Фоторецепторный аннексин А4: обнаружение, локализация и функциональные характеристики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ЗЕРНИЙ Евгений Юрьевич

ФОТОРЕЦЕПТОРНЫЙ АННЕКСИИ А4: ОБНАРУЖЕНИЕ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

д.б.н., профессор Филиппов Павел Павлович

к.х.н., старший научный сотрудник Сенин Иван Иванович

Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Тишков Владимир Иванович

д.б.н., профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Зашита диссертации состоится 24 февраля 2004 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 23 января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

2004-4 20048

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Одним из таких процессов является передача светового сигнала (фототрансдукция) в фоторецепторных клетках позвоночных животных. Воздействие Са+ на систему фототрансдукции у позвоночных животных опосредовано Са2+-связывающими белками. Эти белки сами по себе каталитической активностью не обладают; их функция состоит в придании различным клеточным мишеням чувствительности к ионам кальция. Одним из важнейших свойств фоторецепторных Са2+-связывающих белков является их способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Некоторые из фоторецепторных Са2+-связывающих белков в настоящее время выделены и охарактеризованы, это - кальмодулин, рековерин, S100-белки и активаторы гуанилатциклазы-1, -2 и 3. Все перечисленные белки относятся к обширному семейству EF-hand-содержащих Са2+-связывающих белков, т.е. содержат в своем составе специальную структуру(ы) для связывания Са2+, получившую название EF-hand. Еще одно семейство Са +-связывающих белков - аннексины; это семейство включает в себя более двадцати представителей, сходных между собой по структуре и биохимическим свойствам. Аннексины, хотя и не содержат EF-hand-структур, однако способны Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что интенсивные исследования аннексинов, проводимые в последние годы, позволили обнаружить эти белки в клетках различных типов и выявить их участие в самых разнообразных биологических процессах: от транспорта и организации клеточных мембран до передачи внутриклеточных сигналов. Тем не менее конкретная функция аннексинов в большинстве клеток так и остается неустановленной. Это утверждение особенно актуально для фоторецепторных клеток позвоночных животных, для которых какие-либо исследования аннексинов до сих пор вообще не проводились.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение аннексина А4 из фоторецепторных клеток быка. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. Выделение, очистка и идентификация фоторсцепторного аннексина А4.

2. Исследование локализации аннексина А4 в сетчатке быка.

3. Изучение связывания аннексина А4 с фоторецепторными мембранми и аннексии А4 -зависимой агрегации фоторецепторных мембран.

4. Поиск и идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А4 в фоторецепторной клетке.

Научная новизна и практическая значимость работы. В процессе выполнения настоящей работы впервые выделен, очищен и идентифицирован Са2+-связывающий белок аннексии А4 из фоторецепторных клеток быка. Установлена локализация аннексина А4 в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток. Продемонстрирована способность аннексина А4 связываться с фоторецепторными мембранами, а также агрегировать их в присутствии ионов кальция или цинка. Обнаружено, что потенциальными белковыми мишенями аннексина А4 в фоторецепторной клетке являются рековерин, митохондриальная креатинкиназа и аннексины А2 и А6. Настоящая работа - первое исследование одного из представителей семейства аннексинов в фоторецепторных клетках.

С учетом физиологической важности ионов кальция и Са2+-связывающих белков как регуляторов фототранедукции, изучение Са2+-связывающего белка аннексина А4, впревые обнаруженного нами в фоторецепторной клетке, необходимо для выяснения молекулярных основ зрения. Кроме того, исследование аннексинов в различных тканях важно для установления молекулярных механизмов "аннексинопатии" — нарушений экспрессии и свойств аннексинов, которые сопровождают сердечно-сосудистые и раковые заболевания. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001 и 2002), III съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002) и на 6-ой Международной конференции по молекулярной биологии памяти В.А. Энгельгардта (Санкт-Петербург - Москва, 2003). Структура и объём работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 34 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель включает 199 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ключевую роль в регуляции зрительного сигнала в фоторецепторной клетке выполняют Са2+-связывающие белки: рековерин, действующий как кальциевый сенсор родопсинкиназы; три белка GCAP (от guanylate cyclase activating protein) и белок S100B, которые Са2+-зависимым образом модулируют активность гуанилатциклазы; кальмодулин, служащий регулятором проводимости катионных каналов. Ранее в наружных сегментах палочек (НСП) сетчатки быка выявлено несколько белков, которые связывались с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом (так называемые "Са2*-зависимые белки") и кажущиеся молекулярные массы которых были равны ~ 20, 21 (минорная полоса), 26, 32, 70 и 80 кДа. В то время как какие-либо основания для предположений о природе

последнего белка отсутствовали, можно было предположить, исходя из электрофоретической подвижности, что полосы белков с кажущимися молекулярными массами ~ 20, 21, 26 и 70 кДа соответствовуют кальмодулину, активатору гуанилатциклазы 1 (GCAP 1), рековерину и родопсинкиназе (последняя сама по себе ионы кальция не связывает, но в их присутствии образует комплекс с рековерином, который придает ей способность взаимодействовать с мембраной Са2+-зависимым образом). Что касается белка с молекулярной массой 32 кДа или р32, то, исходя из его способности Са2+-зависимым образом взаимодействовать с мембранами, а также на основании молекулярной массы этого белка, мы предположили, что он может быть одним из представителей семейства аннексинов: кажущиеся молекулярные массы большинства аннексинов варьируют от 32 до 38кДа.

Учитывая, что ранее для фоторецепторных Са2+-связывающих белков была продемонстрирована их функциональная важность и что какие-либо данные о присутствии аннексинов в фоторецепторной клетке в литературе отсутствовали, нами была проведена настоящая работа. Ее целью являлось выделение, идентификация и изучение р32 из фоторецепторных клеток быка.

1. Выделение и очистка фоторецепторного белка р32 и его идентификация как аннексина А4.

Для отделения фоторецепторных "Са2+-зависимых белков" от общей массы внутриклеточных белков мы использовали метод последовательной Са2+-зависимой экстракции НСП. В основу этого метода была положена способность интересующих нас белков связываться с клеточными мембранами в присутствии Са2+ и диссоциировать в раствор при добавлении хелатора кальция ЭГТА. Используя такой подход, мы показали, что в результате пятикратной последовательной экстракции фоторецепторных мембран Са2+-содержащим буфером в раствор переходят цитоплазматические белки, а также белки, связанные с мембранами Са2+-независимым образом (рис. 1 А, дорожки 2-6). При дальнейшей экстракции этих мембран в присутствии ЭГТА в элюате появляются четыре "Са2+-зависимых белка" с кажущимися молекулярными массами ~ 20, 26, 32 и 70 кДа, которые, как было сказано выше, возможно, представляют собой, соответственно, кальмодулин, рековерин, р32 и родопсинкиназу (рис. 1А, дорожка 7). На следующем этапе нашей работы мы провели очистку р32 из НСП и его последующую идентификацию.

При разработке метода выделения р32 из НСП мы исходили из предположения, что этот белок может принадлежать к семейству аннексинов. Из литературы известно, что для выделения аннексинов обычно используются два основных метода. Первый метод

основывается на способности некоторых аннексинов в присутствии Са + связываться с гликозаминогликанами, например, с гепарином. В соответствии со вторым методом, гомогенные препараты этих белков получают с помощью ионообменной хроматографии. Для этого используются анионообменные колонки, так как изоэлектрические точки большинства аннексинов меньше или равны семи. Са2+-зависимая хроматография фракции фоторецепторных "Са2+-зависимых белков" на гепаринсефарозе не позволила нам получить р32 в гомогенном виде. Поэтому для очистки р32 мы использовали альтернативный метод -жидкостную хроматографию FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) на анионообменной колонке MonoQ, - который оказался более эффективным.

Исходным материалом для дальнейшей очистки р32 с помощью этого метода служила фракция фоторецепторных "Са2+-зависимых белков", полученная путем экстракции ЭГТА-содержащим буфером фоторецепторных мембран, которые до этого были отмыты буфером, содержащим ионы кальция (рис. 1А, дорожка 7). Фракцию фоторецепторных "Са2+-зависимых белков" наносили на колонку MonoQ и проводили элкжию линейным градиентом О - 1 М NaCl в Hepes-буфере, рН 7,3. Основная доля р32 была найдена во фракциях, элюируемых с колонки при концентрации соли 195-200 мМ. Полученный препарат р32 был гомогенен по данным SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-ПААГ), рис. 1Б;

-«-70

-*-20

Рис. 1. Выделение р32 (12% SDS-ПААГ). А. Получение фракции фоторецепторных Са2+-зависммых белков. Дорожка 1 - стандартные белки (слева даны их молекулярные массы в кДа); электрофореграммы фракций, полученных , путем пятикратной последовательной экстракции фоторецепторных мембран Са2*-содержащим буфером (дорожки 2 - 6) и последующей однократной экстракции ЭГТА-содержащим буфером (дорожка 7). Стрелками указаны кажущиеся молекулярные массы фоторецепторных Са2*-зависимых белков, кДа. Б. Очищенный препарат р32 после FPLC-хроматографии на колонке Mono Q.

выход белка составил 100 мкг при выделении из 1000 сетчаток.

Таким образом, предложенный нами метод очистки р32 из наружных сегментов фоторецепторных клеток позволил получить гомогенный препарат этого белка с использованием двух стадий: Са2+-зависимой экстракции фоторецепторных мембран и последующей анионообменной хроматографии на колонке MonoQ. Следует подчеркнуть, что способность р32 Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами сохраняется и после его очистки до гомогенного состояния.

