsei, R.T. (1989). Na+ -Ca2+ exchanger in bovine rod outer segment requires and transports. Am. J. Physiol. 257, C153-157.

203. Schnetkamp, P.P.M., Szerencsei, R.T. and Basu, D.K. (1991). Unidirectional Na+, Ca2+ and K+ fluxes through the bovine rod outer segment Na+ -Ca2+-K+-exchanger. J. Biol. Chem. 266,198-206.

204. Cook, NJ. and Kaupp, U.B. (1988). Solubilisation, purification and reconstitution of the sodium-calcium exchanger from bovine retinal rod outer segment. J. Biol. Chem. 263, 11382-11388.

205. McNaughton, P.A., Cervetto, L. and Nunn, B.J. (1986). Measurement of the intracellular free calcium concentration in salamander rods. Nature. 322, 261-263.

206. Semple-Rowland, S.L., Gorczyca, W.A., Buczylko, J., Helekar, B.S., Ruiz, C.C., Subbaraya, I., Palczewski, K. and Baehr, W. (1996). Expression of GCAP1 and GCAP2 in the retinal degeneratiom mutant chicken retina. FEBS Lett. 385, 47-52.

207. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1999). Regulation of photoreceptor membrane guanylyl cyclases by guanylyl cyclase activator proteins. Methods 19, 521-531.

208. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1996). Inactivation of EF-hand makes GCAP-2 (p24) a constitutive activator of photoreceptor guanylyl cyclase by preventing a Ca2+ induced activator-to-inhibitor transition. J. Biol. Chem. 271,19346-19350.

209. Boguta, G. and Bierzynski, A. (1989). Conformational properties of Ca2+-binding segments of proteins from the troponin C superfamily. Biophys. Chem. 31, 133-137.

210. Olshevskaya, E.V., Ermilov, A.N. and Dizhoor, A.M. (1999). Dimerization of guanylyl cyclase-activating protein and a mechanism of photoreceptor guanylyl cyclase activation. J. Biol. Chem. 274,25583-25587.

211. Forsen, S. and Linse, S. (1995). Cooperativity: over the Hill. Trends Biochem. Sci. 20, 495-497.

212. Krishnan, A., Goraczniak, R.M., Duda, T. and Sharma, R.K. (1998). Third calcium-modulated rod outer segment membrane guanylate cyclase transduction mechanism. Mol. Cell Biochem. 178, 251-259.

213. Braunewell, K.-H. and Gundelfinger, E.D. (1999). Intracellular neuronal calcium sensor proteins: a family of EF-hand calcium-binding proteins in search of a function. Cell. Tissue Res. 295, 1-12.

214. Okazaki, K., Watanabe, M., Ando, Y., Hagiwara, M., Terasawa, M., Hidaka, H. (1992). Full sequence of neurocalcin, a novel calcium-binding protein abundant in central nervous system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 185, 147-153.

215. Kumar, S.V. and Kumar, V.D. (1999). Crystal structure of recombinant neurocalcin. Nature Struct. Biol. 6, 80-88.

216. Ladant, D. (1995). Calcium and membrane binding properties of bovine neurocalcin delta expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270, 3179-3185.

217. Moncrief, N.D., Kretsinger, R.H. and Goodman, M. (1990). Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. I. Relationships based on amino acid sequences. J. Mol. Evol. 30, p. 522-562.

218. Heizmann, C.W. and Hunziker, W. (1991). Intracellular calcium-binding proteins: more sites than insight. Trends Biochem. Sci. 16, 98-103.

219. Ikura, M. (1996). Calcium binding and conformational response in EF-hand proteins. Trends Biochem. Sci. 21, 14-17.

220. Chazin, W.J. (1995). Releasing the calcium trigger. Nature struct. Biol. 2, 707710.

221. Skelton, N.J., Korder, J., Akke, M., Forsen, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature struct. Biol. 1, 239-245.

222. Finn, B.E., Drakenberg, T. and Forsen, S. (1993). The structure of apocalmodulin: a 'H NMR examination of the carboxy-terminal domain. FEBS Lett. 336, 368-374.

223. Skeleton, N.J., Korderl, J., Akke, M., Forsem, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature Struct. Biol. 1, 239-245.

224. Faurobert, E., Chen, C.K., Hurley, J.B. and Teng, D.H. Drosophila neurocalcin, a fatty acylated, Ca2+-binding protein that associates with membranes and inhibits in vitro phosphorylation of bovine rhodopsin. J. Biol. Chem. 271,10256-10262.

