Молекулярная организация, функциональная и антигенная активность поринов наружной мембраны Yersinia enterocolitica и Y. enterocolitica-подобных видов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

lb

На правах рукописи

Вострикова Ольга Павловна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПОРИНОВ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ YERSINIA ENTEROCOLITICA И Y. ENTEROCOUTICA-ПОЦОБНЫХ ВИДОВ

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 4 ЯН В 2D13

Владивосток - 2009

003489954

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Новикова О.Д.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Звягинцева Т.Н.

доктор медицинских наук,

профессор

Иванис В.А.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится « 25 » декабря 2009 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232)314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте совета: http://piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «_25_» ноября 2009 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор химических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактерии рода Yersinia относятся к грамотри нательным бактериям, обладающим уникальными адаптивными возможностями: они могут существовать в природе как вне живого организма, так и в теплокровном организме (включая человека), сочетая сапрофитный и паразитический образ жизни. В адаптации бактериальной клетки к постоянно меняющимся условиям среды обитания ключевую роль играют порообразующие белки (порины), являющиеся одним из основных компонентов наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий и названные так в соответствии с их специфической функцией. Они образуют в НМ водонаполненные каналы (поры) для пассивной диффузии низкомолекулярных (около 600 Да) питательных веществ и продуктов жинедеятельности бактериальной клетки. Регуляция проницаемости НМ грамотрицательных бактерий при изменении температуры, осмомолярности или величины рН среды осуществляется с помощью переключения биосинтеза поринов с одного типа на другой. В случае Escherichia coii такими белками являются неспецифические OmpF и ОтрС порины, образующие в бактериальной мембране поры различного диаметра и отличающиеся активностью по отношению к фагам и колицинам.

К настоящему времени накоплен огромный массив информации о поринах НМ грамотрицательных бактерий, включая порины патогенных для человека иерсиний (У. pestis, У. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica): установлены первичные и пространственные структуры этих белков, изучены их иммунобиологические свойства. Несравнимо меньшее количество публикаций, в основном статистически-экологической направленности, посвящено непатогенным (или "редким") видам иерсиний. Несмотря на это обстоятельство, возможность участия "редких" видов иерсиний в патогенезе человека и животных не исключается и подтверждается публикациями последних лет.

В связи с этим, исследования структурно-функциональных особенностей поринов НМ бактерий рода Yersinia, как патогенных, так и непатогенных видов, вносят, во-первых, вклад в фундаментальные представления о свойствах белков-поринов НМ грамотрицательных бактерий в целом. Во-вторых, они весьма важны для практической медицины, поскольку изучение иммунобиологических свойств поринов НМ разных видов иерсиний открывает новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иерсиниями.

Изучение взаимосвязи структурной организации, функциональной и антигенной активности белков-поринов НМ разных видов иерсиний, отличающихся степенью патогенности для человека, с помощью современных биохимических, молекулярно-генетических и теоретических методов (компьютерное моделирование) позволит понять особенности и природу их структурно-функционального разнообразия, обусловленного постоянно меняющейся средой обитания.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции поринов бактерий рода Yersinia и посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры, функциональной активности и антигенных свойств поринов НМ У. enterocolitica, патогенной для человека, и филогенетически близких ей непатогенных Y. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii, культивируемых при температуре 6-8 ("холодовой" вариант) и 37°С ("тепловой" вариант), что соответствует сапрофитным и паразитическим условиям существования иерсиний.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) выделить и охарактеризовать физико-химические свойства поринов из Y. enterocolitica и филогенетически близких У. enterocolitica-подобных видов, культивируемых при различной температуре; 2) провести сравнительное изучение функциональной активности поринов НМ иерсиний; 3) провести сравнительный анализ пространственной структуры разных молекулярных форм поринов НМ иерсиний; 4) изучить влияние способа экстракции и природы солюбилизирующего агента на пространственную структуру функционально

активной формы (тримера) поринов иерсиний разных видов; 5) установить первичную структуру OmpF- и OmpC-подобных поринов из У. enterocolitica и выявить особенности пространственной структуры разных типов поринов с помощью теоретических моделей; 6) изучить иммуногенные и антигенные свойства поринов иерсиний; 7) показать возможность использования поринов НМ иерсиний (на примере порина из У. enterocolitica) в качестве диагностических антигенов.

Научная новизна исследования. Впервые проведено систематическое исследование неспецифических OmpF- и OmpC-подобных поринов НМ бактерий рода Yersinia, отличающихся степенью патогенности для человека: Y. enterocolitica и филогенетически близких Y. enterocoW/ca-подобных видов (У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii).

Установлено, что температура культивирования является одним из главных факторов, определяющих структуру и функциональную активность неспецифических поринов НМ бактерий рода Yersinia: изменение температуры культивирования иерсиний сопровождается экспрессией разных типов (OmpF и ОтрС) поринов, различающихся эффективностью неспецифической диффузии через бактериальную мембрану.

Впервые установлены различия в первичной и пространственной структуре, порообразующих и антигенных свойствах OmpF и ОтрС поринов НМ У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii.

Установлено, что стабильность пространственной структуры поринов иерсиний определяется как типом порина, так и видом микроорганизма.

Показано, что пространственная структура изолированных поринов из НМ исследованных видов иерсиний зависит от способа экстракции порообразующего белка и природы солюбилизирующего агента, используемого для перевода порина в раствор из мембраносвязанного состояния. Обнаружена конформационная пластичность поринов в растворе на уровне третичной структуры белка.

Практическая значимость работы. Впервые показано, что неспецифические порины НМ У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii иерсиний являются видо- и родоспецифическими белками этих бактерий и могут быть использованы в качестве диагностических антигенов.

Впервые на основе OmpF порина из У. enterocolitica разработана иммуноферментная тест-система (ИФА тест-система), позволяющая достоверно и эффективно идентифицировать иерсиниоз на разных стадиях инфекционного процесса независимо от серотипа возбудителя. Данная тест-система может быть использована как для дифференциальной диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза, так и для выявления вторично-очаговых форм этих заболеваний. Разные молекулярные формы OmpF порина из У. enterocolitica могут быть использованы для оценки некоторых показателей гуморального иммунного ответа больных с острыми и вторично-очаговыми формами иерсиниозов.

Результаты и положения работы, выносимые на защиту.

1. Порообразующие белки НМ бактерий рода Yersinia в зависимости от способа экстракции могут быть выделены в 3-х различных молекулярных формах: тртер, мономер и термостабильный мономер.

2. Способ выделения и способ солюбилизации порина влияют на стабильность пространственной структуры тримера - функционально активной формы белка.

3. Подобно неспецифическим поринам Е. coli, в НМ исследованных видов иерсиний при различной температуре культивирования экспрессируются разные типы (OmpF и ОтрС) поринов: каналы, образованные OmpF и ОтрС поринами иерсиний в модельной бислойной липидной мембране (БЛМ), отличаются величиной и характером распределения наиболее вероятных уровней проводимости.

4. Пространственная структура OmpF и ОтрС поринов из разных видов иерсиний существенно различается на уровне третичной структуры, но сохраняет высокую степень структурного подобия на уровне вторичной структуры. Вторичная структура OmpF и ОтрС поринов иерсиний отличается устойчивостью к действию денатурирующих агентов.

5. Конформационная стабильность структуры поринов иерсиний определяется как типом порина, так и видом микроорганизма.

6. Порообразующие белки НМ иерсиний являются родо- и видоспецифическими антигенами и могут быть использованы как диагностические препараты.

7. ИФА тест-система на основе порина HM У. enterocolitica позволяет выявлять иерсиниоз независимо от стадии инфекционного процесса и сероварианта возбудителя.

8. ИФА тест-система может быть использована для верификации как острых кишечных, так и вторично-очаговых форм иерсиниозов (различных иммунопатологий иерсиниозной этиологии).

9. Использование в ИФА тест-системе разных молекулярных форм (тример и термостабильный мономер) порина из У. enterocolitica позволяет выявить различия в гуморальном иммунном ответе у больных с острыми кишечными и вторично-очаговыми формами иерсиниозов.

Апробация результатов работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены автором на следующих Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях: 2-ом Биохимических съезде (Москва, Россия, 1997); Симпозиумах по химии белков и пептидов (Москва, Россия, 2003; Москва, Россия, 2007); International Symposiums on Yersinia (Tokyo, Japan, 1995; Turku, Finnland, 2003); II и III Съездах биофизиков России (соответственно Москва, Россия, 1999 и Воронеж, Россия, 2004); XIX Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999); Международной научно-практической конференции "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, Россия, 2000); 7-th International Congress on Endotoxin (Washington, USA, 2002); International Congress "Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health" (Sudak, Ukraine, 2004); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Россия, 2005); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, Россия, 2006); V Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний» (Москва, Россия, 2006); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 2007).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 17 статей в отечественных и международных журналах и 52 тезиса докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций. Способы диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза защищены патентами РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав изложения результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 279 источников. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков и 16 таблиц.

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе.

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность научному руководителю д.х.н. Новиковой О.Д. и научному консультанту д.х.н., профессору Соловьевой Т.Ф. за постоянное внимание к работе, ценные замечания и полезные советы на всех этапах исследования. Автор чрезвычайно благодарен сотрудникам лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим непосредственное участие в работе или участвовавшим в обсуждении полученных результатов: к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., н.с. Ким Н.Ю., к.м.н. Исаевой М.П., к.х.н. Хоменко В.А, к.б.н. Портнягиной О.Ю., к.х.н. Вакориной Т.И., м.н.с. Гузеву К.В.

Автор также искренне признателен и благодарен за плодотворное сотрудничество в ходе выполнения данной работы: сотрудникам ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток) д.м.н., проф. Шубину Ф.Н. и д.м.н., проф. Тимченко Н.Ф.; сотруднику Института молекулярной биологии РАН (г. Москва) к.х.н. Бажулиной Н.П.; сотрудникам Universität Konstanz (Germania) д-ру Прзибельски М. и д-ру Бюлеру С.; сотрудникам кафедры детских инфекционных болезней ВГМУ (г. Владивосток) д.м.н., проф. Гордеец A.B., к.м.н. Малашенковой В.Г., д.м.н. Бениовой С.Н.; сотруднику ФГУЗ Роспотребнадзора по

Приморскому краю (г. Владивосток) к.м.н. Каленченко Г.Н.; сотрудникам Института микробиологии МО РФ (г. Киров) Дармову И.В., Дробкову В.П., Маракулину И.В., Супотницкому В.М.; сотруднику ФГУ НИИ детских инфекций Росздрава (г. Санкт-Петербург) д.м.н. Бехтеревой М.К.; сотрудникам ГУЗ Медобъединения ДВО РАН (г. Владивосток) зам. глав, врача больницы Павловой Г.Г. и к.м.н. Горбач Т.А.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 7-ми разделов, обобщены литературные данные о структуре и биологических свойствах неспецифических поринов НМ грамотрицательных бактерий. Представлены сведения о типах интегральных мембранных белков и особенностях их пространственной структуры, проанализированы литературные данные о функциональных свойствах неспецифических (OmpF и ОтрС) поринов и механизмах модуляции размера каналов, образованных поринами HIVI грамотрицательных бактерий при изменении условий окружающей среды. Обобщены литературные данные по изучению иммуногенных/антигенных свойств и структуре антигенных детерминант порообразующих белков грамотрицательных бактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и характеристика OmpF и ОтрС поринов НМ иерсиний

Как известно, порообразующие белки НМ грамотрицательных бактерий прочно связаны с пептидогликаном (ПГ) и могут быть выделены из НМ экстракцией 2%-ным раствором SDS при температуре 50-60°С в виде ПГ-белкового комплекса. В случае исследованных видов иерсиний ПГ-белковые комплексы из "холодового" и "теплового" вариантов микроорганизмов (культивируемых, соответственно, при 6-8 и 37°С) были экстрагированы при более низкой температуре (37°С), поскольку при температуре 50°С значительное количество белка, по данным SDS.nAAr-электрофореза, переходило в супернатант. Вероятно, в НМ исследованных видов иерсиний связь между белком и ПГ менее стабильна по сравнению с таковой в НМ других энтеробактерий.

Для получения белковых фракций, содержащих порины, выделенные ПГ-белковые комплексы обрабатывали 1%-ным SDS в присутствии 0.5М NaCI при температуре 37°С (1) и 2%-ным SDS при температуре 100°С (2). В результате в первом случае была получена суммарная пориновая фракция, состоящая из тримера и мономера белка с кажущимися молекулярными массами (М) около 110 и 30 кДа соответственно (рис. 1, а). Во втором случае в составе пориновой фракции в качестве основного компонента обнаружен термоденатурированный мономер с М около 38 кДа.

Изолированные тримеры и мономеры белков из разных видов иерсиний обоих вариантов были получены при разделении суммарных пориновых фракций с помощью гель-хроматографии на сефакриле S-300. Индивидуальность полученных молекулярных форм порина подтверждена данными БОБЛААГ-электрофореза (рис. 1; б, в). Подобно поринам других грамотрицательных бактерий, тримеры и мономеры поринов иерсиний термолабильны: при кипячении растворов белка они превращались в термоденатурированный (термостабильный) мономер (М, 38 кДа). В качестве примера на рис. 1 (б, в) приведены фореграммы белков из У. enterocolitica, У. intermedia, Y. kristensenii, Y. fredereksenii "холодового" варианта, поскольку фореграммы белков из иерсиний обоих вариантов до и после нагревания оказались идентичными.

Получение двух термолабильных форм поринов (тримерной и мономерной) в виде суммарной пориновой фракции при использовании стандартной процедуры выделения тримеров поринов грамотрицательных бактерий может быть свидетельством большей лабильности пространственной структуры поринов НМ иерсиний. В литературе известны

только два случая выделения поринов в мономерной форме - это порины из Pseudomonas aeruginosa и Rodopseudomonas sphaerodies, однако в бактериальной мембране порины функционируют в тримерной форме. Согласно полученным результатам, тример, мономер и термоденатурированный мономер представляют собой разные молекулярные формы одного и того же белка, различающиеся по электрофоретической подвижности в условиях ЗОЗ.ПААГ-электрофореза (рис. 1).

а б б

1 2 3 4 5 6 ? £ 1 2 3 4 5 6 7 » t 2 3 i S 5 i g 9

Uli™*

- ЗЭДЙ

ЗОйа

ЗОйа

{

Рис. 1. Электрофореграммы: (э) суммарных пориновых фракций из У enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii, Y. fredereksenii "холодового" и "теплового" вариантов (дорожки 1-4 и 5-8 соответственно); термолабильных (б) олигомерной и (в) мономерной форм белков из У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii, У. fredereksenii до нагревания (б, дорожки 5-8; в, дорожки 1-4 соответственно) и после нагревания (100°С, 10 мин) (б, дорожки 1-4; в, дорожки 6-9 соответственно; дорожка 5 - белки-стандарты).

Согласно аналитическим данным образцы поринов ИМ -иерсиний обоих вариантов содержали от 5 до 10% моносахаридов.

Значения молекулярных масс поринов НМ разных видов иерсиний "холодового" и "теплового" вариантов, определенные разными методами (SDS, ПААГ-электрофорез, MALDI- спектрометрия, из данных аминокислотной последовательности), оказались очень близкими (М, 37.2-38.6 кДа).

По данным аминокислотного (АК) анализа изолированные белки НМ иерсиний "холодового" и "теплового" вариантов характеризуются высоким содержанием таких полярных аминокислот, как аспарагиновая и глутаминовая кислоты, низким содержанием лизина (до 5%) и отсутствием цистеина. Относительное содержание ароматических аминокислот в исследованных белках НМ иерсиний обоих вариантов достаточно высокое, около 13%. Обнаруженные особенности АК состава белков НМ иерсиний являются отличительными признаками белков-поринов НМ грамотрицательных бактерий.

Индекс полярности исследованных белков составляет 43—45%, что соответствует значению индекса полярности OmpF и ОтрС поринов других грамотрицательных бактерий.

N-Концевой аминокислотой поринов исследованных видов иерсиний обоих вариантов, подобно поринам НМ других энтеробактерий, включая порин из У. pseudotuberculosis, является аланин. Это позволяет отнести белки НМ исследованных видов иерсиний "холодового" и "теплового" вариантов к классу порообразующих белков.

Обнаружено, что белки из иерсиний "холодового" и "теплового" вариантов отличаются между собой содержанием функционально значимых АК остатков. Так, белки из иерсиний "теплового" варианта по сравнению с таковыми из "холодового" варианта содержат на 4-8% больше заряженных (К, Y, D) АК остатков, в том числе на 6.5-11% кислых (D), на 5.5% основных (К) и на 10% полярных (Y) АК остатков. В то же время в белках "теплового" варианта содержание некоторых гидрофобных (V) и полярных (N, Т) АК остатков на 26.8 и 24% (соответственно) меньше, чем в белках из иерсиний "холодового" варианта. Подобные различия в АК составе установлены для поринов разных типов (OmpF и ОтрС) из Е. coli, экспрессированных в клетке при различной температуре.

