Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков

Шахпаронов, Михаил Иванович

Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Шахпаронов, Михаил Иванович АВТОР

доктора химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2000 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков»

Автореферат диссертации на тему "Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК £ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.152.361

ШАХПАРОНОВ Михаил Иванович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИОНТРАНСПОРТИРУЮЩИХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва — 2000

Работа выполнена в Институте биоорганической хими им. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Официальные оппоненты:

доктор хим. наук, член-корреспондент РАН, профессор Северин Е.С.

доктор биол. наук, профессор Сащенко Л. П.

доктор хим. наук, профессор Габибов А.Г.

Ведущая организация — Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится29 июня 2000 г. в на заседании специализированного ученого совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им.М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биооргани ческой химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Диссертация разослана 29 мая 2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

Еом // -<//</&

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фундаментальным свойством живой клетки является наличие градиента концентраций различных ионов относительно как наружной мембраны, так и мембран внутриклеточных компартаментов. Зависимыми от внутриклеточной концентрации ионов являются Такие физиологически важные процессы как возбудимость и сократимость клеток, все виды клеточного движения, секреция гормонов и пищеварительных ферментов, высвобождение нейромедиаторов и транспорт метаболитов. Среди всего многообразия ионов, участвующих в метаболизме целой клетки и ее органелл, ключевую роль играют ионы водорода, калия, натрия и кальция. Нарушение внутриклеточного баланса именно этих катионов вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне организма в целом является одной из причин возникновения и развития многих тяжелых заболеваний.

В клеточных мембранах существует большое многообразие систем транспорта ионов, важнейшую роль среди которых играют мембранные системы активного транспорта катионов - ионзависимые АТФазы. Одни из них отвечают за поддержание градиента концентрации ионов, другие используют созданный градиент как движущую силу для катализа тех или иных биохимических реакций. В свою очередь различные ионы, участвующие в клеточном гомеостазе, требуют наличия широкого спектра систем транспорта этих ионов через мембраны клеток и их органелл.

Большая, физиологическая значимость транспорта ионов предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов всего многообразия ионтранспортирующих систем. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в мире за последние годы в этой области, исследование трехмерной и надмолекулярной структуры ионтранспортирующих систем до сих пор находится на начальном этапе своего развития; *. поскольку специфические трудности работы со сложноорганизованными мембранными белками не позволяют эффективно использовать метод рентгеноструктурного анализа. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реальных механизмов функционирования систем активного транспорта катионов через биологические мембраны.

В то же время список существующих ионтранспортирующих систем на сегодняшний день далеко не полон, и даже грандиозное продвижение в секвенировании генома человека не дает оснований полагать, что в ближайшее время будут полностью определены первичные структуры всех мембранных белков, поскольку структурное многообразие часто увеличивается за счет альтернативного сплайсинга.

Исходя из вышеизложенного, необходимо отметить, что изучение связи между химической структурой, пространственной организацией и принципами функционирования мембранных белковых комплексов, а также поиск новых элементов систем ионного транспорта, необходимых для жизнедеятельности организмов, является одной из основных проблем современной физико-химической биологии.

Цель работы. Основной целью настоящей работы явилась характеризация структуры разных уровней нескольких мембранных ионтранспортирующих белков, а именно Са2*-АТФазы плазматических мембран, изоформ Х*,К*-АТФаз и Н*-трансгидрогеназы.

Наиболее распространенными в животном мире системами активного транспорта ионов являются катионтранспортирующие АТФазы (Н'-. К*- и №*,К*-АТФазы и Са2*-АТФаза плазматических мембран). Используя энергию гидролиза АТФ, эти сложные биологические машины осуществляют два взаимосвязанных и противоположно направленных процесса: выброс ионов водорода или натрия и одновременный перенос ионов калия в клетку в случае ХМО-АТФаз и выведение ионов кальция в случае Са2*-АТФазы. Таким образом, происходит тонкая регуляция ионного состава и объема клетки и обеспечивается постоянстве неравновесного распределения катионов между клеткой и средой.

Одним из потребителей протонного градиента относительно внутреннее митохондриальной мембраны, а также клеточной мембраны бактерий является Н* транспортирующая никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (Н*-трансгидрогеназа), использующая перенос протона для смещения равновесия NADP+NADH -> NADPH + NAD. Физиологическая роль данной реакции до сих пор не осознана полностью, однако о es важности говорит значительная консервативность структуры Н*- трансгидрогеназы бактерий и животных.

В исследование структуры входит прежде всего определение аминокислотной последовательности фермента, установление субъединичного состава, идентификация участков, ответственных за каталитические и регуляторные свойства, а затем определение его трехмерной структуры.

В связи с естественными сложностями установления трехмерной структура мембранных белков в данной работе основной акцент был сделан на использование иммунохимических методов, связанных с получением специфических moho- v поликлональных антител к указанным системам. Антитела позволяют в первую очередь зондировать пространственную организацию фермента, прежде всего трансмембраннук: укладку полипептидной цепи, а изучение влияния антител на каталитические свойства фермента дает возможность определять функционально важные участки молекулы белка Решение этих задач требует как тонкого картирования эпитопов, так и получения антител с предопределенной специфичностью.

Другим аспектом применения антител является выделение изучаемого белка методом иммуноаффинной хроматографии с целью изучения субъединичного строения той или иной системы, т.е. получения информации о четвертичной структуре. Данный подход особенно ценен в изучении белков, синтезируемых клетками в малых количествах. Детекция изучаемого фермента в органах и тканях при помощи антител позволяет создать основу для выяснения конкретной физиологической роли той или иной системы на уровне целого организма.

Учитывая данные по изучению ионтранспортирующих систем, полученные другими исследователями, основное внимание было направлено на получение коллекций моноклональных антител (МА) к вышеупомянутым объектам и характеризацию специфичности (локализацию эпитопов) полученных антител, а также применение данных антител для тестирования трансмембранной организации Са2*"АТФазы плазматических мембран и Na'.K'-АТФазы. Получение же ингибирующего МА к НГ-трансгидрогеназе и тонкое картирование его эпитопа позволило создать модель расположения доменов Н*-трансгидрогеназы Е. coli.

В исследовании ранее малоизученной Н*,1С-АТФазы нежелудочного типа (продукт гена alplall) усилия были сфокусированы на изучении тканеспецифичной экспрессии и иммуногистохимической локализации s тканях с максимальным уровнем экспрессии гена.

Кроме того, проводили поиск новых изоформ субъединиц ионтранспортирующих ферментов на уровне транскриптов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Определена первичная структура новой р-субъединицы Х*,К*-АТФаз, присутствующей только в мышечной ткани (поэтому названной ßm) В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х*,К*-АТФаз гипотетический белок ßm имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками Glu, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.

Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н*,К*-АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

Одной из характерных особенностей данной работы явилось широкое внедрение при решении проблем структурно-функциональных взаимоотношений библиотек экспрессированных фрагментов генов исследуемых ферментов с последующим установлением их функциональной и иммунохимической активности. Этот подход, являясь

более эффективным, с успехом заменил широко распространенный ранее метод пептидного картирования.

Тщательно охарактеризованные монокпональные антитела — исключительно полезный инструмент в исследованиях биополимеров. Антитела, специфичные к определенным изоформам ферментов, находят широкое применение, например, для иммунохимической детекции соответствующих изсформ в тканях организма. Например, в данной работе показано, что одно из МА реагирует только с 4-й изоформой Са-АТФазы плазматических мембран (hPMCA4), а другое — распознает все известные изоформы Са2*-АТФазы высших животных. Это позволяет определять содержание hPMCA4 относительно общего пула фермента.

При помощи анализа связывания охарактеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2*'АТФазы плазматических мембран и С-концевой половины а-субъединицы №',К*-АТФазы.

Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена Са2*-АТФазы для продукции, детекции и аффинной очистки рекомбинантных белков, что с успехом применено для получения высокоочищеннсй Н*-трансгидрогеназы Е. coli. Несмотря на то, что к настоящему времени уже предложено немало различных «партнеров» для создания гибридных белков, например, гексагистидиновая последовательность (которая также широко применялась в данной работе), использование аффинной хроматографии на кальмодулине имеет определенные преимущества, например, позволяет проводить выделение химерных белков в строгих восстановительных условиях.

Таким образом, открыто как существование новых компонентов систем транспорта ионов (р„), так и получена обширная информация по различным аспектам структуры и функции хорошо известных и важных систем. Вся полученная информация существенно расширяет возможности дальнейших исследований функционирования систем транспорта ионов через биологические мембраны.

Работа выполнена в ИБХ РАН в в сотрудничестве со Швейцарским Институтом Технологии (Цюрих, Швейцария), Медицинским Колледжем Огайо (Толидо, США), Гетеборгским Университетом (Гетеборг, Швеция). Автор приносит благодарность всем коллегам, учавствовашим в выполнении работы и обсуждении ее результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований. Научного совета по белковой инженерии, Международного научного фонда, Министерства науки и технологий Российской Федерации, Шведского совета по естественным наукам, Американского фонда гражданских исследований (CRDF) и ИНТАС

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Са2+-АТФаза плазматических мембран (РМСА)

1.1. Картирование регуляторных участков Са2'-АТФазы плазматических мембран.

Исторически сложилось так. что изучение механизмов регуляции Са2*-АТФазы плазматических мембран началось еще до определения первичной структуры фермента. К моменту начала наших исследований этого фермента было известно, что он состоит из одной субъединицы с молекулярной массой около 140 кДа и не имеет остатков Сахаров. Было также установлено, что фермент относится к АТФазам Р-типа и активируется кальмодулином, кислыми фосфолипидами, а также посредством ограниченного трипсинолиза. Следующим необходим'ым этапом исследования Са2^-АТФазы явилось определение первичной структуры молекулы белка и локализация регуляторных участков -сайтов связывания кальмодулина, кислых фосфолипидов и высокой чувствительности к действию протеаз.

В качестве источника для выделения Са2*-АТФазы использовали эритроциты человека, которые лишены ядра и клеточных органелл, а таюке не содержат системы №*,Са2*-обмена. Благодаря этому удавалось за одну хроматографическую стадию (аффинная хроматография на иммобилизованном кальмодулине) выделять Са2*-АТФазу достаточной степени чистоты для проведения структурных работ.

Первым шагом в этой серии исследований явилась идентификация первичной последовательности участка полипептидной цепи Са2*-АТФазы, окружающего сайт фосфорилирования фермента. Для этого радиоактивномеченный с помощью [у-32Р]-АТФ фермент расщепляли по остаткам метионина бромцианом, разделяли пептиды при помощи ВЭЖХ и определяли Ы-концевые аминокислотные последовательности меченых фрагментов. В результате структура искомого участка была установлена как: СЫАТА1С30КТет1_Т

Полученные нами данные помогли другим группам исследователей (лаборатории Шуля и Карафоли) выбрать необходимые олигонуклеотидные зонды для скрининга библиотек кДНК и определить первичную структуру полноразмерной Са:*-АТФазы плазматических мембран человека. Оказалось, что существуют четыре изоформы фермента (РМСА1, РМСА2, РМСАЗ и РМСА4), причем в эритроцитах человека содержатся РМСА1 и РМСА4 с преобладанием последней. Этот факт позволил объяснить гетерогенность последовательностей пептидов, отличных от высококонсервативного сайта фосфорилирования.

кДа

»-У

28- -

33.5- — 28-

m 1 2 3

JJ3

1 2 3

66 -¿5

Рис.1. Электрофорез в ПААГ «водорастворимых» (а) и «мембранных» (6) кальмодулинсвязывающих фрагментов Са2*-АТФазы. т - образцы перед гель-хроматографией, 1-3 - фракции полипептидов, разделенных с помощью гель-хроматографии.

Сем ДТР Сам

Л/-_„

КО к Да

Рис.2. Схема расположения сайтов связывания кальмодулина в Са2*-АТФазе и

предполагаемые пути образования кальмодулинсвязывающих фрагментов. I

кальмодулинсвязывающие участки, II - АТФ-гидролизующий центр, III - большой внутримембранный участок.

Для установления строения участка (или участков) связывания кальмодулина мембраны эритроцитов обрабатывали трипсином в строго контролируемых условиях. Затем «мембранную» и «водорастворимую» фракции отдельно подвергали хроматографии на кальмодулине. Связавшиеся фрагменты элюировали Е1ЭТА, анализировали при помощи электрофореза (рис. 1) и затем определяли 1^-концевую последовательность фрагментов. Кроме этого исследовали пути образования и степень родства выделенных фрагментов с помощью поликлональных антител, специфичных к определенным участкам полипептидной цепи. В результате из «мембранной» фракции были выделены кальмодулинсвязывающие полипептиды с М 82, 75, 53, 33.5 и 28 кДа, а из «водорастворимой» - полипептиды с М 82,

75, 53 и 28 кДа. Анализ строения полипептидов позволил прийти к выводу, что Са2*-АТФаза имеет два сайта связывания кальмодулина, один в Ы-концевой, а другой - в С-концевой области (рис. 2).

Результаты по локализации сайта связывания кальмодулина в крайнем С-концевом «водорастворимом» участке полностью совпали с более поздними данными, полученными в лаборатории Карафоли, где удалось достичь более точной локализации при помощи анализа фрагментов, связывающих меченый кальмодулин в условиях блоттинга. Но существование второго сайта связывания кальмодулина в 1Ч-концевой области молекулы белка иностранными коллегами упорно отрицалось, несмотря на то, что наш эксперимент проводился в условиях, гораздо более приближенных к нативным. Разобраться в этом противоречии впоследствии позволили исследования проф. Пеннистона. Им было показано, что синтетический пептид, соответствующий фрагменту из М-концевой области, способен связывать в растворе кальмодулин, хотя и с более низкой аффинностью, чем пептид, соответствующий С-концевому фрагменту. Таким образом, в Са2*-АТФазе действительно существует два пространственно разделенных сайта связывания кальмодулина, высоко- и низкоаффинны'й. Физиологическая значимость существования этих двух сайтов для активации Са2*-АТФазы кальмодулином, происходящей в живой клетке при повышении цитоплазматической концентрации Са2*, до сих пор остается неясной.

Для локализации высокочувствительных к действию протеаз сайтов применяли сходные подходы, но с использованием солюбилизированной очищенной Са2*-АТФазы. Ранее было известно, что при контролируемой обработке трипсином происходит последовательное образование фрагментов с М 90, 85, 81 и 76 кДа. Как было установлено, эти полипептиды сохраняли способность к активному транспорту ионов Са2*, но существенно различались по регуляторным свойствам (чувствительность к кальмодулину и кислым фосфолипидам).