225. Ames, J. B., Hendricks, K. B., Strahl, T., Huttner, I. G., Hamasaki, N. & Thorner, J. (2000). Structure and calcium-binding properties of Frql, a novel calcium sensor in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Biochemistry, 39, p. 12149-12161.

226. Hendricks, K.B, Wang, B.Q., Schnitders, E.A. and Thorner, J. (1999). Yeast homologue of neuronal frequenin is a regulator of phosphatidylinositol-4-OH kinase. Nat. Cell Biol. 1,234-241.

227. McFerran, B., Graham, M.E. and Burgoyne, R.D. (1998). Lack of bioeffects of ultrasound energy after intravenous administration of FS069 (Optison) in the anesthetized rabbit. J. Biol. Chem. 273, 22768-22772.

228. Olafsson, P., Soares, H.D., Herzog, K.H., Wang, T., Morgan, J.I. and Lu, B. (1997). The Ca2+-binding protein, frequenin is a nervous system-specific protein in mouse preferentially localized in neurites. Brain Res. Mol. Brain Res. 44, 73-81.

229. Olafsson, P., Wang, T. and Lu, B. (1995). The Ca2+-binding protein, frequenin is a nervous system-specific protein in mouse preferentially localized in neurites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8001-8005.

230. Bourne, Y., Dannenberg, J., Pollmanni, V., Marchot, P. and Pongsi, O. (2001). Immunocytochemical localization and crystal structure of human frequenin (neuronal calcium sensor 1). J. Biol. Chem. 276, 11949-11955.

231. Towler, D.A., Gordon, J.I., Adams, S.P. and Glaser, L. (1988). The biology and enzymology of eukaryotic protein acylation. Annu. Rev. Biochem. 57, 69-99.

232. Afshar, M. (1994). Investigating the high affinity and low sequence specificity of calmodulin binding to its targets. J. Biol. Chem. 244, 554-571.

233. Nakamura, T.Y., Pountney, D.J., Ozaita, A., Nandi, S., Ueda, S., Rudy, B. and Coetzee, W.A. (2001). A role for frequenin, a Ca2+-binding protein, as a regulator of Kv4 K+-currents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 12808-12813.

234. De Castro, E., Nef, S., Fiumelli, H., Lenz, S.E., Kawamura, S. and Nef, P. (1995). Regulation of rhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors. Biochem. Biophys. Res. Coramun. 216, 133-140.

235. Ames, J.B., Hendricks, K.B., Strahl, T., Huttner, I.G., Hamasaki, N. and Thorner, J. (2000). Structure and calcium-binding properties of Frql, a novel calcium sensor in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 39, 12149-12161.

236. Kretsinger, R.H., Rudnick, S.E. and Weissman, L.J. (1986). Crystal structure of calmodulin. J. Inorg. Biochem. 28, 289-302.

237. An, W.F., Bowlby, M.R., Betty, M., Cao, J., Ling, H.P., Mendoza, G., Hinson, J.W., Mattsson, K.I., Strassle, B.W., Trimmer, J.S. and Rhodes, K.J. (2000). Modulation of A-type potassium channels by a family of calcium sensors. Nature 403, 553-556.

238. Takimoto, K., Yang, E.K. and Conforti, L. (2002). Palmitoylation of KChIP splicing variants is required for efficient cell surface expression of Kv4.3 channels. J. Biol. Chem. 277, 26904-26911.

239. Cheung, W.Y. Regulatory properties of bovine brain calmodulin-dependent phosphatase. Calcium and calcium binding proteins. Eds. C. Gerday et al. B.; Heidelberg: Springer, 1988,163-178.

240. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 31-39.

241. Bahring, R., Dannenberg, J., Peters, H.C., Leicher, T., Pongs, O. and Isbrandt, D. (2001). Conserved Kv4 N-terminal domain critical for effects of Kv channel-interacting protein 2.2 on channel expression and gating. J. Biol. Chem. 276, 2388823894.

242. Buxbaum, J.D., Choi, E.K., Luo, Y., Lilliehook, C., Crowley, A.C., Merriam, D.E. and Wasco, W. (1998). Calsenilin: a calcium-binding protein that interacts with the presenilins and regulates the levels of a presenilin fragment. Nat. Med. 4, 11771181.