2. Первичная структура OmpF- и OmpC-подобных поринов НМ бактерий рода Yersinia

(на примере У. enterocolitica)

Аминокислотные последовательности белков НМ У. enterocolitica "холодового" и "теплового" вариантов были выведены из нуклеотидных последовательностей клонированных генов, кодирующих синтез OmpF- и OmpC-подобных поринов в бактериях Y. enterocolitica. Кодирующие последовательности ompF- и отрС-подобных генов были получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) участков хромосомной ДНК, _ выделенной.. из У. enterocolitica- (164 штамм, 0:3 серовариант) - (YE164). АК -последовательности зрелых белков-поринов из У. enterocolitica обозначены как OmpF- и OmpC-YE164 (рис. 2).

Для сравнительного анализа полученных АК последовательностей зрелых поринов НМ У. enterocolitica в качестве стандарта были использованы АК последовательности OmpF и ОтрС поринов из £ coli, взятые из банка Swiss-Prot: Q8ZG94 и GenBank: ААС75275. Анализ первичной структуры OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica показал достаточно высокую степень подобия этих белков между собой (65%) и с поринами НМ из £ coli (58 и 76% соответственно). Для OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica были определены теоретические изоэлектрические точки (ИЭТ, 4.58 и 4.43 соответственно) и рассчитаны значения М, которые оказались очень близкими (М, 38.59 и 38.33 кДа соответственно) между собой и совпадали с экспериментальными данными.

При множественном выравнивании АК последовательностей зрелых OmpF и ОтрС поринов У. enterocolitica и поринов Е. coli (рис. 2) были обнаружены общие закономерности в распределении протяженных областей высокой и низкой гомологии. При этом консервативные участки в исследованных белках приходятся на трансмембранные домены, а высоковариабельные участки - на "внешние" петли OmpF и ОтрС поринов £ coli. Кроме того, в белках выявлена закономерность в распределении гидрофобных и ароматических АК остатков (преимущественно тирозиновых и фенилаланиновых), образующих, как известно, два так называемых ароматических "пояса", функция которых заключается в удержании гомотримера в липидном слое мембраны.

3. Вторичная структура и трансмембранная топология OmpF и ОтрС поринов из Y. enterocolitica

Вторичная структура OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica (рис. 2) была смоделирована при помощи программ, предназначенных для предсказания вторичной структуры белков (GOR, Predict Protein, Tmpred) с учетом данных рентгеноструктурного анализа, выполненного на OmpF и ОтрС поринах из Е. coli. Согласно топологической модели, построенной для поринов из £ coli, порины из У. enterocolitica, подобно поринам других энтеробактерий, состоят из 16-ти р-тяжей (образующих p-баррель), 8-ми длинных "внешних" петель, экспонированных на поверхности клетки, и 8-ми коротких петель (изгибы), экспонированных в периплазматическое пространство. Важно отметить, что OmpF и ОтрС порины из У. enterocolitica, несмотря на высокую степень (от 80 до 100%) структурного подобия в p-баррельных участках (Р7, р15, р2-р6, (313, Р14, Р16-тяжи), характеризуются значительными различиями в АК последовательности петель L5-L7 (25-33% гомологии) и L1-L4 (40-53% гомологии). Кроме того, в OmpF и ОтрС поринах петли L6 и L8, являющиеся, согласно литературным данным, поверхностными эпитопами НМ грамотрицательных бактерий, определяющими серологическое различие микроорганизмов, отличаются не только АК последовательностью, но и разной длиной. Обнаруженные вариации в структуре этих петель OmpF и ОтрС белков из У. enterocolitica, вероятно, могут определять их антигенные различия и существенно влиять на иммунохимические свойства поринов. Это предположение было подтверждено результатами теоретических расчетов антигенных детерминант OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica, проведенных с помощью предсказательных методов. Установлено, что OmpF и ОтрС порины существенно отличаются локализацией и структурой антигенных детерминант в петельных участках. Так, ОтрС порин имеет эпитопы в L2- и 1.8-петлях, а в OmpF белке таковые эпитопы

OmpC„YE164_m Огг.рС EC m

OmpF_YE164_m Oi=pF_EC_m losm

OinpC__YE164_m

Oir.pC_EC_m

OnpF_YB164_m

CmpF_EC_rTi

iosm

Orr.pC_YE164_m

OmpC_EC_m

OmpF_YE164_m

Orr.pF_EC_m

losm

OmpC_YE164_m

OmpC_EC_m

OmpF_YE164_m

OmpF_SG_m

losm

OmpC_YE164_m

Ся-.рС_ЕС_и

0rcpF_YE164_m

OmpF_EC_m

losm

(1) (1) (1) (1)

(74)

(73)

(75) (81)

(74)

161 (153) (152) (155) (160) (152)

(219)

(225)

(226) (218) (231)

(299) (299) (302) (296) (314)

1 80

AEIYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDDNSKD-----GDQSYMRFGLKGETQISDQLTGYGQWEYQANIAIKAEDEDQG--NF

AEVYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDNXDVD-----GDQTYMRLGFKGETQVTDQLTGYGQWEYQIQGNSAENENN---SW

AEIYNKDGNKLDLYGKVDARHQFSDNAGQD-----GDESYVRFGFKGETQITDQLTGYGQWEYNVQANHASSQGDKG-NK

AEIYMCTCNKVDLYGKAVGLHYFSKGNGBKSYGGNGDMTYARLGFKGETQINSDLTGYGQWEYWFQGNNSEGADAQTGNK

AEIYNKDGNKLDLYGKIDGLHYFSDDKDVD-----GDQTYMRLGVKGETQINDQLTGYGQWEYNVQAMTE S S S DQ— AW

Ц16 T1 /31 Ы ß2 T2 P3 L2

81 160 TRIGFAGLKFADYGSFDYGKNYGVLYDVTSWTDVLPEFGGDTYG-ADNFLSQRGNGMATYRNTNFFGLVDGLNFALQYQG TRVAFAGLKFQDVGSFDYGRNYGWYDVTSVfTDVLPEFGGDTYG-SDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQG TRLGFAGLKFAEFGSFDYGRNYGVIYDVNAWTDMLPVFGGDSISNSDNYMTGRSTGLATYREsTTNFFGLVDGLNFALQYQG TRLAFAGLKYADVGSFDYGRKYGWYDALGYTDMLPEFGGDTAY-SDDFFVGRVGGVATYRMSNFFGLVDGLMFAVQYLG TRLAFAGLKFGDAGSFDYGRWYGWYDVTSWTDVLPEFGGDTYG-SDNFLQSRANGVATYRMSDFFGLVDGMFALQYQG ,34 73 ßS L3 ß-6 T4 ß 7

240

KNGDGTE-----------------TNNGRSVQGQKGDGYGMSVSYDLGWGVSASAAMASSKRTDEQKDLA-FGHGDRADAYSGG

KNGNPSGEGFTSG------VTNNGRDALRQNGDGVGGSITYDY-EGFGIGGA1SSSKRTDAQNTAAYIGKGDRAETYTGG

KNENDRSAVANG--------VYTGDNLKDQNGDGFGISSTYDIGYGVNFGAGFSSSNRTNQQKALS-TAEGDKAQAWWG

KNERDTAR--------------------RSNGDGVGGSISYEY-EGFGIVGAYGAADRTNLQEAQP -LGMGKKAEQWATG

KNGS—VSGEGA--------TNNGRC-ALKQMGDGFGTSVTYDIFDGISAGFAYAKSKRTDDQNQLL-LGSGDHAETYTGG

L4 ¡¡8 T5 ß9 L5 1310

241 320

LKYDAJSMWLAATYAQTYNLTRFGNFKNKTDSGFAKKAQNIELVAQYQFDFGLRPSIAYLQSKGKDLGNGYSDQDLVKYV

LKYDANNIYLAAQYTQTYNATRVG--------SLGWANKAQNFEAVAQYQFDFGLRPSLAYLQSKGKNLGRGYDD3DILKYV

AKYDANNVYLAVMYAETQNKTPYG----DASNTIANKTRDIEITAQYQFDFGLRPSLGYVQSKGKDLNANGDNQDLLKYV

LKYDAMIYLAAKYGETRNATPITN-KFTNTSGFANKTQDVLLVAQYQFDFGLRPSIAYTKSKAKDVEG-IGDVDLVKYF

LKYDÄNNIYLATQYTQTYWATRAGSL------GFAMKAQNFEVAAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKDL-NGYGDQDILKYV

T6 ß 11 LS ßl2 T7 ßl3 L7 ßl4

321 368

DVGATY YFNKHMST YVDYKINL LDENEFTKNAGINTDDIVAVGLVYQF DVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF SVGSYYYFKKNMSTYVDYKINLLDENDFTRANGLNTDDWGVGLVYQF

EVGATYYFKKNMSTYVDYIINQIDSDN---KLGVGSDDTVAVGIVYQF

DVGATYYFNKMMSTYVDYKINLLDDMSFTRSAGISTDDWALGLVYQF (314 615 L8 ßl6

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей зрелых OmpF и ОтрС поринов из V enterocolitica (ОтpF_YE164 и OmpC_YE164 соответственно) и £ со//(ОтрС_ЕС и OmpF_EC соответственно) и осмопорина Klebsiella pneumoniae (1osm, код PDB 10SM). Серым фоном выделены идентичные аминокислотные последовательности, жирным шрифтом выделены функционально значимые аминокислотные остатки поринов.

отсутствуют. В то же время OmpF порин содержит антигенные детерминанты в петле L6, которые отсутствуют в ОтрС порине. Возможно, это обусловлено различной гибкостью данных сегментов в исследованных белках: как известно, гибкость полипептидной цепи в определенной степени предопределяет локализацию антигенных сайтов в молекуле белка. Определение локализации антигенных детерминант и расчеты коэффициентов гибкости полипептидной цепи поринов из V. enterocolitica выполнены с помощью программных средств, поддерживаемых на сервере http://bioinfonnatics.Weizmann.ac.il./ hydroph/cmp hydph.html.B стабилизации тримерной структуры поринов энтеробактерий важную роль играет петля L2. Анализ структуры 1.2-петель OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica показал их невысокую (40%) гомологию. Следует также отметить, что содержание ароматических АК остатков, триптофана (Тгр) и тирозина (Туг), в OmpF и ОтрС белках практически одинаковое: по 3 остатка Тгр и по 27-29 остатков Туг. Однако положение и ближайшее микроокружение остатков Тгр в белках отличается (рис. 2). Отмеченные особенности могут определять различия в стабильности пространственной структуры исследованных типов поринов. Как известно, конформационные изменения в петле L3, которая находится внутри поры, приводят к уменьшению чувствительности порина по отношению к изменению потенциала на мембране. В ОтрС белке петля L3 отличается от таковой в OmpF белке большим содержанием гидрофобных и меньшим содержанием полярных АК остатков. Кроме того, OmpF порин имеет замену в консервативном участке (пентапептиде PEFGG) петли, где остаток глутаминовой кислоты (Е) заменен на валин (V) (рис. 2). Вероятно, все эти особенности могут влиять на распределение зарядов внутри поры и, соответственно, на порообразующую активность изолированных OmpF и ОтрС белков.

4. Порообразующая активность поринов НМ иерсиний

При добавлении в водную фазу, окружающую БЛМ, тримеров и мономеров поринов НМ исследованных видов иерсиний обоих вариантов, только в случае тримеров поринов наблюдались дискретные флуктуации тока с присущим для порообразующих белков ступенчатым характером изменения проводимости модельной мембраны. Это подтверждает принадлежность исследованных белков к классу поринов.

Тримеры поринов НМ иерсиний как "холодового", так и "теплового" вариантов показали высокую эффективность (5-10 нг/мл) при реконструкции в БЛМ, однако уровни проводимости пор, образованных этими белками, оказались различными (рис. 3). Так, при низком значении мембранного потенциала (-20 мВ), тримеры поринов иерсиний "холодового" варианта образовывали в БЛМ поры с разными уровнями проводимости, порядка 180-480 пСм (рис. 3; а, 6, в, г, черные колонки). Наибольшая проводимость каналов, образованных поринами иерсиний "холодового" варианта, обнаружена для белков из У. enterocolitica (400 пСм) и Y. frederiksenii (480 пСм) (рис. 3; б, г).

В случае тримеров поринов иерсиний "теплового" варианта в этих же условиях наблюдалось увеличение доли каналов с меньшей проводимостью, порядка 168-200 пСм (рис. 3; а*, б*, в*, г*, черные колонки). При этом среди белков "теплового" варианта тример из У. enterocolitica проявлял наименьшую эффективность при реконструкции в БЛМ. Однако в случае белков из У. frederiksenii и У. kristensenii "теплового" варианта образовывались каналы с высоким уровнем проводимости (рис. 3; в*, г*). Кроме того, для порина из У. kristensenii отмечены максимальное значение наиболее вероятного уровня проводимости (420 пСм) и наибольшая кооперативность включения пор (рис. 3, в*).

Отличительной особенностью OmpF поринов из непатогенных видов иерсиний является бимодальное распределение уровней проводимости каналов, т.е. присутствие на гистограммах двух популяций каналов с различными наиболее вероятными уровнями проводимости (рис. 3; а, в, г). Подобный факт существования функциональной гетерогенности белков был обнаружен для OmpF поринов Pseudomonas fluorescens. Возможно, это объясняется образованием в модельной мембране различных по структуре функционально активных конформеров. Для ОтрС поринов из этих же видов иерсиний было отмечено преобладание пор с одним наиболее вероятным уровнем проводимости,

наименьшим для У. intermedia и наибольшим для У. frederiksenii, однако гетерогенность каналов по уровню проводимости сохранялась.

Увеличение мембранного потенциала до -50 мВ (рис. 3, серые колонки) приводило к уменьшению наиболее вероятного уровня проводимости каналов, образованных OmpF белками, до 120-240 пСм, а ОтрС белками - до 80-160 пСм (для непатогенных иерсиний) и 240 пСм (для порина из У. enterocolitica). При этом в случае OmpF поринов из У. intermedia, У. kristensenii, несмотря на то, что сохранялись две популяции каналов с различной проводимостью, заметно увеличивалась доля пор с минимальной проводимостью, порядка 120 пСм (рис. 3; а, в). Подобная закономерность была обнаружена для каналов, образованных поринами из Е. coli, для которых увеличение мембранного потенциала приводило к дестабилизации пор большого диаметра.

•V

ЙО 50 за 20■ 10-

,,,(■:,»-. Т-1 II! SC i? '32

1 I (б;

у JLiLuj

s ---<

N M> 4<>-20 О

Jlfcj

(e> t , 1

rSl <c--i

i lpOßQ;№MQ&Vb ГН>р, flCw

P? 4 ~ ж ■£>

— f-3 c-t Проводи MÜHT

5 Й !?.

. tltbp. tl£*M

JV 35 30

и 20 15

то

5 0

Jp

V

<r

проводимость пор, пСм

JL

проводимость пор, пСн

(в*; м вс- -

5С •

v s^ & & <:

проводимость пор, пСм

т

ли

Г«*)

-

:.......Я ¡1 1 S 1. , П 1

Л

^ # <?•-проводимость пор, пСм

Рис. 3. Гистограммы уровней проводимости пор, образованных OmpF и ОтрС поринами из НМ У. intermedia (а и а* соответственно), У. enterocolitica (б и 6* соответственно), У. kristensenii (s и в* соответственно), У. frederiksenii (г и г* соответственно) в зависимости от мембранного потенциала: -20 мВ (черные колонки) и -50 мВ (серые колонки), ширина колонок 24 пСм. По оси ординат указано число каналов (/V); по оси абцисс - проводимость каналов (Л).

Таким образом, порины НМ иерсиний "холодового" варианта по уровню проводимости каналов подобны классическим ОтрР поринам, которые экспрессируются в НМ грамотрицательных бактерий при низкой температуре и низком содержании солей в культуральной среде. Порины, выделенные из НМ иерсиний "теплового" варианта (за

исключением порина из У kristensenii) по своим функциональным характеристикам подобны ОтрС порину Е. coli: в ответ на повышение температуры наблюдается уменьшение проводимости пориновых каналов. Это, как известно, характерно для многих энтеробактерий и связано с переключением в бактериальной клетке биосинтеза поринов с одного типа на другой при изменении условий окружающей среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что функциональное состояние поринов НМ разных видов иерсиний регулируется температурой культивирования и потенциалом на мембране.-Кроме того, нами обнаружены количественные и качественные различия в уровнях проводимости каналов, образованных OmpF и ОтрС поринами из разных видов иерсиний, которые определяются видом микроорганизма.

