Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния биологических молекул тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

л/ oo ses

/д'Л

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ¡/t

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. M. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

УДК 577.322.5 577.352.332

Н А Б И Е В Игорь Руфаилович

СПЕКТРОСКОПИЯ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии ¡шММЛПемякина Академии наук СССР

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН СССР, профессор ЮЛ. ЧИЗМАДЖЕВ доктор химических наук, профессор В.П.ЗУБОВ доктор физ. - мат. наук, профессор Н.И.КОРОТЕЕВ

Ведущая организация -Московский государственный университет имМВЛомоносова.

Защита состоится <<_>>_ 1990 года в_часов

на заседании специализированного совета Д 00235.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина А£ СССР по адресу: 117871, ГСП Москва В-437, улМиклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР

Автореферат разослан <<_»_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ВЛ.Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Решение основных проблем физико-химической и молекулярной биологии, биоорганпческой химии и генной инженерии во многом зависит от возможности получения структурно-функциональной информации с помощью физико-химических методов анализа. В то же время необходимость изучения более сложных биологических систем, таких как мембранные белки, белок-нуклеотидные комплексы, живущие клетки, а также требования проведения исследования на микроколичествах вещества вызывают некоторый кризис в применении традиционных и высокоинформативных методов рентгеноструктурного анализа, инфракрасной спектроскопии, спектроскопии спонтанного комбинационного рассеяния и кругового дихроизма.

Ключом к решению этих проблем является разработка новых физико-химических методов исследования биологических молекул и надмолекулярных комплексов, которые позволили бы, во-первых, резхо повысить чувствительность анализа, снизив предел регистрации спектров до пюсограммовых количеств вещества и, во-лторых, проводить селективный структурно-функциональный анализ различных компонентов биологической системы in vivo.

Среди методов оптической спектроскопии в приложениях к изучению биомолекул выделяется спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) света. Этот метод позволяет получать информацию о структуре основной цепи белков и нуклеиновых кислот, а также о микроокружении отдельных аминокислотных остатков я нуклеотидов, изучать конформацгао дисульфидных связей, проводить кинетические измерения in vivo. Спонтанная спектроскопия КР позволяет получать спектры изучаемых молекул в любых агрегатных состояниях, что особенно важно для интерпретации данных рентгеноструктурного анализа высокого разрешения. В то же время этот метод отличается низкой чувствительностью, что вызывает необходимость

_"3

использования высоких (до 10 М) концентраций биомолекул и больших, часто недоступных, количеств вещества. Кроме того, он дает усредненную информацию о микроокружешга всех компонентов макромолекул (например, всех остатков триптофана в молекуле белка, либо общее содержание регулярной структуры одного типа в конформации основной цепи белка).

T-Í

В начале 80-х годов возникли новые разновидности этого метода - спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния (РКР) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) биомолекул. Эти методические подходы позволили резко снизить необходимое количество исследуемого вещества, а > также повысить информативность за счет высокой селективности анализа. При этом значительно увеличились объем и качество информация о пространственной структуре белков, нуклеиновых кислот и надмолекулярных комплексов.

Цели и задачи исследования. Основной целью исследования была разработка на основании ГКР-спектроскопии принципиально новых методов анализа пространственной структуры мембранных и водорастворимых белков и нуклеиновых кислот, позволяющих использовать пикограммовые количества вещества. Следующая задача заключалась в разработке подхода к. изучению структуры надмолекулярных комплексов, отличающегося высокой избирательностью анализа состояния отдельных, входящих в их состав, компонентов. Кроме того, разрабатывались методы исследования топографии надмолекулярных комплексов, позволяющие избирательно детектировать сигналы от гидрофобных и экспонированных в водную фазу областей мембранно-связанных белков ш vivo; определения вторичной структуры нуклеиновых кислот и участков дестабилизации двойной спирали с использованием пикограммовых количеств вещества, а также различные аналитические приложения, основанные на рекордной чувствительности метода спектроскопии ГКР.

При решении указанных методических задач было проведено структурно-функциональное исследование молекул, играющих ключевую роль в изучении механизмов следующих процессов:

- светоиндуцированного транспорта протонов через клеточную мембрану (бактериородопсин);

- переноса зрительного импульса (зрительный родопсин);

- АТФ-зависимого ' транспорта ионов через каналы в биологических мембранах (Na,K-AT<t>a3a);

Кроме того, предложен метод диагностики катаракты и получено авторское свидетельство на способ получения ГКР-активной поверхности, обеспечивающей усиление сечения КР на 5-7 порядков величины.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые:

- разработан новый физико-химический метод изучения биологических молекул на основании спектроскопии ГКР и получены спектры аминокислот, дипептидов, водорастворимых и мембранных белков, нуклеиновых кислот и некоторых низкомолекулярных соединений;

- предложены экспериментальные системы для анализа пикограммовых количеств биомолекул, обеспечивающие увеличение сечения КР на 5-7 порядков величины;

- обнаружен эффект индуцированной адсорбцией оптической активности комплексов гидрозолей серебра с биомолекулами, который может послужить основой для разработки новых высокочувствительных методов поляризационной спектроскопии;

- разработаны подходы к определению вторичной структуры нуклеиновых кислот и локализации участков дестабилизации двойной спирали на основании спектроскопии ПСР;

- предложен метод изучения топСграфии мембранно-связанных надмолекулярных комплексов на основе избирательной реализации дально- и короткодействующей компонент механизма усиления КР;

- показано, что спектроскопия ГКР обеспечивает экспресс-диагностику ранних стадий катаракты.

На основании указанных новых методических подходов впервые:

- определено трансмембранное положение и ориентация хромофоров бактериального и зрительного родопсинов на различных стадиях функционирования пигментов и предложена модель их микроокружеивя; локализован аминокислотный остаток катализирующий еветоиндуциро-ванное депротонирование альдимина ретиналя бактериородопсина;

- проведен селективный анализ гидрофобных и гидрофильных участков а- и р-субъединиц КаД-АТФазы из почки свиньи и на основании комбинированного подхода, включающего данные оптической спектроскопии и расчетных методов предложена модель трансмембранной организации фермента;

- обнаружены н локализованы конформационные изменения КаД-АТФазы, индуцированные связыванием одновалентных катионов;

- предложена технология получения ГКР-активных поверхностей, обеспечивающая усиление КР на 5-7 порядков.

Практическая значимость диссертационной работы заключается прежде всего в создании1 нового физико-химического метода анализа биомолекул; метода диагностики катаракты; получении структурно-функциональной информации для ряда белков и нуклеиновых кислот, а также новой технологии получения ГКР—активных поверхностей, которые могут быть использованы в качестве высокочувствительных детекторов в приборах новых поколений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В 1974 году Флейшман с сотр. впервые зарегистрировали спектр КР монослоя пиридина, адсорбированного на развитой поверхности серебра в электрохимической ячейке. Хотя га в этой, ни в последующих работах указанной группы авторов наблюдавшиеся спектры не были интерпретированы как гигантски усиленные и, более того, вопрос об изменении интенсивности спектра КР молекулы при адсорбции вообще не ставился, возможность получать удовлетворительные спектры КР монослоя адсорбата на электродах привлекла внимание других исследователей, что и позволило обнаружить гигантское комбинационное рассеяние (ГКР). Впервые это было сделано независимо тремя группами авторов (Ван Дайн, 1977; Албрехт и Крейтон, 1977; Маршдак, Лззоренко-Маневич, 1978).

Впервые спектры ГКР биологически важных соединений -компонентов нуклеиновых кислот, адсорбированных на серебряных электродах в электрохимической ячейке, были получены Е. Коглином и .соавт. в 1979/80 гг. Одновременно в нашей лаборатории удалось зарегистрировать спектры ГКР ряда ароматических аминокислот и водорастворимых белков. В это асе время были опубликованы результаты Т, Коттон и др, посвященные исследованию цитохрома С и миоглобина.

При применении спектроскопии ГКР к изучению биологических макромолекул основными являются следующие вопросы, определяющие круг задач, решаемых этим методом.

1. Каковы молекулярные механизмы взаимодействия изучаемых биомолекул с поверхностью металла в экспериментальных условиях, используемых для получения спектров ГКР и возможно ли проведение измерений при полном сохранении нативной конформации макромолекул ?

2. Какова реальная зависимость коэффициента усиления КР от расстояния молекула-металл? Является ли механизм усиления дально-или короткодействующим и, соответственно, позволит ли он наблюдать все разрешенные колебания макромолекулы или лишь колебания групп, находящихся в непосредственном контакте с поверхностью ?

3. Каковы нижние пределы регистрации спектров ГКР биомолекул в различных экспериментальных системах (электроды, гидрозоли, поверхности с регулярными неоднородносгами) и можно ли получать спектры ГКР высокого разрешения от тнсограммовых количеств биомолекул, что является необходимым для конкурентоспособности спектроскопии ГКР с традиционными методиками аналитической химии, биотехнологии и генной инженерии ?

В настоящей работе дан ответ на эти вопросы, а также продемонстрирована применимость метода спектроскопии ГКР к решению широкого круга задач, связанных с различными классами биомолекул. Основное внимание уделяется тем особенностям механизма эффекта, которые охазываются важными при изучении именно биологических молекул (величина коэффициента усиления в различных системах, тушение флуоресценции в видимой области спектра, условия сохранения конформации молекул, дальнодействие эффекта при реализации различных механизмов).

К началу настоящей работы (1978 г.) как методические подходы к изучению биомолекул различных классов, так и теоретическое обоснование используемых весьма ограниченных методов практически отсутствовали. Необходимо было создать практически новый метод колебательной спектроскопии биомолекул, продемонстрировать его применимость к структурно-функциональному изучению мембранных и водорастворимых белков и нуклеиновых кислот, развить подходы, повышающие его информативность и чувствительность по сравнению с традиционными методами анализа.

Г Л А В А 1. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И МЕХАНИЗМЫ

ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ.

