Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Чистюлин Дмитрий Константинович

Выделение и характеристика иорообразующих белков из

Yersinia ruckeri

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005549737 5 KOI! ZD14

Владивосток - 2014

005549737

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный

руководитель: доктор химических наук, старший научный сотрудник Новикова Ольга Данииловна

Официальные

оппоненты: Антоненко Юрий Николаевич

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией биофизики мембран НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Винокуров Леонид Михайлович

кандидат химических наук, руководитель группы биоинженерии репортёрных белков Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая

организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита состоится «4» июля 2014 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан « » 2014 года

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

Черников О. В.

Актуальность темы исследования. Yersinia ruckeri — грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз у рыб лососевых пород, известный также как «энтерит, сопровождающийся покраснением рта». Ежегодно этот микроорганизм является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним.

Известно, что порообразующие белки наружной мембраны (порины) играют важную роль в адаптация бактерий к условиям окружающей среды и межклеточных взаимодействиях. Бактериальные порины - интегральные мембранные (3-структурированные белки, образующие поры для пассивной диффузии гидрофильных молекул через наружную мембрану (НМ). Особенности структуры и локализация в НМ бактериальной клетки обуславливают наличие у поринов и других функций, отличных от транспортной. Экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, формируют потенциальные сайты взаимодействия с клетками организма-хозяина, в том числе с клетками иммунной системы. Показано, что порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий. Антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов.

Известно также, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с То11-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ бактерий до сих пор изучены недостаточно.

Кроме вышеназванных задач, имеющих прикладное значение, структурно-функциональные исследования поринов НМ бактерий важны для химии мембранных (3-структурированных белков в целом: для выяснения особенностей их пространственной организации, для установления участков структуры, ключевых для поддержания стабильности молекулы этих белков, а также для выяснения механизмов их сборки и денатурации под действием температуры и химических агентов.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции неспецифических поринов бактерий рода Yersinia. Она посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры и функциональной активности ОтрС и OmpF поринов Y. ruckeri, исследованию процесса денатурации OmpF порина под действием температуры и изучению его иммунобиологических свойств.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1) выделить и идентифицировать ОшрБ и ОтрС порины У. гискегг,

2) изучить влияние условий культивирования на экспрессию неспецифических поринов;

3) установить их первичную и пространственную структуру;

4) сравнить физико-химические свойства и функциональную активность этих белков;

5) исследовать процесс термоденатурации ОтрБ порина методами оптической спектроскопии, микрокалориметрии и компьютерного моделирования;

6) изучить иммуногенные свойства ОшрР порина, установить в антигенной структуре белка наличие детерминант, общих с поринами других видов иерсиний;

7) исследовать характер взаимодействия ОтрБ белка с клетками эукариот.

Научная новизна исследования. Впервые выделены индивидуальные ОтрБ и ОшрС порины У. гискеп, установлена их первичная и пространственная структура, охарактеризована функциональной активность. Впервые показана зависимость экспрессии этих белков от условий окружающей среды. Впервые показано, что олигомеры ОшрР порина являются более устойчивыми к действию температуры по сравнению с поринами других видов иерсиний. Впервые показано, что термоденатурация ОтрБ порина проходит поэтапно на различных уровнях организации белковой молекулы. В антигенной структуре ОшрР порина У. гискеп выявлены антигенные эпитопы, общие с поринами других видов иерсиний. Впервые исследовано влияние поринов У. гискеп на клеточный цикл злокачественных клеток крови человека и нормальных клеток тканей рыб.

Практическая значимость работы. Данные о высокой иммуногенности ОшрР порина У. гискеп при относительно низкой его цитотоксичности, позволяет рассматривать этот белок как перспективный протективный антиген для борьбы с инфекцией, вызываемой У. гискеп.

Разработан исключающий стадию гель-хроматографии технологичный способ получения высокоочищенного ОшрР порина, основанный на использовании препарата ДНКазы из гепатопанкреаса крабов, содержащего примесь протеаз.

Основные положения выносимые на защиту. П ОшрР и ОшрС порины У. гискеп подобно неспецифическим поринам наружной мембраны иерсиний имеют различные физико-химические характеристики, отличительные особенности первичной и пространственной структуры и образуют в искусственном бислое разные по размеру каналы.

2) Экспрессия исследуемых поринов зависит от условий культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется ОшрР порин, введение в среду №С1 и повышение температуры приводит к увеличению содержания в бактериальных клетках ОшрС порина.

3) Структура ОшрР порина обладает аномально высокой для неспецифических поринов термостабильностью и способностью

восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя даже после инкубации при 85 °С, температуре необратимого конформационного перехода.

4) Процесс термоденатурации тримера OmpF порина имеет несколько стадий, сопровождающихся на начальных этапах обратимыми изменениями в структуре наружных петель, а в дальнейшем перестройками на уровне третичной и четвертичной структуры белка, приводящими к образованию термостабильных мономеров порина. Различия в спектрах триптофановой флуоресценции исследуемых поринов обусловлены особенностями положений Тгр212 в OmpF и Тгр184 в ОшрС порине.

5) В петлях L1 и L4 молекулы OmpF порина локализованы иммунодоминантные В-эпитопы, перекрёстно реагирующие с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

6) OmpF порин Y. ruckeri имеет низкую цитотоксичность и оказывает влияние на клеточный цикл как злокачественных, так и нормальных клеток. В низких концентрациях белок ингибируют S-стадию клеточного цикла для обоих типов клеток, а высокие концентрации вызывают апоптоз злокачественных клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде статей в материалах Международных заочных научно-практических конференций, Новосибирск, 1 февраля и 4 июля 2012 г; в Сборнике трудов Международной научной конференции «Математическое им компьютерное моделирование в биологии и химии», Казань, 28-30 мая 2012 г.; на XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 11-18 сентября 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в российских журналах и 1 в международном журнале, рекомендованных ВАК РФ, 4 статьи в сборниках трудов Международных и отечественных конференций и 2 тезисов докладов в материалах отечественных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 18 апреля 2014 г.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Структура и обьем диссертации. Диссертация содержит разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы и методы, Выводы и Список литературы, включающий 185 наименований. Диссертация изложена на 110 страницах. Результаты представлены в 12 таблицах и иллюстрированы 40 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение неспецифических (OmpF и ОтрС) поринов К ruckeri 1.1. Первичная структура и пространственные модели ОтрС- и OmpF поринов Y. ruckeri

С помощью ПЦР амплификации с использованием ген-специфичных праймеров были секвенированы нуклеотидные последовательности ompF и отрС генов Y. ruckeri, на основании которых были выведены аминокислотные (АК) последовательности соответствующих белков (рис. 1). Величины мол. масс мономеров ОтрС- и OmpF- подобных поринов Y. ruckeri, рассчитанные из данных АК последовательности, составили 39359.35 и 38015.20 Да.

шщ>С_Хгцс ompr_Yruc 10SH_A -SSA

ompC_Yrac

ompF Yruc

L10SH_A -3SA

Рис. 1. Выравнивание АК последовательностей OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri и прототипа осмопорина Klebsiella pneumonia (код PDB lOSM). Наружные петли и элементы вторичной структуры указаны в соответствии с кристаллической структурой прототипа: а-спиралъныеучастки отмечены красным цветом, p-структура —синим цветом. Рисунок выполнен с помогцыо программы Maestro 9.3.