В данной работе проводили поиск условий протеолиза, приводящих к обогащению гидролизата каждым из анализируемый фрагментов. Наилучшие результаты были получены при обработке Са2*-АТФазы трипсином при 0°С и соотношении трипсин/белок 1:10 по массе. В выбранных условиях преимущественное накопление фрагмента с М 90 кДа происходило в течение первых 5 мин, фрагментов с М 85 и 81 кДа - в течение 40 мин в присутствии необходимых эффекторов (кальмодулин/кальций и магний/ванадат, соответственно). Фрагмент с М 76 кДа получали расщеплением белка трипсином в течение 90 мин. Фрагменты анализировали при помощи электрофореза (рис. 3), а затем определяли их Ы- и С-концевые аминокислотные последовательности (табл. 1).

S 1 2 3 AS

Рис. 3. Электрофореграмма образцов, использованных для определения N1- и С-концевой последовательности триптических фрагментов. 1-4 - образцы гидролизата, обогащенные по фрагментам с М 90, 85, 81 и 76 кДа, соответственно. Э - белки -маркеры.

Табл. 1. N- и С-концевые последовательности триптических фрагментов.

фрагмент аминокислотная последовательность

N-концевая С-концевая

90 кДа TQDGVALEIQPL KASK

315-326 1158-1161

85 кДа TQDGVA TQIK

- 315-320 1102-1105

81 кДа TQDGVALEIQ GTTK

315-324 1063-1066

76 кДа LAVQIGKA GTTK

359-366 1063-1066

Данные о расположении расщепляемых пептидных связей позволяют восстановить основные этапы контролируемой фрагментации функционально активной Са2*-АТФазы. Первичная атака трипсином (образование фрагмента 90 кДа) происходит по участкам Lys314-Ala315 и Lys"61 -Phe1162 молекулы белка. На следующем этапе при образовании фрагментов с M 85 и 81 кДа происходит расщепление пептидных связей только в С-концевой области: Lyst,G5-Valt,0lî и Lys106°-Glu'067, соответственно. Формирование устойчивого к дальнейшему протеолизу полипелтида с M 76 кДа происходит путем отщепления N-концевого пептида Ala3,5-Arg358

Ранее при исследовании свойств фрагмента с M 90 кДа было показано, что этот полипептид сохраняет все функциональные свойства интактного фермента. Вопрос о функциональной значимости расщепляемых при образовании фрагмента 90 кДа участков белка до сих пор остается открытым. В отличие от фрагмента с /W 90 кДа, полипептид с M 85

кДа имеет низкую активность и не чувствителен к действию кальмодулина, хотя и сохраняет способность его связывать. Образование фрагмента с М 81 кДа сопровождается утратой способности к связыванию кальмодулина и резким увеличением АТФазной активности, что, как полагают, обусловлено расщеплением участка связывания активатора и аутоингибиторной области фермента.

В то же время фрагмент с М 81 кДа сохраняет чувствительность к действию кислых фосфолипидов. При образовании фрагмента с М 76 кДа способность фермента к регуляции кислыми фосфолипидами утрачивается, что предполагает расщепление соответствующей регуляторной области фермента. Эта область находится в области ТЬг315-Агд358 Выявленный участок предположительно образует амфифильную положительно заряженную а-спираль (рис. 4). Данный участок не имеет аналогов в структуре других АТФаз Р-типа. Амфифильный характер участка, его превалирующий положительный заряд, а также предполагаемая близость к мембране теоретически благоприятствуют его взаимодействию с липидным бислоем, и, в частности, с молекулами кислых фосфолипидов.

Рис. 4. Модель аксиальной проекции а-спирального пептидного участка 339-358 Са2*-АТФазы (изоформа ИРМСА4).

1.2. Получение МА к Са2'-АТФазе плазматических мембран.

Для создания представительной коллекции моноклональных антител к Са2*-АТФазе эритроцитов человека при иммунизации использовали три различных препарата антигена: А — нитроцеллюлозные реплики белковой полосы с М 138 кДа, полученные путем электропереноса из полиакриламидного геля, В — нативный солюбилизированный

фермент, С — денатурированную Са2*-АТФазу в растворе (табл.2). Различные препараты для иммунизации применялись потому, что Са2*-АТФаза плазматических мембран обладает умеренной иммуногенностью, что, возможно, связано с относительно высокой консервативностью строения ее молекулы у млекопитающих. В нативном состоянии, когда белковая молекула имеет определенную конформацию, некоторые антигенные детерминанты могут экранироваться соседними участками полипептидной цепи или детергентом, присутствие которого необходимо для солюбилизации фермента.

Табл. 2. Первичная характеристика МА к Са2*-АТФазе эритроцитов человека.

ПРОТОКОЛ МА Класс и Кафф1 М'' Сохранение эпитопов

ИММУНИЗАЦИИ подкласс после гидролиза

трипсином химотрипсином

А (Фермент, иммобилизованный на нитроцеллюлозе) 1Е4 1дМ 2.6-109 + +

Ю2 1дМ 3.1-109 -

8 (Нативная АТФаза) 5Е6 •6.7-107 -

208 "дб, 5.1-107

С (Денатурированная АТФаза) 7С8 3.2-108 -

8В8 3.8-103 -

2С7 Чдсз, 6.2-107 -

Р9 |дО, 6.5-107 - +

В результате трех гибридизаций были отобраны 8 устойчивых клонов, продуцирующих антитела к Са2*-АТФазе эритроцитов человека. Степень сродства моноклональных антител к нативной и денатурированной Са2*-АТФазе определяли методом ИФА. Все антитела, полученные после гибридизации «А» и «С», обнаруживали более высокое сродство к денатурированной форме фермента; антитела, отобранные после гибридизации В, одинаково связывались с нативной и с денатурированной АТФазой. В созданной коллекции моноклональных антител не было выявлено ни одного антитела, предпочтительно взаимодействующего с нативным ферментом. Определение констант аффинности всех антител с целью стандартизации условий проводилось на денатурированной Са2*-АТФазе. Установленные величины аффинности приведены в табл. 2. Существенные различия аффинности моноклональных антител, очевидно, связаны с протоколом иммунизации и, в частности, с тем, в каком виде антиген попадает в организм иммунизируемого животного.

Для доказательства специфичности моноклональных антител изучали и> взаимодействие с суммарной фракцией белков эритроцитарной мембраны. Все антитела и; нашей коллекции выявляли только белковую полосу с М 138 кДа, что соответствует

молекулярной массе фермента (результаты не представлены). Таким образом, все полученные антитела могут быть использованы в экспериментах как на эритроцитарных везикулах, так и на интактных клетках.

1.3. Тонкое картирование зпитопов МА

Для картирования эпитопа антитела 1Е4 на первом этапе проводили тестирование на реактивность с этим МА продуктов протеолитического расщепления Са2*-АТФазы. Было показано, что среди продуктов ограниченного триптического гидролиза иммунореактивными являются только фрагменты с М 35 и 33.5 кДа. Ранее эти фрагменты были соотнесены с концевой областью АТФазы, на основании чего было сделано заключение о расположении эпитопа МА 1Е4 в пределах 1-312.

Исчерпывающее расщепление протеазой \/8, химотрипсином и идозобензойной кислотой с последующим анализом продуктов расщепления на реактивность с МА 1Е4 позволило сузить рамки эпитопа. Эпитоп оказался чувствителен к расщеплению протеазой \/8, а значит, содержит остатки С1и. При расщеплении иодозобензойной кислотой образуется фрагмент с М 16 кДа. Поскольку Ы-концевой аминокислотный остаток этого фрагмента блокирован, он скорее всего представляет собой Ы-концевую область молекулы белка. Среди продуктов химотриптического расщепления удалось идентифицировать два иммунореактивных фрагмента с М 13.5 и 8.8 кДа, которые в качестве Ы-концевого аминокислотного остатка содержат остаток С1у81 (ИРМСА4).

80 90 100 110

УЕСНЫУ1РРККРКТгЬЕЪУМЕАЬ00УТЬ11ЬЕ1АА1Г31,УЬ

ЬРМСА4

120 133 140 150

ЗЕУКРАСЕЕЫЕЪСС0УАТТРЕ0ЕЫЕА(2АСИ1ЕСАА1ЬГЗУ1 4 2

11РМСА4

130 140 153 160

ЬсУ0РРЕС0ЫАЪССЕ73УСЕЕЕСЕСЕТСИ1ЕСАА1ЪЬЗУУС

11РМСА1

Рис. 5. Синтетические пептиды, использованные для локализации эпитопа МА 1Е4.

1.2

1 4 6

1.0-

0.8

0.6

0.4-

* 3

«-• 5

0.2

Рис. 6. Конкурентный анализ взаимодействия синтетических пептидов с МА 1Е4. МА в концентрации 1.4-10"8 М инкубировали с пептидами в различных концентрациях и затем использовали в ИФА с иммобилизованной Са2*-АТФазой.

Далее эпитоп картировали при помощи анализа синтетических пептидов в конкурентном ИФА, выявляя способность пептидов связываться с МА 1Е4 и таким образом ингибировать его связывание с полноразмерной АТФазой (рис. 5,6). Среди синтезированных пептидов пептиды 1, 4 и 6 не взаимодействовали с МА 1Е4, а оставшиеся пептиды по интенсивности связывания с МА 1Е4 можно выстроить в следующем порядке: 3=5>2. Анализируя приведенные данные, эпитопу МА 1Е4 следует приписать координаты 130-142.

Интересно, что пептид 6, уникальный для изоформы ИРМСА1Ь и перекрывающий область эпитопа МА 1Е4, с антителом не взаимодействовал. Поэтому очевидно, что МА 1Е4 является изоформспецифичным: оно специфично к ИРМСА4 и не распознает ЬРМСА1.

С использованием протеолитического расщепления не удалось картировать эпитопы МА 208 и 8В8, поскольку они оказались чувствительными к обработке трипсином и химотрипсином. Поэтому для характеристики пяти МА против Са2*-АТФазы была использована комбинация комбинаторного и систематического подходов: фаговый дисплей и ИФА рекомбинантных фрагментов Са2*-АТФазы.

Для фагового дисплея (рис. 7) использовали библиотеки случайных гекса- или пентадекапептидов (любезно предоставлены проф. Дж. Смитом). Для пяти МА были получены фаги, специфически связывающиеся с антителами. Для всех МА были также определены последовательности вставок нескольких клонов из последнего тура отбора (4-й тур для пентадекапептидов и 3-й тур для гексапептидов, соответственно) (рис. 8). Во всех случаях можно вывести консенсус, который является общим для гекса- и пентадекапептидов.

'иммобилизация антитела на твердой фазе! J.

¡инкубация с фаговой библиотекой!

1промывка| А

¡злюция связавшихся фагов!

¡инфекция клеток Е. coli i

(несколько туров селекции)

!секвенирование последовательности ДНК вставки индивидуальных клонов

Рис. 7. Стратегия метода фагового дисплея.

; F9 Число клонов 2D8 Число клонов

LLLSS?

"FALLVE- . WRLKDL 1

FAIIVE (■/EVWD L 1

SFACIV GDVKDP 1

PFAYW WEVWAL 2 -

dglpfairplml;;la RACPRDFFDPFCKVL 5

RNSAVYPSCfFSFW [iDGCDL консенсус

PFAeev консенсус

8B8 7C8

IRAKFL

DKTWD DKRSVS YNDGRCVSCIGARRA YNDGRCVTCIGCSSA HLCTSSDK_iVri?FRD HLCSSCDK FVIRFRÜ VDGRPLFHHFAVRSS . DKRPVIRXR 1 1 консенсус FRGAFL YRGVFX WRGVFF WRGPFS RAVYAH KRDPFLGSIGSNRNH CRGVFL ' 2 1 1 1 1 5 консенсус

Рис. 8. Аминокислотные последовательности, выведенные из нуклеотидных последовательностей вставок клонов, отобранных в процессе фагового дисплея. Указано количество идентифицированных клонов. Жирным шрифтом отмечены аминокислотные остатки, совпадающие не менее чем в 2/3 клонов (без учета их частоты). В консенсусы также включены остатки, встречающиеся в более чем 1/3 клонов (курсив). 0 — Гидрофобные остатки (С, Я, I, Ц М, V, \А/, У), П — ароматические (Р. V/, У).

К сожалению, в аминокислотной последовательности Са2*-АТФазы (анализировались последовательности изоформ hPMCAIb и hPMCA4b, содержащихся в эритроцитах человека) не было обнаружено участков, которые можно недвусмысленно соотнести с фаговыми мимотопами всех четырех антител. Таким образом, на первый взгляд нельзя сделать обоснованного заключения о природе взаимодействия антитело - Са2*-АТФазе.

Для того чтобы все же добиться успеха в картировании эпитопов исследуемых МА, в дополнение к фаговому дисплею применен систематический подход — продукция фрагментов Са2*-АТФазы и тестирование их на реактивность с МА. При этом последовательно проводилась экспрессия все более коротких фрагментов — прием, называемый «охотой за эпитопами».

Типичные результаты продукции и очистки рекомбинантных фрагментов Са2*-АТФазы представлены на рис. 9. и в табл. 3. В данной работе использованы векторы для экспрессии в Е. coli, позволяющие получать белки с шестью остатками гистидина на N-конце (серия pQE фирмы Qiagen) с последующей очисткой при помощи металлоаффинной хроматографии.

1 2 3 4 5 6 7

— — 94

I« Z

----™ — 43

— — 30

— 20

— 11

Рис. 9. Экспрессия фрагментов кДНК, соответствующих С-концевым фрагментам Са2*-АТФазы. 1 — белки Е. coli до индукции экспрессии гена, кодирующего РМСА4; 2 — после индукции; 3 — очищенный фрагмент РМСА4; 4,5,6 — аналогично для hPMCAIb; 7 — стандарты молекулярной массы.

ТАБЛ. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПРЕССИИ ФРАГМЕНТОВ РМСА.

я 2 •5 0 Я 3 fr-2 1 о о < у < -э- о Гибрид с * Токсичность нрн экспрессии * * S S 2 Ä = о о о я — ° U ~ 2 -5 - ^ S 3 5 Л з s. а ю и ü * U — - 2 г я

РА2 1-93 4Ь - 3.2 р

PG23 166-371 4Ь - 2.7 р

PN232 166-480 4Ь В + 1.1 HP

PN261 166-238 4Ь в - 3.0 р

PN349 222-267 4Ь в ид 0.9 р

pDU7 222-249 4Ь д. в нд HP

PN279 237-371 4Ь в - 1.4 р

pN307 321-371 4Ь в - 0.7 р

рВМ1 321-371 (V342A) 4Ь в - 0.15 р

PN30P1 321-353 4Ь в - 0.4 р

pN191 330-480 4Ь Д, В ++ 0.06 HP

PN2510 406-682 4Ь в + 0.04 HP

pV5 670-843 4Ь нд 3.7 HP

PN1519 745-924 4Ь д. в + 0.1 HP

PN32A 791-843 4Ь Д, В нд нд HP

PN171 844-1205 4Ь д, в + 0.08 HP

pO* 1057-1205 4Ь - 6.3 p

pAA13 1-98 1Ь нд 0.2 p

pGG6 170-381 1Ь нд нд p

PSAD6 170-281 1Ь В нд нд p

pPG2 280-381 1Ь нд 0.25

PN2815 965-1220 1Ь Д. в +/- 0.1 HP

PE1 1069-1220 1Ь - 0.6 p

Приведены данные по всем фрагментам за исключением тех случаев, когда желаемого белка выделить не удалось. * — Все фрагменты содержат N-концевую последовательность MRGSHHHHHHGS и также могут содержать на N-конце дегидрофолатредуктазу (Д) и небольшое количество аминокислотных остатков, кодируемых полнлинкером (В), как в N-, так и в С-концевой области. * * — после добавления ИПТГ рост клеток: не изменяется (-); несколько замедляется (-/+); сильно замедляется (+); останавливается, идет частичный лизис клеток * * * — при диализе из 6М мочевины против ФСБ белок выпадает в осадок (HP) или не образует заметного преципитата (Р).