Молекулы, адсорбированные на металлических поверхностях, при

- б -

определенных условиях обладают аномально высоким поперечным

сечением КР света. Это явление и называется гигантским

комбинационным рассеянием н представляет собой яркий пример

изменения оптических свойств молекул вблизи поверхности твердого

тела. Величина усиления КР зависит от химической природы молекул,

а также от типа и структуры поверхности металла. Наибольшее

усиление КР возникает на серебре, золоте и меди, причем

поверхность металла должна быть в определенном смысле шероховатой

и обладать специфическими адсорбционными свойствами.

ГКР обладает тремя основными особенностями, отлнчакнщши его

от традиционной спектроскопии КР. Во-первых, сечения КР для

колебательных мод адсорбированных молекул увеличиваются б 105-о

10 раз по сравнению с аналогичными величинами для неадсорбированных молекул. Во—вторых, величина усиления зависит от частоты возбуждающего света (по закону отличному от v^) в от степени шероховатости поверхности. К, в-третьих, спектры ГКР большинства молекул сильно отличаются от соответствующих спектров КР молекул в свободном состоянии. Это проявляется в избирательном усилении определенных типов колебаний, а также в появлении в спектрах ГКР новых полос, запрещенных правилами отбора КР. Кроме того, пра адсорбции молекул происходит мощное тушение люминесценции, изменение поглощения, проявляется ряд нелинейных эффектов и индуцированная адсорбцией оптическая активность хиральных хромофоров в видимой области.

За счет каких механизмов происходит усиление спектров КР молекул, находящихся вблизи поверхности металла? Поскольку

величина сечения КР определяется величиной дипольного момента —

( р(а>) ) индуцированного взаимодействием электромагнитного поля падающего света (Епад(г,0) с молекулярной поляризуемостью а, и

р(ш) - а Епад(Т,1) (1.1),

то логично заключить, что гигантское усиление сигналов КР адсорбированных молекул определяется увеличением либо напряженности электромагнитного поля, либо поляризуемости, либо обоих этих параметров одновременно. Соответственно, теории,

объясняющие эффект ПСР, разделяются на "электромагнитные" и "молекулярные". Большинство "электромагнитных* теорий основано на том факте, что вблизи поверхности металла падающее и рассеяное излучение будет усилено по сравнению с объемом. Это происходит за счет резонансного возбуждения поверхностных электромагнитных волн на шероховатой поверхности. Кроме того, в отдельных структурных элементах поверхности, а также в малых изолированных металлических частицах существуют локальные резонансы, связанные с возбуждением под действием света коллективных электронных осцилляций. Это приводит к увеличению индуцированного дипольного момента молекулы, находящейся вблизи поверхности металла, и, соответственно, к изменению распределения ее стоксова рассеяного поля. Электромагнитные механизмы являются относительно дальнодействующими и характеризуются расстояниями, значительно превышающими атомные размеры, а также не зависят от природы специфического взаимодействия молекул с металлом и адсорбционных свойств поверхности. При этом спектры ГКР не отличаются от спектров КР молекул в свободном состоянии.

"Молекулярные" теории основаны на том факте, что если в случае изолированной молекулы КР является следствием модуляции колебаниями молекулы лишь ее электронной, поляризуемости, то при адсорбции необходимо рассматривать поляризуемость системы молекула-металл. В этом случае существует возможность появления новых возбужденных состояний, обусловленных переносом заряда, а также локального изменения плотности электронного заряда вблизи поверхности, возникающего вследствие образования химической связи, либо туннелирования электронов металла к месту расположения молекулы. Молекулярные механизмы являются короткодействующими и проявляются, когда расстояние между молекулой и металлом становится порядка атомных размеров. При этом химическая природа молекул и адсорбционные свойства поверхности становятся определяющими для возникновения усиления КР, а наблюдаемые спектры ГКР могут существенно отличаться от соответствующих спектров КР неадсорбированных молекул.

Рассмотрим оптические свойства комплекса биомолекула-металл на примере одной из экспериментальных систем, использованных и модифицированных в настоящей работе для получения спектров ГКР

- Ь -

биомолекул - гидрозолей серебра. Гидрозоли серебра имеют единственную полосу в сЬектре эксгинкции, максимум которой лежит вблизи 395 нм (рис.1, кривая 1). Эта полоса определяет поглощение света в кристаллике серебра с характерным размером 15 нм и связана с возбуждением плазменных колебаний в ограниченном электронном газе. Частота со моды Ь этих колебаний зависит от диэлектрических проницаемосгей. ионного остова сферы ем и окружающей среды е^, а также от радиуса частицы а следующим образом:

ю2 „ ш2_1_ [е^-е^^]"1 м^а/д (12),

где М^(аДо) - фактор, зависящий от размера частицы, г0 — радиус экранировки Томаса-Ферми, а а>0 «=■ 4япе^/т -. плазменная частота объема металла. Для частицы диаметром 15 нм (характерный размер используемого нами гидрозоля серебра), а >> г и М^(а/г0) ~ 1. Тогда, при соответствующих значениях параметров для серебра (еш=4,9) и для воды (6^=1,77), получаем шо«=1^3*10 6 Гц (А.=141,6 нм),ш1=4173*1015 Гц (Х1=398 нм),0)2=4,84 • 1015 Гц (^-389 нм). Таким образом, для первой и второй мод плазменных колебаний расчетная частота совпадает с частотой наблюдаемой полосы в спектре эксгинкции гидрозоля серебра. После добавления к

гидрозолям серебра молекул ароматических аминокислот в спектре экстинхции возникает дополнительная длинноволновая полоса (рис.1, кривая 3). Из данных электронной микросколии (рис.2) следует, что в этом случае происходит образование агрегатов с характерным размером 150 - 200 нм. При добавлении к гидрозолям серебра неароматических молекул в спектре эксгинкции длинноволнового дополнительного максимума не наблюдается (рис.1), а происходит лишь несимметричное уширение в длинноволновую область полосы, связанной с собственными плазменными колебаниями отдельной изолированной частицы (390 нм).

Связь спектра экстинхции гидрозолей с агрегацией позволяет предположить, что возникновение длинноволновой полосы обусловлено рассеянием Ми на агрегатах. При этом отличия в спектрах эксгинкции ароматических и неароматических молекул в гидрозолях

300

ш

Рис.1 Спектры поглощения гидрозоля серебра (1), гидрозоля, агрегированного добавлением КаС1 (2) или « алифатической амино-0 кислотой глицином (4), а также комплекса гидрозоля с РЬе (3). Справа - спектры возбуждения ГКР комплекса золь-РЬе для различных полос колебаний. Концентрация, РЬе в золе - 10 ° М. 9 Справа по оси ординат О указан нормированный коэффициент усиления КР (Ь).

500

600

700 Д.1

Рис.2 Электронно - микроскопические фотографии гидрозоля серебра (А) и комплекса золь-фенилаланин (Б).

Масштаб - 1000 А.

могут быть объяснены различием в размерах и форме образующихся агрегатов. В общем случае спектр экстинкцин определяется эффектами поглощения я рассеяния. В чистых гидрозолю, когда размер частиц мал, вклад в экстшпсцню определяется главным образам поглощением, сечение которого записывается в виде:

°погл."

взЛ3 г е-1 ч

-Г^Ы1

где е — в| + 1&2 ~ диэлектрическая проницаемость металла на оптической частоте по отношению к окружающей среде. Это сечение достигает максимума при е^—2, что для серебра к выполняется на длине волны Я*°385 ли. В агрегированных гидрозолях размер частиц значительно больше, следовательно, растет вклад упругого рассеяния, сечение которого а рэлеевском режиме имеет вид:

128 а6 | с _ < i2

°расс."

Видно, что при длине волны, дня которой е^—2, сечение рассеяния, подобно поглощению, имеет максимум к быстро растет с увеличением размеров агрегатов.

Мы изучили гидрозоля серебра, агрегированные добавлением ароматических и неароматкческкх аминокислоту с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что несмспря на существенные отличия в спектрах экстинкцин, распределение агрегатов по размерам практически одинаково, а сами агрегаты в обоих случаях имеют неправильную форму. Это дает основание предположить, что док возникновения длинноволновой полосы в спектре эксшшцш определяющей является химическая природа молекул.

Мы обнаружили связь механизмов усиления гигантского и резонансного комбинационного рассеяния на примере биомолекул различных классов, адсорбированных на гидрозолях серебра, измерив относительные интенсивности стоксовой (1<^) и антистоксовой Оа55{) компонент полос в спектре ГКР. Так, для нерезонансного (спонтанного) комбинационного рассеяния:

РКР

V — со «с.

V + со •ехс. •

.Ьт/кТ

тогда как для случая резонансного КР:

.5»

РКР

V — юг

ехс. I

.Ъо/кТ

V + (01

'•ехс. }

(*ехс Г + ю)2 + Г2 (\хс.- ^ - о>)2 + г2

(1.6)

где Уиа - частота возбуждающего света, со - частота

рассматриваемого колебания, - частота электронного перехода, ответственного за резонансный эффект КР и Г — полуширина полосы Уе. Отношение 2£ уравнений (1.6)я (¿5)

К -

~ °»2 + г2

(1.7>

зависит от чехс- Таким образом, измеряя отношения ¡<^/1^ для двух или более в случае спонтанного и резонансного КР,

можно получить параметры ответственного за РКР электронного перехода и сравнить их с параметрами экспериментально наблюдаемой дополнительной полосы поглощения. Расчитанные параметры Хмакс 520 нм и Г-70 им очень хорошо (с точностью до 5%) соответствуют экспериментальным данным, что

свидетельствует о резонансной природе механизма усиления спектров КР биомолекул при адсорбции.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ

Мы использовали и усовершенствовали три типа экспериментальных систем, в которых наблюдается ПСР:

1. электроды, поверхность которых становится ГКР-активноЙ

после проведения специфического окислительно—восстановительного цикла (ОВЦ) в электрохимической ячейке;

2. системы малых по сравнению с длиной волны падающего света изолированных металлических частиц в коллоидах и

3. ГКР-активные металлические поверхности с контролируемыми однородными и регулярными по размеру "шероховатостями".