243. Carrion, A.M., Link, W.A., Ledo, F., Mellstrom, B. and Naranjo, J.R. (1999).• 2+

244. DREAM is a Ca -regulated transcriptional repressor. Nature 398, 80-84.

245. Gorodovikova, E.N. and Philippov, P.P. (1993). The presense of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cell. FEBS Lett. 335, 277-279.

246. Kawamura, S. (1993). Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362, 855-857.

247. Stryer, L., Hurley, J.B. and Fung, B.K.K. (1981). First stage of amplification in the cyclic nucleotide cascade of vision. Trends Biochem. Sci. 6, 245-247.

248. Dizhoor, A.M., Ericsson, L.H., Johnson, R.S., et al. (1992). The NH2 terminus of retinal recoverin is acylated by a small family of fatty acids. J.Biol.Chem. 267, 16033-16036.

249. Fliesler, S.J., Anderson, R.E. (1983). Chemistry and metabolism of lipids in the vertebrate retina. Prog. Lipid Res., 22, p. 79-131.

250. Boesze-Battaglia, K., Schimmel, R. (1997). Cell membrane lipid composition and distribution: implications for cell function and lessons learned from photoreceptors and platelets.J. Exp. Biol., 200(23), p. 2927-36.

251. Boesze-Battaglia, K., Hennessey, T., Albert, A.D. (1990). Cholesterol heterogeneity in bovine rod outer segment disk membranes. J. Biol. Chem., 264(14), p. 8151-5.

252. Boesze-Battaglia, K., Fliesler, S.J., Albert, A.D. (1990). Relationship of cholesterol content to spatial distribution and age of disc membranes in retinal rod outer segments. J. Biol. Chem., 265,18867-18870.

253. Boesze-Battaglia, K. and Albert, A.D. (1990). Cholesterol modulation of photoreceptor function in bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem., 265(34), p. 20727-30.

254. Albert, A.D. and Boesze-Battaglia, K. (2005). The role of cholesterol in rod outer segment membranes. Prog. Lipid Res., 44(2-3), p. 99-124.

255. Schnapf, J.L. (1983). Dependence of the single photon response on longitudinal position of absorption in toad rod outer segments. J. Physiol., 343, p. 147-59.

256. Niu, S.-L., Mitchell, D.C., Litman, B.J. (2002). Manipulation of cholesterol levels in rod disk membranes by methyl-beta-cyclodextrin: effects on receptor activation. J. Biol. Chem., 277(23), p. 20139-45

257. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11569-11573.

258. Strissel, K.J., Lishko, P.V., Trieu, L.H., Kennedy, M.J., Hurley, J.B., Arshavsky, V.Y. (2005). Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. J. Biol. Chem., 80(32), p. 29250-5.

259. Brown, B.M., Carlson, B.L., Zhu, X., Lolley, R.N., Craft, C.M. (2002). Light-driven translocation of the protein phosphatase 2A complex regulates light/dark dephosphorylation of phosducin and rhodopsin. Biochemistry, 41(46), p. 13526-38.

260. Martin, R.E., Elliott, M.H., Brush, R.S., Anderson, R.E. (2005). Detailed characterization of the lipid composition of detergent-resistant membranes from photoreceptor rod outer segment membranes. Invest. Ophthalmol. Vis.Sci., 46(4), p. 1147-54.

261. Liu, H., Seno, K., Hayashi, F. (2003). Active transducin alpha subunit carries PDE6 to detergent-resistant membranes in rod photoreceptor outer segments. Biochem. Biophys. Res. Commun., 303(1), p. 19-23.

262. Nair, K.S., Balasubramanian, N. Slepak, V.Z. (2002). Signal-dependent translocation of transducin, RGS9-l-Gbeta5L complex, and arrestin to detergent-resistant membrane rafts in photoreceptors. Curr. Biol., 12(5), p. 421-5.

263. Erickson, M.A., Lagnado, L., Zozulya, S., Neubert, T.A., Stryer, L., Baylor, D.A. (1998). The effect of recombinant recoverin on the photoresponse of truncated rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95(11), p. 6474-6479.

264. Koutalos Y, Nakatani K, Yau KW. (1995). The cGMP-phosphodiesterase and its contribution to sensitivity regulation in retinal rods. J Gen Physiol., 106(5), p. 891921

265. Gray-Keller MP, Detwiler PB. (1996). Ca2+ dependence of dark- and light-adapted flash responses in rod photoreceptors. Neuron., 17(2), p.323-31.