Продукция фрагментов, представляющих собой гидрофильные участки Са2*-АТФазы, проходила с высоким уровнем экспрессии а клетках Е. coli, что позволило произвести их эффективную очистку с помощью металлоаффинной хроматографии в денатурирующих

условиях (рис. 9). Напротив, индукция экспрессии фрагментов кДНК, кодирующих трансмембранные участки, приводила к остановке роста клеток, зачастую с их частичным лизисом и низкой продукцией белка, который невозможно было обнаружить при помощи гель-электрофореза клеточных лизатов. Выход и чистота таких фрагментов обычно оказывались неудовлетворительными. Эти проблемы были частично решены при помощи присоединения фрагментов к С-концу дегидрофолатредуктазы и введения детергентов во время очистки.

Результаты ИФА по связыванию МА с различными фрагментами Саг*-АТФазы показаны на рис. 10. В качестве положительного контроля использовали поликлональные куриные антитела к Са2*-АТФазе эритроцитов и биотинилированный кальмодулин, который реагирует с С-концевым доменом фермента.

л ,

МА.7С8 , МЛ.8В8 МЛ.зря „

Й С

Рис. 10. Взаимодействие мопо- и поликлональных антител и кальмодулина с фрагментами ИРМСА1 и ЬРМСА4 в непрямом ИФА. Слева направо: фрагменты 11РМСА4; фрагменты ИРМСА!: РМСЛ трпгроцитов человека н кролика (НРМСА и кр. РМСЛ).

Согласно результатам ИФА, эпитоп МА 5Е6 находится в пределах 791-843 аминокислотной последовательности hPMCA4 . Это консервативный участок, поскольку 5Е6 реагирует и с Са2*-АТФазой эритроцитов кролика. Для картирования эпитопа MA 5Е6 применен также фаговый дисплей. В результате идентифицированы два клона, вставки которых кодируют два пентапептида, специфически связывающие МА 5ES: GLFVGSWGVGSAEHP и QWGSLFVSPYPVIML. Выравнивание этих последовательностей дает три типа консенсуса (LFV, GSXXV, WGX5.6P), которые все же не могут быть однозначно выравнены ни с каким фрагментом Са2*-АТФазы. Существование нескольких типов консенсуса фаговых пептидов позволяет предположить, что эпитоп имеет интегральную природу, т.е. MA 5Е6 реагирует с двумя пространственно сближенными участками в пределах локализованного фрагмента. Детальная идентификация такого эпитопа представляет собой нетривиальную задачу.

МА 8В8 и 7С8 реагируют с одним и тем же фрагментом hPMCA4 (330-353), который перекрывается с сайтом связывания кислых фосфолипидов. Однако, полученные для МА 8В8 и 7С8 фаговые мимотопы (рис. 8) совершенно различны, следовательно, специфичность этих МА также различна, несмотря на перекрывание их эпитопов в аминокислотной последовательности Са2*-АТФазы. Эти МА распознают четвертую, но не первую изоформу и, кроме того, не реагируют с Са2*-АТФазой эритроцитов кролика (рис. 10). Выравнивание консенсуса фаговых мимотопов МА 8В8 с некоторыми известными аминокислотными последовательностями этого участка Са2*-АТФазы показано на рис. 11. При этом важно отметить, что ключевыми остатками эпитопа являются D, К,, и V. Роль последнего подтверждена при помощи сайт-направленного мутагенеза. Мутация V342Á-(конструкция рВМ1, табл. 3) приводит к прекращению связывания МА 8В8, в то время как для МА 7С8 взаимодействие сохраняется. В этом положении именно остаток Val характерен для аминокислотной последовательности hPMCA4, в то время как остаток. Ala — для других изоформ и РМСА4 крысы, поэтому 8В8 следует считать изоформ- и видоспецифичным МА (хотя нельзя полностью исключить возможность реактивности с изоформами hPMCA2 и ИРМСАЗ). В то же время идентифицированный эпитоп не позволяет произвести сколько-нибудь убедительного выравнивания с фаговыми мимотопами МА 7С8. Интересно, что такое выравнивание вполне может быть произведено с С-концевым кальмодулин-связывающим фрагментом Са2*-АТФазы, с которым антитело совершенно не реагирует. Известно, что кальмодулин с низкой аффинностью распознает синтетический пептид, представляющий собой часть фосфолипид-связывающего сайта. Таким образом, пространственная структура этих участков (предположительно это a-спирали) может быть сходной. Также обращает на себя внимание, что наличие двух дополнительных регуляторных участков - характерная структурная черта Са2*-АТФазе, отличающая ее, например, от Са2*-АТФазы сарко- эндоплазматического ретикулума.

О К R X V I R X R Консенсус i мимотопов

335- Е Е К D К К А V К V Р К К hPMCA4

335- Е Е К Е К К А S К G Р К К РМСА4 крысы

245-• , D Е к D к К К А N L Р •К К. hPMCAI

371- D - - D R К К А S М н К К hPMCA2

343- Е Е R Е К К К А N А Р К к hPMCA3

Рис. 11. Выравнивание аминокислотных последовательностей консенсуса фаговых мимотопов MA 8В8 и фрагментов четырех изоформ Са2*-АТФазы человека и РМСА4 крысы. Курсивом выделены идентичные аминокислотные остатки. Остаток Val342 hPMCA4 подчеркнут.

Эпитоп антитела 2D8 находится в районе 222-249; дальнейшая фрагментация приводит к потере взаимодействия с антителом (конструкции pN261 и pN279, содержащие только половину этого фрагмента, табл. 3). MA 2D8 реагирует с фрагментами hPMCAI и hPMCA4,"a также и с Са2*-АТФазой, выделенной из эритроцитов кролика. Учитывая высокую консервативность этого участка (рис. 12), можно достаточно обоснованно предполагать, что МА способно распознавать все изоформы Са2*-АТФазы различных видов животных. .Особенностью этого эпитопа с функциональной точки зрения является его расположение в гипотетическом домене трансдукции, ответственном з? сопряжение гидролиза АТФ и переноса ионов кальция; предсказание вторичной структуры говорит о том, что данный регион представляет собой пучок р-листков [455].

-DGILIQGNDLKIDESSLTGESDHVK- 1 -DGLFIQGNDLKIDESSLTGESDQVR- 2 -DGILIQGNDLKIDESSLTGESDHVR- 3 -DGILIQGNDLKIDESSLTGESDHVK- 4 WDQQDL

Рис. 12. Выравнивание аминокислотных последовательностей четырех изоформ Са2*-АТФазы в районе истинного эпитопа MA 2D8, сравнение с последовательностью консенсуса фаговых мимотопов. Неконсервативные остатки подчеркнуты. 1.3. Мембранная топология молекулы Са2'-АТФазы

1.3. Мембранная топология молекулы Са2"-АТФазы

Определение ориентации эпитопов Саг*-АТФазы относительно плазматической мембраны. На начальном этапе топографических исследований необходимо было выяснить, с какими участками интегрального белка — внеклеточными, цитоплазматическими или внутримембранными — связывается каждое конкретное антитело. С этой целью изучали взаимодействие МА с интактными эритроцитами человека и инвертированными эритроцитарными везикулами. Образование иммунных комплексов детектировали с помощью радиоактивно меченных 1251 вторичных антител. Семь из восьми МА связывались о инвертированными везикулами и лишь одно антитело (1Е4) . взаимодействовало с интактными эритроцитами. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что эпитоп, распознаваемый антителом 1Е4, расположен на внешней поверхности клетки, а эпитопы других антител ориентированы в цитоплазму.

8В8, 7С8

208

гЬ 1Е4

Рис. 13. Схема трансмембранной организации молекулы Са2*-АТОазы. Участки молекулы, реагирующие с охарактеризованными МА, показаны стрелками.

Мембранная топология ионтранспортирующих систем обычно предсказывается на основании анализа профилей гидрофобности, и только в ряде случаев удается найти экспериментальное подтверждение этим моделям. Получить МА, распознающее внеклеточный эпитоп - особенно редкая удача, поскольку подавляющее большинство антител направлено к внутриклеточным участкам. Сочетание результатов картирования эпитопов, которые позволили его локализовать в участке последовательности в 13 а.о., с данными по внеклеточному его расположению в интактном ферменте позволяет впервые найти экспериментальное подтверждение топологической модели фермента в его N-концевом участке, а именно локализацию первых двух трансмембранных участков. В сочетании с данными по другим МА получается, что топологическая модель фермента верна по-крайней мере для его N-концевой половины (рис. 13),

МА 1Е4 представляет собой удобный инструмент для изучения распределения Са2*-АТФазы в интактных тканях млекопитающих и для топографических исследований. Остальные антитела, взаимодействующие с цитоплазматическими доменами фермента, также могут быть использованы в экспериментах по изучению топографии Са2*-насоса, его функционально важных областей, их взаимного расположения и влияния.

Влияние моноклональных антител на активность Фермента. Для изучения функциональных свойств фермента, взаимного расположения и взаимодействия его функционально важных участков представлялось целесообразным выявить антитела, влияющие на активность Са2*-АТФазы. С этой целью проводили измерения базальной и кальмодулинзависимой АТФ-гидролазной активности Са2*-АТФазы очищенного солюбилизированного препарата фермента после предварительной инкубации со специфическими антителами и нормальными иммуноглобулинами мыши (последние использовались в качестве контроля). МА 7С8, полученное после иммунизации денатурированным ф?рментоМ в растворе, вызывало увеличение базального и кальмодулинзависимого компонента активности фермента соответственно в 2,1 и 1,3 раза. Предложенная Карафоли схема активации Са"-АТОазы предполагает, что кальмодулин и другие регуляторы, связываясь с АТФазой в определенных участках, вызывают конформационные изменения ее молекулы, облегчающие доступ субстрата к активному центру фермента. Активирующее влияние моноклональных антител также может быть объяснено с этих позиций. Интерпретировать активирующее влияние МА 7С8 на Са2*-АТФазу и отсутствие такого влияния в случае других антител особенно интересно с учетом знания эпитопов этих антител. Эпитоп МА 208 локализован в районе 222-249 (в предполагаемом домене трансдукции), эпитопы МА 8В8 и 7С8 — в районе 330-353 (в сайте связывания кислых фосфолипидов), МА 5Е6 — в районе 791-843 (в предполагаемом шарнирном регионе), а эпитоп МА 1Е4 — в районе 130-142 (в первой внеклеточной петле).

В этой связи легко объяснить активирующий эффект МА 7С8, которое по всей видимости, связываясь с Са-АТФазой, вызывает эффект, подобный действию фосфолипидов, - давно известных активаторов фермента. Также легко понять отсутствие влияние МА 1Е4, которое связывается со стороны, противоположной активному центру. В то же время несколько сложнее объяснить отсутствие эффекта других антител, которые также должны связываться с функционально важными участками. Наиболее вероятно, что, несмотря на тот факт, что молекула иммуноглобулина весьма велика, в случае этих антител их связывание все же не оказывает влияния ни на способность связывать субстрат, ни на способность претерпевать необходимые конформационные изменения 8 ходе рабочего цикла.

2. Н*-транспортирующая никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа

(Н+-трансгидрогеназа)

2.1. Разработка нового метода очистки hf-трансгидрогеназы £ coli

Для получения специфических моноклональных антител к Н*-трансгидрогеназе возникла необходимость получения высокоочищенных препаратов фермента. Для этого был разработан новый способ аффинной очистки рекомбинантных белков, основанный на использовании свойства С-концевого фрагмента Са2*-АТФазы плазматических мембран связывать кальмодулин в присутствии ионов кальция.

Нами был создан гибридный белок, содержащий С-концевой фрагмент Са2*-АТФазы, присоединенный к С-концевой области ß-субъединицы Н*-трансгидрогеназы. Для этого сначала был модифицирован вектор pSA2 для экспрессии Н*-трансгидрогеназы дикого типа при помощи молчащего сайт-направленного мутагенеза. Полученная конструкция содержала новый сайт узнавания рестриктазы Hind III, позволяющий подстраивать любые фрагменты к С-концевому участку гена, кодирующего ß-субъединицу Н*-трансгидрогеназы. Затем в это положение произведена вставка олигонуклеотида, кодирующего пептид ^ сайт^ связывания кальмодулина hPMCA4b (30 а. о.) (конструкция рНЕК). Другая конструкция, pHEG, была создана сходным путем, но в отличие от первой она содержала весь С-концевой фрагмент изоформы hPMCA4b (150 а.о.). Эта изоформа была выбрана потому, что продукция ее С-концевого фрагмента проходила с гораздо более высоким выходом, чем в случае изоформы hPMCAIb.

Лизат клеток Е. coli TG-1, несущих конструкцию pHEG, дал 40% трансгидрогеназной активности от дикого типа, тогда как в клетках, трансформированных плазмидой рНЕК, трансгидрогеназная активность отсутствовала. Иммуноблоттинг общего клеточного белка с биотинилированным кальмодулином и антителами, специфичными к а-субъединице Н*-трансгидрогеназы, представлен на рис. 13. В случае Е. coli TG-1/pHEG был обнаружен продукт экспрессии с М 67 кДа, реагирующий с кальмодулином. Однако в случае £ coli TG-1/рНЕК не удалось детектировать белковых продуктов, которые отсутствовали бы в клетках дикого типа. В то же время экспрессия а-субъединицы Н'-трансгидрогеназы не нарушена в клетках, содержащих обе конструкции.

При очистке химерного белка HEG решающее значение для чистоты продукта имел выбор детергента. Оптимальные результаты были получены с использованием смеси бриджа-35, холата и дезоксихолата. В таких смешанных детергентных мицеллах химерный белок эффективно сорбировался на кальмодулин-сефарозе в присутствии ионов Ca2* и элюировался EDTA.