Схема используемой установки для регистрации ГКР приведена на рисЗ. Для возбуждения использовали лазерные линии в видимом диапазоне. Выбор экспериментальной системы для регистрации спектров позволяет реализовать либо дальнодействующую либо короткодействующую компоненты механизма, либо наблюдать их суперпозицию.

Для получения спектров ГКР биомолекул, адсорбированных на серебряных электродах, мы разработали несколько типов электрохимических ячеек, позволяющих получать спектры от "50 мкл растворов. Систему из трех электродов, рабочего и сравнения (серебряные) и вспомогательного (платиновый) включали в схему — потенциостатирования. После проведения обработки поверхности рабочего электрода посредством окислительно—восстановительного цикла (ОВЦ) наблюдалось усиление спектра КР биомолекул, введенных в рабочий объем иоветы после окончания процесса обработки. Параметры ОВЦ подбирали с целью уменьшения воздействия на конформацию изучаемых соединений. Важным достоинством предложенной системы является конструктивное разделение рабочего и вспомогательного электродов, что исключает денатурацию макромолекул за счет больших токов на вспомогательном электроде в процессе ОВЦ. Использованная система позволяет получать увеличение сечения КР биомолекул на 5-7 порядков величины при сохранении их конформации. Некоторым недостатком этой системы является сложность предварительной обработки электродов.

Другая экспериментальная система, использованная в настоящей работе для получения спектров ГКР биомолекул представляет собой гидрозоль серебра, получаемый восстановлением нитрата серебра борогидридом или цитратом натрия (Рис.2). Эта система весьма проста в приготовлении и отличается высокой стабильностью. Добавление в гидрозоль биомолекул вызывает частичную коагуляцию

/Л

1 (п«итрогра<р

ло^рожешв

II |

Ь—(|—

шшшщ

<ч

Г

Рис3 Схема экспериментальной установ- Рис.4 Один из типов разра-ки, использованной в настоящей работе ботанных нами ГКР—активных для получения спектров КР, ПСР и РКР поверхностей на основе биомолекул. ядерных фильтров.

гидрозоля и возникновение высокоинтенсивных спектров ГКР. Именно такая методика приготовления гидрозоля обеспечивает рекордные чувствительности метода спектроскопии ГКР - позволяет детектировать спектры от пикограммовых количеств биомолекул.

Нами была предложена методика "активации" гидрозоля серебра хлоридом натрия и показано, что образование комплекса молекула-адатом-противоион является весьма специфичным к химической природе изучаемого соединения (см. главу 3).

Твердые ГКР-активные поверхности являются новым шагом в применении спектроскопии ГКР. Из общих соображений, поверхность серебра, на которой будут сформированы регулярные по форме, а в идеальном случае и по расположению неоднородности субмикронного размера должны быть ГКР-активны при преимущественной реализации электромагнитного механизма усиления. Нами разработана технология приготовления нескольких типов ГКР-активных поверхностей на основе ядерных фильтров с последующим термическим напылением серебра и оптимизированы параметры получаемых неоднородностей для получения максимальных коэффициентов усиления (рис.4). Такие поверхности обеспечивают усиление сечения КР на 5-7 • порядков, являются воспроизводимыми и достаточно стабильными во времени.

ГЛАВА 3. СПЕКТРОСКОПИЯ ГИГАНТСКОГО И ГИГАНТСКОГО РЕЗОНАНСНОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ БИОМОЛЕКУЛ. ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА.

АМИНОКИСЛОТЫ И ВОДОРАСТВОРИМЫЕ БЕЛКИ.

При""адсорбции"молекул"на" поверхности металла возможно изменение правил отбора для колебательных переходов, активных в комбинационном рассеянии. В результате спектры ГКР адсорбированных молекул могут сильно отличаться от спектров КР водных растворов тех же соединения. Отсюда следует, что для отнесения полос в спехтрах ГКР белков и полипептидов необходимо провести их сравнение именно со спектрами ГКР аминокислот и модельных соединений, а также выяснить особенности молекулярных механизмов их взаимодействия с заряженной поверхностью металла, что и было проделано в настоящей работе.

Ароматические аминокислоты отличаются от кеароматических наличием развитой л-электронной системы. При адсорбции молекулы на поверхности образуется комплекс с переносом заряда между я-электронной системой и металлом. В результате появляется новый электронный переход, поглощающий свет в видимой области спектра (рис.1, глава I). Параметры этого перехода и соответствующей полосы поглощения определяются сродством электронных систем молекулы и металла и, следовательно, зависят от типа молекулы и геометрии ее адсорбции на поверхности. В случае неароматических аминокислот все отличия в спектрах поглощения комплексов в видимой области обусловлены рассеянием Ми на агрегатах с характерным размером 150 —200 нм.

Если из анализа спектров экстинкции можно лишь с помощью косвенных данных прийти к выводу о существовании комплекса, поглощающего свет в видимой области спектра, то появление оптической активности, индуцированной адсорбцией ароматических аминокислот на гидрозоле серебра, определенно указывает на образование нового электронного перехода. На рис.5 представлены спектры кругового дихроизма (КД) комплексов гидрозоля серебра с молекулами 1- и d-фенилалашша. Сходные спектры были получены и для других хиральных аминокислот в гидрозолях. Чистые гидрозоли и

гидрозоли, агрегированные добавлением соли, либо ахиральной аминокислоты глицина, в спектре КД полос не обнаруживают.

Индуцирование адсорбцией оптической активности ароматических аминокислот указывает на образование комплекса с металлом посредством я-элекгронной системы кольца. Такой комплекс обладает оптической активностью, которая не зависит от собственной оптической' активности молекулы. Это проявляется в спектре КД в виде длинноволновой полосы, знак которой зависит от хиральности молекулы. Помимо этого, при адсорбции происходит поляризация электронного газа металла и возникает электростатическое изображение адсорбированной молекулы. Поскольку молекула обладает оптической активностью, то ее изображение будет также оптически активно, причем, вследствие зеркальной симметрии, с противоположным знаком. Происходит своеобразная модуляция электронной плотности металла и возникновение на частоте

плазменного резонанса частицы (395 нм) полосы в спектре КД. Эта полоса должна иметь знак, противоположный знаку собственной оптической активности молекулы, что и наблюдается в эксперименте (рис.5).

Эффект индуцированной адсорбцией оптической активности комплексов гидрозолей серебра с ароматическими аминокислотами позволяет сделать вывод о наличии полосы электронного перехода, определяющего поглощение света в видимой области спектра. Кроме того, факт усиления оптической активности при адсорбции на металле может послужить основой для разработки нового высокочувствительного метода поляризационной спектроскопии.

Сигнал ГКР неароматических аминокслот проявляется только после агрегации гидрозоля серебра, причем при концентрациях более чем в 103 раз меньших минимально необходимых для получения спектров КР этих соединений в растворе. При анализе приведенных спектров обращают на себя внимание следующие особенности:

1) сильные отличия спектров ГКР от соответствующих спектров КР водных растворов, что проявляется в избирательном усилении рассеяния на отдельных группах, в появлении новых полос и указывает на изменение правил отбора КР;

2) характерное сходство спектров ГКР алифатических аминокислот друг с другом;

3) появление характерных низкочастотных полос в области 200-250 см-1, отсутствующих в спектрах КР водных растворов и отвечающих колебанию связи молекула-металл. Анализ этих полос, соответствующих колебанию молекулы как целого, позволяет проследить различия в механизме взаимодействия аминокислот различных классов с поверхностью металла. Из рис.6 видно, что одну из ipynn образуют Gly, Ala, Val, Cys, Leu, взаимодействующие

с металлом только посредством карбоксильной группы; для аспарапша и глутамина появляется дополнительное взаимодействие через неподеленные электронные пары кислорода карбонила; появление дополнительной карбоксильной группы выделет в отдельный класс Asp и Glu, ну а возможность образовывать я-электронные комплексы с металлом отличает ароматические аминокислоты, причем Тгр выделяется возможностью дополнительного взаимодействия через гетероатом азота кольца. Интересно, что в спектрах ГКР

Ам

240

230

220

61»

I,

Ак

К

4А ч

я»

КО

с*к

;СГ

:6г

40

СО

РЬе1

Тгр!

V

I

Рис.6 Зависимость частот колебаний молекула-металл от при___ веденной мас-

«50 М аде. сы адсорбиро-"ванных аминокислот. На вставке — для сравнения -аналогичная зависимость для некоторых ионов.

ВО

<20

«0 200 Мале.

преимущественное усиление наблюдается только для указанных групп, непосредственно взаимодействующих с поверхностью металла. В целом спектры РЬе, Тут и Тгр интенсивнее спектров алифатических аминокислот.

Анализ спектров ГКР аминокислот позволяет сделать следующие заключения«

1) В гидрозолях серебра наблюдается увеличение сечения КР на уровне 5'1(Г (рис.1), причем величина усиления зависит от длины волны возбуждения и химической природы изучаемых молекул;

2) Высокая величина усиления КР обусловлена несколькими механизмами, которые проявляются одновременно: электромагнитным — связанным с увеличением интенсивности локального электромагнитного поля вблизи поверхности металла за счет возбуждения плазменных резонансов в малых изолированных металлических частицах - и локальными - связанными с непосредственным взаимодействием молекулы с металлом;

\

3) Спектры ГКР аминокислот в гидрозолях серебра отражают особенности локальных мёханизмов усиления КР, которые проявляются в избирательном усилении некоторых колебательных мод и появлении новых полос в спектрах. Во всех системах, в которых усиление КР обеспечено суперпозицией механизмов, спектры ГКР отражают особенности именно локальных, а не дальнодействующкх механизмов. Это очевидно, поскольку для всех молекул, КР которых усиливается за счет локальных механизмов, будет наблюдаться усиление и за счет далькодействующих механизмов, в то время как усиление за счет дальнодействующей компоненты далеко не всегда сопровождается непосредственным взаимодействием молекулы с металлом и, как следствие, проявлением локального усиления;

4) Для алифатических аминокислот взаимодействие с металлом реализуется преимущественно через карбоксильные и, в меньшей степени, карбонильные . группы. Усиление КР для ароматических аминокислот превышает усиление для алифатических. При этом ароматические аминокислоты адсорбируются как через карбоксильные и карбонильные группы, так и через ароматические боковые радикалы и гетероатомы колец.