Идентификацию р32 мы провели с помощью метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии (Matrix-Assistant Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight mass-spectrometry). Этот метод позволяет определять значения отношений масса/заряд пептидов, полученных в -результате ферментативного гидролиза исследуемого белка, и затем идентифицировать его путем сравнения экспериментально измеренных отношений масса/заряд с теоретически рассчитанными значениями для пептидов всех известных белков, имеющихся в соответствующих базах данных. Перед проведением масс-спектрометрического анализа очищенный препарат р32 подвергали SDS-электрофорезу, фрагмент геля, содержащий полосу р32, вырезали и белок в геле подвергали гидролизу трипсином. Далее полученные фрагменты р32 элюировали из геля и анализировали методом масе-спектрометрии (рис. 2А). В результате удалось идентифицировать значения отношения массы/заряд для четырнадцати пептидных фрагментов р32 (рис. 2Б). Сравнение экспериментально полученных данных с наборами рассчитанных значений отношения масса/заряд, имеющимися в базе данных SWISS-PROT/TrEMBL по первичным структурам всех известных белков быка, осуществляли с помощью программы Peptldent (сайт www.expasy.ch). Проведенное сравнение показало, что полученные фрагменты р32 соответствуют фрагментам аннексина А4 (аннексии IV, эндонексин 1) (рис. 2В). Следовательно, можно заключить, что выделенный нами белок р32 является аннексином А4.

Следует подчеркнуть, что хотя ранее аннексии А4 был обнаружены в целом ряде тканей позвоночных животных, данные о присутствии этого белка в сетчатке отсутствовали. Таким образом, полученные нами результаты являются не только первой демонстрацией присутствия аннексина А4 в фоторецепторных клетках быка, но и первой демонстрацией присутствия этого аннексина в сетчатке позвоночных животных.

Для доказательства того, что аннексии А4 присутствует именно в НСП, требовалось провести цитоиммуногистохимическое исследование локализации этого белка в сетчатке. Однако тех количеств аннексина А4, которые могли быть получены при его выделении из НСП, было недостаточно для иммунизации животных и получения антител против этого белка. Поскольку, по литературным данным, молекулы аннексина А4, полученного из

разных тканей быка, имеют идентичную структуру, для иммунизации животных (кроликов) мы выделили аннексии А4 из альтерантивного источника - печени быка, содержащей наибольшее количество этого белка по сравнению с другими тканями. Далее антитела против аннексина А4 очищали из иммунной сыворотки кролика с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным аннексином А4. По данным иммуноблоттинга такие антитела дают кросс-реакцию с очищенным р32, выделенным из НСП быка (рис. 3, дорожка 1), и выявляют этот белок в составе исходного экстракта НСП

1 2 3 4 5

Рис. 3. Иммунохимическое выявление аннексина Л4 в экстракте НСП с помощью поликлональных (моноспецифических) антител против аннексина А4. Иммуноблоты очищенного р32 (трек 1) и экстрактов НСП быка (треки 2 - 5) при концентрациях антител 0,01 (трек 2), 0,001 (трек 3), 0,0002 (трек 4) и 0,0001 (трек 5) мг/мл. Слева указаны молекулярные массы стандартных белков, кДа.

(рис. 3, дорожки 2-5). Специфичность наблюдаемой реакции между аннексином А4 из сетчатки и антителами против анпексина А4, очищенного из печени быка, подтверждается тем, что вне зависимости от концентрации антител (0,0001 - 0,01 мг/мл), используемой при иммуноблоттинге, интенсивность окрашивания полосы, соответствующей аннексину А4, практически не меняется. Таким образом, полученные антитела могут быть использованы для изучения локализации аннексина А4 в сетчатке быка. Добавим, что способность полученных антител против аннексина А4 давать кросс-реакцию с р32 служит дополнительным подтверждением сделанного выше вывода о том, что р32 является аннексином А4.

Как видно из рис. 4, поликлональные (моноспецифические) антитела против аннексина А4 выявляют этот белок как на срезах печени быка (рис. 4Г), так и на срезах сетчатки быка (рис. 4А). На срезах сетчатки эти антитела окрашивают слой фоторецепторных клеток, при этом наиболее интенсивно окрашиваются слои наружных и внутренних сегментов фоторецепторных клеток. При высоком увеличении видно, что окрашивание наружных сегментов выражено несколько слабее, чем внутренних (рис. 4А, врезка). В ядрах и синаптических окончаниях фоторецепторных клеток, а также в клетках сетчатки, отличных от фоторецепторов, флуоресценции практически не наблюдается. Для подтверждения специфичности реакции, выявленной на срезах сетчатки с помощью антител против аннексина А4, нами были поставлены контрольные пробы, которые показали, что флуоресцентное окрашивание отсутствует при инкубации срезов сетчатки в присутствии только вторичных антител (рис. 4Б), в присутствии первичных антител, предварительно проинкубированных с аннексином А4 (рис. 4В) и в присутствии сыворотки кролика,

Рис. 4. Цнтоиммупогнстохимнческое исследование локализации аннексина Л4 в сетчатке и печени быка. Микрофоторафии срезов сетчатки быка, инкубированных: Л - с первичными антителами против аннексина А4 из печени; Б - без первичных антител; В - с первичными антителами против аннексина А4 из печени, истощенными по аннексину А4 (увеличение х 600, на врезке увеличение х 1000). Микрофотографии срезов печени быка, инкубированных: Г — с первичными антителами против аннексина А4 из печени; Д - без первичных антител (увеличение х 800). Во всех случаях, срезы окрашивали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорофором. Слева схематически показаны слои клеток, входящие в состав сетчатки (сверху вниз): клетки пигментного эпителия, фоторсцепторные клетки, биполярные клетки, ганглии.

полученной до иммунизации (данные не показаны); кроме того, предварительная инкубация антител против аннексина А4 с другим фоторецепторным белком, рековерином, не препятствовала флуоресцентному окрашиванию срезов (данные не показаны).

Результаты описанных экспериментов позволяют сделать вывод о том, что в сетчатке быка аннексии А4 локализован в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток.

2. Изучение функциональных свойств фоторецепторного аннексина А4.

Физиологическая функция (или функции) аннексина А4 в различных клетках к настоящему моменту не установлена. В то же время существует большое количество литературных данных, касающихся свойств аннексина А4 в условиях in vitro. Важнейшими свойствами этого белка являются его способность к Са2+-зависимому связыванию с клеточными мембранами и способность агрегировать клеточные мембраны Са2+-зависимым образом. Считается, что эти свойства аннекенна А4, скорее всего, могут являться ключевыми

для функции этого белка. Поскольку ранее исследования взаимодействия аннексина А4 с фоторецепторными мембранами не проводилось, на следующем этапе настоящей работы мы изучили способность аннексина А4 Са2+-зависимым образом связывать и агрегировать фоторецепторные мембраны, а также рассмотрели влияние различных факторов на эти процессы.

2.1. Связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами.

Изучение связывания аннексина А4 с фоторецепторными мембранами проводили следующим образом. Исследуемый белок инкубировали в присутствии отмытых мочевиной фоторецепторных мембран в различных условиях, мембраны осаждали центрифугированием, осадок мембран отбрасывали, а супернатант анализировали методом SDS-электрофореза в ПААГ. Количество аннексина А4, не связавшегося с мембранами (А„), определяли денситометрическим сканированием геля. Долю аннексина А4, связанного с мембранами, рассчитывали по формуле: (Ао — А„)/АоХ100%, где Ао - общее количество аннексина А4, добавленного в пробу.

С помощью описанного метода мы показали, что повышение концентрации свободного кальция ([Са2+]г) от 0,2 до 2 мкМ приводит к увеличению количества аннексина А4, связавшегося с мембранами (рис. 5А). Указанный диапазон значений [Са2+]Г включает физиологические значения концентрации свободного кальция в фоторецепторной клетке. Са2+-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами является кооперативным процессом (коэффициент Хилла = 3,6) с полумаксимальным эффектом по кальцию (К50), равным 1 мкМ.

Известно, что ионы цинка присутствуют в сетчатке млекопитающих, в частности, в фоторпецепторных клетках, причем установлено, что фоторецепторная еОМР-фосфодиэстераза, а также зрительный рецептор родопсин связывают 2п2+. По нашим данным, фоторецепторный Са2+-связывающий белок рековерин способен связывать 2п2+, причем присутствие 2п2+, так же, как и присутствие Са2+, стимулирует связывание рековерина с фоторецепторными мембранами. По аналогии с рековерином мы исследовали способность аннексина А4 взаимодействовать с фоторецепторными мембранами 2п2+-зависимым образом. Как видно из рис. 5А, связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами возрастает при повышении концентрации цинка от 0,05 до 1 мМ, при этом Ко по 2п2+ составляет 276 мкМ. 2п2*-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами, так же как и Са2*-зависимое связывание является кооперативным процессом (коэффициент Хилла = 2,2).

Сравнение количества аннексина А4, связанного с фоторецепторными мембранами в присутствии насыщающих коцентраций (2 мМ) ионов Са2+ и Zn2+, показало, что в присутствии ионов кальция с фоторецепторными мембранами связывается большее количество аннексина А4, чем в присутствии ионов цинка (рис. 5Б). Поскольку количество аннексина А4, связывающегося с мембранами в присутствии обоих катионов одновременно (2 мМ Са2+ + 2 мМ Zn2+), было меньшим, чем в присутствии только Са2+, можно полагать, что Са + и Zn2+ конкурируют между собой за центр(ы) связывания в молекуле аннексина А4.