Табл. 4. Очистка химерного белка HEG

Фракция Выход белка, мг Общая Удельная Обогащение,

активность, % активность, мкмоль'мг'''мин"1 раз

Мембраны 41 100 0.86 1

Солюбилизован 25 45 0.63 0.75

ные белки

Несолюбилизов 17 15 0.34

энные белки •.

Проскок -■ 8 -

Элюат 0.58' 18 10.8 12.5

12 3 4

_Mf::

Рис. 14. Электрофоретический анализ чистоты химерного белка HEG (С-концевой домен ЬРМСА4Ь-трансгидрогеназа Е. coli). 1 — стандарты молекулярной массы, 2 — мембраны Е. coli, содержащие Н*-трансгидрогеназу дикого типа (продукт экспрессии плазмиды pSA2), 3 — мембраны, содержащие продукт экспрессии плазмиды pHEG, 4 — продукт HEG, очищенный аффинной хроматографией.

Электрофореграмма мембранных белков Е. coli и очищенного продукта HEG показана на рис. 14, а обобщение результатов очистки — в табл. 4. Чистота полученного продукта оказалась сравнимой с чистотой гексагистидинсодержащей Н*-трансгидрогеназы, (очищенной при помощи металлоаффинной хроматографии) и существенно выше, чем

чистота Н*-трансгидрогеназы дикого типа (очищенной при помощи ионообменной хроматографии). Хотя на электрофореграммах все эти препараты выглядят довольно чистыми (результаты не представлены), на рис. 15 видно, что Н'-трансгидрогеназа дикого типа, очищенная без применения аффинных взаимодействий, содержит примесь неизвестного бактериального белка с молекулярной массой примерно такой же, как и у р-субъединицы Н'-трансгидрогеназы. Примесь этого белка отсутствует в препаратах НЕС.

Таким образом, за одну хроматографическую стадию представилась возможность получать высокоочищенный препарат химерной Н'-трансгидрогеназы. Достоинства и недостатки аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе и столь широко используемой ныне металлоаффинной хроматографии . различны. Несомненным преимуществом последней является небольшой размер аминокислотой последовательности, добавляемой к целевому продукту. В случае Н'-трансгидрогеназы присоединение гексагистидиновой последовательности к 1\1-концу ее р-субъединицы не приводит к понижению уровня продукции целевого белка, чего, к сожалению, не удалось избежать в случае НЕв. Однако очистку на иммобилизованном кальмодулине можно проводить в строгих восстановительных условиях (в присутствии ДТТ), что может быть полезным для многих ферментов. Хотя Н'-трансгидрогеназа и не имеет функционально важных остатков Суэ, в качестве примера достоинства полученного химерного белка можно привести тот факт, что по неизвестной причине очищенная (но не мембранносвязанная) металлоаффинной хроматографией Н'-трансгидрогеназа очень быстро теряет активность при хранении. Очищенный продукт экспрессии конструкции рНЕв лишен этого досадного недостатка.

1 2

Рис. 15. Иммуноблоттинг очищенных препаратов Н*-трансгидрогеназы. 1 — Н'-трансгидрогеназа дикого типа, очищенная при помощи ионообменной хроматографии, 2 — химерный белок HEG, очищенный аффинной хроматографией на кальмодулине. Использовалось МА 1D6, распознающее неидентифицированный белок Е. coli.

Данная работа — первый пример практического использования аффинной хроматографии на кальмодулине для очистки химерного мембранного белка, продуцированного в бактериях. Хотя сама идея использования взаимодействий кальмодулина и его мишеней для очистки рекомбинантных белков была предложена достаточно давно, метод долго не находил широкого применения. В настоящее время данный подход усиленно рекламируется фирмой «Stratagene», которая продает несколько конструкций для создания и очистки химерных белков с коротким кальмодулин-связывающим пептидом киназы легкой цепи миозина. Однако в случае Н'-трансгидрогеназы использование аналогичного подхода (конструкция рНЕК) оказалось совершенно неудовлетворительным. Введение в С-концевую область ß-субъедиНицы небольшого положительно заряженного фрагмента могло фатально повлиять на фолдинг и взаимодействие субъединиц Н'-трансгидрогеназы. В то же время использование длинного фрагмента (конструкция pHEG) позволило провести успешную продукцию и очистку химерного фермента. Возможно, решающую роль сыграло то, что С-концевой фрагмент Са2'-АТФазы (150 а.о.) «стабилизирован» по заряду (его pl и pl Н'-трансгидрогеназы примерно равны 5.5).

2.1. Изучение структурно-функциональной организации Н'-трансгидрогеназы Е. coli при помощи ингибирующих антител

Для получения библиотеки моноклональных антител использовали очищенный препарат химерной Н'-трансгидрогеназы. Было получено несколько клонов, три из которых обнаружили интересное свойство - в ИФА они реагировали только с нативным белком, и совершенно не давали ответа в том случае, когда субъединицы фермента были физически разделены. Этот факт указывает на то, что эпитопы антител имеют конформацию, чувствительную к денатурирующим воздействиям. Также можно предположить, что эти эпитопы имеют интегральную природу и составлены из участков разных субъединиц Н'-трансгидрогеназы. Данные антитела также не оказывали видимого влияния на работу фермента.

Клон (2G10) оказался наиболее интересным. Прежде всего, стало ясно, что антитело специфически распознает домен I. Но наиболее важным является тот факт, что после инкубации высокоочищенного иммуноглобулина с ферментом активность последнего полностью пропадает.

Это явление было изучено более подробно. Оказалось, что антитело 2G10 ингибирует все известные виды активности Н'-трансгидрогеназы в одинаковой мере Ингибирование активности на 50% наблюдалось при различных молярных соотношениях фермент/антитело очищенной, солюбилизированной или мембраносвязанной Н'-трансгидрогеназы, а также при использовании полноразмерного (бивалентного)

иммуноглобулина и Ра„ (моновалентного) фрагмента (рис. 16, табл. 5) Эти результаты можно интерпретировать следующим образом: • антитело, связываясь с одной а-субъединицей, вызывает 100% (или почти 100%) ингибирование сф-протомера Н'-трансгидрогеназы, причем такое связывание не оказывает влияния на каталитическую активность другого протомера в сс2р2-структуре Н'-трансгидрогеназы. Т.е. протомеры Н*-трансгидрогеназы проявляют каталитическую активность независимо друг от друга. Сравнение результатов ингибирования 1дС и Ра0 указывает на то, что в солюбилизированном виде антитело способно связать две молекулы Н'-трансгидрогеназы. В случае мембраносвязанной Н'-трансгидрогеназы ситуация совершенно другая, при этом один из антигенсвязывающих центров 1дО остается незанятым. Кроме того, эти результаты указывает на то, что ингибирование не может происходить вследствие преципитации Н'-трансгидрогеназы.

Табл. 5. Отношение фермент/антитело, необходимое для 50% ингибирования активности

фермента

мембраны солюбилизированный фермент

IgG 2:1 4:1

Fab 2:1 2:1

На эффект ингибирования не оказывает влияния концентрация субстратов, присутствие протонных ионофоров, не наблюдается аддитивности при ингибировании пальмитоилкоэнзимом А.

Для проверки гипотезы о том, что антитело взаимодействует с субстрат-связывающим центром молекулы фермента, был получен комплекс Н'-трансгидрогеназа-антитело, который затем исследовали при помощи равновесного диализа. Оказалось, что константы диссоциации и NADH, и NADPH одинаковы для нативного фермента и неактивного комплекса фермента с антителом. Таким образом, механизм ингибирования не связан с затруднением связывания субстратов. Очевидно, потерю активности фермента следует объяснять тем, что массивная молекула иммуноглобулина, связавшись с молекулой фермента, препятствует необходимому для проявления ферментативной активности конформационному изменению последнего.

Картирование эпитопа МА 2G10 было проведено при помощи комбинации протеолитического расщепления Н'-трансгидрогеназы и продукции ее рекомбинантных фрагментов с последующим ИФА. Показано, что эпитоп имеет интегральную природу и состоит из двух участков полипептидной цепи, находящихся в пределах 5-15 и 65-79, соответственно, причем в эпитопе имеются ключевой остаток Arg9, замена которого на остаток Cys приводит к потере способности эпитопа связывать антитело (рис. 17).

Учитывая данные, полученные другими исследователями. по трансмембранной топологии Н*-трансгидрогеназы, пространственному строению домена III и аланиндегидрогеназы (фермент, гомологичный домену I !-Г-трансгидрогеназы), а также зная расположение эпитопа ингибирующего МА, нами предложена модель расположения доменов Н*-трансгидрогеназы относительно друг друга (рис. 18). Согласно этой модели антитело связывается с участком домена I. Поскольку молекула иммуноглобулина достаточно массивна, то создаются пространственные препятствия для взаимодействия доменов I и III, а также затрудняется сближение никот^инамидных колец субстратов Н*-трансгидрогеназы. Интересно, что эпитоп MA 2G10 располагается в участке, гомологичном сайту связывания субстратов аланиндегидрогеназы (пируват, аммоний, аланин), в котором некоторые остатки Arg высококонсервативны. Н'-Трансгидрогеназа не обладает способностью связывать субстраты аланиндегидрогеназы, однако архитектура домена I очень напоминает аланиндегидрогеназу, что, возможно, обуславливает также и нечто общее в механизме работы, например, в междоменных взаимодействиях. В случае Н*-трансгидрогеназы механизм работы более сложен, поскольку предполагает участие еще двух доменов.

Рис. 16. Ингибирование активности Н*-трансгидрогеназы Е. coli МА 2G10. По оси абсцисс - количество МА в процентах от количества фермента, по оси ординат - активность трансгидрогеназы в процентах.

mrigipre|r]l tnetrvaatp ktveqllklg ftvavesgag qlasfddkaf

vqagaeiveg nsvwqseiil kvnaplddei allnpgttlv ~

Рис. 17. Эпитоп МА 2G10. Показана N-концевая последовательность а-субъединицы Н*-трансгидрогеназы Е. coli. Подчеркнуты участки, формирующие эпитоп МА, Arg9 выделен.

Ы/\Е)( И)-связываюшис домены

опитоп ингноирующего антитела 2010

ЫАОР(Н)-связываюшие домены

Рис. 18. Модель расположения доменов трансгидрогеназы относительно мембраны, а также взаимодействия фермента с ингибирующим антителом 2С10.

Таким образом, использование МА как секвенс-специфичного инструмента позволяет зондировать поверхность мембранных ферментов в поисках функционально важных участков. Такие эксперименты очень важны ввиду трудностей, связанных с определением структуры интегральных мембранных белков методом рентгеноструктурного анализа, и еще больших трудностей в изучении конформационных изменений, сопровождающих работу таких сложноорганизованных ферментов.

3. Н+,К+-АТФаза нежелудочного типа

3.1. Получение моно- и поликлональных антител к a-субъединице гипотетической hT.lC-АТФазы человека, кодируемой геном atp1al1.

Удобным инструментом детекции и выделения гипотетических белков могут стать специфические антитела. Основной целью нашей работы являлось получение МА, специфичных к гипотетическому белку ATP1AL1. В качестве антигена был выбран фрагмент Ser,4-lle104 этого белка, который имеет низкий уровень гомологии с другими АТФазами Р-типа. Соответствующий участок кДНК клонировали в вектор pQE30, в результате чего была получена конструкция рНЗО, обеспечивающая синтез белка с последовательностью (His)s в N-концевой области. Затем вставка из плазмиды рНЗО была субклонирована в вектор pQE16 для получения белкового продукта без дополнительных остатков His (конструкция pTL16/1).

Очищенный металлоаффинной хроматографией белок НЗО использовали в качестве антигена для иммунизации мышей и скрининга гибридомных клонов. Выло отобрано пять стабильных гибридомных линий, из которых 2Н11 и 1АЗ продуцируют антитела класса IgM, а три другие (В11, Е11 и ЗН5) — IgG. Полученные антитела реагируют в ИФА: 1}с исходным антигеном; 2)с лизатом клеток Е. coli, содержащим белковый продукт, кодируемый pTL16/1; 3)с препаратом мембран клеток Sf-9, продуцирующих полноразмерный рекомбинантный белок ATP1AL1; но не проявляют взаимодействия: 1) с Ыа.К-АТФ-азой; 2) с химерным белком, состоящим из TNF и фрагмента Ser'4-Leu""; и 3) с контрольным белком, содержащим последовательность (H¡s)5 в N-концевой области — фрагментом Са:*-АТФазы плазматических мембран человека. При использовании полученных антител для детекции белка ATP1AL1 в иммуноблоттинге оказалось, что антитела IgM не взаимодействуют с полноразмерным белком, в то время как IgG дают прекрасную реактивность, т.е. могут быть использованы для детекции как нативного, так и денатурированного белка. Полученные МА были наработаны в большом количестве в асцитах мышей, очищены и иммобилизованы на сефарозе.

Кроме того, получены поликлональные антитела к фрагментам ATP1AL1 человека и крысы. Для получения поликлональных антител нами была выбрана курица, как наиболее экономичный источник антител: в каждом курином яйце содержится столько же антител, как и в 50 мл крови, взятой от кролика. Куриные антитела были очищены при помощи аффинной хроматографии на иммобилизованном антигене. Приятной неожиданностью для нас оказалось то, что куриные антитела, в отличие от кроличьих и мышиных не реагировали с №*,К*-АТФазой.

В предварительных экспериментах антитела были использованы в иммуноблоттинге с целью определения наличия и относительного содержания ATP1AL1 в различных

препаратах плацентарных мембран, таких как микровилли и базальный синцитиотрофобласт, а также и в препаратах мембран мозга человека. Выбранную мембранную фракцию солюбилизировали в буфере, содержащем тот или иной детергент, а затем проводили иммуноаффинную хроматографию на носителе с иммобилизованными антителами. Полученные образцы анализировали SDS-ПААГ-электрофорезом с последующим иммуноблоттингом с использованием поли^ и моноклональных антител, отличных от используемых для выделения. Показано, что содержание ATP1AL1 в плаценте настолько мало, что невозможно осуществить выделение даже в количестве, достаточном для иммунохимической детекции.

Казалось бы, что выделение ATP1AL1 при помощи выбранной стратегии крайне затруднено, поскольку только плацента и кровь являются легкодоступными тканями человека, а использование других тканей животных в нашем случае невозможно, так как полученные антитела видоспецифичны. Однако при первом же эксперименте с использованием микросом мозга человека удалось впервые показать принципиальную возможность выделения полноразмерного ATP1AL1 при помощи иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованном моноклональном антителе Е11. К сожалению, ограниченная доступность свежих тканей человека серьезно затруднила возможность оптимизации процедуры выделения, поэтому пока удалось выделить только следовые количества искомой АТФазы.

3.2. Исследование тканеспецифичности экспрессии гена atp1al1.