На основании данных первичной структуры исследуемых белков с помощью метода гомологичного моделирования в программе МОЕ 2013.08 были построены их теоретические модели (рис. 2). В качестве прототипа был использован белок отркЗб из К. pneumonia (код PDB 10SM), для которого известны данные рентгеноструктурного анализа. Степень идентичности АК последовательностей OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri и прототипа составляют 63.5 и 75.4%, а степени подобия - 72.0 и 83.0% соответственно. Суперпозиция всех Са-атомов ЗБ-моделей поринов Y. ruckeri и прототипа показала, что

величина среднеквадратичного отклонения для ОшрС и OmpF поринов составляет 0.68 и 0.77 Ä соответственно.

Структуры OmpF и ОтрС мономеров Y. ruckeri по аналогии с прототипом представляют собой ß-баррель (бочонок), образованный 16-тью ß-тяжами, связанными 8-мью короткими периплазматическими петлями (Т1-Т8) и 8-мью наружными петлями различной длины с а-спиральной и неупорядоченной пространственной структурой. (L1-L8) (Рис. 2, А). Петля L2 участвует в образовании олигомерной структуры поринов. Петля L3 OmpF и ОтрС белков направлена к центру поры, где она образует сужение канала. Петли LI, L4-L8 направлены во внеклеточное пространство. При суперпозициии полученных моделей обнаружено, что мономеры OmpF и ОтрС поринов различаются длиной и конформацией некоторых наружных петель, а также локализацией одного из 3-х остатков триптофана. Теоретические модели тримеров ОтрС и OmpF поринов Y. ruckeri построены и оптимизированы с помощью программы МОЕ 2013.08 с использованием в качестве прототипа кристаллической структуры тримера осмопорина (отркЗб) К. pneumoniae. В стабилизации тримерной структуры поринов Y. ruckeri участвуют водородные связи, гидрофобные и ионные взаимодействия. Полученные высокоточные модели поринов были использованы для объяснения некоторых физико-химических свойств этих белков.

L5

Рис. 2. А: Суперпозиция ЗО-структур мономеров ОтрС (отмечено желтым цветом) и ОтрР (отмечено фиолетовым цветом) поринов У. гискег!. Б: Пространственная структура тримера ОтрР порина У. гискегг

1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны К гискеп, извлекаемых детергентами различной природы

Для получения поринов было использовано несколько подходов, в основу которых легли классические методы, разработанные для поринов энтеробактерий. Для выделения белков использовали культуру клеток, выращенную в условиях температурного оптимума метаболических процессов иерсиний, при 24-26 °С.

1.2.1. Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом (РОЕ)

Для разрушения микробных клеток использовали ультразвуковую дезинтеграцию. Полученную фракцию «сырых» мембран последовательно экстрагировали 5 раз 0.5%-ным раствором РОЕ и 4 раза - 3%-ным РОЕ. Анализ полипептидного состава полученных экстрактов проводили методом БОБ, ПААГ-электрофореза. Профиль полученных белков НМ представлен на рис. 3,А. Как видно из данных рисунка, максимальная интенсивность полипептидных полос в области олигомеров поринов обнаружена во фракциях 6 и 7.

6 6к 7 7к 8 8к

ц

150 120 70 55 45 35

25

Рис. 3. Электрофореграммы фракций неспецифических поринов НМ У. гискеп, извлекаемых различными детергентами. Температура культивирования бактерий 24 °С.

А: Профиль белков, экстрагируемых 3%-ным раствором РОЕ. Номера фракций указаны на рисунке (приведены профили не всех фращий). *к — образец кипятили в течение 5 мин для получения ТСБ мономеров. Б: Профиль белков, экстрагируемых с помощью растворов БОБ. 1 —лизат бактериальных клеток', 2 — фракция ТЛБ олигомеров поринов', 3 — фракция ТСБ мономеров поринов; 4 — фракция ТСБ мономеров поринов, очищенная с помощью гель-хроматографии на БерИасгу! Б-ЗОО; 5 - белки-маркёры, мол. масса указана в кДа.

После кипячения фракций, содержащих олигомеры поринов, в области мономеров было обнаружено несколько полипептидов с мол. массами в интервале значений 32-40 кДа. Учитывая расчетные значения мол. масс исследуемых поринов, можно предположить, что во фракциях 6к и 7к, помимо доминирующего в количественном отношении ОтрС порина (39 кДа), присутствует ОтрБ порин (38 кДа). Кроме того, данные фракции содержали неидентифицированные белки, не изменяющие свою электрофоретическую

подвижность после кипячения, с мол. массами, близкими к мол. массам целевых поринов и, предположительно, ОтрА порин с мол. массой 37.75 кДа.).

Таким образом, фракция белков НМ, извлекаемая 3%-ным раствором РОЕ, помимо неспецифических поринов содержала примесные белки с близкими значениями мол. масс, что значительно затруднило бы очистку целевых белков.

1.2.2. Экстракция ионным детергентом и очистка фракции пориновых белков

Для экстракции поринов ионным детергентом БОБ был использован классический метод Розенбуша, модифицированный нами.

Полученную после экстракции бактериальной массы саркозилатом натрия фракцию клеточных оболочек обрабатывали ДНКазой для расщепления нуклеиновых кислот и последующего их удаления. Остаток экстрагировали 2%-ным раствором БОБ, в результате получили нерастворимый пептидогликан (ПГ)-белковый комплекс, обогащенный неспецифическими поринами. В отличие от метода Розенбуша, предусматривающего эту обработку при 50- 60 °С, получение ПГ-белкового комплекса У. гискег1 проводили при комнатной температуре, поскольку при повышенной температуре происходила диссоциация комплекса и большая потеря белка за счет перехода его в супернатант. Для получения термолабильной олигомерной пориновой фракции диссоциацию полученного ПГ-белкового комплекса проводили по методу Райтмайер обработкой 1%-ным раствором БОБ, содержащим 0.5 М №С1, при 37 °С.

Полученный после центрифугирования супернатант содержал олигомерную фракцию поринов У. гискег/ и небольшое количество примесных белков (рис. 3, Б линия 2). После кипячения в этой фракции были обнаружены белки, по подвижности соответствующие ОшрС и ОтрР поринам (рис. 3, Б, линия 3).

Вследствие больших различий молекулярных масс примесных белков и фракции ТЛБ тримеров поринов (110-120 кДа) для последующей очистки целевых белков использовали метод гель-хроматографии. В качестве сорбента использовали 5ерЬасгу1 Б-ЗОО, элюирующий буфер содержал 0.25% БОБ. Электрофоретический профиль очищенной фракции поринов, прогретой при 100 °С, приведён на рис. 3, линия 4. Таким образом, с помощью экстракции БОв была получена олигомерная фракция поринов У. гискеп, которая не содержала значительных количеств трудноотделимых примесных белков.

Как видно из полученных данных, культивирование У. гиске/ч при комнатной температуре приводит к экспрессии двух неспецифических поринов, по подвижности соответствующих белкам ОтрБ и ОтрС. В связи с этим следующим этапом исследования стал подбор условий культивирования У. гискеп для получения максимального выхода индивидуальных поринов и их идентификации.

