Взаимодействие бактериальных липополисахаридов с белками и полисахаридами. Модификация физиологической активности липополисахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЕРМАК ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ С БЕЛКАМИ И ПОЛИСАХАРИДАМИ. МОДИФИКАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

02.00.10- биоорганическая химия Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток - 2006 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук профессор Каминский В.Л

доктор химических наук профессор Книрель ГО.Л.

доктор химических наук профессор Щеголев С.Ю.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится " " октября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН но адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: scienceCi?pihoc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 15?, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан ief У " сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

' Прокопенко Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Липополисахарид (ЛПС), специфический компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент (липид А) и ковалентно связанную с ним гидрофильную полисахаридную часть.

ЛПС играют важную роль во взаимодействии микро- и макроорганизма и являются мощными токсинами, которые получили название эндотоксинов.

В наружной мембране бактерий ЛПС специфически взаимодействуют с белками мембраны, образуя ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК). Эти комплексы играют важную роль в организации и функционировании бактериальной мембраны и в значительной степени определяют ее свойства. ЛПБК представляет собой так называемый полный О-соматический антиген Буавена и при попадании в макроорганизм обеспечивает формирование иммунитета к бактериальному возбудителю. Долгое время считалось, что все основные свойства ЛПБК определяются ЛПС, пока не была установлена важная роль белкового компонента в модификации физиологической активности ЛПС. Комплекс обладает особыми биологическими свойствами, которые отсутствуют у отдельно взятых ЛПС и белка, но характерны для бактериальной клетки в целом.

Способность ЛПС образовывать комплексы с белками наружной мембраны бактерий подтверждена многими экспериментальными фактами, однако сведения о структуре и свойствах ЛПБК, их поведении в водных средах весьма ограничены. Поэтому изучение физико-химических свойств и макромолекулярной организации ЛПБК, а также его ЛПС составляющей, до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено тем, что достаточно полно понять молекулярные механизмы биологического действия ЛПС и ЛПБК, можно лишь располагая соответствующими данными об их макромолекулярной организации.

Взаимодействие ЛПС с веществами белковой природы не ограничивается только белками наружной мембраны бактерий. При попадании в макроорганизм ЛПС взаимодействуют с белками сыворотки и бактерицидными белками организма хозяина, а также являются мишенью для антибактериальных веществ поликатионной природы, используемых при лечении бактериальных инфекций. В таком случае ЛПБК, выделенные из бактериальной мембраны, могут служить удобной моделью для изучения ЛПС-белковых взаимодействий.

Сокращения, используемые в тексте: АДФ — аденозиндифосфат, ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, ГПХ - гель-проникающая хроматография, ГЖХ — газожидкостная хроматография, ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, ДСН — додецилсульфат натрия, ИЛ — интерлейкин, КДО — 2-ксто-3-дезокси-П-лшшю-окто новая кислота, ЛПБК -липополисахарид-белковый комплекс, ЛПС — липополисахарид, Man — манноза, Hep -гептоза, ММР — молекулярно-массовое распределение, ПТИ - пищевая токсикоинфекция, ПААГ — полиакриламидный гель, РИА — радиоиммуноанализ, ТХУ — трихлоруксусная кислота, TLR — толлподобные рецепторы, CsCl — хлористый цезий, ЭДТА -этилендиаминтетраацетат натрия, ФЧ — фагоцитарное число, ФП — фагоцитарный показатель, ФНО - фактор некроза опухоли, Х-ВМ и Х-НМ — хитозаны высокой и низкой молекулярных масс соответственно.

Результатом специфического взаимодействия ЛПС с клетками макроорганизма является биосинтез активных медиаторов - цитокинов, гиперпродукция которых при высокой концентрации ЛПС приводит к развитию сложной гаммы токсических эффектов, таких как пирогенность, лейкопения, шок, объединяемых понятием «бактериальный эндотоксикоз». Открытие тонких молекулярных механизмов токсического эффекта ЛПС стимулировало появление новых подходов для нейтрализации его действия. Один из них заключается в использовании веществ, нейтрализующих токсическое действие ЛПС на макроорганизм за счет образования с ним макромолекулярных комплексов. Этот прием является достаточно специфическим, так как не нарушает механизмы защиты хозяина от патогена. Для этих целей в последние годы активно исследуется взаимодействие ЛПС с несколькими классами катионных амфифильных молекул, включая белки, пептиды и синтетические полипептиды, для которых ЛПС является важной мишенью, благодаря высокому отрицательному заряду за счет фосфатных, пирофосфатных и карбоксильных групп, локализованных во внутренней части кора и в липиде А - токсическом центре ЛПС.

Поиск природных веществ, снижающих негативное действие бактериальных эндотоксинов, повышающих неспецифическую резистентность организма к действию ЛПС и восстанавливающих работу иммунной системы организма, имеет важное значение. Среди веществ, способных нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов, перспективными представляются полисахариды морского происхождения благодаря их разносторонней биологической активности, в том числе бактерицидной и иммуностимулирующей, их биосовместимости, безопасности и доступности. Особого внимания заслуживают два таких полисахарида: хитозан и каррагинан, первый - в силу его поликатионной природы, благодаря чему он может рассматриваться в качестве потенциального лиганда для ЛПС, а второй — как представитель класса пищевых волокон, играющих важную роль в гомеостазе и широко используемый в составе различных пищевых продуктов. Механизмы специфического и неспецифического взаимодействия ЛПС с полисахаридами на молекулярном уровне, как и их влияние на биологические свойства эндотоксинов не исследованы.

Изучение взаимодействия бактериальных ЛПС с белками и полисахаридами может внести вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС, осуществляемого на уровне гуморальных и клеточных факторов макроорганизма, молекулярные основы которого остаются еще неясными.

Прикладное значение таких исследований заключается в том, что они открывают перспективу создания препаратов вспомогательной терапии при лечении септических осложнений грамотрицательных инфекций.

Цель н задачи исследования. Цель работы - изучить взаимодействие ЛПС грамотрицательных бактерий с белками внешней мембраны бактерий и природными полисахаридами и установить влияние этих полимеров на физиологическую активность ЛПС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать ЛПБК - комплекс ЛПС с мембранными белками псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis;

- изучить надмолекулярную организацию ЛПБК и входящего в его состав ЛПС в различных водных средах;

- провести сравнительное исследование физиологической активности ЛПС и ЛПБК и определить её связь с физико-химическими характеристиками эндотоксинов;

получить из природных источников препараты полисахаридов: каррагинанов и хитозана, — изучить их структуру и свойства;

- определить особенности взаимодействия ЛПС с хитозаном и константы их связывания;

- провести сравнительное изучение физиологической активности ЛПС и его комплексов с хитозаном;

- оценить взаимодействие ЛПС с каррагинаном;

- изучить влияние каррагинана на физиологическую активность ЛПС;

оценить возможность использования полисахаридов для лечения осложнений, вызванных грамотрицательными бактериями.

Научная новизна работы

Впервые проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств ЛПБК и ЛПС из Y. pseudotuberculosis. Установлена важная роль белка в макромолекулярной организации комплекса и его физиологической активности.

Впервые на молекулярном уровне изучено взаимодействие ЛПС с хитозанами и установлено образование комплексов ЛПС - хитозан различной стехиометрии. Изучен процесс комплексообразования и определены параметры связывания ЛПС с хитозанами.

Впервые в опытах in vivo установлено снижение токсичности ЛПС при образовании им комплекса с хитозаном и обнаружена модификация физиологической активности ЛПС под действием хитозана в опытах in vitro.

Впервые установлена зависимость структуры сульфатированных полисахаридов каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae, от стадии развития водоросли и изучены физико-химические свойства каррагинанов.

Впервые исследовано взаимодействие каррагинанов с бактериальными ЛПС и установлен ингибирующий эффект каррагинана на токсическое действие ЛПС в опытах in vivo.

Впервые в опытах in vivo установлено, что макроорганизм под влиянием хитозана и каррагинана способен противостоять действию бактериального эндотоксина.

Практическая значимость

Показано, что ЛПБК обусловливает возникновение и развитие инфекционного процесса при псевдотуберкулезе.

Предложен метод существенного снижения токсического действия ЛПС путем образования комплекса с хитозаном.

На уровне целостного организма получены данные о защитном действии хитозана и каррагинана при ЛПС-индуцируемой эндотоксинемии, что открывает перспективы их использования в клинической практике для связывания и детоксикации ЛПС.

Обоснована возможность внедрения терапии пищевых токсикоинфекций (ПТИ) с помощью природных полисахаридов: каррагинана и хитозана, - для коррекции нарушений тромбоцитарного звена гемостаза.

При использовании каррагинана в добавлении к базовой регидратационной терапии получен положительный эффект на систему гемостаза, иммунного статуса и на некоторые биохимические параметры, характеризующие состояние гомеостаза, в условиях эндотоксинемии у больных ПТИ сальмонеллезной этиологии.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых подходов с использованием' полисахаридов для снятия интоксикационного синдрома у септических больных.

Разработаны и утверждены ТУ № 92S4-037-02698170-99 от 21.06.99 г на получение каррагинана из водоросли Chondrus armatus в качестве пищевой добавки.

IIa защиту выносятся следующие результаты и положения

1. В наружной мембране псевдотуберкулезного микроба У. pseudotuberculosis ЛПС тесно связаны с белками мембраны и образуют с ними ЛПБК, состав которых зависит от условий культивирования бактерий.

2. Физико-химические свойства и физиологическая активность ЛПБК определяются как ЛПС-составляющей комплекса, так и . его белковым компонентом.

3. ЛПС образует с хитозанами комплексы различной стехиометрии. Макромолекулярная организация ЛПС играет важную роль при его взаимодействии с поликатионами.

4. Процесс взаимодействия ЛПС с хитозанами зависит от структурных особенностей взаимодействующих компонентов и условий проведения реакции связывания.

5. ЛПС взаимодействует с каррагинаном, и этот процесс зависит от структуры используемого каррагинана.

6. Структура каррагинана определяется как видовой принадлежностью водоросли, так и стадией ее развития.

7. Полисахариды: хитозан и каррагинан, - нейтрализуют токсическое действие ЛПС и сохраняют его иммунобиологические свойства.

8. Хитозан и каррагинан могут быть могут быть полезными в качестве препаратов вспомогательной терапии при лечении эндотоксинемии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены лично автором в виде устных сообщений на: Всесоюзной конференции «Бактериальные токсины» (Юрмала, Латвия, 1989); II Всесоюзном семинаре «Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов» (Саратов, 1991); International Symposium "Chemical Natural products" (Tenerife, Spain, 1996); Первом международном симпозиуме «Натуральные биокорректоры: питание, здоровье, экология» (Москва, 1997); XVI International Seaweed Symposium (Cube, Philippine, 1998); International Symposium «Biotechnology of Marine Algae and Marine Bioactive Substances» (Qindao, China, 2000); 2rd German-Polish - Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Moscow, 2002); Конференции «Фундаментальные пауки - Медицине» (Москва, 2003); XVII International Seaweed Symposium (Bergan, Norway, 2004); A satellite to the XVII International Seaweed Symposium «Marine Biopolymers» (Trondheim, Norway, 2004); 3rd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 статей в отечественных и международных журналах и более 50 тезисов докладов.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, восьми глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 445 источников. Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста, содержит 58 рисунков и 30 таблиц.

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Отдела молекулярной иммунологии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. В основу работы положены исследования, проведенные в период 1985-2005гг в рамках научных программ плановой темы НИР «Изучение молекулярных основ иммунных процессов, в том числе антибактериального и антиопухолевого иммунитета».

Частично работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики ГНП № 402-15.2.1S (8.1.14), ГНП № 41.028.1.1.2447 (02.04.14); Российского фонда фундаментальных исследований №97-04-48238-а, №01-04-96920, №05-04-49901-а, РФФИ-ГФЕН, (№ 99-04-10004), фонда CRDF, Президиума РАН «Фундаментальные науки - Медицине», «Молекулярная и клеточная биология» и Президиума ДВО РАН №05- IIIA-05-041, № 06-2У-0-05-009, № 06-04-96022.

Автор выражает свою искреннюю благодарность научным консультантам: академику РАН Ю.С. Оводову и проф. д.х.н.Т.Ф. Соловьевой, - за неустанное внимание к работе, ценные консультации и полезные советы, за совместное обсуждение отдельных положений работы, их тщательный анализ и добрую критику. Автор приносит глубокую признательность за всестороннюю помощь в работе всем сотрудникам ЛМОАБИ и, в частности, к.х.н. В.Н Давыдовой, к.х.н. В.И Горбачу, к.х.н. А.О. Барабановой, к.х.н. Г.А Набережных, к.х.н. И.Н Красиковой, а также сотрудникам ТИБОХ - к.ф-м.н. В.П Глазунову, д.б.н. A.B. Реунову, к.б.н. Л.А.Лапшиной, к.х.н Е.Л. Назаренко., к.х.н. В.В Исакову, д.х.н. П.А. Лукьянову, к.х.н. Г.М. Фроловой. Автор также благодарит за сотрудничество в работе сотрудников ИБМ ДВО РАН к.б.н Э.И. Хасину, д.б.н. Э.А. Титлянова, д.б.н. А.Л. Дроздова, д.ф-м.н. В.Г. Заводинского, сотрудников ЦНИЭМ МЗ (г.Москва ) д.б.н. А.М. Полякову, к.б.н. О.П. Астрину, академика РАМН В.В. Малеева и сотрудников НИИЭМ РАМН (г. Владивосток) академика РАМН H.H. Беседнову, к.б.н. Т.Н. Запорожец, к.б.н. Т.А.Кузнецову. Автор выражает признательность чл.-корр. РАН В.Е. Васьковскому за доброжелательное отношение, советы и поддержку работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 6 разделов, приведено описание строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий и ее основного структурного компонента - ЛПС; дана характеристика макромолекулярной организации ЛПС и его поведению в растворах; описаны комплексы ЛПС с белками наружной мембраны и проанализирована связь структуры и

физиологической активности ЛПС; подробно изложены вопросы взаимодействия ЛПС с белками макроорганизма, в том числе сывороточными, такими как липопротеииы, глобулин, альбумин, бактерицидными и ЛПС-связывающими белками, и приведены примеры детоксикации ЛПС; рассмотрены структурные особенности и физико-химические свойства используемых в работе полисахаридов - хитозанов и каррагинанов.

Обсуждение результатов

ЛПС и ЛПБК из Yersinia pseudotuberculosis

Среди широкого набора методов выделения ЛПБК наиболее распространенной является экстракция с помощью ТХУ и ЭДТА. Обычно используемый при экстракции эндотоксинов водный фенол разрушает комплекс между ЛПС и белком и оказывает деградирующее действие. Важно было определить, какая часть ЛПС экстрагируется в виде комплекса с белком, и сравнить ЛПС, входящий в состав комплекса, с ЛПС, выделенным из клеточной стенки при обработке бактерий водным фенолом. С этой целью клетки псевдотуберкулезного микроба (серовар 1В, штамм 598) последовательно обрабатывали раствором ТХУ, КаНСОз и ЭДТА согласно схеме, приведенной на Рис. 1. Остаток бактериальной массы обрабатывали горячим водным фенолом и получили ЛПС-1, содержащий 1% белка. Параллельно этим же методом из исходной бактериальной массы получали ЛПС-П и очищали от сопутствующих примесей центрифугированием в градиенте CsCl. Экстракты ТХУ, ИаНСОз и ЭДТА очищали от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на колонке с сефарозой 2В, а затем изоплотностным центрифугированием в градиенте CsCl. Совпадение максимумов выходных кривых по белку и по КДО - специфический моносахаридный остаток, входящий в состав ЛПС, свидетельствует о том, что экстракты ТХУ, ЭДТА и NaHC03 содержат ЛПБК (Рис. 26). Все выделенные ЛПБК имеют одинаковую плотность 1.41 г/см3, отличную от плотности ЛПС (Табл. 1). Соотношение компонентов моносахарид-белок во всех ЛПБК одинаково (2:1 в/в), белковый компонент идентичен и по данным ДСН-ПААГ электрофореза представлен двумя полипептидами с молекулярными массами 40 и 14,5 кДа.

Все полученные ЛПБК и ЛПС имеют одинаковый моносахаридный состав, идентичный установленному ранее для ЛПС из псевдотуберкулезного микроба, однако мольное отношение маннозы к гептозе, характеризующее размер О-специфической полисахаридной цепи, различается для ЛПС и ЛПБК. В ЛПБК О-полисахаридный фрагмент, в среднем, длиннее, чем в ЛПС. ЛПС-1 имеет более короткую углеводную цепь, чем ЛПС-П. Эти данные хорошо согласуются с результатами электрофореза, которые показывают, что после обработки микробной массы ТХУ, NaHCOa и ЭДТА в клетках преимущественно остается ЛПС с короткой цепью.

Следует отметить, что если при выделении ЛПБК исключить стадии диализа и лиофилизации экстрактов, то после гель-фильтрации каждый из них (например, ТХУ) при изоплотностном центрифугировании делится на две фракции ЛПБК с плотностью 1,40 и 1,43 г/см3, обозначенные для ЛПБК-А, как ЛПБК-А] и ЛПБК-Аг (Рис. 2а).

45% 5% • одм NaHCOj 45%

ФЕНОЛ i ТХУ NaHCOj рН 10.7 0.1M3DTA ФЕНОЛ

Л П С -II

ЭКСТРАКТ ЭКСТРАКТ ЭКСТРАКТ

ЭДТА

ТХУ I г

NaHCCb I: I:

\z

Гельфильтрация на сефарозе 2В

!'■ I

~Г~Г

НЕ

J

XZ

ЛПС - II

V ЛПБК-А ТХУ

S7

ЛПБК-NaHCO

V ЛПБК -ЭДТА

! Остаток : Остаток Остаток

клеток =0 ' клеток -2 —^ клеток -3

ЛПС-1

Изоплотностное центрифугирование в градиенте плотности CsCl

ЛПС-1

Рис. 1. Схема выделения ЛПБК и ЛПС из псевдотуберкулезного микроба.

Эти комплексы (ЛПБК-А] и ЛПБК-Аг) отличаются соотношением полисахарида и белка, что обусловливает разницу в их плотности. Смесь этих комплексов после диализа и лиофилизации не удается разделить центрифугированием. Вероятно, процесс лиофилизации способствует их гибридизации и образованию промежуточной формы ЛПБК со средней плотностью гидратации (1,41 г/см3).