На основании результатов, описанных в настоящем разделе, можно сделать следующие выводы. 1. Связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами в условиях in vitro является Са2+-зависимым процессом (в отсутствие ионов кальция связывания практически не наблюдается). 2. Диапазон значений [Са +]г, при которых происходит связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами, включает физиологические значения концентрации свободного кальция в фоторецепторной клетке. 3. Ионы цинка, так же, как и ионы кальция, способны стимулировать связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами. Хотя прямых измерений связывания ионов цинка с аннексином А4 не проводилось, демонстрация эффекта Zn2+ на связывание аннексина А4 с

фоторецепторными мембранами дает основание для предположения о том, что аннексии А4 является не только Са2+-связывающим, но и 2п2+-связывающим белком.

Для оценки сродства аннексина А4 к фоторецепторным мембранам мы изучили также зависимость взаимодействия аннексина • А4 с фоторецепторными мембранами от их концентрации при насыщающей концентрации Са2+, равной 2 мМ (концентрацию мембран выражали в концентрации присутствующего в них родопсина). Аннексии А4 проявляет высокое сродство к фоторецепторным мембранам: величина Kso по родопсину составляет 1,2 мкМ. Для сравнения укажем, что величина Kso по родопсину для связывания с мембранами у другого фоторецепторного Са2+-связывающего белка, рековерина, в 200 раз больше, чем полученное нами значение для аннексина А4. Ранее было показано, что некоторые представители семейства аннексинов способны связывать АТР и GTP, причем это связывание влияет на аффинность аннексинов по отношению к клеточным мембранам. Однако, по нашим данным, ATP, GTP или cGMP (последний циклический нуклеотид является вторичным мессенджером в системе зрительной транедукции) на связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами не влияют. Кроме того, взаимодействие аннексина А4 с фоторецепторными мембранами не зависит от освещения последних и изменения рН в диапазоне от 5 до 8.

2.2. Аннексии А4-зависимая агрегатщя фоторецепторных мембран.

Одним из основных свойств аннексинов является их способность Са2+-зависимым образом агрегировать внутриклеточные фосфолипидные везикулы, клеточные мембраны и даже целые клетки. Во всех этих случаях в основе аннексинзависимой агрегации указанных структур лежит "бивалентное" связывание мембран, т.е. когда единичная молекула или димер аннексина связывает два слоя фосфолипидов. В некоторых случаях агрегация мембран, вызванная аннексинами, приводит к слиянию мембран, которое лежит в основе эндо- и экзоцитоза. Процессы, связанные с транспортом и организацией мембран, происходят и в фоторецепторной клетке. Поэтому далее мы изучили эффект аннексина А4 на агрегацию фоторецепторных мембран в присутствии ионов Са + и Zn2+. За агрегацией фоторецепторных мембран следили по изменению оптической плотности их суспензии при 350 нм (оптическая плотность изменяется в результате повышения мутности суспензии мембран при их агрегации). Степень агрегации мембран определяли по формуле

где - величина оптической плотности в присутствии аннексина А4; - величина оптической плотности в отсутствие аннексина А4 (учет позволяет исключить вклад аннексии А4-независимой агрегации фоторецепторных мембран).

0.30 А

0,50 0,48 0,46 0,44 г 0,42

Б

0,25

0,20

3 0'15

0,10 0,05

«Г

0,40 0,38 0,36 0,34 0,32

0,00

0,01 0,1 1 10 100 1000 [Мй2*], мкМ

0

100 Время, с

200

• + аннексии А4 + Са

* + аннексии А4 + Ъа"

н - аннексии А4

Рис. 6. Са2*- и Zn2*- зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии аннексина А4. А. Изменение оптической плотности суспензии фоторецепторных мембран при 350 нм в присутствии аннексина А4 при различных значениях [Са2+]г или [Та2*]. Б. Кинетика аннексии А4-зависимой агрегации фоторецепторных мембран в присутствии ионов Са2+ (2 мМ) или 2п2* (2 мМ). Измеряли оптическую плотность суспензии фоторецепторных мембран при 350 нм в присутствии или в отсутствие аннексина А4.

С помощью описанного метода было найдено, что возрастание [Са2+]1 в диапазоне от 0,1 до 100 мкМ приводит к увеличению агрегации фоторецепторных мембран с полумаксимальным эффектом по кальцию, равным 2,25 мкМ (рис. 6А). Как видно из рис. 6А, аннексии А4 вызывает агрегацию фоторецепторных мембран также при увеличении концентрации ионов цинка от 0,02 до 1,5 мМ; полумаксимальный эффект наблюдается при концентрации 2п2+, равной 262 мкМ. Заметим, что диапазон концентрации ионов цинка, при которой аннексии А4 вызывает агрегацию фоторецепторных мембран, практически совпадает с концентрацией этого катиона, необходимой для связывания аннексина А4 с фоторецепторными мембранами (см. рис. 5А). Это означает, что в вышеуказанном диапазоне концентраций 2п2+ процессы связывания и агрегации мембран могут происходить одновременно.

Сравнение кинетики аннексии А4-зависимой агрегации фоторецепторных мембран в присутствии насыщающих концентраций Са * или 2п + приведено на рис. 6Б. Как видно из рисунка, скорость агрегации фоторецепторных мембран в присутствии 2п2+ выше, чем в отсутствие этого катиона, но ниже, чем в присутствии Са \ Заметим, что некоторая агрегация фоторецепторных мембран происходит также и в отсутствие аннексина А4, что,

по-видимому, обусловлено взаимодействием двухвалентных ионов кальция с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран. Нельзя исключить, что интегральные мембранные белки, присутствующие в мембранах, также могут быть причиной Са2+-независимой агрегации фоторецспторных мембран.

Результаты наших экспериментов, описанные выше, позволяют заключить, что (1) аннексии А4 может выступать в роли фактора, вызывающего агрегацию фоторецепторных мембран как в присутствии ионов капьция, так и ионов цинка; (2) концентрация Zn2+, необходимая для того, чтобы аннексии А4 вызывал агрегацию фоторецепторных мембран, значительно выше, чем концентрация Са2+; (3) аннексии А4-зависимая агрегация в присутствии ионов кальция происходит быстрее, чем в присутствии ионов цинка.

По литературным данным, агрегация мембран в присутствии аннексинов лежит в основе слияния двух мембранных поверхностей при экзо- и эндоцитозе, а также при образовании и организации мембранных структур внутри клетки. При экзо- и эндоцитозе молекулы аннексинов, во-первых, участвуют в образовании экзо- и эндосом, и, во-вторых, покрывают поверхность экзо- и эндосом, и затем прикрепляют их к плазматической мембране, вызывая слияние фосфолипидных слоев. В состав наружных сегментов фоторецепторных клеток входят фоторецепторные диски, на поверхности которых происходят события, связанные с передачей зрительного сигнала. В процессе жизнедеятельности фоторецепторной клетки диски претерпевают постоянное обновление: "новые" диски образуются в базалыюй части наружного сегмента из плазматической мембраны; "старые" диски объединяются, сливаются с плазматической мембраной в апикатьной части фоторецептора и попадают в фагосомы клеток пигментного эпителия сетчатки, где подвергаются лизису. Регуляция обновления фоторецепторных дисков происходит с участием ионов кальция. Дело в том, что внутри фоторецепторной клетки существует градиент концентрации Са2+ с увеличением от базалыюй к апикальной части клетки. Таким образом, слияние фоторецепторных дисков между собой и с плазматической мембраной происходит только при высокой концентрации кальция в апикальной части фоторецепторов. Для того, чтобы описанный выше механизм мог функционировать в клетке, необходимо существование какого-либо фактора, который был бы способен Са +-завпепмым образом агрегировать фоторецепторные диски. Основываясь на данных, полученных в настоящем разделе, можно предположить, что таким фактором мог бы служить аннексии А4. Это предположение основано на способности аннекспна А4 связывать фоторецепторные мембраны уже при [Са2+]г, равной 200 нМ (диапазон [Са2+]г в фоторецепторной клетке составляет от 30 до 700 нМ), а при более высоких занченпях [Са +]г - агрегировать фоторецепторные мембраны.

3. Поиск потенциальной белковой мишени (мишеней) для аннсксина Л4 в фоторецепторной клетке.

В многочисленных работах показано, что аннексины, помимо связывания с металлами и объектами фосфолипидной природы, способны взаимодействовать также с различными белками. Аннексии А4, как и другие представители семейства аннексинов, способен взаимодействовать с такими белками, как, например, Б-актин и гликопротеин А поверхности легочных альвеол (лектин). Для того, чтобы ответить на вопрос, какова функция аннексина А4 в фоторецепторных клетках, в первую очередь необходимо было бы определить, присутствуют ли в них какие-либо белковые мишени аннексина А4. Поэтому на следующем этапе нашей работы мы провели - эксперименты по выявлению потенциальных белковых мишеней аннексина А4 в фоторецепторных клетках. С этой целью очищенный препарат аннексина А4 иммобилизовали на ВгСМ-активированной агарозе и полученный носитель использовали для аффинной Са2+-зависимой хроматографии экстракта растворимых белков НСП. (Выбор Са2+-зависимой хроматографии был обусловлен тем, что, по литературным данным, взаимодействие аннексинов с белковыми мишенями чаще всего происходит в присутствии ионов кальция).

Фракцию белков экстракта НСП наносили на колонку с иммобилизованным аннексином А4 в присутствии 2 мМ Са2+. Для того, чтобы удалить белки, не специфически связанные с иммобилизованным аннексином А4, колонку затем промывали буфером, содержащим 300 мМ №С1. Элюцию белков, связавшихся с аннексином А4 Са2+-зависимым образом, проводили буфером, содержащим 5 мМ ЭГТА. Полученная таким образом фракция содержала белки с кажущимися молекулярными массами 26 (р26), 32 (р32), 38 (р38), 44 (р44) и 67 (р67) кДа (рис. 7А). Специфичность Са2+-зависимого взаимодействия перечисленных выше белков с иммобилизованным аннексином А4 подтверждается тем, что: 1) при нанесении экстракта НСП на колонку с иммобилизованным аннексином А4 в ЭГТА и последующей элюции в присутствии Са2+ в полученной фракции какие-либо белки отсутствовали и 2) ни один из белков экстракта НСП не взаимодействовал с ВгСМ-активированной агарозой, не содержащей иммобилизованного аннексина А4 (не показано).