5. Пространственная структура OmpF и ОтрС поринов иерсиний Физико-химическая характеристика различных молекулярных форм OmpF и ОтрС поринов иерсиний. Для сравнительного анализа структурной организации тримерной, мономерной и термоденатурированной мономерной форм OmpF и ОтрС поринов из Y. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii, У. frederiksenii в растворе использовали методы оптической спектроскопии: УФ-спектроскопию, круговой дихроизм (КД) и собственную белковую флуоресценцию. Порины как мембранные белки могут быть переведены в водорастворимое состояние только с помощью детергентов. Для получения спектральных характеристик OmpF и ОтрС поринов исследованных видов иерсиний были использованы растворы белка в присутствии 0.25%-ного SDS, поскольку, как показано ранее, в этих условиях не происходит денатурации порина из У. pseudotuberculosis.

Обнаружено, что спектры КД разных молекулярных форм OmpF и ОтрС поринов иерсиний в дальней (190-240 нм) и ближней (250-300 нм) УФ-областях различаются, но для одних и тех же форм поринов разных видов иерсиний они подобны. В связи с этим, в качестве примера приведены спектры КД разных молекулярных форм OmpF порина из У. kristensenii (рис. 4; а, б) и ОтрС порина из У. intermedia (рис. 4; в, г).

210 ' 230,/Я*'" " "

*нм и

2S0 250 300 320

Рис. 4. Спектры КД в дальней (190-240 нм) и ближней (250-300 нм) УФ-областях термолабильных тримерной (1), мономерной (2) и термостабильной мономерной (3) форм OmpF порина из Y. kristensenii (а, б) и ОтрС порина из У. intermedia (в, г) в 0.01 М Трис-HCI буфере (pH 7.4) в присутствии 0.25%-ного SDS.

Форма спектров КД в дальней УФ-области (рис. 4; а, в) разных молекулярных форм OmpF и ОтрС поринов иерсиний характерна для белков с достаточно высоким содержанием ß- структуры. Исключение составляет спектр КД термоденатурированного

OmpF порина, который имеет отрицательную полосу высокой интенсивности при 207 нм, что свидетельствует о значительном содержании а-спирали в белке. Согласно расчетам содержания элементов вторичной структуры, выполненным с помощью метода Provencher - Glockner и пакета программ CDPro, тримеры и мономеры исследованных OmpF и ОтрС поринов относятся к белкам ß-класса: доля суммарной ß-структуры составляет 55-96 и 50-85%, соответственно, доля а-спирали в белках составляет 0-17 и 0-18% соответственно.

Термоденатурированные мономеры OmpF и ОтрС поринов относятся к белкам a+ß класса и характеризуются увеличением доли a-спирали до 22% за счет уменьшения доли ß-структуры и ß-изгибов. Изменения в содержании неупорядоченной структуры денатурированных OmpF и ОтрС поринов зависят от типа и вида микроорганизма: в одних случаях доля ее увеличивалась (OmpF белки из У. intermedia и У. enterocolitica), в других (OmpF из У. intermedia, ОтрС из У. kristensenii) уменьшалась почти в два раза. Согласно расчетам, полученным с помощью пакета программ CDPro, вторичная структура тримеров и мономеров OmpF и ОтрС поринов в процессе выделения не претерпевает существенных изменений, поскольку показатель денатурации (d) для этих форм белков равен нулю (d = 0), а в случае термоденатурированных мономеров показатель денатурации больше нуля (d = 2-3).

Как видно из рис. 4, спектры КД в дальней УФ-области разных молекулярных форм OmpF поринов иерсиний имеют изодихроичную точку при 206 нм. Этот факт свидетельствует о том, что переход тример—»мономер—»термостабильный мономер в случае OmpF поринов происходит без образования каких-либо промежуточных конформационных состояний. В спектре ОтрС поринов наблюдаются две изодихроичные точки: при 208 и 210 нм, соответствующие переходу тример->мономер и тример->термостабильный мономер. Вероятно, в случае ОтрС белков переход одной формы белка в другую носит менее кооперативный характер в сравнении с OmpF. Полученные данные указывают на то, что разные молекулярные формы поринов иерсиний представляют собой стабильные конформационные интермедиаты белка.

На уровне третичной структуры разные молекулярные формы OmpF и ОтрС поринов иерсиний, как видно из спектров КД в ближней УФ-области (рис. 4; б, г), существенно отличаются. Так, тримеры OmpF и ОтрС поринов имеют жесткую третичную структуру, что подтверждается наличием в спектрах положительной полосы при 288 нм, природа которой обусловлена остатками триптофана, фиксированными во внутренней части белковой молекулы, и рядом положительных полос в области 260-280 нм, связанных с присутствием остатков тирозина и фенилаланина. Спектры КД мономерных форм OmpF и ОтрС поринов иерсиний (рис. 4; б, г) характеризуются меньшим количеством полос, меньшей степенью их разрешения и меньшей амплитудой, что свидетельствует об увеличении симметризации окружения ароматических аминокислотных остатков. Очевидно, диссоциация тримеров OmpF и ОтрС поринов иерсиний на мономеры сопровождается "разрыхлением" структуры белковой молекулы. В спектрах термоденатурированных мономерных форм OmpF и ОтрС поринов исследованных видов иерсиний отсутствуют вышеуказанные характеристические полосы, свидетельствующие о выраженной третичной структуре белка (рис. 4; б, г).

Методом собственной белковой флуоресценции были обнаружены различия между разными молекулярными формами OmpF и ОтрС белков на уровне локальной третичной структуры. Так, тримерные и мономерные формы OmpF поринов из исследованных видов иерсиний в растворах SDS характеризуются практически одинаковым положением максимумов (ХЫЭкс.) спектров как суммарной (328±2 - 330±2 нм), так и триптофановой (335±2 - 337±2 нм) флуоресценции. Исключение составляет порин из У. enterocolitica: максимум спектра триптофанового излучения его тримера по сравнению с максимумом спектра мономера смещен в длинноволновую область на 6 нм (340±2 против 334±1 нм). Вероятно, в мономере порина из У. enterocolitica остатки триптофана находятся в менее полярном и менее подвижном микроокружении, чем в тримере.

В случае OmpC поринов иерсиний тримеры и мономеры, напротив, различаются положением максимумов спектров как суммарной, так и триптофановой флуоресценции, и эти различия определяются видом микроорганизма. Спектры флуоресценции мономеров OmpC поринов У. intermedia, У. enterocolitica, У. frederiksenii отличаются от подобных спектров тримеров более коротковолновым положением максимумов суммарного (324±2 - 327±1 против 329±2 - 332±1 нм) и триптофанового (331 ±2 - 333+2 против 336±1 - 339+1 нм) излучения. Исключение составляет OmpC порин из У. kristensenii: тример и мономер, подобно OmpF белкам, имеют практически одинаковое положение суммарной (333+1 и 332+2 нм соответственно) и триптофановой (340+1 и 339+1 нм соответственно) флуоресценции.

Общие тенденции изменений параметров спеетров флуоресценции при переходе тример->мономер продемонстрированы на примере спектров флуоресценции OmpF и OmpC поринов из У. intermedia (табл. 1). Несовпадение положений максимумов полос при Лвозб, = 280 и 296 нм в спектрах тримеров и мономеров как OmpF, так и и OmpC поринов иерсиний (табл. 1) свидетельствует о существенном вкладе остатков тирозина в суммарную эмиссию белка. На это также указывает значительно большая интенсивность суммарной флуоресценции тримеров и мономеров обоих типов поринов по сравнению с интенсивностью триптофанового излучения (в 3.1-3.5 раза для OmpF и 3-4 раза для OmpC белков) и увеличение значения R (АВОзб. = 280 нм) в 1.3-1.7 раза для OmpF порина и 1.3-1.5 раза для OmpC белков. Эти особенности спектров поринов могут быть вызваны невысокой эффективностью передачи энергии возбуждения от остатков тирозина к остаткам триптофана, вследствие расположения этих ароматических флуорофоров в разных структурных доменах белковой молекулы и/или тушением триптофановой флуоресценции белков.

Таблица 1. Параметры спектров флуоресценции OmpF и OmpC поринов НМ У. intermedia.

Образец порина в 0.01 М Трис-HCI буфере (pH 7.4) в присутствии 0.25% SDS ^-воэб.- нм /фл., отн. ед. bXVi, нм Я Сз20/ 35t>)

ТЛТ OmpF 280 328+2 224.30 63 1.35

296 337+1 66.00 64 0.94

ТЛМ OmpF 280 329+1 258.30 69 1.28

296 338+1 82.80 61 0.85

ТСМ OmpF 280 310+1 138.90 78 1.28

296 339+1 46.60 67 0.82

ТЛТ ОтрС 280 329+2 280.40 65 1.29

296 336+2 80.00 62 • 0.85

ТЛМ ОтрС 280 324+2 332.60 59 1.52

296 332±1 97.90 59 1.16

ТСМ ОтрС 280 310±2 43.60 88 1.18

296 345+1 18.70 62 0.64

Обозначения: ТЛТ, ТЛМ и ТСМ — термолабильные тримерная и мономерная, и термостабильная мономерная формы порина соответственно; / фл., отн. ед. — интенсивность флуоресценции в относительных единицах.

Спектры мономеров как ОтрР, так и ОтрС поринов НМ иерсиний по сравнению со спектрами тримеров характеризуются увеличением интенсивности суммарной и триптофановой флуоресценции, а в случае ОтрС белков уменьшением полуширины полосы (ДАи) и увеличением значения Я (отношение интенсивностей излучения при 320 и 350 нм). Вероятно, наблюдаемые эффекты являются результатом нарушения взаимодействия триптофанилов с окружающими карбоксильными группами в молекуле тримера при его диссоциации и, как следствие, изменения микроокружения остатков триптофана в белках.

Термостабильные мономеры как ОтрР, так и ОтрС поринов по сравнению с нативными формами белков характеризуются существенным сдвигом максимума спектра

суммарной флуоресценции в коротковолновую область (до 310±1 - 312±1 нм), а также уменьшением почти в 3 раза интенсивности флуоресценции, увеличением полуширины полосы и уменьшением величины R. Наблюдаемый так называемый "голубой" сдвиг \макс. в спектрах указывает на изменение конформации порина, поскольку вклад тирозина в суммарное излучение белка увеличивается за счет увеличения расстояния между остатками тирозина и триптофана.

Изменения в спектрах триптофанового излучения термостабильных мономеров OmpF и ОтрС поринов зависят от типа порина и вида микроорганизма. Так, обнаружено существенное (6 нм) смещение Лыакс. в длинноволновую область спектра OmpF порина из У. kristensenii и незначительное - в спектрах OmpF поринов из У. intermedia, У. enterocolitis, У. frederiksenii. В спектрах термостабильных мономеров ОтрС белков наблюдаются значительные смещения Хиж. триптофанового излучения в длинноволновую область (до 343-345 нм) в случае поринов из У. intermedia и У. frederiksenii и менее значительные (до 340 нм) в случае поринов из У. enterocolitica и У. kristensenii. Другие параметры спектров (/фЛ., &km, R) всех термостабильных мономеров OmpF и ОтрС поринов иерсиний также существенно отличаются от подобных характеристик спектров триптофановой флуоресценции тримеров.

Влияние способа экстракции и природы солюбилизирующего детергента на пространственную структуру поринов. На следующем этапе исследований изучено влияние способа экстракции и природы солюбилизирующего детергента на молекулярную организацию функционально активных тримеров OmpF поринов НМ из У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii.

Порины НМ грамотрицательных бактерий могут быть выделены двумя способами. Характеристика пространственной структуры OmpF поринов НМ иерсиний, полученных первым способом, который основан на диссоциации комплекса ПГ-белок при температуре 37°С в присутствии 0.5 M NaCI и 1%-ного SDS (тример - Tsds), представлена выше. Второй способ основан на расщеплении ПГ слоя лизоцимом (LYS) при температуре 42°С и pH 6.0. В результате использования второго метода из исследованных видов иерсиний "холодового" варианта были получены белковые фракции, содержащие по данным SDS, ПААГ-электрофореза только олигомерную форму порина - гомотримеры Obs) (M, 110 кДа) (рис. 5). Tlys поринов иерсиний, подобно Tsds. являются термолабильными и при кипячении (в течение 10 мин) переходят в термостабильный мономер (M, 38 кДа) (рис. 5).

1 2 3 4 Рис. 5. Электрофореграмма поринов НМ бактерий рода Yersinia (на

примере порина из Y. enterocolitica), выделенных из комплекса ПГ-белок при 110 кДа обработке лизоцимом (при pH 6.0) и температуре 42°С (TLYs, дорожки 1, 3) и " ** " 1 %-ным SDS в присутствии 0.5 M NaCI при температуре 37°С (Tsds, дорожки

_ ЗЗкДа 2, 4): 1, 2 - термолабильные тримерные (и мономерная) и 3, 4 -30 кДа термостабильные мономерные формы белков соответственно.

Спектры КД в дальней (190-240 нм) и ближней (250-300 нм) УФ-областях для Т|_уз поринов из исследованных видов иерсиний, как и в случае Тбоэ, оказались близки между собой. В связи с этим, в качестве примера на рис. 6 представлены спектры КД ^уэ и Тзоэ из У. еп(егосо1Шса. Как показал анализ пространственной структуры, Тьуб и Тбээ существенно различаются на уровне вторичной (рис. 6, а) и третичной структуры белков (рис. 6, б). Согласно расчетам, содержание элементов вторичной структуры ^уэ поринов из всех видов иерсиний характерно для полностью Р-структурированных белков: относительное содержание суммарной (¡-структуры в Т^э поринах составляет 84-94 против 64-86% в Тэоэ образцах, содержание а- спирализованных участков в Тьуэ составляет 0-5 против 0-12% в Тэоэ- На уровне третичной структуры Тьуэ отличаются от

Тбоз более компактной упаковкой белковой молекулы, что подтверждается большей (в 1.5 раза) интенсивностью полос в спектрах КД в ближней УФ-области (рис. 6, б).

1.0

. 0.8

£ i <

330 340 350 360

Л, нм

Рис. 6. Спектры КД в дальней (а) и ближней (б) УФ-областях и спектры триптофановой флуоресценции (е) OmpF поринов HM У. enterocolitica, выделенных из ПГ-белковых комплексов экстракцией 1%-ным SDS при температуре 37°С (Tsds) и после обработки лизоцимом при температуре 42°С (TLys).

Кроме того, спектры Tlys отличаются от спектров Tsds значительным смещением положения максимума суммарной и триптофановой флуоресценции в среднем на 7-10 нм в область коротких длин волн (рис. 6, в) и изменением ряда других спектральных характеристик. Обнаружено, что в случае У. enterocolitica изменения на уровне третичной структуры поринов иерсиний в зависимости от способа выделения были более заметными, чем в случае непатогенных видов иерсиний. Полученные данные позволяют предположить, что молекулярная организация Tlys поринов иерсиний, в отличие от Tsds, в большей степени приближена к нативному состоянию порина в составе HWI бактериальной клетки.

Как показали наши исследования, пространственные структуры функционально активных тримеров OmpF поринов из У. intermedia, У. enterocolitica, У. kristensenii, У. frederiksenii в присутствии 0.25%-ного SDS и 0.25%-ного ß-D-октилглюкозида (0G) существенно различаются (рис. 7). Согласно расчетам количественного содержания элементов вторичной структуры, полученным с помощью двух методов (Provencher -Glockner и пакета программ CDPro), порин в присутствии 0G характеризуется большей долей суммарной ß-структуры (до 97%) и меньшими долями а-спирализованных участков (до 4%) и неупорядоченной структуры (до 12%).

а б

Рис. 7. Спектры КД в дальней (190-240 нм, а) и ближней (250-300 нм, б) УФ-областях тримеров OmpF порина из У. kristensenii в 0.01М Трис-HCI буфере (pH 7.4) в присутствии 0.25%-ного SDS (1) и 0.25%-ного OG (2).

Как известно, вторичная структура порина из Е. coli в липидной мембране характеризуется высоким содержанием ß-структуры и низким содержанием а-спирали (не более 4%). Считается, что такая конформация порина приближена к состоянию белка в нативной бактериальной мембране. В связи с этим можно предположить, что вторичная структура поринов НМ иерсиний в присутствии OG в большей степени соответствует таковой в нативной бактериальной мембране.

На уровне третичной структуры порины в растворах OG (рис. 7, б) характеризуются более компактной структурной организацией молекулы белка, чем в растворе ионного детергента. Это подтверждается значительным смещением положения максимумов спектров флуоресценции тримерных форм поринов в растворах OG в коротковолновую область (на 5-9 нм в случае суммарного и 6-10 нм в случае триптофанового излучения) и изменением других параметров спектра флуоресценции по сравнению с таковыми для белков в растворе SDS. Кроме того, результаты тушения триптофановой флуоресценции поринов подтверждают высказанное предположение: величины констант тушения в присутствии OG (К"туш. = 1.36-3.44 М"1) в 6-10 раз меньше в сравнении с таковыми для поринов в растворах SDS (/Стуш. = 6.24-15.0 М"1). Этот факт свидетельствует о низкой степени доступности остатков триптофана в белках молекулам растворителя в этих условиях. Можно предположить, что при замене SDS на OG, с одной стороны, происходит ассоциация белка с образованием высокоструктурированных агрегатов; с другой стороны, возможно, OG восстанавливает нативную конформацию порина, т.е. ту конформацию, что характерна, как полагают, для поринов в составе бактериальной мембраны.

