Структурно-функциональная организация кальмодулин-активируемой Са2+, Mg2+-зависимой АТФазы эритроцитов человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М-М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи УДК 577.112.5:577.152.361 *3' 134

ЗВАРИЧ Елена Ивановна

СГРЖГУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ .ОРГАНИЗАЦИЯ КАЛЬШШИН-АКГИВИРУЕШЙ са2*. Нд2+-ЗАВИСИМОЙ АТФазы ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и фонологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 1990

Работа выполнена в Институте биоорга иической химии имени М. М. Шемякина Академии Наук СССР

Научные руководители - академик Овчинников Ю. А.

доктор химических наук Модянов H.H.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Левицкий Д.О. доктор химических наук Абдулаев Н. Г.

Ведущая организация --Институт молекулярной биологии АН СССР Задата состоится 1090г. в ■/О час на заседании

специализированного совета Д 002 35 01 при Институте биоорганичес-нической химии имОДЫ. Иемякина АН'СССР по адресу: II787I ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая ШЛО.

С диссертацией можно ознакомиться вУ'библиотеке Института биоорганической химии им. U. М. Шемякина АН СССР. Автореферат разослан

■ Актуальности проблемы. Изучение механизмов внутриклеточного гомеостаза ионов Са2+ является одной из важнейших задач современной физико-химической биологии. Выполняя в клетке функцию "вторичного мессенджера", ионы обеспечивают адекватную реакции клетки на внешние раздражители, участвуют в регуляции широкого спектра биохимических процессов. Под контролем ионов находятся все виды клеточного движения, секреция и зкзоцитоз метаболитов и гормонов, проведение нервного импульса, метаболизм гликогена, проницаемость мембран и деление клеток. В основе регуляторного действия лежит сбалансированное изменение внутриклеточной концентрации катиона, являющееся' результатом функционирования сложной сети мембранных -транспортирующих систем.

Одна ю таких систем - Са^+-АТФаза плазматических мембран - найдена в ¡мембранах практически всех клеток млекопитающих и является ключевым ферментом тонкой регуляции внутриклеточного содержания иона. Этот интегральный мембранный белок состоит из одной субьеди-ницы М. м. около 140 кДа и осуществляет активный транспорт ионов против более чем тысячекратного градиента их концентрации. Активность фермента находится под строгим контролем большого числа природных регуляторов, к которым относятся: ионы как таксзые, кислые фосфолипиды, кальмодулин, цАМФ-зависимая протеинкиназа, про-теинкиназа С, кальпаин.

Проведение структурно-функциональных исследований Са^+-АТФазы затруднено из-за малого содержания фермента в мембранах - менее 0,1^ от общего числа мембранных, белков, а также вследствие высокой лабильности его очищенных препаратов. Тем не менее, в настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении структуры и функций системы: установлена полная аминокислотная последовательность белковой цепи, определена первичная структура ряда функциональных и регуляторных областей. Однако современные представления о механизмах работы и принципах регуляции фермента еще очень далеки от понимания реальных молекулярных событий, лежащих в их основе и требуют проведения дальнейших более детальных исследований системы.

Цель и задачи исследования. Цель» настоящей диссертационной работы явилось исследование структурно-функциональных свойств Са^-АГФазы мембран эритроцитов человека.

1-119/7

Выполнение работы заключалось в решении следующих задач:

1) выделение препаративных количеств функционально активного фермента и проведение первичней химической характеризации белка.

2) выяснение основных закономерностей молекулярной организации фермента в составе натизной мембраны.

3) проведение сравнительного имыунохинического анализа Са"+-АТФазы эритроцитов и других ион-транспортирухщих АТФаз Е^Ч^-, 11, г0~типов.

4) картирование функционально активных триптических фрагментов Са^+-АТФазы в полилептидной цепи молекулы и выяснение расположения основных функциональных и регуляторных областей белка.

Научная новизна работы. Разработаны методические приемы выделения -АТФазы мембран эритроцитов в количествах, необходимых для проведений химических и икыунохимических исследований системы. Проведена первичная з&мическая характеристика белка и впервые показано, что N-концевой остаток полилептидной цепи интактной молекулы блокирован (наиболее вероятно, ацетилирован). В результате прямых исследований фермента в составе нативной мембраны- получены первые сведения 8 пространственной организации Са^-транспортирую-щей системы. Впервые получены экспериментальные данные об иымунохи-ыическом сходстве Са^+-АТФазы плазматических мембран и других АТФаз Е^ -Е^ типа, выявлено сходство стрЬеуия АТР-гидролазного центра Са^*-АТФазы мембран эритроцитов и активных центров АТФаз Е^Ь,-, Гр гц-ютов.

Найдены условия Целенаправленного получения высокомолекулярных полипептидсв в ходе ограниченного расщепления очищенной Са^'-АТФазы трипсином. Разработан новый метод определения С-концевой последовательности труднодоступных полипегггидов, основанный на расщеплении карбоксипегтгидазаш иммрбилизованнызс*'"на PVDF мембране белков и их фрагментов. Определены ы-_и с-концевые последовательности высокомолекулярных фрагментов Са^+-АТФазы и установлены границы расположения фрагментов в полипептидной цепи белка. Картирование фрагментов позволило однозначно локализовать ряд важнейших функциональных участков фермента: центр связывания кальмодулина и участок, необходимый для проявления регулятор-'ого действия активатора, аутоингиби-торный участок, расположенные в с-концевой части молекулы. Впервые обнаружен регуляторный участок в к-концевой области фермента, явлл-

сщийся центром действия кислых <$ос!$олилидов. Входящий в состав ре-гуляторного центра участок структуры характерен только для кальмо-дулкн-зависимсй Са^-АТФазы и не имеет аналогов в строении других ион-траяспортирушда АТЯаз.

Гфактическое значение работы. Полученные данные о структурно-функциональной организации Са^+-АТФазы мембран эритроцитов являются вкладом в развитие представлений о молекулярных основах функционирования мембранных ион-транспортир ух®« систем и тонких механизмах регуляции системы транспорта в плазматических мембранах.

Разработанный в ходе исследования метод определения С-концевой последовательности иммобилизованных полилептидов может найти широкое применение в белковой химии при анализе строения труднодоступных белков и их фрагментов.

Полученные сведения о локализации и структуре важнейших регуля-торных центров Са^+-АТФазы плазматических мембран могут быть использованы в медицине, белковой инженерии, биотехнологии и послужить основой для разработки и создания терапевтических средств, специфично корректирующих активность Са^+-транспоргирувщей систем при патологических явлениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

- vi Всесоюзном, симпозиуме по химии белков и пептидов, Рига. 1983г.