В спектрах ГКР аминокислот, адсорбированных на серебряных электродах, проявляются те же особенности, что в в спектрах этих соединений, адсорбированных на гидрозолях серебра. В то же время, использование электрохимической ячейки обеспечивает дополнительные возможности изучения динамики поведения биомолекул на границе раздела фаз при различных потенциалах.

К настоящему времени мы получили и охарактеризовали спектры ГКР ряда водорастворимых белков, адсорбированных на серебряных электродах — лейцинизолейцинвалинсвязывающего и лейцинспецифичного белков периплазматического пространства Ecoli, бычьего сывороточного альбумина, лизоцима и некоторых других (рис.7). Спектры получены при концентрациях в "V? раз меньших минимально необходимых для получения нормальных спектров КР водных растворов этих соединений.

Сравнение этих спектров со спектрами аминокислот, адсорбированных на серебряных электродах, позволило сделать отнесения для большинства характеристичных полос. Наиболее интенсивные полосы соответствуют колебаниям боковых цепей

1800 uoo nao uto iodo too toa too i), ы" Рис.7 Спектры ГКР лизоцима и бычьего сывороточного альбумина, адсорбированных на серебряных, электродах при потенциале нулевого заряда серебра и концентрации 10 М.

ароматических аминокислотных остатков, обращает на себя внимание отсутствие в спектре ГКР лизоцима характеристичной полосы колебаний остатка фенилаланина с максимумов; ~ 1000 см-*. По-видимому, геометрия адсорбции молекулы лизоцима на поверхности электрода такова, что остатки фенилаланина не вступают в непосредственный контакт с металлом и, соответственно, их сигналы КР не претерпевают усиления. Это согласуется с данными рентгеноструктурного анализа высокого разрешения, согласно которым все три остатка фенилаланина находятся внутри белковой глобулы. В спектре ГКР лизоцима не видно также полосы, соответствующей колебаниям дисульфидной связи, которая в нормальном спектре КР в растворе отчетливо проявляется при 509 см-1. Все эти данные позволяют утверждать о короткодействии механизма усиления КР в данной экспериментальной системе.

Обычный спектр КР бычьего сывороточного альбумина, белка с молекулярной массой 64000, содержащего 26 остатков Phe, 19 Туг, 2 Тгр и 16 дисульфидных moctkkobjiслучают при концентрации не менее

20 мг/мл и мощности лазерного излучения 250 мВт. Приведенный спектр ГКР получен при концентрации 0,005 мг/мл и мощности 50 мВт. В отличие от лизоцима в спектре отчетливо проявляются полосы колебаний фенилаланина и дисульфидных связей, часть из которых расположена на поверхности белковой глобулы. ,

Особой информативностью в спонтанной спектроскопии KP отличаются полосы колебаний Амид I (1640—1680 см-*) и Амид III (1230-1300 см-*). Однако обнаружить эти полосы в спектрах ГКР белков, адсорбированных на серебряных электродах, оказалось невозможным. По-видимому, при адсорбции белков на серебряных электродах колебания пептидных групп не претерпевают усиления либо за счет слабого сродства к металлу, либо за счет экранирующего действия боковых цепей ароматических и алифатических аминокислотных остатков.

Таким образом, анализ спектров ГКР водорастворимых белков, адсорбированных на серебряных электродах, позволяет изучать расположение и ориентацию групп атомов, находящихся на поверхности белка и, таким образом, получать информацию о топографии макромолекулы.

МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ.

Изучений механизмов рецепции, преобразования и передачи солнечной энергии в биологических системах является одной из важнейших задач современной молекулярной биофизики. Примером биосисгемы, преобразующей энергию поглощенных квантов оптического излучения в химическую энергию, служит бактериородопсин -светочувствительный интегральный мембранный белок галоф ильных микроорганизмов Halobactmum halobium, которые в анаэробных условиях могут использовать солнечный свет в качестве источника энергии для синтеза АТФ, транспорта ионов и аминокислот через мембрану, а также для движения клетки (рис.8а). После поглощения кванта света хромофором молекулы пигмента претерпевают циклические светозависимые конформацианные переходы, результатом которых является трансмембранный перенос протонов по граднекту pH.

Актуальность изучения бактериородопсина вызывается также его структурным сходством со зрительным родопсином — ключевым белком

процесса зрения. Этот пигмент представляет собой интегральный мембранный белок, соединенный посредством альдимшшой связи с остатком 11-цис ретиналя (рис.8б). Однако функция зрительного родопсина принципиально другая. Обеспечивая первичный этап зрительного возбуждения — поглощение кванта света - родопсин претерпевает необратимые конформационные изменения на цитоплаэматической стороне мембраны фоторецепторного диска, запуская таким образом ферментативный каскад передачи зрительного импульса.

Поскольку механизм усиления КР при адсорбции биомолекул на "рыхлых" серебряных электродах и гидрозолях серебра имеет весьма короткодействующий характер, логично ожидать, что метод ГКР позволит получить принципиально важную информацию о расположении и ориентации хромофоров бактериального и зрительного родопсинов относительно поверхностей пурпурных мембран и мембран фоторецепторных дисков.

После добавления к гидрозолям серебра пурпурных мембран, либо фоторецепторных дисков спектр поглощения золя практически не меняется. Как следует из данных электронной микроскопии, в отличие от адсорбции аминокислот и дипептидов, в этом случае образование комплекса происходит без агрегации мицелл серебра. Спектры РКР и ГРКР пурпурных мембран, адсорбированных на гидрозолях серебра, мало отличаются друг от друга. Оказалось, что при взаимодействии я-электронной системы с металлом для возникновения эффекта ГКР достаточно, чтобы хотя бы часть я— электронного облака адсорбированной молекулы находилась в пределах двойного электрического слоя поверхности металла. Мы продемонстрировали короткодействие механизма усиления КР при адсорбции биомолекул на гидрозолях серебра при сравнительном анализе спектров ГКР нативного бактериородопсина и его аналогов — хромопротеинов, реконструированных из апомембран Halobacterium halobium и "ароматических" аналогов ретиналя с различной длиной полиеновой цепи (рис.9). В хромопротеинах аналоги ретиналя связаны с белком в виде протонированных альдиминов, занимая то же положение и имея ту же ориентацию, что и ретина.чь в нативном пигменте. Оказалось, что для аналогов, содержащих три и четыре двойные связи в полиеновой цепи, регистрируется мощный сигнал

1-Й

Рис.8 Схемы структурной организации бактериального (а) и зрительного (б) родопсинов в пурпурных мембранах НаЬЬас1епит каЬЫит и мембранах фоторецепторных дисков, соответственно. Указаны расстояния от альдимина ретиналя до поверхности мембраны, определенные по данным спектроскопии ГКР нативных и реконструированных пигментов. Стрелками обозначены хромофоры — остатки ретиналя.

МеО

МеО

МеО

МеО

Рис.9 Структурные формулы "ароматических" аналогов ретиналя, использованных для определения расстояния между альдимином ретиналя и поверхностью пурпурной мембраны НаЬоааепит каюЫит с помощью спектроскопии ГКР.

Е

ГКР, в то время как для более коротких аналогов сигнал ГКР практически полностью исчезает. Очевидно, что при переходе от аналога с тремя к аналогу с двумя двойными связями в полиеновой цепи, я-электронная система такого укороченного аналога ретиналя перестает попадать в двойной электрический слой вблизи поверхности металла, что и приводит к исчезновению сигнала ГКР. Зная угол, образуемый дипольным моментом ретиналя с плоскостью мембраны и длину остатка ретиналя и его аналогов, легко определить расстояние от поверхности мембраны до альдимина ретиналя - места соединения хромофора с молекулой белка. Для бактериородопсина оказалось, что альдимин ретиналя находится на расстоянии 0,6-0,9 нм от поверхности пурпурной мембраны (рис.8а).

В экспериментах с пурпурными мембранами оставался открытым вопрос о том с какой именно стороной мембраны, цитоплазматической или наружной, сближен остаток ретиналя. Частично ответ на этот вопрос дал эксперимент с тенями клеток На1оЬас1епит НаЬЫит, замкнутыми цитоплазматической стороной внутрь. Оказалось, что в этом случае, хак и при адсорбции пурпурных мембран на неагрегированном гидрозоле, наблюдаются интенсивные спектры ГКР связанного с белком хромофора. Это позволило предположить, что ретиналь в бактериородопсине сближен именно с наружной стороной пурпурной мембраны. Однако окончательный ответ на этот вопрос дали эксперименты по анализу спектров ГКР пурпурных мембран, адсорбированных на серебряных электродах, обработанных посредством ОВЦ.

Пурпурные мембраны адсорбируются на положительно заряженном серебряном электроде цитоплазматической стороной к металлу. В наблюдаемом спектре ГКР полностью отсутствуют полосы колебания хромофора, хотя отчетливо проявляются характеристичные полосы колебаний боковых цепей ароматических аминокислотных остатков, входящих в состав пигмента (рис.10). В то же время, в спектре ГКР теней клеток НсЛоЬааепит ШоЫит, адсорбированных на приготовленных таким образом электродах, проявляются как полосы ароматических остатков, так и ретиналя. Эти эксперименты позволили сделать вывод о том, что хромофор бактериородопсина сближен именно с наружной стороной пурпурной мембраны.

Убедительные данные в пользу короткодействия механизма

Рис.10 а-Спект-

) ры РКР водной ^ »««ч»? "/ суспензии пур-

пурных мембран (1) и спектры ГКР пурпурных мембран, адсорбированных на серебряных электродах (2), и адсорбированных теней клеток На1оЬас1епит каЬЫит (3). б — Пурпурная мембрана (1), адсорбированные пурпурная мембрана (2) и тень клетки НаЬЪас-¡епит ИЫоЫшп замкнутая цито— плазматической стороной внутрь (3).