Таблица 1. Выход и характеристика ЛПБК и ЛПС после очистки в градиенте

плотности СзС1

ЛПБК-А (ТХУ) ЛПБК NaHCOj ЛПБК ЭДТА ЛПС-1 ЛПС-П

Плотность (р) CsCl г/см3 1,41 1,41 1,41 1,44 1,43

Man/Hep Моль/Моль 5,0 5,0 5,0 1,8 2,5

Выход, % от микробной массы 0,65 0,05 0,58 0,74 1,3

Рис. 2. Центрифугирование в градиенте СьС1: а - ЛПБК-А - экстракт ТХУ без лиофилизации; б - ЛПБК-А - экстракт ТХУ после лиофилизации и диализа

Как известно, химический состав бактерий во многом определяется параметрами среды обитания, важнейшим из которых является температура. Для изучения влияния температуры культивирования бактерий на состав ЛПС и ЛПБК У.р$еш1ошЬегси1о$1з (шт. 2602) выращивали при трех температурных режимах: 4°С , 20°С и 37°С. Выделение и очистку ЛПС и ЛПБК проводили, как описано выше. Как показали результаты, выход ЛПБК и ЛПС зависит от температуры культивирования бактерий, резко уменьшаясь при ее повышении. Чем ниже температура культивирования бактерий, тем более длинные в среднем О-специфические цепи имеет ЛПС, что следует из результатов химического анализа (Табл. 2). Электрофорез ЛПС в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием ионами серебра подтверждает приведенные выше результаты: ЛПС - 37°С в отличие от ЛПС - 4°С не содержит молекул с длинными О-цепями. Как видно из таблицы 2, ЛПБК и ЛПС, выделенные из клеток, выращенных при 20°С и 37°С, гетерогенны по плотности, в отличие от ЛПБК - 4°С и ЛПС - 4°С.

Таблица 2. Выход и характеристика ЛПС и ЛПБК из бактерий Y. pseudotuberculosis, выращенных при различных температурах

Вещество Выход, % Плотность (р) в Выход, % от мик- Man/Hep,

от CsCl, г/см3 робной массы Моль/Моль

микробной после центрифу-

массы гирования в CsCl

ЛПС - 4иС 1,9 1,43 1,4 2,5

ЛПС - 37иС 0,8 1,45 0,48 1,0

1,43 0,02 2,5

ЛПБК - 4иС 0,9 1,40 0,60 6,5

ЛПБК - 37иС 0,2 1,43 0,01 3,0

1,41

ЛПБК - 20иС 0,7 1,43 0,14 3,2

1,40 0,25

Температура культивирования оказывает влияние на содержание О-антигеиов на поверхности бактериальных клеток, что было установлено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Бактерии, выращенные на холоду, имеют на поверхности больше доступных О-полисахаридных детерминант, по сравнению с клетками, культивируемыми при 37°С.

Таким образом, из бактерий Y. pseudotuberculosis традиционными методами экстракции могут быть выделены как ЛПС, так и ЛПБК. Последовательная обработка бактериальной массы ТХУ и ЭДТА позволяет увеличить выход ЛПБК в 2 раза, при этом не извлеченным остается половина ЛПС, который экстрагируется горячим водным фенолом. В каждом из ТХУ и ЭДТА экстрактах присутствуют две фракции ЛПБК, которые в процессе лиофилизации образуют усредненную или гибридную форму. Выделенные различными реагентами и очищенные (после лиофилизации экстрактов) ЛПБК имеют идентичный химический состав, одинаковое соотношение компонентов (полисахарид : белок) и их полисахаридный фрагмент имеет один и тот же средний размер О-специфических цепей. В составе комплекса ЛПС имеет в среднем более длинную О-специфическую углеводную цепь, по сравнению с ЛПС, выделенным из бактериальных клеток горячим фенолом. Эта закономерность сохраняется независимо от температуры роста бактерий и становится более ярко выраженной при низкой температуре культивирования У. pseudotuberculosis.

Анализ собственных и литературных данных позволяет предположить, что во внешней мембране псевдотуберкулезного микроба присутствуют два типа ЛПС, которые занимают различное положение в мембране. ЛПС с более длиной О-специфической углеводной цепью находится в тесной ассоциации с белком и экстрагируется в виде ЛПБК. ЛПС с более короткой О-цепыо, вероятно, участвует в образовании «чистых» ЛПС-фосфолипдных бислоев внешней мембраны и экстрагируется фенолом как более жестким реагентом.

Уменьшение размера О-цепей в ЛПС бактерий, выращенных при 37°С, может вносить определенный вклад в потерю им вирулентности, поскольку известно, что О-полисахарид в значительной степени отвечает за устойчивость бактерий против защитных факторов макроорганизма.

Физико-химические свойства ЛПБК И ЛПС из Y. pseudotuberculosis

Физико-химические свойства ЛПБК практически не изучены, а данные о поведении ЛПС в водных растворах весьма противоречивы. Изучение физико-химических свойств как ЛПБК, так и ЛПС осложняется в силу их особенностей: слабой растворимости, полидисперсности и способности, вследствие амфифильной природы их молекул, образовывать в растворах агрегаты, что накладывает определенные ограничения на применение физико-химических методов исследования и затрудняет интерпретацию полученных результатов. В связи с этим, такие параметры, как молекулярная масса, размер и форма характеризуют не макромолекулы полимера, а формируемые в растворе агрегаты ЛПС и ЛПБК.

Для изучения поведения ЛПС и ЛПБК в водных растворах и определения их физико-химических характеристик в данной работе были использованы дополняющие друг друга методы: аналитическое равновесное и скоростное центрифугирование, гель-проникающая хроматография на макропористых стеклах (ГПХ), вискозиметрия, светорассеяние и электронная микроскопия. Совокупность полученных данных позволила с достаточной степенью достоверности определить физико-химические параметры эндотоксинов, а параллельное изучение ЛПС и

ЛПБК позволило оценить вклад ЛПС составляющей в макромолекулярнуго организацию комплекса.

Исследование проведено на образцах ЛПБК-А и ЛПС, которые были выделены из бактерий У.р$еис1о1иЪегси1о$'1$, выращенных при 4°С. Все образцы по данным равновесного центрифугирования гомогенны по плотности и образуют одну границу седиментации при аналитическом центрифугировании."

М„„(М)

СНЖ0х( 1 +со52 еЯвтв) 107

а

Ь

"/V А

5 6 7 8

Рис. 3. Молекулярно- массовое распределение для ЛПБК в: 0,1М N301 - а; О.ОЗМ трис-НС1 (рН 8) - б; воде - с

Рис. 4. График Зимма для ЛПБК в1М ЫаС1. Экстраполяционные зависимости построены с учетом данных трех (1); четырех (2,4) и пяти (3) концентраций

Молекулярно-массовые параметры ЛПБК в растворах определяли методом ГПХ на макропористых стеклах. Относительная площадь каждого хроматографического пика (в процентах) и соответствующие значения М», вычисленные по скорректированной на функцию приборного уширения хроматограмме, приведены в таблице 3. Многомодалыюсть молекулярно-массового распределения (ММР) ЛПБК, наблюдаемая этим методом (Рис. 3), указывает на существенную полидисперсность ЛПБК, что обусловлено образованием в растворе агрегатов, размеры которых зависят от концентрации полимера и условий раствореиия (Табл. 3). С увеличением ионной силы раствора и уменьшением концентрации полимера наблюдается снижение степени полидисперсности и размеров агрегатов. ЛПС, по сравнению с ЛПБК, образует агрегаты больших размеров (Табл. 3). Сравнение молекулярно-массовых параметров, полученных для разных концентраций полимера, показывает, что М„ агрегатов с точностью до ошибки эксперимента кратны некоторой постоянной величине, условно обозначенной Ма и равной 0,18 МОа для ЛПБК в ОДМ №С1 буфере и 0,26 1УГОа в воде. Зависимость содержания низко- и высокомолекулярных агрегатов в растворе от концентрации ЛПБК свидетельствует об обратимом процессе: агрегации- дезагрегации.

Таблица 3. Средневесовые молекулярные массы (М„) и содержание (Р) агрегатов ЛПБК и ЛПС в растворах в зависимости от концентрации полимера (С) и природы растворителя

Растворитель Вещество С м» Р,% М„ Р, М„ Р,% М„ Р,%

мг/мл МДа МДа % МДа МДа

Вода ЛПБК-А 2,0 55 71 - 0,26 29

2,5 270 18 58 12 1 70 -

0,03 М ЛПБК-А 2,0 14 53 1,2 35 0,45 6

трис-НС1 рН 8 2,5 13 64 2,0 18 0,64 20

0.1М КаС1 ЛПБК-А 0,5 - - 3,1 23 0,18 76

2,0 15 68 3,0 24 0,75 4

0.1М 1ЧаС1 в ЛПБК-А 1,0 - - - 3,2 47 0,18 10

0,03М - 1,8 39

трис-НС1 рН8 ЛПС 1,0 15 62 2,7 0,75 38

Полученные результаты полностью согласуются с данными метода светорассеяния. Для растворов ЛПБК большинство графиков угловой зависимости двойной экстраполяции (Зимма) имеют Б-образную форму, что может быть обусловлено полидисперсностью исследуемых образцов и/или присутствием в растворе частиц с характеристическим размером, большим длины волны падающего света (Рис. 4). Рассчитанные этим методом значения средневесовых молекулярных масс для разных концентраций ЛПБК находятся в пределах 4-14 МДа, а г-средние значения радиуса инерции частиц при этом равны 66 - 130 нм. С увеличением ионной силы раствора наблюдается образование меньших по размеру агрегатов ЛПБК, а разбавление растворов ЛПБК вызывает диссоциацию агрегатов, сопровождаемую изменением их формы, в сторону более компактных.

Для определения достоверных значений средневесовых (М*) и г-средних (Мг) молекулярных масс ЛПБК и ЛПС с учетом их концентрационной зависимости были использованы методы аналитического центрифугировании: низкоскоростной метод равновесной седиментации и метод неустановившегося равновесия (Арчибальда). Для ЛПБК М„ и М2 составляют 1,3 и 2,1 МДа, а для ЛПС - 2,9 и 4,0 МДа соответственно. Полученные существенные различия значений М„ и М 2 указывают на полидисперсность исследуемых полимеров в растворе. М» ЛПБК почти в 2 раза меньше М„ ЛПС. Концентрационная зависимость молекулярной , массы ЛПБК, описываемая квадратичным полиномом второго порядка (Рис. 5 (1)), как и анализ данных равновесного центрифугирования, свидетельствует о самоассоцииации частиц ЛПБК в растворе. В пользу этого говорит и существенное увеличение коэффициента седиментации ЛПБК с возрастанием его концентрации. В отличие от ЛПБК для ЛПС наблюдается линейная концентрационная зависимость молекулярной массы (Рис. 5(2)), и коэффициент седиментации незначительно зависит от концентрации полимера, что характерно для невзаимодействующих систем.

М^'.мДа

М„',мДа

0,9

в-

8

0.6

4'

0,3

2

2'

0.0■

о.

0.0 0.2 0.4

0.6

0,8

1.0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1.0

С, мг/мл

С. мг/л

Рис. 5. Зависимость М« ЛПБК и ЛПС от концентрации. ЛПБК в растворе: 0,03М трис-НС1 (рН 8) (1), в 0,2% дезоксихолата ^диализ Н20 (3), 0,8% саркозилата N8 (4), 6М мочевины (5); ЛПС в растворе 0,03М трис-НС1 (рН 8) (2)

Превышение в 2 раза молекулярной массы ЛПС, по сравнению с ЛПБК, можно объяснить более сильным гидрофобным взаимодействием между молекулами ЛПС. Вероятно, в ЛПБК это взаимодействие ослаблено белковым компонентом, который, как известно, связан с липидной частью и может экранировать гидрофобные участки ЛПБК.

Для ЛПС и ЛПБК были определены гидродинамические параметры: характеристическая вязкость и коэффициент трения, - которые тесно связаны с конформацией полимера в растворе. Для этого были получены шесть фракций ЛПБК при фракционировании его гель-фильтрацией на колонке с сефарозой 2В. Характеристическая вязкость (г|) ЛПБК-А в воде имеет довольно высокое значение (около 260 см3/г) и существенно уменьшается с увеличением ионной силы раствора (до 29 см3/г в 0,1 М МаС!). Значительная зависимость этого параметра наблюдается от концентрации ЛПБК и времени его растворения - при длительном выдерживании растворов полимера (до трех суток) вязкость уменьшается до 6070% первоначальной величины, что, вероятно, является результатом диссоциации агрегатов ЛПБК, происходящей при разбавлении его растворов в течение достаточно длительного времени. Подобная диссоциация агрегатов ЛПБК в процессе разбавления также наблюдалась при исследовании его растворов методами светорассеяния и ультрацентрифугирования.

Низкие значения характеристической вязкости при большой молекулярной массе ЛПБК характерны для компактных частиц, близких к сферическим. Из логарифмической зависимости характеристической вязкости от молекулярной массы (определенных для шести фракций ЛПБК) были найдены константы "а" и "К" из уравнения Марка-Куна-Хаувинка: ([т|] = К х М"), значения которых (а=0,57 и К=5,5 х 104) позволяют с определенным приближением аппроксимировать форму частиц ЛПБК моделью компактного непроницаемого клубка. В пользу такой формы частиц ЛПБК в растворе говорит и близкое к единице отношение коэффициентов трения вычисленных на основании экспериментальных данных скоростного и равновесного центрифугирования (Табл. 4). Кроме того, значение коэффициента р, рассчитанное из уравнения Шераги-Манделькерна (оно приблизительно равно 2,12 х 106), исключает жесткую стержнеобразную форму частиц ЛПБК.

ЛПС, в отличие от ЛПБК, образует агрегаты асимметричных форм ({/{0 =6,5).

a

„'v "V

. Jk ■ ■ - ? J

' * ' i • ^ - ; ' ** Tf^gt

у*

"If: Ф "

б Mb. ■» * V

в

Рис. 6. Электронная микрофотография ЛПБК и ЛГГС из У. pseudotuberculosis: а - ЛПБК в воде; 6 - ЛПБК в трис-HCl буфере (рН 8,0); в - ЛПС в трис-НС1 буфере (рН 8,0); окрашивание уранилацетатом. Масштаб: 1см=100нм

Полученные гидродинамические параметры ЛПБК и ЛПС вполне сопоставимы с результатами электронно-микроскопического исследования макромолекул методом негативного контрастирования. Как видно из рис. 6, ЛПБК в воде формирует частицы в виде везикул с размерами от 60 х 5 до 200 х 10 им (Рис. 6а), а в растворе 0.03 М трис-HCl буфера (рН 8,0)-сферические частицы со средним диаметром 20 нм (Рис. 66). В отличие от ЛПБК, ЛПС из псевдотуберкулезпого микроба, подобно ЛПС из других бактерий, проявляет значительный полиморфизм, образуя частицы в виде лент, пластинчатых структур, дисков (Рис. 6в).

Агрегация ЛПБК и ЛПС в водных растворах происходит за счет нековалентных взаимодействий. В связи с этим было исследовано влияние различных диссоциирующих агентов на надмолекулярную структуру ЛПБК и ЛПС. Как показали результаты аналитического центрифугирования, при действии детергентов (саркозилата натрия и дезоксихолата натрия) происходит диссоциация частиц ЛПБК и ЛПС до субъединиц, характеристики которых приведены в таблице 4. Существенное уменьшение молекулярной массы и констант седиментации ЛПБК и ЛПС, обработанных детергентами, подтверждает важную роль гидрофобного взаимодействия в образовании высокомолекулярных агрегатов. Дезагрегация макромолекул ЛПБК сопровождается изменением форм частиц, что видно из увеличения отношения коэффициентов трения (Табл. 4), и согласуется с данными электронной микроскопии: в присутствии детергента ЛПБК образует стержни и диски. Обработка ЛПБК дезоксихолатом натрия и последующее удаление детергента вызывают реагрегацию субъединиц эндотоксина. Линейный характер концентрационной зависимости молекулярной массы и коэффициента седиментации ЛПБК говорит об образовании менее полидисперсных, по сравнению с исходными, частиц ЛПБК, слабо взаимодействующих в растворе (Рис. 5 (3)).

Таблица 4. Физико-химические характеристики ЛПБК и ЛПС в различных водных средах по данным аналитического центрифугирования

Вещество Добавки к буферу Плотность (р), г/см3 М„, МДа S2o.wX ю-13 f/f Форма (электронная микроскопия)

ЛПБК Трис-НС 1 буфер, рН8 1,1 1,3 26 1,2 сферы 20-нм

ЛПБК 0,8% саркозилат Na 1,32 0,12 2,4 2,7 тонкие нити

ЛПБК 0,005 М ЭДТА 1,41 0,7 5,1 5,1 Диски,стержни

ЛПБК 6М мочевина 1,41 0,2 5,8 1,7 н/о

ЛПБК 0,2% дезокси- холат Na/ диализ (Н20) 1,38 1,03 20,8 1,5

ЛПС Трис-НС 1 буфер, рН8 1,45 2,9 11,5 6,5 ленты, диски ламеллы

ЛПС 0,8% саркозилат Na 1,36 0,15 - - н/о

ЛПС 0,2% дезоксихолат Na 1,42 0,10 4,0 2,2 н/о

р - плотность в СбО , 5го,«-константа седиментации, М».,- средневесовая молекулярная масса, № отношение коэффициентов трения

Уменьшение молекулярной массы и константы седиментации ЛПБК и ЛПС наблюдается также в случае удаления части двухвалентных ионов при диализе растворов эндотоксинов против ЭДТА, при этом отношение коэффициентов трения возрастает, что свидетельствует об образовании более асимметричных структур. Мочевина также вызывает разукрупнение агрегатов ЛПБК (Табл. 4), что указывает на участие в их образовании водородных связей. Как показывают данные скоростной седиментации и изоплотностного центрифугирования, детергенты, мочевина и ЭДТА вызывают общую диссоциацию агрегатов ЛПБК, но не приводят к диссоциации комплекса на составляющие его компоненты: ЛПС и белок.

Существенное влияние на размер, форму и поведение частиц ЛПБК и ЛПС в растворе оказывает температура. Значения молекулярных масс и коэффициентов седиментации, а также величины коэффициентов, трения, рассчитанные на основании данных седиментационного анализа, приведены в таблице 5. Температурные зависимости всех физико-химических параметров ЛПС и ЛПБК в исследуемом диапазоне температур (5°С - 47°С) имеют достаточно сложный характер. Значения молекулярных масс ЛПС и ЛПБК с увеличением температуры вначале возрастают, а затем резко уменьшаются. Наиболее крупные агрегаты с высокой степенью асимметрии образуются при 30°С, (Табл. 5), что хорошо согласуется с данными электронной микроскопии. Как видно из рис. 7, ЛПБК, выдержанные при 30°С, под электронным микроскопом проявляются в виде ассоциированных структур. ЛПС образуют плотно упакованные лентоподобные структуры.

Рис. 7. Электронная микрофотография ЛПБК (а) и ЛПС (б) из У. pseudotuberculosis в 0,1 М NaCl . Образцы выдержаны при 30°С. Окрашивание 2% ФВК (рН7) . Масштаб: 1см=100нм

Дальнейший подъем температуры сопровождается уменьшением размера агрегатов. Повышение температуры от 37°С до 47°С вызывает разукрупнение частиц, а также уменьшение степени полидисперсности и самоассоциации исследуемых образцов.