Тканевая специфичность экспрессии гена atplall в органах человека и животных была подробно изучена при помощи метода обратной транскрипции-ПЦР. Праймеры для амплификации были сконструированы на основе анализа попарных выравниваний последовательностей кДНК изучаемых видов (мышь, крыса, кролик, собака и человек).

Результаты изучения транскрипционной активности гена atplall представлены на рис. 19. Среди исследованных органов мыши экспрессия соответствующего гена была детектирована не только в прямой кишке, но также в коже, женских репродуктивных органах (влагалище, матка и яичники) и мозге. В случае сердца, печени, щитовидной и слюнных желез результаты оказались отрицательными. В тканях крысы транскрипты atplall были уверенно детектированы в прямой кишке, коже, легком и почке. Экспрессия гена не была обнаружена в скелетных мышцах (диафрагма и смесь лимбических мышц), тимусе, надпочечниках, неонатальном желудке и поджелудочной железе, а также в мозге взрослого животного. Наиболее интересным оказалось обнаружение мРНК. соответствующей гену atplall, в мужской урогенитальной системе. Следовая экспрессия наблюдалась во многих секциях, но сильный сигнал был обнаружен только в коагулирующей и препуциевой железах.

I 2 3 4 3 ь т ■ 9 1» II 12 13 14131*

Рис. 19. Анализ тканеспецифичной экспрессии гена э(р1э/1 в тканях нескольких видов млекопитающих при помощи метода обратной транскрипции-ПЦР. А - Продукты амплификации кДНК АТР1А1.1. В -Контрольная амплификация кДНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. 1а. Мышь: 1 - мозг, 2 -подчелюстная железа, 3 - щитовидная железа, 4 - сердце, 5 - печень, 6 - поджелудочная железа, 7 -слизистая желудка, 8-слизистая прямой кишки, 9 - яичник и яйцевод, 10-матка, 11 -влагалище, 12

- семенник, 13 - придаток семенника и дополнительные мужские половые железы, 14 - пенис, 15 -кожа, 16 - фрагменты риС18/Н/л1 I. 1Ь. Крыса: 1-9 - ткани взрослого животного, 10-14 - ткани новорожденного животного. 1 - кожа. 2 - скелетные мышцы, 3 - мозг, 4 - щитовидная железа, 5 -диафрагма, 6 - легкое, 7 - сердце, 8 - надпочечник, 9 - почка, 10 - желудок, 11 - поджелудочная железа, 12 - кожа, 13 - скелетные мышцы, 14 - мозг. 1с. Мужская урогенита/ъная система крысы: 1 -«лесенка» 100 п.о., 2 - мочевой пузырь, 3 - семенник, 4 - голова придатка семенника, 5 - хвост придатка, 6 - семяпровод, 7 - везикулярная железа, 8 - вентральная простата, 9 - коагулирующая железа, 10 - бульбоуретральная железа, 11 - уретра, 12 - препуциевая железа. 1(). Крогик: 1 - кора мозга, 2 - белое вещество, 3 - обонятельные луковицы, 4 - хороидальное сплетение, 5 - тапамус, 6 -гипоталамус, 7 - ствол мозга,.8 - сетчатка, 9 - сердце, 10 - почка, 11 - печень, 12 - поджелудочная железа, 13 - слизистая желудка, 14 - слизистая прямой кишки, 15 - пенис, 16 - кожа (спина), 17 - кожа (морда), 18 - фрагменты р11С18/Н//й I. 1е. Чепсеек: 1 - клетки САСО-2, 2 - мозг, 3 - почки, 4 - печень, 5

- плацента, 6 - слизистая сигмовидной кишки. Собака: 7. - почка

Среди тканей кролика значительный уровень мРНК, соответствующей данному гену, был обнаружен в прямой кишке, коже и почке. Слабые сигналы были детектированы в мозге, сетчатке и поджелудочной железе. Печень, слизистая желудка и сердце дали отрицательный результат. Для более подробного анализа мозг кролика был разрезан на несколько частей, и экспрессия данного гена была обнаружена в хороидальном сплетении и

4 5 6

Рис. 20. Иммунодетекция Н,К-АТФазы нежелудочного типа в различных тканях крысы. Мембранные белки соответствующих тканей анализировали при помощи иммуноблоттинга со специфическими поликлональными антителами к Ы-концевому фрагменту исследуемого фермента. 1- почка, 2 - коагулирующая железа, 3 - вентральная простата, 4 - препуциевая железа, 5 - эпителий прямой кишки. Полоса А является результатом неспецифичного взаимодействия вторичных антител, полоса В соответствует А(р1а11.

В тканях человека мРНК присутствует в значительных количествах в коже и почке, в меньших - в мозге и плаценте, в следовых - в сигмовидной кишке и полностью отсутствует в печени. Кроме того, была также обнаружена мРНК в почке собаки.

Таким образом, за некоторыми исключениями, транскрипционная активность а1р1а!1 у различных видов млекопитающих имеет весьма сходный характер. Поэтому можно сделать вывод, что справедлива наша гипотеза о том, что все белки, кодируемые известными транскриптами, следует рассматривать как одну изоформу, а не как 4 разных изоформы, как предполагалось ранее на основании ограниченных несистематизированных данных по тканеспецифичности экспрессии.

коре, но не в стволе и не в белом веществе полушарий.

А В

***** 1м» 4М*

Ль

Рис. 21. Иммуногистохимический анализ коагулирующей железы на наличие продукта экспрессии гена а(р1а!1 (Н'.К'-АТФазы нежелудочного типа). Срез ткани инкубировали со специфическими поликлональными антителами к Ы-концевому фрагменту исследуемого фермента, а затем - с меченными флуоресцеином вторичными антителами.

Кроме того, подобные исследования были также проведены и на уровне белка гтри помощи иммуноблоттинга. На рис. 20 представлены результаты такого эксперимента по детекции белка АТР1АЫ в тканях крысы. Видно, что наибольший уровень экспрессии имеется в коагулирующей железе, затем в порядке убывания следуют эпителий прямей кишки, прелуциевая железа, почка. Вызывает удивление присутствие значительных количеств белка з коагулирующей железе и его полное отсутствие в вентральной простате, потому что эти две железы являются частями единого комплекса простаты. Таким образем, экспрессия имеет характер, специфичный к долям простатного комплекса. Чтобы определить локализацию белка более точно, использовали также иммуногистохимичесхсе окрашивание (рис. 21). Видно, что антитела специфически связываются с клетками выстилающими люминальную поверхность, причем такой поверхностный характер мече-ия указывает также на апикальную локализацию белка. Это согласуется также с даннь.ми других исследователей, обнаруживших белок в апикальных мембранах клеток прямой кишки Учитывая также данные по изучению функциональной экспрессии в ооцитах и

клетках млекопитающих следует сделать вывод, что данный ген кодирует апикальную К" К'-АТФазу, которую следует называть Н*,К*-АТФазой нежелудочного типа.

4. Каталитическая субъединица Ма\К+-АТФазы

4.1. Проблема трансмембранной топологии С-концевой половины а-субъединицы Л/а", К*-АТФазы

На рис. 22 показан профиль гидрофобное™ а-субъединицы №*,К*-АТФазы. Данный фермент имеет восемь гидрофобных участков, причем участок 3 имеет длину достаточную, чтобы вместить в себя две трансмембранные а-спирали. Наличие в Ы-концевой половине фермента четырех трансмембранных сегментов, соединяющих три больших внутриклеточных домена, хорошо предсказывается при помощи такого анализа гидрофобности и полностью согласуется с огромной массой информации о Ма'Х-АТФазе.

В то же время не вполне ясно количество и расположение трансмембранных (а соответственно, вне- и внутриклеточных) участков в С-концевой части фермента. Предложенные различными исследователями модели представлены на Рис. 23.

Для того, чтобы определить какая из данных моделей наиболее приближена к истине, было предпринято исследование топологии фермента с использованием антител с предопределенной специфичностью, полученных к отдельным участкам фермента.

, 190 21)0 З90 -490 590 69О 79О

-4.5_|

1 2

4 5 6 7 8

Рис. 22. Профиль гидрофобности а-субъединицы №*,К*-АТФазы по Кайту-Дулитлу с использованием окна в 13 аминокислотных остатков.

"aVtF ^ г-

К' щф jffiÄi

! N

H.'-l с

i -I ?

%—i ir

' ¡'III. Ш

Рис. 23. Предложенные разными исследователями модели мембранной топологии а-субъединицы Ыа*,Ю-АТФазы (из обз0р'а'""'Аристархсвсй и Свиднер). Выделены участки, исследованные в данной работе.

4.2. Получение библиотеки антител, специфичных к участкам a-субъединицы Na',K-АТФазы.

■ Для продукции '¿гнтйтёл', "с'пеЦифичнб!*" к различным участкам полипептидной цепи белка, была осуществлена продукция фрагментов а-субъединицы Ыа*,К*-АТФазы свиньи, соответствующих аминокислотным последовательностям с координатами 541-589, 825-842, 868-886, 928-945, 946-967 и 962-978. Каждый из шести выбранных фрагментов а-субъединицы был синтезирован в клетках Е. coli в виде гибридных белков с фактором некроза опухолей человека (TNF). Гибридные белки накапливались в клетках в виде телец включения. Для предварительной очистки гибридных белков использовали последовательную экстракцию белков из телец включения гидрохлоридом гуанидина повышающейся концентрации -1 М, 3 М и 5М. При очистке всех шести гибридных белков основная их часть освобождалась из телец включения в результате экстракции 5 М гидрохлоридом гуанидина. В качестве заключительной стадии очистки использовали гель-фильтрацию на колонке TSK-G 3000 SWG в буфере, содержащем 0.2% SDS и 0,05% ß-меркаптоэтанопа. Электрофоретический анализ фракции, соответствующей верхней части

максимального пика на хроматограмме, показал, что она содержит практически чистый гибридный белок.

Очищенные фрагменты были использованы для иммунизации животных с целью получения антител к фрагментам а-субъединицы. Для получения моноклональных антител к фрагментам а-субъединицы №*,К*-АТФазы мышей иммунизировали по двухнедельной схеме гибридными белками, содержащими фрагменты а-субъединицы с координатами 825842, 868-886, 928-945, 946-967 и 962-978. Для предварительного отбора положительных гибридомных клонов использовали ИФА. Специфичность МА, продуцируемых отобранными клонами, изучали с помощью ИФА активной и денатурированной №*,К'"-АТФазы и иммуноблоттинга. В случае фрагментов с координатами 825-842, 868-886, 946-967 и 962-978 антитела, секретируемые полученными гйбридомными клонами, не взаимодействовали с АТФазой. Возможно, в состав эпитопов этих антител входят как участок а-субъединицы №*,К*-АТФазы, так и участок TNF. Для фрагмента с координатами 928-945 было получено два гибридомных клона — 4С1 и 4С2, узнающих а-субъединицу Ыа*,К*-АТФазы в ИФА и 8 иммуноблоттинге. Антитела 4С1 и 4С2 являются иммуноглобулинами класса М. Очистку IgM из культуральной и асцитной жидкостей проводили с помощью аффинной хроматографии на конканавалин А-сефарозе.

Использование в качестве антигена при иммунизации животных полученных генно-инженерным способом коротких фрагментов а-субъединицы Na'.K'-АТФазы позволило применить аффинно очищенные поликлональные антитела к этим фрагментам для изучения трансмембранной организации фермента. у-Глобулиновую фракцию сыворотки кроликов, иммунизированных гибридными белками, состоящими из TNF и фрагмента -АТФазы, сначала очищали от антител к TNF с помощью аффинной хроматографии на ковалентно связанном с сефарозой TNF несколько раз до исчезновения способности у-глобулиновой фракции сыворотки узнавать TNF в ИФА и при иммуноблоттинге. Затем иммуноглобулины очищали на колонке с суммарным белком клеток Е. со//, ковалентно связанными с сефарозой. Окончательную очистку антител к фрагментам АТФазы осуществляли с помощью аффинной хроматографии на ковалентно связанном с сефарозой гибридном белке, состоящем из TNF и соответствующего фрагмента АТФазы. Все полученные таким образом антитела узнавали а-субъединицу ^'.Ю-АТФазы при иммуноблоттинге.

Для изучения специфичности полученных антител к фрагментам а-субъединицы №\К*-АТФазы изучали их взаимодействие с суммарной фракцией белков плазматических мембран клеток СПЭ/1. Как антитела 4С1 и 4С2, так и аффинно очищенные поликлональные антитела к каждому из шести фрагментов выявляли при иммуноблоттинге белковую полосу, соответствующую по молекулярной массе а-субъединице №*,К*-АТФазы. Отсутствие

взаимодействия с другими белками плазматических мембран клеток СПЭЛ позволило использовать полученные антитела для изучения организации а-субъединицы Na\K*-АТФазы в мембранах этих клеток.

4.2. Изучение трансмембранной организации Ыа',К"-АТФазы с помощью антител к ее фрагментам.

Полученные как описано в предыдущих разделах антитела к фрагментам каталитической субъединицы Ыа\К*-АТФазы с координатами 541-589, 825-842, 868-886, 928945, 946-967 и 962-978 были использованы для изучения пространственной организации фермента. В первую очередь была изучена способность этих антител связываться с очищенной нативной Ма*,К*-АТФазой для того, чтобы установить, какие из перечисленных фрагментов содержат экспонированные на поверхности молекулы эпитопы, а какие нет. Затем была исследована способность антител связываться с интактными клетками СПЭЛ и фракцией плазматических мембран этих клеток с целью установить, какие фрагменты содержат эпитопы, экспонированные на внеклеточной поверхности, а какие - на внутриклеточной.

Для того чтобы установить, остаются ли исследуемые участки а-субъединицы экспонированными или маскированными при переходе фермента из одного конформационного состояния в другое, инкубацию с антителами проводили либо в присутствии 150 мМ NaCI (АТФаза стабилизирована в Е, -конформации), либо в присутствии 150 мМ KCI (АТФаза стабилизирована в Е2-форме). Оказалось, что антитела к фрагментам 541-589 и 825-842 находят свои эпитопы на поверхности Ыа'.К'-АТФазы, стабилизированной как в Е:. так ив Е2 конформациях. Следовательно, в обоих исследованных конформационных состояниях фермента, по крайней мере часть этого участка полипептидной цепи а-субъединицы экспонирована на поверхности молекулы. В ИФА №*,К*АТФазы с помощью антител к фрагменту а-субъединицы с координатами 928-945 использовали как моноклональные антитела 4C1 и 4C2, так и аффинно очищенные поликлональные антитела к этому фрагменту. Специфическое взаимодействие этих антител с мембранным препаратом Ыа*,К*-АТФазы свидетельствовало об экспонированности их эпитопов на поверхности молекулы фермента.

Напротив, ИФА мембранного препарата Ыа*,К*-АТФазы с помощью антител к фрагментам ее каталитической субъединицы с координатами 868-886, 946-967 и 962-978 не выявил экспонированных на поверхности молекулы фермента эпитопов.