Таким образом, нами была получена фракция растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са л-зависимым образом. Основываясь на способности аннексина А4 к Са2+-зависимой димеризации, мы предположили, что белок с молекулярной массой 32 кДа из полученной фракции является аннексином А4. Для проверки такой возможности мы провели иммуноблоттинг фракции растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом. Окрашивание иммуноблотов проводили поликлональными (моноспецифическими)

43 31

21 14

р67 р44 рЗЗ р32

р26

43

31

21

14

Рис. 7. Поиск белковых мишеней аннексина- А4 в фотореиепторной клетке. А.

Электрофореграмма (12% ЗОБ-ПААГ) белков экстракта наружных сегментов палочек сетчатки, взаимодействующих с иммобилизованным аннексином А4 Са2*-зависимым образом (указанны стрелками). Слева даны молекулярные массы стандартных белков, кДа. Б. Иммуноблоты очищенного аннексина А4 из печени (дорожка 1) и фракции фоторецепторных белков, взаимодействующих с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом (дорожка 2); окрашивание проводили антителами против аннексина А4 (0,0001 мг/мл); слева указаны молекулярные массы стандартных белков, кДа.

антителами против аннексина А4. Как видно из рис. 7Б, антитела против аннексина А4 распознают в составе фракции растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом, только белок с кажущейся молекулярной массой 32 кДа. Таким образом, белок с кажущейся молекулярной массой 32 кДа, связывающийся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом, скорее всего является аннексином А4.

Для идентификации остальных выявленных нами потенциальных мишеней аннексина А4 мы использовали метод MALDI-TOF-масс-спекгрометрии. Фракцию, содержащую полученные белки, подвергали SDS-элекгрофорезу, фрагменты геля, содержащие полосы р26, р38, р44 и р67, вырезали и белки в геле подвергали гидролизу трипсином. Далее полученные фрагменты белков элюировали из геля и анализировали методом масс-спектрометрии. Результаты масс-спектрометрического анализа р26, р38, р44 и р67 представлены на рис. 8. Данные масс-спектрометрии позволили идентифицировать белки НСП, связывающиеся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом.. Ими оказались рековерин (р26), аннексии А2 (р38), креатинкиназа (р44) и аннексии А6 (р67). Заметим, что присутствие в экстракте НСП аннексинов А2 и А6 показано нами впервые.

Таким образом, на основании полученных нами данных можно рассматривать рековерин, аннексины А2 и А6 и креатинкиназу в качестве потенциальных мишеней для аннексина А4 в фоторецепторной клетке. Однако для того, чтобы доказать, что аннексии А4 действительно взаимодействует с перечисленными белками в физиологических условиях, в дальнейшем необходимо решить две основные задачи. Во-первых, нужно получить доказательства того, что аннексины А2 и А6, рековерин и креатин киназа в фоторецепторной клетке колокализованы с аннексином А4. Во-вторых, необходимо более детально исследовать взаимодействие аннексина А4 с каждым из перечисленных белков. Однако уже сейчас можно полагать, что наиболее вероятными мишенями аннексина А4 являются рековерин и креатинкиназа, поскольку, по имеющимся литературным данным, оба этих белка в сетчатке локализованы в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток, т.е. в тех частях фоторецепторов, где, по нашим данным, локализован и аннексии А4.

Какие предположения можно высказать относительно функции аннексина А4 в наружных сегментах фоторецепторных клеток? По нашим предварительным данным, аннексии А4 способен не только связываться, но и ингибировать активность креатинкиназы. В то же время, креатинкиназа, по-видимому, является единственным источником АТР, необходимого для фототрансдукции в НСП. Дело в том, что синтез АТР в результате гликолиза затруднен по причине низкого уровня гликолитической активности в НСП, а образование АТР за счет окислительного фосфорилирования в НСП невозможно, так как митохондрии в этой части фоторецепторной клетки отсутствуют. Так что можно предположить, что в наружных сегментах фоторецепторных клеток аннексии А4 мог бы участвовать в метоболизме АТР, выступая в роли Са2+-зависимого регулятора активности креатинкиназы. Необходимость в локальном увеличении концентрацими АТР в наружных сегментах фоторецепторных. клеток возникает, например, при фосфорилировании родопсинкиназой зрительного рецептора родопсина, поглотившего квант света и инициировавшего передачу сигнала в зрительном каскаде. Сигналом к фосфорилированию родопсина является падение концентрации кальция внутри клетки, в результате чего Са2+-связывающий белок рековерин диссоциирует с поверхности фоторецепторных мембран и высвобождает родопсинкиназу. Возможно, что при высокой концентрации кальция аннексии А4 связан с фоторецепторными мембранами и находится в комплексе с креатинкиназой, ингибируя активность фермента, а при понижении концентрации кальция, одновременно с диссоциацией родопсинкиназы из комплекса с рековерином и мембранами, креатинкиназа также диссоциирует из комплекса с аннексином А4 и катализирует синтез АТР, необходимый для фосфорилирования родопсина родопсинкиназой.

выводы

1. Из наружных сегментов фоторецепторных клеток быка выделен и очищен ранее не идентифицированный белок с молекулярной массой 32 кДа (р32), способный Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами.

2. Методом масс-спектрометрии р32 идентифицирован как аннексии А4.

3. Аннексии A4 локализован в сетчатке быка в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток.

4. Аннексии А4 взаимодействует с фоторецепторными мембранами в присутствии ионов кальция или цинка и выступает в роли фактора, вызывающего агрегацию фоторецепторных мембран в присутствии этих катионов.-

5. Иммобилизованный на агарозе аннексии A4 Са2+-зависимым образом взаимодействует с фоторецепторными белками: рековерином, аннексинами А2 и А6 и креатинкиназой, что позволяет рассматривать перечисленные белки в качестве потенциальных мишеней аннексина A4 в фоторецепторной клетке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зерний Е.Ю., Сенин И.И., Филиппов П.П. Новый Са2+-связывающий белок с кажущейся молекулярной массой 32К (р32) из фоторецепторных клеток быка. Тезисы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 2000, т. 1, с. 86-87.

2. Зерний Е.Ю., Сенин И.И., Филиппов П.П. Новый Са2+-связывающий белок с кажущейся молекулярной массой 32К (р32) из фоторецепторных клеток быка. Тезисы докладов и стендовых сообщений XIII зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва,

2001, с. 26.

3. Зерний Е.Ю., Комолов К.Е., Егоров Н.С., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Сенин И.И. Идентификация аннексина IV в фоторецепторных клетках быка. Тезисы докладов и стендовых сообщений XIV зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва,

2002, с. 96.

4. Зерний Е.Ю., Сенин И.И., Филиппов П.П. Аннексии IV в фоторецепторных клетках быка. Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 440.

5. Permyakov S.E., Cherskaya A.M., Wasscrman LA, Khokhlova T.I., Senin I.I, Zargarov A.A., Zinchcnko D.V., Zernii E.Yu., Lipkin V.M., Philippov P.P., Uversky V.N, Permyakov EA Recoverin Is a Zinc-Binding Protein. J. Proteome Res., 2003, v. 2(1), p. 51-57.

6. Зерний Е.Ю., Тихомирова U.K., Филиппов П.П., Сенин И.И. Обнаружение аннексина IV в палочках сетчатки быка. Биохимия, 2003, т. 68(1), с. 154-160.

7. Zernii E.Yu., Tikhomirova N.K., Senin I.I., Philippov P.P. Annexin IV in bovine photoreceptors: localization, binding to photoreceptor membranes and potential protein targets. 6th International Engelhardt conference on molecular biology. June 29 - July 5, 2003, St.Peterburg - Moscow, Russia, p. 16.

Подписано в печать 15 января 2004 г. Заказ 396. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф. Москва, Б. Якиманка, 13, оф. 410. Тел. 778-97-47

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

АННЕКСИНЫ - СЕМЕЙСТВО Са27ФОСФОЛИПИДСВЯЗЫВАЮ-ЩИХ БЕЛКОВ».

1. Са2+-связывающие белки в регуляции зрительной трансдукции.

1.1. Общая схема зрительной трансдукции.

1.2. Регуляция зрительной трансдукции.

2. Структура и общие свойства аннексинов.

2.1. Номенклатура.

2.2. Тканевая и внутриклеточная локализация.

2.3. Гены и первичная структура.

2.4. Вторичная и третичная структуры.

2.5. Димеризация и четвертичная структура.

2.6. Связывание с мембранами и агрегация клеточных мембран.

2.7. Взаимодействие с лигандами нелипидной природы.

3. Функциональная активность аннексинов.

3.1. Участие в транспорте и организации клеточных мембран.

3.2. Регуляция проводимости и образование ионных каналов.

3.3. Участие в клеточной пролиферации и дифференцировке.

3.4. Аннексины в крови и межклеточном пространстве.

4. Аннексинопатии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы.

2. Выделение НСП из сетчаток быка и получение экстракта НСП.

3. Очистка аннексина А4 (р32) из НСП и печени быка.

4. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.

5. Получение поликлональных моноспецифических антител против ан-нексина А4 из печени быка.

6. Получение фракции белков НСП, способных Са -зависимым образом взаимодействовать с иммобилизованным аннексином А4.

7. Определение концентрации белков.

8. БОЗ-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

9. Иммуноблотгинг.