- XIX Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам, Иркутск, 1937г.

- VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллин. 1987г.

- I Советско-Испанском конгрессе по физико-химической биологии. Испания, 1987 г,

- у Советско-Ивейцарском симпозиуме по биомемо'ранам, Рига, 1988 г.

- Международном симпозиуме по молекулярным основам транспорта в биомембранах, ¡{талия, 1888 г.

- VII Международном симпозиуме по калъций-связивающим белкам в норме и патологии, Канада, 1990 г.

Объем работа. Диссертация содержит У'/-^" страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводоз к списка цитируемой литературы С ссылок),

Содержание работы

1. Выделение и очистка Са^+-АТФаэы плазматических мембран.

Источником выделения Са^+-АТФазы служили мембраны зритръдитов

человека. Плазматические мембраны были получены лизированием интакт-ных клеток в гипотоническом буфере и тщательной промывкой мембранной фракции в присутствии ЭДГА. Примененная для получения препара-. тивных количеств мембранного материала методика представляла собой сочетание методов Карафоли (Carafoli е. et ¿1., 1981) и Гитцена (Gietzen к. et ai., 1982). Для снижения трудоемкости процесса и сокращения времени отмывок плазматических мембран многократные центрифугирования на стадии получения мембранной фракции были заменены фильтрацией гемолизата на кассетной системе типа Peiiicon ("míiu-роге", США). Выход мембранных белков из одного литра эритроцитарной массы составлял обычно 5-7 г. Са^+-зависимая АТР-гидролазная активность мембранных препаратов - 0,016-0,02 мкмоя Pi'мин"*' кг белка-* в отсутствии кальмод;; ;ина и 0,06 - 0,00 мкМ Pi' иин~*' мг белка-* в присутствии активатора.

Очистку Са^+-АТФазы проводили с помощью аффинной хроматографии солюбилизированньос мембранных <5елкоз на кальмодулин-сефарозе cl 4В. Для предотвращения инактивации фермента во все буферы, используемые на стадии аффинной хроматографии, вводили до 10 %-ов. по объему, глицерина. Полученные препараты фермен^э хранили при -70°С в буфере, содержащем 10 -ный глицерин и 30 <-ный зтиленгликоль. Выход фермента из I г мембранных белков составлял 0,5-0,7 мг. Са^+-зави-симая АТР-гидролазная активность очищенного фермента - 0,35 мкмол pí'mhh-** кг белка в отсутствии кальмодулина и 1,8-2 «смол Pi'мин-** мг белка в присутствии активатора.

2. Первичная химическая характеристика

Аминокислотный анализ белка проводили путем полного (в течение 24 и 72 часовi кислотного гидролиза образцов в 5,7 н НС1 при 105°С с последующей идентификацией аминокислот на аминокислотном анализаторе Durrum d 500. В состав молекулы входили следующие аминокислотные остатки (моль/моль, в расчете на Ы.в. белка 140 000): Asx 124, Thr 79, Ser 103, Clx 122, Pro 71, Gly 166, Ala 134, Cys 30, Val 109, Met 23, lie 80, Leu 125, Tyr 21, Phe 41, Hie 19, Lya 67, Arg 37, Trp 6.

В составе селка преобладают неполярные аминокислотные остатки -60 % от общего чйсЛа остатков полипептидной цепи. Высокий уровень ГйдрофобносТй характерен для мембранных белковых систем и необходим для обеспечения взаимодействия белка с липидным бислоем. В- группе йолярных аШНокксЛо'Гйых остатков преобладают остатки кислых аминокислот, Которые, ёозМожно, играет существенную роль в процессах связывания и транс йо*а(Хии катиона.

N-концевой octйгí£>K белка не удалось идентифицировать при проведении дансилированйй '» присутствии зоз, а также после обработки образцов с цельо раскрытия пироглутаминового цикла и деформилиро-вания. Полученные результаты говорят о блокированном и, наиболее вероятно, ацетилированном к-концевом остатке белковой цепи.

3. Исследование характера взаимодействия Са^+-АТФазы с кальмодулином.

Измерение АТР-гидролазной активности очищенного солюбилизирован-ного фермента в присутствии различных концентраций активатора выя- '.

Рис.1. Активация очищенной Са^+-АТФазы кальмодулином,-На врезке - кривая активации, построенная в координатах Хил л а.'

а-ин/у

6

вило сложный характер взаимодействия Са -АТФазы с кальмодулином: линейный лишь при относительно низких (до I0~® tí) концентрациях кальмодулина (рис. 1). Анализ полученной зависимости в координатах Хилла (врезка на рис.1) показал, что при концентрации кальмодулина менее М взаимодействие Са^*-АТФазы с активатором происходит по некооперативному принципу (h=D, более высокие концентрации активатора приводят к появление отрицательной кооперативности (h--o, 5).

Полученные данные предполагают существование в молекуле Ca¿+-АТФазы как минимум двух центров взаимодействия с активатором, различающихся своим сродством к кальмодулину.

4. Исследование молекулярной организации

-АТФазы в составе

нативной мембраны.

4.1. Ограниченный триптический гидролиз белка и выделение кальиодуяик-связывающих фрагментов Одним из иироко иерользуемых подходов к изучению топографии мембранных белковых систем является их ограниченный протеолиз в составе натавного липопротеинового комплекса и последующий анализ образующихся белковых фрагментов. Применение протеолитических методов для исследования Топографии Са -насоса в нативной мембране связано со значительными трудностями, обусловленными чрезвычайно малым количественным содержанием фермента в,, мембранах и, как следствие, сложностью идентификации к выделения ''продуктов протеолиза бежа.

При изучении кинетики гидролиза меыбр&о-связанной Са^+-АТФазы трипсином было показано, что на начальных этапах протеолиза функционально важные участки белка (в том числе, и кальмодулин-свя-зывающий) сохраняются интэктными. Исходя из этих данных нами било предложено провести исследование молекулярной организации Са -АТФазы путем избирательного выделения и анализа кальмодулин-связывающих фрагментов белка;

Услобия ограниченного триптического гидролиза меибрано-связан-ного белка были подобраны в ходе аналитических экспериментов. Основными критериями выбора условий ясляяись: I) сохранение чувствительности расщепленной системы к кальмодулину; и 2) ее достаточно Еысокая Са2+ -зависимая АТР-гидролазная активность. Наилучшие результаты были получены при обработке мембран эритроцитов (концентрация белка 2 мг/мл) трипсином при соотношении фермент: белок=1:50. по массе, в точение 2 мин при 4°С.