Таким образом, при изучении способности антител к фрагментам каталитической субъединицы Ма*,К*-АТФазы связываться с мембранным препаратом фермента показано наличие экспонированных на поверхности молекулы эпитопов в составе участков а-

от ма КС

им ал ьн ог

2а

-4С1 -4С2 -анти-541-58< -анти-825-84; - анти-928-94;

Количество антител, мкг

- анти-863-886

- анти-946-967

- анти-962-978

Количество антител, мкг

- МА

- антитела к участкам Ма'.К'-АТФазы

Количество антител, мкг

Рис. 24. Взаимодействие поли- и монокпональных антител к различным участкам а-субъединицы Ма*,К*-АТФазы с мембранным препаратом разрушенных клеток СПЭЛ (А и Б) и с интактными клетками СПЭЛ (В) в ИФА.

492

субъединицы с координатами 541-589, 825-842 и 928-945 и их отсутствие в составе участков с координатами 868-886, 946-967 и 962-978. Во всех случаях, наличие или отсутствие экспонированных на поверхности молекулы АТФазы эпитопов в составе исследуемых участков а-субъединицы не зависело от конформации фермента.

В случае участков а-субъединицы Ыа*,К*-АТФазы с координатами 541-589, 825-842 и 928-945, для которых было показано наличие экспонированных на поверхности молекулы

эпитопов, интересно было установить, экспонированы ли эти эпитопы во внеклеточное или внутриклеточное пространство. С этой целью изучали способность антител к этим фрагментам а-субъединицы взаимодействовать с интактными клетками СПЭЛ и с фракцией плазматических мембран этих клеток. В ИФА интактных клеток СПЭЛ не было обнаружено экспонированных наружу клетки эпитопов в составе участков с координатами 541-589, 825842 и 928-945. В качестве положительного контроля использовали моноклональное антитело VGIV, эпитол которого был обнаружен на внеклеточной поверхности мембраны в различных тестах (Ovchinnikov et а!., 1986). В то же время антитела ко всем трем фрагментам взаимодействовали с фракцией плазматических мембран клеток СПЭЛ. Следовательно, исследуемые участки каталитической субъединицы Ыа'.Ю-АТФазы содержат эпитопы, экспонированные во внутриклеточное пространство.

MA 4С1 и 4С2, направленные к участку 928-945, взаимодействовали также только с мембранными препаратами разрушенных клеток, но не с интактными клетками, что свидетельствовало о внутриклеточной локализации их эпитопов.

Антитела к фрагментам 868-886, 946-967 и 962-978 не взаимодействовали ни с интактными клетками СПЭЛ, ни с фракцией плазматических мембран этих клеток, что подтвердило данные ИФА Na'.K'-АТФазы об отсутствии экспонированных эпитопов в составе этих участков а-субъединицы.

Таким образом, при помощи специфических поли- и моноклональных антител показано внутриклеточное расположение участков 541-589, 825-842 и 928-945 в а-субъединице №*,К*-АТФазы. Участки 868-886 и 946-967 не имеют экспонированных наружу эпитопов, что может свидетельствовать об их расположении внутри мембраны или внутри массивно внутриклеточной глобулы фермента.

В то же время в данной работе не было получено антител, взаимодействующих с внеклеточными участками №*,К*-АТФазы. Это не противоречит более поздним исследованиям Fiedler and Scheiner-Bobis, которые при помощи анализа гибридов а-субъединицы Ыа*,К*-АТФазы с репортерным ферментом показали внеклеточное расположение остатков Asp8" и Arg972. По всей видимости, последняя внеклеточная петля, включающая s себя Arg972, очень мала, а остаток Asp884 входит во внеклеточный участок, взаимодействующий с ß-субъединицей. и, соответственно, экранированный от взаимодействия с антителами.

Таким образом, полученные результаты указывают на корректность топографической модели а-субъединицы Na'.K'-АТФазы, в которой предполагается существование десяти пронизывающих мембрану а-спиралей и расположение N- и С-концевых участков на цитоплазматической стороне (рис. 23, С).

5. Мышечная р-субъединица Х+,К+-АТФаз

В базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank мы обнаружили EST АЮ71721, кодирующий последовательность длиной 50 а.о., имеющую 42% идентичности с соответствующим фрагментом р2 Na'.K'-АТФазы. Найденная последовательность была использована для выбора специфических праймеров для проведения ПЦР и поиска тканей, имеющих соответствующие транскрипты. Значительный уровень экспрессии был обнаружен в скелетных мышцах, и несколько меньший — в сердце. Во всех остальных исследованных тканях желаемые транскрипты либо полностью отсутствовали, либо были детектированы в следовых количествах. Полученные результаты указывают на высокую тканеспецифичность экспрессии гена новой р-субъединицы (ген активен только в поперечнополосатых, но не в гладких мышцах!). Чтобы подчеркнуть этот факт, новая р-субъединица была названа р„.

При помощи RACE ПЦР с использованием препаратов кДНК скелетных мышц человека и крысы были амплифицированы перекрывающие участки xflHK р„. Секвенирование продуктов ПЦР "позволило определить">структуру мРНК и вывести аминокислотную последовательность гипотетических белков (рис. 25). Сходным образом была определена кодирующая последовательность мРНК свиньи. Согласно результатам RACE ПЦР мРНК р„ человека имеет открытую рамку считывания длиной 1074 п.о., 5'-нетранслируемую.область — 80 п.о. и 3'- нетранслируемую область — 2728 п.о. Последний факт весьма интересен, поскольку из него следует, что мРНК новой р„ имеет самый длинный 3'- нетранслируемый регион среди членов своего семейства. При секвенировании кДНК р„ человека была обнаружена гетерогенность последовательности в одном из участков; клонирование продуктов ПЦР помогло установить, что причиной является альтернативный сплайсинг (± 12 п.о.).

Во время выполнения данной работы стала доступной также последовательность участка генома человека, содержащая полный ген р„ (Waterston R.H., HTGS No АС006962). Сравнение последовательности гена и мРНК позволило определить его экзон-интронное строение. Ген р„ человека имеет 8 экзонов (на один больше, чем гены других в-субъединиц; добавочный экзон кодирует Glu-богатый участок).

Выведенная аминокислотная последовательность белка р„ человека имеет 357 а.о. (крысы на 1, а свиньи - на 2 а.о. короче). Эктодомен р„ в целом сходен с эктодоменами других изоформами (консервативный мотив YYPYYG, 6 консервативных остатков Су$, 4 потенциальных сайта N-гликозилирования). В то же время, р„ имеет структурную особенность, выделяющую его среди родственных белков — удлиненный N-концевой

;.ti ctcragaactctcacccgartgcctgcctctgctgcgtctttgtccactgaaragcc

1 U 2

ATGAGAAGGCAACTCCGGTCCAGAAGGGGTGaATCCTTTCCTTACAGTTATCGC7ACAGACTcgATGATCCGGA7GAAGCGAAC3AGAAC 90

л MRRQLRSRRAPSFPYSYRYRLDDPDEANQN 30

¡с AG Q M Я 30

..т. TACTTAGCAGATGAA.GAGGAGGJ.-.GCAGAAGAA.iAGGC'rCGGGTGACGGTGGTGCGCAAATCGGAGGAGGAGGA.-.GAAGAGGAGG.-.GAA.A 13

.л; YLADEEEEAEEEARVTVVPKSEEEEEEE3K SO

it 2 М М а L 59

GAAGAGGAGGAAGAGGAGGAA---.;GAGGAGGAAGAGGGTCAAGGTCAGCCAACAGGaAATGCCTGGTGGCAGAA.-.TTGCAGATCA7GAGT 27

.г. Е Е Е Е Е Е Е К Е Е EEGQGQPTGNAWWQKLQ IMS 90

it GKEEEEEREEEEGQGQSTGNAWWRKLQIVN 99

2 И 3~ 2' U 3'

:r. GAATACCTGTGGGATCCAGAGAGAAGGATG7TTCTGGCCCGAACAGgt;agagttggaGCCTGATCT7ACTCA777ACT,7C:,7TG77CTAT 36

EYLWDPERRMFLARTGqswsLILLIYFFFY 12

it К S г 11

============трансмембранныи==

GCCTCGTTGGCTGCTGTGATGAC:rTCTGGATGT.-GACACTATTTCTGACCATCAGTGCCTATATACGAACCT'r:AGGGAGGGG3rAAAG 15

..т ASLAAVITLCMYTLFLTISPYIPTFTERVK 15

ä- F I М А М Q 14

Г'ме ИТ - -== - ■ -.-=---'■-==—- ■-—-- -----

3 И 4

-л CCTCGTggAGTTATGATCAGACCCTTCGCCGATAGCCTTAACTTCAACTTCAACGTTTCTGAACCCGACACTTGGGAGGATTATGTGATT 54

-гг. PPGVMIRPFAHSLNFNF И V S EPDTWQHYVI 1В

It £ R 17

4 U 5

art AGGCT.AAATGGCTTTCTCGAGi;TTAT.AATGACAGTGTrGAAGAGGAAATGAAT:?AGATTGTCCCGG3GGGGA;-7AGTT;ATC:.4AGAT 63

- SLNGFLQGY SOS LQEEMNVD С* PPGQYFI2D 21

• t I 20

-- GGCAATGAGGATGAGGACAAGAA : GCCTGCG.AAT? :AAGGGCTCCTTCCTAAAG.-A.CTGCTCTGGTCTGGAGGA:GGA.AGTTTT 3 3ATAC 72

GMEOEOKKAC'QFKRSFLK .4 C* S GLEDPTFjY 24

a: 23

5 JJ 6

TCTACTGGACAGCCCTGCATCCTTGTAAA.GATGAACCGgaTTGTAGGCTTTCGTGGTGAGCTTGGAGATCCTGTiA.AGGTT'TGGTJCP.W 81

S T G Q P C* ILLKMNRIVG FRPE LGD P V К V S С* К 27

F 2 6

6 V 7

GTTGATaGAGGTGA?GAAAATG.-.;ATCCGArG;A7:AGTTACrACGGAGAGTG:'G:TTCTTTTGACCTGGGCTA:TACGGTTA;7A;GGC SC

VQRGDENDIRSISYYPESASFDLRYYPYYG 3C

at К N 23

7 U 3

-LT. AAACTGACTCAcgTTAAC7ACA3A7CCGGG77GG7GGC.AATGCACTT?ACAGACG7GGTGAAGAACCAA.GCAG737C'737GCAG7 3GGAA 95

ал К Ь Т Н V N Y Г SPLVAMHFTDVVKHQA VPVQC'Q 33

at з;

_.т CTGAAGGGC.AAA.GGGGTCA7.AAA7GATG7CArc.A:.7GATCG77TTGTGGGCAG7G7AATCT7TACGG7GAACA7AGAJj:.C7TP_A.-i3Ctt 1Z

л LKGKGVINDVINDRFVGRVIFTLNIET 35

jt IV I 35

cagggggccattcttaccagtt tt:tttct gttttatcttatggtatctctggtatcacctgaactctttttctttaattagga:t tage 11

'ис. 25. Первичная структура ß„. Показана нуклеотидная последовательность кДНк и аминсксилотная юследовательность выведенного белка человека (hum) и аминокислотные остатки ßM крысы (rat), )тличные от соответсвующих остатков белка человека. Сайты N-гликозилирования под-еркнуты. ;снсервативные остатки цистеина выделены звездочками. Стрелками показаны границы экзонов. Строчными буквами отмечена последовательность, присутствующая только s одном из альтернативных ■ранскриптов.

Рис. 26. Теоретическая модель трансмебранной укладки мышечной р-субъединицы Х*,Ю-АТФаз (р„).

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 27. Иммунодетекция мышечной р-субъединицы Х*,К*-АТФаз (р„) в различных тканях человека и анализ гликозилирования. 3 - 5 - сердце, 6 - 8 - скелетная мышца, 1 - 2 - мозг. 1,3,6 - препараты без дегликозилирования; 2,4,7 - препараты, обработанные эндогликозидазой Н; 5,8 - препараты, обработанные гликопептидазой Г.

участок, содержащий кластеры, богатые остатками глутаминовой кислоты (например, ЕЕЕЕЕЕЕЕКЕЕЕЕЕЕЕКЕЕЕЕ). Кроме того, альтернативный сплайсинг приводит к образованию двух продуктов, в которых присутствует или отсутствует последовательность GSWS на границе цитоплазматического и мембранного участков (указанный остаток триптофана весьма консервативен). Большое количество остатков Glu делает рч очень кислым белком (pl 4.6). Теоретическая модель трансмебранной укладки р„, основанная на анализе гомологии последовательностей изоформ р-субъединиц Х*,К*-АТФаз, представлена на рис. 26. На основании предсказания вторичной структуры сделано предположение, что удлиненный N-концевой домен белка содержит две а-спирали. В этой модели также показаны три дисульфидные связи (консервативные для всех изоформ р-субъединиц) и четыре сахарные цепи.

Нужно отметить, что сравнение аминокислотных последовательностей рм разных видов (человек, крыса и свинья) указывает на высокую степень консервативности структуры р„ (90% процентов идентичности), сходную с р, (91%). Такой уровень ниже чем для р2 (95%), но выше чем для р3 (76%) и р-субъединицы Н\К*-АТФазы желудка (82%)._.При этом надо заметить, что в последовательности р„ можно выделить вариабильный участок (Glu-богатый). В то же время эктодомен р„ в отдельности крайне консервативен (96%), т.е. в такой же степени как и наиболее консервативная изоформа р-субъединицы — р2.

Особенности строения р„не позволяют априори отнести ее к р-субъединицам Na*,K*-АТФазы. Нельзя исключить, что р„ ассоциирована с еще неизвестной а-субъединицей, или же с каталитической субъединицей АТФаз Р-типа, не относящейся к Х*,К*-АТФазам вообще. Все предположения о функции р„ требуют экспериментальной проверки. С использованием подходов, аналогичных описанным выше для других систем, нами был получен рекомбинантный белок, представляющий собой полноразмерную р„ за вычетом трансмембранного участка. При помощи поликлональных антител к рекомбинантному белку Pu было показано существование самого белка в мембранах скелетных мышц человека (рис. 27). Сравнение подвижностей интактного белка и белка, обработанного гликозидазами, указывает на то, что степень гликозилирования р„ гораздо меньше, чем других изоформ, а также на то, что сахарные цепи р„ чувствительны к эндогликозидазе Н. Таким образом, р„ имеет тип гликозилирования необычный для белков своего класса.