Характер изменения молекулярной массы и коэффициентов седиментации ЛПБК от температуры, в основном, подобен наблюдаемому для ЛПС. Однако определенные отличия в поведении ЛПС и ЛПБК существуют, особенно при низкой и высокой температуре. Концентрационные зависимости молекулярных масс ЛПС при всех температурных режимах носят линейный характер, в то время как для ЛПБК при 5°С и 20°С эти зависимости описываются нелинейными квадратичными полиномами. Нелинейный характер зависимости свидетельствует о самоассоциации частиц ЛПБК в области низких температур. Действительно, при переходе от 5°С к 20°С наблюдается резкое увеличение молекулярной массы ЛПБК, в то время как для ЛПС она изменяется незначительно. При температуре выше 37°С значения молекулярных масс и степень асимметрии частиц ЛПБК больше, чем для ЛПС. Изменение параметров частиц при изменении температуры, вероятно, является следствием термотропных фазовых переходов в эндотоксинах. Анализ зависимости физико-химических параметров от температуры позволяет предположить наличие в ЛПБК нескольких структурных переходов в области 5°С -47°С. Первые два (выше 20°С и выше 30 С) обусловлены ЛПС-составлющей комплекса, а последний (около 37°С) связан с белковым компонентом. Существенный вклад белкового компонента проявляется и в области низких температур (5°С-20°С). Сопоставление полученных результатов с литературными данными позволяет предположить, что переходы выше 20°С и в области 30°С вызваны гидратацией молекул ЛПС и плавлением липидной составляющей соответственно.

Таблица 5. Физико-химические характеристики ЛПБК и ЛПС при различных температурах

Температура <°С) S0 х 10"" Mw МДа f/f0

ЛПС ЛПБК ЛПС ЛПБК ЛПС ЛПБК

■ 5 4,0 13,7 1,74 0,31 12,0 1,21

20 11,5 26,0 2,31 1,30 6,5 1,15

30 2,2 4,5 6,00 1,50 61,0 10,8

37 8,5 8,9 0,35 0,66 2,37 3,1

47 17,2 2,4 0,29 0,15 1,19 4,2

Результаты, полученные методом центрифугирования, согласуются с данными светорассеяния - с повышением температуры изменяется конформация и уменьшаются размеры частиц ЛПБК.

Таким образом, данные, полученные различными физико-химическими методами, характеризуют агрегаты ЛПБК как в высокой степени динамичные самоассоциирующие структуры: их форма, размер, молекулярно-массовое распределение и ультраструктура зависят от концентрации полимера, времени его растворения, ионной силы и температуры раствора. ЛПС образуют более крупные, по сравнению с ЛПБК, агрегаты, не склонные к самоассоциации.

Низкомолекулярные соединения, такие, как детергенты, мочевина и ЭДТА вызывают разукрупнение частиц ЛПБК и ЛПС. Следовательно, силы, стабилизирующие макромолекулярную организацию агрегатов эндотоксинов, имеют различную природу: гидрофобное взаимодействие, водородные и ионные связи. Важную роль в архитектонике макромолекул ЛПБК и ЛПС играют ионы двухвалентных металлов, главным образом, кальция и магния. Существенное влияние на размер, форму и поведение эндотоксинов в растворе оказывает температура. Изменение параметров частиц ЛПБК и ЛПС при повышении температуры, вероятно, является следствием термотропных фазовых переходов в этих полимерах. Эти переходы могут быть физиологически значимыми, так как их значения лежат в температурном интервале, в котором псевдотуберкулезный микроб, являющийся психрофилом, нормально живет и размножается.

Обращает на себя внимание тот факт, что молекулярные массы агрегатов ЛПБК и ЛПС в растворах с разной концентрацией, ионной силой и температурой кратны некоторым величинам М<>. В растворах преобладают агрегаты с Mw =20-30 Mo, 12М0, 5М0,2Mq. Это позволяет предполагать, что большие агрегаты, подобно агрегатам некоторых амфифильных соединений, построены из «субъединиц» (первичных агрегатов). Первичные агрегаты, сформированные за счет гидрофобных взаимодействий, объединяются между собой с помощью, главным образом, полярных взаимодействий, образуя «вторичные» структуры. В пользу подобного «вторичного» связывания, в котором могут принимать участие углеводные цепи молекулы ЛПС, может свидетельствовать диссоциация агрегатов под действием мочевины и при повышении ионной силы раствора, а также уменьшение доступности полисахаридных детерминант с увеличением размеров агрегатов.

Сравнительный анализ физико-химических свойств ЛПБК и ЛПС показывает, что основные физические свойства ЛПБК определяются ЛПС составляющей, но белковый компонент вносит заметный вклад в его макромолекулярную организацию. Об этом свидетельствуют выявленные различия между ЛПС и ЛПБК по размерам, морфологии агрегатов, их термотропному поведению и степени самоассоциации в растворе.

Физиологическая активность ЛПС и ЛПБК из Y. pseudotuberculosis

ЛПС и ЛПБК играют важную роль во взаимоотношениях бактериального патогена с организмом млекопитающих, оказывая влияние практически на все системы макроорганизма. Большая часть биологических эффектов ЛПС и ЛПБК связана с их высокой токсичностью и иммуногенностью. Как показали исследования, проведенные нами на экспериментальных животных, ЛПБК и ЛПС отличаются высокой токсичностью, сравнимой для обоих препаратов. ЛДчо

(летальная доза) для ЛПБК и ЛПС составляет соответственно 131- 142 мкг/мышь и 125-158 мкг/мышь.

Известно, что эндотоксины грамотрицательных бактерий самостоятельно инициируют агрегационную активность тромбоцитов, которым принадлежит ведущая роль в каскаде гемокоагуляционных нарушений в условиях клинической и экспериментальной эндотоксинемии. Изучение влияния эндотоксинов на тромбоциты крови выявило повреждающее действие как ЛПС, так и ЛПБК. Однако, для ЛПБК это свойство проявлялось в меньшей степени. Более того, при действии 50 мкг ЛПБК на тромбоциты крови донора было отмечено снижение суммарной степени агрегации при последовательном добавлении эндотоксина и АДФ - индуктора активации тромбоцитов.

Изучение динамики первичного гуморального ответа на введение ЛПБК и ЛПС показало, что ЛПБК обладает значительно большей иммуногенностью по сравнению с ЛПС.

Получены данные, свидетельствующие о том, что ЛПБК и ЛПС играют определенную роль в процессе фагоцитоза бактерий псевдотуберкулеза макрофагами, при этом ЛПБК усиливает поглотительную активность макрофагов в широком диапазоне концентраций, в то время как для ЛПС этот эффект проявляется только при его низкой концентрации.

Исследовано влияние молекулярной массы эндотоксинов на проявление ими ряда биологических свойств. Установлено, что ЛПБК с разной, но достаточно высокой молекулярной массой (3,6 МДа и 1,2 МДа) обладают одинаковой иммуногенностью для кроликов, в то время как субъединица ЛПБК (0,12МДа) проявляет очень низкую иммуногенность. Молекулярная масса агрегатов ЛПБК играет важную роль в проявлении токсичности. В экспериментах на мышах (с предварительным введением галактозамина, усиливающего токсический эффект) ЛД50 для ЛПБК с мол массой 12 кДа составляет 2 мкг/мышь. Уменьшение мол. массы ЛПБК на два порядка приводит к падению его токсичности в 4,5 раза.

Изучена способность ЛПС индуцировать синтез мононуклеарными клетками крови человека таких цитокинов, как фактор некроза опухоли (ФНО) и иитерлейкин-6 (ИЛ-6). ЛПС были выдержаны при разных температурах (20°С и 37°С), и их молекулярные массы при этих температурах, как было показано выше, равны 2,3 МДа и 0,35 МДа соответственно (Табл. 5). Как показали результаты (Рис. 8), инициирующая роль ЛПС в индукции клетками ФНО и ИЛ-б незначительно увеличивается по мере уменьшения его молекулярной массы.

Антигенная активность ЛПБК и ЛПС зависит от их физико-химических свойств, что видно из анализа связывающей активности эндотоксинов (инкубированных в растворе при температуре в области 5°С-55°С) с О-полисахарид-специфическими антителами. Связывающая активность ЛПБК и ЛПС, определенная с помощью РИА, существенно зависит от температуры растворения образцов, и графики этой зависимости имеют несколько точек перегиба в области 20 С-55°С (Рис. 9). Различия в активности этих антигенов соответствуют изменениям гидродинамических характеристик и морфологии их агрегатов. Уменьшение связывающей способности антигенов в диапазоне температур 10-30°С имеет место с увеличением молекулярной массы и асимметрии частиц (Табл 5.) Влияние температуры на доступность детерминант в О-антигенах при их связывании с антителами, видимо, объясняется нарушением плотности упаковки или степени экранирования углеводных Цепей в агрегатах антигенов в связи с изменением их размера, формы или структурной организации. Важным фактором,

влияющим на связывающую активность модифицированных нагреванием О-антигенов, является конформация О-цепей, которая, как известно, изменяется при термотропных структурных переходах в агрегатах. Действие этого фактора особенно сильно проявляется в крайних точках рассматриваемого температурного интервала (5°С и 55°С).

Концентрация :

I___.) 100 нг/мл

I □ 10 нг/мл С.1 ^ ] иг/мл

Л-

Рис. 8. Уровень синтеза ФНО-а клетками крови человека под действием: 1 - ЛПС, 37'С; 2 - ЛПС, 20"С. 3 - контроль (физ.р-р)

Рис. 9. Температурная зависимость О-антигенной активности ЛПБК и ЛПС

Таким образом, физико-химические характеристики ЛПС, а так же то, находится ли он в свободном состоянии или в комплексе с белком, играют важную роль в проявлении им физиологической активности. Токсичность и иммуногенность эндотоксинов во многом определяются молекулярной массой их агрегатов.

Макромолекулярное строение агрегатов ЛПС и ЛПБК оказывает существенное влияние на их связывание с антителами и, как можно предположить, с иммуноглобулиновыми рецепторами на иммунокомпетентных клетках и с другими ЛПС-связывающими белками хозяина. Таким образом, активность эндотоксинов зависит от их физического состояния и может регулироваться различными факторами, влияющими на надмолекулярную организацию ЛПС. К таким факторам могут относиться и вещества, взаимодействующие с ЛПС.

Полисахариды: получение, структура, свойства

Как известно, ряд антибиотиков, используемых при лечении инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, связываются с ЛПС, выделяемыми этими бактериями, и изменяют его макромолекулярную организацию. Антибиотики часто обладают побочным эффектом. В связи с этим актуален поиск веществ, сочетающих максимальную активность по нейтрализации токсического действия эндотоксина за счет связывания с ним, и в то же время, обладающих минимальным повреждающим эффектом на макроорганизм.

Для этих целей выбраны полисахариды морского происхождения - хитозан и каррагинан, бактерицидная и иммуностимулирующая активности которых предполагают повышение неспецифической сопротивляемости организма.

Для изучения взаимодействия биополимеров в растворах необходима характеристика взаимодействующих компонентов. В связи с этим в данной работе

две главы посвящены получению, установлению структуры и изучению физико-химических характеристик полисахаридов, используемых с целью модификации физиологической активности ЛПС.

Хитозан. Получение и свойства

Имеющиеся в литературе данные о физико-химических свойствах хитозана получены для кислых растворов полимера, что обусловлено его хорошей растворимостью при низких значениях рН. В связи с задачами, поставленными в данной работе, необходимо было изучить поведение хитозана в водных средах при рН, близких к нейтральным.

В работе использован хитозан различной степени полимеризации в виде двух образцов, полученных последовательной деполимеризацией хитина. Согласно данным ИК- и 13С- ЯМР спектроскопии исследуемые полисахариды представляют собой полимеры р- 1,4 Р-глюкозамина, в которых содержание М-ацетильных групп составляет 4%. Хитозаны были обозначены как Х-НМ и Х-ВМ и их молекулярные массы, определенные методом аналитического центрифугирования, равны 30 кДа и 130кДа соответственно. Была определена вязкость растворов хитозанов при 25°С и 37°С в двух растворителях - растворе 0,01 М фосфатного буфера/0,15 М №С1, (рН=6) и в растворе 0,1 МАсОН/0,2М №С1. Физико-химические характеристики хитозанов приведены в Табл. 6.

Таблица 6. Физико-химические характеристики хитозанов (0,01 М фосфатный буфер /0,15 М 1\'аС1, рН 6)

Вещество Ти,С [ Г1 |,мл/г 8-10-'3 М, кДа ОТо

Х-ВМ 25 160,0 1,50 130 8,1

94,0* 123*

37 120,0 1,51 8,1

Х-НМ 25 5,0 1,23 30 3,7

18,0* 20 *

37 5,3 28,0

*значения получены для раствора хитозана в 0,1МАсОН/0,2М ЫаС1

Как видно из таблицы 6, вязкость растворов хитозанов изменяется с изменением рН среды, особенно в случае Х-НМ.

Большие значения ОТо, рассчитанные для образцов хитозана, указывают на высокую степень асимметрии молекул полимеров, особенно в случае Х-ВМ. Различие в гидродинамических характеристиках Х-ВМ и Х-НМ, вероятно, связано с различной конформацией их молекул в растворе. Значения параметра а, рассчитанные из уравнения Марка-Хаувинка-Куна, позволяют предположить, что в водных растворах, близким к нейтральным (рН 6), Х-НМ представляют собой гибкие линейные макромолекулы (а= 0,7), а Х-ВМ образуют жесткие структуры (а=0,96). С увеличением температуры от 25°С до 37°С наблюдается значительный рост коэффициента седиментации Х-НМ, в то время как значение характеристической вязкости остается практически неизменным, что, вероятно, связано с изменением конформации молекул Х-НМ, которая при повышенной температуре может соответствовать форме свободно-протекаемого клубка. Физико-химические характеристики Х-ВМ практически остаются неизменными

при повышении температуры, чему, вероятно, может способствовать склонность высокомолекулярных образцов полисахарида к образованию межмолекулярных ассоциатов. Данные, полученные гидродинамическими методами, согласуются с результатами электронно-микроскопического исследования. Под электронным микроскопом в случае Х-ВМ наблюдаются длинные нити, соединенные между собой, в то время как молекулы Х-НМ имеют форму коротких стержней.

Таким образом, изучение двух образцов хитозана с молекулярной массой 130 и 30 кДа в растворах, близким к нейтральным (рН 6), позволило выявить существенные различия в конформации двух образцов полисахарида, что может отражаться при взаимодействии этого поликатиона с ЛПС.

Структура и свойства каррагинанов из водорослей Пскосагрш сппЫив, С/юпе1ги5 ртпиШия, Скопйгиз агтШих

Физико-химические и биологические свойства каррагинанов в значительной степени определяются их структурой, характеризуемой большим разнообразием. В основе стругауры каррагинанов лежит дисахаридное звено, состоящее из остатков О-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися р-1-4 и а-1-3 гликозидными связями. Структура каррагинанов зависит от вида водоросли, места ее обитания и фазы вегетации. Последнее особенно важно, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий в себя чередование вегетативного, полового и бесполого размножения.

В работе использованы каррагинаны, выделенные из наиболее распространенных в дальневосточных морях красных водорослей, представителей семейств 01§аПтасеае (Скопс1гиз ртпикши и С. агтшиа) и ТкЬосаграсеае {ТкИосагрих сгЫш), собранных в соответствии с их стадией развития -вегетативной и репродуктивной.

Исследуемые полисахариды были выделены из водорослей экстракцией водой (90°С) и фракционированы осаждением 4% КС1 на желирующие (КС1-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции, выход и характеристики которых представлены в Табл. 7. Основными моносахаридами всех фракций являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза. Согласно химической структуре желирующих типов каррагинана, построенных из повторяющихся дисахаридных звеньев этих моносахаридов, их соотношение в случае регулярности полимерной цепи должно быть равным 1. Как видно из таблицы 7, такая регулярность, в основном, наблюдается для полисахаридов из вегетативной формы водоросли.

Для идентификации полисахаридов и отнесения их к определенному типу каррагинана использовали методы 13С-ЯМР- и ИК-Фурье спектроскопии, сопоставляя все полученные спектры полисахаридов со спектрами каррагинанов известных предельных структур.

В ИК-спектрах полисахаридов желирующего типа из двух форм водоросли Т. сгШш наблюдается интенсивная полоса поглощения при 932 см" , характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 847 см'1, относящаяся к сульфатной группе при С-4 остатка 3,6-ангидрогалактозы, что позволяет отнести эти полисахариды к к-типу каррагинана. Полоса слабой интенсивности в области 893 см"1 указывает на присутствие несульфатированного остатка галактозы, что характерно как для Р-, так и а-типов каррагинанов. Отсутствие полосы поглощения

при 805 см"1, характерной для сульфатной группы при С-2 остатка З.б-ангидро-D-галактозы а-каррагинана, говорит в пользу Р-типа этого полисахарида (Рис. 10).

Таблица 7. Выход и химический анализ полисахаридных фракций, выделенных из двух форм водорослей Т. сптшз, С. ртпи1аШ$,.С агтМи^

Вид водоросли Форма водоросли фракции полисахаридов Выход (%) tía в.м Содержание (%) от сухого вещества AnGal/ Gal моль/ моль

Gal 3,6-AnGal SO42" белок

г. crinitus Вегетативная А В 16,0 5,0 33,1 37,7 30,0 5,6 20,0 27,0 5,2 10,5 1.0:1.1 1.0: 6.0

Репродуктивная- А В 30,0 7,0 39,0 33,2 25,5 7,2 15,0 26,8 7,0 7,8 1.0 : 1.4 1.0: 4.0

C.pin-nulatus Вегетативная А В 40,0 9,4 32,9 36,5 29,9 23,9 24,9 2,8 3.1 1.0: 1.1

Репродуктивная А В 20,5 18,2 40,8 35,5 38,0 22,9 27,0 4,7 5,7 1.0:1.1

C.ar-matus Вегетативная А В 30 10 32,2 39,1 32,0 2,0 18,0 26,0 1,9 2,1 1.0: 1.0

А - KCl-нерастворимая фракция полисахаридов В - KCJ-растворимая фракция полисахаридов

Анализ 13С-ЯМР спектров этих полисахаридов подтверждает данные ИК-спектроскопии. В 13С-ЯМР спектрах полисахаридов желирующих фракций из репродуктивной и вегетативной форм водоросли в области резонанса аномерных углеродных атомов наблюдаются четыре сигнала. Сигналы с 8 95.3 м.д. относятся к атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы р-типа каррагинана, а сигналы с 5 95.8 м.д. (Рис. 11) соответствуют атомам С-1 остатков 3,б-ангидро-0-галактозы к-каррагинана. Плохо разрешенные сигналы двойной интегральной интенсивности с химическими сдвигами 5 103.2 м.д. и 103.3 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 остатков галактозы к- и Д-типов каррагинанов. Спектры 13С-ЯМР полисахаридов в области относительно сильного поля также имеют типичный для к- и р-типов каррагинанов вид, но отличаются между собой соотношением дисахаридных к- и р-звеньев, что следует из интенсивности соответствующих сигналов в 13С-ЯМР-спектрах. В каррагинане из вегетативной формы водоросли преобладают дисахаридные звенья к-типа (80%), тогда как в полисахариде из репродуктивной формы их содержание примерно одинаково (3:2). Кроме того, последние содержат в небольшом количестве сульфатированные дисахаридные звенья, соответствующие предшественникам к-типа каррагинанов.

Рис. 10. ИК-спектры желирующих полисахаридов, выделенных из вегетативной (а, а') и репродуктивной (б, б') форм Т. crinitus.