усиления КР при адсорбции мембранно-связанных белков на -гидрозолях серебра были получены также при анализе спектров ГКР фоторецепторных дисков, вывернутых фоторецепторных дисков и комплексов диски-моноклональные антитела. На рис.11 приведены спектры ГКР нативных фоторецепторных дисков, дисков, обработанных ферментом термолизином (что приводит к отщеплению С-концевой части молекулы родопсина) и вывернутых дисков, адсорбированных на гидрозоле серебра. Очевидно, что после обработки дисков термолизином интегральная интенсивность ОС валентных колебаний псшиеновой цепи ретин а ля возрастает в 3-5 раз. Поскольку после такой обработки молекула родопсина сохраняет свои функциональные свойства и конформация белка как целого не меняется, обнаруженный эффект объясняется устранением чисто стераческих препятствий для сближения частиц серебра с поверхностью мембраны и л-электронной системой ретиналя. После дополнительной обработки расщепленных дисков, приводящей к их выворачиванию внутренней стороной наружу, и, таким образом, к удалению л-электронной системы ретиналя от

CD Ю ю

w

(600

'V з

1500 Д см"'

I70D 1600 1500 дО см"'

Рис.11 Спектры ГКР в области Рис.12 Спектры ГКР в области 0=С ва-С=С валентных колебаний лектных колебаний фоторецепторных дис-фоторецептор1ШХ дисков (1), ков (1) и комплексов с моноклональны-дисков, обработанных фермен- ми антителами к С—концу молекулы родо-том термолизином (2) и псина при отношениях родопсин/антитело

вывернутых дисков (3). 5/1 (2) и 1/1 (3).

поверхности металла на расстояние более 4 нм, спектр ГКР родопсина практически полностью исчезает. й

Из анализа спектров ГКР родопсина и его комплексов с моноклональными антителами на С-концевую область молекулы следует, что экранирующее действие антител приводит к исчезновению сигнала ГКР хромофора при увеличении молярного соотношения родопсин/антитело (рис.12).

Эта результаты исследования родопсина с помощью спектроскопии ГКР позволили также, хак и для бактериородопсина, определить расстояние от альдимина ретиналя до цитоплазматической поверхности мембраны фоторецепторного диска. Оказалось, что расстояние составляет 0,5—1,0 нм (рис.8б).

Как уже отмечалось, под действием света в бактериородопсине происходит цикл конформационных перестроек (фотоцикл), при

котором молекула последовательно проходит через рад интермедиатов, отличающихся друг от друга структурой хромофора и его ближайшего белкового окружения и, соответственно, спектрами поглощения и РКР. При возбуждении пигмента преимущественно наблюдается спектр РКР, характерный для той формы, максимум поглощения которой наиболее близок к длине волны возбуждения. Отличия в спектрах РКР. суспензии пурпурных мембран при ^ =476,5 им и 514,5 нм (рис.13) как раз и связаны с тем, что при возбуждении с более короткой длиной волны в спектре РКР появляется полоса 1570 см-* колебания С=С ретиналя, характерная для интермедиата бактериородопсина с максимумом поглощения 412 нм (М412), в то время как при =514,5 нм наблюдается только

полоса 1530 см-*, соответствующая основной форме бактериородопсина с максимумом поглощения 570 нм (БР570). Иными словами, зависимость спектра РКР от для бактериородопсина

является результатом фотоцикла этого пигмента.

В спектрах ГРКР адсорбированных пурпурных мембран, полученных при возбуждении светом с длиной волны 514,5 и 476,5 нм, никаких отличий, связанных с фотоциклом, не наблюдается (рис.13). Очевидно, бактериородопсин в адсорбированном состоянии сохраняет свою конформацию, характерную для основной формы БР570, т.е. происходит фиксация фотоцикла пигмента. Было проведено также сравнение спектров ГКР бактериородопсина при добавлении пурпурных мембран к гидрозолю в процессе сильного освещения и без такового. При этом предполагалось, что при сильном освещении в суспензии пурпурных мембран увеличивается относительное содержание других (кроме основной) форм фотоцикла и, если такие мембраны добавить к гидрозолю, то должна произойти фиксация фотоцикла не только на основной, но и на промежуточных формах пигмента. Оказалось, что в спектре ГКР засвеченного бактериородопсина помимо полосы, характерной для основной формы БР570, появляется также полоса С=С валентных колебаний ретиналя интермедиата М412 (1570 см-1). Таким образом, при добавлении пурпурных мембран к неагрегированным гидрозолям серебра происходит остановка светоиндуцированных информационных перестроек ретиналя и его ближайшего белкового окружения, причем на любой стадии фотоцикла.

Аналогичная ситуация наблюдается и для зрительного

о

г

суспензия

пурпурных

мембран

суспензия пургурных мем5ран

пурпурные мем5роны 6 гиврозоле

пурпурные мембраны 8 гиЗразолв

Зирференциолылш спектр

Рис. 13 Спектры РКР водной суспензии пурпурных мембран и ГКР пурпурных мембран, адсорбированных на неагрегированных гидрозолях серебра

родопсина. Этот белок также претерпевает под действием света серию конформационных изменений, но эти изменения не носят, как в случае бактериального родопсина, циклического характера, а приводят к необратимому гидролизу хромофора. Спектрально это проявляется в том, что спектр РКР необратимо исчезает в течение ы 5 мин после начала освещения водной суспензии фоторецепторных

ОБЛАСТЬ Т)ТПЕЧДШ)8" тЛЬЦЕБ*

V

1 450

ISOC 1500

900 4i.CN-'

•--»••»

•f

\

\.6

7 '

\»в

\

\

1ЯС Ч;,С-С»

Рис.14 а — Спектры ГКР фоторецепторных дисков (1) и апомембран (2) в гидрозолях серебра, б — Зависимость максимумов полос поглощения пигментов и модельных альдиминов ретиналя (1-11) от частоты валентных колебаний С-С в спектрах РКР; * — для спектра ГКР родопсина, добавленного в темноте к гидрозолю серебра.

дисков лазерным излучением с длиной волны 514,5 нм (максимум поглощения нативного пигмента 500 нм). После адсорбции нативных дисков на гидрозоле серебра в темноте процесса фотолиза родопсина не происходит и наблюдается стабильный спектр ГРКР в течение сколь угодно большого времени освещения (рис.14). Отметим, что максимум поглощения пигмента не меняется при адсорбции (рис.146), что свидетельствует о сохранении микроокружения хромофора. Фиксация фогоцихла бактериородопсина и фотолиза родопсина является характерным примером влияния поверхности металла на функциональные свойства биомолекул.

Механизм усиления КР при адсорбции биомембран на агрегированных до характерных размеров ~ 100 нм гидрозолях в основном определяется электромагнитными факторами. При сравнения спектров ГРКР со спектрами РКР пр-- различных длинах волн возбуждения оказалось, что в частично агрегированных гидрозолях ба ктери ородоп син сохраняет свой фотоцикл, причем механизм усиления имеет дальнодействукнций характер. Аналогичные результаты получены для пурпурных мембран, адсорбированных на "гладких" (не обработанных посредством ОВЦ) серебряных электродах в

электрохимической ячейке (рис.15). В этом случае в спектре ГРКР наблюдаются сигналы хромофора как для нативных пурпурных мембран, так и для хромоггротеинов, содержащих сильно укороченные аналоги ретиналя - аналоги с одной и двумя двойными связями в полиеновой цепи. Спектр ПСР на "гладком" электроде абсолютно не отличается от спектра РКР водной суспензии пурпурных мембран и механизм усиления (далькодействующий) определяется только электромагнитной компонентой.

Варьирование потенциала на "гладком" электроде приводит к заметным обратимым изменениям спектра ГРКР пурпурных мембран. Как при увеличении, так и при уменьшении электродного потенциала относительно точки нулевого заряда серебра (-0,65 В) происходит увеличение относительной интегральной интенсивности полос валентного колебания С-С в ретинале с максимумом 1505 см-* при соответствующем уменьшении вклада полосы 1528 см-*. Эти полосы являются характеристичными для интермедиата фотоцикла с максимумом 610 нм (К610) и основной формы пигмента (БР570), соответственно (Рис. 15). Сходные эффекты, связанные с воздействием внешнего электрического поля на фотоцикл бакгериородопсина, наблюдаются при изучении сухих пленок пурпурных мембран, помещенных в электрическое поле напряженностью до 10** В/см. Тот факт, что накопление интермедиата К610 происходит при потенциалах как меньших, так н больших потенциала нулевого заряда серебра, указывает на наличие динамического 0 равновесия между мембранами, адсорбированными на поверхности электрода и находящимися в растворе. В этом случае при переходе через потенциал нулевого заряда серебра происходит переориентация пурпурных мембран за счет сильно отличающихся плотностей заряда на различных сторонах мембраны.

Таким образом, эксперименты по ГРКР мембранно-связанных белков, адсорбированных на агрегированных гидрозолях серебра и "гладких" серебряных электродах, позволяют продемонстрировать возможность селективной (реализации дальнодействующей, электромагнитной компоненты ГКР в весьма простых экспериментальных системах. Изучение биомолекул в таких системах позволяет получать информацию, ничем не отличающуюся от данных традиционной спектроскопии РКР, однако при существенно меньших

0.5

од

1600 WOO 1200 I ОГО лч)см" 0.0 ОД OA 0.6 0.8 I.D 1.2 f, 6

Рис.15 а - Спектры РКР суспензии пурпурных мембран и ГКР пурпурных мембран, адсорбированных на гладком" серебряном электроде при потенциале нулевого заряда серебра; в нижнем спектре чувствительность увеличена в 25 раза, б - зависимость относительных_^нтегральных интенсивностей полос с максимумами 1505 и 1528 см в спектрах ГКР пурпурных мембран на "гладком" электроде от электродного потенциала.

концентрациях исследуемых соединений.

Спектроскопия ГКР а РКР являются взаимодополняющими подходами при структурно-функциональном изучении мембранных белков. Спектроскопия РКР позволяет получить информацию о микроокружении хромофоров при возбуждении спектров в области их электронных переходов. Мы использовали спектроскопию РКР для выяснения михроокружения альдимина репиаля в бактериородопсине, с целью локализации пространственно сближенных с ним аминокислотных остатков.