1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и OmpC-подобных поринов и их идентификация

С целью изучения влияния условий культивировании Y. ruckeri на экспрессию неспецифических поринов нами был проведен сравнительный анализ профилей фракций поринов, полученных из НМ бактерий, выращенных в различных условиях (при температурах 8, 24, 37 °С и концентрациях NaCl 0, 150, 300 мМ) (рис. 4). Данные, представленные на рис. 4, свидетельствуют о том, что во всех белковых фракциях присутствуют оба типа поринов (за исключением фракции 8-0). Тем не менее, изменение условий культивирования бактерий значительно влияет на соотношение OmpF и ОшрС белков. При пониженной температуре (вне зависимости от присутствия соли в среде), а также при комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин (рис. 4, линии 1-4).

8-0 8-150 8-300 24-0 24-150 24-300 37-0 37-150 37-300

39,4 kDac 38 kDac

Рис. 4. Электрофоретические профили фракций пориновых белков, полученных из бактерий, выращенных в различных условиях (температура указана в "С, концентрация ИаС1 в мМ).

Da

Рис. 5. Идентификация исследуемых поринов из НМ Y. ruckeri с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Учитывая, что содержание OmpF порина при добавлении соли увеличивается, оптимальными условиями культивирования бактерий с целью получения максимального выхода OmpF белка следует считать 8 °С и концентрацию NaCl в среде, равную 150 мМ.

При комнатной температуре введение в среду NaCl (фракции 24-150 и 24-300) приводит к появлению заметного количества ОтрС порина. Изменение соотношения двух типов белков в пользу ОтрС порина характерно для фракций 37-150 и 37-300, полученных из бактерий, выращенных при повышенной температуре в присутствии соли. Это обстоятельство, а также уменьшение количества OmpF белка во фракции 37-150 позволяют считать эти условия оптимальными для получения максимального выхода ОтрС порина.

Идентификация поринов, присутствующих в исследуемых фракциях, была проведена с помощью масс-спектрометрического анализа образца 24-300, в котором представлены оба типа поринов. Результаты, представленные на рис. 5, подтверждают наличие во фракции 24-300 двух белков с массами соответствующими расчетным мол. массам ОтрС и OmpF поринов (39 359 и 38 015 Да соответственно). В качестве маркера использовали бычий сывороточный альбумин (расчетные массы ионов 33.2 и 66.4 кДа).

1.4. Выделение индивидуальных OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri

Для выделения индивидуальных белков был использован метод экстракции SDS, описанный в гл. 1.2.2. Оптимальные условия культивирования бактерий для получения OmpF и ОтрС поринов приведены в главе 1.3.

На рис. 6 показаны электрофореграммы очищенных ТЛБ олигомеров и ТСБ мономеров ОтрС (линии 3, 4 соответственно) и OmpF поринов (линии 6, 7

м 5 6

Рис. 6.

Электрофореграммы очищенных поринов Y. ruckeri:

1, 3, 5 - ТЛБ олигомеры;

2, 4, 6 — ТСБ мономеры; 1,2 — смесь OmpF и ОтрС;

__3,4-ОтрС;

5, б- OmpF; М- белки- маркеры.

Для сравнения приведены соответствующие фракции (линии 1, 2), полученные из бактерий, выращенных при комнатной температуре в присутствии 150 мМ NaCl. В этой фракции, как видно на рисунке, присутствуют оба типа поринов. Индивидуальность полученных белков была подтверждена методом твердофазного секвенирования до 8-го N-концевого остатка. N-Концевой аминокислотой обоих белков является аланин.

соответственно).

12 3 4

170 150

_ 120

70

■

55

35 25

1.5. Технологичный способ очистки OmpF порина

Согласно процедуре выделения поринов НМ грамотрицательных бактерий по методу Розенбуша, перед извлечением комплекса ПГ-белок необходима обработка ДНКазой для удаления большого количества нуклеиновых кислот, присутствующих в экстрактах после разрушения микробных клеток. Кроме того, как было сказано выше, сырая фракция пориновых белков содержит большое количество примесных низкомолекулярных белков. С целью упрощения процедуры выделения, мы изменили порядок обработки микробных клеток и обрабатывали сырую фракцию поринов препаратом ДНКазы после диссоциации комплекса ПГ-белок. В используемом препарате из гепатопанкреаса крабов, помимо ДНКазы, содержится ряд протеолитических ферментов. Это позволило в одну стадию очистить OmpF белок от нуклеиновых кислот и примесных белков, поскольку тримеры порина устойчивы к действию протеиназ. Результат такой очистки представлен на рис. 7. Отсутствие нуклеиновых кислот в очищенной фракции поринов подтверждено данными УФ-спектроскопии.

Рис. 7. Электрофореграмма фракций OmpF порина Y. ruckeri.

1 — неочищенная фракция поринов, полученная методом экстракции SDS;

2 — фракция 1 после кипячения;

3 — фракция поринов, обработанная препаратом ДНК-азы из гепатопанкреаса крабов 4 - фракция 3 после кипячения.

2. Исследование функциональных свойств OmpF и ОтрС поринов

2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и ОтрС

поринов из НМ Y. ruckeri

Изолированные OmpF и ОтрС белки Y. ruckeri обладают порообразующей активностью. Сравнительный анализ проводимости одиночных каналов, образованных этими белками в бислойной липидной мембране (БЛМ), показал, что поры OmpF и ОтрС белков имеют разную проводимость, 3 и 2 нСм соответственно (рис. 8). Кроме того, поры, образованные OmpF белком закрывались при мембранном потенциале 175 мВ, каналы ОтрС белка — при 150 мВ. Проведенные эксперименты подтвердили известные литературные данные о том, что при пониженной температуре в НМ иерсиний экспрессируется преимущественно OmpF белок, а при повышенной - ОтрС порин с меньшим размером пор.

■105 -150

+50 тУ 0. -50 тУ

t встраивание

1

Рис. 8. Запись флуктуации тока одиночных каналов, образованных ОтрР (слева) и ОтрС (справа) поринами НМ У. гискеп в БЛМ, сфомированной из дифитаноилфосфатидилхолина, в 10 мМ трис-НС1 и 1 М КС1, рН 7.9. Концентрация белка 4 нг/мл.

2.2. Порообразующие свойства ОтрК порина при повышенных температурах

В ходе измерения проводимости каналов, образуемых ОтрР порином в БЛМ, было обнаружено, что исследуемый белок восстанавливает функциональную активность после нагревания при 85°С. Так, через 5 мин после включения прогретого белка в липидный бислой наблюдались аномальные флуктуации тока (рис. 9, А, кривая 1), однако уже через 1 ч характер изменения проводимости мембраны мало отличался от такового в присутствии нативного белка (рис. 9, А, кривая 2). После прогревания образца порина при 95 °С (в этих условиях в растворе белка с помощью БОЗ, ПААГ-электрофореза были обнаружены только ТСБ мономеры белка (глава 3.2) наблюдались единичные включения белка (рис. 9, Б), которые в большинстве случаев приводили к образованию короткоживущих каналов и дестабилизации мембраны.

Рис. 9. А: Функциональная активность ОтрР порина после нагревания образца при 85°С в течение 30 мин. Запись тока через БЛМ через 5 мин (1) и через 1 ч (2) после включения белка в бислой.

Б: Функциональная активность ОтрР порина после нагревания образца при 95°С в течение 30 мин.