13С ЯМР - спектры полисахаридов нежелирующих фракций из двух форм водоросли идентичны, но сложны для интерпретации. Для улучшения разрешения спектров эти полисахариды были обработаны NaOH. Спектры полученных продуктов содержат 12 сигналов, однако, при сравнении их со спектрами известных структур каррагинанов отнести полисахариды к определенному типу не удалось. Анализ спектров ПМР с использованием 2D экспериментов COSY, TOCSY, ROESY, позволил провести отнесение сигналов протонов мопосахаридных остатков, а использование HSQC эксперимента позволило провести С/Н корреляцию. На основании полученных и литературных данных сделан предположительный вывод, что в основе нежелирующих полисахаридов лежит повторяющееся дисахаридное звено, состоящее из р-1,3-D-галактопиранозил-2,4,-дисульфата и а-1,4-(3,6-ангидро)-0-галактопиранозида. Этот полисахарид был обозначен как каррагинан Х-типа.

По данным 13С ЯМР- и ИК- спектроскопии с Фурье-преобразованием полисахариды желирующих фракций из вегетативной и репродуктивной форм С. pinnulatus имеют идентичную структуру, относящуюся к кЛ-каррагинанам. 13С-ЯМР спектры этих полисахаридов содержат более 12 сигналов, что в целом говорит об их нерегулярной структуре. В области резонанса аномерных сигналов наблюдаются 4 различных сигнала. Двойные сигналы с 8 95.9 м.д. относятся к С1-атомам остатков 3,6-ангидро-Б-галактозы к-каррагинана, а сигналы с 6 92.7 м.д. соответствуют С1-атомам остатков З.б-ангидро-О-галактозы i-каррагинана Двойные сигналы с химическими сдвигами 103.2 и 103.1 м.д. относятся к атомам С1-остатков галактозы к- и i-типов каррагинанов. В ИК-спектрах желирующих типов полисахаридов из С. pinnulatus наблюдается интенсивная полоса поглощения при 930 см'1, характерная для 3,6-апгидрогалактозы и полоса поглощения при 848 см"1, относящаяся к сульфатной группе при С4-остатка галактозы, что позволяет отнести полисахариды к к-каррагинанам. Полоса поглощения в области 804 см"1 указывает на. присутствие сульфатной группы при С2-остатка 3,6-ангидрогалактозы, что является характерным для i-каррагинана. Таким образом, данные ИК-спектроскопии также указывают на то, что исследуемые полисахариды относятся к к/i- каррагинанам. Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты (рис.12) позволило оценить содержание к- и i-звеньев в исследуемых

каррагинанах. Расчеты, сделанные на основании соотношения площадей полос поглощения при 848 и 806 см"1, характерных для 1-каррагинана, показали, что в каррагинане из вегетативной формы водоросли содержание 1-звеньев меньше, чем из репродуктивной. Различие в соотношении дисахаридных звеньев к- и 1-типов следует также из отношения интенсивности сигналов в 13С-ЯМР-спектрах. Для полисахаридов, выделенных из вегетативной формы водоросли, это соотношение составляет 3:2, а из репродуктивной -4:1.

Рис. 11. 13С-ЯМР -спектр КС1-нерастворимой фракции полисахаридов из вегетативной формы Т. сптгиз.

Анализ результатов, полученных методом ИК-спектроскопии, позволяет предположить, что нежелирующие полисахариды из С. р'тпиЫшь являются смесью Х-типа с другими типами каррагинанов, имеющими низкое содержание 3,6-ан гидрогалактозы.

Таким образом, согласно данным ЯМР- и ИК-спектроскопии желирующие полисахариды из вегетативной и репродуктивной форм Т. спп'них и С. р1ппи1аш$ имеют структуры каррагинанов, относящихся к к/р- и кА-типам соответственно.

Желирующие полисахариды из водорослей С. агтаШз, собранных в вегетативной фазе роста, по данным ИК- и ЯМР-спектроскопии имеют более простую структуру, относящуюся к к-каррагинанам. ИК-спектр КС1-растворимых полисахаридов из С. агташя идентичен спектрам коммерческого Х-каррагинана

(фирмы «Sigma») и характерная полоса поглощения в области 824см"1 указывает на то, что исследуемые полисахариды относятся в основном к Х-типу каррагинанов.

Рис. 12. Разложение ИК-спектра КС1-нерастворимых фракций полисахаридов из вегетативной формы С. р'тпиШия на индивидуальные компоненты.

Таблица 8. Физико-химические характеристики каррагинанов из водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae

Водоросль Структур- Вегетативная ф-ма Репродуктивная ф-ма

ный тип [Т)], мл/г М, кДа И, мл/г М, кДа

С. к/1 0,48 х 10J 294 0,28 х 103 160

pinnulatus к 0,39 х I03 237 0,63 х 103 390

Т. crinitus к/р 0,62 х 103 380 0,34 х 10J 202

Х-тип 0,36 х 103 214 0,46 х 103 250

C.armatus к и/о 312

X ' н/о 246

Все параметры получены для растворов каррагинанов в 0,М NaCl.

Согласно результатам, полученным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Asipark CS-620, все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярным массам, значения которых находятся в пределах 200-500 кДа. По данным аналитического центрифугирования и вискозиметрии наибольшую средневесовую молекулярную массу имеет к/(3-каррагинан из вегетативной формы Т. crinitus (Табл.8).

При исследовании реологических свойств полисахаридов было обнаружено, что наилучшие желирующие свойства проявляют юЧ-каррагинаны из репродуктивной формы С. pinnulatus, формирующие гели высокой прочности. Анализ спектров динамической вязкости (при низкой скорости сдвига) нежелирующих типов каррагинанов показал, что полисахариды из С. pinnulatus имеют в концентрированных растворах конформацию неупорядоченного клубка ("random coil") в диапазоне температур от 20- до 65° С, в то время как для каррагинанов из Т. crinitus подобная конформация характерна только при высоких температурах.

Взаимодействие ЛПС с хитозаном

Так как известно, что токсическим центром ЛПС является липид А -анионная и амфифильная часть молекулы, то катионные амфифилы могут представлять потенциальные идеальные лиганды для детоксикацни ЛПС. В качестве специфического лиганда ЛПС нами выбран полиамин - хитозан. Этот выбор продиктован двумя обстоятельствами. Во-первых, поликатионпая природа хитозана предполагает его способность связываться с ЛПС и, возможно, нейтрализовать его токсическое действие, что открывает перспективы использования этого полиамина в терапии грамотрицательной инфекции. Во-вторых, комплексы ЛПС-хитозан могут служить удобной моделью для изучения взаимодействия бактериальных ЛПС с белками поликатионной природы млекопитающих и могут внести определенный вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС.

Как было показано выше, надмолекулярная организация агрегатов ЛПС и ЛПБК зависит от структуры эндотоксина и его концентрации, а также времени растворения ЛПС, температуры и ионной силы раствора. Следует предположить, что эти параметры могут играть существенную роль при взаимодействии ЛПС с поликатионами и, в частности, с хитозаном.

Для изучения взаимодействия эндотоксинов с хитозаном использованы несколько образцов ЛПС, которые были очищены, как описано выше. ЛПС-I и ЛПС-И, выделенные из микробной массы Y. pseudotuberculosis (серовар 1В, 598 штамм) по методу Вестфаля и Галаноса имеют среднюю степень полимеризации пентасахаридных О-специфических цепей 13 и 2, и степень ацшшрования остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты - 27% и 45% соответственно. Кроме того, в работе был использован ЛПС из Escherichia coli 055:В5 (Sigma,USA).

Исследование взаимодействия ЛПС с хитозанами проводили методами аналитического и препаративного центрифугирования, оптической и флуоресцентной спектроскопии, электронной микроскопии, а также компьютерного моделирования.

Как показали результаты, важным фактором, влияющим на связывание ЛПС с хитозаном, является температура. При смешивании исходных ЛПС и хитозана при 25°С и центрифугировании их смеси в градиенте плотности глицерина или перколла образование комплекса не обнаружено.

Aj40 А,475 А475,540

Нзмера фракций а Номера фракцш с Нэмэра фракций с

Рис. 13. Скоростная седиментация в градиенте глицерина ЛПС-1 -(а); Х-НМ-(б) и их смеси ЛПС/Х-НМ 1:5 (в/в) -(с). Исходные компоненты инкубированы при 37°С в течение 48 ч, смесь ЛПС хитозан выдержана при 37°С в течение 18 ч. Содержание N112-групп (А475) (1); ЛПС/КДО (А54о) (2).

Результаты скоростной седиментации в градиенте глицерина показали, что только предварительная инкубация при 37°С ЛПС и хитозана, а также последующая инкубация их смеси при 37°С приводит к связыванию ЛПС с хитозаном и образованию комплекса. Доказательством образования комплекса между ЛПС и Х-НМ при предварительном выдерживании каждого компонента, а затем их смеси при 37°, является совпадение максимумов кривых распределения хитозана и ЛПС в зоне одной плотности глицерина при центрифугировании (Рис. 13с).

Подтверждением образования комплекса между ЛПС и хитозаном являются данные аналитического центрифугирования. Как видно из рис. 14, наличие единственной границы седиментации характерно как для исходных компонентов, так и их смесей в диапазоне весовых соотношений ЛПС-хитозан от 1:1 до 1:5. При содержании в смеси хитозана, в 7 раз превышающем количество ЛПС (ЛПС:Х = 1:7 в/в), на седиментограмме появляется второй пик, с коэффициентом седиментации, характерным для исходного хитозана. Полное насыщение ЛПС хитозаном происходит при концентрации последнего, превышающего концентрацию ЛПС из У. рхейогиЪегыйозгз в 5 раз, а ЛПС из Е.соИ в 7 раз (при исходной концентрации ЛПС 1мг/мл).

"А

ЛПС

=0.8 . А

!А

А

Рис. 14. Седиментограмма ЛПС из У.р$еис1о1иЬегси1о$11 -а; Х-НМ - б; их смесей при соотношении ЛПС/Х-НМ 1:1 - в; 1: 5 - г;. 1:7 - д. По оси X -расстояние от оси вращения (г) и У- градиент концентрации (Зс/сЬс.

Результаты электронно-микроскопического исследования взаимодействия ЛПС с хитозаном полностью согласуются с данными, полученными методами седиментации. Добавление хитозана к раствору ЛПС при 20°С практически не изменяет ультраструктуру эндотоксина, тогда как предварительная инкубации ЛПС и его смеси с Х-НМ при 37°С свидетельствует о существенном влиянии поликатиона на морфологию ЛПС (Рис.15в, г), что проявляется в отсутствии крупных ассоциатов и лентоподобных образований, характерных для исходного ЛПС (Рис. 15 а).

Таким образом, ЛПС взаимодействует с хитозаном с образованием комплексов различной стехиометрии. Связывание ЛПС с хитозаном представляет собой сложный процесс, который является время - и температурозависимым. Существенное влияние температурного фактора на взаимодействие ЛПС с хитозаном отражает важную роль в этом процессе макромолекулярной структуры ЛПС. Вероятно, в крупных и асимметричных агрегатах ЛПС с молекулярной массой порядка 6 МДа, образующихся в растворе при температуре свыше 20°С, участки связывания на его макромолекулах недоступны для хитозана. Изменение агрегатного состояния, приводящее к 20-кратному уменьшению молекулярной массы ЛПС и обусловленное его термотропными переходами, которые, как показано выше, наблюдаются в данном температурном интервале 5 - 45°С и, вероятно, вызваны изменениями в конформации полисахаридных цепей и углеводородных цепей жирных кислот липидного фрагмента ЛПС, способствует связыванию эндотоксина с хитозаном.

Рис. 15. Электронная микрофотография: ЛПС Y. pseudotuberculosis - а; X-IIM - б; комплекс ЛПС -Х-НМ (1:1в/в, С= 1 мкг/мл) - в; комплекс ЛПС - Х-НМ (1:1 в/в, С = 250мкг/мл ) - г. Окрашивание 2% ФВК .Масштаб: 1см= ЮОнм

Комплексообразовапие хитозана с ЛПС сопровождается дальнейшей диссоциацией последнего. Дезагрегация ЛПС, наблюдаемая в процессе его связывания с хитозаном, подтверждается результатами оптической спектроскопии и аналитического ультрацентрифугирования. Молекулярная масса комплекса ЛПС-Х-НМ, по данным метода Арчибальда, составляет 160 кДа, в то время как молекулярная масса ЛПС, выдержанного при 37°С, равна 300 кДа.

Взаимодействие ЛПС с хитозаном приводит к образованию комплексов различной стехиометрии от 1:1 до 1:5 в случае ЛПС из Y. pseudotuberculosis и 1:1 до 1:7 для ЛПС из Е. coli. Эти комплексы получены при высокой концентрации ЛПС (выше 1 мг/мл) и характеризуются его низким содержанием (как следует из расчетов, на 1 моль ЛПС приходится свыше 200 остатков D-глюкозамина в хитозане для комплекса ЛПС-ХН 1:5в/в).

Метод флуоресценции, позволивший изучить комплексообразовапие в области низких концентраций полимеров, показал, что кажущаяся стехиометрия комплексов ЛПС-хитозан, рассчитанная в точке насыщения, не является постоянной величиной, а зависит от концентрации взаимодействующих компонентов в растворе. Как показали расчеты, в комплексах ЛПС-хитозан, полученных при концентрации хитозана 20, 50 и 100 мкг/мл, 1 моль ЛПС приходится на каждые 14, 17 и 22 остатка D-глюкозамина в молекуле хитозана. Таким образом, чем меньше концентрация ЛПС, тем больше его связывается с хитозаном при образовании комплекса. Электронно-микроскопическое изучение

препаратов ЛПС и их комплексов с хитозаном подтверждает влияние концентрации полимеров на структуру изучаемых комплексов. При низких концентрациях взаимодействующих компонентов (250 мкг/мл) полученные комплексы выглядят как морфологически однородные сферические частицы с диаметром 7-12 нм (Рис 15г). С увеличением концентрации до 1 мг/мл наблюдается образование комплексов различной морфологии: сферических частиц, тонких нитей (Рис. 15в). Такая зависимость стехиометрии комплексов от концентрации определяется, видимо, агрегатным состоянием ЛПС, которое, как было показано выше, зависит от концентрации его в растворе.

Методом компьютерного моделирования проведена количественная оценка взаимодействия ЛПС с хитозаном. Для этих целей был использован полуэмпирический квантово-химический метод АМ, позволяющий оптимизировать молекулярные конфигурации и находить энергию взаимодействия. Как показали расчеты, комплекс, образующийся при связывании хитозана с ЛПС, характеризуется равновесным расстоянием, равным 0.17 нм, между взаимодействующими центрами и энергией связи 0.5 эВ. Среди трех анионных связующих центров на молекуле ЛПС (карбоксильная группа на остатке КДО- и фосфатные группы на невосстанавливающем и восстанавливающем концах липида А) два оказались слабо активными. Расчетные данные указывают на то, что наиболее вероятным является участие в связывании только одного фосфата, находящегося в первом положении глюкозамина, в то время как взаимодействие на двух других отрицательно заряженных группах энергетически не выгодно. Результаты, полученные нами методом коллоидного титрования, согласуются с этим предположением.

Так как взаимодействие между ЛПС и хитозаном происходит при участии заряженных групп, то значение рН среды, определяющее степень ионизации этих групп, оказывает существенное влияние на процесс комплексообразования. Было установлено, что комплексы образуются в интервале рН от 4.0 до 7.0 и сохраняют стабильность в диапазоне ионной силы раствора от 0.2 до 1М №С1.

Данные изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности СзС1, приведенные на Рис. 16, показывают, что в условиях высокой ионной силы комплекс ЛПС-хитозан (с плотностью 1,41 г/см3) сохраняется.

Плотность СвС!, 1,43 рем' г/см!

0,4 0,2-

ПхгтностъСБО,

О 2 4 6 8 10 12 14 16 Номера фракций

1,45 пои5

Плотность СвС1, г/см1

/

\

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Номера фракций

О 2 4 6 8 10 12 14 16

НомЕра

а В С

Рис. 16. Изоплотностное центрифугирование в градиенте СбО: а - Х-НМ; б-ЛПС-1; в- ЛПС-1/Х-НМ (1:5 в/в). Содержание ОТ^-групп (А475) (1); ЛПС/КДО (А54о) (2).

Устойчивость комплекса в условиях высокой ионной силы позволяет предполагать, что в его образовании наряду с электростатическим взаимодействием, принимают участие водородные связи. Действительно,

результаты влияния мочевины как на процесс формирования комплексов ЛПС с X-ВМ, так и на их стабильность подтвердили это предположение.

Полученные данные позволяют предположить, что на молекуле ЛПС имеется несколько участков связывания с хитозаном. Одна группа мест связывания локализована преимущественно в области кор-липид А и отвечает за ионные взаимодействия, а на других участках взаимодействие осуществляется за счет водородных связей.

С целью изучения механизма взаимодействия между ЛПС и хитозаном было исследовано влияние структуры ЛПС и молекулярной массы хитозана на процесс образования комплексов. Определение параметров связывания ЛПС с хитозанами проводили в 0.005М фосфатном буфере (рН 5,0), используя ЛПС со степенью полимеризации О-специфического полисахарида 24 (ЛПС -III), и ЛПС, лишенный О-специфических цепей (R-ЛПС), наряду с уже описанными образцами ЛПС-I и ЛПС-П из Y. pseudotuberculosis (серовар 1В, 598 штамм). Для определения констант связывания ЛПС с Х-НМ и Х-ВМ был использован метод конкурентного связывания эндотоксина с комплексом хитозан/анионный краситель - тропеолин ООО: натриевая соль-2 [4-(2-гидрокси-1-нафто-)бензолсульфокислоты]. Метод основан на вытеснении красителя из его комплекса с хитозаном с помощью ЛПС с последующей регистрацией высвободившегося тропеолина.

С помощью графиков Скэтчарда и Хилла были определены константы связывания хитозанов с ЛПС, значения которых представлены в Табл. 9.

0,10-

0,05-

0,00-

0,0

Д2 AD

Ц4

0,00-

ОД6

ftOOl

-6-.Э • •А- 4

ч

л.

00

02

03

Рис.17. Графики Скэтчарда для связывания ЛПС с хитозанами. Х-НМ (а), где 1 -Я-ЛПС; 2 - ЛПС-1; 3 - ЛПС-П; 4 - ЛПС-Ш; Х-ВМ (б), где 1 - К-ЛПС; 2 - ЛПС-1; Х-ВМ (в), где 3 - ЛПС-П; 4 - ЛПС-3. Комплекс хитозан-тропеолин титровали раствором ЛПС. Поглощение определяли при длине волны 483 нм. С-концентрация внесенного ЛПС, ДЭ-разница оптического поглощения раствора хитозан-тропеолина до и после внесения ЛПС

Из кривых насыщения была определена концентрация ЛПС, соответствующая точке насыщения хитозана эндотоксином, и на основании этого было рассчитано число мест связывания в точке насыщения. Как показал анализ графиков Скэтчарда, на процесс формирования комплекса влияет как структура ЛПС, так и молекулярная масса хитозана. Линейный график Скэтчарда (Рис. 17а) представляющий данные по связыванию ЛПС с Х-НМ и комплексов Х-ВМ с Я-ЛПС и ЛПС-1 (Рис. 176) предполагает отсутствие кооперативное™ в процессе взаимодействия и то, что в этом процессе участвует один тип мест связывания. Значения коэффициентов кооперативности, определенные из графика Хилла, близки к единице, что согласуется с этим предположением (Табл. 9). В то же время для системы Х-ВМ и ЛПС с длинной О-специфической цепью (ЛПС-1 и ЛПС-Ш) график Скэтчарда (Рис. 17в) имеет вид вогнутой кривой, что может быть

следствием как наличия двух типов мест связывания (высоко- и низкоаффинных), так и отрицательной кооперативности.