Совокупность полученных данных показывает, что способ экстракции и природа солюбилизирующего агента влияют на молекулярную организацию изолированных поринов HM У. intermedia, У. enterocolitica, У. kristensenii, У. frederiksenii. Очевидно, порины из исследованных видов иерсиний в изолированном виде представляют собой различные конформационные интермедиаты, пространственная структура которых зависит от условий перевода белков в раствор.

Температурная денатурации поринов иерсиний. Влияние температуры на пространственную структуру тримеров OmpF и ОтрС "поринов иерсиний было исследовано в интервале 20-90°С. Согласно данным БОЗ.ПААГ-электрофореза, нагревание тримеров в указанном диапазоне температур не приводит к появлению термолабильного мономера, наблюдаемого в процессе выделения поринов, а только к образованию термостабильного (термоденатурированного) мономера (рис. 8).

123 45678 9

Рис. 8. Электрофореграмма порина из У. enterocolitica (в растворе 0.25%-ного SDS) при 20-40°С (1), 45°С (2), 50°С (3), 55°С (4), 60°С (5), 65°С (6), 70°С (7), 80°С (8), 90°С (9). ТЛТ и ГСМ - термолабильная тримерная и термостабильная мономерная формы порина соответственно.

Вероятно, термоденатурация исследованных белков представляет собой двухстадийный процесс (диссоциация - денатурация), отдельные стадии которого существенно различаются по своим скоростям. Отсутствие на электрофореграммах мономерной формы порина можно также объяснить тем, что диссоциация тримера на мономеры происходит одновременно с денатурацией мономера белка. Подобный характер температурной денатурации отмечен для поринов из £ coli и У. pseudotuberculosis.

Методом собственной белковой флуоресценции установлено, что до температуры 50°С денатурация белков является обратимой, а в интервале 50~70°С наблюдается информационный переход порина в термоденатурированный мономер (рис. 9, 10), на это указывает резкое изменение положения максимума (с 330±2 до 313+1 — 310±1 нм), а также изменения других параметров спектров суммарной флуоресценции OmpF и ОтрС

белков. Конформационный переход для всех исследованных ОтрР и ОтрС поринов описывается Б-образной кривой, средняя точка которой соответствует температуре такого перехода. Для ОтрР и ОтрС поринов из разных видов иерсиний она оказалась разной (рис. 9, а; 10, а). Так, для ОтрЯ белка из У. еп¡егосоИНса термопереход происходит при 55°С, что на 7-10°С меньше по сравнению с таковым для ОтрР поринов из непатогенных видов иерсиний (62-65°С). При этом ОтрР порин из У. к^епвепп, в отличие от ОтрР поринов других видов иерсиний, претерпевает два температурных перехода - при 50 и 70°С, причем оба носят кооперативный характер (рис. 9, б).

335

X 330

2 г 325

с

о о 320

«5

1 ч" 315

£

310

t=*=t

........ 2

_. -А«. 3

•fb \ 4

' \ \

V

5"!

355

350

345

340

5 335

ззо-

20 30 40 50 60 70 80 100 Температура. °С

».....ЦЩ*

20 30 40 50 60 70 80 100 Температура, °С

Рис. 9. Графики изменения (А„акс.) суммарной (а) и триптофановой (б) флуоресценции OmpF поринов из У. intermedia (1), У. enterocolitica (2), У. kristensenii (3) и У. frederiksenii (4) в зависимости от температуры (20—90°С).

• У./. -У.е -УЛ. -Y.f.

0 345

S 340

1 335 г, 330

20 40 60

температура, С

80 100

20 40 60 80 температура, С

1СС

Рис. 10. Графики изменения (Лшкс.) суммарной (а) и триптофановой (б) флуоресценции ОтрС поринов из У. intermedia (У. /'.), У. enterocolitica (У. е.), У. kristensenii (У .к.), У. frederiksenii (У. f.) в зависимости от температуры (20-90°С).

В случае ОтрС поринов из У. kristensenii и У. frederiksenii термопереход наблюдался при 57 и 45°С соответственно, что в среднем на 10°С ниже, чем для OmpF-подобных белков из этих микроорганизмов.Для ОтрС поринов из У. enterocolitica и У. intermedia переход в денатурированный белок происходит при температурах 54 и 62°С соответственно, что близко значениям температур перехода OmpF белков из данных видов иерсиний. Дальнейшее повышение температуры (70-90°С) не вызывает измений спектральных характеристик как OmpF, так и ОтрС белков (рис. 9, а; 10, а).

Переход тримера в термостабильный мономер для OmpF и ОтрС поринов иерсиний приводит к различным конформационным состояниям этих белков. Так, в спектрах триптофановой флуоресценции термоденатурированных мономеров OmpF белков наблюдается два пика: один при 332±2 нм (характерный для поринов из всех иерсиний) и второй при 350+1 нм (для белков из непатогенных иерсиний) и 355±1 нм (для порина из У. enterocolitica). Можно предположить, что при термоденатурации OmpF белков I часть остатков триптофана оказывается на поверхности белковой молекулы и доступна растворителю, другая же часть остается в гидрофобном окружении, в структурном домене, устойчивом к нагреванию. Для термоденатурированных ОтрС поринов в спектре триптофановой флуоресценции наблюдается только один пик: при 337±2 нм для белков непатогенных иерсиний и при 340+1 нм для порина из У. enterocolitica (рис. 10, б). Эти параметры спектров близки к таковым в спектрах исходных ОтрС тримеров, что (

свидетельствует о минимальных изменениях в микроокружении остатков триптофана в , этих условиях. Для подтверждения высказанного предположения были построены и проанализированы модели пространственных структур OmpF и ОтрС поринов иерсиний (на примере белков из У. enterocolitica).

Теоретические модели пространственных структур OmpF и ОтрС поринов из Y. enterocolitica Методом сравнительного моделирования с помощью сервера SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasv.Org//SWISS-MODEL) были построены высокоточные модели пространственных структур мономеров и тримеров OmpF и ОтрС поринов У. enterocolitica. В качестве прототипа была выбрана кристаллическая структура осмопорина из Klebsiella pneumoniae (код PDB 10SM) ввиду высокой степени идентичности первичных структур OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica и осмопорина из К. pneumoniae (64 и 75% соответственно). Точность полученных 30-структур ОтрС и J

OmpF поринов У. enterocolitica подтверждена методом суперпозиции Ca атомов прототипа и каждого из мономеров поринов с помощью программы МОЕ [(Chemical Computing Group, Inc.; http://www.chemcomp.com)l (величина среднеквадратичного отклонения для всех Ca атомов OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica в сравнении с таковыми для осмопорина из К. pneumoniae составила 0.34 Ä и 0.59 А соответственно). Анализ пространственных структур ОтрС и OmpF поринов из У. enterocolitica показал, что белки отличаются количеством межмолекулярных (межмономерных) контактов, стабилизирующих эти структуры (табл. 2), и конформацией внешних петель L4, L6 и L7 (рис. 11).

Таблица 2. Количество внутри- и межмономерных контактов, стабилизирующих структуры OmpF и ОтрС поринов из У. enterocolitica.

Тип порина Водородные Гидрофобные Ионные

связи контакты связи

мономер OmpF 69 36 11

мономер ОтрС 74 38 10

гример OmpF 52 41 8

гример ОтрС 27 36 6

Рис. 11, Суперпозиция Са атомов ЗЭ-структур мономеров ОтрР и ОтрС поринов из У. еЫегосоШюа. Ленточные диаграммы структур поринов обозначены серым (ОтрР) и черным (ОтрС) цветами (стрелками отмечены наибольшие различия во внешних петлях мономеров).

Анализ локализации остатков триптофана в ОтрР и ОтрС поринах из У. еМегосо/Шса и изучение ориентации Тгр 222 ОтрР порина методом молекулярной динамики. С помощью методов молекулярной динамики и суперпозиции ЗО-структур мономеров ОтрС и ОтрР поринов У. еЫегосоННса было установлено, что локализация и микроокружение одного из трех остатков Тгр в белках (Тгр222 в ОтрР и Тгр184 в ОтрС) существенно различаются (рис. 12, А, Б, В). Так, в ОтрЯ порине остаток Тгр222, находящийся на внешней поверхности (3-барреля ((310-стренд), стабилизирован взаимодействием с РИе199, при этом остаток Тгр лишь частично доступен растворителю (рис. 12, А, В). В случае ОтрС порина остаток Тгр184, расположенный в середине Т5-изгиба, полностью доступен растворителю (рис. 12, Б, В).

Рис. 12. Локализация остатков триптофана в Зй-структурах ОтрР (А) и ОтрС (Б) поринов из У. ел¡еюсоИИса: структуры поринов показаны в виде линии, структуры молекул триптофана (Тгр) и фенилаланина (Р11е199) показаны в виде атомных радиусов. Суперпозиция ЗР-структур мономеров поринов из У. еМегосоННса и локализация остатков триптофана (В): структуры поринов в виде ленточных диаграмм показаны серым (для ОтрР) и черным (для ОтрС) цветами, структуры остатков Тгр и РЬе199 показаны в виде атомных моделей (рисунок получен с помощью программы МОЕ).

' Методом молекулярной симуляции ЗР-структур мономеров при температурах 300 и 350К (соответственно 27 и 77°С), соответствующих нативной и термоденатурированной формам белков, была проанализирована конформация (пространственная ориентация) остатков триптофана в ОтрР и ОтрС поринах. Обнаружено, что локальное микроокружение и конформация остатка Тгр184 в молекуле нативного и термоденатурированного ОтрС порина не имеет существенных различий. Остаток Тгр184 в обеих формах ОтрС порина одинаково доступен растворителю, что подтверждается экспериментальными данными. Особенностью микроокружения Тгр222 в ОтрР порине (рис. 13) является наличие остатка РИе199, при этом атомы фенольного кольца (РИе199) при 300К являются ближайшими к атомам индольного кольца (находятся на расстоянии 3.07 А). При повышении температуры до 350К расстояние между остатками Тгр222 и РИе199 в симулированной ЗО-структуре мономера ОтрБ порина увеличивается с 3.07 А до 5.38 А (рис. 13). При этом конформация остатка Тгр222 (положение плоскости и угла наклона индольного кольца и боковой цепи остатка триптофана) в структуре ОтрЯ порина значительно меняется, и, как следствие, нарушаются (ослабляются) связи между остатками Тгр222 и Р1пе199. Это существенно влияет на подвижность остатка Тгр222 в молекуле порина и увеличивает его доступность растворителю, что согласуется с полученными экспериментальными данными.

Рис. 13. Положения индольных колец остатков Тгр222 и РИе199, определенные с помощью метода молекулярно динамической симуляции при температурах 300 и 350К (обозначены светло-серым и темно-серым цветами соответственно). Расстояние между триптофаном и фенилаланином при температуре ЗООК равно 3.07 А, при температуре 350К - 5.38 А (рисунок получен с помощью программы МОЕ).

Таким образом, проведенный детальный сравнительный анализ пространственной организации поринов исследованных видов иерсиний с помощью оптических методов, а также анализ теоретических моделей OmpF и ОгпрС поринов из У. enterocolitica позволил выявить различия в структуре этих белков на атомном уровне. Обнаружено, что на фоне высокой степени подобия структурной организации молекул поринов иерсиний, существует целый ряд особенностей, которые определяются типом порина и видом микроорганизма. На уровне вторичной структуры белка это различное содержание/соотношение элементов регулярной структуры; на уровне первичной структуры это различное положение одного из остатков триптофана в молекуле OmpF и ОтрС белков и, как следствие, различные изменения в структуре белков в результате термоденатурации. Изменения параметров спектров флуоресценции при диссоциации и/или денатурации обоих типов поринов подчиняются общим правилам: диссоциация способствует уменьшению внутреннего тушения флуоресценции, термоденатурация приводит к увеличению вклада тирозина в суммарное излучение белка и экспонированию остатков триптофана в растворитель.

6. Иммунобиологические свойства поринов бактерий рода Yersinia Иммуногенные свойства поринов иерсиний (на примере порина из Y. enterocolitica). С помощью иммунохимических методов (иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа, ИФА) было установлено, что порин из У. enterocolitica, подобно порину из У. pseudotuberculosis, является иммунодоминантным белком НМ возбудителя, антитела к которому вырабатываются как при экспериментальной инфекции (иммунизация животных), так и при естественном течении иерсиниозной инфекции у людей (рис. 14). Антитела к поринам иерсиний (У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis) образовывались при иммунизации животных независимо от формы вводимого антигена: лизаты клеток, фрагменты наружной мембраны, изолированный порин. Разные молекулярные формы (тример и термостабильный мономер) порина из У.enterocolitica являются тмуногенными для кроликов: титры полученных антисывороток составляют 1:51200 и 1:102400 соответсвенно (липополисахарид из У. enterocolitica взаимодействует с данными антисыворотками на уровне фона).

Рис. 14. Иммуноблоттинг сывороток крови: интактных белых мышей (1) и павианов гамадрилов (4), иммунизированных (перорально) целыми клетками иерсиний белых мышей (2), морских свинок (3), павианов гамадрилов (5) и переболевших иерсиниозом людей (больные № 19, № 22, № 24, № 38 - ряды 6-9). Электрофореграмма лизатов клеток У. enterocolitica (657 штамм, 0:9 серовар) (1-9) и порина (термостабильный мономер) из У. enterocolitica (164 штамм, 0:3 серовар) (10).

1 2 3 i 5 8 7 8 S 1»

W

Антигенное родство поринов иерсиний. Порины иерсиний, как установлено с помощью ИФА и иммуноблоттинга, являются видо- и родоспецифическими антигенами НМ бактерий. Порин из У. enterocolitis 0:3 сероварианта в ИФА взаимодействует с антисыворотками к У. enterocolitica других серовариантов в разведении 1:12800-1:25600, а порин из У. pseudotuberculosis lb серовара - с антисыворотками к бактериям I-VI сербваров У. pseudotuberculosis в разведении 1:12800. Титры гомологичных антисывороток к изолированным поринам из У. enterocolitica и У pseudotuberculosis равны 1:51200.

В то же время порин из Y.enterocolitica взаимодействует с кроличьими антисыворотками, полученным к бактериям I-VI сероваров У. pseudotuberculosis, а порин из У. pseudotuberculosis реагирует с антисыворотками к бактериям различных сероваров У. enterocolitica, У. kristensenii, Y. intermedia и У. frederiksenii. При взаимодействии поринов иерсиний с антителами к некоторым микроорганизмам семейств Enterobacteriaceae и Brucellaceae обнаружен низкий уровень перекрестных реакций.

Согласно данным иммуноблоттинга, кроличьи антисыворотки, полученные к порину и фракции белков НМ У. pseudotuberculosis, лизату клеток У. kristensenii, выявляют все порообразующие белки НМ бактерий рода Yersinia как "холодового", так и "теплового" вариантов (рис. 15).

1, 2* 2т hkh4, к 5т !r2;y ?I j> Зт „ jT:jx 5х 5т 1i 2* 2т J* Л 4я it 5* 5т

Рис. 15. Иммуноблоттинг сывороток кроликов, иммунизированных мономером порина (а) и фракцией белков НМ У. pseudotuberculosis (6); лизатом клеток У. kristensenii (в). Электрофореграмма лизатов клеток: 1 - У. intermedia; 2 - У. enterocolitica: 3 - У. kristensenii, 4 - У. frederiksenii; 5 - У, pseudotuberculosis. Микроорганизмы выращены при температуре 6-8 и 37°С, соответственно, "холодовой" (х) и "тепловой" (т) варианты.

Использование порина из У. enterocolitica для диагностики иерсиниоза с помощью ИФА. Результаты изучения иммуногенных и антигенных свойств порина из У. enterocolitica послужили предпосылкой к использованию белка для диагностики иерсиниоза с помощью ИФА. Разработанная диагностическая ИФА тест-система на основе термостабильного мономера порина из У enterocolitica характеризуется высокой специфичностью (89%) и эффективностью (95%) верификации иерсиниоза. За диагностический титр принято разведение сывороток крови больных 1:800-1:1600, которое позволяет достоверно дифференцировать больного иерсиниозом от здорового пациента. Диагностическая ценность ИФА тест-системы была подтверждена при сравнении статистически достоверных результатов серологического обследования больных иерсиниозом (с бактериологически подтвержденным диагнозом) с помощью коммерческого иерсиниозного диагностикума (РНГА с использованием типоспецифического полисахаридного антигена) и предлагаемой тест-системы (рис. 16). В результате обследования пациентов двумя методами, установлено, что ИФА на основе порина в 2.3 раза эффективнее, чем РНГА, выявляет в сыворотках крови больных иерсиниозом антитела к У. enterocolitica как на ранних, так и на более поздних стадиях заболевания независимо от серологического варианта возбудителя.