Таким образом, в ходе экспериментов была обнаружена способность ОтрР порина восстанавливать свою функционально активную конформацию в присутствии липидного бислоя даже после нагревания до 85°С. Эта значение близко к температуре его термоденатурации (глава 3.3.).

3. Молекулярная структура и пространственная организация ОтрГ и ОтрС поринов К гискеп

3.1. Сравнительный анализ пространственной структуры ОшрГ и ОтрС поринов У. гискег1 с помощью оптических методов

Для характеристики пространственной организации исследуемых белков в растворе использовали методы оптической спектроскопии: круговой дихроизм и собственную белковую флуоресценцию. Для солюбилизации образцов поринов использовали 0.25%-ный раствор БОБ, в котором, как было показано ранее, не происходит денатурации ОтрР порина из псевдотуберкулезного микроба.

Круговой дихроизм. Спектр КД ОтрР порина в ближней УФ-области (240-310 нм) имеет достаточно выраженную тонкую структуру, обусловленную в областях 260-270, 275-285 285-305 нм, обусловленную остатками фенилаланина, тирозина, и триптофана соответственно (рис. 10, А кривая 1).

Рис. 10. Спектры КД OmpF (А) и ОтрС (Б) поринов HM Y ruckeri в ближней (250 - 300 нм) (кривые 1) и дальней (190 - 240 нм) УФ-области (кривые 2).

В спектре КД ОтрС порина в этой УФ-области те же характеристичные полосы менее выражены и имеют меньшую эллиптичность (рис. 10, Б кривая 1), что указывает на менее жёсткую фиксацию третичной структуры этого белка.

Спектры КД исследуемых поринов в дальней УФ-области (190 - 240 нм), области поглощения пептидных связей, существенно различаются, что подтверждается расчётом элементов вторичной структуры, выполненным с помощью пакета программ CD Pro. Как следует из расчетов, содержание а-спирали в ОтрС порине в 3 раза больше, нежели в OmpF белке. Поскольку порообразующие белки обоих типов (OmpF и ОтрС), выделенные из HM Y. ruckeri, имеют высокое содержание (62.8 и 60.6 %) суммарной ß-структуры, их можно отнести к белкам ß-класса, что характерно для изолированных поринов грамотрицательных бактерий в растворах детергентов.

Собственная белковая флуоресценция. Спектры суммарной флуоресценции OmpF и ОтрС поринов Y rucken имеют различное положение максимумов. В случае OmpF порина максимум суммарной эмиссии находится

при 323±1 им, а в случае ОтрС белка - при 339±1 нм. Максимумы триптофановой флуоресценции обоих поринов находятся соответственно при 335±1 и 340±1 нм. Аппроксимация суммарной флуоресценции исследуемых белков спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина (рис. 11) показала, что в случае OmpF порина 24.5% всех остатков триптофана приходится на долю формы III (максимально доступной растворителю), а в случае ОтрС белка - 45.3%.

Рис. 11. Спектры флуоресценции OmpF (слева) и ОтрС (справа) поринов Y. ruckeri и га аппроксимация спектральными формами излучения остатков тирозина (Y) и триптофана (формы S, I, III). Возбуждение 280 нм при 20 "С. А - Спектр OmpF порина: вклады остатков тирозина (27.9 %) и спектральных форм триптофана S, I и III (14.0, 33.7 и 24.5 соответственно). Б - Спектр ОтрС порина: вклады остатков тирозина (11.4 %) и спектральных форм триптофана S, 1 и III (10.9, 32.4 и 45.3 % соответственно).

Как было сказано выше (глава 1.1) два из 3-х остатков триптофана в полипептидной цепи исследуемых белков расположены одинаково (Тгр56 - в 3-ем ß-тяже, на поверхности барреля в межмономерном пространстве, Тгр105 - в петле L3). Положение 3-его остатка Тгр существенно различается: Тгр212 в OmpF порине находится в 10-ом ß-тяже и входит в состав так называемого гидрофобного пояса, Тгр 184 в ОтрС белке, расположенный в периплазматической петле Т9, экспонирован на поверхности молекулы порина и не имеет такого гидрофобного окружения. Как следует из расчетов доступности растворителю этих остатков триптофана (табл. 1, глава З.1.), при 27 °С Тгр 184 ОтрС порина полностью доступен растворителю (97.3%), a Trp212 OmpF порина - только наполовину (56.9%) (табл. 1). Таким образом, данные, полученные с помощью теоретических моделей исследуемых белков, хорошо объясняют различия в параметрах спектров их суммарной и триптофановой флуоресценции.

А

Б

300 320 540 360 380 400 ^на

300 310 340 360 380 400 Мы

3.2. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре OmpF и ОшрС поринов под действием температуры

Для того, чтобы определить, влияют ли различия в пространственной структуре исследуемых белков на их термоустойчивость, с помощью SDS, ПААГ-электрофореза мы провели сравнительный анализ изменений в их молекулярной структуре под действием температуры (рис. 12). Полученные данные свидетельствуют о различной стабильности тримерной структуры исследуемых поринов. Превращение олигомеров OmpF порина (ТЛБ тримеры) в термоденатурированные мономеры (ТСБ мономеры) наблюдалось при более высокой температуре, в интервале 80-90 °С. В случае ОтрС порина диссоциация тримеров белка начиналась при 65°С и заканчивалась при 75 °С.

А Б

Рис. 12. Электрофореграммы образцов ОтрР и ОтрС поринов У. гискеп, прогретых при различных температурах.

А - ОтрР порин; Б - ОтрС порин. Образцы белков прогреты в течение 10 мин при указанных температурах; М - белки-маркеры (мол. масса указана в кДа).

Изучение процесса температурной денатурации исследуемых белков с помощью метода собственной белковой флуоресценции подтвердило результаты, полученные с помощью БОБ, ПААГ-электрофореза. Середины переходов, отражающих зависимость изменения соотношения интенсивностей флуоресценции К=1з2о/1з5о от температуры при термоденатурации ОтрБ и ОтрС белков приходятся на 87 и 70 °С соответственно. Таким образом, подобно неспецифическим поринам НМ других грамотрицательных бактерий, ОтрБ порин У. гискег! оказался более устойчив к действию температуры, нежели порин ОтрС типа. С помощью теоретических моделей олигомерных структур исследуемых белков показано, что в стабилизации тримера ОтрБ порина У. гискег1 участвует большее количество водородных связей и гидрофобных контактов, чем в стабилизации молекулы ОтрС тримера. Это коррелирует с экспериментальными данными о термостабильности исследуемых белков.

Существенные различия были обнаружены в характере изменения положения максимума триптофановой флуоресценции исследуемых белков. Как видно из данных рис. 13, в случае ОтрС порина, в отличие от ОтрР белка, существенного сдвига в длинноволновую область спектра при нагревании образца порина не наблюдается.

3dO

J 355 «

4 350

» 345 ?

J 340

335 330

Рис. 13. Изменение положения максимума эмиссии в спектре триптофановой флуоресценции поринов У. гискеп в процессе термоденатурации. 1- ОтрР, 2-ОтрС.