Наличие двух независимых участков связывания на молекуле хитозана представляется маловероятным, поскольку поликатион содержит только аминогруппы с преимущественно одинаковым окружением. Поливалентность лиганда (ЛПС), предполагающая, что две константы связывания могут соответствовать взаимодействиям неэквивалентных отрицательно заряженных групп ЛПС с хитозаном, также не представляется состоятельной, поскольку во всех ЛПС, используемых в эксперименте, число и природа таких групп, которые потенциально могут связываться с поликатионом, одинакова, и наблюдаемые различия в форме кривых не могут быть объяснены в рамках вышеназванной модели. Кроме того, полученные нами данные компьютерного моделирования взаимодействия ЛПС-хитозан показали, что наиболее вероятно связывание только с одним фосфатом в первом положении глюкозамина, в то время как взаимодействие с другими отрицательно заряженными группами энергетически невыгодно. Таким образом, вогнутый характер графиков Скэтчарда для связывания ЛПС-Н и ЛПС-Ш с Х-ВМ может быть результатом антикооперативного взаимодействия. При оценке числа мест связывания на ЛПС, наблюдается следующая закономерность: с увеличением длины О-цепи уменьшается количество мест связывания на эндотоксине в расчете на мономерное звено хитозана. Этот факт можно объяснить тем, что длинные О-цепи, с одной стороны, могут частично экранировать участки на молекуле ЛПС, которые отвечают за связывание (отрицательно заряженные группы кора и липида А), а с другой стороны, могут создавать пространственные затруднения при связывании лигандов на соседних сайтах.

Выявленные зависимости Касс и стехиометрии комплексов от размера О-цепи ЛПС справедливы для обоих образцов хитозана. Однако ВМ-Х связывает в точке насыщения меньше ЛПС в расчете на мономерное звено и с меньшей аффинностью, чем НМ-Х. Наблюдаемое различие в способности двух хитозанов связываться с ЛПС, по-видимому, обусловлено не только разной степенью полимеризации поликатионов, но и различиями в конформации их молекул.

Таблица 9. Параметры связывания ЛПС с хитозанами

Комплекс Кс-Ю' Кс-101 Кс10> А коэф- Число моль

моль/л моль/л моль/л фициент ЛПС на 1

(Скэтчард (Хилл) (среднее Хилла МН2-группу

значение хитозана

Х-НМ

Я-ЛПС 0,759 0,791 0,775 1,020 0,26

ЛПС-1 1,015 1,009 1,012 1,000 0,19

ЛПС-П 1,840 1,753 1,797 0,9748 0,11

ЛПС-Ш 5,930 6,015 5,973 1,016 0,04

Х-ВМ

Я-ЛПС 0,331 0,326 0,329 1,000 0,17

ЛПС-1 0,617 0,594 0,606 0,997 0,13

ЛПС-П - 0,504 - 0,929 0,09

ЛПС-Ш - 2,820 - 0,974 0,05

Порядок констант связывания (105 моль'1) согласуется со значениями этих параметров, приводимыми другими авторами для комплексов ЛПС с полимерами катионпой природы.

Таким образом, ЛПС взаимодействует с хитозаном с образованием стабильных комплексов различной стехиометрии. Процесс связывания отражает общий принцип взаимодействия эндотоксинов с поликатионами и зависит от таких факторов, как температура, рН и ионная сила раствора, структура ЛПС и степень полимеризации хитозана. Макромолекулярная структура ЛПС играет важную роль в процессе взаимодействия.

Сравнительная характеристика физиологической активности ЛПС и его комплекса с хитозаном

Как было показано выше, взаимодействие ЛПС с хитозаном прежде всего, осуществляется через область липида А, который ответственен за многие биологические свойства эндотоксина, включая токсичность, в связи с чем следовало ожидать изменение различных видов активности ЛПС.

Сравнительное изучение токсичности комплексов ЛПС-хитозан различного состава (1:5, 1:1, 5:1 в/в) показало, что токсичность падает с уменьшением отношения ЛПС:хитозан, и самой низкой токсичностью обладает комплекс состава 1:5 (в/в). В таблице 10 приведена острая токсичность ЛПС их комплексов с X-IIM и Х-ВМ (1:5 в/в), определенная на мышах линии BALB, в присутствии галактозамина и актиномицина, которые, как известно, увеличивают токсичность ЛПС и используются в экспериментах in vivo. Как видно из данных (Табл.10), токсичность ЛПС из У. pseudotuberculosis и Е. coli в комплексе с хитозаном снижается с галактозамином в 7,5 и 5 раз, а с актипомиципом - в 5,5 и 12,5 соответственно.

Таблица 10. Токсичность ЛПС и его комплексов с хитозаиами 1:5 (в/в)

Вещество LD50 (мкг на 1 мышь) при введении с галактозамином LD5o (мкг на 1 мышь) при введении с актиномиципом D

ЛПС У. pseudotuberculosis 0,059 0,28

ЛПС У. pseudotuberculosis -Х-ВМ (1:5 в/в). 0,447 -

ЛПС У. pseudotuberculosis -X-IIM (1:5 в/в). - 1,50

ЛПС Е. coli 0,034 0,20

ЛПС Е. coli - Х-ВМ (1:5 (в/в). 0,170 -

ЛПС Е. coli - Х-НМ (1:5 в/в). - 2,50

Известно, что ЛПС, являясь иммуностимуляторами, запускают процесс синтеза клетками иммунной системы различных цитокинов, включая ФИО и интерлейкииы. Была изучена способность ЛПС в составе комплексов с хитозаном вызывать индукцию ИЛ-8 и ФНО клетками иммунной системы человека. ЛПС в комплексе с хитозаном не потерял способности индуцировать продукцию ИЛ-8 и ФНО in vitro. Однако в результате комплексообразования активность ЛПС из E.coli в отношении синтеза ФИО снижается более чем в 2 раза (Рис. 18а). ЛПС как

из У. pseudotuberculosis, так и из Е. coli при взаимодействии с хитозаном частично теряет способность к синтезу ИЛ-8 на 20% и 70% соответственно (Рис.18 в)

Для изучения механизма изменения цитокин-индуцирующей активности ЛПС под действием хитозана были проведены эксперименты с использованием трансфицированных эмбриональных клеток почек человека (НЕК 293), содержащих TLR4 рецепторы, через взаимодействие с которыми ЛПС активирует синтез цитокинов.

;

. т

íf;-"i 1 •

Ж

Jig Т

250200150100500-

[ 2 Сппс = 10 мкг/мл, Сх н = 50мкг/мл С = 0.5 мкг/мл. С = 2.5мкг/мл

Рис. 18. Влияние ЛПС Е. coli (1), хитозана Х-НМ (2) и их комплексов ЛПС/Х-НМ 1:5 (3) на способность индуцировать клетками: а - ФНО, в - ИЛ-8

1 10 100 10 Концентрация ЛПС, нг/мл

^т тс ЛПОХ-ВМ; ЛПОХ-HVI

Рис. 19. Индукция ИЛ-8 НЕК 293 клетками, трансфицированными TLR4/MD2, под действием ЛПС из Е. coli и его комплексов с хитозанами (1:5 в/в)

Как показали результаты, ни Х-ВМ, ни Х-НМ не способны активировать синтез ИЛ-8 дикими НЕК 293 клетками или НЕК 293 клетками, трансфицированными с TLR4/MD2, и ни один из образцов хитозана не стимулирует активацию синтеза ИЛ-8 через TLR3 в НЕК 293 клетках. Сравнительный анализ сигнальной индукции через TLR4 в НЕК 293 клетках под действием ЛПС и комплексов ЛПС-Х-НМ и ЛПС-Х-ВМ ( 1:5 в/в) показал, что комплекс ЛПС-Х-ВМ очень слабо стимулирует индукцию ИЛ-8 этими клетками, а комплекс ЛПС-Х-НМ стимулирует синтез этого интерлейкина подобно чистому ЛПС (Рис. 19). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что хитозан индуцирует синтез цитокинов независимо от TLR и не блокирует TLR4 рецептор для связывания с ЛПС и ЛПС - сигнальной индукции в клетках. Таким образом, уменьшение способности ЛПС в составе комплекса индуцировать синтез цитокинов не связано с ингибированием хитозаном взаимодействия ЛПС с TollLike рецепторами.

Изучена модификация иммунобиологических свойств ЛПС при образовании им комплекса с хитозаном. В комплексе с хитозаном ЛПС сохраняет иммуностимулирующее действие, при этом в сравнении со свободным ЛПС,

комплекс более эффективно стимулирует фагоцитарные функции макрофагов, увеличивая их способность к поглощению бактерий псевдотуберкулеза. ЛПС, связанный с хитозаном, теряет способность частично подавлять реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ).

Возможность ослабления повреждающего действия ЛПС на клетки крови при комплексообразоваиии с хитозаном была изучена при определении агрегационной способности тромбоцитов здорового человека под действием различных доз ЛПС из E.coü, Х-НМ и комплекса ЛПС - Х-НМ. Полученные результаты показали, что хитозан является протектором клеток от такого сильного индуктора агрегации тромбоцитов, как АДФ. Инкубация тромбоцитов в течение 5 мин с комплексом ЛПС-Х-НМ (1:5 в/в) в концентрациях 16 и 160 мкг/мл приводит к достоверному снижению степени агрегации на 5% и 8%, соответственно, по сравнению с контролем и на 14% и 11% - по сравнению с суммарной степенью агрегации, вызванной ЛПС и АДФ.

Каррагинаны - ингибиторы токсического действия ЛПС

Известно, что ЛПС бактерий определяют функциональную активность иммунной системы всего организма в целом, а гиперреакция иммунной системы на компоненты бактериальной стенки, в том числе ЛПС, лежит в основе многих воспалительных заболеваний кишечника. Общепризнано, что эффективность иммунитета в какой-то мере зависит от особенностей питания, а пищевые волокна, к которым относится и каррагинан, усиливают процессы иммунной защиты. Особая роль каррагинанов состоит в том, что они широко представлены в диете, и допустимое потребление этого полисахарида составляет в среднем 250 мг в день на человека.

Изучена возможность использования каррагинанов в качестве препаратов, модифицирующих биологическую активность ЛПС. Так как проявление активности каррагинанов определяется их структурным типом и его физико-химическими свойствами, были использованы каррагинаны нескольких структур, выделенные и охарактеризованные, как описано выше.

В экспериментах in vivo было установлено, что каррагинаны повышают резистентность мышей к токсическому действию ЛПС. Анализ проведенных экспериментов показал, что к- и к/ß- каррагинаны оказывают защитный эффект на животных, что выражается в увеличении процента выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, по сравнению с контрольной группой. Степень защиты зависит от структурного типа каррагинана, концентрации и времени его воздействия. Наилучший защитный эффект наблюдается при предварительной обработке мышей к-каррагинаном. При внутрибрюшипиом введении к-каррагинана мышам за 7 дней до инъекции ЛПС, а также при инъекции смеси ЛПС с каррагинаном смертность животных была ниже, чем при введении этого каррагинана в тех же дозах за 24 часа до инъекции ЛПС. Токсичность ЛПС, рассчитанная на основании экспериментальных данных, снижается почти в 2 (б/п мыши) и 1,5-2 раза (мыши линии Balb/C) в случае предобработки мышей каррагинаном (Табл.11).

Таблица 11. Токсичность ЛПС с к-каррагинаном

Тип мыши LD so ЛПС, мкг/мышь £05оЛПС мкг/мышь (каррагинан за 7 дней до ЛПС) LD jo ЛПС мкг/мышь (смесь ЛПС и каррагинана)

Инбредные 0,65 1,9 1,3

Balb/c 0,4 0,6 -

Препараты, ингибирующие токсическое действие эндотоксинов, могут быть протекторами тромбоцитов в условиях эндотоксинемии. Действительно, при предварительной инкубации к- и Х-каррагинанов с тромбоцитами донора, наблюдалось достоверное снижение степени АДФ-индуцированной агрегации: на 37,8% (р<0,05) при действии к- и на 33,7% (р<0,05) Х-каррагинана.

Непосредственное введение ЛПС из S. typhimurium (200 мкг/мл) в плазму, обогащенную тромбоцитами, с дальнейшим добавлением АДФ приводит к увеличению степени агрегации тромбоцитов до 109,5% (р< 0, 05), в то время как предварительное введение каррагинана в богатую клетками плазму отменяет этот эффект, и степень агрегации тромбоцитов в этом случае снижается до 80%. Предварительная инкубация тромбоцитов с каррагинанами (как к-, так и Х-типов ) снижает величину АДФ-агрегации в условиях действия на клетки ЛПС из E.coli в среднем на 15%, что также свидетельствует о выраженных защитных свойствах этого полисахарида.

Для изучения механизма ингибиторного действия каррагинана на токсичность ЛПС в опытах irt vivo была определена способность каррагинана и его смесей с ЛПС (1:1 в/в) индуцировать синтез цитокинов в иммунокомпетентных клетках.

1 2 3 4 5 6

Рис. 20. Индукция синтеза ИЛ- 6 под действием: 1-ЛПС; 2,3 -смеси ЛПС с к- и к/р -кар-рагинанами; 4,5- к- и к/р -каррагинанами; 6- контроль (физ.р-р)

20С

Ьй

оо 15С

ч

К ЮС

50

Концентрация: 1 1100 нг/мл I I 10 нг/мл

t'.4'""" I ] нг/мл

J HflH 0 нг/мл

Й J L Г3-» ГП

Рис. 21. Индукция синтеза ИЛ-8 НЕК 293 клетками, трансфици-рованными TLR4/MD2, под действием: 1 - ЛПС; 2 - к-кар-на (10 нг/мл); 3 - смеси к -кар-н/ЛПС 1:1, (10 нг/мл); 4 - Х-кар-на (10 нг/млV 5 - смеси Х-кап-н/ЛПС 1:1.

При изучении действия каррагинанов и их смесей с ЛПС на способность к индукции ФИО мононукпеарными клетками человека было установлено, что к- и X-каррагинаны индуцируют дозозависимый синтез ФИО, подобно ЛПС, но в значительно меньшей степени, чем ЛПС. Способность ЛПС в смеси с к-каррагинаном влиять на синтез ФИО зависит от исходной концентрации ЛПС. Действие к/р-каррагинана на синтез клетками ФИО является очень слабым, а активность ЛПС в смеси с к/ß -каррагинаном сопоставима с действием исходного ЛПС.

Сравнительный анализ способности ЛПС и его смеси с каррагинанамн индуцировать синтез ИЛ-6, который согласно последним данным относится к противовоспалительным медиаторам, показал увеличение активирующего действия ЛПС на продукцию ИЛ-б при его смешивании с к- и к/ß- каррагинанамн (Рис. 20).

Эксперименты с использованием трансфицированных клеток почек человека, экспрессирующих ряд TOL-Like рецепторов, свидетельствуют о том, что активация клеток каррагинаном происходит через специфические для ЛПС рецепторы, в большей степени TLR2 и TLR4. к-Каррагинан менее эффективно активирует клетки, экспрессирующие рецепторы TLR4, но в комбинации с ЛПС его способность индуцировать синтез ИЛ-8 возрастает очень существенно (Рис.21). Для Х- каррагинана это свойство выражено незначительно. Таким образом, цитокин-индуцирующая активность каррагинана может вносить важный вклад в его способность модулировать токсические свойства ЛПС.

Модификация биологических свойств ЛПС в присутствии каррагинана может быть обусловлена как самостоятельным иммуномодулирующим эффектом каррагинана, так и результатом взаимодействия полисахарида с ЛПС. Была оценена возможность неспецифического взаимодействия каррагинана с ЛПС методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электронной микроскопии. Для этих целей использованы ЛПС из Е. coli, к/i-, к/ß- и X-каррагинаны из вегетативных форм водорослей С. pinnulalus, T.crinitus и C.armalus соответственно, и их смеси ЛПС/ каррагинан 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:3 (в/в), полученные при 20°С и инкубированные при комнатной температуре или при 37°С в течение 48 часов.

Результаты, полученные методом ВЭЖХ, свидетельствуют об изменении молекулярно-массовых характеристик каррагинана и ЛПС при их смешивании, что следует из анализа профилей выходных кривых этих полимеров на хроматографической колонке Asipark CS-620. Как видно из рис.22, время выхода каррагинана в смеси ЛПС/каррагинан сдвигается в сторону уменьшения (с 16.2 до 14.5 min), что свидетельствует об увеличении его молекулярной массы. При этом площадь пика, соответствующего ЛПС, уменьшается, что может быть результатом перехода части вещества в область меньших молекулярных масс. С увеличением количества каррагинана в смеси (при прежней концентрации ЛПС) площадь пика, соответствующего ЛПС (12 min), существенно уменьшается. При двукратном избытке каррагинана (соотношение ЛПС/каррагинан 1:2 в/в) выходные кривые представлены практически одним пиком, время выхода которого (15,6 min) соответствует веществу с молекулярной массой, промежуточной между значениями молекулярных масс каррагинана и ЛПС.

Рис. 22.. Профили выходных кривых, полученные ВЭЖХ на колонке Asipark CS-620, для : а ЛПС ; б - кА-каррагинана; в,г - смесей ЛПС и кЛ-каррагипана (1:1 в/в - в, и 1:2 - г). Растворитель 0.1М NaCI

Полученные данные позволяют предположить наличие неспецифического взаимодействия между ЛПС и каррагинаном, приводящего к изменению их физико-химических характеристик. Подобная картина наблюдается и при смешивании ЛПС с к/р-каррагинаном, молекулярная масса которого больше, чем у кЛ-каррагинана. Следует отметить, что анализ хроматограмм, полученных для смеси Х-каррагинапа с ЛПС, был затруднен и не укладывался в схему, наблюдаемую в случае к- и к/ß- каррагинанов.

Для изучения влияния каррагинана на ультраструктуру ЛПС было проведено сравнительное электронно - микроскопическое исследование каррагинана, ЛПС и их смеси. Как показали результаты, к- и к/р-каррагинаны образуют упорядоченные объемные сотообразные структуры, похожие на кристаллическую решетку. ЛПС из Е. coli при 20°С проявляет полиморфизм и образует ламеллярные лентоподобные и мембраноподобные структуры. При выдерживании смеси каррагинана с ЛПС 48 часов при 20°С лентоподобные структуры не обнаруживаются, и вместо упорядоченной сетки, характерной для каррагинана, видна рыхлая сетчатая структура, перекрученная в различных местах, внутри которой наблюдаются частицы различных форм. Изменение морфологии как ЛПС, так и каррагинана при их смешивании может быть результатом их взаимодействия.