Рис. 16. Сравнительная эффективность ИФА тест-системы на основе порина из У. ^ЫегосоШса и коммерческого диагностикума РИГА на основе ЛПС) при анализе пуловых сывороток крови больных иерсиниозом в различные сроки заболевания (ряды 1, 2, 3 -1-ая, 2-ая и 3-я недели соответственно).

длительность заболевания, нодоли

Данная ИФА тест-система (поддержана патентом РФ) успешно прошла апробацию в лечебных учреждениях гг. Владивостока и Санкт-Петербурга и может быть рекомендована для практического применения. При апробации ИФА тест-системы были проанализированы 857 сывороток крови больных с характерными клиническими признаками иерсиниоза, 106 сывороток здоровых доноров, а также, учитывая полиморфизм иерсиниозной инфекции, сыворотки крови больных псевдотуберкулезом (228 больных), сальмонеллезом (54 больных) и гепатитом (А и В) (64 больных). Анализ индивидуальных и пуловых сывороток крови больных показал высокую специфичность и эффективность. ИФА тест-системы на основе порина из У. enterocolitica для диагностики иерсиниоза, что позволяет достоверно выявлять его среди других острых кишечных инфекций. Обнаружена также возможность дифференцировать иерсиниозы с учетом этиологии возбудителя (рис. 17). В настоящее время клинические лаборатории нашей страны не располагают методами диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза, сравнимыми по эффективности с предлагаемой тест-системой.

Рис. 17. Анализ сывороток крови больных (сальмонеллезом, иерсиниозом, псевдотуберкулезом, гепатитом) и здоровых доноров в разведении 1:800 (ряды 1-5 соответственно) и 1:1600 (ряды 7-11 соответственно) с помощью ИФА тест-системы на основе порина из У. enterocolitica. АЮ2 - значение оптической плотности Продукта ферментативной реакции в относительных единицах ИФА (А), регистрируемое при А = 492 нм.

Диагностика вторично-очаговых форм иерсиниозов с помощью ИФА тест-системы на основе порина из Y. enterocolitica. Впервые для этиологической верификации вторично-очаговых форм иерсиниозов (или иммунопатологий), связанных с нарушениями функции опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой и нервной систем, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы была использована ИФА тест-система на основе поринов НМ У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis. С помощью тест-системы в сыворотках крови взрослых больных (65 человек) с различными формами артралгий неустановленной этиологии в 42% случаев были обнаружены антитела к У pseudotuberculosis и в 9% случаев - антитела к У. enterocolitica. Анализ сывороток крови детей (40 человек) с кардиологическими патологиями (инфекционно-аллергический миокардит) с помощью данной тест-системы в 10% случаев выявил антитела к У. pseudotuberculosis, а в 5% случаев - антитела к У. enterocolitica. При анализе сывороток крови больных детей с поражениями центральной нервной системы (55 человек с первичным диагнозом «бактериальный менингит») в 20% случаев были обнаружены антитела к порину из У. enterocolitica, антител к порину из У. pseudotuberculosis не было обнаружено. Анализ сывороток крови взрослых больных (75

"4921.61.41.г-1 0.8 0.6 0.4 0.2

6

НШо-лшп

11

человек) с поражением периферической нервной системы (вертеброгенная люмбальгия, дискогенный радикулит) в 32% случаев выявил антитела к порину из У. еп(егосоИНса. Полученные результаты подтверждают принципиальную возможность выявления различных форм иммунопатологии, обусловленных иерсиниями, с помощью предлагаемой тест-системы.

Использование разных молекулярных форм ОтрР и ОтрС поринов НМ У. ел{егосо//(/са для диагностики иерсиниоза и оценки некоторых показателей гуморального иммунного ответа у больных иерсиниозом. Сравнительный анализ антигенных свойств разных молекулярных форм (тримера и термоденатурированного мономера) ОтрР и ОтрС поринов из У. еп1егосо1Шса с помощью ИФА тест-системы показал, что порины отличаются антигенной структурой. Так, ОтрС в два раза эффективнее, чем ОтрР, выявляет специфические антитела к порину в сыворотках крови больных иерсиниозом на разных стадиях заболевания. Обнаруженные различия в антигенных свойствах двух типов поринов из У. е^егосоННса обусловлены структурными различиями этих белков, о которых сообщалось выше. Кроме того, тримеры поринов (как ОтрР, так и ОтрС) в ИФА в 1.5-2 раза эффективнее, чем мономер, выявляют антитела к порину из У. еМегосоНИса в сыворотках крови больных с острой кишечной формой иерсиниоза независимо от срока заболевания (рис. 18).

Рис. 18. Определение с помощью ИФА антител к тримерной (Т) и термостабильной мономерной (ТСМ) формам ОтрС и ОтрР поринов из У. еМегосоНИса в сыворотках крови больных иерсиниозом в разные сроки заболевания: 1 и 2 - сыворотки взрослых и детей соответственно, 1-ая неделя болезни; 3,4 — сыворотки взрослых и детей соответственно, 2-ая неделя болезни. Д492 — значение оптической плотности продукта ферментативной реакции в относительных единицах ИФА (А), регистрируемое при А = 492 нм.

Вероятно, различия в пространственной структуре тримеров и мономеров поринов ОтрР и ОтрС поринов из У. еЫегосо!Шса определяют различия и в антигенной структуре этих белков, что характерно и для поринов других энтеробактерий.

Разные молекулярные формы поринов из У. е^егосоМюа были использованы для определения некоторых показателей гуморального иммунного ответа (уровня специфических иммуноглобулинов (1д) классов Ми6)у больных с острыми кишечными и вторично-очаговыми формами иерсиниоза. Обнаружено, что в сыворотках крови больных с острой кишечной формой иерсиниоза уровень класс-специфических иммуноглобулинов к тримеру порина был выше, чем к мономеру. Это позволяет рассматривать тример порина как более перспективную форму антигена из У е^егосоННса не только для диагностики иерсиниоза, но и для выявления напряженности иммунной реактивности организма (возможных осложнений) при иерсиниозе.

Сравнительный анализ сывороток крови больных с поражением периферической нервной системы с помощью ИФА с использованием тримера и термоденатурированного мономера порина из У. еЫегосоЧИса показал, что уровень класс-специфических иммуноглобулинов (1дМ, 1дС) к мономеру у больных с хроническим состоянием выше, чем у больных на стадии обострения и ремиссии.

Совокупность полученных результатов подтверждает диагностическую ценность ИФА тест-системы на основе порина из У. еЫегосоЧИса как для диагностики острой кишечной и вторично-очаговой форм иерсиниоза, так и для оценки напряженности специфического иммунитета больных при этих формах иерсиниозной инфекции.

12 3 4

ВЫВОДЫ

1. Впервые из наружной мембраны 4-х видов бактерий рода Yersinia, патогенной для человека (V. enterocoiitica) и 3-х непатогенных видов (У. intermedia, Y. frederiksenii, У. kristensenii), культивируемых при температуре 6-8 и 37°С, выделены неспецифические порообразующие белки. Установлено, что изменение температуры культивирования приводит к экспрессии в ИМ иерсиний разных типов (OmpF- и OmpC-подобных) поринов.

2. Установлено, что функционально-активной формой OmpF и ОтрС поринов всех исследованных видов иерсиний является тример. Каналы, образованные поринами непатогенных видов иерсиний, по сравнению с У. enterocoiitica, отличаются значительно большей гетерогенностью по распределению уровней проводимости.

3. Определены физико-химические характеристики изолированных OmpF и ОтрС поринов из У. enterocoiitica, У. intermedia, Y. kristensenii и V. frederiksenii. Обнаружено, что исследованные порины, несмотря на высокую степень структурного подобия, имеют некоторые особенности на уровне вторичной и третичной структур. Показано, что порины в растворе детергентов могут существовать в виде тримеров и мономеров.

4. Показано, что способ извлечения белков из бактериальной мембраны и природа используемого для экстракции детергента влияют на стабильность третичной структуры и соотношение элементов регулярной вторичной структуры тримера порина.

5. Впервые установлены первичные структуры OmpF и ОтрС поринов из У. enterocoiitica и построены теоретические модели пространственных структур этих белков.

Основные различия между OmpF и ОтрС поринами иерсиний наблюдаются в конформации "внешних" петель и расположении одного из трех остатков триптофана в различных структурных элементах ß-барреля.

6. Установлено, что порины наружной мембраны бактерий рода Yersinia относятся к иммунодоминантным белкам этих микроорганизмов, являются видо- и родоспецифическим антигенами и могут быть использованы в качестве диагностических антигенов.

7. Впервые на основе порина НМ У. enterocoiitica разработана иммуноферментная тест-система для диагностики иерсиниоза. Предлагаемая тест-система обеспечивает диагностику иерсиниоза независимо от стадии инфекционного процесса и сероварианта возбудителя. Эффективность ИФА тест-системы в два раза выше используемого клиническими лабораториями коммерческого эритроцитарного кишечноиерсиниозного (0:3 и 0:9) диагностикума.

8. Впервые показано, что ИФА тест-система на основе разных молекулярных форм (тримера и мономера) порина из У. enterocoiitica в качестве диагностических антигенов отличается чувствительностью при верификации острой и вторично-очаговой форм иерсиниоза, а также специфичностью при оценке гуморального иммунного ответа больных с этими формами иерсиниозной инфекции.

Список статей и патентов, опубликованных по теме диссертации

1. Новикова О.Д., Лихацкая Г.Н., Фролова Г.М., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Тимченко Н.Ф., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Молекулярная организация и биологические свойства иерсинина-порина из псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis II Биол. мембраны. 1990. Т. 7, № 5. С. 453-461.

2. Хоменко В.А., Новикова О.Д., Федореева Л.И., Лихацкая Г.Н., Борисова М.П., Вострикова О.П., Вакорина Т.И., Тимченко Н.Ф., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Порин из Yersinia enterocoiitica 0:3. Выделение и характеристика //Биол. мембраны. 1994. Т. 11, № 1. С. 68-79.

3. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т. 128, №10. С. 437-440.

4. Вострикова О.П., Лихацкая Г.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Антигенное родство и функциональные свойства поринов рода Yersinia И Биол. мембраны. 2000. Т. 17, № 4. С. 399-409.

5. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Дробков В.И, Дармов И.В., Маракулин И.В., Соловьева Т.Ф. Иммунный ответ к основному порообразующему белку наружной мембраны Yersinia

pseudotuberculosis у людей и экспериментальных животных II Ред. журн. «Иммунология». - М., 2000. 15 с. Деп. в ВИНИТИ 28.03.00, № 795-В.

6. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Бениова С.Н., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В. Апробация иммуноферментной тест-системы на основе белка-порина из Yersinia pseudotuberculosis для диагностики псевдотуберкулеза (экстраинтестинального иерсиниоза) у детей // Иммунология. 2000. № 2. С. 59-61.

7. Гордеец А.В., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Малашенкова В.Г., Бениова С.Н., Новикова О .Д., Соловьева Т.Ф. Патент 2153172 Российская Федерация, MnK7G 01 N 33/53, 33/569. Способ

------------диагностики псевдотуберкулеза; "заявители и патентообладатели ВГМУ и ТИБОХ ДВО РАН. - №

98122085/14; Заявл. 02.12.98; Опубл. 20.07.00, Бюлл. № 20. 8 с.

8. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Бениова С.Н., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В. Диагностика псевдотуберкулеза с помощью иммуноферментной тест-системы на основе белка порина из Yersinia pseudotuberculosis II Тихоокеанский мед. журн. 2001. № 2. С. 23-25.

9. Vostrikova О.P., Novikova O.D., Kim N.Yu., Likhatskaya G.N., Solovjeva T.F. Pore-forming proteins of genus Yersinia!/ Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529, N 2. P. 261-263.

10. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний II Вестник ДВО РАН. 2004. № 3. С. 35-44.

11. Вострикова О.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Структура и функция порообразующих белков бактерий рода Yersinia. I. Выделение и сравнительная характеристика физико-химических свойств и функциональной активности поринов иерсиний II Биоорган, химия. 2006. Т. 32, № 4. С. 371-383.

12. Ким Н.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Лихацкая Г.Н. Вострикова О.П., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. 1. Функционально значимые информационные переходы иерсинина II Биол. мембраны. 2007. Т 24, № 2. С. 150-158.

13. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Малашенкова В.Г., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Патент 2339952 Российская Федерация, MnK7G 01 N 33/53, 33/569. Способ дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления; заявители и патентообладатели ТИБОХ ДВО РАН и ВГМУ. - № 20071200082; Заявл. 29.05.2007; Опубл. 27.11.2008, Бюлл. № 20. 8 с.

14. Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Исаева М.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 2008. Т. 34, № 2. С. 1-8.

15. Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Иммуногенные свойства рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Бюлл. эксп. биол. мед. 2009. № 7. С. 85-88.

16. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Патент 2345365 Российская Федерация, МПК7Э 01 N 33/53, 33/569. Способ дифференциальной диагностики кишечного иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления; заявители и патентообладатели ТИБОХ ДВО РАН и ВГМУ. - № 2007120080; Заявл. 29.05.2007; Опубл. 27.01.2009, Бюлл. № 20.8 с.

17. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Использование порина наружной мембраны Yersinia enterocolitis для диагностики кишечного иерсиниоза с помощью ИФА // Биол. мембраны. 2009. Т. 26, № 5. С. 419-428.

Соискатель

Вострикова О.П.

Вострикова Ольга Павловна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПОРИНОВ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ YERSINIA ENTEROCOLITICA И У. EWTEROCOL/Г/СА-ПОДОБНЫХ ВИДОВ

Автореферат

Подписано в печать 20 ноября 2009 г. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0 Тираж 100 экз. Заказ № 209507

Отпечатано в типографии "Краски" 690048, г. Владивосток, пр. 100 лот Владивостоку, 43; тел. (4232) 36-26-16, 55-95-31.

www.kpacku.com

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Неспецифические порообразующие белки наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

2.1. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий: структура и свойства.

2.2. Характеристика интегральных p-структурированных белков НМ грамотрицательных бактерий.

2.2.1. Асимметрия в распределении АК остатков.

2.2.2. Пространственная структура p-баррельных белков.

2.3. Структурные особенности поринов НМ грамотрицательных бактерий.

2.3.1. Основные элементы пространственной организации пориновых белков.

2.3.2. Геометрия поры.

2.4. Конформационная пластичность изолированных поринов.

2.4.1. Способы солюбилизации пориновых белков.

2.4.2. Влияние денатурирующих факторов / агентов на структуру и свойства поринов.

2.5. Функциональные свойства неспецифических поринов грамотрицательных бактерий.

2.5.1. Методы исследования функциональной активности поринов.

2.5.2. Модуляция функциональных свойства поринов: влияние структурной организации белков и компонентов мембраны (в экспериментах in vitro).

2.5.3. Экспрессия OmpF и ОшрС поринов под влиянием изменения условий среды.

2.6. Иммунохимические свойства неспецифических поринов грамотрицательных бактерий.

2.6.1. Иммуногенные свойства поринов.

2.6.2. Антигенные свойства поринов.

2.6.2.1. Особенности антигенной структуры поринов.

2.6.2.2. Методы идентификации антигенных детерминант поринов.

2.6.2.3. Порины как эффективные диагностические антигены.

2.7. Бактерии рода Yersinia: Y. enterocolitica и Y. enterocolitica-подобные виды.

2.7.1. Эколого-эпидемиологическая характеристика иерсиний.

2.7.2. Медицинское значение Y. enterocolitica и

Y. enterocolitica-подобных видов.

2.7.3. Особенности развития (патогенеза) иерсиниоза.

2.7.3.1. Клинические проявления иерсиниозной инфекции.

2.7.4. Диагностика иерсиниоза.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика белков-поринов НМ Y. enterocolitica и Y. enterocolitica-подобных видов иерсиний, культивируемых при разной температуре.

3.1.1. Выделение разных молекулярных форм поринов иерсиний.

3.1.2. Характеристика OmpF- и OmpC-подобных поринов НМ бактерий рода Yersinia (на примере Y. enterocolitica).

3.1.2.1. Сравнительный анализ первичной структуры OmpF- и ОтрС- подобных поринов НМ Y enterocolitica.

3.1.2.2. Вторичная структура и трансмембранная топология OmpF и ОтрС поринов Y. enterocolitica.

3.2. Порообразующая активность основных белков НМ бактерий рода Yersinia.

3.2.1. Порообразующие свойства изолированных белков НМ бактерий рода Yersinia.

3.2.2. Порообразующие активность OmpF и ОгпрС поринов НМ бактерий рода Yersinia в составе ПГ-белковых комплексов.

3.2.3. Влияние величины мембранного потенциала на порообразующую активность белков.

3.3. Пространственная структура поринов наружной мембраны бактерий рода Yersinia.

3.3.1. Физико-химическая характеристика различных молекулярных форм поринов.

3.3.2. Влияние способа экстракции на пространственную структуру поринов.