10. Масспктрометрический анализ белковых препаратов.

11. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов сетчатки и печени.

12. Связывание аннексина А4 с отмытыми мочевиной фоторецепторны-ми мембранами.

13. Агрегация отмытых мочевиной фоторецепторных мембран в присутствии аннексина А4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение и очистка фоторецепторного белка р32 и его идентификация как аннексина А4.

1.1. Получение и характеристика фракции фоторецепторных "Са -зависимых" белков.

1.2. Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (р32).

1.3. Доказательство способности гомогенного р32 взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са -зависимым образом.

1.4. Идентификация р32 как аннексина А4.

1.5. Изучение локализации аннексина А4 в сетчатке быка.

2. Изучение функциональных свойств фоторецепторного аннексина А

2.1. Взаимодействие аннексина А4 с фоторецепторными мембранами

2.1.1. Са -зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами.

2.1.2. Ъгс -зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами.

2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран.

2.2.1. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов кальция.

2.2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов цинка.

3. Поиск потенциальной белковой мишени (мишеней) для аннексина А4 в фоторецепторной клетке.

3.1. Выявление растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са -зависимым образом.

3.2. Идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А

ВЫВОДЫ.

Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Одним из таких процессов является передача светового сигнала (фототрансдукция) в фоторецепторных клетках позвоночных животных. Воздействие Са на систему фототрансдукции у позвоночных животных опосредовано л I

Са -связывающими белками. Эти белки сами по себе каталитической активностью не обладают; их функция состоит в придании различным клеточным мишеням чувствительности к ионам кальция. Одним из важнейших свойств фоторецепторных Са2+-связывающих белков яв

Л | ляется их способность Са -зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами.

Некоторые из фоторецепторных Са -связывающих белков в настоящее время выделены и охарактеризованы, это - кальмодулин, ре-коверин, БЮО-белки и активаторы гуанилатциклазы-1, -2 и 3. Все перечисленные белки относятся к обширному семейству ЕР-Ъапё-содержащих Са2+-связывающих белков, т.е. содержат в своем составе л . специальную структуру(ы) для связывания Са , получившую назваI ние ЕР-Иапё. Еще одно семейство Са -связывающих белков - аннексиям; это семейство включает в себя более двадцати представителей, сходных между собой по структуре и биохимическим свойствам. Ан-нексины хотя и не содержат ЕЕ-Иапё-структур, однако способны Са -зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Интенсивные исследования аннексинов, проводимые в последние годы, позволили обнаружить эти белки в клетках различных типов и выявить их участие в самых разнообразных биологических процессах: от транспорта и организации клеточных мембран до передачи внутриклеточных сигналов. Тем не менее, конкретная функция аннексинов в каждом случае остается не установленной.

Исследования аннексинов в фоторецепторных клетках позвоночных животных до сих пор не проводились. В настоящей работе мы впервые показали присутствие одного из представителей семейства аннексинов, аннексина А4, в наружных сегментах фоторецепторных клеток быка, и получили данные, указывающие на функцию аннексина А4 в этом виде клеток.

выводы

Из наружных сегментов фоторецепторных клеток быка выделен и очищен ранее не идентифицированный белок с молекулярной массой 32 кДа (р32), способный Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами.

Методом масс-спектрометрии р32 идентифицирован как аннексии А4.

Аннексии А4 локализован в сетчатке быка в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток.

Аннексии А4 взаимодействует с фоторецепторными мембранами в присутствии ионов кальция или цинка и выступает в роли фактора, вызывающего агрегацию фоторецепторных мембран в присутствии этих катионов.

Л I

Иммобилизованный на агарозе аннексии А4 Са -зависимым образом взаимодействует с фоторецепторными белками: рековерином, аннексинами А2 и А6 и креатинкиназой, что позволяет рассматривать перечисленные белки в качестве потенциальных мишеней ан-нексина А4 в фоторецепторной клетке.

1. Филиппов П.П., Аршавский В.Ю., Дижур A.M. (1987). Биохимия зрительной рецепции. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, т.26.2 . Philippov, Р. (2000). Phototransduction and calcium. Membr. Cell. Biol. 13, 195-206.

2. Chabre, M. (1985). Trigger and amplification mechanisms in visual phototransduction. Ann. Rev. Biophys. Chem. 14, 331-360.

3. Dratz, E.A. and Hargrave, P.A. (1983). The structure of rhodopsin and the rod outer segment disk membrane. Trends Biochem. Sci. 8, 128-131.

4. Hamm, H.E. and Bownds, M.D. (1986). Protein complement of rod outer segments of frog retina. Biochemistry 25,4512-4525.

5. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

6. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and active site studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, 261-264.

7. Ovchinnikov, Y.A., Abdulaev, N.G. and Bogachuk, A.S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. 230, 1-5.

8. Applebury, M. A. (1991) Curr. Opin. Neurobiol., 1, 263-269.

9. Hurley, J.B. (1992). Signal transduction enzymes of vertebrate photoreceptors. J. Bioenerg. and Biomemb. 24, 219-226.

10. Baehr, W., Delvin, M.J. and Applebury, M.L. (1979). Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine ROS. J. Biol. Chem. 254, 11669-11677.

11. Hurley, J.B. and Stryer, L. (1982). Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, 11094-11099.

12. Florio, S.K., Prusti, R.K and Beavo, J.A. (1996). Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 5 subunit. J. Biol. Chem. 271, 24036-24047.

13. Palczewski, K. and Saari, J.C. (1997). Activation and inactivation steps in the visual transduction pathway. Curr. Opin. Neurobiol., 7, 500-504.

14. Pfister, С., Chabre, М., Plouet, J., Tuyen, V.V., De Kozak, Y., Faure J.P. and Kuhn, H. (1985). Retinal S antigen identified as the 48K protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods. Scince 228, 891-893.

15. Palczewski, K., Polans, A., Baehr, W., and Ames, J. (2000). Ca(2+)-binding proteins in the retina: structure, function, and the etiology of human visual diseases. Bioessays 22 (4), 337-50.

16. Schnetkamp, P.P.M., Szerencsei, R.T. and Basu, D.K. (1991). Unidirectional Na+, Ca2+ and K+ fluxes through the bovine rod outer segment Na+ -Ca2+-K+-exchanger. J. Biol. Chem. 266, 198-206.

17. Lagnado, L. and Baylor, D.A. (1994). Calcium controls light-triggered formation of catalytically active rhodopsin. Nature 367, 273-277.

18. Gray-Keller, M.P. and Detwiler, P.B. (1994). Regulation of the cAMP synthesis by calcium in rods. Neuron 13, 846-861.

19. Means, A.R., VanBerkum, M.F., Bagchi, I., Lu, K.P., Rasmussen, C.D. (1991). Regulatory functions of calmodulin. Pharmacol Ther. 50(2), 25570.

20. Vogel, H.J. (1994). Calmodulin: a versatile calcium mediatorprotein. Biochem. Cell. Biol. 72(9-10), 357-76.

21. Nicholson, D.G. Proteins, transmitters and Synapses. Blackwell Scin-tific Publication, Oxford, 1994, 198-239

22. Hsu, Y.-T. and Molday, R.S. (1993) Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell by calmodulin. Nature 361, 76-79.

23. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, 709-716.

24. Senin, I.I., Fischer, T., Komolov, K.E., Zinchenko, D.V., Philippov, P.P. and Koch, K.W. (2002). Ca2+-myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+-binding sites. J. Biol. Chem. 277(52), 50365-72.

25. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11569-11573.

26. Gorodovikova, E.N., Gimelbrant, A.A., Senin, I.I., Philippov, P.P. (1994). Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349(2), 187-90.

27. Gorodovikova, E.N., Senin, I.I., Philippov, P.P. (1994). Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. FEBS Lett. 353(2), 171-2.

28. Gorczyca, W.A., Polans, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W., Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activating protein. A calcium-sensitive regulator of phototransduction. J. Biol. Chem. 270(37), 22029-36.

29. Lange, C., Duda, T., Beyermann, M., Sharma, R.K., Koch, K.W. (1999). Regions in vertebrate photoreceptor guanylyl cyclase ROS-GC1 involved in Ca(2+)-dependent regulation by guanylyl cyclase-activating protein GCAP-1. FEBS Lett. 460(1), 27-31.

30. Dizhoor, A.M., Lowe, D.G., Olshevskaya, E.V., Laura, R.P., Hurley, J.B. (1994). The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator. Neuron. 12(6), 1345-52.

31. Ames, J.B., Dizhoor, A.M., Ikura, M., Palczewski, K., Stryer, L. (1999). Three-dimensional structure of guanylyl cyclase activating protein-2, a calcium-sensitive modulator of photoreceptor guanylyl cyclases. J. Biol. Chem. 274(27), 19329-37.

32. Semple-Rowland, S.L., Gorczyca, W.A., Buczylko, J., Helekar, B.S., Ruiz, C.C., Subbaraya, I., Palczewski, K. and Baehr, W. (1996). Expression of GCAP1 and GCAP2 in the retinal degeneratiom mutant chicken retina. FEBS Lett. 385,47-52.

33. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1999). Regulation of photoreceptor membrane guanylyl cyclases by guanylyl cyclase activator proteins. Methods 19, 521-531.

34. Krishnan, A., Goraczniak, R.M., Duda, T. and Sharma, R.K. (1998). Third calcium-modulated rod outer segment membrane guanylate cyclase transduction mechanism. Mol. Cell Biochem. 178, 251-259.

35. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1996). Inactivation of EF-hand makes GCAP-2 (p24) a constitutive activator of photoreceptor guanylyl cyclase by preventing a Ca2+ induced activator-to-inhibitor transition. J. Biol. Chem. 271, 19346-19350.