Хотя трудно представить, что ЛПС, несущий на своей поверхности отрицательный заряд, и каррагинан, относящийся к полианионам, будут взаимодействовать друг с другом, однако полученные результаты свидетельствуют о взаимном влиянии этих полимеров на физико-химические характеристики друг друга, что не исключает наличия такого взаимодействия с учетом нескольких факторов.

Рис.23. Электронная микроскопия ЛПС из Е. соИ - а; к/р-каррагинан - б; к -каррагинана - в; смеси ЛПС и к/р-каррагинана (1:1 в/в) - г. Окрашивание 2% ФВК. Масштаб: 1см=100нм

Прежде всего, следует обратить внимание на то, что в к- и к/р-каррагинанах, используемых в эксперименте, содержание сульфатных групп невелико (одна сульфатная группа на дисахаридное звено в к- и, в среднем, два дисахаридных звена в к/р-каррагинанах). Кроме того, наличие ионной силы (связывание происходит при физиологических условиях, в 0,1 М растворе ИаС1) обеспечивает снижение электростатического отталкивания и возможность межмолекулярной ассоциации. Такая межмолекулярная ассоциация, характерная для этих типов каррагинанов, приводящая к формированию двойной спирали и к экранированию отрицательных зарядов, прежде всего может проявляться в растворах к- и кЛ-каррагинанов в присутствии ионов Ыа. При исследовании взаимодействия каррагинанов с фосфолипидными бислоями (димиристоилфосфатидилхолином) в растворах различной ионной силы было показано, что ассоциаты каррагинанов могут адсорбироваться на поверхности бислоя, а во взаимодействии кислых полисахаридов с липидными нейтральными монослоями могут принимать участие гидрофобные и водородные связи. Организация в полисахаридах гидрофобных доменов, обусловленная конформацией полимерной цепи, выявлена для таких полисахаридов, как хитозан. Сопоставление этих литературных данных и собственных результатов, приведенных выше, позволяет говорить о взаимодействии каррагинана с ЛПС. Можно предположить, что это взаимодействие имеет неспецифический характер и осуществляется как за счет адсорбции каррагинана на поверхности агрегатов ЛПС, так и за счет водородных и гидрофобных связей. Наблюдаемая на электронных фотографиях упорядоченная структура к- и к/р-каррагипанов в присутствии ЛПС принимает форму рыхлой сетки, что может быть результатом их взаимодействия. Необходимо отметить, что

>.-каррагинан, цепи которого не образуют двойных спиралей, вероятно, не может создавать дополнительных связей с ЛПС. Кроме того, в Х-каррагинане плотность сульфатных групп довольна высока, что может, в свою очередь, препятствовать его взаимодействию с ЛПС за счет сил электростатического отталкивания.

Влияние каррагииана и хитозана на неспецифическую резистентность организма при ЛПС - индуцированной эндотоксинемии

Общеизвестно, что эндотоксины, кроме специфических, также вызывают ряд неспецифических патофизиологических изменений систем организма. В связи с тем, что токсическая активность ЛПС при его избытке, когда возможности защитных систем организма истощены, проявляется в острых или вялотекущих воспалительных процессах, было изучено профилактическое действие каррагинана и хитозана на неспецифическую резистентность организма мышей при бактериальной интоксикации, которую моделировали внутрибрюшинным однократным введением ЛПС Е.соИ в дозе 1 мг/кг. Предварительно в течение 5 дней мыши внутрижелудочно, один раз в сутки получали хитозан или каррагинан в дозе 100 мг/кг. Эвтаназию животных осуществляли через сутки после введения ЛПС. Изменение биохимических и патоморфологических показателей свидетельствует о выраженной стресс-реакции мышей на введение ЛПС (Табл. 12).

Таблица 12. Влияние хитозана и каррагинана на некоторые показатели стресс-реакции мышей при интоксикации ЛПС.

Показатель Группы животных

Норма ЛПС ЛПС + хитозан ЛПС+каррагинан

МАССА ОРГАНОВ

Тимус, мг/100г м/т 130,2+5,2 90,4+3,9 120+5,8 110,2+4,0

Надпочечник 15,4+0,31 18,0+0,52 15,8+0,42 14,3+0,62

Мг/100м/т

СЫВОРОТКА КРОВИ

Кортикостерон 0,30+0,02 0,41+0,03 0,33+0,02 0,35+0,02

мкмоль/л

ПЕЧЕНЬ

Гликоген мкмоль/г 215,3+10,8 146,6+8,2 188,8+11,6 178,5+10,2

Лактат мкмоль/мг 1,48+0,07 1,97+. 11 1,52 + 0,12 1,65 +0,10

МДА нмоль/мг 5,2+ 0,28 7,1+0,53 6,0 +0,42 6,4+0,38

Биохимические и патоморфологические показатели, представленные в таблице 12, свидетельствуют о том, что организм под влиянием хитозана и каррагинана способен гораздо успешнее противостоять токсическому действию бактериального эндотоксина. Оба полисахарида проявляют при этом сходное фармакологическое действие. На уровне целостного организма впервые показано, что хитозан и каррагинан оказывают влияние на ряд неспецифических процессов, характерных для ответа организма на ЛПС - индуцируемую эндотоксинемию.

Использование каррагинана в терапии пищевых токсикоинфекций.

Медико-биологические испытания

В странах ЕЭС, США, Японии каррагинан признан полезным и безопасным веществом и разрешен для применения в качестве пищевой добавки Экспертным комитетом по пищевым добавкам ВОЗ. Нами разработаны и утверждены Приморским центром Гос. Комитета РФ по стандартизации, метр'ологии и сертификации ТУ (№9284-037-02698170-99) на получение каррагинана из водоросли С.агтаШь в качестве пищевой добавки. Наличие такого документа, а также согласие Этического комитета ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ позволило провести изучение терапевтического эффекта к-каррагинана на течение пищевых токсикоинфекций (ПТИ) сальмонеллезной этиологии на базе 2-ой Клинической инфекционной больницы Москвы.

Известно, что при ПТИ развивается диссеминированное внутрисосудистос свертывание (ДВС-синдром) со значительным повреждением тромбоцитов. Было исследовано влияние каррагинана на тромбоциты больных ПТИ. Введение ЛПС из 5. 1урЫтигшт в обогащенную тромбоцитами плазму больного на фоне АДФ, вызывает существенную, по сравнению с донорами, активацию клеток (до 133%). Предварительное введение каррагинана в плазму больного перед добавлением ЛПС и АДФ ингибирует активирующее действие ЛПС, практически отменяет его. В этом случае агрегация тромбоцитов составляет 103% (за 100%-ную норму принята АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов больных). Последние данные имеют особый практический интерес, так как показывают возможность защиты каррагинаном тромбоцитов больных различными бактериальными инфекциями.

Пероральное введение каррагинана с раствором хлосоль в дозе 150мг/сутки в 3 приема в течение первых двух суток терапии проведено 49 больным ПТИ. Контрольную группу (31 человек) составили больные, получавшие базовую терапию (солевые растворы) без каррагинана. Результаты оценивали по данным клинического течения болезни и параметрам систем гемостаза и иммунитета.

Пероральное введение каррагинана больным с ПТИ на фоне стандартной терапии более активно, по сравнению с контрольной группой, восстанавливает систему гемостаза. При этом действие препарата носит модулирующий (регуляторный) характер: у больных с гиперкоагуляцией отмечается снижение агрегационной активности тромбоцитов, в среднем, на 65% (р<0,01), а у больных с гипокоагуляцией степень агрегации возрастает на 22% (р<0,001).

Действие каррагинана на иммунный статус оценивалось по изменению следующих показатели: общий лейкоцитоз, процентное сокращение и абсолютное количество лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов; количество эритроцитов, общее содержание гемоглобина и гематокрита, средний объем эритроцитов, среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроцитах группы пациентов, получавших каррагинан. На четвертые сутки лечения наблюдается снижение лейкоцитоза, увеличение процентного и абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови, рост содержания общей популяции Т-лимфоцитов (СОЗ+), иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (СБЗ+/СВ4+ и С03+/С08+); уменьшение количества активированных клеток до нормальных значений. В контрольной группе больных эти показатели не восстанавливаются за данный период. Достаточно быстрое восстановление показателей иммунной системы при приеме каррагинана, вероятно, обусловлено его иммунорегуляторными свойствами.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о положительном эффекте каррагинана на функциональную активность тромбоцитов в условиях эндотоксинемии у больных ПТИ сальмонеллезной этиологии. Отмечено также корригирующее влияние препарата на некоторые биохимические показатели, характеризующие состояние гомсостаза, и на восстановление статуса иммунной системы у исследуемых больных.

Полученные в результате проведенного исследования данные позволяют надеяться на эффективное использование каррагинана в комплексной терапии различных форм бактериальных инфекций и эндотоксинемии.

ВЫВОДЫ

1. Из бактерий Y. pseudotuberculosis выделены два эндотоксина - ЛПС и ЛПС — белковый комплекс (ЛПБК). Установлено, что в составе комплекса ЛПС имеет в среднем более длинную О-специфическую углеводную цепь, по сравнению с ЛПС, свободным от белка. Эта закономерность становится более выраженной при низкой температуре культивирования бактерий Y. pseudotuberculosis .

2. Показано, что в водных растворах ЛПС и ЛПБК формируют высокомолекулярные и полидисперсные агрегаты, размеры, форма, ультраструктура и молекулярно-массовое распределение которых зависят от концентрации полимера, ионной силы и температуры раствора. Определены их физико-химические характеристики и изучено поведение в растворах. В надмолекулярной организации ЛПС и ЛПБК участвуют ионы двухвалентных металлов, водородные связи и гидрофобные взаимодействия.

3. Физико-химические и биологические свойства ЛПБК в основном определяются ЛПС-составляющей. Белковому компоненту также принадлежит важная роль в структурной организации комплекса и проявлении его физиологической активности. Надмолекулярные структуры ЛПС и ЛПБК оказывают заметное влияние на их физиологическую активность.

4. Впервые изучено взаимодействие в растворах ЛПС с хитозаном на молекулярном уровне и показана важная роль надмолекулярной структуры ЛПС в этом процессе. Установлено влияние температуры, рН, ионной силы раствора, а также структурных особенностей ЛПС и степени полимеризации хитозана на их взаимодействие.

5. Определены параметры связывания ЛПС с хитозаном. Установлено, что ЛПС образуют с хитозаном комплексы различной стехиометрии и показано, что в образовании комплексов, наряду с электростатическим взаимодействием, принимают участие водородные связи.

6. Установлено, что токсичность ЛПС существенно снижается при образовании им комплекса с хитозаном. Показано, что хитозан модифицирует иммунобиологические свойства ЛПС..

7. Проведено комплексное изучение сульфатированных полисахаридов: каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств . Gigartinaceae и Tichocarpaceae. Установлена структура и изучены физико-химические свойства различных типов каррагинанов. Впервые определена зависимость структуры каррагинанов от стадии развития этих водорослей. ,.

8. Показано, что каррагинаны взаимодействуют с ЛПС и изменяют его надмолекулярную организацию. Этот процесс зависит от структурного типа каррагинана.

9. Установлено, что каррагинаны уменьшают токсическое действие ЛПС в экспериментах in vivo и in vitro и изменяют его биологические свойства. Показано, что проявление физиологической активности ЛПС зависит от структуры каррагинана.

10. Впервые получен положительный эффект при применении каррагинана в терапии больных пищевыми токсикоинфекциями сальмонеллезной этиологии. Показано, что на фоне стандартной терапии пероральное ведение каррагинана более активно, по сравнению с контрольной группой, восстанавливает параметры системы гемостаза, гомеостаза и показатели иммунной системы больных.

11. Показано, что каррагинан и хитозан повышают неспецифическую резистентность организма при ЛПС-ипдуцированной эндотоксинемии в опытах in vivo.

12. Результаты, полученные при изучении взаимодействия ЛПС с полисахаридами, позволяют рассматривать хитозан и каррагинан как перспективные вещества, которые могут быть использованы в специфической и вспомогательной терапии эндотоксинемии и эндотоксического шока.

Список статей по теме диссертации:

1. Solov'eva T.F., Yermak I.M., Bondarenko O.D., Frolova G.M., Ovodov Yu.S.. Studies on a lipopolysaccharide-protein complex from Yersinia pseudotuberculosis // Microbios. 1979.Vol. 25, № 1. P.133-144.

2. Ермак И.М., Васильев Б.К., Гладких P.B., Недашковская Г.М., Шеховцова М.Ф., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Характеристика молекулярно-массовых параметров и вязкости растворов липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis // Химия природ, соедин. 1982. Т. 3, С.384-388.

3. Кузнецова Т.А., Ермак И.М., Горшкова Р.П.. О некоторых аспектах биологического действия липополисахарида из бактерий псевдотубсркулсза. //в сб.: Иерсиниозы. Новосибирск. 1983. С. 43-50.

4. Ермак И.М., Соловьева Т.Ф., Судник Ю.М., Оводов Ю.С. Седимен-тационные свойства липополпсахарид-бслкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis // Биофизика. 1984. Т. XXIX, вып. 6. С. 945-948.

5. Васильев Б.К., Ермак И.М., Гладких Р.В., Соловьева Т.Ф., Дзизенко А К. Исследование ЛПБК из Yersinia pseudotuberculosis в водных растворах методом светорассеяния //Биофизика. 1985. Т. XXX, вып. 6. С. 981-984.

6. Ермак И.М., Фролова Г.М., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. О различных формах липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган, химия. 1985. T.l 1, № 9. С. 1270-1276.

7 Тимченко Н.Ф., Новикова О.Д., Ермак И.М, Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Компоненты наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и их роль в патогенезе пссвдотуберкулеза // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1986. №6. С.38-41.

8. Ермак И.М., Дроздов А.Л. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физико-химические свойства и морфология липополисахарид-белкового комплекса

из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биол. мембраны. 1986. Т.3,№ 1. С. 52-59.

9. Ермак И.М., Ядыкина Г.М.. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С Исследование водных растворов липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis гидродинамическими методами // Биофизика. 1988. Т.ХХХ111, вып.2. С. 288-292.

10. Соловьева Т.Ф., Ермак И.М., Мороз С.И., Красикова И.Н., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Фролова Г.М., Иванова Е.П., Тимченко Н.Ф., Оводов Ю.С Влияние температуры культивирования на состав компонентов внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биол. мембраны. 1988. Т.5, №5. С. 492-500.

11. Ovodov Yu.S., Solov'eva T.F., Khomenko V.A., Novikova O.D., Frolova G.M., Yermak I.M., Naberezhnykh G. A. Porin as component of Yersinia pseudotuberculosis endotoxin // Endotoxin Adv. Exp. Med. Biol. 1990. Vol.256. P. 185-187.

12. Ермак И.М., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Изучение термотропного поведения липополисахарида и липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis методом седиментации //Биол. мембраны. 1990. Т.7, № 5. С. 462-466.

13. Соловьева Т.Ф., Бахолдина С.И., Ермак И.М., Хоменко В.А., Федореева Л.И., Новикова О.Д., Фролова Г.М., Лихацкая Г.Н., Н.Ф., Оводов Ю.С. Характеристика белкового компонента эндотоксина из Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган, химия. 1990. Т.16, № 10. С. 1601-1309.

14. Ермак И.М., Бахолдина С.И., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф, Фурман В.Я., Стуруа Г.И., Геденеванишвили Г.И. Физико-химическая характеристика эндотоксина из Yersinia pseudotuberculosis и его компонентов // Изв. АН Грузии. 1991. Т. 17, № 1. С. 65-71

15. Ермак И.М., Мороз С.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С.. Сравнительная характеристика эндотоксинов, выделенных последовательной экстракцией из Yersinia pseudotuberculosis // Биол. мембраны. 1991. Т.8, № 2. С. 128-133.

16. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Мороз С.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С.. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган, химия. 1993. Т. 19, №5. С. 536-547.

17. Ермак И.М., Горбач В.И., Полякова A.M., Астринан О.С., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Малеев В.В., Оводов Ю.С. Растворимый комплекс липополисахарид-хитозан и его влияние на агрегацию тромбоцитов // Биол. мембраны. 1994. T.l 1, № 5. С. 496-500.

18. Yermak I.M., Naberezhnykh G.A., Solov'eva T.F., Drozdov A.L., Ovodov Yu.S. The effect of temperature on supramolecular structure and antigenic activity of Yersinia pseudotuberculosis endotoxin // J. Biochem. Organization. 1994. Vol.1, №4. P. 295-304.

19. Полякова A.M., Кравченко A.B., Ермак И.М., Горбач В.И., Астрина О.С., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Малеев В.В., Оводов Ю.С. Влияние хитозана на биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Бюл. эксперим. биол. мед. 1995. Т. СХХ, №8. С. 169-172.

20. Solov'eva T.F., Elyakova L.A., Zvyagintseva T.N., Yermak I.M. Polysaccharides from the Russian Pacific Coast algae and their enzymatic transformation//J. Marine. Technol. Soc. 1996. Vol. 30,№.l P.35-39.

21. Ермак И.М., Хотимченко Ю.С. Физические и химические свойства, применение и биологическая активность каррагинана, полисахарида красных водорослей//Биол. моря. 1997.Т. 23, №3. С. 109-122.

22. Mi-Sun Hong, Yong-Hwan Kim, Irina M. Yermak. The characterization of polysaccharides from Tichocarpus crinitus // Korean J. Fd Nutr. 1997. Vol.11, №1. P. 99-106.

23. Давыдова B.H., Ермак И.М., Горбач В.И., Соловьева Т.Ф. Влияние температуры на процесс взаимодействия липополисахарида из Yersinia pseudotuberculosis с хитозаном/У Биол.мембраны. 1999. Т.16, №1. С.42-48.

24. Соловьева Т. Ф., Ермак И.М. Липополисахарид-белковый комплекс из бактерий псевдотуберкулеза. Структура и свойства // В кн. ( В.А. Стоник) Успехи в изучении природных соединений. 1999. Дальнаука С.168-178.

25. Davidova V.N., Yermak I.M., Gorbach V.I. Solov'eva T.F. The effect of temperature on the interaction of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide with chitosan// Membr. Cell Biol. 1999. Vol.13, №1. P. 49-58.

26. Yermak.I.M., Titlyanov E.A., Kim Y.H., Solov'eva T.F. Chemical structure and gel properties of carrageenans from algae belonging to the families Gigartinaceae and Tichacarpaceae and collected from the Russian Pacific Coast // J. Appl. Phycol. 1999. Vol.11, №1. P.41-48

27. Давыдова B.H., Ермак И.М., Горбач В.И., Дроздов А.Л., Соловьева Т.Ф. Сравнительное изучение физико-химических свойств хитозанов различной степени полимеризации в нейтральных водных растворах // Биофизика. 2000. Т.45, № 4. С. 624-630.

28. Давыдова В.Н., Ермак И.М., Горбач В.И., Красикова И.Н. Соловьева Т.Ф.. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексообразования // Биохимия. 2000. Т.65, вып.9. С. 1278-1287.

29. Yakovleva I.M., Yermak I.M., Titlyanov Е.А., Barabanova A.O., Clazunov P. Changes in growth rates, anatomy and polysaccharide content of a steril form of Tichocarpus crinitus under differing photon irradiance in the Sea of Japan (Russia) // Bot. Mar. 2001. Vol. 44, № 5. P. 491-497.