е

Суспензию обработанных трипсином мембран разделяли с помощью центрифугирования на две фракции: D супернатант, содержащий "гидрофильные" пептидные фрагмент« и 2) осадок, состоящий из мембран и белковых фрагментов, оставшихся в липидном бислее. Выделение каль-модулин-связывающих полипептидов Са^-АТФазы из обеих фракций проводили с помощью аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе. В результате из "мембранной" фракции были выделены кальмодулин-свя-зывающие полипептиды М. м. 82. 75, 53, 33,5 и 28 кДа. а из фракции "гидрофильных" фрагментов - полипептиды М.н. 82, 75, 53 и 28 кДа. Из всех фрагментов "мембранной" фракции полипептид 33,5 кДа оказался наиболее прочно связанным с липидным'бислоем: его количественная солюбилизация происходила лишь при относительно высоких концентрациях детергента - около 0,5 % тритона Х-100. Очевидно, что этот фрагмент является частью внутримембранной области Са^+-насоса.

4.2. Идентификация фрагментов, содержащих каталитический центр фермента.

Эксперименты по измерению активности показали, что обе фракции калькодулия-связывающих полипептидов обладали АТР-гидролазной активностью и, следовательно, содержали каталитически активные фрагменты. Идентификацию фрагментов, содержащих активный "центр фермента, проводили с помощью фосфорилированяя полипептидов (у-32Р)АТР.

Известно, что гидролиз АТР Са^+-АТФазой, являющейся ферментом Ej-Eg типа, происходит через образование промежуточного продукта -фосфорилированной формы фермента. Образующаяся при этом ацилфосфат-ная связь,, щелочелабильна и легко расщепляется, например, в присутствии гидроксиламина. Таким образом, гидроксиламин-чувстви-тельное фосфорилирование белка и его фрагментов является высокоспецифичным методом идентификации активного центра Ej-Eg АТФаз.

В ходе эксперимента препараты обеих фракций инкубировали в присутствии радиоактивно-меченого АТР. Авторадиография электрофорети-чески разделенных полипептидов выявила включение радиоактивного фосфата во фрагменты 82. 75, 53 и 28 кДа обеих фракций и полное отсутствие включения метки зо фрагмент 33,5 кДа. Фосфорилирование фрагментов было чувствительным к действию гидроксиламина и, следовательно, действительно происходило по участку фосформирования активного центра Са^*-АТФазы.

Наличие АТР-гидролазного центра во фрагментах.82, 75, 53 и 28 кДа

указывает на их происхождение из одной и той же структурно-функциональной области Са +-насоса. Присутствие полипептидов 82 и 75 кДа в "гидрофильной" фракции свидетельствует о существовании обширных внемембранных областей в структуре фермента, а наличие во фрагментах каяьмодулин-связывающего и АТР-фосфорилируемого центров, имеющих. как известно, внутриклеточную локализацию, указывает на цито-гслазматическую ориентацию экспонированных районов.

4.3. Выделение гомогенных кальмодулин-связывающих фрагментов и их химическая характеристика.

Фрагменты обеих фракций разделяли с помощью гель-проникающей хроматографии на Ультрагеле АсА 44. Для предотвращения агрегации полипептидов хроматографию проводили В присутствии 0,2 % додецил-

а280

Рис.2. Гель-хроматография "водорастворимых" (а) и мембранных (б) кальмодулин-связывзющих фрагментов на ультрагеле АсА 44. Прямоугольниками обозначены границы объединения фракций. Фракции содержали а) I. Смесь фрагментов 82. 75, 70 и 53 «Да; 2, 3. Гомогенные фрагменты 53 кДа и 28 кДа, соответственно, б) I, 2. 3. Гомогенные фрагменты 53. 33,5 к 28 кДа, соответственно,

сульфата натрия (sds), а образцы перед нанесением на колонку выдерживали 5 мин на кипящей водяной бане в буфере, содержащем 2 % sds. ' Картина разделения фрагментов обеих фракций приведена на рис.2.

В результате в гомогенном состоянии были выделены полипептиды 53 и 28 кДа обеих фракций и фрагмент 33,5 кДа "мембранной" фракции, кроме того, была получена смесь высокомолекулярных "гидрофильных" фрагментов 82. 75. 70 и 53 кДа.

Аминокислотный состав гомогенных фрагментов приведен в табл.I.

Амино- Фрагменты

кислота 53 KÜß 33,5 кДа 28 кДа

Asx 37 26 21

ihr 30 20 19

Ser 64 30 30

Glx 36 35 24

Pro 28 21 16

Gly 48 40 ' 39

Ma 33 31 31

Cye 15 6 6 .

Val 55 25 32

Met 5 5 2

Ile 17 11 9

Leu 56 30 20

Туг 10"" 4 5

Phe 11 9 6

His 7 7 3

Lys 23 16 13

Arg 11 9 7

Trp Не определяли

Таблица I. Аминокислотный состав кальмодулин-связывавщих фрагментов

Смольхмоль)

Данные для фрагментов 53 и 28 кДа приводятся без указания исходной фракции, так как в ходе анализа было выявлено практически полное сходство составов соответствующих по массе полипептидов.

3-119/7

9

Как и в случае целого фермента, для фрагментов характерно довольно высокое содержание неполяриых аминокислотных остатков (около 60 % от общего числа остатков), а среди полярных - количественное преобладание кислых остатков над основными. Одинаковая гид^офоб-ность "мембранных" и "гидрофильных" полипептидов указывает на то, что полученные фрагменты не являются строго внутркмембраниыми или экспонированными, а могут содержать в своем составе как гидрофобные, связанные с мембраной, так и гидрофильные, внемембраккые области.

х-концевым аминокислотным остатком фрагмента 33,5 кДа является глутамин. .v-концевые остатки фрагментов 53 и 28 кДа обеих фракций, а также смеси фрагментов 82, 75 и 53 кДа, не удалось идентифицировать ни в присутствии sos, ни в условиях раскрытия пироглутаминово-го цикла и деформилирования. Результаты анализа свидетельствуют о наличии ацетильной блокирующей группы в х-концевых остатках полипе-гггидов и предполагаю^ происхождение блокированных - фрагментов из N-концевой области белгт.

4.4. Иммунохимический анализ калъмодулин-связывающих фрагментов.