Сравнение кинетических спектров РКР нативного и биоскнтетически модифицированного бактериородопсина показало, что остаток тирозина катализирует светоиндуцированное

депротонирование альдимина ретиналя при временах ^10 мхе после поглощения квантов света. Мы провели химическую модификацию бактериородопсина тетрашпрометаном и проанализировали распределение включенной метки в бромциановых пептидах

хромопротенда. Оказалось, что именно преимущественно

10С

модифицируемый остаток Туг катализирует светоиндуцированное депротонирование альдимина ретиналя, причем этот остаток связан водородной связью с карбоксильной группой аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Как видно из рис.16, нитрование именно остатка Туг , приводящее к смещению рК депротонирования, Туг к величине 7,2 приводит к смещению рК депротонирования альдимина ретиналя к той же величине. Из даннгея спектроскопии РКР, ГКР и квантовохимическкх расчетов по методу СМХ)/5-С1 предложена модель распределения зарядов в хромофорном центре бактериородопсина (рис.17). Модель включает остаток тирозина, сближенный с альдимиком п образующий водородную связь с карбоксильной группой, атомы кислорода которой расположены над протонированным альдимином на расстоянии 2,5-3,0 Я от плоскости остатка репшаля. Эта карбоксильная группа выступает в качестве противоиона по отношению к протонированному альдим1шу. Батохромный сдвиг максимума полосы поглощения бактериородопсина относительно протоиированного альдимина ретиналя в растворе определяется величиной эффективного

заряда на атомах гидроксильной группы

Рис.16 рН-зависимости депротонирования альдимина ретиналя биосянтетнческого бактериородопсина, содержащего остатки ¿ггортирозина (1), фтортриптофана (2), нативного бактериородопсина (3), модифицированного по методике Остерхельта (4) и модифицированного по остатку Туг (5) бактериородопсююв.

Рис.17 Модель зарядового микроокружения альдимина Ретаналя бактериородопсина по данным спектроскопии УНУ, 1 л-г и квантовохимических расчетов.

остатка тирозина, расположенного на расстоянии 2,0-3,0 А от атома кислорода карбоксильной группы тирозина. Модель отлично предсказывает спектральные свойства интермедиатов фотоцикла бактериородопсина а описывает наблюдаемые эффекты депротонирования остатка тирозина и протонирования карбоксильной группы в процессе фотоцикла, а также катализирование тирозином депротонироваииа альдимина ретиналя.

Если в случае фоточувствительных мембранных белков преимущественное усиление в спектрах ПСР, как и в случае РКР претерпевают полосы хромофоров, поглощающих свет в видимой области (исключение составляет система электродов обработанных посредством ОВЦ в электрохимической ячейке), то для такого ыембранно-связанного комплекса, каким является КгцК-АТФаза, усиление претерпевают колебания практически всех групп, сближенных с поверхностью металла. В этом случае в полной мере проявляются преимущества комбинированного подхода, сочетающего спектроскопию спонтанного КР и ГКР.

Из анализа спектров КР препарата ИаД-АТФазы из почек свиньи

и мембранно-связанных продуктов его двухступенчатого гидролиза трипсином мы провели расчет вторичной структуры гидрофильных и мембранно-связанных гидрофобных участков о- и субъединиц фермента. При последовательном сравнении процентного содержания различных типов вторичных структур в нативном ферменте, образце, содержащем гидрофобные участки а-субъединицы и интактную Р-субъединицу, и в препарате, содержащем лишь гидрофобные участки а— и р-субъединиц, а также с помощью статистических методов предложена модель организации вторичной структуры гидрофильных

Рис Л 8 Вторичная структура Ка,К-АТФазы. Стрелки - участки Р-структуры, цилиндры - участки а-спирали.

областей КаДС—АТФазы и ее восьми гидрофобных трансмембранных сегментов (рис.18).

Мы провели анализ спектров КР и ГКР препаратов высокоактивной мембранно-связанной Ма,К-АТФазы в средах, содержащих ионы № или К, а также в отсутствии указанных ионов. Оказалось, что связывание ионов калия с "бессолевой" либо натриевой формами фермента приводит к изменению вторичной структуры, затрагивающему ^100 пептидных групп белка и выраженному в увеличении содержания а-спиральной конформации при соответствующем уменьшении числа остатков, образующих (З-структуру. Эти структурные сегменты расположены преимущественно в двух высококонсервативных районах а-субъединицы фермента, локализованных в цитоплазматическом домене Ка,К-АТФазы.

Метод спектросхошгк ГКР дает возможность селективного детектирования сигналов сстатков, расположенных с наружной и внутренней сторон мембранно—связанного комплекса. Это позволяет анализировать конформационные изменения, происходящие на поверхностях мембраны , изучать топографию нуклеотид-свяэывающего центра и ее изменения в процессе функционирования фермента. Мы проводим эту работу а настоящее время.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ КОМПОНЕНТЫ.

Т1сслёдовашй~ну»5«шоШх^ *5слот1шляется,-ш>:-видимому, одним из наиболее перспективных приложений спектроскопии ГКР при изучении биомолекул. Большие потенциальные возможности метода в этой области могут быть реализованы при обеспечении следующих основных принципов:

— регистрация спектров ГКР высокого разрешения от пикограммовых и субпикограммовых количеств нуклеиновых кислот для обеспечения конкурентоспособности метода с традиционными аналитическими методиками биотехнологии и генной инженерии;

— определение вторичной структуры нуклеиновых кислот с использованием микроколичеств вещества, что даст возможность проводить анализ регуляторных участков генома, находить корреляции между вторичной структурой и вуклеотидной последовательностью;

— детектирование участков дестабилизации двойной спирали и идентификация входящих в их состав нуклеотидныл оснований, а также уникальных неканонических структур нуклеиновых кигяот.

Экспериментальная система для получения спехтроз ГКР, основанная на использовании "активированного" или "неактивированного" нитратного золя представляется нам оптимальной для изучения конформации нуклеиновых кислот. Нами получены спектры ГКР нуклеотидов и ДНК из тимуса теленка при

"7

использовании 1 мкл адсорбата в концентрации до 10 мг/мл, что соответствует 10~^ г. исследуемого вещества. "Неактивированные" гидрозоли позволяют регистрировать спектры от всех нуклеотидных оснований. "Активирование" цитратного гидрозоля приводит к возникновению на мицеллах серебра дополнительных высокоспецифных сайтов хемосорбции, обладающих повышенным сродством к аденину

Рис.19 Спектры ГКР эк-вимолярной смеси адени— на, тимина, гуанина и цитозина, адсорбированных на неактивированном (1) и активированном (2) гидрозолях серебра.

Ш) Йоо _ 500

(рис.19). Механизм усиления для молекул, адсорбированных как на "активированном" так и на "неактивированном" гидрозолях, имеет выраженный короткодействующий характер. Специфичность "активированного" золя проявляется при денатурации ДНК в виде увеличения сигнала аденина в 10 раз при полном отсутствии симметричных колебаний колец других нуклеогидов.

Таким образом, "неактивированный", неспецифичный золь может быть использован для определения вторичной структуры нуклеиновых кислот, а "активированный" — для локализации участков дестабилизации двойной спирали. Мы получили спектры ГКР модельных полинуклеотидов, находящихся в канонических А- и В^ формах, хорошо коррелируют с данными спонтанного КР. Наиболее характерные отличия, наблюдаемые в спектрах КР при В<->А переходах связаны с изменением полос, относимых к сахаро-фосфатным колебаниям п связанных с переходом хонформации сахара из С^-эндо в Су-эндо-форму.

Спектры ГКР сверхспирализованной и линейной форм плазмид на неактивированном гидрозоле также имеют ряд характерных отличий Снятие сверхспирализации путем обработки плазмиды рестрнктазой приводит к воспроизведению спектра ГКР, характерного для канонических структур (рис.20).

Плазмида рАО 3 в сверхспирализованной форме образует крестообразную структуру в участке нуклеотидной последовательности, богатом АТ-парами. Для идентификации такого участка дестабилизация двойной спирали мы использовали

|<СВЕ.РХСПиРЛЛЬНД«

5 ДНК

". ° II (2) форм плазми;

Рис.20 Спектрь спиральной (1) и линейно'й ' м плазмиды рАО 3, шых на неакти-гидрозоле серебра.

С1ВЕРЛСПИ*ЯЯЬНЯЯ ДНК \ ГЕСТРИКТДЭЯ

""ЙоГ"

500 а^с. -1

"активированный" гидрозоль. Резкое увеличение сигналов аденина для сверхспирализованной плазмиды, по сравнению с ее линейной формой, однозначно свидетельствует в пользу появления при сверхспирализадии участка дестабилизации двойной спирали (рис.21).

воооосс

пиве-О

2

1500

"¡¿00

500

Рис.21 Спектры ГКР сверхспиральной (1) и линейной (2) форм плазмиды рАО 3, адсорбированных на активированном гидрозоле серебра.

Таким образом, мы показали:

1) существует возможность регистрации спектров ГКР высокого

—13

разрешения от 10 г. нуклеиновых кислот;

2) метод позволяет определять вторичную структуру нуклеиновых кислот при использовании микроколичеств вещества;

3) использование гидрозоля с активированными адсорбционными центрами позволяет избирательно детектировать дестабилизированные участки двойной спирали и идентифицировать входящие в их состав нуклеотидные основания.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ГКР.

"В то время как 1фйлбжёния" спектроскопии ГКР к фундаментальным структурно-функциональным исследованиям белков и нуклеиновых кислот ограничивается необходимостью дополнительного контроля сохранения структуры биомолекул при адсорбции, существует широкий класс задач, в решении которых указанный метод находится вне конкуренции. Речь идет об аналитических возможностях спектроскопии ГКР - детектировании следовых количеств биомолекул и надмолекулярных комплексов. В этой области чувствительность ГКР сравнима, а в ряде случаев превышает бывшие до настоящего время рекордными пределы детектирования, характерные для методов флуоресценции и даже изотопного анализа.