30. И.М. Ермак, H.B. Ситун, В.П. Дедюхина, Соловьева Т.Ф. Физико-химические характеристики каррагинанов из дальневосточной красной Chondrus armatus и их смесей с молочными белками // Раст. ресурсы. 2002, вып.З. С.98-106.

31. Yermak I.M., Chotimchenko Yu.S. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red algae //in Recent Advances in Marine Biotechnology" (Fingerman V., and Nagabhushaman R., eds). Sci. Publ. Inc. USA-UK. 2003.Vol. 9. P.207-250.

32. Заводинский В.Г., Гниденко A.A., Давыдова В.II., Ермак И.М. Компьютерное моделирование взаимодействия бактериального эндотоксина с поликатионом — хитозаном // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2003. № 2. С. 12-14

33. Barabanva A.O., Yermak I. M., Glazunov V.P, Yakovlcva I. M., Kim Yong Hwan, Solov'eva T. F. Influence of life-history stage and pboton irradiance on yield and quality of carrageenan in Tichicarpus crinitus (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Jap. J. Phycol. 2004. V.52. P. 61-65.

35. Полякова A.M., Ермак И.М., Астрина O.C., Малеев В.В.,. Горбач В.И., Соловьева Т.Ф. Влияние биологически активных природных } ^ полисахаридов на функциональную активность тромбоцитов в условиях экспериментальной эндотоксемии // Инфекц. болезни. 2003. Т. 1, № 1. С. 80-82.

36. Ермак И.М., Давыдова В.II., Горбач В.И., Бердышев Е.Л., Кузнецова Т.А., Иванушко И.А., Гажа А.К., Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Соловьева Т.Ф. Модификация биологических свойств липополисахарида (ЛПС) при образовании им комплекса с хитозаном // Бюл. эксперим. биол. мед. 2004. Т.137, № 7. С.430-434.

37. Сгрсбнева М.Н., Хасина Э.И., Оводова Р.Г., Ермак И.М., Давыдова В.Н., Оводов Ю.С. Влияние полисахаридов: зостсрина и хитозана, - па белок-синтезирующую функцию гепатоцитов // Исследовано в России [Электронный ресурс] 2004. Т. 211. С. 2230-2239.

38. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. Хитозан и неспецифическая резистентность организма // Вест. ДВО РАН. 2005.№1. С. 62-71.

39. Хотимченко Ю.С., Ермак И.М., Бедняк А.Е., Хасина Э.И., Кропотов А.В., i Коленченко Е.А., Сергущенко И.С. Фармакология некрахмальных полисахаридов // Вест. ДВО РАН. 2005. № 1. С. 72-82.

40. Ермак И.М., Реунов А.В., Лапшина Л.А., Давыдова В.Н., Соловьева Т.Ф. Электронно-микроскопическое изучение ЛПС из грамотрицательных бактерий и их комплексов с хитозаном // Биол. мембраны. 2005. Т.22, № 2. С. 117-122.

41. А.О.Барабанова, И.М. Ермак, В.П. Глазунов, В.В. Исаков, Э.А. Титлянов,

Т. Ф. Соловьева. Сравнительная характеристика каррагинанов, выделенных f из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr/ ( Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биохимия. 2005. T.70, №3 C.430-437.

42. Полякова A.M., Астрина O.C., Бахтина Ю.А., Малеев В.В., Барабанова А.О., Ермак И.М. Возможность коррекции функционального состояния тромбоцитов человека с помощью природных полисахаридов в условиях \У экспериментальной эндотоксинемии и у больных пищевыми токсикоинфскциями // Инфекц. болезни. 2005. Т. 3, № 1. С.44-46.

43. Ермак И.М., Барабанова А.О., Кукарских Т.А., Соловьева Т.Ф., Богданович Р.Н., Полякова А.М., Астрина О.П., Малеев В.В. Природный полисахарид каррагинан как ингибитор токсического действия эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Бюл. эксперим. биол. мед. 2006. Т.141, №2 С. 1-6.

44. Yermak I.M., Davidova V.N., Gorbach V.I., Luk'yanov P.A., Solov'eva T.F., Ulmer Arthur J., Buwitt-Beckmann U., Rietschel E.T., and Ovodov Yu.S. Forming ' and immunological properties of some lipopolysaccharide-chitosan complexes//Biochimie. 2006. Vol. 88, №1. P.23-30.

45. Давыдова В.Н., Набережных Г.А., Ермак И.М., Горбач В.И., Соловьева Т.Ф. Определение констант связывания ЛПС различной структуры с хитозаном И Биохимия. 2006. Т.75, № 3. Р. 300-347.

46. Yermak I.M., Barabanova A.O.,Glazunov V.P., Isakov V.V, Kim Yong Hwan, Shin Kwang Soon, Titlynova T.V., Solov'eva T.F. Carragcenans from cystocarpic and sterile plants of Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae, Rhodophyta) collected from the Russian Pacific Coast // J. Appl. Phycol. 2006. Vol. 22. № l.P. 1-8.

Соискатель

к.х.н. Ермак И. M.

Ирина Михайловна ЕРМАК

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ С БЕЛКАМИ И ПОЛИСАХАРИДАМИ, МОДИФИКАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

Автореферат

Изд. лиц. ИД № 05497 от 01.08.2001 г. Подписано к печати 07.09.2006 г. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Усл. п. л. 3,0. Уч.-изд. л. 2,92. Тираж 100 экз. Заказ 129

Отпечатано в типографии ФГУП Издательство «Дальнаука» ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио, 7

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий

1. 2. Липополисахарид (ЛПС) - структурный компонент наружной 11 мембраны бактерий 1.2.1. Строение ЛПС

1.2.2. Микрогетерогенность ЛПС

1.2.3. Макромолекулярная организация ЛПС. Поведение ЛПС в растворах

1. 3. Комплексы ЛПС с белками наружной мембраны

1. 4. Взаимодействие ЛПС с растворимыми белками макроорганизма

1.4.1. Взаимодействие ЛПС с липопротеинами, с ЛПС-связывающими белками и белками, увеличивающими бактерицидную проницаемость

1.4.2. Взаимодействие ЛПС с гемоглобином, альбумином, лактоферинами, лизоцимом.

1.5. Детоксикация ЛПС.

Взаимодействие ЛПС с катионными антибиотиками

1.6. Связь структуры и биологической активности ЛПС

1.7. Полисахариды - хитозан и каррагинан

11. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Введение

2.1. ЛПС и ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК) из псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis

2.1.1. Экстракция и очистка ЛПБК

2.1.2. Сравнительная характеристика ЛПБК и ЛПС, выделенных последовательной экстракцией

2.1.3. Влияние условий культивирования бактерий псевдотуберкулеза на ЛПБК и ЛПС

В процессе своей жизнедеятельности бактериальные клетки активно взаимодействуют с окружающей средой, а патогенные бактерии - с организмом хозяина. В последнем случае это взаимодействие осуществляется, со стороны макроорганизма на уровне клеток и гуморальных факторов - компонентов иммунной системы, а со стороны бактерий - на уровне макромолекул и их комплексов, расположенных на поверхности бактериальных клеток.

Липополисахарид (ЛПС), специфический компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, занимает около 45% ее поверхности и представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент (так называемый липид А) и ковалентно связанную с ним гидрофильную полисахаридную часть [1]. В наружной мембране клетки ЛПС специфически взаимодействуют с белками, образуя устойчивые к химическим воздействиям ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК) [2, 3,4, 5,]. Эти комплексы играют важную роль в организации и функционировании бактериальной мембраны и в значительной степени определяют ее свойства [2, 4, 6, 7, 8, 9]. Специфическое взаимодействие ЛПС с белком обеспечивает формирование пространственной структуры последнего и закрепление его в мембране [8, 10]. Важным доказательством существования связи между белком и ЛПС является функциональная активность комплекса, которая проявляется только при наличии обоих компонентов [3, 6, 11, 12].

ЛПБК представляет собой так называемый полный О-соматический антиген Буавена [3] и является нативным иммуногеном грамотрицательных бактерий. При попадании в организм ЛПБК вызывают картину полного иммунного ответа и обеспечивают формирование иммунитета к бактериальному возбудителю.

Изучение антигена Буавена начато еще в 30-е годы [13], однако его дальнейшее исследование к середине прошлого столетия было фактически приостановлено. Это связано с появлением новых методов выделения из бактериальных клеток чистого ЛПС, в связи, с чем внимание ученых было сосредоточено на исследовании именно этого компонента антигена. Изучением структуры ЛПС были заняты десятки групп исследователей в разных странах мира, и в этом направлении достигнуты существенные успехи [1, 5, 14,15, 16], что особенно важно для практической медицины, так как полисахаридная часть ЛПС часто является характерным антигеном патогенных бактерий, узнаваемым иммунной системой макроорганизма. Долгое время считалось, что все основные свойства ЛПБК, как антигена, определяются ЛПС [17], пока не была установлена важная роль белкового компонента в модификации биологической активности ЛПС [3]. Комплекс обладает особыми биологическими свойствами, которые отсутствуют у отдельно взятых ЛПС и белка, но характерны для бактериальной клетки в целом [5, 11, 12]. ЛПС и ЛПБК играют важную роль во взаимодействии микро - и макроорганизма и являются мощными токсинами, которые получили название эндотоксины.

Способность ЛПС образовывать с белками наружной мембраны комплексы, подтверждена многими экспериментальными фактами, как in vitro, так и in vivo, однако данные о надмолекулярной структуре и свойствах ЛПБК, их поведении в водных средах весьма ограничены. В то же время, проявление физиологической активности эндотоксинов во многом определяется их третичной структурой. Поэтому лишь располагая соответствующими данными о макромолекулярной организации ЛПС и ЛПБК, можно достаточно полно решить основную задачу биохимии эндотоксинов - установить молекулярные механизмы их биологического действия.

Взаимодействие ЛПС с белком не ограничивается только наружной мембраной бактерий. При попадании в макроорганизм ЛПС взаимодействуют с белками сыворотки и бактерицидными белками организма хозяина и являются мишенью для антибактериальных веществ поликатионной природы, используемых при лечении бактериальных инфекций [1, 9, 18, 19, 20, 22]. В этом случае комплексы ЛПБК, выделенные из бактериальной мембраны, могут служить удобной моделью для изучения ЛПС - белковых взаимодействий.

Среди широкого спектра биологической активности ЛПС и ЛПБК, особое внимание исследователей привлекает их токсичность и способность активировать клетки иммунной системы. В настоящее время механизм проявления активности эндотоксина в макроорганизме достаточно понятен. Результатом специфического взаимодействии ЛПС или ЛПБК с клетками макроорганизма является биосинтез активных медиаторов - цитокинов, которые при низкой концентрации регулируют работу иммунной системы организма, а при высокой - вызывают развитие сложной гаммы токсических эффектов, таких как пирогенность, лейкопения, септический шок, объединяемых понятием «бактериальный эндотоксикоз» [1, 13, 21, 24, 25, 26]. В связи с этим разрабатываются способы нейтрализации токсического действия ЛПС и использования его ценных свойств. Для этих целей активно исследуются антибиотики или синтезированные на их основе пептиды [27 - 31]; моно-клональные антитела к ЛПС [32]; ингибиторы цитокинов [33, 34]; малотоксичные ЛПС, обладающие свойствами антагонистов [35, 36, 37]; липосомальные вакцины [38, 39], а также вещества, нейтрализующие действие ЛПС за счет образования с ними комплексов.

Среди последних веществ наиболее перспективными являются поликатионные антибактериальные белки, пептиды и их синтетические аналоги, как новые потенциальные антисептические препараты [40, 41, 42, 43, 44, 45], для которых ЛПС является важной мишенью благодаря высокому отрицательному заряду за счет фосфатных, пирофосфатных и карбоксильных групп, локализованных во внутренней части кора и липиде А - токсическом центре ЛПС. Особый интерес вызывают липополиамины, проявляющие высокую аффиность к ЛПС и нейтрализующие in vitro его эндотоксическую активность [40,41].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые при изучении взаимодействий ЛПС с различными белками, многие биохимические и биофизические факторы, лежащие в их основе, остаются до конца неизученными. Основные трудности, с которыми сталкиваются исследователи при решении этих вопросов, обусловлены самой природой эндотоксинов - их гетерогенностью и способностью образовывать в водных растворах полидисперсные высокомолекулярные агрегаты. В этом случае изучение физико-химических характеристик ЛПС и ЛПБК приобретает особую важность.

Таким образом, изучение комплекса ЛПС с белком, физико-химические свойства и макромолекулярная организация ЛПБК, а также и его ЛПС составляющей, до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено и тем, что достаточно полно понять молекулярные механизмы биологического действия эндотоксинов и их взаимодействие с антибактериальными веществами различной природы, можно лишь располагая данными о макромолекулярной структуре ЛПС и ЛПБК.

При выборе препаратов антибактериального действия, важно отсутствие их побочных эффектов на макроорганизм. Такому требованию могут отвечать природные вещества, если они способные повышать резистентность организма к действию бактериальных эндотоксинов и восстанавливать работу его иммунной системы.

Среди веществ, способных нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов, перспективными представляются полисахариды морского происхождения благодаря их разносторонней биологической активности, в том числе бактерицидной и иммуностимулирующей, биосовместимости, безопасности и доступности. Особого внимания заслуживают два таких полисахарида: хитозан и каррагинан, первый - в силу его поликатионной природы [46], благодаря чему он может рассматриваться в качестве потенциального лиганда для ЛПС, а второй -как представитель класса пищевых волокон, играющих важную роль в гомеостазе и широко используемый в составе различных пищевых продуктов [47, 48, 49]. Механизм специфического и неспецифического взаимодействия ЛПС с полисахаридами на молекулярном уровне, как и их влияние на биологические свойства эндотоксинов, не исследованы.

Изучение взаимодействия бактериальных ЛПС с белками и полисахаридами может внести определенный вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС, осуществляемого на уровне гуморальных и клеточных факторов макроорганизма, молекулярные основы которого еще не достаточно понятны.

В методическом плане такая работа важна для разработки методов исследования широко распространенных в природе макромолекулярных комплексов, которые лежат в основе большинства устойчивых структур живой клетки.

Прикладное значение этих исследований заключается в перспективе создания новых терапевтических препаратов при лечении септических осложнений грамотрицательных инфекций. Модификация биологических свойств ЛПС и ЛПБК предполагает их активное использование для создания вакцин и других биологически-активных препаратов биохимического и медицинского назначения.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. Из бактерий Y. pseudotuberculosis выделены два эндотоксина - ЛПС и ЛПС - белковый комплекс (ЛПБК). Установлено, что в составе комплекса ЛПС имеет в среднем более длинную О-специфическую углеводную цепь, по сравнению с ЛПС, свободным от белка. Эта закономерность становится более выраженной при низкой температуре культивирования бактерий Y. pseudotuberculosis .

2. Показано, что в водных растворах ЛПС и ЛПБК формируют высокомолекулярные и полидисперсные агрегаты, размеры, форма, ультраструктура и молекулярно-массовое распределение которых зависят от концентрации полимера, ионной силы и температуры раствора. Определены их физико-химические характеристики и изучено поведение в растворах. В надмолекулярной организации ЛПС и ЛПБК участвуют ионы двухвалентных металлов, водородные связи и гидрофобные взаимодействия.

3. Физико-химические и биологические свойства ЛПБК в основном определяются ЛПС-составляющей. Белковому компоненту также принадлежит важная роль в структурной организации комплекса и проявлении его физиологической активности. Надмолекулярные структуры ЛПС и ЛПБК оказывают заметное влияние на их физиологическую активность.

4. Впервые изучено взаимодействие в растворах ЛПС с хитозаном на молекулярном уровне и показана важная роль надмолекулярной структуры ЛПС в этом процессе. Установлено влияние температуры, рН, ионной силы раствора, а также структурных особенностей ЛПС и степени полимеризации хитозана на их взаимодействие.

5. Определены параметры связывания ЛПС с хитозаном. Установлено, что ЛПС образуют с хитозаном комплексы различной стехиометрии и показано, что в образовании комплексов, наряду с электростатическим взаимодействием, принимают участие водородные связи.

6. Установлено, что токсичность ЛПС существенно снижается при образовании им комплекса с хитозаном. Показано, что хитозан модифицирует иммунобиологические свойства ЛПС.

7. Проведено комплексное изучение сульфатированных полисахаридов: каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae. Установлена структура и изучены физико-химические свойства различных типов каррагинанов. Впервые определена зависимость структуры каррагинанов от стадии развития этих водорослей.

8. Показано, что каррагинаны взаимодействуют с ЛПС и изменяют его надмолекулярную организацию. Этот процесс зависит от структурного типа каррагинана.

9. Установлено, что каррагинаны уменьшают токсическое действие ЛПС в экспериментах in vivo и in vitro и изменяют его биологические свойства. Показано, что проявление физиологической активности ЛПС зависит от структуры каррагинана.

10. Впервые получен положительный эффект при применении каррагинана в терапии больных пищевыми токсикоинфекциями сальмонеллезной этиологии. Показано, что на фоне стандартной терапии пероральное ведение каррагинана более активно, по сравнению с контрольной группой, восстанавливает параметры системы гемостаза, гомеостаза и показатели иммунной системы больных.

11. Показано, что каррагинан и хитозан повышают неспецифическую резистентность организма при ЛПС-индуцированной эндотоксинемии в опытах in vivo.

12. Результаты, полученные при изучении взаимодействия ЛПС с полисахаридами, позволяют рассматривать хитозан и каррагинан как перспективные вещества, которые могут быть использованы в специфической и вспомогательной терапии эндотоксинемии и эндотоксического шока.

Заключение

Макромолекулярная организация эндотоксинов псевдотуберкулезного микроба, а также то, представляют ли они чистый ЛПС или его комплекс с белком (ЛПБК), играют существенную роль в проявлении некоторых показателей физиологической активности. ЛПБК и ЛПС отличаются высокой токсичностью, показатели которой для обоих препаратов близки. Изучение влияния эндотоксинов на тромбоциты крови выявило повреждающее действие как ЛПС, так и ЛПБК. Однако для ЛПБК это свойство проявлялось в меньшей степени. ЛПС, по сравнению с ЛПБК, показывает меньшую иммуногенность.

ЛПБК с разной, но достаточно высокой молекулярной массой обладают одинаковой иммуногенностью для кроликов, в то время как субъединица ЛПБК проявляет очень низкую иммуногенность. Уменьшение молекулярной массы ЛПБК на два порядка приводит к падению токсичности ЛПБК в 4,5 раза.

Макромолекулярное строение агрегатов ЛПС и ЛПБК оказывает существенное влияние на их связывание с антителами и, как можно предположить, с иммуноглобулиновыми рецепторами на иммунокомпетентных клетках и другими ЛПС-связывающими белками хозяина. Следовательно, активность эндотоксинов зависит от их физического состояния и может регулироваться факторами, влияющими на надмолекулярную организацию антигенов.

Глава 2.4. СТРУКТУРА и СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИДОВ.