Дальнейшее исследование путей образования и степени родства выделенных фрагментов проводили с помощь» по^иклональных антител против полипептидов 53 и 28 кДа обеих фракций. Все полученные антитела перекрестно взаимодействовали с псяи^птидаии 53 и 28 кДа обеих фракций и образовывали комплексы антиген-антитело с "гидрофильными" полипептидами 82 и 75 кДа. Данные иммуноферментного анализа подтверждают предположение 'об образовании фрагментов 82, 75, 53 и 28 кДа из одной и той же структурной области фермента и указывают на возможную идентичность соответствующих по массе фрагментов (53 и 28 кДа) обеих фракций. ч

При обработке очищенного полипепгйда 33,5 кДа антителами против фрагментов 53 и 28 кДа обеих фракций образования иммунных комплексов не происходило, тогда как антитела против Са^+-АТФазы взаимодействовали с этим фрагментом с высокой эффективность» (табл. 2). В таблице приведены данные иммуноферментного анализа фрагментов "мембранной" фракции с помощью антител против фрагментов "гидрофильной" фракции.

При исследовании влияния антител на активность фермента было показано, что антитела против фрагментов "гидрофильной" фракции предотвращают активацию фермента кальмодулином. Следовательно, некото-

tO

Антитела против Фрагменты, А490 Сотн.ед.) при разведении igG

фрагмента, кНа кДа 1:500 1:1000 1:2000 1:5000 1:10000

28 28 0,981 0,630 0.315 0,117 0,07

28 33,5 0,06 0,03 - - -

28 53 0,90 0,559 0.208 0,09 -

53 28 0,496 0,278 0,045 0,013 0,01

53 33,5 0,08 - - - -

53 53 0,852 0,521 0,215 0,073 0,04

Цэотив Са2+- 33,5 0,792 0,401 0,285 0,110 0,06

АТФазы

Таблица 2. Иммунотестирование фракций igG. Иммунореактивность антител, полученных против Са^+-АТФазы и гомогенных фрагментов 53 и 28 кДа, определяли с помощью метода elisa. Колориметрические измерения проводили спектрофотометрически на приборе Multiscan Plate Reader (США).

рые из эпитопов антител находятся в непосредственной близости от кальмодулин-связьгващего участка Срегуляторного центра) Са^+-АТФазн. Полное отсутствие кросс-реактивности антител по отношению к кальмо-дулин-связьшащему фрагменту 33,5 кДа (табл.2) указывает на его происхождение из другой структурно-функциональной области фермента.

Обобщая полученные данные, можно предложить следующую схему расположения функционально важных участков в полипептиднсй цепи молекулы Са^+-АТФазы: в преимущественно экспонированной м-концевой области фермента находятся АТР-гидролазный центр и один из кальмоду-лин-связывающих участков белка. Второй предполагаемый участок взаимодействия с активатором локализован, по-видимому, в С-концевой части белка, содержащей в основном внутриыембранные области.

5. Иммунохимический анализ строения АТР-гидролазного центра Саг+-АТ4азы.

При определении химической структуры ряда Ej-Eg АТФаз в их строении были выявлены обширные участки гомологии, особенно ярко выраженной в области активных центров этих белков. Поскольку АТФаз а плазматических мембран также относится к Ет-Е? типу ферментов,

и

естественно было предположить существование подобных участков в структуре и этого белка. Однако все ранее предпринятые попытки выявления иммунохимического сходства -насоса плазматических мембран с Са^+-транспортирующими системами сарко/зндоплазматического ретикулума, ка+,К+-АТ Фазой. кальмодулин-зависимой фосфодиэстеразой были безуспешными. Во всех экспериментах в качестве антигена использовали целую молекулу фермента.

Идея настоящей работы заключалась в получении антител против фрагментов 53 и 28 кДа Са2+-АТФазы. содержащих каталитический центр фермента, и исследовании их кросс-реактивности по отношению к Е^!^, г0 АТФазам. Предполагалось, что такой подход позволит провести целенаправленное изучение ограниченных областей фермента.

На рис.3 приведены кривые зависимости Са^-АТРазной активности мембран эритроцитов от концентрации антител против фрагмента 28 кДа и неиммунных 1до в присутствии кальмодулина и без активатора. Исследуемые антитела окАзывали ингибирующев действие как на "базаль-ную" (кривая 2). так ^ на стимулированную калькодулином (кривая 15 активности фермента. Действие антител, полученных против фрагмента

_ I—в—1-1-:-—J-II-1-1_

Ю'3 ю-2 Ю-1 5-101 г

Цф1,нг/яА

Рис.3 . Влияние антител против фрагмента 28 кДа на АТР-гидролазную активность мембран эритроцитов в присутствии (Пив отсутствие (2) кальмодулина. 3, 4. Контрольные эксперименты с неиммунными igG с активатором и без активатора, соответственно.

53 кДа, имело аналогичный характер. Очевидно, обе фракции антител содержат субпопуляции 1дс, эпитопы которых расположены в области функциональных центров Са2+-АТФазы или же в непосредственной близости от этих центров. , 4

Для проведения иммунохимического анализа были взяты три катион-транспортирующих фермента: Са^+-АТФаза саркоплазматического рети-. кулума скелетной мышцы кролика, ма+,к+-АТФаза наружных медулл почек свиньи и Н+-АТФаза митохондрий сердца быка. Первые два белка, как и Са2+-АТФаза мембран эритроцитов, относятся к ферментам Е^Ед

АТФазы (б) и Н+-АТФазы (в). I. Антитела против фрагмента 28 кДа: 2. неиммунные ige.

тивных центров. Протон-транспортирувдая АТФаза митохондрий - представитель семейства Fj.Fp АТФаз - отличается от Ej-Eg ферментов по структурно-функциональным свойствам, и в частности, по строению активного центра и механику гидролиза АТР.

По данным иммуноферментжого анализа антитела против обоих фрагментов проявляли кросс-реактивность по отношению ко всем исследуемым белкам. При этом в случае олигомерных белков (Na+,K+- и Н+-АТФазы) антитела взаимодействовали только с их каталитическими субъединицами (вир, соответственно).

На рис.4 приведены зависимости активности мембранных препаратов ферментов от концентрации иммунных (против фрагмента 28 кДа) и неиммунных igG. Присутствие иммунных антител приводило к ингибирова-нию АТР-гидролазной активности исследуемых АТФаз. Аналогичные результаты были получены и при использовании антител против фрагмента 53 кДа.