3.3.3. Влияние солюбилизирующего агента на пространственную структуру поринов.

3.3.4. Температурная денатурация поринов.

3.3.5. Теоретическая модель пространственных структур ОтрС и OmpF поринов Y. enterocolitica. Анализ локализации и ориентации остатков триптофана в белках методом молекулярной динамики.

3.4. Иммунохимические свойства поринов наружной мембраны бактерий рода Yersinia.

3.4.1. Иммуногенные свойства поринов иерсиний.

3.4.2. Антигенные свойства поринов иерсиний.

3.4.2.1 Видоспецифичность поринов НМ иерсиний.

3.4.2.2. Антигенное родство поринов иерсиний.

3.4.3. Использование порообразующего белка наружной мембраны Y. enterocolitica для диагностики иерсиниоза с помощью ИФА.

3.4.3.1. Разработка диагностической ИФА тест-системы.

3.4.3.2. Использование разных молекулярных форм порина наружной мембраны Y enterocolitica для диагностики иерсиниоза и оценки некоторых показателей гуморального иммунного ответа у больных иерсиниозом.

3.4.4. Антигенные свойства OmpF и ОтрС поринов НМ Y. enterocolitica.

3.4.5. Диагностика вторично-очаговых форм ерсиниозов с помощью ИФА тест-системы на основе порина из Y. enterocolitica.

3.4.5.1. Использование ИФА тест-системы на основе порина Y enterocolitica для оценки гуморального звена иммунитета у больных с поражением периферической нервной системы иерсиниозной этиологии.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5. ВЫВОДЫ.

6. СПИСИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислота/ аминокислотный;

БЛМ - бислойные липидные мембраны;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КД - круговой дихроизм,

ЛПС - липополисахарид,

М- молекулярная масса;

НМ - наружная мембрана;

OG - р -D-октилгл юкозид;

ОКИ — острые кишечные инфекции;

ПГ - пептидогликан;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РА - реакция агглютинации;

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

TJI - термолабильная (-ные) и ТС - термостабильная (-ные) молекулярные формы порина;

SDS - додеци л сульфат натрия;

SDS,ПААГ-электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Удивительное совершенство, с которым клетка тонко реагирует не толко на факторы внешней среды, но и на изменения в других клетках данного организма, в значительной мере достигается за счет строго согласованной работы отдельных компонентов ее наружной мембраны (НМ) - рецепторов, ферментных комплексов и каналообразующих структур. Роль биологических мембран для сохранности клетки от внешнего воздействия уникальна, поскольку их функционирование является необходимым условием существования клетки как единого целого. Исследование структуры и функций биологических мембран важно для понимания общих принципов жизнедеятельности клетки, оно связано с выяснением организации мембранных структур и механизмов их действия. Успехи, достигнутые к настоящему времени в области изучения биомембран на молекулярном уровне, оказались значимыми для биологии и медицины.

Разнообразие функций, выполняемых биологическими мембранами, в большинстве случаев обусловлено содержащимися в них белками, среди которых интегральные мембранные белки составляют порядка 30% от общего числа протеинов [1]. Среди интегральных белков НМ грамотрицательных бактерий доминирующими в количественном отношении являются порообразующие белки, которые относятся к классу Р-структурированных белков. Эти белки НМ бактерий названы неспецифическими белками-поринами, так как они образуют трансмембранные водонаполненные каналы (или поры), предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул с небольшой молекулярной массой (не более 600 Да).

Благодаря поринам НМ грамотрицательных бактерий осуществляется обмен низкомолекулярными веществами между клеткой и внешним окружением. Особенности структуры и поверхностная локализация поринов в бактериальной клетке обусловливает наличие у них не только транспортной функции, но и ряда различных биологических свойств. Известно, что участки полипептидной цепи поринов, экспонированные на поверхности бактериальной клетки, так называемые петли, являются потенциальными сайтами взаимодействия с другими клетками. Благодаря этому, бактериальные порины участвуют в активации факторов немедленной защиты макроорганизма, включаясь в формирование специфического иммунного ответа, направленного на освобождение от патогена. С другой стороны, они подавляют отдельные стадии иммунной защиты организма хозяина, что обеспечивает выживание патогена в макроорганизме, т.е. выступают как эффекторы патогенеза. Многообразие свойств позволяет рассматривать порообразующие белки НМ грамотрицательных бактерий в качестве перспективных антигенов для решения ряда проблем инфекционной иммунологии, связанных как с разработкой эффективных диагностических и протективных препаратов, так и принципиально новых подходов к защите от возбудителей инфекционных заболеваний.

Интенсивное изучение структурной организации и биологичесих свойств поринов НМ Escherichia coli и специфических каналов (LamB) для осуществления транспорта мальтозы, а также исследования строения наружного липидного бислоя началось в середине 80-х годов прошлого столетия [2]. К этому времени было установлено, что НМ грамотрицательных бактерий обладает аномально низкой проницаемостью для липофильных веществ, поскольку ее внутренний слой состоит из фосфолипидов, а внешняя часть образована липополисахаридом (ЛПС). Последующие 20 лет были посвящены исследованиям взаимосвязи структуры и функций поринов и сопровождались стремительным ростом накопления знаний в этой области. В настоящее время неспецифические и специфические пориновые каналы охарактеризованы достаточно подробно на молекулярном уровне. Благодаря полученным результатам по установлению большого числа различных геномных последовательностей, порообразующие белки были идентифицированы, помимо энтеробактерий, во многих микроорганизмах. Это позволило выявить некоторые особенности физиологии различных микроорганизмов в естественных условиях обитания и оценить их влияние на взаимоотношения с макроорганизмом.

Настоящий обзор посвящен особенностям структуры и функции поринов НМ грамотрицательных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из наружной мембраны 4-х видов бактерий рода Yersinia, патогенной для человека Y. enterocolitica и 3-х непатогенных видов (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii), культивируемых при температуре 6-8 и 37°С, выделены неспецифические порообразующие белки. Установлено, что изменение температуры культивирования приводит к экспрессии в НМ иерсиний разных типов (OmpF- и ОтрС-подобных) поринов.

2. Установлено, что функционально-активной формой OmpF и ОтрС поринов всех исследованных видов иерсиний является тример. Каналы, образованные поринами непатогенных видов иерсиний, по сравнению с Y. enterocolitica, отличаются значительно большей гетерогенностью по распределению уровней проводимости.

3. Определены физико-химические характеристики изолированных OmpF и ОтрС поринов из Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. kristensenii и Y. frederiksenii. Обнаружено, что исследованные порины, несмотря на высокую степень структурного подобия, имеют некоторые особенности на уровне вторичной и третичной структур. Показано, что порины в растворе детергентов могут существовать в виде тримеров и мономеров.

4. Показано, что способ извлечения белков из бактериальной мембраны и природа используемого для экстракции детергента влияют на стабильность третичной структуры и соотношение элементов регулярной вторичной структуры тримера порина.

5. Впервые установлены первичные структуры OmpF и ОтрС поринов из Y. enterocolitica и построены теоретические модели пространственных структур этих белков. Основные различия между OmpF и ОтрС поринами иерсиний наблюдаются в конформации "внешних" петель и расположении одного из трех остатков триптофана в различных структурных элементах р-барреля.

6. Установлено, что порины наружной мембраны бактерий рода Yersinia относятся к иммунодоминантным белкам этих микроорганизмов, являются видо- и родоспецифическим антигенами и могут быть использованы в качестве диагностических антигенов.

7. Впервые на основе порина НМ Y. enterocolitica разработана иммуноферментная тест-система для диагностики иерсиниоза. Предлагаемая тест-система обеспечивает диагностику иерсиниоза независимо от стадии инфекционного процесса и сероварианта возбудителя. Эффективность ИФА тест-системы в два раза выше используемого клиническими лабораториями коммерческого эритроцитарного кишечноиерсиниозного (0:3 и 0:9) диагностикума.

8. Впервые показано, что ИФА тест-система на основе разных молекулярных форм (тримера и мономера) порина из Y. enterocolitica в качестве диагностических антигенов отличается чувствительностью при верификации острой и вторично-очаговой форм иерсиниоза, а также специфичностью при оценке гуморального иммунного ответа больных с этими формами иерсиниозной инфекции.

1. Lugtenberg В., Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bcteria. // Bochim. Biophys. Acta 1983. V. 37. N. 1. P. 51-115.

2. Bayer M.E. The fusion sites between outer membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection. In: Outer membrane. Biogenesis and function. // Ed. Inouye M. New York: Wiley-Interscience, 1979. P. 167-202.

3. Miura Т., Mizushuma S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membranes from spheroplast membrane of Escherichia coli K-12. // Bochim. Biophys. Acta. 1969. V. 193. N. 2. P. 268-276.

4. Osborn M., Gander J.E., Parisi E., Carson J. Mechanism of assembly of the membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of the cytoplasmic and outer membrane. // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. N. 8. P. 3962-3972.

5. Schnaitman C.A. Solubilization of the cytoplasmic membrane of Escherichia coli by triton X100.//J. Bacteriol. 1971. V. 108. N. l.P. 545-552.

6. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that producestransmembrane channels. //J. Biol. Chem. 1976. V. 251. N. 7. P. 2176-2178.

7. Schein S.J., Colombini M., Finkelstein A. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from Paramecium mitochondria. // J. Membr. Biol. 1976. V. 30. N. 2. P. 99-120.

8. Ulmschneider M.B., Sansom M.S. Amino acid distributions in integral membrane protein structure. //Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1512. N. 1. P. 1-14.

9. Chamberlain A.K., Bowie J.U. Asymetric amino acid compositions of transmembrane p-strands. // Protein Science. 2004. V. 13. N. 8. P. 2270-2274.

10. Schulz G.E. The structure of bacterial outer membrane proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1565. N. 2. P. 308-317

11. Arora A., Abildgaard F., Bushweller J.H., Tamm J.H. Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR spectroscopy. // Nature Struct. Biol. 2001. V. 8. N. 4. P. 334-338.

12. Pautsch A., Schulz G.E. High-resolution structure of the OmpA membrane domain. // J. Mol. Biol. 2000. V. 298. N. 2. P. 273-282.

13. Conlan S., Zhang Y., Cheley S., Bayley H. Biochemical and biophysical characterization of OmpG: a monomeric porin. // Biochem. 2000. V. 39. N. 39. P. 11845-11854.

14. Cowan S.W., Garavito R.M., Jansonius J.N., Jenkins J.A., Karlsson R., Konig N., Pai E.F., Pauptit R.A., Rizkallah P.J., Rosenbusch J.P. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. // Struct. Fold. Design. 1995. V. 3. N. 10. P. 1041-1050.

15. Cowan S.W., Schirmer Т., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Cristal structure explain functional properties of two Escherichia coli porins. //Nature. 1992. V. 258. N. 6359. P. 727-733.

16. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N., Egmond M.R., Gros P. Crystal structure of the outer membrane protease OmpT from Escherichia coli sugest a novel catalytic site. // EMBO J. 2001. V. 20. N. 18. P. 5033-5039.

17. Hwang P.M., Choy W.Y., Lo E.I., Chen L., Forman-Kay J.D., Raetz C.R., Prive G.G., Bishop R.E., Kay L.E. Solution structure and dynamics of the outer membrane enzyme PagP by NMR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. N. 21. P. 13560-13565.

18. Schirmer Т., Keller T.A., Wang Y.F., Rosenbusch J.P. Structural basis for sugar translocation through maltoporin channels at 3.1 A resolution. // Science. 1995. V. 267. N. 5197. P. 512-514.

19. Forst D., Welte W., Wacker Т., Diederichs K. Structure of the sucrose-specific porin SerY from Salmonella tuphimurium and its complex with sucrose. // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. N. 1. P. 37-46.

20. Ferguson A.D., Hofmann E., Coulton J.W., Diederichs K., Welte W. Siderophore-mediated iron transport: crystal structure of Fhu A with bound lipopolysaccharide. // Science. 1998. V. 282. N. 5397. P. 2215-2220.

21. Chimento D.P., Monanty A.K., Kadner R.J, Wiener M.C. Crystallization and initial X-ray diffraction of BtuB, the integral membrane cobalamin transporter of Escherichia coli. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2003. V. 59. N. 3. P. 509-511.

22. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. Principles determing of beta-sheet barrels in proteins. II. The observed structure. // J. Mol. Biol. 1994. V. 236. N. 5. P. 1382-1400.

23. Weiss M.S., Kreusch A., Schiltz E., Nestel U., Welte W., Weekesser J., Sehulz G.E. The structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 1.8 A resolution. // FEBS Lett. 1991. V. 280. N. 2. P. 379-382

24. Weiss M.S., Wacker Т., Weekesser J., Welte W., Sehulz G.E. The three-dimensional structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 3 A resolution. // FEBS Lett. 1990. V. 267. N. 2. P. 268-272.

25. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Three-dimensional crystals of an integral membrane protein: an initial X-ray analysis. // J. Cell Biol. 1980. V. 86. N. 1. P. 327-329.

26. Weiss M.S., Abele U„ Weekesser J., Welte W., Schiltz E., Sehulz G.E. Molecular architecture and electrostatic properties of a bacterial porin. // Science. 1991. V. 254. N. 5038. P. 1627-1630.

27. Jap B.K. High-resolution electron diffraction of reconstituted PhoE porin. // J. Mol. Biol. 1988. V. 199. N. 4. P. 407-420.

28. Jap B.K., Walian P.J. Structure and functional mechanism of porins. // Physiol. Rev. 1996. V. 76. N. 4. P. 1073-1088.

29. Koebnick R., Locher K.P., van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253.

30. Sehulz G.E. p-Barrel membrane proteins. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. N. 4. P. 443-447.

31. Phale P.S., Philippsen A., KiefhaberT., Koebnik R., Phale V.P., Schirmer T. and Rosenbusch J.P. Stability of trimeric OmpF porin: the contributions of the latching loop L2. // Biochemistry. 1998. V. 37. N. 45. P. 15663-15670.

32. Jeanteur D., Lakey J.H., Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction. // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. N. 9. P. 2153-2164.

33. Delcour A.H. Functon and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. N. 2. P. 115-125.

34. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study. // J. Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286.

35. Jap B.K., Wallia P.J., Gehring K. on B.A. Structural architecture of an outer membrane channel as determined by electron crystallography. //Nature, 1991. V. 350. N. 6314. P. 167170.

36. Sipos L., von Heijne G., Prediction the topology of eucariotic membrane proteins. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. N. 3. P.1333-1340.

37. Jaenicke R. Do ultrastable proteins from hyperthermophiles have high or low conformational rigidity? // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. N. 7. P. 2962-2964.

38. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. N. 3. P. 715-728.

39. Daggett V, Fersht AR. Is there a unifying mechanism for protein folding? // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. N. 1. P. 18-25.

40. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Isolation and crystallization of bacterial porin. // Met. Enzym. 1986. V. 125. N. 2. P. 309-329.

41. Kleinschmidt J.H. Membrane proteins Introduction. // Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. N. 8. P. 1527-1528.

42. Eriks L.R., Mayor J.A, Kaplan R.S. A strategy for identification and quantification of detergens frequently used in the purification of membrane proteins. // Anal. Biochem. 2003. V. 323. N. 2. P. 234-241.

43. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. N. 24. P. 8019-8029

44. Nurminen M. Isolation of porin trimers. In: Korhonen Т.К., Dawes E.A., Makela P.H. (eds) Enterobacterial Surface Antigen Methods for Molecular Characterization. N.-Y. Elsevier Science Publ. 1985. P. 293-300.

45. Sivaraman Т., Kumar T.K.S., Jayraman G., Han C.C., Yu C. Characterization of partially structured state in an all p-sheet protein. // Biochem. J. 1997. V. 321. N. 2. P. 457-464.

46. Pawar S.A., Deshpande V.V. Character. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 232. N. 3. P. 63315338.

47. Rosenbusch J.P. Structural and functional properties of porin channels in E. coli outer membranes. // Experimentia. 1990. V. 46. N. 2. P. 167-173.

48. Bolla J.-M., Loret E., Zalewsky M., Pages J.-M. Conformational analysis of the Campylobacter jejuni porin. //J. Bacteriol. 1995. V. 177. N. 15. P. 4266-4271.

49. Eisele J.L, Rosenbusch J.P. In vitro folding and oligomerization of a membrane protein. Transition of bacterial porin from random coil to native conformation. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 18. P. 10217-10220.

50. Markovic-Housley Z., Garavito R.M. Effect of temperature and low pH of matrix porin in micellar detergent solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 869. N. 2. P. 158-170.

51. Minetti C.A.S.M., Blake S., and Remeta D.P. Characterization of the Structure, Function, and Conformational Stability of PorB Class 3 Protein from Neisseria meningitides. II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 39. P. 25329-25338.

52. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transition of porin, a transmembrane protein. // FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

53. Sukuraman S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Tracking the unfolding and refolding pathways of outer membrane protein porin from Paraccocus denitrificans. II Biochemistry. 2006. V. 45. N. 12. P3972-3980.

54. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Structure-function correlation of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans. И Biopolymers. 2006. V. 82. N. 4. P. 344-348.

55. Мажуль В.М., Кананович С.Ж. О возможности белка существовать во множестве частично свернутых состояниях. // Биофизика. 2004. Т. 40. № 3. С. 413—423.

56. Nikaido Н. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. // Microbiol. Mol. Biol. 2003. V. 676. N. 4. P. 593-656.

57. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. N. 6. P. 3905-3908.

58. Nakae T. Identification of the outer membrane proteins of Escherichia coli that produced transmembrane channels in reconstituted vesicle membrane. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 71. N. 3. P.877-884.

59. Tokunaga M., Tokunaga H., Nakae T. The outer membrane permeability of Gram-negative bacteria. Determination of permeability rate in reconstituted membrane vesicles. // FEBS Lett. 1979. V. 106. N. 1. P. 85-88.

60. Nakae T. Outer membrane of Salmonella typhymurium: Reconstitution of sucroe-permeable membrane vesicles. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. N. 4. P. 1224-1230.

61. Nikaido H., Rosenberg E.Y. Porin channels in Escherichia coli studies with liposomes reconstituted from purified proteins. // J. Bacteriol. 1983. V. 153. N. 1. P. 241-252.

62. Nikaido H., Rosenberg E.Y. Effect on solute size on diffusion rates through the transmembrane pores of the outer membrane of Escherichia coli. II J. Gen Physiol. 1981. V. 77. N. 2. P. 121-35.

63. Zimmermann W., Rosselet A. Function of the outer membrane of Escherichia coli as a permeability barrier to beta-lactam antibiotics. // Antimicrob. Agents Chemother. 1977. V. 12.N.3. P. 368-372.

64. Nikaido H., Song S.A., Shaltiel L., Nurminen M. Outer membrane of Salmonella XIV. Reduced transmembrane diffusion rate in porin-deficient mutants. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 76. N. 2. P. 324-330.

65. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vivo and its transformation into an excitable system. // Nature. 1962. V. 194. N. 4832. P. 979-980.

66. Montal M., Muller P. Formation of biomolecular membranes from lipid bilayers and study of their electrical properties. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. N. 12. P. 3561-3566.

67. Schindler H. Formation of planar bilayer from artificial or native membrane vesicles. // FEBS Lett. 1980. V. 122. N. 1. P. 77-79.

68. Schindler H., Rosenbusch J. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled chanells in lipid bilayers. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. N. 8. P.3751-3755.

69. Benz R., Schmid A., Hancock R.E. Ion selectivity of gram-negative bacterial porins. // J. Bacteriol. 1985. V. 162. N. 2. P. 722-727.

70. Dargent В., Hofmann W., Pattus F., Rosenbusch J.P. The selectivity filter of voltage-dependent channels formed by phosphoporin (PhoE) from E. coli. II EMBO J. 1986. V. 5. N. 4. P. 773-778.

71. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann В., Sigworth F.J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches. //Pflugers Arch. 1981. V. 391. N. 2. P. 85-100.

72. Martinac В., Buechner M., Delcour A.H., Adler J., Kung C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. II Proc. Nat. Acad. Sci USA. 1987. V. 84. N. 8. P. 2297-2301.

73. Buechner M., Delcour A.H., Martinac В., Adler J., Kung C. Ion channel activity in the Escherichia coli outer membrane. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1024. N. 1. P. 111121.

74. Delcour A.H., Martinac В., Kung С., Adler J. A modified reconstitution method used in patch-clamp studies of Escherichia coli ion channels. // Biophys. J. 1989. V. 56. N. 3. P. 631-636.

75. Berrier C., Coulombe A., Houssin C., Ghazi A. A patch-clamp study of ion channels of inner and outer membranes and of contact zones of E. coli fused into giant liposomes. // FEBS LEtt. 1989. V. 259. N. 1. P. 27-32.

76. Delcour A.H., Martinac В., Kung C., Adler J. Voltage-sensitive ion channel of Escherichia coli. // J. Memb. Biol. 1989. V. 112. N. 3. P. 267-275.

77. Delcour A.H. Solute uptake throught general porins. // Front. Biosci. 2003. V. 8. N. 3. P. 1055-1071.

78. Benz R., Janko K., and Lauger P. Ionic selectivity of pores formed by the matrix protein (porin) of Escherichia coli. II Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 551. N. 2. P 238-247.

79. Nestorovich E.M., Rostovtseva Т.К., and Bezrukov S.M. Residue Ionization and Ion ' Transport through OmpF Channels. // Biophys. J. 2003. V. 85. N. 6. P. 3718-3729.

80. Buehler L.K., Kusumoto S., Zhang H., Rosenbusch J.P. Plasticity of Escherichia coli porin channels. Dependence of their conductance on strain and lipid environment. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. N. 36. P. 24446-24450.

81. Schirmer T. General and specific porins from bacterial outer membrane. // J. Struct. Biol. 1998. V. 121. N. 2. P. 101-109.

82. Muller D.J., Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. N. 4. P. 1347-1351.

83. Todt J.C., Roque W.J., McGroarty E.J. Effects of pH on bacterial porin function. // Biochemistry. 1992. V. 31. N. 43. P. 10471-10478.

84. Xu G., Shi В., McGroarty E.J., Tien H.Y. Channel-closing activity of porins from E. coli in bilayer lipid membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 862. N. 1. P. 57-64.

85. Ashish A., Rinehart D., Szabo G., Tamm L.K. Refolded outer membrane protein A of Escherichia coli forms ion channels with two conductance states in panar lipid bilayers. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N. 3. P. 1594-1600.

86. Schindler H., Rosenbusch J.P. Matrix protein in planar membranes: Clusters of channels in native invironment and functional reassembly. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V. 78. N. 4. P. 2302-2306.

87. Alcaraz A., Nestorovich E.M., Aguilella-Arzo M., Aguilella V.M., Bezrukov S.M. Salting Out the Ionic Selectivity of a Wide Channel: The Asymmetry of OmpF. // Biophys. J. 2004. V. 87. N. 2. P. 943-957.

88. Eppens E.F., Saint N., Van Gelder P., van Boxtel R., and Tommassen J. Role of the constriction loop in the gating of outer membrane porin PhoE of Escherichia coli. II FEBS Lett. 1997. V. 415. N. 3. P. 317-320.

89. Phale P.S., Philippsen A., Widmer C., Phale V.P., Rosenbusch J.P., Schirmer T. Role of charged residues at the OmpF porin channel constriction probed by mutagenesis and simulation. // Biochemistry. 2001. V. 40. N. 21. P. 6319-6325.

90. Bainbridge G., Mobasheri H., Armstrong G.A., Lea E.J., and Lakey J.H. Voltage-gating of Escherichia coli porin: a cystine-scanning mutagenesis study of loop 3. // J. Mol. Biol. 1998. V. 275. N. 2. P. 171-176.

91. Liu N., Delcour A. The spontaneous gating activity of OmpC porin is affected by mutation of putative hydrogen bond network or of a salt bridge between the L3 loop and the barrel. // Protein Eng. 1998. V. 11. N. 9. P. 797-802.

92. Arbing M.A., Dahan D., Boismenu D., Mamer O.A., Hanrahan J.W. and Coulton J.W. Charged residues in surface-located loops influence voltage gating of porin from Haemophilus influenzae type b. // J. Membr. Biol. 2000. V. 178. N. 3. P. 185-193.

93. Tomassen J., van der Ley P., van Zzeiji M., Agterberg M. Localization of functional domains in E. coli outer membrane porins. // EMBO J. 1985. V. 4. N. 6. P. 1583-1587.

94. Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Silhavy T.J. From acids to osmZ multiple factors influence synthesis of OmpF and OmpC porin in Escherichia coli. II Mol. Microbiol. 1996. V. 20. N. 5. P. 911-917.

95. Mizuno Т., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis of the osmotic regulationof the porin genes. II Mol. Microbiol. 1990. V. 4. N. 7. P. 1077-1082.

96. Lan C.Y., Igo M.M. Differential expression of the OmpF and OmpC porin proteins in Escherichia coli K-12 depends upon the level of active OmpR. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. N. l.P. 171-174.

97. Slauch M., Garrett S. Jackson D.E., and Silhavy T.J. EnvZ functions through OmpR to control porin gene expression in Escherichia coli K-12.1 I J. Bacteriol. 1988. V. 170. N. 1. P. 439-441.

98. Batchellor E., Walthers D., Kenney L.J., Goulian M. The Escherichia coli CpxA-CpxR envelope stress response system regulate expression of the porins Omp F and Omp C. // J. Bacteriol. 2005. V. 187. N. 16. P. 5723-5731.

99. Achouak W., Heulin Т., Pages J.-P. Multiple facets of bacterial porins. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. N. l.P. 1-7.

100. Rawling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF. // Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42.

101. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucarie S., Pages J.M. Immunological analysis of porin polymorphism in Escherichia coli В and K-12. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P.1027-1036.

102. Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway D.R. Antibody response of infected mice to outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa. II Infect. Immun. 1984. V. 43. N. 1. P. 49-53.

103. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep. // Vet. Microbiol. 1995. V. 43. N. 1. P. 21-32.

104. Wiertz E.J., Delvig A., Donders E.M., Brugghe H.F., van Unen L.M., Timmermans H.A., Achtman M., Hoogerhout P., Poolman J.T. T-cell responses to outer membrane proteins of

105. Neisseria meningitidis: comparative study of the Opa, Opc, and PorA proteins. // Infect. Immun. 1996. V. 64. N. 1. P. 298-304.

106. Henrilsen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an enterobacterial porin protein domain. // APMIS. 1991. V. 99. N. 8. P. 49-57.

107. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H.J., Sparling P.F. Immunobiology of purified recombinant outer membrane porin protein I of Neisseria gonorrhoeae. II Mol. Microbiol. 1994. V. 14. N. 2. P.1059-1075.

108. Nandakumar K.S., Muthukkaruppan V.R. Influence of immunopotentiators on the antiporin immunoglobulin G subclass: distribution and protective immunity against murine salmonellosis. // Scand. J. Immunol. 1999. V. 50. N. 2. P. 188-194.

109. Peeters C.C., Claassen I.J., Schuller M., Kersten G.F., van der Voort E.M., Poolman J.T. Immunogenicity of various presentation forms of PorA outer membrane protein of Neisseria meningitidis in mice. // Vaccine. 1999. V. 17. N. 20. P. 2702-2712.

110. Jansen C., Kuipers В., van der Biezen J., de Cock H., van der Ley P., Tomassen J. Immunogenicity of in vitro folded outer membrane protein PorA of Neisseria meningitides. //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V. 27. N. 3. P. 227-233.

111. Singh S.P., Singh S.R., Williams Y.U., Jonnes L., Abdullach T. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium. II Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 12. P. 4600-4605.

112. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В. // Журн. микробиол. 1997. № 6. С. 92-96.

113. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Immunogenicity expressed in patients with bacteraemia of an epitope shared by enterobacterial and neisserial porin proteins. // APMIS. 1995. V. 103. N. 5. P. 388-394.

114. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Baalaji S.N., Katpally U.C., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi. II J. Struct. Biol. 2004. V. 148. N. 1. P. 22-33.

115. Волышна О.М., Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей. // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. № 5. С. 387-395.

116. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики. // Вестник ДВО РАН. 2004. №3. С. 35—44.

117. Jofre S. Evaluation of the immunospecificity of the porin Oml of Vibrio anguillarum serotype Ol. // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84. N. 5. P. 709-714.

118. Muthukkumar S., Muthukkaruppan V.R. Detection of porin antigen in serum for early diagnosis of mouse infections with Salmonella typhimurium. // FEMS Microbiol. Lett. V. 89. N. 3. P. 147-154.

119. Sheikhian A., Mustafaie Z.M.H.A., Shokri F., Malekzadeh R., Siavoshi F. Extraction of the Outer Membrane Proteins of H. pylori and Evaluation of Their Presence in Stool of the Infected Individuals. // Iran. Biomed. J. 2004. V. 8. N. 2. P. 83-88.

120. Jossens S., Colombel J.-F., Landers C., Poulain D., Geboes K., Bossuyt X., Targan S., Rutgeerts P., Reinisch W. Anti-outer membrane of porin С and anti-I2 antibodies in indeterminate colitis. // Gut. 2006. V. 55. N. 11. P. 1667-1669.

121. Определитель бактерий Берджи. Пер. с англ. Г.А. Заварзина. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, ДЖ. Стейли, С. Уильямса. В. 2т. М.: Мир, 1997.

122. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиноза и близкие к нему микроорганизмы. // Клин, микробиол. антимикроб, химотер. 2004. Т. 6. № 1. С. 10-21.

123. Sulakvelidze A. Yersinia other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species. // Microb. Infect. 2000. V. 2. N. 5. P. 497-513.

124. Martinez R.J. Plasmid-mediated and temperature-regulated surface properties of Yersinia enterocolitica. //Infect. Immun. 1983. V. 41. N. 3. P. 921-930.

125. Portnoy D.A., Wolf-Watz H., Bolin I., Beeder А.В., Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins. // Infect. Immun. 1984. V. 43. N. 1. P. 108-114.

126. Bottone E.J. Yersinia enterocolitica overier and epidemiologic correlates. // Microbiol. Infect. 1999. V. 1. N. 4. P. 323-333.

127. Schleifstein J.I., Coleman M.B. An indentified microorganism resembling В lignieri and Pasterella pseudotuberculosis and pathogenic for man. // N-Y State J. Med. 1939. V. 39. P. 1749-1753.

128. Schleifstein J.I., Coleman M.B. Bacterium enterocoliticum. // Ann. Rep. Div. Lab. Res. NY State Dept. Health, Albany. 1943. P 56.

129. Knapp W. Mesenteric adenitis due to Pasteurella pseudotuberculosis in young people. // N. Engl. J. Med. 1958. V. 259. P. 776-778.

130. Ценева Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. СПб.: Медмассмедиа, 2006. 168 с.

131. Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: the charisma continues. // Clin. Microbiol. 1997. V. 10. N. 2. P. 257-276.

132. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G., Morris J.G.Jr., Sulakvelidze A., and Stine О. C. Multilocus Sequence Typing for Studying Genetic Relationships among Yersinia Species. I I J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. N. 6. P. 2674-2684.

133. Siriken B. The presence of Yersinia enterocolitica and Other Yersinia Species in Ground Beef in Aydin, Turkey. // Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2004. V. 28. N. 4. P. 489-495.

134. Prpic J.K., Robins-Browne R.M., Davey A.B. In vitro Assessment of virulence in Yersinia enterocolitica and Related Species. // J. Clin. Microbiol. 1985. V. 22. N. 1. P. 105-110.

135. Старостина Н.В., Ющенко Г.В. Распространение иерсиний малоизученных видов в окружающей среде и их роль в патологии человека. // Актуальные вопросы эпидемиологии. 1997. Вып. 2. С. 48-51.

136. Okwori A.E.J., Agada G.O.A., Olabode A.O., Agina S.E., Okpe E.S., Okopi J. The prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica among diarrhea patients in Jos, Nigeria // African J. Biotechnology. 2007. V. 6. N. 8. P. 1031-1034.

137. Asplund K., Johansoion Т., Siiton A. Evolution of pulsed-field gel electroforesis of genomic restriction fragment in the discrimination of Yersinia enterocolitica 0:3. // Epidemiol. Infect. 1998. V. 121. N. 3. P. 579-586.

138. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсниоза и его значение для диагностики. // Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунологии. 1992. № 1. С. 60-65.

139. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний. // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2002. Т. 4. № 3. С. 248-266.

140. Carniel Е. Plasmids and Pathogenicity Islands of Yersinia. II Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. V. 264. N. 3. P. 89-108.

141. Koornhof H.J. « Yersiniosis II: The pathogenesis of Yersinia Infections». // Eur. J. Clin. Infect. Dis. 1999. V. 18. N. 2. P. 87-112.

142. Pepe J.C., Miller V.L. Yersinia enterocolitica invasion: a primaryroly in the infection. // ProssidingNat. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. N. 3. P. 6473-6477.

143. Mikulskis A.V., Delor I., Thi V.H., Cornelis G.R. Regulation of the Yersinia enterocolitica enterotoxin yst gene. Influence of growth phase, temperature, osmolarity, pH and bacterial host factors. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. N. 5. P. 905-915.

144. Vishnubhatla A., Fung D.Y.C., Oberst R.D., Hays M.P., Nagaraja T.G., Flood S.J.A. Rapid 5' Nuclease (TaqMan) Assay for Detection of Virulent Strains of Yersinia enterocolitica II Appl. Envirom. Microbiol. 2000. V. 66. N. 9. P. 4131-4135.