36. Haeseleer, F., Sokal, I., Li, N., Pettenati, M., Rao, N., Bronson, D., Wechter, R., Baehr, W., Palczewski, K. (1999). Molecular characterization of a third member of the guanylyl cyclase-activating protein subfamily. J. Biol. Chem. 274(10), 6526-35.

37. Krebs, J., Quadroni, M., and Van Eldik, L.J. (1995). Dance of the dimers. Nat. Struct. Biol. 2(9), 711-4.

38. Margulis, A., Pozdnyakov, N., and Sitaramayya, A. (1996). Activation of bovine photoreceptor guanylate cyclase by SI00 proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218(1), 243-7.

39. Duda, T., Goraczniak, R.M. and Sharma, R.K. (1996). Molecular characterization of S100A1-S100B protein in retina and its activation mechanism of bovine photoreceptor guanylate cyclase. Biochemistry 35(20), 6263-6.

40. Geisow, M.J., Walker, J.H., Boustead, C., Taylor, W. (1987). Annexins new family of Ca2+-regulated-phospholipid binding protein. Biosci. Rep. 7(4), 289-98.

41. Gerke, V., Moss, S.E. (2002). Annexins: from structure to function. Physiol. Rev. 82(2), 331-71.

42. Tagoe, C.E., Boustead, C.M., Higgins, S.J., Walker, J.H. (1994). Characterization and immunolocalization of rat liver annexin VI. Biochim. Bio-phys. Acta 1192(2), 272-80.

43. Dreier, R., Schmid, K.W., Gerke, V., and Riehemann, K. (1998). Differential expression of annexins I, II and IV in human tissues: an immuno-histochemical study. Histochem. Cell Biol. 110(2), 137-48.

44. Genge, B. R., Wu, L. N. Y., and Wuthier, R. E. (1989) Identification of phospholipid-dependent calcium-binding proteins as constituents of matrix vesicles. J. Biol. Chem. 264, 10917-10921

45. Kirsch, T., Nah, H. D., Shapiro, I. M., and Pacifici, M. (1997) Regulated production of mineralization-competent matrix vesicles in hypertrophic chondrocytes. J. Cell Biol. 137, 1149-1160.

46. Gerke, V., Moss, S.E. (1997). Annexins and membrane dynamics. Biochim. Biophys. Acta 1357(2), 129-54.

47. Eberhard, D.A., Karns, L.R., VandenBerg, S.R., Creutz, C.E. (2001). Control of the nuclear-cytoplasmic partitioning of annexin II by a nuclear export signal and by pi 1 binding. J. Cell Sci. 114, 3155-66.

48. Tait, J.F., Sakata, M., McMullen, B.A., Miao, C.H., Funakoshi, T., Hendrickson, L.E., Fujikawa, K. (1988). Placental anticoagulant proteins: isolation and comparative characterization four members of the lipocortin family. Biochemistry 27(17), 6268-76.

49. Massey, D., Traverso, V., Maroux, S. (1991). Lipocortin IV is a baso-lateral cytoskeleton constituent of rabbit enterocytes. J. Biol. Chem. 266(5), 3125-30.

50. Mayran, N., Traverso, V., Maroux, S., Massey-Harroche, D. (1996). Cellular and subcellular localizations of annexins I, IV, and VI in lung epi-thelia. Am. J. Physiol. 270, 863-71.

51. Kojima, K., Utsumi, H., Ogawa, H., Matsumoto, I. (1994). Highly polarized expression of carbohydrate-binding protein p33/41 (annexin IV) on the apical plasma membrane of epithelial cells in renal proximal tubules. FEBS Lett. 342(3), 313-8.

52. Weinman, J.S., Feinberg, J.M., Rainteau, D.P., Gaspera, B.D., Weinman, S.J. (1994). Annexins in rat enterocyte and hepatocyte: an immunogold electron-microscope study. Cell Tissue Res. 278(2), 389-97.

53. Raynal, P., Kuijpers, G., Rojas, E., and Pollard, H.B. (1996). A rise in nuclear calcium translocates annexins IV and V to the nuclear envelope. FEBS Lett 392(3), 263-8.

54. Smith, P.D. and Moss, S.E. (1994). Structural evolution of the annexin supergene family. Trends Genet. 10, 241-246.

55. Smith, P.D., Davies, A., Crumpton, M.J. and Moss, S.E. (1994). Structure of the human annexin VI gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 27132717.

56. Towle, C.A., Weissbach, L. and Treadwell, B. V. (1992). Alternatively spliced annexin XI transcripts encode proteins that differ near the amino-terminus. Biochim. Biophys. Acta 1131,223-226.

57. Raynal, P., Pollard, H.B. (1994). Annexins: the problem of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium- and phos-pholipid-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta 1197(1), 63-93.

58. Weng, X., Luecke, H., Song, I.S., Kang, D.S., Kim, S.H., Huber, R. (1993). Crystal structure of human annexin I at 2.5 A resolution. Protein Sci. 2(3), 448-58.

59. Rety, S., Sopkova, J., Renouard, M., Osterloh, D., Gerke, V., Tabaries, S., Russo-Marie, F. and Lewit-Bentley, A. (1999). The crystal structure of a complex of pi 1 with the annexin II N-terminal peptide. Nat. Struct. Biol. 6(1), 89-95.

60. Favier-Perron, B., Lewit-Bentley, A. and Russo-Marie, F. (1996). The high-resolution crystal structure of human annexin III shows subtle differences with annexin V. Biochemistry 35(6), 1740-4.

61. Zanotti, G., Malpeli, G., Gliubich, F., Folli, C., Stoppini, M., Olivi, L., Savoia, A. and Berni, R. (1998). Structure of the trigonal crystal form of bovine annexin IV. Biochem. J. 329, 101-6.

62. Concha, N.O., Head, J.F., Kaetzel, M.A., Dedman, J.R., Seaton, B.A. (1993). Rat annexin V crystal structure: Ca(2+)-induced conformational changes. Science 261, 1321-4.

63. Huber, R., Romisch, J., Paques, E.P. (1990). The crystal and molecular structure of human annexin V, an anticoagulant protein that binds to calcium and membranes. EMBO J. 9(12), 3867-74:

64. Lewit-Bentley, A., Morera, S., Huber, R., Bodo, G. (1992). The effect of metal binding on the structure of annexin V and implications for membrane binding. Eur. J. Biochem. 210(1), 73-7.

65. Benz, J., Bergner, A., Hofmann, A., Demange, P., Gottig, G., Liemann, S., Huber, R. and Voges, D. (1996). The structure of recombinant human annexin VI in crystals and membrane-bound. J. Mol. Biol. 260(5), 638-43.

66. Chen, J.M., Sheldon, A. and Pincus, M.R. (1993). Structure-function correlations of calcium binding and calcium channel activities based on 3-dimensional models of human annexins I, II, III, V and VII. J. Biomol. Struct. Dyn., 10(6), 1067-89.

67. Cartailler, J.P., Haigler, H.T. and Luecke, H. (2000). Annexin XII E105K crystal structure: identification of a pH-dependent switch for mutant hexamerization.Biochemistry 39(10), 2475-83.

68. Liemann, S., Bringemeier, I., Benz, J., Gottig, P., Hofmann, A., Huber, R„ Noegel, A.A. and Jacob, U. (1997). Crystal structure of the C-terminal tetrad repeat from synexin (annexin VII) of Dictyostelium discoideum. J. Mol. Biol. 270, 79-88.

69. Hofmann, A., Proust, J., Dorowski, A., Schantz, R. and Huber, R. (2000). Annexin 24 from Capsicum annuum: X-ray structure and biochemical characterization. J. Biol. Chem. 275, 8072-8082.

70. Liemann, S. and Lewit-Bentley, A. (1995). Annexins: a novel family of calcium- and membrane-binding proteins in search of a function. Structure 3, 233-237.

71. Brisson, A., Mosser, G., Huber, R. (1991). Structure of soluble and membrane-bound human annexin V. J. Mol. Biol. 220(2), 199-203.

72. Driessen, H.P., Newman, R.H., Freemont, P.S., Crumpton, M.J. (1992). A model of the structure of human annexin VI bound to lipid monolayers. FEBS Lett. 306(1), 75-9.

73. Kaetzel, M.A., Mo, Y.D., Mealy, T.R., Campos, B., Bergsma-Schutter, W., Brisson, A., Dedman, J.R., Seaton, B.A. (2001). Phosphorylation mutants elucidate the mechanism of annexin IV-mediated membrane aggregation. Biochemistry 40(13), 4192-9.

74. Crivici, A., Ikura, M. (1995). Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 85116.

75. McPhalen, C.A., Strynadka, N.C., James, M.N. (1991) Calcium-binding sites in proteins: a structural perspective. Adv. Protein. Chem. 42, 77-144.

76. Swairjo, M.A., Seaton, B.A. (1994). Annexin structure and membrane interactions: a molecular perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23,193-213.

77. Mukhopadhyay, S. and Cho, W. (1996). Interactions of annexin V with phospholipid monolayers. Biochim. Biophys. Acta, 1279(1), 58-62.

78. Swairjo, M.A., Concha, N.O., Kaetzel, M.A., Dedman, J.R. and Seaton B.A. (1995). Ca(2+)-bridging mechanism and phospholipid head group recognition in the membrane-binding protein annexin V. Nat. Struct. Biol 2(11), 968-74.

79. Blackwood, R.A., Ernst, J.D. (1990). Characterization of Ca2(+)-dependent phospholipid binding, vesicle aggregation and membrane fusion by annexins. Biochem. J. 266(1), 195-200.