Данные проведенного нами иммунохимического анализа убедительно свидетельствуют о существовании в молекуле Са^+-АТФазы плазматических мембран участков иммунохимического сходства с АТФазами Ej-Eg. f1,fq типо?. Ингибиторное действие антител на АТР-гидролазную активность всех исследованных АТФаз указывает на локализацию обнаруженных сходных структур в активных центрах белков. Поскольку для иммунизации были использованы денатурированные препарата фрагментов, можно предположить образование IgG преимущественно против линейных участков структуры полипептидов. Ранее при анализе аминокислотной последовательности каталитической субъединицы Н^-АТФазы в составе ее активного центра был обнаружен лишь один участок структурного сходства с ферментами Ej-Eg типа. По-видимому, именно этот •участок, гомологичный АТР-фосфорилируемой область Ej-Eg АТФаз, и является мишенью .кросс-реактивного действия антител. Эффективное, подавление антителами активности Ej-Eg АТФаз предполагает обширное сходство строения активных центров этих ферментов и Са^+-АТФазы эритроцитов.

Полученные данные о сходстве строения активного центра Са2+-АТФ-азы плазматических мембран и других ион-транспортирующих АТФаз были подтверждены в ходе исследований, проведенных совместно с сотрудниками лаборатории биохимии Федерального Технологического Института (г.Цюрих, Швейцария).

Препараты карбоксиметилированной Са^*-АТФазы (25 мг очищенного

белка) расщепляли в^ по остаткам метионина и полученную смесь фрагментов разделяли с помощь» обратиофазной ВЭЖХ. Время выхода пептидного фрагмента, содержащего участок фосфорилирования, было определено в ходе аналитических экспериментов по разделение бромциа-новых фрагментов фосфорилированного фермента. Первичная структура выделенного пептида С табл.3) оказалась гомологичной структуре ранее идентифицированных участков фосфорилирования других Е|-^АТФаз.

АГФаза

Аминокислотная последовательность

Мембраны эритроцитов, Са2+

Саркоплазматический ретикулум, Са2+ Желудок крысы, н+/к+

Почки свиньи, Ма+/к+

E.coll Kdp, К+

М О N А Т А

I G Т С S V

L G Т С 8 V

L031ST

ICSDKTGTLT

ICSDKTGTLT ь

1С SDKTGTLT ICSDKTGTLT

AODVDVLLLDKTGTITL (307)

М (465)

Т (348)

Q (382)

Q (369)

Табл. 3. Аминокислотные последовательности участков фосфорилирования активных центров Е^-Ед АТФаз. Цифры в скобках указывают порядковый номер фосфорилируемрго остатка Аар в белковой цепи.

6. Картирование функционально активных триптических фрагментов в полипептидной цепи Са2+-АТФазы. Следующий этап работы по изучению структурно-функциональных свойств Са^+-АТФазы плазматические мембран заключался в локализации высокомолекулярных фрагментов - продуктов триптического гидролиза очищенного фермента - в полипептидной цепи белка.

Известно, что расщепление очищенной солюбилизированной Са^+-АТФ-азы трипсином происходит через последовательное образование высокомолекулярных фрагментов - 90, 85, 81 и 76 кДа. Эти полипептиды, как было установлено, сохраняют способность к активному транспорту ионов Са и, следовательно, содержат все необходимые для функционирования домены. 0 то же время фрагменты существенно различаются по

и»

своей активности и регуляторным свойствам, что, по-видимому, связано с отщеплением определенных пептидных областей белка. Картирование этих фрагментов могло бы дать"ценную информацию о располохении функциональных и регулято^ых доменов в структуре Са^+-АТФазы.

6.1. Получение высокомолекулярных триптических фрагментов.

Ранее при исследовании характера ограниченного триптического гидролиза Са^+-АТФазы было показано, что фрагмент 90 кДа является неустойчивым продуктом протеолиза и быстро расщепляется до более низкомолекулярных фрагментов 85, 81 и 76 кДа. Образование в ходе протеолиза полипептидов 85 или 81. кДа зависит от присутствия в среде инкубации специфических эффекторов (кальмодулина / СаС12 и ванаДа" та / Mgci2, соответственно). Продолжение протеолиза приводит в обоих случаях к образованию полипептида 76 кДа, устойчивого к дальнейшему расщеплению.

В настоящей работе был проведен поиск условий протеолиза, приводящих к обогащению гидролюата каждым из анализируемых фрагментов, а также обеспечивающих достаточно длительное присутствие фрагментов в протеолитической смеси. Наилучшие результаты были получены при обработке Са^+-АТФазы .(20 мкг/мл) трипсином при 0°С и. соотношении трипсин/белок - 1:10, по массе. В выбранных условиях преимуществен-, ное накопление фрагмента 90 кДа происходило в течение первых 5 мин протеолиза, фрагментов 85 и 81 кДа - в .течение 40 мин при проведении протеолиза в присутствии необходимых эффекторов. Фрагмент 76 получали расщеплением белка трипсином в течение 90 мин.' ~

6.2. Структурный анализ триптических фрагментов. •

а) Определение n-концевой последовательности фрагментов.

Труднодоступностъ объекта исследования, а также палые количества, образующихся фрагментов обусловили выбор методических подходов к определению их частичной N- и С-концевой последовательности. Для сокращения потерь анализируемого материала при очистке и выделении было решено проводить разделение фрагментов в одну стадию с помадью sds-электрофореза в полиакриламидном геле и осуществлять структурный анализ полипептидов после их количественного переноса на ■pvdf мембрану.

Высокомолекулярные полипептиды отделяли от других фрагментов Са^+-АТФазы с помощью sds-электрофореза в 6,5 %-ном полиакриламидном

геле. Используемая для разделения довольно низкая плотность геля способствовала оптимальному разрешению полос исследуемых полипептидов. По окончании электрофореза полипептиды электрофоретически переносили га геля на руог мембрану и зате^ вырезали полоски мембраны, несущие индивидуальные фрагменты 90, 85. 81 и 76 кДа, соответственно. ы-концевые последовательности фрагментов определяли на автоматическом секвенаторе, используя 0.1 нмоль иммобилизованного полипептида. Выход фенилтиогидантоинов аминокислот составлял около 20 пкмоль.

ФРАГМЕНТ Аминокислотная последовательность

N-концевая С-концевая

90 к Да Т01ЮУАЬЕ10РЬ КАЗК

(315-326) (1158-1161)

85 кДа ТООвУА Т01К

(315-320) (1102-11051

81 кДа ТООО\'.и,ЕЮ сгтк

(315-324) (1063-1066)

76 кДа ЬАУОЮКА сттк

(359-366) (1063-1066)

Таблица 4. Частичные 1«- и с-концевые последовательности высокомолекулярных фрагментов. Цифры в скобках указывают на местоположение пептидных участков в белковой цепи.