145. Thisted Lambertz S., Danielsson-Tham M.-L. Identification and Characterization of Pathogenic Yersinia enterocolitica Isolates by PCR and Pulsed-Field Gel Electrophoresis. // Appl. Enviroment. Microbiol. 2005. V. 71. N. 7. P. 3674-3681

146. Cherkassky B.L., Podounova L.G., Akuolova N.K. Food-related zoonosis in people in Russia.//Ditto. P. 18-19.

147. Fredriksson-Ahomaa M., Korkeala H. Low Occurrence of Pathogenic Yersinia enterocolitica in Clinical, Food, and Environmental Samples: a Methodological Problem. // Clin. Microbiol. 2003. V. 16. N. 2. P. 220-229.

148. Agbonlahor D.E. Characteristics of Yersinia intermedia-like, bacteria isolated from patients with diarrhea in Nigeria. // J. Clin. Microbiol. 1986. V. 23. N. 5. P. 891-896.

149. Kapperud G. Yersinia enterocolitica and Yersinia-like microbes isolated from mammals and water in Norway and Denmark. // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. (Sect. B). 1977. V. 85. N. l.P. 129-135.

150. Nesbakken Т., Kapperud G. Yersinia enterocolitica and Yersinia enterocolitica-Wke bacteria in Norwegian slaughter pigs. // Int. J. Food Microbiol. 1985. V. 1. N. 2. P. 301-309.

151. Sinha I., Choudhary I., and Virdi J.S. Isolation of Yersinia enterocolitica and Yersinia intermedia from waste waters and their biochemical and serological characteristics. // Curr. Sci. 2000. V. 79. N. 5. P. 510-513.

152. Старостина H.B. Эпидемиологические и экологические особенности заболеваний, вызываемых Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii и Yersinia intermedia. / Автореф. дис. .канд. биол. наук. Москва. 2000. 25 с.

153. Старостина. Н.В., Ющенко Г.В., Зайцев Б.Е. Некоторые особенности эпидемического процесса иерсиниозов на современном этапе. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. 1999. Вып. 3. С. 78-81.

154. Ющенко Г.В., Старостина Н.В., Саргсян С.С. Частота встречаемости Yersinia frederiksenii в различных объектах в сравнении с другими видами иерсиний. // Актуальные вопросы эпидемиологии. 1997. Вып. 2. С. 51-58.

155. Сомов Г.П. Беседнова H.H., Дзадзиева М.Ф., Тимченко Н.Ф. Иммунология псевдотуберкулеза. Новосибирск: Наука, 1985. 182 с.

156. Кононова Д.Г., Шарапова Т.А. Кишечный иерсиниоз и его значение в патологии человека. Инфромационное письмо. Владивосток. 1980. С. 1-15.

157. Wenzel В.Е., Heeseman J., Heufelder A., Franke T.F., Grammerstorf S., Stemerowicz R., Hopf U. Enteropathogenic Yersinia enterocolitica and organ-specific autoimmune diseases in man. // Contrib. Microbiol. Immunol. 1991. V. 12. N. 3. P. 80-88.

158. Бениова C.H, Гордеец A.B., Малашенкова В.Г., Ященя O.B., Седулина О.Ф. Иммунопатологические аспекты иерсиниозных инфекций у детей. // Педиатрия. 2001. №2. С. 111-112.

159. Малый В.П. Аутоиммунные процессы при псевдотуберкулезе. / Автореф. дисс. канд. мед. наук. Владивосток. 1975. 28 с.

160. Шанина Л.Н., Беседнова Н.Н. Аутосенсибилизация организма при псевдотуберкулезной инфекции // Клиническ. медицина. 1980. № 2. С. 44-49.

161. Ламберт И.М., Данилова Т.А. Перекрестно-реагирующие антигены микроорганизмов и тканей млекопитающих. // Успехи совр. биологии. 1974. Т. 75. Вып. 2. С. 183-202.

162. Saario R., Leino R., Lahesmaa R., Granfors K., Toivanen A. Function of terminal ileum in patients with Yersinia-triggered reactive arthritis. // J. Int. Med. 1992. V. 232. N. 5. P. 7376.

163. Гордеец А.В., Бениова C.H., Шуматова Т.А. Этапное лечение и диспансеризация больных иерсиниозами. // Клиническая медицина. 1994. Т. 72. N. 2. С. 42-44.

164. Попова О.В., Шепелева Г.К., Шестокова И.В., Андреев И.В., Попова Т.И., Ющук Н.Д. Клинико-иммунологическая характеристика иерсиниозной инфекции. // Инфекционные болезни. 2006. Т. 4. № 3. С. 51-55.

165. Hoogkamp-Korstanje J.A., de Koning J. Clinical aspects, diagnosis and therapy of Yersinia enterocolitica infections. // Immun. Infekt. 1990. V. 18. N. 6. P. 192-197.

166. Бениова C.H, Гордеец A.B. Динамическое наблюдение детей, перенесших иерсиниозную инфекцию. // Педиатрия. 2002. № 2. С. 44-48.

167. Abdel-Haq N.M., Asmar B.I., Abuhammour W.M., Brown W.J. Yersinia enterocolitica infection in children. // Pediatr. Infect. Dis. J. 2000. V. 19. N. 10. P. 954-958.

168. Саатова Г.М., Яковлева A.A. Клинические особенности иерсиниозного артрита у детей. // Педиатрия. 2001. № 2. С. 107-108.

169. Акбаров С.В., Султанов Х.К., Маткаримов Б.Д., Балтабаева М.А. Клинические варианты иерсиниозного реактивного артрита у детей. // Педиатрия. 1993. № 6. С. 54-56.

170. Каманцев В.Н., Скрипченко Н.В., Тихомирова О.В., Бехтерова М.К. Поражения периферической нервной системы при иерсиниозной инфекции у детей. // Российский мед. журн. 2003. № 2. С. 27—29.

171. Challa Y.R., Marx R.S. Pathology of Yersinia enterocolitica meningitis. // J. Neurol. Neurosurg Psychiatry. 1980. V. 43. N. 1. P. 455-457.

172. Sotaniemi K.A. Neurologic complications associated with yersiniosis. // Neurology. 1983. V. 33. N. 3. P. 95-97.

173. Вяльба E.B., Ющук Н.Д., Белая Ю.А. Определение антигена иерсиний в биологических субстратах у взрослых. // Советская медицина. 1989. № 4. С. 96-97.

174. Климанова Е. М., Белая О.Ф., Лаврова К.В. Использование реакции коагглютинации в диагностике иерсиниозов у детей. // Педиатрия. 1993. № 4. С. 48-49.

175. Королюк A.M. Использование реакции коагглютинации для определения и быстрой идентификации возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза. // Лаб. дело. 1984. № 4. С. 250-252.

176. Аксенов М.Ю., Гинзбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции. // Мол. генетика. 1993. № 4. С. 3-9.

177. Королюк A.M., Головачева С.Н., Дулатова М.В. Выбор рациональных методов определения антител к Yersinia enterocolitica. Реакция агглютинации. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунологии. 1988. № 9. С. 45-47.

178. Александер С.К., Лукин Ю.В., Фидлер Л.М. Приготовление IgG диагностикума на основе окрашенных полиакролеиновых латексов для применения в реакции латексной агглютинации. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунологии. 1990. № 6. С. 84-88.

179. Яшина Н.В., Дулатова М.В., Фиш Н.Г. Прокопов Н.И., Черкасов В.П., Кравцов Э.Г., Янина Т.Н., Грицкова И.А. Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза: А.с. Р.Ф. 2087913 // Б. И. 1997. № 27. С. 371.

180. Granforst К. Measurement of Immunoglobulin М (IgM), IgG and IgA Antibodies Against Yersinia enterocolitica by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Persistence of Serum Antibodies During Disease. // J. Clin. Microbiol. 1979. V. 9. N. 3. P. 336-341.

181. Малов И.В., Рубцов И.В., Ющенко Г.В., Леоненко В.В. Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов: А.с. РФ 1767435 // Б.И. 1992. № 37. С. 192.

182. Богаутинов З.Ф., Вылегжанина Е.С., Кузьмина В.Б., Астахова Т.С., Ниязов У.Э., Шумилов К.В. Способ диагностики иерсиниозов: А.с. РФ 2152037 // Б.И. 2000. № 18. С. 427.

183. Королюк A.M., Головачева С.Н., Дулатова М.В. Серодиагностика кишечного иерсиниоза. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунологии. 1990. № 3. С. 30-34.

184. Гузев К.В., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia. // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 10. С. 1338-1345.

185. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. Purification and characterization of heat-modifiable protein from outer membrane of Escherichia coli. // FEBS Lett. 1974. V. 41. N. 2. P. 195-198.

186. Benson S.A., Occi J.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K12. // J. Mol. Biol. 1988. V. 203. N. 4. P. 961-970.

187. Tsai C-M., Frasch C.E. A Sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrilamide gels. // Anal. Biochem. 1982. V. 119. P. 115-119.

188. Yoshimura F, Zalman LS, Nikaido H. Purification and properties of Pseudomonas aeruginosa porin. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. N. 4. P. 2308-2314.

189. Weckesser J., Zalman L.S., Nikaido H. Porin from Rhodopseudomonas sphaeroides. II J. Bacteriol. 1984. V. 159. N. 2. P. 199-205.

190. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи J1. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. 157 с.

191. Inouye M. What is the bacterial outer membrane? // Ed. Inouye M. New York: Wiley-Interscience Pub., 1979. P. 5-12.

192. Capaldi R.A., Vandercooi G. The polarity of many membrane proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. N. 4. P. 930-932.

193. Kyte J., Doolittle R.F: A simple method for displaying the hydropathic character of a protien. //J. Mol. Biol. 1982. V. 157. N. 1. P. 105-108.

194. Alurcar V., Kamat R. Immunomodulatory properties of porins of some members of the family Enterobacteriaceae. II Infect Immun.1997. V. 65. N. 6. P. 2382-2388.

195. Simonet V., Mallea M., Pajes J.M. Substitutions in the eyelet region disrupt cefepime diffusion through the Escherichia coli OmpF channel. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V. 44. N. 2. P. 311-315.

196. Wong R.S.Y., Wirtz R.A., Hancock R.E.W. Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein OprF as an expression vector for foreign epitopes: the effects of positioning and length on the antigenicity of the epitope. // Gene. 1995. V. 158. N. 1. P. 55-60

197. Singh S.P., Miller S., Williams Y.U., Rudd K.E., Nikaido H. Immunochemical structure of the OmpD porin from Salmonella typhimurium, II Microbiology. 1996. V.142. N. 11. P. 3201-3210

198. Норр T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein antigenic determinants. // Mol. Immunol. 1983. V. 20. N. 4. P. 483-489.

199. Karplus P., Schulz G. Prediction of chain flexibility in proteins. // Naturwissenschaften. 1985. V. 72. P. 212-213.

200. Frommel C. Use of averaged mutation rate in pieces of protein sequences to predict the location of antigenic determinations. //J. Theor. Biol. 1988. V. 132. 171-177

201. Carplus P., Wejer W., Zee R., Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins.//FEBS Lett. 1985. V. 188. P. 215-218.

202. Вострикова О.П., Лихацкая Г.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Антигенное родство и функциональные свойства поринов рода Yersinia. II Биол. мембраны. 2000. Т. 17. № 4. С. 399-409.

203. Vostrikova О. P., Kim N.Yu., Likhatskaya G. N., Novikova O. D., Solov'eva T. F. Pore-forming proreins of genus Yersinia. II Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 51. N. 1. P. 261-263.

204. Туроверов K.K., Кузнецова И.М. Собственная флуоресценция глобулярного белка актина. Особенности локализации триптофановых остатков. // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. № 12. С. 893-898.

205. Manavalan P., Jonson J.W.C. Sensitivity of circular dichroism to protein tertiary structure class. //Nature. 1983. V. 305. N. 5937. P. 831-832.

206. Provencher C.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 34-37.

207. Sreerama N., Woody R.W. Estimation protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON and CDSSTR methods with an expanded reference set. // Anal. Biochem. 2000. V. 287. N. 2. P. 252-260.

208. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 1986. С. 262—305.

209. Safar J., Roller P.P., Gajdusek D.C., Gibbs Jr. J.C. Scrapie Amyloid (Prion) Protein Has the Conformational Characteristics of an Aggregated Molten Globule Folding Intermediate. // Biochemistry. 1994. V. 33. N. 27. P. 8375-8383.

210. Jeanteur D., Lakey J. H., Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction. // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. N. 9. P. 2153-2164.

211. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. // J. Electrophoresis. 1997. V. 18. N. 15. P. 2714-2723.

212. Dutzler R., Schirmer T. Crystal structure and functional characterization of OmpK 36, the osmoporin of Klebsiella pneumoniae. II J. Structure. 1999. V. 7. N. 4. P. 425-434.

213. Berman H.N., Westbrook K.J., Feng Z., Gilliland G.L., Bhat T.N., Weissing H., Shindyalov I.J., Bourne P.E. The protein data bank. // J. Nucl. Acids Res. 2000. V. 28. N. 21. P. 235242.

214. Sussman J.L., Abola E.E., Lin D., Jiang J., Manning N.O., Prilusky J. The protein data bank. // J. Genetica. 1999. V. 106. N. 1-2. P. 149-158.

215. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., Schwede T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modeling. // Bioinformatics. 2006. V. 22. N. 15. P. 195-201.

216. Schwede Т., Kopp J., Guex N. and Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. // J. Nucl. Asid Research. 2003. V. 31. N. 13. P. 3381-3385.

217. Spoel D.V., Lindahl E., Hess В., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J.C. GROMACS: fast, flexible and free. // J. Comput. Chem. 2005. V. 26. N. 16. P. 1701-1718.

218. Pedretti L., Villa K., Vistoli G. « Vega: a versatile program to convert, handle and visualize molecular structure on windows-based PCs» // J. Mol. Graph. 2002. V. 21. P. 47-49.

219. Пермяков E.A. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука, 2003. 189 с.

220. Towbin Н., Stackelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. N. 9. P. 4350-4354.

221. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б, Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. 288 с.

222. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний. // Бюлл. эксп. биол. и медицины. 1996. Т. 122. № 6. С. 657-660.

223. Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Антигенные свойства порина наружной мембраны Yersinia enterocolitica. II Русский журн. иммунологии. 2004. Т. 9. С. 65.

224. Greenberg R., Daniels S., Flanders D. Medical Epidemiology. N.Y.: Lange Medical Books, 2001.215 р.

225. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М.: Мир, 1962. С. 30-66.

226. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Использование порина наружной мембраны Yersinia enterocolitica для диагностики кишечного иерсиниоза с помощью ИФА. // Биол. мембраны. 2009. Т. 26. № 5. С. 419-428.

227. Гордеец А.В., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Малашенкова В.Г., Бениова С.Н.,п

228. Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Патент 2153172 Российская Федерация, МПК G 01 N 33/53, 33/569. Способ диагностики псевдотуберкулеза; заявители и патентообладатели ВГМУ и ТИБОХ ДВО РАН. № 98122085/14; Заявл. 02.12.98; Опубл. 20.07.00, Бюлл. № 20. 8 с.

229. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Хоменко В.А., Малашенкова В.Г., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Новый подход в диагностике иерсиниозов. // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4. №. 3. С. 132-133.

230. Дранник Г.И., Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 608 с.

231. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Малашенкова В.Г., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Опыт диагностики вторично-очаговых форм иерсиниозов. // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4. №. 3. С. 143.

232. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Горбач Т.А., Малашенкова В.Г., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Опыт диагностики поражения нервной системы при иерсиниозной инфекции. // Русский журн. иммунологии. 2006. Т. 9. № 3. С. 168.

233. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Малашенкова В.Г., Горбач Т.А., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Вторично-очаговые формы иерсиниозов и их верификация. // Российский аллерг. журн. 2007. № 3, прил. 1. С. 261.

234. Ogita Z., Markert C.L. A miniturized system for electrophoresis on polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 1979. V. 99. N. 2. P. 233-241.

235. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert N.E. A modification of the Lowry procedure to simply protein determination in membrane and lipoprotein samples. // Anal. Biochem. 1978. V. 87. N. 1. P. 206-210.

236. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., rebera P.A., Smit F. Colometric metod for determinated sugar and related substances. // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

237. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. N. 5259. P. 680-685.

238. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology / Hirs C.H.W., Timasheff S.N., eds. N.Y., London: Acad. Press, 1972. V. 25B. P. 121-139.

239. Беленький Б.Г., Ганкина Е.С., Нестеров В.В. Экспрессный ультра-чувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии. //ДАН СССР. 1967. Т. 172. № 1. С. 91-93.

240. Allen G. Amino acid analyses. // In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Sequencing of proteins and peptides. Burdon R.H., van Knippenberg P.H., eds. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier, 1989. P. 40.

241. Ichikawa T, Terada H. Second derivative spectrophotometry as an effective tool for examining phenylalanine residues in proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 494. N. 1. P. 267-270.

242. Eftink M.R., Ghiron C.A. Fluorescence quenching studies with proteins. // Anal. Biochem. 1981. V. 114. N. 2. P. 199-227.