266. Erickson MA, Lagnado L, Zozulya S, Neubert ТА, Stryer L, Baylor DA. (1998). The effect of recombinant recoverin on the photoresponse of truncated rod photoreceptors. Proc Natl Acad Sci U S A., 95(11), p. 6474-9.

267. Nikonov S, Lamb TD, Pugh EN Jr. (2000). The role of steady phosphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse. Gen Physiol., 116(6), p. 795-824.

268. Makino CL, Dodd RL, Chen J, Burns ME, Roca A, Simon MI, Baylor DA. (2004). Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods. J Gen Physiol., 123(6), p. 729-41.

269. Edwards, H.C. and Crumpton, M.J. (1991). Ca(2+)-dependent phospholipid and arachidonic acid binding by the placental annexins VI and IV Eur. J. Biochem., 198, 121 129.

270. Franke, P.R., Sakmar, T.P., Graham, R.M., and Khoran, H.G. (1992). Structure and function in rhodopsin. Studies of the interaction between the rhodopsin cytoplasmic domain and transducin. J. Biol. Chem. 267,14767-14774.

271. Strynadka, N.C.J, and James, M.N.G. (1989) Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins. Annu. Rev. Biochem. 58, 951-998.

272. Moncrief, N.D., Kretsinger, R.H. and Goodman, M. (1990). Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. I. Relationships based on amino acid sequences. J. Mol. Evol. 30, 522-562.

273. Lefkowitz, R.J. (1993). G protein-coupled receptor kinase. Cell 74, 409-412.

274. Polans, A.S., Buczylko, J., Crabb, J. and Palczewski, K. (1991). A photoreceptor calcium binding protein is recognized by autoantibodies obtained from patients with cancer-associated retinopathy. J. Cell. Biol. 112, 981-989.

275. Kawamura, S., Takamatsu, K. and Kitamura, K. (1992). Purification and characterization of S-modulin, a calcium-dependent regulator on cGMP phosphodiesterase in frog rod photoreceptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 411-417.

276. Senin, I.I., Koch, K.-W., Akhtar, M. and Philippov, P.P. (2002). Ca2+-dependent control of rhodopsin phosphorylation: recoverin and rhodopsin kinase. Photoreceptors and Calcium, 24-32.

277. Calvert, P., Klenchin, V. and Bownds, M. (1995). Rhodopsin kinase inhibition by recoverin. J. Biol. Chem. 270, 24127-24129.

278. Stenberg, E., Persson, H., Roos, H. and Urbaniczky, C. (1991). Quantitative determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance by using radiolabeled proteins. J. Colloid Interface Sci. 143, 513-526.

279. Lange, C. and Koch, K.-W. (1997). Calcium-dependent binding of recoverin to membranes monitored by surface plasmon resonance spectroscopy in real time. Biochemistry 36, 12019-12026.

280. Tanaka, T., Ames, J.B., Harvey, T.S., Stryer, L. and Ikura, M. (1995). Sequestration of the membrane-targeting myristoyl group of recoverin in the calcium-free state. Nature 376,444-447.

281. Senin I.I., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Ergorov N.S., Philippov P.P., Koch K.-W. (2003). Functional restoration of the Ca2+-myristoyl switch in a recoverin mutant. J. Mol. Biol., 330(2), p. 409-18.

282. Herzberg, O. and James, M.N. (1988). Refined crystal structure of troponin C from turkey skeletal muscle at 2.OA resolution. J. molec. Biol. 203, p. 761-779.

283. Skelton, N.J., Korder, J., Akke, M., Forsen, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal• • • • 24" • • *transduction versus buffeting activity m Ca -binding proteins. Nature struct. Biol. 1, p. 239-245.

284. Finn, B.E., Drakenberg, T. and Forsen, S. (1993). The structure of apocalmodulin: a 1H NMR examination of the carboxy-terminal domain. FEBS Lett. 336, p. 368-374.

285. Senin I.I., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Ergorov N.S., Philippov P.P, Koch K.-W. (2003). Functional Restoration of the Ca2+-myristoyl Switch in a Recoverin Mutant. J. Mol. Biol. 330, p. 409-418.

286. Vijay-Kumar, S. & Kumar, V. D. (1999). Crystal structure of recombinant bovine neurocalcin. Nature Struct. Biol. 6, p. 80-88.

287. Kuhn, H. and Dreyer, WJ. (1972). Light dependent phosphorylation of rhodopsinby ATP. FEBS Lett. 20, 1-6.

288. Shichi, H. and Somers, R.L. (1978). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin. J. Biol. Chem. 253, 7040-7046.