За счет тщательного подбора различных приготовлений гидрозоля, обладающих улучшенными адсорбционными свойствами, нам удалось детектировать колебательные спектры высокого разрешения от долей пикограмм нуклеотидов и пикограммовых количеств ДНК (рис22).

Широкое применение спектроскопия ГКР может найти и в экспресс—диагностике различных заболеваний. Мы разработали метод диагностики катаракты, основанный на детектировании специфичных пигментов, образующихся в хрусталике глаза на ранних стадиях этого заболевания. Оказалось, что метод позволяет детектировать пигменты - производные индола и фенола на уровне пикограмм вещества на фоне суперпозиции полос веществ, входящих в экстракт (рис.23). Этот подход позволяет не только повысить чувствительность анализа, по сравнению с применяющимся в

настоящее время методом микрофлу орим етрии, но и увеличить селективность, за счет четкой идентификации пигментов по наблюдаемому спектру.

С целью расширения аналитических приложений ГКР вам удалось разработать новую экспериментальную систему — ГКР—активную

фильтров, обладающую высокой стабильностью и очень высокими коэффициентами усиления К? (рлс.4). Такие поверхности оказались исключительно перспективными дли аналитических приложений в биологии. Были получены спектры от нескольких пикограмм в пробе лизоцима, некоторых аминокислот, нуклесггидов и ДКК, причем вид спектров практически не отличается от спектров водных растворов соответствующих соединений (ри<х24). Это означает, что в данной экспериментальной системе, в отличие от, например, обработанных с помощью ОВЦ электродов в электрохимической ячейке, реализуется преимущественно электромагнитная, дальнодействующая компонента механизма усиления КР. Очевидно, что в этом случае теряет актуальность вопрос о нарушении конформации молекул при

Рис.24 СпектрГКР лизоцима несенного на ГКР-активную поверхность на основе ядерного фильтра (рис.4). Количество вещества в пробе — 2 пикограмма.

адсорбции, поскольку вклад в сигнал ГКР молекул непосредственно адсорбированных на поверхности металла оказывается весьма небольшим. Таким образом, разработанная система может быть эффективно использована как для аналитических приложений, так и для фундаментальных структурно-функциональных исследований макромолекул. Кроме того, в силу своей универсальности, ГКР-активные поверхности могут быть использованы в качестве систем детекции в оптических приборах новых поколений.

УСЛОВИЯ СОХРАНЕНИЯ КОНФОРМАЦИИ БИОМОЛЕКУЛ, АДСОРБИРО-ВАННЬПСШ: ТЖРЕБРЯНБПСЭШКТР0ДАХ'И~ГИДРи307ШГТКРТШ>АТ ~

ТЭсновным вопросом", определяющем применимость методов спектроскопии ГКР и ГРКР для структурно-функционального изучения биомолекул, является определение условий сохранения конформации при адсорбции этих соединений на поверхности металла. Очевидно, что в случае денатурации биологических макромолекул в экспериментальных системах, используемых для получения спектров ГКР, этот метод может быть применим только в аналитических приложениях. В случае, когда адсорбция приводит лишь к локальным возмущениям, связанным, например, с изменением ориентации боковых цепей экспонированных ароматических аминокислотных остатков в белках, метод можно использовать для определения вторичной и элементов третичной структуры макромолекул. Тем не менее в каждом конкретном случае этот вопрос требует специального рассмотрения. Из общих соображений очевидно, что идеальной в плане сохранения конформации изучаемых биомолекул была бы экспериментальная система, в которой усиление KP происходило бы без хемосорбции -только за счет электромагнитной компоненты механизма усиления KP. Такими системами могут стать поверхности с упорядоченными макродефектами.

Впервые вопрос о сохранении конформации биомолекул, адсорбированных на электродах и гидрозолях серебра, был поставлен нами при изучении цитотоксина I яда кобры Naja naja oxiana, и лейцинизолейцинвалинсвязывающего и лейцинспецифичного белков периплазматического пространства E.coli. Мы провели сравнение спектров кругового дихроизма цитотоксина в водном растворе и в адсорбированном состоянии. Оказалось (рис.25), что конформация

полипептидной цепи цитотокснна при адсорбции остается неизменной, тогда как существенные отличия в области поглощения ароматических' аминокислотных остатков (300-250 нм) свидетельствуют о непосредственном взаимодействии ароматических боковых цепей с серебром и изменении при этом их ориентации.

Нами проводились также функциональные тесты на активность некоторых адсорбированных белков. Оказалось, что при адсорбции лейцинизолейцинвалинсвязывающего и лейцинспецифичного белков на разрыхленном с помощью ОВЦ серебряном электроде эти соединения сохраняют свою функцию — способность к специфичному связыванию аминокислот. При этом ОВЦ проводили в чистом электролите, и лишь после окончания процесса рыхления в электрохимическую ячейку добавляли белки, а все измерения проводили при электродном потенциале равном потенциалу нулевого заряда серебра.

В случае ГРКР фоточувствительных мембранных белков структурно—функциональное состояние биомолекул проверяли с помощью ряда методов. Так, анализ спектров ГРКР бактериального и зрительного родопсинов ■ позволяет определить микроокружение хромофорных центров пигментов в адсорбированном и неадсорбированном состояниях. Анализ спектров КД позволяет ответить на вопрос о сохранении структуры белковой части молекулы как целого, а из спектров ГРКР этих пигментов при различных длинах волн возбуждения можно получить информацию о параметрах фотоцикла и фотолиза бактериального и зрительного родопсинов, соответственно. Мы уже отмечали, что адсорбция бактериородопсина и родопсина на неагрегированных гидрозолях серебра приводит к фиксации фотоиндуцированных конформационных изменений пигментов,

в то время как адсорбция на частично агрегированных золях и "гладких" серебряных электродах не влияет на их фотоиндуцированные переходы. При этом, как следует из анализа спектров КД во всех случаях структура белковой части молекул как целого не претерпевает изменений. Микроокружение хромофоров в адсорбированных пигментах можно определить с высокой точностью с помощью детального сравнительного анализа спектров ГКР и ГРКР в областях С»=С валентных колебаний (1500-1600 см-*) и "отпечатков пальцев" (980-1200 см-1)-

Положение максимума полосы поглощения модельных альдиминов ретин аля, зрительных пигментов и промежуточных продуктов фотоцикла бактериородопсина линейно зависит от частоты валентных колебаний связей ОС в спектрах РКР этих соединений (рис.146). В спектре ГКР фоторецепторных дисков, адсорбированных на гидрозоле серебра, частота валентных колебаний С=С составляет 1550 см-*, что соответствует хромопротеину с максимумом полосы поглощения вблизи 500 нм (как это имеет место для нативного пигмента). Анализ полос в области "отпечатков пальцев" в спектрах' РКР зрительных пигментов и пурпурных мембран позволяет определить конфигурацию полиеновой цепи хромофора. Оказалось, что как конфигурация, так и микроокруженис хромофоров в бактериальном и зрительном родопсинах не претерпевают существенных изменений при адсорбции.

Мы привели примеры сохранения информационного состояния биомолекул при адсорбции в экспериментальных системах, используемых в спектроскопии ГКР. Несмотря на то, что при использовании стандартных методик приготовления гидрозолей, проведении ОВЦ в чистых электролитах в электрохимических ячейках с последующим добавлении изучаемых соединений и измерениях при потенциале нулевого заряда серебра не происходит изменений структуры макромолекул, этот вопрос остается наиболее болезненным в приложениях метода и в каждом случае требует специального рассмотрения.

С уверенностью можно утверждать следующее: 1. Метод слегтроскопии ГКР и ГРКР можно весьма эффективно применять в аналитических приложениях в любых используемых в

настоящее время экспериментальных системах;

2. Изучение топографии мембранно-связанных комплексов с помощью спектроскопии ГКР можно проводить без нарушений как структуры белковых частей молекул как целого, так и микроокружения входящих в их состав хромофороз;

3. Структурно-функциональное изучение макромолекул методом спектроскопии ГКР требует проведения как структурных так и функциональных тестов для адсорбированных молекул.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы к исследованию белков, пептидов и нуклеиновых кислот с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, позволяющей проводить анализ с использованием пикограммовых количеств вещества. Созданы новые экспериментальные системы, позволяющие повысить информативность и чувствительность исследований.

2. Определены молекулярные механизмы взаимодействия биомолекул с поверхностью' серебра в использованных экспериментальных системах и впервые получены спектры ГКР ст пикограммовых количеств аминокислот, пептидов, водорастворимых и мембранных белков, нуклеотвдов п нуклеиновых кислот.

3. На примере зрительного и бактериального родопсинов и ЫаД-АТФазы разработаны общие комбинированные подходы к изучению топографии мембранно-связанных комплексов с помощью спектроскопии гигантского, резонансного и спонтанного комбинационного рассеяния. Определено расположение хромофоров в бактериальном и зрительном родопсинах ■ относительно поверхностей пурпурной мембраны и мембраны фоторецепторного диска, предложена модель вторичной структуры гидрофильных областей а- и (И-субъединиц КаД-АТФазы и ее восьми трансмембранных гидрофобных сегментов. Предложена и подтверждена экспериментально модель зарядового микроокружения альдимина ретиналя бактериородопсина на различных стадиях функционирования пигмента.

4. Разработана новая технология приготовления ГКР-активных поверхностей, позволяющая реализовывать усиление КР на 5-7 порядков величины и использовать ГКР в создании

высокочувствительных систем детекции в оптических приборах новых поколений.

5. Предложен метод спектральной диагностики ранних стадий катаракты.

6. Разработаны и применены подходы к определению вторичной структуры нуклеиновых кислот и селективного детектирования участков дестабилизации двойной спирали с помощью спектроскопии ГКР.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Набиев ИР., Траханов СД, Плетнев ВЗ, Ефремов B.C. Структура акгиноксантина в кристалле и в водном растворе. — Биоорган, химия, 1981, т. 7, N б, с. 832-835.