20 30 40 50 60 "0 80 90 100

ис

Расчёт изменений в процессе термоденатурации доступности растворителю различных по положению остатков триптофана в исследуемых белках показал следующий эффект. Остаток Тгр212 в Отрр порине при увеличении температуры от 27 до 97 °С становится в два раза более доступным для растворителя, в то время как Тгр184 в ОтрС порине не меняет своей доступности (табл. 1). С помощью моделей пространственной структуры исследуемых белков было наглядно показано, как изменяется положение боковой цепи остатков триптофана (ориентация индольного кольца) относительно поверхности барреля ОтрБ и ОтрС поринов (рис. 14) при термоденатурации.

Таблица 1. Влияние температуры на доступность растворителю* остатков

АК остатки Trpl84 OmpC Y. ruck. Тгр212 От pF Y. ruck.

Температура 27 °С 97 °С 27 °С 97 °С

% доступности растворителю 97.336 98.438 56.889 100.625

* - Расчет поверхности доступной растворителю проведен с помощью программы Discovery Studio 3.0 (Discovery Studio Modeling Environment, Release 3.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2010j с размером грида 240 точек на атом и радиусом пробы 1.0 А.

ОтрС TrplS4

Рис. 14. Суперпозици 3D- структур мономеров OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri после молекулярно-динамической симуляции в течение 1нс.

3.3 Мониторинг изменений в пространственной структуре ОшрР порина под действием температуры

Детальное исследование изменений в пространственной организации ОтрБ порина под действием температуры было проведено с помощью оптических методов и микрокалориметрии.

Анализ спектров КД ОтрБ порина в пептидной области до и после прогревания образца белка от 25 до 90 °С и расчеты с помощью пакета программ СЭРго показали, что при диссоциации олигомеров порина (при переходе от ТЛБ тримеров белка к ТСБ мономерам) происходит резкое увеличение (в 4.4 раза) доли а-спиральных участков и уменьшение содержания (в 1.5 раза) суммарной Р-структуры , в то время как содержание неупорядоченной структуры остается практически неизменным. Как и в случае поринов из других видов иерсиний для ОтрБ белка У гискач под действием температуры наблюдается постепенное уменьшение интенсивности флуоресценции, так называемое температурное тушение, и потеря жесткости пространственной организации белковой молекулы.

Мониторинг изменений вкладов излучения тирозина и различных спектральных форм триптофана (рис. 15) показал, что при увеличении температуры в эмиссии порина происходит существенное перераспределение вкладов форм триптофана I и III: значительно увеличивается количество остатков триптофана, экспонированного в воду за счет соответствующего уменьшения остатков триптофана в гидрофобном окружении. Следует отметить, что небольшое гидрофобное ядро в молекуле порина сохраняется (наблюдается небольшое увеличение остатков триптофана формы Б) и практически не изменяется вклад остатков тирозина.

На рис. 16 представлены результаты изменений во вторичной, третичной и четвертичной структуре ОтрБ порина из У. гискег1 в процессе его термоденатурации, определенные методами КД, собственной белковой флуоресценции и электрофореза соответственно. Как видно из данных рис. 16, эти изменения сопровождаются поэтапной перестройкой структуры белка на различных уровнях его пространственной организации. В интервале 20-60 °С наблюдается плавное повышение эллиптичности, что, очевидно, связано с

р 0,5

Рис. 15. Температурная зависимость относительной эмиссии ОтрР порина и вкладов спектральных форм триптофана.

20 30 40 а 60 70 80 90 1,°С

незначительными перестройками в области петель, участков АК последовательности порина с относительно гибкой структурой. В интервале 6075 °С наблюдаются более значительные изменения на уровне вторичной структуры порина, которые, однако, не приводят к диссоциации тримеров белка. Возможно, эти изменения происходят на участках тяжей р-барреля, прилегающих к петлям, и приводят к увеличению содержания а-спирали за счет р-структуры. При дальнейшем увеличении температуры в интервале 75-85 °С по данным электорофореза наблюдается постепенный переход тримерной ТЛБ формы порина в ТСБ мономеры. При 85 °С завершаются изменения на уровне вторичной структуры порина, которые сопровождаются резким кооперативным переходом на уровне третичной и четвертичной структуры белка, т.е. происходит полная диссоциация тримера порина.

Рис. 16. Относительные изменения под действием температуры в пространственной структуре ОтрБ порина из К гискеп. Для характеристики изменений в структуре белка методом собственной флуоресценции (чёрная линия) взята величина отношения интенсивностей флуоресценции при длинах волн 350 и 320 нм (К=1з5(/1з2о)> для характеристики изменений методом КД (синяя линия) взята величина средней молярной эллиптичности при 210 нм.

Важно отметить, что изменения вторичной структуры, предшествующие диссоциации порина, являются обратимыми. Об этом говорят результаты исследований функциональной активности белка, которые показали, что при реконструкции образцов порина, прогретых до 85 °С, в липидный бислой их функциональная активность восстанавливается до исходной в течение 1 ч (глава 2.2, рис. 9, А, кривая 2).

С помощью сканирующей микрокалориметрии была определена точка плавления ТЛБ тримеров OmpF порина Y. ruckeri. Избыточная теплоемкость белка описывается кривой с максимумом при 82.5 °С и полушириной 2.5 °С. Следует отметить, что тепловой переход исследуемого белка необратим, поскольку при повторном прогреве образца порина изменения теплоемкости белка не наблюдалось. Значение температуры тотального плавления OmpF порина хорошо согласуется с данными конформационного перехода на уровне четвертичной структуры белка (диссоциации олигомера порина).

3.4 Иммунологическая и иммунохимическая характеристика OmpF порина Y. ruckeri

Тример OmpF порина НМ Y. ruckeri оказался высокоиммуногенным для мышей. В результате трехкратной иммунизации мышей линии BALB/c была получена антисыворотка с титром антител, равным 4.4 (в -lg). Обнаружено, что антисыворотка к OmpF порину Y. ruckeri взаимодействуют с OmpF поринами из НМ других видов патогенных и непатогенных иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia). Результаты ИФА (рис. 17) взаимодействия этой антисыворотки с гетерологичными антигенами демонстрируют достаточно высокий (60-88 %) уровень перекрестных реакций между OmpF поринами бактерий рода Yersinia. Полученный результат коррелирует с расчетными данными степени подобия полных АК последовательностей (в среднем 85%) и вариабельных участков их первичной структуры, соответствующих наружным петлям (в среднем 60%).

%падсбия

100, щ

ИМ

Yirt. Yjenrt. Yfred. Ypsdt. Y.ruck. порты иерсжий

Рис. 17. ИФА взаимодействия антисыворотки к OmpF порину Y. ruckeri с OmpF поринами некоторых видов □ ифа патогенных и непатогенных ■ пост. иерсиний.