80. Sohma, H., Creutz, C.E., Gasa, S., Ohkawa, H., Akino, T. and Kuroki, Y. (2001) Differential lipid specificities of the repeated domains of annexin1.. Biochim. Biophys. Acta 1546(1), 205-15.

81. Campos, B., Wang, S., Retzinger, G.S., Kaetzel, M.A., Seaton, B.A., Karin, N.J., Johnson, J.D. and Dedman, J.R. (1999). Mutation of highly conserved arginine residues disrupts the structure and function of annexin

82. V. Arch. Med. Res. 30, 360-367.

83. Creutz, C.E. (1992). The annexins and exocytosis. Science 258, 92431.

84. Kojima, K., Yamamoto, K., Irimura, T., Osawa, T., Ogawa, H. and Matsumoto, I. (1996). Characterization of carbohydrate-binding protein p33/41. J. Biol. Chem. 271, 7679 7685.

85. Liu, L. (1999). Calcium-dependent self-association of annexin II: a possible implication in exocytosis. Cell Signal 11, 317-324.

86. Zaks, W.J. and Creutz, C.E. (1991). Ca(2+)-dependent annexin self-association on membrane surfaces. Biochemistry 30(40), 9607-15.

87. Pradel, L.A. and Rendon, A. (1993). Annexin 1 is present in different molecular forms in rat cerebral cortex. FEBS Lett 327(1), 41-4.

88. Mo, Y., Campos, B., Mealy, T., Commodore, L., Head, J., Dedman, J.R. and Seaton, B.A. (2003). Interfacial Basic Cluster in Annexin V Couples Phospholipid Binding and Trimer Formation on Membrane Surfaces. J. Biol. Chem. 278, 2437 2443.

89. Concha, N.O., Head, J.F., Kaetzel, M.A., Dedman, J.R. and Seaton, B.A. (1992). Annexin V forms calcium-dependent trimeric units on phospholipid vesicles. FEBS Lett 314(2), 159-62.

90. Meers, P., Mealy, T. (1993). Relationship between annexin V tryptophan exposure, calcium, and phospholipid binding. Biochemistry 32(20), 5411-8.

91. Filipenko, N.R. and Waisman, D.M. (2000) Characterization of Ca2+-binding sites of annexin II tetramer. J. Biol. Chem. 275, 38877-38884.

92. Ayala-Sanmartin, J. (2001) Cholesterol enhances phospholipid binding and aggregation of annexins by their core domain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 283(1), 72-9.

93. Bianchi, R., Giambanco, I., Ceccarelli, P., Pula, G., Donato, R. (1992). Membrane-bound annexin V isoforms (CaBP33 and CaBP37) and annexin VI in bovine tissues behave like integral membrane proteins. FEBS Lett. 296(2), 158-62.

94. Rojas, E., Pollard, H.B., Haigler, H.T., Parra, C., Burns, A.L. (1990). Calcium-activated endonexin II forms calcium channels across acidic phospholipid bilayer membranes. J. Biol. Chem. 265(34), 21207-15.

95. Köhler, G., Hering, U., Zschörnig, O. and Arnold, K. (1997). Annexin V interaction with phosphatidylserine-containing vesicles at low and neutral pH. Biochemistry 36, 8189-8194.

96. Beermann, B., Hinz, H.-J., Hofmann, A. and Huber, R. (1998). Acid induced unfolding of annexin V wild type shows two intermediate states. FEBS Lett 423, 265-269.

97. Bitto, E., Li, M., Tikhonov, A.M., Schlossman, M.L. and Cho, W. (2000). Mechanism of annexin I-mediated membrane aggrega-tion.Biochemistry 39(44), 13469-77.

98. Ayala-Sanmartin, J., Gouache, P. and Henry, J.P. (2000). N-Terminal domain of annexin 2 regulates Ca(2+)-dependent membrane aggregation by the core domain: a site directed mutagenesis study. Biochemistry 39(49), 15190-8.

99. Creutz, C.E., Moss, S., Edwardson, J.M., Hide, I. and Gomperts, B. (1992). Differential recognition of secretory vesicles by annexins. Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 184(1), 347-52.

100. Sen N., Spitzer A.R. and Chander A. (1997). Calcium-dependence of synexin binding may determine aggregation and fusion of lamellar bodies. Biochem. J. 322, 103-109.

101. Bitto, E., Cho, W. (1998). Roles of individual domains of annexin I in its vesicle binding and vesicle aggregation: a comprehensive mutagenesis study. Biochemistry 37(28), 10231-7.

102. Rosengarth, A., Gerke, V. and Luecke, H. (2001). X-ray structure of full-length annexin I and implications for membrane aggregation. J. Mol. Biol. 306, 489-498.

103. Cho, W. and Bitto, E. (1999). Structural determination of the vesicle aggregation activity of annexin I. Biochemistry 38, 14094-14100.

104. Avila-Sakar, A.J., Kretsinger, R.H. and Creutz, C.E. (2000). Membrane-bound 3D structures reveal the intrinsic flexibility of annexin VI. J. Struct. Biol. 130, 54-62.

105. Lambert, 0., Gerke, V., Bader, M.F., Porte, F. and Brisson, A. (1997). Structural analysis of junctions formed between lipid membranes and several annexins by cryoelectron microscopy. J. Mol. Biol. 272, 42-55.

106. Waisman, D.M. (1995). Annexin II tetramer: structure and function. Mol. Cell Biochem. 149-150,301-22.

107. Naka, M., Qing, Z.X., Sasaki, T., Kise, H., Tawara, I., Hamaguchi, S., Tanaka, T. (1994). Purification and characterization of a novel calcium-binding protein, S100C, from porcine heart. Biochim. Biophys. Acta 1223(3), 348-53.

108. Johnsson, N., Nguyen Van, P., Soling, H.D. and Weber, K. (1986). Functionally distinct serine phosphorylation sites of p36, the cellular substrate of retroviral protein kinase; differential inhibition of reassociation with pi 1. EMBO J. 5, 3455 3460.

109. Sudo, T. and Hidaka, H. (1998). Regulation of calcyclin (S100A6) binding by alternative splicing in the N-terminal regulatory domain of annexin XI isoforms. J. Biol. Chem. 273, 6351-6357.

110. Garbuglia, M., Verzini, M. and Donato, R. (1998). Annexin VI binds S100A1 and S100B and blocks the ability of S100A1 and S100B to inhibit desmin and GFAP assemblies into intermediate filaments. Cell Calcium 24, 177-191.ft

111. Brownawell, A.M. and Creutz, C.E. (1997). Calcium-dependent Binding of Sorcin to the N-terminal Domain of Synexin (AnnexinVII). (1997). J. Biol. Chem. 272, 22182 22190.

112. Verzili, D., Zamparelli, C., Mattei, B., Noegel, A.A. and Chiancone, E. (2000). The sorcin-annexin VII calcium-dependent interaction requires the sorcin N-terminal domain. FEBS Lett. 471, 197-200.

113. Alvarez-Martinez, M.T., Mani, J.C., Porte, F., Faivre-Sarrailh, C., Li-autard, J.P., Sri Widada, J. (1996). Characterization of the interaction between annexin I and profilin. Eur. J. Biochem. 238(3), 777-84.

114. Traverso, V., Morris, J.F., Flower, R.J. and Buckingham, J. (1998). Lipocortin 1 (annexin 1) in patches associated with the membrane of a lung adenocarcinoma cell line and in the cytoplasm. J. Cell. Sci. Ill, 14051418.

115. Babiychuk, E.B. and Draeger, A. (2000). Annexins in cell membranedynamics: Ca(2+)-regulated association of lipid microdomains. J. Cell. Biol. 150, 1113-1124.

116. JBandorowicz-Pikula, J. and Awasthi, Y.C. (1997). Interaction of annexins IV and VI with ATP. An alternative mechanism by which a cellular function of these calcium- and membrane-binding proteins is regulated. FEBS Lett., 409(2), 300-6.

117. Tzima, E., Trotter, P.J., Orchard, M.A. and Walker, J.H. (2000). Annexin V relocates to the platelet cytoskeleton upon activation and binds to a specific isoform of actin. Eur. J. Biochem. 267, 4720-4730.

118. Kim, S.W., Rhee, H.J., Ko, J., Kim, Y.J., Kim, H.G., Yang, J.M., Choi, E.C. and Na, D.S. (2001). Inhibition of Cytosolic Phospholipase A2 by Annexin I. J. Biol. Chem. 276(19), 15712-9.

119. Edwards, H.C. and Crumpton, M.J. (1991). Ca(2+)-dependent phospholipid and arachidonic acid binding by the placental annexins VI and IV Eur. J. Biochem., 198, 121 129.

120. Kim, S., Ko, J., Kim, J.H., Choi, E.C. and Na, D.S. (2001). Differential effects of annexins I, II, III, and V on cytosolic phospholipase A2 activity: specific interaction model. FEBS Lett. 489(2-3), 243-8.

121. Davidson, F.F., Dennis, E.A., Powell, M. and Glenney, J.R. (1987). Inhibition of phospholipase A2 by "lipocortins" and calpactins. J. Biol. Chem. 262, 1698-1705.

122. Brownawell, A.M. and Creutz, C.E. (1996). Calcium-dependent binding of the plasma protein apolipoprotein A-I to two members of the annexin family.Biochemistry 35(21), 6839-45.

123. Sohma, H., Creutz, C.E., Saitoh, M., Sano, H., Kuroki, Y., Voelker, D.R. and Akino, T. (1999). Characterization of the Ca2+-dependent binding of annexin IV to surfactant protein A. Biochem. J. 341, 203-9.

124. Kassam, G., Manro, A., Braat, C., Louie, P., Fitzpatrick, S. and Waisman, D. (1997). Characterization of the Heparin Binding Properties of Annexin II Tetramer. J. Biol. Chem. 272, 15093 15100.