2. Набиев Ш\, Траханов СД, Ефремов E.G, Маринюк ГШ, Лазоренхо-Маневич РЛ1 'Аномально интенсивные спектры комбинационного рассеяния некоторых биологических молекул, адсорбированных на серебряных электродах. — Биоорган, химия, 1981, т. 7, N 6, с 941-945.

3. Набиев ИР, Плужников КА, Траханов СД, Ефремов Е.С, Цетлин ВЛ Сравнительное исследование токсинов яда кобры Naja naja oxiana и токсина 3 Naja naja siamensis методом лазерной спектроскопии комбинационного рассеяния. - Биоорган, химия, 1981, т. 7, N 6, с. 836-846.

4. Воротынцева ТЛ, Сурин AM, Траханов СД, Набиев ИР, Антонов BJC Спектральные свойства лейцинизолейцинвалин связывающего белка и его комплексов с субстратами. — Биоорган. химия, 1981, т.7, NU 45-57.

5. Nabiev LR, Savchenko VA, Efremov RS. Surface-enhanced Raman spectroscopy of aromatic amino acids and proteins adsorbed by silver hydrosols. - J. Raman Spectrosc, 1983, v. 14, p. 375-379.

6. Набиев ИР, Саргсян A.C, Ефремов ЕС, Михалева ИЛ, Иванов В.Т. Пространственная структура пептида 6—сна и его аналогов. Лазерные спектры комбинационного рассеяния. — Биоорган. тин^ця,

1982, тД N 7, е. 900-904.

7. Набиев ИР. Применение эффекта аномально интенсивного комбинационного рассеяния к изучению биологических молекул. В кн: Применение лазеров в биологии. М, МГУ, 1983, с. 104-108.

8. Набиев ИР., Чуманов ГД, Маныкин ЭА. Хемосорбция биомолекул на поверхности металла и ее роль в эффекте аномально интенсивного комбинационного рассеяния света. - Известия ВУЗ MB и ССО СССР, сер. Физика, 1985, выпЗ, с. 33-37.

9. Nabiev I.R., Efremov R.G, Chumanov GD. The chromophore-binding site of bacteriorhodopsin. Resonance and surface-enhanced resonance Raman spectroscopy and quantum chemical study. - J. Biosciences, 1985, v.8, Nos 1&2, p. 363-373.

10.Nabiev I.R, Efremov R.G, Chumanov GD, Abdulaev N.G. Transverse location of retinal Schiffs base in bacteriorhodopsin

and rhodopsin. Surface-enhanced Raman spectroscopy and quantum chemical study. - In: Spectroscopy of Biological Molecules / Eds. AJPAlix, L-Bernard, M.Manfait. Chichester - N.Y. - Brisbane -Toronto - Singapore: Wiley, 1985, p. 348-350.

ШЕфремов РГ, Набиев ИР. Микроокружение альдимина ретиналя в бактериородопсине. - Биол. мембраны, 1985, т2, N 5, с. 460-469.

12.Набиев ИР, Ефремов РГ, Чуманов ГД, Курятов А.Б. Расположение альдимина ретиналя относительно поверхности пурпурной мембраны. Спектроскопия шгантского комбинационного рассеяния. - Биол. мембраны, 1985, т. 2, N 10, с. 1003-1015.

13.Абдулаеа НГ, Набиев ИР, Ефремов РГ, Чуманов ГД. Расположение альдимина ретиналя родопсина относительно поверхности фоторецепторного диска. - Биол. мембраны, 1986, тЗ, NU 26-33.

М.Овчинников ЮА, Абдулаев НГ, Киселев А.В, Набиев ИР, Василева XJ3, Ефремов РГ. Остаток тирозина катализирует светоиндуцированное депротонирование альдимина ретиналя в бактериородопсине. - Биол. мембраны, 1986, т. 3, N 4, с. 325—338. 15.Набиев ИР, Чуманов ГД. Спектроскопия шгантского комбинационного рассеяния биополимеров: водорастворимые белки, аминокислоты и дипептиды, адсорбированные на серебряных

электродах н гидрозолях серебра. — Биофизика, 1986, T.XXXI, выо2, с. 183-190.

16.Набиев ИР, Ефремов Р.Г, Чуманов ГД. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния биополимеров: мембранные белки, бактериородопсин и родопсин, адсорбированные на серебряных электродах и гидрозолях серебра. - Биофизика, 1986, T.XXXI, вып.

4, с. 724-734.

17.Abdulaev N.G, Nabiev IJt, Efremov R.G, Chumanov G£>. Retinal Schiff base position relative to the surfaces of photoreceptor disk. - FEBS Lett., 1987, v. 213, p. 113-118.

18.Модянов НД, Аристархова E.A, Арзамазова HM, Джанджугазян KJL, Ефремов PX, Набиев ИР, Овчинников ЮЛ. Трансмембранная организация ЫаДС-АТФазы: анализ вторичной структуры гидрофильных и гидрофобных участков а- и р-субъединиц методами оптической спектроскопии. - Биол. мембраны, 1987, т. 4, N 12, с. 1244-1253.

19.Набиев ИР, Джанджугазян КД, Ефремов PJ", Модянов НЛ. Изменения вторичной структуры КаДС-АТФазы, индуцированные связыванием одновалентных катионов. - Биол. мембраны, 1988, т. 5,

N 9, с. 901-909.

20.0vchinnikov YuA, Arystarkhova ЕА, Arzamazova NJvL, Dzhandzhugazyan ICN, Efremov R.G, Nabiev I.R, Modyanov NJi. Differentiated analysis of the secondary structure of hydrophilic and hydrophobic regions in a- and fJ-subunits of Na,K-ATPase by Raman spectroscopy. - FEBS Lett, 1988, v. 227, N 2, p. 235-239.

21.Nabiev LR, Dzhandzhugazyan K.N, Efremov R.G, Modyanov NX Binding of monovalent cations induces large changes in the secondary structure of Na^C-ATPase as probed by Raman spectroscopy. - FEBS Lett, 1988, v. 236, N 1, p. 235-239.

22.Набиев ИР, Ефремов РГ„ Чуманов ГД Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния и ее применение к изучению биологических молекул. - Успехи физич. наук, 1988, т. 154, вып.

3, с. 459-496.

23-Chumanov GJD, Efremov R.G, Nabiev LR. Surface-enhanced Raman spectroscopy of biomolecules. L Water-soluble proteins, dipeptides and amino acids. - J Лат an Spectrosc, 1990, v.17, N

1, р.119-124.

24.Nabiev I.R, Chumanov GJD. , Efremov R.G. Surface-enhanced Raman spectroscopy of biomolecules. IL The application of short-and long-range components of SERS to study the structure and function of the membrane proteins. - JJRaman Spectrosc., 1990, y.17, N 1, p.124-130.

25№biev LR, Sokolov K.V, Voloshin OX Surface-enhanced Raman spectroscopy of biomolecules. Ш. Determination of the secondary structure of nucleic acids and destabilization regions in the double helix. -LRaman Spectrosc, 1990, v.17, N 2,p.l2-18 2бЛабиев И.Р, Ефремов РТ. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния и ее применение к изучению биологических молекул. -Ми ВИНИТИ, 1989. - 132 с 27Jiabiev I.R, Efremov R.G, Sokolov K.V. Surface-enhanced Raman studies of membrane proteins and nucleic acids: topography and secondary structure of biomolecules. - In: Spectroscopy of Biological Molecules. State of the Art / Eds. A-Bertoluzza, CJragnano, P.Monti. Bologna: SEE, 1989, p. 17-20. 28£fremov R.G, Feofanov A.V, Nabiev LR. Quantitative treatment of UV resonance Raman spectra of biological molecules. Application to study of ATP-binding site in Na,K-ATPase. - J. Am. Chem. Soc, 1990, vol.124, N 2, p.1245-1256.

29.Феофанов AB, Ефремов PX, Джанджугазян КЛ, Набпев ИР. Спектроскопия резонансного комбинационного рассеяния мембранных л белков. Микроокружение аденинового кольца АТФ в комплексе с КаД-АТФазой. - Биол. мембраны, 1990, т.7, N 4, с. 76-85. 30Etiemov R.G, Feofanov A,V, Dzhandzhugazyan K.N, Modyanov 1Ш, Nabiev III. Study of ATP binding in the active site of Na,K-ATPase as probed by ultraviolet resonance Raman spectroscopy. - FEBS Lett, 1990, vol.244, N 2, p. 12-18. 31-Nie S, Castillo C.G, Bergbauer K.L, Kuck J.F.R, Nabiev LR, Yu N.-T. Surface enhanced Raman spectra of eye lens pigments. - Appl. Spectrosc, 1990, vol.278, N 1, p. 48-57,

Результаты работы докладывались на различных всесоюзных и

международных симпозиумах, в том числе на III Советско-западногерманском симпозиуме по химии пептидов и белков (Махачкала, 1980); XVI Европейском симпозиуме по химии пептидов (Копенгаген, 1980); 1и III Всесоюзных конференциях "Применение лазеров в биологии" (Тбилиси, 1980; Москва, 1983); III Советско-шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси, 1981); V Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980); IV, V и VI Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981; 1984; 1988); Ш Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция" (Ташкент, 1983); VI и VII Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Рига, 1983; Таллин, 1987); Советско-индийском симпозиуме по структуре и функции биомембран (Калькутта, 1984); Международном симпозиуме по структуре биомолекул и их взаимодействиям (Бангалор, 1984); 16 Конференции ФЕБО (Москва, 1984); Международной конференции по ретиналъ-содержащим белкам (Иркутск, 1986); 1 и 111 Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Реймс, 1985; Римини, 1989); XI Международной конференции по Раман спектроскопии (Лондон, 1988); II и Ш Международных конференциях по лазерной спектроскопии биологических объектов (Печ, 1988; Прага, 1989).

Соано в набор 30.01.90 Пошшсаио в печать 29.01.00 Т- 02465

Формат 60x30 1/16 Печать офсетная Бум.офс.

Усллечл. 3,0 Усл.кр.-отт. 3,12 Уч.-«за.л. 2,90 Тир. ISO 8кэ. Зак. 847

Пранэвоаственяо-изаательсюй комбинат ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, Московской обл., Октабрьсюй проспект, 403