□петли поел. - степень подобия АК последовательностей петли - степень подобия участков наружных петель

Как следует из данных рис. 18, несмотря на высокую степень подобия полных АК последовательностей OmpF поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis степень подобия линейных детерминант белков невелика. Очевидно, определяющим фактором во взаимодействии OmpF порина Y. ruckeri с гетерологичными антителами является степень подобия составных (конформационных) детерминант. Так, в случае рекомбинантных мутантных белков с делениями петель LI (dell), L4 (del4), L6 (del6) и L8 (del8), мы наблюдали значительное уменьшение полноты связывания (рис. 18, А). Очевидно, это вызвано утратой одного из элементов структуры порина и, как следствие, изменениями в конформации остальных наружных петель. Также уменьшалась в 2 раза эффективность взаимодействия OmpF Y. ruckeri с антителами к ТСБ мономеру порина Y. pseudotuberculosis по сравнению с таковой при взаимодействии с антителами к тримеру порина псевдотуберкулезного микроба (рис. 18, А). Кроме того, был выявлен достаточно низкий уровень торможения специфического связывания при ингибировании реакции связывания ТСБ мономера OmpF порина Y.

pseudotuberculosis с гомологичными антителами соответствующим мономером OmpF порина Y. ruckeri (рис. 18, Б). Скорее всего, это связано с тем, что в процессе термоденатурации тримеров поринов конформационные детерминанты разрушаются, и в реакции участвует только часть эпитопов, представленных линейными детерминантами и устойчивыми к действию температуры общими эпитопами, линейными и сохранившимися на уровне вторичной структуры белка. Полученные данные согласуются с современными представлениями о том, что определяющую роль в иммунохимической активности белков играют конформационные антигенные детерминанты, формирующиеся на более высоких уровнях пространственной организации их молекул.

Использование в качестве ингибиторов синтетических пептидов, соответствующих наружным петлям поринов, позволяет выявить участие той или иной петли в формировании антигенных детерминант. Мы использовали этот подход для выяснения роли некоторых наружных петель в формировании антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri. Учитывая высокую степень подобия первичной структуры наружных петель в молекулах поринов Y.ruckeri и Y. pseudotuberculosis, в качестве ингибиторов реакции взаимодействия OmpF порина Y.ruckeri с гомологичной антисывороткой были взяты синтетические пептиды, соответствующие наружным петлям LI, L4, L6, L8 OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

1,8 1 1,6 1,4 1,2 1 ■ 0,8 0,6 0,4 0,2 0

rfi

rh

Г*1

rfl

nf~|

rb

jn.

Б

90.00

80.00

к 70.00

Е fZ 60.00

а

о 50.00

5 40.00

с X 30.00

20.00

10.00

0.00

антитела к антигенам

.А«'

„8"

ТСБ ТСБ Y.psdt Y.ruck.

ИН ГН б ИТ 0|) Ы( 28 I,I кг)

Рис. 18. А: ИФА взаимодействия тримера OmpF Y. ruckeri с антисыворотками к различным молекулярным формами и мутантным белкам OmpF порина Y. pseudotuberculosis

Б: Ингибирование реакции взаимодействия (ИФА) ТСБ мономера OmpF порина Y. pseudotuberculosis с гомологичными антителами. Ингибиторы: ТСБ OmpF поринов Y. pseudotuberculosis (ТСБ Y. psdt.) и Y. ruckeri (ТСБ Y. ruck.).

Обнаружено, что только пептиды, соответствующие петлям L1 и L4, в наибольшей степени ингибировали (22.7 и 17% соответственно) реакцию связывания OmpF порина Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой (рис. 19).

Рис. 19. Ингибирование реакции взаимодействия (ИФА) OmpF порина Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой. Ингибиторы: синтетические пептиды,

соответствующие участкам

наружных петель LI, L4, L6, L8 OmpF порина Y. pseudotuberculosis. [С] ингибитора 16 мкг.

В то же время, пептиды, соответствующие петлям L6 и L8 порина Y. pseudotuberculosis, несмотря на достаточно высокий уровень подобия АК последовательностей с соответствующими петлями порина Y. ruckeri, практически не ингибировали данную реакцию. Построение ЗО-модели показало, что участки, соответствующие петлям L1 и L4 в нативной структуре этого белка, более доступны для взаимодействия (например, с антителами), чем, петля L6. Таким образом, можно предположить, что участки петель L1 и L4 (или их фрагменты) являются иммунодоминантными В-эпитопами OmpF порина Y. ruckeri и играют значительную роль в образовании перекрестно реагирующих антигенных детерминанта OmpF порина Y. ruckeri. Это соответствует современным представлениям, о том, что В-лимфоциты и антитела узнают конформационно-зависимые поверхностные эпитопы, расположенные в местах наибольшей гидрофильности и гибкости полипептидной цепи белка

3. 5. Взаимодействие OmpF порина Y. ruckeri с клетками эукариот

Для изучения процесса взаимодействия OmpF порина У. ruckeri с клетками макроорганизма были использованы клетки моноцитарного лейкоза человека (ТНР-1) и нормальные клетки сердца кеты (СНН439). В предварительных опытах была определена цитотоксическая активность порина. Для ее оценки был использован MTS-метод, в качестве положительного контроля в этом эксперименте был использован цисплатин (1С50 = 3.15 мкг/мл). OmpF порин проявил умеренную цитотоксичность по отношению к обоим видам клеток (после 48 ч обработки 1С50 составляли 23.5 и 48.6 мкг/мл для СНН439 и ТНР-1 соответственно).

На основании полученных данных был выбран рабочий диапазон концентраций порина. Для оценки влияния белка на распределение клеток эукариот по фазам клеточного цикла был применён метод проточной цитометрии (FACS) с окрашиванием ДНК клеток красителем пропидиййодидом.

Установлено, что в присутствии ТЛБ тримеров OmpF Y. ruckeri в 1.5 раза увеличивалось количество клеток ТНР-1 в фазе S (рис. 20), а также

наблюдалось снижение в 5.6 раза количества клеток в фазе G2, причем эффект был наиболее выражен при низких концентрациях белка (12.5 мкг/мл). Обработка клеток СНН439-В порином в концентрации 11.8 мкг/мл также стимулировала небольшое, однако статистически достоверное увеличение количества клеток, находящихся в S-фазе, и их незначительное снижение в фазе G2. На стадии G1 количество клеток ТНР-1 и СНН439-В снижалось в 1.38 и 1.05 раза по сравнению с контролем соответственно.

Таким образом, можно предположить, что OmpF порин НМ Y. ruckeri инициирует так называемый S-арест клеточного цикла как в нормальных, так и в опухолевых клетках, т.е. препятствует синтезу белков, необходимых для клеточного деления. В связи с этим уменьшается количество клеток, находящихся на стадии подготовки к митозу. Интересно отметить, что наблюдаемый эффект был наиболее выражен в отношении опухолевых клеток.

ТНР-1 СНН439-В

Рис. 20. Влияние ОтрБ порина У.гискеп на распределение клеток по фазам клеточного цикла. ТНР-1 - клетки моноцитарного лейкоза

человека, СНН439 - нормальные клетки сердца кеты.

Рис. 21. Влияние ОтрБ порина К гискеп на развитие клеток лейкоза человека ТНР-1.Слева контроль; справа клетки, обработанные ТЛБ ОтрБ порином в концентрации 1С ¡о

Кроме того, для тримера OmpF порина Y. ruckeri было показано, что белок в концентрации, соответствующей 1С 50, стимулирует развитие апоптоза в клетках ТНР-1. Количество клеток в состоянии апоптоза после 48 часовой инкубации с исследуемым порином составило 18.26% (рис. 21). В случае ТСБ мономера OmpF увеличение количества таких клеток при концентрации 1С50 было незначительно, всего 1.67%. Полученный результат согласуется с данными Buommino с соавторами, показавшими индукцию апоптоза в клетках эпителия семенников крысы под действием порина из Pseudomonas aeruginosa.

ВЫВОДЫ

1. Полученные в индивидуальном виде неспецифические OmpF и ОтрС порины наружной мембраны Y. ruckeri являются p-структурированными белками, отличаются особенностями строения и физико-химических свойств, способны образовывать разные по проводимости каналы в липидных мембранах.