выводы

1. Осуществлено комплексное исследование разных уровней структуры и функции ряда ионтранспортирующих мембранных белков: Са2*-АТФазы плазматических мембран, Н*-транспортирующей трансгидрогеназы, а также изоформ а- и ß-субъединиц Х*,Ю-АТФаз. Показано, что универсальным инструментом в исследованиях таких сложноорганизованных мембранных систем являются моноклональные и специфические поликлональные антитела. Применения антител включают в себя тестирование трансмембранной топологии ферментов и зондирование междоменных взаимодействий при помощи ингибирующих антител. Специфические антитела незаменимы для тонкого .изучения тканеспецифичной экспрессии, в особенности для характеризации новых изоформ.

2. Получена коллекция МА к Са2*"АТФазе плазматических мембран, выделенной из эритроцитов человека. При помощи иммуноферментного анализа протеолитических и

■ рекомбинантных фрагментов Са2*'АТФазы плазматических мембран и скрининга больших библиотек случайных гекса- и пентадекапептидов методом фагового дисплея картированы эпитопы пяти моноклональных антител к Са2*-АТФазе (МА). Эпитоп MA 2D8 локализован в районе 222-249 (в предполагаемом домене трансдукции), эпитопы МА 8В8 и 7С8 — в районе 330-353 (в сайте связывания кислых фосфолипидов), МА 5Е6 - в районе 791-843 (в предполагаемом шарнирном регионе), МА 1Е4 - в районе 130-142 (первая внеклеточная петля). МА 2D8 распознает РМСА1 и РМСА4, в то время как 1Е4, 8В8 и 7С8 специфичны к hPMCA4.

3. При помощи анализа связывания характеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2*'АТФазы плазматических мембран.

4. Разработан новый способ очистки химерной Н*-трансгидрогеназы £ coli с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном кальмодулине.

5. С использованием очищенной химерной Н*-трансгидрогеназы Е. coli для иммунизации получена коллекция МА к-данному ферменту. Показано, что эпитопы трех МА имеют интегральную природу и состоят из участков, принадлежащих как а-, так и ß-субъединице Н'-трансгидрогеназы. Одно МА (2G10) специфически распознает домен la а-субъединицы. Более точное картирование эпитопа показало, что МА связывается с участками 5-15 и 65-79, причем остаток Arg9 абсолютно необходим для связывания.

6. MA 2G10 эффективно ингибирует Н'-трансгидрогеназу Е. coli, но не влияет на способность связывать субстраты. На основании данных по картированию эпитопа этого МА предположено, что ингибирование происходит благодаря блокированию междоменных взаимодействий, необходимых для трансгидрогенизации, а также предложена модель расположения доменов Н*-трансгидрогеназы Е. coli относительно мембраны и друг друга.

7. Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные гену ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н*,К*-АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

8. С применением поли- и моноклональных антител, специфичных к участкам каталитической а-субъединицы №\К*-АТФазы, показано внутриклеточное расположение участков 541-589, 825-842 и 928-945. Участки 868-886, 946-967 и 962-978 не имеют экспонированных наружу эпитопов, что может свидетельствовать об их расположении или внутри мембраны, или внутри массивной внутриклеточной глобулы фермента. Полученные данные подтверждают теоретическую модель трансмембранной укладки С-концевой половины а-субъединицы Ыа'.Ю-АТФазы, предполагающих существование 6 трансмембранных столбов в этом участке.

9. Определена первичная структура новой ß-субъединицы Х*,К*-АТФаз, присутствующая только в мышечной ткани (поэтому названная ßm). В сравнении с другими членами семейства ß-субъединиц Х*,К*-АТФаз гипотетический белок ßm имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками глутаминовой кислоты, а также необычный тип гликозилироаания своего эктодомена.

Основные результаты диссертации изложены а следующих публикациях:

1. Кочергинская С.А., Шахпаронов М.И., Алданова Н.А, Модянов Н.Н.,. Овчинников Ю А. Протонная аденозинтрифосфатаза Streptococcus faecalis. Структура дициклогексилкарбодиимидсвязывающей субъединицы. Биоорган, химия, 1982, т. 9, с. 746-755.

2. Кочергинская С А, Шахпаронов М.И., Алданова Н.А, Модянов Н.Н. Первичная структура дициклогексилкарбодиимидсвязывающей субъединицы Н*-АТР-азы Streptococcus faecalis. Биоорган, химия, 1983, т. 9, с. 746-755.

3. Emelyanenko E.I., Shakhparonov M.I., Modyanov N.N. Limited proteolysis of human erythrocyte Ca2*-ATPase in membrane-bound form. Identification of calmodulin-binding fragments. Biochem. Biophys. Res Commun., 1985, v. 126, p. 214-219.

4. Alakhov V.Yu., Emelyanenko E.I., Shakhparonov M.I., Dudkin S.M. Calcium-independent bacterial activator of cyclic nucleotide phosphodiesterase and Ca2*/Mg2*-ATPase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, v. 132, p. 591-597.

5 Модянов H.H., Шахпаронов М.И., Емельяненко Е.И. Локализация кальмодулинсвязывающих участков в полипептидной цепи Са2*,Мд2*-АТФазы эритроцитов человека. Биол. мембраны, 1986, т. 3, с. 481-488.

6. James P., Zvantch E.I., Shakhparonov М I., Penniston J.Т., Carafoli Е. The amino acid sequence of the phosphorylation domain of the erythrocyte Ca2*-ATPase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, v. 149, p. 7-12.

7 - Alakhov V.Yu., Modyanov NN.. Shakhparonov M.I., Zvantch E.I., Feschenko M.S., Lutzenko S.V.

Elucidation of conservative elements of calmodulin-dependent enzymes with the use of monoclonal-antibodies. Biotechnol. Appl. Biochem., 1988, v. 10, p. 319-325

8 Овчинников ЮА., Модянов H.H., Шахпаронов М.И., Зварич Е.И. Сходство антигенной структуры АТР-гидролазного центра Са2*-АТФазы плазматических мембран и активных центров АТФаз Е(-Ez-, F,F0-™nOB. Биол. мембраны , 1987, т. 4, с. 1237-1243.

9. Фещенко М.С., Зварич Е.И., Шахпаронов М.И., Модянов Н.Н Антигенные свойства Са2*-АТР-азы эритроцитов человека. Биол. мембраны., 1991, т. 8, с. 1237-1247.

10 Зварич Е.И, Шахпаронов М.И., Модянов Н.Н., Джеймс П.Х., Карафоли Э. Картирование функциональных доменов Са2*-АТФазы плазматических мембран с помощью ограниченного протеолиза. Биол. мембраны, 1991, т. 8, с. 677-688.

11 Feschenko M.S , Zvantch E.I, Hofmann F„ Shakhparonov M.I., Modyanov N N.. Vorherr T, Carafoli E A monoclonal antibody recognizes an epitope in the first extracellular loop of the plasma membrane Ca2* pump. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 4097-4101.

12. Ларин Д.И., Шахпаронов М.И., Ортис Э., Костина М Б., Модянов Н.Н. Экспрессия и очистка гибридных белков, содержащих лримембранные фрагменты а-субъединицы Na'.K'-АТРазы. Биол мембраны, 1994, v. 11, р. 469-475.

13 Ларин Д.И, Шахпаронов М.И., Ортис Э., Костина МБ, Модянов Н Н. Внутриклеоточная локализация эпитопов двух моноклональных антител к фрагменту Val928-Lys9,15 а-субъединицы Na*,K*-ATPa3bi: приложение к построению топологической модели. Биол. мембраны., 1994, т. 11, с. 605-613.

14 Ларин Д.И., Шахпаронов М.И., Костина М.Б , Модянов Н.Н. Изучение мембранной организации С-концевого фрагмента а-субъединицы Na*,K*-ATPa3bi с помощью поликлональных антител к ее примембранным фрагментам. Биол. мембраны. 1994, т. 11, с. 469-475.

15. Пестов Н.Б., Гусаксза Т.В., Костина М.Б., Шахпаронов М.И. Фаговые мимотопы моноклональных антител к Саг*-АТР-азе плазматических мембран. Биоорган, химия, 1996, т. 22, с. 664-670.

16. Корнеенко Т.В., Пестов Н.Б., Егоров М.8., Иванова М.В., Костина М.Б., Шахпаронов М.И. Моноклональные антитела к а-субъединице гипотетической Н*,К*-АТФазы человека, кодируемой геном atplall. Биоорг. хим., 1997, т. 23. с. 800-804.

17. Pestov N.B., Romanova L.G , Korneenko T.V., Egorov M.V., Kostina M.B., Sverdlov VE., Askari A., Shakhparonov M.I., Modyanov N.N. Ouabain-sensitive H,K-atpase: tissue — specific expression of the mammalian genes encoding the catalytic a-subunit. FEBS Lett., 1998, т. 440, с. 320-324.

18 Пестов Н.Б., Корнеенко Т.В., Костина М.Б., Шахпаронов М.И. Картирование эпитопов моноклональных антител к Са2*-АТР-азе плазматических мембран человека. Биоорган, химия, 1999, т. 25, С. 505-512.

19. Pestov N.B., Adams G„ Shakhparonov M.I., Modyanov N.N. Identification of a novel gene of the X,K-ATPase p-subunit family that is predominantly expressed in skeletal and heart muscles. FEBS Lett, 1999, 456, 243-248.

20. Bizouarn Т., FjellstrCm 0., Axelsson M., Meuller J., Korneenko T.V., Pestov N.B., Ivanova M.V., Egorov M.V., Shakhparonov M.I., RydstrOm J. Interactions between the soluble domain I of nicotinamide nucleotide transhydrogenase from Rhodospirillum rubrum and transhydrogenase from Escherichia coli. Effects on catalytic and H+-pumping activities. Eur. J. Biochem., 2000, 267, 3390-3396.

21. Корнеенко T.B., Пестов Н.Б., Егоров M.B., Иванова М.В., Костина М.Б., Ридстрем Я., Шахпаронов М.И. Идентификация нитратредуктазы Escherichia coli как антигена моноклонального антитела неизвестной ранее специфичности. Биоорган, химия, 2000, т. 26, с. 601-604.

материалы конференций:

22. Емельяненко Е.И.. Модянов Н.Н., Шахпаронов М.И. Первичная химическая характеристика кальмодулин-активируемой Са2*,Мд2*-АТФазы эритроцитов человека. VI Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Рига, 1983, с. 176-177.

23. Фещенко М.С., Зеарич Е.И., Шахпаронов М.И. Исследование структурно-функциональных свойств Са2*,Мд2*-АТФазы эритроцитов человека с помощью моноклональных антител. VII Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Таллин, 1987, с. 126.

24. Зеарич Е.И., Фещенко М.С., Модянов Н.Н., Шахпаронов М.И. Исследование структурно-функциональной организации Са2*,Мд2*-АТФазы мембран эритроцитов человека. XII Всесоюзное совещание по транспортным АТФазам. Иркутск, 1987, с. 11.

25. Zvaritch E.I., Festchenko M.S., Shakhparonov M.I. Arrangement of functional domains in the polypeptide chain of human erythrocyte membrane Ca2*-ATPase. I Spanish-Soviet Congress on physical chemical biology. Granada, Spain, 1987, p. 22.

26. Зеарич Е.И., Фещенко M.C., Шахпаронов М.И, Модянов Н.Н. организации Са'*,Мд2*-АТФаза мембран эритроцитов человека. Исследование молекулярной организации. V Советско-Швейцарский симпозиум по биомембранам. Рига, 1988, с. 71.

27. Shakhparonov M.I., Zvaritch E.I., Festchenko M.S., Modyanov N.N. Human erythrocyte Ca2*-ATPase. Immunochemical study of molecular organization. International symposium on molecular basis of biomembrane transport. Rosa Marina, Italy, 1988, p.22.

28. Фещенко M.C., Зеарич Е.И., Шахпаронов М.И. Исследование молекулярной организации Са2*,Мд2*-АТФазы эритроцитов. Иммунологический подход. Всесоюзный симпозиум «Химия белков», Тбилиси, 1990, с. 159.

29. Гевондян Н.М., Владимирова Н.М., Костина М.Б., Чертова Е.Н., Гринберг А.В., Эфендиев Р.Э., Платошкина Е.А., Шахпаронов М.И., Модянов Н.Н. Исследование молекулярных основ активного

транспорта через биологические мембраны. Всероссийская конференция по направлению «Белковая инженерия», Москва, 22-24 ноября, 1994, 1995, с. 20.

30. Egorov M.V., Korneenko T.V., Pestov N.B., Ivanova M.V., Shakhparonov M.I., Rydström J. Fusion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase and the calmodulin-binding domain of the plasma membrane Ca-ATPase: purification and use for raising monoclonal antibodies. EBEC Reports, 1998, v. 10, p. 61 (Xth European Bioenergetic Conference, Göteborg, Sweden).

31. Romanova L.G., Pestov N.B., Korneenko T.V., Egorov M.V., Kostina M.B., Shakhparonov M.I. Expression of the ouabain-sensitive H,K-ATPase alpha subunit gene (atplall) In animal and human tissues, comparison with X,K-ATPase betas. EBEC Reports, 1998, v. 10, p. 114 (Xth European Bioenergetic Conference, Göteborg, Sweden).

32. Pestov N.B., Shakhparonov M.I.. Modyanov N.N. The fifth member of X,K-ATPase ß-subunit possesses an antypical N-terminal domain. IXth International Conference on the Na/K-ATPase & Related ATPases, August 17-23, 1999, Sapporo, Japan.

33. Modyanov N.N., Adams G„ Pestov N.B., Yu C„ Tillekeratne M., Korneenko T.V., Shakhparonov M.I., Crambert G., Horisberger J.-D., Geering K. Structural and functional properties of human ouabain-sensitive H,K-ATPase. Sodium pump. IXth International Conference on the Na/K-ATPase & Related ATPases, August 17-23,1999, Sapporo, Japan.