N-концевые последовательности фрагментов приведены в табл. 4. Установленные последовательности полностью совпали с участками первичной структуры преобладающей в эрйтроцитарных мембранах иэоформы Са2+-АТФазы, нефосфорилируемой цАЫФ-зависимой протеинкиназой.

В результате структурного анализа была выявлена идентичность к-концевых последовательностей фрагментов 90, 85 и 81 кДа и показано, что их формирование обусловлено расщеплением связи ьуа-А1а (314315) полипептидной цепи белка (рис,5).

1Т

Установленная N-концевая последовательность полипептида 76 кДа соответствует участку Leu (359)-Ala (366) первичной структуры Са2+-АТФазы и указывает на расщепление связи Aig-Leu (358-359). Полученные данные означают, что в* процессе образования этого фрагмента из фрагментов-предшественников'' 85 и 81 кДа происходит отщепление V-концевого пептида Ala (3I5)-Arg (358) их первичной структуры.

б) Определение С-концевой последовательности фрагментов.

Метод С-концевого анализа иммобилизованных на pvdf мембране полипептидов в литературе не описан. Поэтому в ходе предварительных экспериментов был проведен поиск условий С-концевого расщепления полипептидов после их иммобилизации на pvdf мембране. Исследования проводили на препаратах иммобилизованного кальмодулина. Наилучшие результаты - идентификация до четырех остатков С-концевой последовательности - были получены при обработке 0.5 нмоль белка смесью карбоксипептидпз У, Р, А и В (10, 2, I и I единиц активности, соответственно) в течение 3-4 часов при 20°С. Выход аминокислот при этом составлял около 50-100 пкмоль. Найденные условия расщепления бшш апробированы на образце иммобилизованной на pvdf мембране Са^+-АТФазы эритроцитов. Установленная последовательность -. etsv - соответствует реальной С-концейой последовательности белковой цепи не-фосфорилируемой цАМФ-завиеимой протеинкиназой изоформы Са2*-АТФазы.

Для однозначной идентификации С-концевых последовательностей препараты каждого фрагмента анализировали в серии из четырех независимых экспериментов. Установленные С-концевые последовательности полипептидов приведены в табл. 4. С-концевая последовательность фрагмента 90 кД? соответствует участку Ala (II5Q)-Lys41I6I) первичной структуры и указывает на расщепление связи Lya-Phe (II6I-II62) при его образовании (рис. 5). Формирование полипептида 85 кДа прог исходит путем расщепления связи Lya-val (II05-II06) белковой цепи. Фрагменты 81 и 76 кДа имеют сходные С-концевые последовательности, соответствующие участку ciy (I063)-Lys (1066) белка, расщепляемая при их формировании связь - Lys-Giu (1066-1067).

6.3. Идентификацил функциональных и регуляторных областей Саг+-АТФазы (анализ путей протеолиза фермента).

На рис. 5 приведена аминокислотная последовательность нефосфори-лируемой протеинкиназой изоформы Са^+-насоса. В структуре белка от-

1 51 101 151 .201 251 301 351 401 451 501 . 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151

мторзокухр анзмаезкес пгост\те1л кшетбюл ьт01ыу1!усс

УОПЬСЗРХКТ вРУБИЯ®? АЛЬЕККР-Оте СТЛЯРРК/- КТЩХУИЕА

1дооты1ье 1аап.^таб е1ирасееж ьсвсматтре сеш-аош.п

---------М1 ~

есаыьгэу! хууьутагш изкекогнсь осигесеокг siip.ng01.iq

-М2-

Ц^ЙЕХУУОЭ 1АОУКУССЬЬ РАГ^ИЛО® 01.К1ПЕ331Л' СЕБОНУККЭЬ ОГОРМЫЗСТ НУМЕСБСКМУ УТАУСУЖОТ етПДШПЛ! ЕЭОЕСЕЮТК

г-Т|

сккострего жактсяхлга ьеторшбое сюиееижк аукурккекэ

г-ТУ ,----.

ухдао/гаха заьтугиль угушмп/ш йкрицрестр ,___.—Мз

гуюугжгб' исгтуьууа уремлаут хзхлузуккм мкркмлжнх. йасетмсыат а1030ктат1, тмм!штуус)а х1«31нта01 р5ро\тьрю/ хоглуысхз! ызаутяки^ рекеозьряр. уснитеса1х сплтижспу

оаумсурее кьукуутгмц тркзмзтут н?мссгнм-/з^кск5е111,г<к ошшжзе Атеетсютиз кот.тлерм лсизшпс1 ауи>пжтер зюлеыехьт ейс1аутс1 еср^еуро а1акскоас1 тоюютош кгара1аткс 01ьтра30еь сишиш. 1шексеуе<2 екцж1иркх кухлкззрго кнть'/кию згусенвд/у аутсзхзтшс раьккасуср

амс1астоуа кеазош/го оыетзхукау мийеиглгозг екпдгоьту

нууау1уагт састтоьбрь кауотитоь 1иртеа51а1. атеррте51х

М5--......"Мб ........

гакртогажр ьхбнтмккы! lghafyqi.iv гештасек е^р1рб(жка

,__. М7-;_

ршэррзйт ттугмттутл ¿ЬЕМЕДКМС ШЗЕЮЛТЗС 1геш0та/

м8

уютг1с01г i уер'сскргз стзь5ьзои1, яст.г161сеь №с0г13а1е>

м9 Г-Тд _Мда_

тибикешеа gilgttkee.it коаешшр наемей,юэд() пялудда!

*=13__, III

отслюлтаг изгшебюк ртоокзхнэг мгнрега1ее ехрктрхлзе 1 ееземреказ кгстй\тх1.0 сеутруамти юдоллхт'от) ьрозоэбцгз

Рис. 5 . Первичная структура нефосфорилируемой цАМФ-зависимой про-теинкиназой изоформы Са^+-АТФазы эритроцитов человека. Стрелками указаны точки ограниченного расщепления АТФазы трипсином. тх, Т2;

т1- тз: г1' т4' Т1»■ Т4 ~ и с-концевые координаты фрагментов

80. 85, 81 и 76 кДа, сбответственно. Прямоугольниками. отмеченными м1 - мю, обозначены гипотетические трансмембранные сегмэнты. 1 -участок фосфсрилирования активного центра АТФазы:. II итс-связывающий участок; III - участок связывания кальмодулина.