2. Выявлена зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и повышение температуры приводит к появлению заметного количества ОтрС порина.

3. Обнаружена необычайно высокая для поринов термостабильность OmpF белка НМ Y. ruckeri и его способность восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя после инкубации при 85°С.

4. Показано, что процесс термоденатурации нативной формы (тримера) OmpF порина проходит в несколько стадий. На начальных этапах этот процесс сопровождается изменениями в структуре относительно «гибких» наружных петель, а в дальнейшем перестройкой на уровне четвертичной и третичной структуры белка, приводящей к диссоциации порина на мономеры.

5. С помощью иммунохимических методов выявлена локализация в наружных петлях L1 и L4 двух иммунодоминантных В-эпитопов, перекрёстно реагирующих с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

6. Исследовано влияние OmpF порина Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток (лейкоза крови человека) и клеточных культур тканей рыб. Установлено, что порин в низких концентрациях приводят к S-аресту клеточного цикла, а в высоких вызывают апоптоз злокачественных клеток.

7. Разработан упрощенный метод выделения очищенной фракции порина Y. ruckeri, исключающий стадию гель-хроматографии, пригодный для технологического способа получения белка.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах.

1. Чистюлин Д.К., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Вакорина Т.И., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Лихацкая Г.Н., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri II Биол. мембраны. 2012. Т. 29. № 3. С. 156-164.

2. Sidorova O.V., Khomenko V.A., Portnyagina О. Yu., Likhatskaya G.N., Vakorina T.I., Kim N. Yu., Chistyulin D.K., Solov'eva T.F., Novikova O.D. Mutant OmpF porins of Yersinia pseudotuberculosis with deletions of external loops: Structure-functional and immunochemical properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. V. 445. P. 428-432.

3. Портнягина О.Ю., Хоменко B.A., Чистюлин Д.К., Кузьмич A.C., Черников О.В., Сидорова О.В., Вострикова О.П., Новикова О.Д. Влияние неспецифических поринов наружной мембраны бактерий рода Yersinia на развитие клеток острого Т-клеточного лейкоза человека// Росс, иммунолог, журн. 2013. Т. 7. № 16. С.295-296.

4. Чистюлин Д.К. Вакорина Т.И., Ким НЛО., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д. Молекулярная и физико-химическая характеристика OmpF-и ОтрС- подобных белков наружной мембраны Yersinia ruckeri IIВ сб. «Биология, химия, физика: вопросы и тенденции развития». Материалы международной заочной научно- практической конференции. Новосибирск. 1 февраля 2012 г. С. 99-108.

5. Чистюлин Д.К., Мензорова Н.И., Новикова О.Д, Ким H.IO. Технологичный способ получения пориновых белков из наружной мембраны Yersinia ruckeri, патогенной для рыб // В сб. «Биология, химия, физика: вопросы и тенденции развития». Материалы международной заочной научно-практической конференции. Новосибирск. 4 июля 2012 г. С. 40-45.

6. Чистюлин Д.К., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д. Первичная и пространственная структура OmpF и ОтрС поринов Yersinia ruckeri II В сб. «Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии: перспективы развития». Казань. 28-30 мая 2012 г. С. 178-181.

7. Кузьмич A.C., Чистюлин Д.К., Черников О.В., Портнягина О.Ю. Взаимодействие неспецифических поринов наружной мембраны Yersinia ruckeri с клетками эукариот // Тезисы докладов XIV Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии Владивосток. 11-18 сентября 2012 г. С. 64-65.

8. Сидорова О.В., Чистюлин Д.К.. Выделение, рефолдинг и иммунохимические свойства мутантных OmpF поринов Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель // Тезисы докладов XIV Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 11-18 сентября 2012 г. С. 49.

9. Чистюлин Д.К., Кузьмич A.C., Дышловой С.А., Сидорова О.В., Черников О.В., Портнягина О.Ю., Хоменко В.А., Рудакова С.Л., Новикова О.Д. Иммунобиологические свойства OmpF порина Yersinia ruckeri II В сб. работ Всероссийской молодежной конференции «Взгляд в будущее». Владивосток. 7-14 ноября 2013 г. С. 78-86. http://piboc.dvo.ru/conf.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

vit v i Н J 7 i wU

Чистюлин Дмитрий Константинович

'■i

Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri

02.00.10 - биоорганическая химия

диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Владивосток - 2014 г.

1. ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................... 5

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны

грамотрицательных бактерий и методы их исследования......................................... 8

2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий......................................................................................... 8

2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных

бактерий........................................................................................... 9

2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов.................... 9

2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий............................................. 10

2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий................ 11

2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков........................ 11

2.3.2. Пространственная организация молекул поринов............................... 15

2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры 0-баррельных белков........................................................................ 19

2.4. Способы получения изолированных поринов............................................ 22

2.5. Конформационные переходы изолированных поринов................................ 24

2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны

грам орицате л ьных бактерий................................................................. 28

2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами.................................................................................... 28

2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант........................... 30

2.7. Регуляция экспрессии OmpF и ОшрС поринов грамотрицательных

Бактерий........................................................................................... 32

2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri........................................... 34

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................................. 39

3.1. Получение неспецифических (OmpF- и ОшрС- подобных) поринов наружной

мембраны Y. ruckeri............................................................................ 40

3.1.1. Первичная структура ОшрС- и OmpF поринов из Y. ruckeri....................... 40

3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны

Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы............................. 40

3.1.2.1 .Экстракция поринов неионным детергентом

октилполиоксиэтиленом........................................................... 41

3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции

пориновых белков.......................................................................... 42

3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и ОшрС-подобных поринов и их идентификация............................................................................. 44

3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и ОтрС поринов 7. ruckeri.............. 47

3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина 7. ruckeri..... 47

3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и ОтрС поринов.................... 49

3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и ОтрС поринов из НМ 7. ruckeri.................................................................................... 49

3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri................... 50

3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri.............................................................................. 52

3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и ОтрС поринов 7.

ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры......................... 52

3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri........................................................................ 56

3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и ОтрС поринов Y.

ruckeri....................................................................................... 59

3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и ОтрС поринов

Y. ruckeri под действием температуры..................................................... 66

3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и ОтрС поринов в процессе термоденатурации.............................................. 66

3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры................................................................. 69

3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика

OmpF порина Y. ruckeri......................................................................... 76

3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина 7.

ruckeri....................................................................................... 76

3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина 7.

ruckeri........................................................................................ 78

3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из

НМ 7. pseudotuberculosis........................................................... 78

3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина 7. ruckeri............... 80

3.6. Взаимодействие OmpF порина 7. ruckeri с клетками эукариот....................... 84

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................................................................................87

4.1. Материалы............................................................................................................................................................................87

4.2. Приборы и оборудование........................................................................................................................................87

4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов............................................................................................................................................87

4.4. ПЦР амплификация и секвенирование отрС и отрБ генов..................................................88

4.5. Получение изолированных поринов иерсиний..................................................................................88

4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов..................................................................................................................................................................................89

4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью

техники БЛМ......................................................................................................................................................................90

4.8. Построение теоретических моделей поринов....................................................................................91

4.9. Иммунохимические методы................................................................................................................................91

4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот..............................92

5. ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................................................94

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................................................95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................................96

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Yersinia ruckeri - грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз у рыб, известный также как «энтерит, сопровождающийся покраснением рта». Ежегодно этот микроорганизм является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним.