125. Ishitsuka, R., Kojima, K., Utsumi, H., Ogawa, H. and Matsumoto, I. (1998). Glycosaminoglycan Binding Properties of Annexin IV, V, and VI. J. Biol. Chem. 273, 9935 9941.

126. Mel'gunov, V.I., Akimova, E.I. and Krasavchenko, K.S. (2000). Effect of divalent metal ions on annexin-mediated aggregation of asolectin liposomes. Acta. Biochim. Pol. 47(3), 675-83.

127. Andree, H.A., Reutelingsperger, C.P., Hauptmann, R., Hemker, H.C., Hermens, W.T. and Willems, G.M. (1990). Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers. J. Biol. Chem. 265, 4923 4928.

128. Schlaepfer, D.D. and Haigler, H.T. (1987) Characterization of Ca2+-dependent phospholipid binding and phosphorylation of lipocortin I. J. Biol. Chem. 262, 6931 6937.

129. Bandorowicz-Pikula, J., Buchet, R., Pikula, S. (2001) Annexins as nu-cleotide-binding proteins: facts and speculations. Bioessays 23(2), 170-8.

130. Cohen, B.E., Lee, G., Arispe, N., Pollard, H.B. (1995). Cyclic 3'-5'-adenosine monophosphate binds to annexin I and regulates calcium-dependent membrane aggregation and ion channel activity. FEBS Lett. 377(3), 444-50.

131. Caohuy, H., Srivastava, M. and Pollard, H. (1996). Membrane fusion protein synexin (annexin VII) as a Ca2+/GTP sensor in exocy-totic secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 10797 10802.

132. Hirata, A. and Hirata, F. (1999). Lipocortin (Annexin) I hetero-tetramer binds to purine RNA and pyrimidine DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265(1), 200-4.

133. Vedeler, A. and Hollas, H. (2000). Annexin II is associated with mRNA which may constitute a distinct subpopulation. Biochem. J. 348: 565-572.

134. Ali, S.M., Geisow, M.J. and Burgoyne, R.D. (1989). A role for cal-pactin in calcium-dependent exocytosis in adrenal chromaffin cells. Nature, 340(6231), 313-5.

135. Sarafian, T., Pradel, L-A., Henry, J-P., Aunis, D. and Bader, M-F. (1991). The participation of annexin II (Calpactin I) in calcium-evoked exocytosis requires protein kinase C. J. Cell Biol. 114, 1135-1147.

136. Faure, A.V., Migne, C., Devilliers, G. and Ayala-Sanmartin, J. (2002). Annexin 2 "secretion" accompanying exocytosis of chromaffin cells: possible mechanisms of annexin release. Exp. Cell Res. 276(1), 79-89.

137. Liu, L., Tao, J.Q., Li, H.L. and Zimmerman, U.J. (1997). Inhibition of lung surfactant secretion from alveolar type II cells and annexin II tetramer-mediated membrane fusion by phenothiazines. Arch. Biochem. Biophys. 342, 322-328.

138. König, J., Prenen, J., Nilius, B. and Gerke, V. (1998). The annexin II-pl 1 complex is involved in regulated exocytosis in bovine pulmonary artery endothelial cells. J. Biol. Chem. 273, 19679-19684.

139. Diakonova, M., Gerke, V., Ernst, J., Liautard, J-P., Van Der Vusse, G. and Griffiths, G. (1997). Localization of five annexins in J774 macrophages and on isolated phagosomes. J. Cell. Sei. 110, 1199-1213.

140. Lafont, F., Lecat, S., Verkade, P. and Simons, K. (1998). Annexin XHIb Associates with Lipid Microdomains to Function in Apical Delivery. J. Cell Biol. 142,1413- 1427.

141. Nilius, B., Gerke, V., Prenen, J., Szücs, G., Heinke, S., Weber, K. and Droogmans, G. (1996). Annexin II modulates volume-activated chloride currents in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 271, 30631-30636.

142. Diaz-Munoz, M., Hamilton, S.L., Kaetzel, M.A., Hazarika, P. and Dedman, J.R. (1990). Modulation of calcium release channel activity from sarcoplasmic reticulum by annexin VI (67 kDa-calcimedin). J. Biol. Chem. 265, 15894-15899.

143. Chan, H.C., Kaetzel, M.A., Goiter, A.L., Dedman, J.R. and Nelson, D.J. (1994). Annexin IV inhibits calmodulin-dependent protein kinase II-activated chloride conductance. A novel mechanism for ion channel regulation. J. Biol. Chem. 269, 32464-32468.

144. Kaetzel, M.A., Chan, H.C., Dubinsky, W.P., Dedman, J.R. and Nelson, D.J. (1994). A role for annexin IV in epithelial cell function. Inhibition of calcium-activated chloride conductance. J. Biol. Chem. 269(7), 5297302.

145. Isas, J.M., Cartailler, J.P., Sokolov, Y., Patel, D.R., Langen, R., Luecke, H., Hall, J.E. and Haigler, H.T. (2000). Annexins V and XII insert into b'ilayers at mildly acidic pH and form ion channels. Biochemistry 39, 3015-3022.

146. Hofmann, A., Benz, J., Liemann, S. and Huber, R. (1997). Voltage dependent binding of annexin V, annexin VI and annexin VII core to acidic phospholipid membranes. Biochim. Biophys. Acta 1330, 254-264.

147. Tokumitsu, H., Mizutani, A., Minami, H., Kobayashi, R., Hidaka, H. (1992). A calcyclin-associated protein is a newly identified member of the Ca2+/phospholipid-binding proteins, annexin family. J. Biol. Chem. 267(13), 8919-24.

148. Vishwanatha, J.K., Kumble, S. (1993) Involvement of annexin II in DNA replication: evidence from cell-free extracts of Xenopus eggs. J. Cell Sci. 105,533-40.

149. Walther, A., Riehemann, K. and Gerke, V. (2000). A novel ligand of the formyl peptide receptor: annexin I regulates neutrophil extravasation by interacting with the FPR. Mol Cell. 5(5), 831-40.

150. Hajjar, K.A., Mauri, L., Jacovina, A.T., Zhong, F., Mirza, U.A., Padovan, J.C. and Chait, B.T. (1998). Tissue Plasminogen Activator Binding to the Annexin II Tail Domain. DIRECT MODULATION BY HOMOCYSTEINE. J. Biol. Chem. 273, 9987 9993.

151. Schwartz-Albiez, R., Koretz, K., Moller, P. and Wirl, G. (1993). Differential expression of annexins I and II in normal and malignant human mammary epithelial cells. Differentiation 52(3), 229-37.

152. Kirsch, T., Harrison, G., Golub, E.E. and Nah, H.D. (2000). The roles of annexins and types II and X collagen in matrix vesicle-mediated mineralization of growth plate cartilage. J. Biol. Chem. 275, 35577 35583.

153. Schnetkamp, P.P.M., Klompmarkers, A.A. and Daemen, F.J.M. (1979). The isolation of stable cattle rod outer segments with an intact plasma membrane. Biochim. Biophys. Acta 552, 379-389.

154. Dizhoor, A.M., Chen., C., Olshevskaya, E., Sinelnikova, V.V., Phil-lipov, P., and Hurley, J.B. (1993) Role of the acylated amino terminus of recoverin in Ca(2+)-dependent membrane interaction. Science 259, 829832.

155. Shichi, H. and Somers, R.L. (1978). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin. J. Biol. Chem. 253, 7040-7046.

156. Tikhomirova, N.K., Kochetov, G.A. (1990). Purification of transketo-lase from baker's yeast by an immunoadsorbent. Biochemistry Intern. 22, 31-36.

157. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

158. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

159. Morrissey, J.H. (1981). Silver stain for proteins in Polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivity. Anal. Biochem.* 117(2), 307-10.

160. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76(9), 4350-4.

161. Lee, G., Pollard, H.B. (1997). Highly sensitive and stable phosphati-dylserine liposome aggregation assay for annexins. Anal. Biochem. 252(1), 160-4.

162. Senin, I.I., Koch, K.-W., Akhtar, M., and Philippov, P.P. (2002) in Photoreceptors and Calcium, Ch. 5 (Baehr, W. and Palczewski, K., eds.), Landes Bioscience, Georgtown, USA.

163. Grahn, B.H., Paterson, P.G., Gottschall-Pass, K.T. and Zhang, Z. (2001). Zinc and the Eye. J. Am. Coll. Nutr. 20, 106 118.

164. Ugarte, N. and Osborne, N.N. (2001). Zinc in the retina. Prog. Neuro-biol. 64(3), 219-49.

165. Boesze-Battaglia, K., Dispoto, J., Kahoe, M.A. (2002). Association of a photoreceptor-specific tetraspanin protein, ROM-1, with triton X-100-resistant membrane rafts from rod outer segment disk membranes. J. Biol. Chem. 277(44), 41843-9.

166. Boesze-Battaglia, K., Albert, A.D. and Yeagle, P.L. (1992). Fusion between disk membranes and plasma membrane of bovine photoreceptor cells is calcium dependent. Biochemistry 31(15), 3733-8.

167. Leibovic, K.N. (2002). The calcium gradient along the rod outer segment. Adv. Exp. Med. Biol. 514, 21-35.

168. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B., Stryer, L. (1991). Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251, 915-918.

169. Stolz, M. and Wallimann, T. (1998). Myofibrillar interaction of cyto-solic creatine kinase (CK) isoenzymes: allocation of N-terminal binding epitope in MM-CKand BB-CK. J. Cell Sci. 111, 1207 1216.

170. Meers, P. (1990). Location of tryptophans in membrane-bound annexins. Biochemistry, 29(13), 3325-30.