мечены установленные и- и с-концевые границы высокомолекулярных триптических фрагментов 90, 85, 81 и 76 кДа; все к настоящему времени локализованные функционально важные участки Са2+-АТФаэы плазматических мембран: АТР-ф^сфорилируемый и fiтс-связывавший. Принадлежащие активному центру фермента, а также участок связывания каль-модулина.

Известно, что образование высокомолекулярных, триптических фрагментов в ходе ограниченного протеолиза очищенного фермента происходит последовательно. Поэтому данные о местоположении расщепляемых пептидных связей (рис.5) позволяют восстановить основные этапы контролируемой фрагментации солюбилиэированной функционально активной Са2+-АТФазы мембран эритроцитов. Первичная атака трипсина (образование фрагмента 90 кДа) происходит по участкам Lys-Aia (314-315) и Lys-Phe (II6I-II62) молекулы. На следующем этапе при образовании фрагментов 85 или 81. кДа происходит расщепление пептидных связей только с-концевой области: Lys-val (II05-II06) или Lys-Glu (10661067), соответственно. Формирование устойчивого к дальнейшему про-теолизу полипептида 76 кДа происходит путем отщепления N-концевого пептида Ма(315)-\гд(358). а в случае расщепления фрагмента 85 кДа, и с-концевого пептида Glu (1067)-Lys (1105).

Ранее при исследовании свойств фрагмента 90 кДа было показано, что этот полипептид сохраняет все функциональные и регуляторные характеристики интактного фермента. Локализации фрагмента в полипептидной цепи (рис. 5 ) указывает на то, что основные функционально важные области белковой молекулы расположены в границах Thr (315) -Lys (I06D первичной структуры. Вопрос О функциональной значимости расщепляемых при образовании фрагмента 00 кДа N- и g-концевых участков белка в настоящее время остается открытым, так как достоверных данных об их роли в функционировании этого фермента не имеется.

В отличие от фрагмента 00 кДа, полипептид 85 кДа проявляет низкую активность и не чувствителен к действию кальмодулина, хотя и сохраняет способность к связыванию, активатора. Учитывая функциональные свойства1 фрагментов, можно утверждать, что отщепленная область val (1106)-Lys (II6I) является частью кальмодулин-зависимого регуляторного центра Са2+-АТФаэы и отвечает за проявление стимулирующего действия активатора.

Образование фрагмента 81 кДа сопровождается утратой способности к связыванию кальмодулина и резким увеличением активности Са2+-

«-спиральный участок Антипараллельные ------**************************----------------^----

Ery 2 GVNSQTGIILTLLGVNEDDEGEK......KKKGKKQOVPENRNKAk^TQDGVA 320

Ery 1 GVNSQTGIIFTLLGAGGEEEEKKDEKKKEKKNKKQDGAIENRNKAKAQDGAA 330

PMCA 1 GVNSQTGIIFTLLGAGGEEEEKKDEKKKEKUNKKQDGAIENRNKAKAQDGAA 330

PMCA 2 GVNSQTGIIFTLLGAGGEEEEKKD.....KKAKQQDGA...........:AA 311

РМСА 3 GVNSQTGIIFTLLGAGGEEEEKKD.....KKAKKQDGA............VA 314

SRCa 1 GVNTEIGKIRDEMVATEQE................................. 24 5

SRCa 2 GVSTEIGKIRDQMAATEQD................................. 245

NaK GDRTVMGRIATLASGLEGG................................. 273

HK CDRTIIGRIASLASGVENE................................. 289

р-слои а-спиральный участок ' мз -------*********************** ******** —-----# tf ff ff #

Ery 2 LEIQPLNSQEGIDNEEKDKKAVKVPKKEKSVLQGKLT^LAVQIGKAGLLM 370

Ery 2 MEMQPLKSEEGGDGDEKDKKKANLPKKEKSVLQGKLTKLAVQIGKAGLLM 380

РМСА 1 MEMQPLKSEEGGDGDEKDKKKANLPKKEKSVLQGKLTKLAVQIGKAGLLM 380

PMCA 2 MEMQPLKSAEGGDAIX.'.DKKKANMHKKEKSVLQGKL'fKLAVQIGKAGLVM 359

PMCA 3 MEMQPLKSAEGGEMEEREKKKAUVPKKEKSVLQGKLTKLAVQIGKAGLVM 361

SRCa 1 ...............................RTPLQQKLDEFGEQLSKVI 264

SRCa 2 ...............................KTPLQQKLDEFGEQLSKVI 264

NaK .....................................QTPIAAEIEHFIHI 287

HK ....................................KTPIAIEIEHFVDI 303

Таблица 5.

Частичные аминокислотные последовательности изоформ Са2+-АТФазы плазматических мембран человека С Ery 1, Ery 2) и крысы С РМСА 1, рмса 2, рмса 3), Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума медленных (SRCa 1) и быстрых скелетных мышц (SRCa 2), о- субъединицы Na+,K+- АТФазы почек свиньи (NaK) и н\к+-АТФазы (нк) желудка крысы. Стрелками указаны пептидные связи, расщепляемые трипсином при образовании N-концевых участков фрагментов 90 (I) и 76 кДа (2). Пропуски введены в структуры белков для сходного расположения гомологичных участков.

транспортирующей системы, что, как полагают, обусловлено расщеплением участка связывания активатора и некоторой аутоингибиторной области Са^+-АТФазы. Положение фрагментов 85 и 81 кДа в полипептидной цепи указывает на ло&клизацию обоих участков в области Glu( 1067) -Lyo (I105) белковой молекулы. Полученные данные подтверждают результаты ранее проведенных исследований по выявлению кальмодулин-связывающего и аутоингибиторного участков Са^+-АТФазы.

Полипептид 81 кДа сохраняет чувствительность к действию кислых фосфолипидов, являющихся, наряду с кальмодулином, природными регуляторами активности Са^+-насоса. фи образовании фрагмента 76 кДа способность системы к регуляции кислыми фосфолипидами утрачивается, что предполагает расщепление соответствующей регуляторной области фермента. Эта область, судя по расположению фрагментов 81 и 76 кДа, находится в N-концевой части молекулы, в участке Thr (3I5)-Arg (358) полипептидной цепи (рис.5, табл.5). Выявленный участок, представляющий собой амйифильную положительно заряженную «-спираль, является одним из консервативных элементов структуры изоформ Са^+-АТФазы плазматических мембран и не имеет аналогов в структуре других АТФаз Ej-Eg типа (табл. 5). В молекулярной модели Са^+-АТФазы, построенной на основе расчета профиля гидрофобности белка, эта область располагается в самом начале третьего трансмембранного сегмента на цитоплаз-матической стороне мембраны. Совокупность сведений о строении участка делает его реальным кандидатом на роль фосфолипид-зависимого ре-гуляторного центра Са^+-АТФазы плазматических мембран.