34. Pestov N.B., Adams G., Kostina M.B., Shakhparonov M.I., Modyanov N.N. A novel muscle-specific isoform of the mammalian X,K-ATPase ß-subunit. Biophys. J. 78, 77A (44m Annual Meeting of Biophysical Society, February 12-16, 2000, New Orleans, USA):

Список сокращений

ВЭЖХ

ДТТ

ИПТГ

высокоэффективная жидкостная хроматография дитиотреитол

изопропил-р-О-тиогалактопиранозид иммуноферментный анализ моноклональное антитело не определено

обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция

лолиакриламидный гель

полимеразная цепная реакция

свиная почечная эмбриональная линия

этилендиаминтетрауксусная кислота

ацетил

expressed sequence tag high throughput genome sequencing human plasma membrane calcium ATPase plasma membrane calcium ATPase rapid amplification of cONA ends tumor necrosis factor

ИФА

НД

ОТ-ПЦР

ПААГ ПЦР

СПЭЛ

ЭДТА Ac

EST

HTGS

hPMCA

PMCA

RACE

TNF

Содержание диссертации автор исследовательской работы: доктора химических наук, Шахпаронов, Михаил Иванович

Введение

1. Литературный обзор:

1.1. Са2+-АТФаза плазматических мембран:

1.1.1. Очистка и реконструкция

1.1.2. Общая функциональная характеристика

1.1.3. Топология молекулы

1.1.4. Регуляция активности кальмодулином

1.1.5. Другие модуляторы активности

1.1.6. Разнообразие изоформ

1.1.7. Системы экспрессии

1.1.8. Медицинские аспекты

1.2. Семейство Х\К+-АТФаз:

1.2.1. Ш+,К+-АТФаза

1.2.2. Желудочная Н^Х-АТФаза

1.2.3. р-субъединицы Х\К+-АТФаз

1.2.4. El ,К -АТФаза нежёлудочного типа:

1.2.4.1. Идентификация мРНК и гена

1.2.4.2. Проблема классификации

1.2.4.3. Вопрос о истинной Р-субъединице

1.2.4.4. Каталитические свойства

1.2.4.5. Тканеспецифичность экспрессии и внутриклеточная локализация

1.2.4.6. Физиологическая роль

1.3. Н^-трансгидрогеназа

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Са2+-АТФаза плазматических мембран:

2.1.1. Картирование регуляторных участков

2.1.2. Получение МА

2.1.3. Тонкое картирование эпитопов МА

2.1.4. Мембранная топология молекулы

2.2. Н+-трансгидрогеназа:

2.2.1. Разработка нового метода очистки

2.2.2. Изучение структурио-функциональной организации

2.3. Н+,К+-АТФаза нежелудочного типа:

2.3.1. Получение специфических антител к а-субъединице

2.3.2. Исследование тканеспецифичности экспрессии гена ATP1AL

2.4. Каталитическая субъединица №+,К+АТФазы:

2.4.1. Проблема трансмембранной топологии С-концевой половины

2.4.2. Получение библиотеки антител, специфичных к участкам а-субъединицы №+,К+-АТФазы

2.4.3. Изучение трансмембранной организации №+,К+-АТФазы

2.5. Мышечная Р-субъединица Х^-АТФаз

3. Экспериментальная часть

4. Выводы

5. Благодарности

6. Список сокращений

Введение диссертация по химии, на тему "Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков"

Фундаментальным свойством живой клетки является наличие градиента концентраций различных ионов относительно как наружной мембраны, так и мембран внутриклеточных компартаментов. Зависимыми от внутриклеточной концентрации ионов являются такие физиологически важные процессы как возбудимость и сократимость клеток, все виды клеточного движения, секреция гормонов и пищеварительных ферментов, высвобождение нейромедиаторов и транспорт метаболитов. Среди всего многообразия ионов, участвующих в метаболизме целой клетки и ее органелл, ключевую роль играют ионы водорода, калия, натрия и кальция. Нарушение внутриклеточного баланса именно этих катионов вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне организма в целом является одной из причин возникновения и развития многих тяжелых заболеваний.

Большая физиологическая значимость транспорта ионов предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов всего многообразия ионтранспортирующих систем. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в мире за последние годы в этой области, исследование трехмерной и надмолекулярной структуры ионтранспортирующих систем до сих пор находится на начальном этапе своего развития, поскольку специфические трудности работы со сложноорганизованными мембранными белками не позволяют эффективно использовать метод рентгеноструктурного анализа. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реальных механизмов функционирования систем активного транспорта катионов через биологические мембраны.

Основной целью настоящей работы явилась характеризация структуры разных уровней нескольких мембранных ионтранспортирующих белков, а именно Са2+-АТФазы плазматических мембран, изоформ Х+,К+-АТФаз и Н+-трансгидрогеназы.

Наиболее распространенными в животном мире системами активного транспорта ионов являются катионтранспортирующие АТФазы (Н+-, \С- и Na*,^-АТФазы и Са2+-АТФаза плазматических мембран). Используя энергию гидролиза АТФ, эти сложные биологические машины осуществляют два взаимосвязанных и противоположно направленных процесса: выброс ионов водорода или натрия и одновременный перенос ионов калия в клетку в случае Х+,К+-АТФаз и выведение ионов кальция в случае Са2+-АТФазы. Таким образом, происходит тонкая регуляция ионного состава и объема клетки и обеспечивается постоянство неравновесного распределения катионов между клеткой и средой.

Одним из потребителей протонного градиента относительно внутренней митохондриальной мембраны, а также клеточной мембраны бактерий является Н+-транспортирующая никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (Н+трансгидрогеназа), использующая перенос протона для смещения равновесия NADP+NADH -> NADPH + NAD. Физиологическая роль данной реакции до сих пор не осознана полностью, однако о ее важности говорит значительная консервативность структуры Н+- трансгидрогеназы бактерий и животных.

В связи с естественными сложностями установления трехмерной структуры мембранных белков в данной работе основной акцент был сделан на использование иммунохимических методов, связанных с получением специфических моно- и поликлональных антител к указанным системам. Антитела позволяют в первую очередь зондировать пространственную организацию фермента, прежде всего трансмембранную укладку полипептидной цепи, а изучение влияния антител на каталитические свойства фермента дает возможность определять функционально важные участки молекулы белка. Решение этих задач требует как тонкого картирования эпитопов, так и получения антител с предопределенной специфичностью.

Учитывая данные по изучению ионтранспортирующих систем, полученные другими исследователями, основное внимание было направлено на получение коллекций моноклональных антител (МА) к вышеупомянутым объектам и характеризацию специфичности (локализацию эпитопов) полученных антител, а также применение данных антител для тестирования трансмембранной организации Са2+"АТФазы плазматических мембран и Ма+,К+-АТФазы. Получение же ингибирующего МА к Н+-трансгидрогеназе и тонкое картирование его эпитопа позволило создать модель расположения доменов Н+-трансгидрогеназы Е. со//.

В исследовании ранее малоизученной Н+,К+-АТФазы нежелудочного типа (продукт гена ATP1AL1J усилия были сфокусированы на изучении тканеспецифичной экспрессии и иммуногистохимической локализации в тканях с максимальным уровнем экспрессии гена.

Кроме того, проводили поиск новых изоформ субъединиц ионтранспортирующих ферментов на уровне транскриптов. При этом была определена первичная структура новой р-субъединицы Х\К+-АТФаз, присутствующей только в мышечной ткани (поэтому названной рт). В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х+,К+-АТФаз гипотетический белок рт имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками Glu, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.

Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н+,К+-АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

Тщательно охарактеризованные моноклональные антитела — исключительно полезный инструмент в исследованиях биополимеров. Антитела, специфичные к определенным изоформам ферментов, находят широкое применение, например, для иммунохимической детекции соответствующих изоформ в тканях организма. Например, в данной работе показано, что одно из МА реагирует только с 4-й изоформой Са-АТФазы плазматических мембран (hPMCA4), а другое — распознает все известные изоформы Са2+-АТФазы высших животных. Это позволяет определять содержание hPMCA4 относительно общего пула фермента.

При помощи анализа связывания охарактеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2+"АТФазы плазматических мембран и С-концевой половины а-субъединицы ЫаМГ-АТФазы.

Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена Са2+-АТФазы для продукции, детекции и аффинной очистки рекомбинантных белков, что с успехом применено для получения высокоочищенной Н+-трансгидрогеназы Е. coli. Несмотря на то, что к настоящему времени уже предложено немало различных «партнеров» для создания гибридных белков, например, гексагистидиновая последовательность (которая также широко применялась в данной работе), использование аффинной хроматографии на кальмодулине имеет определенные преимущества, например, позволяет проводить выделение химерных белков в строгих восстановительных условиях.

Таким образом, открыто как существование новых компонентов систем транспорта ионов (рм), так и получена обширная информация по различным аспектам структуры и функции хорошо известных и важных систем. Вся полученная информация существенно расширяет возможности дальнейших исследований функционирования систем транспорта ионов через биологические мембраны.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

1. Осуществлено комплексное исследование разных уровней структуры и функции ряда ионтранспортирующих мембранных белков: Са2+-АТФазы плазматических мембран, Н+-транспортирующей трансгидрогеназы, а также изоформ а- и р-субъединиц Х+,К+-АТФаз. Показано, что универсальным инструментом в исследованиях таких сложноорганизованных мембранных систем являются моноклональные и специфические поликлональные антитела. Применения антител включают в себя тестирование трансмембранной топологии ферментов и зондирование междоменных взаимодействий при помощи ингибирующих антител. Специфические антитела незаменимы для тонкого изучения тканеспецифичной экспрессии, в особенности для характеризации новых изоформ.

2. Получена коллекция МА к Са2+"АТФазе плазматических мембран, выделенной из эритроцитов человека. При помощи иммуноферментного анализа протеолитических и рекомбинантных фрагментов Са2+"АТФазы плазматических мембран и скрининга больших библиотек случайных гекса- и пентадекапептидов методом фагового дисплея картированы эпитопы пяти моноклональных антител к Са2+-АТФазе (МА). Эпитоп МА 2D8 локализован в районе 222-249 (в предполагаемом домене трансдукции), эпитопы МА 8В8 и 7С8 — в районе 330-353 (в сайте связывания кислых фосфолипидов), МА 5Е6 - в районе 791-843 (в предполагаемом шарнирном регионе), МА 1Е4 - в районе 130-142 (первая внеклеточная петля). МА 2D8 распознает РМСА1 и РМСА4, в то время как 1Е4, 8В8 и 7С8 специфичны к hPMCA4.

3. При помощи анализа связывания характеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2+"АТФазы плазматических мембран.

4. Разработан новый способ очистки химерной Н+-трансгидрогеназы Е. coli с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном кальмодулине.

5. С использованием очищенной химерной Н+-трансгидрогеназы Е. coli для иммунизации получена коллекция МА к данному ферменту. Показано, что эпитопы трех МА имеют интегральную природу и состоят из участков, принадлежащих как а-, так и р-субъединице Н+-трансгидрогеназы. Одно МА (2G10) специфически распознает домен la а-субъединицы. Более точное картирование эпитопа показало, что МА связывается с участками 5-15 и 65-79, причем остаток Arg9 абсолютно необходим для связывания.

6. МА 2G10 эффективно ингибирует Н+-трансгидрогеназу Е. coli, но не влияет на способность связывать субстраты. На основании данных по картированию эпитопа этого МА предположено, что ингибирование происходит благодаря блокированию междоменных взаимодействий, необходимых для трансгидрогенизации, а также предложена модель расположения доменов Н+-трансгидрогеназы Е. coli относительно мембраны и друг друга.

7. Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные гену ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н+,К+-АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

8. С применением поли- и моноклональных антител, специфичных к участкам каталитической а-субъединицы Ма\К+-АТФазы, показано внутриклеточное расположение участков 541-589, 825-842 и 928-945. Участки 868-886, 946-967 и 962-978 не имеют экспонированных наружу эпитопов, что может свидетельствовать об их расположении или внутри мембраны, или внутри массивной внутриклеточной глобулы фермента. Полученные данные подтверждают теоретическую модель трансмембранной укладки С-концевой половины а-субъединицы Ма+,К+-АТФазы, предполагающих существование 6 трансмембранных столбов в этом участке.

9. Определена первичная структура новой р-субъединицы Х\К+-АТФаз, присутствующая только в мышечной ткани (поэтому названная рт). В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х+,К+-АТФаз гипотетический белок рт имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками глутаминовой кислоты, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.

Благодарности

Осуществлению намеченных планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с академиками РАН Вадимом Тихоновичем Ивановым и Анатолием Ивановичем Мирошниковым, а также с профессором Цетлиным Виктором Ионовичем, за что автор им искренне признателен.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить коллег и друзей, совместно с которыми были получены экспериментальные результаты, составившие основу данной работы: Нину Александровну Алданову, Марьяну Юрьевну Фейгину, Марию Борисовну Костину, Николая Борисовича Пестова, Татьяну Васильевну Корнеенко, Николая Николаевича Модянова, Николая Сергеевича Быстрова.

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Министерства науки и технологий, Международного научного фонда, Шведского совета по естественным наукам, Американского фонда гражданских исследований и ИНТАС.

Список источников диссертации и автореферата по химии, доктора химических наук, Шахпаронов, Михаил Иванович, Москва

1. Dunham G., Glynn P. II Ca2+-dependent adenosinetriphospahatse in human erythrocytes. J. Physiol. (London). 1961. V. 156. P. 274-293.

2. Schatzmann H.J. II ATP-dependent Ca2+ extrusion from human red cells. Experientia. 1996. V. 22. P. 364365.

3. James P., Maeda M, Fischer R., Verma A.K., Krebs J., Penniston J.T., Carafoli E. И Identification and primary structure of a calmodulin binding domain of the Ca2+ pump of human erythrocytes. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 2905-2910.

4. Penniston J.Т., EnyediA. //Modulation of the plasma membrane Ca2+pump. J. Membr. Biol. 1998. V. 165. P. 101-109.

5. Guerini D. II The significance of the isoforms of plasma membrane calcium ATPase. Cell Tissue Res. 1998. V. 292. P. 191-197.

6. Penniston J.T., EnyediA., Verma A.K., Adamo H.P., Filoteo A.G. II Plasma membrane Ca2+ pumps. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. V. 834. P. 56-64.

7. Carafoli E. II Plasma membrane calcium pump: structure, function and relationships. Basic. Res. Cardiol. 1997. V. 92 Suppl. 1. P. 59-61.

8. Carafoli E, Garcia-Martin E., Guerini D. II The plasma membrane calcium pump: recent developments and fiiture perspectives. Experientia. 1996. V. 15. P. 1091-1100.

9. Brandt P. C., Vanaman Т. С. II The plasma membrane calcium pump: not just another pretty ion translocase. Glycobiology. 1996. V. 6. P. 665-668.

10. Smith J.B., Lee H.W., Smith L. II Regulation of expression of sodium-calcium exchanger and plasma membrane calcium ATPase by protein kinases, glucocorticoids, and growth factors. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996. V. 779. P. 258-271.

11. Guerini D., Carafoli E. II The targeting of the plasma membrane calcium pump in the cell. Biosci. Rep. 1996. V. 16. P. 129-137.

12. Abramowitz J., Suki W.N. II Ca-ATPase and bone cell mineralization. Miner. Electrolyte Metab. 1996. V. 22. P. 336-344.

13. Зварич Е.И. II Ca2+-АТФаза плазматических мембран. Структура и функции. Биол. мембраны. 1991. Т.8. С. 565-585.

14. Wolf Н. U., Dieckvoss G., Lichtner R. II Purification and properties of high-affinity Ca2+-ATPase of human erythrocyte membranes. Acta Biol. Med. Germ. 1977. V. 36. P. 847-858.

15. Gietzen K., Tejcka M., Wolf H.U. II Calmodulin affinity chromatography yields a functional purified erythrocyte (Ca2++Mg2+)-dependent adenosine triphosphatase. Biochem. J. 1980. V. 189. P. 81-88.28