Известно, что порообразующие белки наружной мембраны (порины) играют важную роль в таких аспектах функционирования бактериальных клеток как адаптация к условиям окружающей среды и межклеточные взаимодействия. Бактериальные порины - интегральные Р-структурированные белки, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул через наружную мембрану (НМ). Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславливают наличие у поринов и других функций, отличных от транспортной. Экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, формируют потенциальные сайты взаимодействия с клетками организма-хозяина, в том числе с клетками иммунной системы. Показано, что порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий. Антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов, имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов.

Представляет интерес также способность поринов взаимодействовать с клетками эукариот. Так, известно, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с То11-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ бактерий до сих пор остаются мало изученными.

Кроме вышеназванных задач, имеющих прикладное значение, структурно-функциональные исследования поринов НМ бактерий важны для химии мембранных р-структурированных белков в целом, для выяснения особенностей их пространственной организации, для установления участков структуры, ключевых для поддержания стабильности молекулы этих белков, а также особенностей их сборки и денатурации под действием температуры и химических агентов.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции неспецифических поринов бактерий рода Yersinia, проводимого в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ

ДВО РАН им. Г.Б. Елякова. Она посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры и функциональной активности ОшрС и OmpF поринов Y. ruckeri, исследованию процесса денатурации OmpF порина под действием температуры и изучению его иммунобиологических свойств.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выделить и идентифицировать неспецифические OmpF и ОтрС порины НМ Yersinia ruckeri-,

• изучить влияние условий культивирования на экспрессию этих белков;

• сравнить физико-химические свойства, особенности пространственной организации молекул и функциональную активность OmpF и ОтрС поринов;

• исследовать процесс термоденатурации OmpF порина методами оптической спектроскопии, микрокалориметрии и компьютерного моделирования;

• изучить иммуногенные свойства OmpF порина, выявить общие с поринами иерсиний элементы антигенной структуры;

• исследовать характер взаимодействия OmpF белка с клетками эукариот.

Научная новизна исследования. Впервые выделены индивидуальные OmpF и ОтрС

порины из наружной мембраны Y. ruckeri и проведена сравнительная характеристика их пространственной структуры и функциональной активности. Впервые показано, что термоденатурация OmpF порина проходит в несколько стадий. Впервые показана зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий окружающей среды. Впервые охарактеризованы иммунохимические свойства OmpF порина Y. rucke, выявлены общие антигенные эпитопы OmpF поринов иерсиний. Впервые исследовано влияние поринов Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток человека и нормальных клеток тканей рыб.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные о высокой иммуногенности OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri при относительно низкой их цитотоксичности, а также обнаружение в структуре белков общих с другими поринами иммунодоминантных эпитопов позволяют рассматривать исследуемые порины как перспективные протективные антигены для борьбы с инфекцией вызываемой Y. ruckeri.

Разработан технологичный способ получения очищенной фракции поринов, исключающий стадию гель-хроматографии. Это стало возможным при использовании ДНКазы из гепатопанкреаса крабов, содержащей примеси протеаз.

Основные положения, выносимые на защиту: • OmpF и ОтрС порины Y. ruckeri подобно неспецифическим поринам наружной

мембраны иерсиний имеют различные физико-химические характеристики,

отличительные особенности первичной и пространственной структуры и образуют в искусственном бислое разные по размеру каналы.

• Транскрипция соответствующих генов и экспрессия исследуемых поринов зависят от условий культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и увеличение температуры приводит к появлению заметного количества ОтрС порина.

• Структура OmpF порина обладает аномально высокой для неспецифических поринов термостабильностью и способностью восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя даже после инкубации при 85 °С, температуре необратимого конформационного перехода.

• Процесс термоденатурации тримера OmpF порина имеет несколько стадий, сопровождающихся на начальных этапах обратимыми изменениями в структуре наружных петель, а в дальнейшем перестройками на уровне третичной и четвертичной структуры белка, приводящими к образованию термостабильных мономеров порина. Различия в спектрах триптофановой флуоресценции исследуемых поринов обусловлены особенностями положений Тгр212 в OmpF и Тгр184 в ОтрС порине.

• В петлях L1 и L4 молекулы OmpF порина локализованы иммунодоминантные В-эпитопы, перекрёстно реагирующие с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

• OmpF порин Y. ruckeri имеет низкую цитотоксичность и оказывает влияние на клеточный цикл как злокачественных, так и нормальных клеток. В низких концентрациях белок ингибируют S-стадию клеточного цикла для обоих типов клеток, а высокие концентрации вызывают апоптоз злокачественных клеток.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования

2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий

Основным структурным компонентом живой клетки являются биологические мембраны, которые поддерживают её структурную целостность и регулируют обменные процессы (поступление питательных веществ и выброс метаболитов). Кроме того, они служат для передачи сигналов между различными функционально важными участками клеточной поверхности.

Цитоплазма клеток грамотрицательных бактерий защищена от окружающей среды 2-мя мембранами - внутренней (цитоплазматической) и наружной. Средний слой, неплотно прилегающий к внутренней мембране, представляет собой специфический биополимер, называемый пептидогликаном (ПГ), который обеспечивает жесткость клеточной стенки микроорганизма [1] (рис. 1). Он является гликопептидом, состоящим из остатков 14-ацетилглюкозамина и И-ацетилмурамовой кислоты, и может быть разрушен под действием лизоцима. Помимо этого, мембраны связаны между собой видимыми в электронный микроскоп зонами адгезии, или зонами контакта (всего в клетке существует 200-400 таких зон) [2].

Столь сложное строение клеточной стенки вызвано условиями обитания грамотрицательных бактерий. Чаще всего это гипотоническое окружение, способное вызвать лизис цитоплазматической мембраны. Например, бактерии сем. ЕтегоЬаМепасеае, обитающие в кишечнике человека, должны обладать каким-либо механизмом защиты цитоплазматической мембраны от детергентного действия желчных солей, жирных кислот и глицеридов. Кроме того, кишечная полость богата протеолитическими и липолитическими ферментами, а также гликозидами [1].

В состав НМ грамотрицательных бактерий входят белки, фосфолипиды и липополисахарид (ЛПС). Содержание этих основных элементов мембраны может весьма различаться, что зависит от вида исследуемых микроорганизмов, условий их культивирования и методов количественной оценки данных компонентов [3, 4, 5]. Фосфолипиды представлены фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицерином, или кардиолипином. ЛПС является специфическим компонентом НМ бактерий, занимая около 45% ее поверхности[6]. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. В НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками (в частности, с поринами) [7].

Рис. 1 - Клеточная стенка грамотрицательных бактерий. 1 — внутренняя, или цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликановый слой; 3 — периплазматическое пространство; 4 — молекулы белков; 5 — фосфолипид; 6- липополисахарид; 7 — интегральный белок, 8 - наружная мембрана.

В НМ было обнаружено несколько основных типов белков, общее содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные каналообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку НМ, в соответствии с химической природой составляющих ее липидов, малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляют собой своеобразную транспортную систему бактериальной клетки. �