выводы

1. Разработаны методические подходы к препаративному выделении функционально активной Са2+-ДТФазы мембран эритрсч-ггов человека

2. Проведена первичная химическая характеризация белка к установлено, что N-концевой аминокислотный остаток белковой цепи блокирован (предположительно, ацетилирован).

3. Данные о характере взаимодействия Са^+-АТ<Зшы с кальмодули-нсм, а также результаты иммунохимического анализа кальыодулин-связывающих фрагментов свидетельствуют о наличии двух центров связывания активатора в молекуле фермента.

4. Результаты анализа белковых фрагментов - продуктов ограниченного триптического гидролиза мембрано-связанного фермента - указывают на наличие в к-концевой части молекулы обширных внеыембранних областей, содержащих АГР-гидролазный и один из кальмодулин-связи-вающих участков. Второй участок связывания активатора расположен в с-концевой области фермента.

5. Впервые продемонстрировано иммунохимкческое сходство активных центров Са^-АТФази плазматических мембран и АТФаз е1-е2-, FJ,F0-ranoB, Выявлена - высокая консервативность строения участка фос формирования активного центра фермента.

6. Разработан метод определения с-концевой последовательности полипептидов. иммобилизованных на pvdf мембране.

7. Разработаны условия ограниченного триптического гидролиза очищенной Са^+-АТФазы, приводящие к избирательному образованию высокомолекулярных фрагментов. Определены я- и с- концевые координаты этих фрагментов в полипептидной цепи.

8. Предполагается, что основные функциональные и регуляторные домены Са^+-АТФазы плазматических мембран находятся в границах Thr (315)-Lye (1061) белковой цепи;

участок связывания кальмодулина и аутоингибиторная область фермента расположены в участке Glu (1067)-Lys (I105);

пептидная область Val С1105)-Lys (IÍ6I) белка ответственна за проявление активирующего действия кальмодулина;

участок Thr (3I5)-Xrg (358) является центром регуляции фермента кислыми фосфолипидами.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Емельяненко Е. И., Модянов Н. Н. Шахпаронов М.И. Первичная химическая характеристика каль'модулин-активируемой Са^+,мд -АТФазы зри троцитов человека. - Материалы VI Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов, Рига, 1983, стр. 176-177.

2. Emelyanenko E.I., Shakhparonov M.I., Modyanov N.N. Limited pro-

2+

teolysis of human erythrocyte Сa -ATPase in membrane-bound form. Identification of ca'lmodulin-binding fragments. - Biochem.Biophys. Res.Commun. 1985,,v.126, p.214-219

3. Alakhov V.Yu., Emelyanenko E.I., Shakhparonov M.I., Dudkin S.M.

Calcium-Independent bacterial activator of cyclic nucleotide phos-2+ 2+

phodieaterase and Ca ,Mg -4TPase. - Biochem.Biophys.Res.Commun. 1985, V.132,p.591-597.

4. Модянов H, H., Шахпаронов Mi И"., Емельяненко E. И, Локализация

2+ '

кальмодулин-связывающих участков в полипептидной цепи ca ,мд -AT Фазы эритроцитов человека. - Биология, мембраны), 1986*. т.З-, N5, стр.481-488.

5. Овчинников Е. А., Модянов Н. К., Шахпаронов М. И., Зварич Е. № Сходство антигенной структуры АТР-гидролазного центра .Са -АТФазы плазматических мембран и активных центров АТФаз Ej-Eg-, Fi'Fo~ типов. - Биологич. мемЗраны, 1987, т.'4, N12, стр.1237-1243.

6. Зварич Е.И., Фещенко U.C., Модянов Н.Н. , Шахпаронов VLИ. Исследование структурно-функциональной организации Са2+Мд2+АТФазН мембран эритроцитов человека. - Материалы хи Всесоюзного совещания по транспортным АТФазам, Иркутск, 1987, стр,II.■

7. James P., Zvaritch E.I., Shakhparonov M.I., Penniston J.Т., Carafoli E. The amino* acid sequence of the phosphorylation domain of the erythrocyte Cai -ATPase. - Biochem.Biophys.Res.Commun. 1987, v.149, p.7-12.

8 Zvaritch E.I.,. Festchenko M.S., Shakhparonov M.I. Arrangement of

functional domadne in the polypeptide chain of human erythrocyte 2+

membrane Ca -ATPase. - 1 Spanish-Soviet Congress on physical chemical biology., Spain, 1987, p.22,

9. Alakhov V.Yu., Modyanov N.nv, Shakhparonov M.I., Zvaritch E.I.,

Feschenko M.S., Lutzenko S.V. Elucidation of conservative elements of calmodulin-dependent enzymes with the use of monoclonal antibodies. - Biotech.and Appl.Biochem., 1988, v.10, p.319-325

10. Зварич Е. И., Фещенко Ц.С., Иахпаронов М.И.. Ыодянов Н. Н. Са -АТФаза мембран эритроцитов человека. Исследование молекулярной организации. - Материалы Y Советско-Швейцарского симпозиума по биомембранам, Рига. 1988, с.71.

11. Shakhparonov M.I., Zvaritch Е. I,, f'efltchenko M.S., Modvanov N.N. Human erythrocyte membrane Ca^-ATP'asa. Immunochemical study of the molecular organization. - International Symposium on Molecular basis of biomembrane transport, Italy, 1988, p.82.

12. Zvaritch E.X., Modyanov N.N., James P.H., Carafoll E. Limited

2+

trypsln cleavage of the plasma membrane Ca -ATPase. Identification of the cuts leading to the 90,85,81,and 76 kDa fragment formation. - YII Internationa] Symposium on Calcium-Binding Proteins in Health and Disease, Canada, 1990, p.193.

13. Зварич E. И., Джеймс П. К. Определение С-концевой последовательности белков, иммобилизованных на pvdf мембране. - Материалы Всесоюзного симпозиума по химии белков, Тбилиси, 1990, стр.95.

60x84 i/16 Тир.100

Т-11062 от - 20.07.90г. Формат изд. Объем 1,Бп,л. '. Зал. 119Д

t

ШГПечатник" Мосгорпечать. Н. Краснохолмская д. 5