Как было сказано выше проявление той или иной формы биологического действия эндотоксинов, а значит и исход его взаимодействия с различными клетками зависит от концентрации ЛПС. При низких дозах ЛПС вызывает активацию клеток и систем организма, тогда как увеличение концентрации ЛПС может привести к развитию диссеминированного внутрисосудистого свертывания, эндотоксинового шока. Нормализация концентрации ЛПС и показателей антиэндотоксинового иммунитета может быть достигнута с помощью веществ, которые сочетали бы максимальную активность по нейтрализации токсического действия ЛПС за счет взаимодействия или образования с ними макро-молекулярных комплексов и, в то же время, обладали бы минимальным повреждающим эффектом на макроорганизм и его нормальную флору.

Поиск веществ, способных повышать устойчивость организма к бактериям и выделяемым им токсинам, оставаясь при этом безвредными для организма, является одной из актуальных задач. Полисахариды морского происхождения, в частности хитозан и каррагинан, могут быть перспективными кандидатами для таких целей, в виду, безопасности и разносторонней биологической активности.

Так как изучение взаимодействия биополимеров в растворах требует тщательной характеристики взаимодействующих компонентов, в данной работе две главы посвящены получению, установлению структуры и изучению физико-химических характеристик полисахаридов, используемых для нейтрализации ЛПС.

2.4.1. Сравнительное изучение хитозанов различной степени полимеризации в водных растворах.

Хитозан, как известно, представляет собой полностью или частично N-дезацетилированное производное природного полисахарида - хитина. Обычно получают хитозан при обработке хитина концентрированным раствором щелочи в жестких условиях. В данной работе были использованы два образца хитозана различной степени полимеризации, полученные последовательной деполимеризацией хитина. Хитин получали из панциря камчатского краба и обрабатывали раствором щелочи в жестких условиях. Выход хитозана составил 75 % и он был обозначен как высокомолекулярный хитозан- (Х-ВМ). Для получения второго образца была проведена деполимеризация Х-ВМ с использованием 2,5 % раствора Н202. Полученный полисахарид осаждали спиртом, и очищали методом гель-хроматографии. В результате был получен низкомолекулярный хитозан (Х-НМ) с выходом 35%.

Для характеристики образцов хитозанов были использованы методы ЯМР и ИК-спектроскопии. Согласно данным ИК-спектроскопии содержание N-ацетильных групп в обоих образцах хитозана составляет 4%. В ,3С- ЯМР спектрах присутствуют 6 основных сигналов атомов углерода с химическими сдвигами 98,5 (С1), 78,0 (С4); 76,0 (С5), 71,1 (СЗ), 61,4(С6), 57ДС2) м.д. и минорный сигнал метильной группы ацетамидного атома углерода при 23,4 м.д. Эти данные подтверждают, что исследуемые полисахариды представляют собой полимеры (3- 1,4 Д-глюкозамина.

Сравнительное изучение гидродинамических характеристик двух образцов хитозанов проводили методами аналитического центрифугирования-скоростной и равновесной седиментацией, а также вискозиметрии. Наличие единственной границы седиментации как в случае Х-ВМ, так и Х-НМ свидетельствует об отсутствии каких либо примесных компонентов в обоих образцах а б

Рис.2.21. Седиментограмма Х- НМ (а) и Х- ВМ (б) в растворе 0,01 М Na-фосфатного буфера /0,15 М NaCl (рН 6,0). п= 12 000 об/мин., Т=25°С,С=10 мг/мл. Время - 20 мин.

Значения констант седиментации, а также молекулярных масс Х-ВМ и Х-НМ, определенных методом неустановившегося равновесия по Арчибальду, представлены в таблице. 2.15. Как видно, молекулярная масса Х- ВММ более чем в 4 раза больше, чем Х-НММ, в то время как их коэффициенты седиментации, приведенные к стандартным условиям, отличаются незначительно. Анализ концентрационных зависимостей коэффициентов седиментации и молекулярных масс хитозанов, представленных на рис 2.22,

1. Lugtenberg В., Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other gram-negative bacteria //Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 737, N 1. P.51-115.

2. Hitchcock P.J., Morrison D.C. The protein component of bacterial endotoxins // In: Handbook of endotoxin / Eds. R.A.Proctor. Elsevie: Amsterdam-New York- Oxford. 1984. P.339-375.

3. Freudenberg M.A. Meier-Dieter U., Staehelin Т., Galanos C., Analysis of LPS released from Salmonella abortus equi in human serum // Microb. Pathogen. 1991. V.10, N.l. P.93-104.

4. Оводов Ю.С. Химия иммунитета. 1997. Сыктывкар. 159 С.

5. Benz R., Bauer К. Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane og gram-negative bacteria. Review on bacterial porins // Eur. J. Biochem. 1988. V.176, N.l. P.l-19.

6. Sen K. and Nikaido H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin // J.Bacteriol. 1991. V. 173, N.2. P. 926928.

7. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Bio. Rev. 2003. V. 67, N.4. P. 593-656

8. Brandenburg К and Wiese A. Endotoxin: Relationships between Structure, Function and Activity // Curr. Top. Med. Chem. 2004. V.4, N.l 1. P. 1127-1146.

9. Arockiasamy A., Kumar P.D., Baalaji N.S., Rukmini M.R., Krishnaswamy S. Folding and structural stability of OmpC from Salmonella typhi: Role of LPS and environment // Curr.Sci. 2004. V.87, N.2. P. 197-202.

10. Boivin A., Messrobeanu J., Messrobeanu L. Technique pour la preparation des polysaccharides microbiens specifiques // C. R. Soc. Biol. 1933.V.113. P.490-492.

11. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // В кн.: Прогресс химии углеводов. Под. ред. И.В. Торгова. М.: Наука. 1984. С. 222-308. .

12. Knirel Y.A and Kochetkov N.K. The structure of lipopolysaccharides of gram-negative bacteria. III. The structure of O-antigens: A review // Biochemistry (Moscow) 1994. V.59, N.12. P.1325-1383.

13. Tobias P.S., Soldau K., Iovine N.M., Elsbach P., Weiss J. Lipopolysaccharide ( LPS)-binding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS // J. Biol. Chem. 1997. V.272, N.30. P.18682-18685.

14. Kaca W., Roth R., Levin J. Hemoglobin, a newly recognized Lipopolysaccharides (LPS)-binding protein that enhances LPS biological activity // J. Biol. Chem. 1994 V. 269, N.40. P.25078-25084.

15. Gustmann Т., Hagge S.O., David A., Roes S., Bohling A., Hammer M.U., Seydel U. Lipid-mediated resistance of Gram-negative against various pore-forming antimicrobial peptides // J. Endotoxin Res. 2005. V.l 1, N.3. P.l67-173.

16. Galanos C., Rietschel R.T., Luderitz 0., Westphal 0. Biologic activities of lipid A complexed with bovine serum albumin // Eur. J. Biochem. J. 1972. V.31, N.l. P.230-233.

17. Galanose C., and Luderits 0. Lipopolysaccharide: properties of an amphipathic molecule // In: handbook of Endotoxin. Ed. E.T RietscheL.Amsterdam-N.Y.- Oxford. 1984.V. 1. P.46- 58.

18. Яковлев М.Ю. « Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи соврем, биол. 2003. Т.123, № 1. С. 31-40.

19. Рябиченко Е.В., Веткова Л.Г., Бондаренко В.М. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журн. микробиол.2004. №3. С. 98-105.

20. Brandenburg К., Jurgens G., Muller М., Fukuoka S. Koch M. Biophysical characterization of lipopolysaccharide and lipid A inactivation by lactoferin // Biol.Chem. 2001. V.382, N.l. P. 15-25.

21. Japelj В., Pristovsek P., Majerle A., Jerala R. Strucrtural origin of endotoxin neutralization and antimicrobial activity of a lactoferrin-based peptide // J. Biol.Chem.2005. V.280, N.17. P. 16955-16961.

22. Bland J.M., De Lucca A.J., Jacks T.J. Vigo C.B. All-D-cecrolin B: Synthesis, conformation, lipopolysaccharide binding, and antibacterial activity // Mol.Cell.Biochem. 2001. V.218, N.l/2. P. 105-111.

23. Fujihara Y., Lei M-G., Morrison D.C. Characterization of specific binding of a human immunoglobulin M monoclonal antibody to lipopolysaccharide and its lipid A domain //Infect. Immun. 1993. V.61, N.3. P.910-918.

24. Kovacs E.J., Radzioch D., Young H.A., Varesio L. Differential inhibition of IL-1 and TNF-a mRNa expression by agents which block second messenger pathways in murine macrophages // J. Immunol. V. 141, N. 16. P.3110-3105

25. Natanson C., Hoffman W.D. Suffredini A.F. Eichacker P.Q. Danner R.L. Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis // Ann. Untern. Med. 1994. V.120, N.3. P.771-783.

26. Kutuzova G.D., Albrecht R.M., Erickson C.M., Qureshi N. Diphosphoryl lipid A from Rhodobacter sphaeroides blocks the binding and internalization of lipopolysaccharide in RAW 264.7 cells // J.Immunol. 2001. V.167, N.l. P. 482-489.

27. Bennett-Guerrero E., Mcintosh T.J., Barclay G.R., Snyder D.S., Gibbs R.J., Mythen M.G., Poxton I.R. Preparation and preclinical evaluation of a novel liposomal complete core lipopolysaccharide vaccine // Infect. Immun. 2000. V.68, N. 11. P.6202-6208.

28. Velucchi M., Rustici A., Meazza X., Villa P., Ghezzi P., Tsai C-M., Porro M. A model of Neisseria meningitidis vaccine based on LPS micelles detoxified by synthetic anti-endotoxin peptides // J. Endotoxin Res. 1997. V.4, N.4. P.261-272.

29. David S.A., Silverstein R., Amura C., Kielian Т., Morrison D.C. Lipopolyamines : Novel antiendotoxin compounds that reduce mortality in experimental sepsis caused by gram-negative bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. V.43, N.4. P.912-919.

30. Blagbrough I.S., Geall A.J., David S.A. Lipopolyamines incorporating the tetraamine spermine, bound to an alkyl chain, sequester bacterial lipopolysaccharide // Bioorg. Med. Chem. 2000. V.10, N.4. P. 1959-1962.

31. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. V.415, N.l. P.389-395.

32. Schroder-Born H., Willumeit R., Brandenburg K., Andra J. Molecular basis for membrane selectivity of NK-2 , a potent peptide antibiotic derived from NK-lysin // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1612, N.l. P. 164-171.

33. Andra J., Koch M., Bartels R., Brandenburg K. a-. Biophysical characterization of endotoxin of endotoxin inactivation by NK-02, an antimicrobial peptide derived from mammalian NK-lysin // Antimicrob. Agents and Chemother. 2004. V.48, N.5. P. 1593-1599.

34. Andra J., Lohner K., Blondelle S.E., Jeralas R., Moriyoni I., Koch M., Garidel P., Brandenburg K. Enhancement of endotoxin neutralization by coupling of a C12-alkyl chain to a lactoferricin-derived peptide // Bichem. J. 2005. V.385, N1. P.135-143.

35. Kumar M.N. Muzzarelli R.A., Muzzarelli C., Sashiva H., Domb A.J. Chitosan chemistry and pharmacceutical persspective // Chem. Rew. 2004. V.104, N.12. P.6017-6084

36. Lahaye, M., Kaeffer, B. Seaweed dietary fibres: structure, physico-chemical and biological properties relevant to intestinal physiology // Sciences and Aliments. 1997 V.17, N.2. P.563-584.

37. Kilpatrick D.C. Immunological aspects of the potential role of dietary carbohydrates and lectins in human health // Eur. J. Nutr.1999. V.38, N.l. P. 107-117.

38. Nikaido N, Nakae T. The outer membrane of gram-negative bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1979. V.20, N.2. P. 163-250. ,

39. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channales // J. Biol. Chem. 1976. V.251, N.21. P.2176-2178.

40. Benz R., Bauer K. Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-negative bacteria. Review on bacterial porins // Eur. J. Biochem. 1988. V.176, N.l. P.l-19.

41. Nikaido H., Nikaido K., Harayama S., Identification and characterization of porins in Pseudomonas aeruginosa II J. Biol.Chem. 1991 V.266, N.3. P.770-779.

42. Conlan S., Zhang Y., Cheley S., Bayley H. Biochemical and biophysical characterization of OmpG: monomeric porin // Biochemistry. 2000. V.39,.N.32. P.l 184511854.

43. Cowan S.W., Garavito R.M., Jansonius J.N., Jerkins J.A., Karlsson R., Konig N.,Oai E. F., Rizkallish P.J., Rusenbusch J.P., Rummel G., Schurmer T. The structure of OMpF porin in a tetragonal crystal form // Structure. 1995. V.3, N10. P.1041-1050.

44. Forst D., Welte W., Wacker T. Dicderichs K. Structure of the sucrose-spesific porins Ser Y from Salmonella typhimurium and its complex with sucrose // Nat. Struct. Biol. 1998. V.5, N.l. P.37-46.

45. Koebnik R., LocherX.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol .2000. V.37, N.2. P.239-253.

46. Zhang C., Walker L.M., Hinson J.A., Mayeux P.R. Oxidant stress in rat liver after lipopolysaccharide administration: effect of inducible nitric-oxide syntheses inhibition // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. V.293, N.3. P. 968 972.

47. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraction von bacterien mit phenol/wasser // Z. Naturforsch 1952. V.76, N.3. P. 148-155.

48. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides-themes and variations // Prog. Lipid Res., 1996. V.35, N.3. P.283-343.

49. Горбач В.И., Красикова И.Н. Липид А как центр эндотоксической активности грамотрицательных бактерий. Структура, свойства, синтез аналогов // В кн.: Успехи в изучении природных соединений. Под ред. Стоник В.А. Дальнаука : Владивосток. 1999. С.209- 222.

50. Batley M., Packer N.H.,Redmond J.W. Configurations of the glycoside phosphates of lipopolysacharide from Salmonella minesota R 595 // Biochemistry 1982. V.21, N 25. P.6580-6583.

51. Brade L., Schramek S., Schade U., Brade H. Chemical, biological, and immunochemical properties of the Chlamydia psittaci lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1986. V.54, N.3. P.568-574.

52. Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. D-3-Dodecanoyltetradecanoic acid as a constituent of lipid A from the lipopolysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis // Experientia 1984.V.40, N.l 5. P.709-710.

53. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Isakov V.V., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. The application of 13C-NMR spectroscopy to study lipid A from Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide // Eur.J. Biochem 1982. V.126, N2. P.349-351.

54. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Studies on lipid A from Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide. Isolation and general characterization //EurJ. Biochem. 1978. V. 89, N.l. P.289-290.

55. Seydel U., Hawkins L. Schramm A.B. Heine H., Scheel 0., Koch M.H.J. Brandenburg K. The generalized endotoxic principle // Eur.J.Immunol. 2003. V.33, N.6. P. 1586-1992.

56. Schromm A.B., Brandenburg K., Loppnow H., Moran A.P., Koch M.H., Rietschel E.T., Seydel U. Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipidA portion // Eur. J. Biochem. J. 2000. V.267, N12. P.2008- 2013

57. Knirel Y. A. Rietschel E. T. Marre R., Zahringer U. The structure of the 0-specific chain of Legionella pneumophia serogroup 1 lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1994. V.221, N.2. P.239-245.

58. Томшич C.B., Горшкова Р.П., Командрова H.A., Зубков В.А., Назаренко E.JI. Структура О- специфических полисахаридов рода YERSINIA // В кн; Успехи в изучении природных соединений. Под. ред. В.А. Стоника.-Дальнаука: Владивосток. 1999. С.202-208.

59. Gorshkova R.P., Zubkov V.F., Isakov V.V., Ovodov Yu.S. Yersiniose, a New Branched-Chain Sugar // Carbohydr. Res. 1984. V.126, N.4. P.308-312.

60. Novotny A. Heterogeneity of endotoxin // In: handbook of Endotoxin Ed. E.T Rietschel. Amsterdam-N.Y.- Oxford. 1984.V.l. P.308-338.

61. Morrison D.C., Leive L. Fractions of lipopolysaccharide from Escherichia colli 0111:B4 prepared by two extraction procedures // J.Biol.Chem. 1975.V. 250, N.8. P. 2911-2919.

62. Goldman R.C., Leive L. Heterogeneity of antigen-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2 // Eur. J.• Biochem. 1980. V.107, N 1. P.145-153.

63. Langley S., Beverridge T.J. Effect of O-side-chain -lipopolysaccharide chemistry on metal binding //Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65, N. 2. P. 489-498.

64. Dezelic G.J., Dezelic N., Jusic D., Pends В., Sinkovic D., Nebec M. A gel-chromatographic and light scattering study of the Salmonella typhimurium II Croat. Chem. Acta 1977. V.49, N.l. P. 149-162.

65. Mclntire F.C., Barlow G.h., Siever H.W., Finley R.A. Yoo A/L. Studies on a lipopolysaccharide from Escherichia coli .Heterogeneity and mechanism of reversible inactivation by sodium deoxycholate // Biochemistry. 1969. V.8, N.23. P.4063-4067.

66. Muck A., Ramm M., Hamburger M. Efficient method for preparation of highly purified lipopolysaccharides by hydrophobic interaction chromatography // J. Chromatog. 1999. V.732, N.l. P.39-46.

67. Snyder S., Kim. D., Mcintosh T.J. Lipolysaccharide bilayer structure: Effect of chemotype, core mutation, divalent cations, and temperature // Biochemistry 1999. V.38, N.33. P.10758-10767.

68. Vaara M.and N.Nikaido . Molecular organization of bacterial outer membrane // In: Handbook of Endotoxin/ Ed. E. Rietschel. Elsevier: Amsterdam-New York-Oxford 1984. V.l. P. 1-33.

69. Munford R.S., Hall C.L. Rick P.D. Size heterogeneity of Salmonella typhimurium in the lipopolysaccharides in outer membranes and culture supernatant membrane fragments // J.Bactirio.1980. V.144, N.2. P.630-640.

70. Dirienzo J.M., Macleod R.A. Composition of the fractions separated by polyacrylamide gel electrophoresis of the lipopolysaccharides of marine bacterium //J. Bacteriol. 1978. V.l36, N.l. P. 158-167.

71. Rietschel, E.T., Brade H., Brandenburg K., Flad H.D. de Jong-Leuveninck, Kawahara K., Lidner В., Loppnow H., Luederitz. Chemical sctructure and biologic activity of bacterial and synthetic lipid A // Rev.Infect. Dis. 1987. Suppl. 5. P.527-536.

72. Leive L. Release of lipopolysaccharide by EDTA-treatment of E.coli // Biochem. Biophys. Com. 1965. V.21, N1. P.290-296.

73. Goodman M.G., Morrison D.C., Weigle W.D. Modulation of lipopolysaccharide (LPS)-mediated function by structural differences of two physically distinct fractions of Escherichia coli K-235 // J. Immunol.1977. V.l 18, N5. P.1852-1857.

74. Tsang J.C., Wang C.S., Alaupovic P. Degradative effect of phenol on endotoxin and lipopolysaccharide preparations from Serratia marcescens // J. Bacteriol.1974. V.l 17, N.2. P.786-795.

75. Brandenburg K., Seydel U. Physical aspects of structure and function of membranes made from lipopolysaccharides and free lipid A // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V.775, N.2. P.225-238.

76. Brandenburg K., Mayer H., Koch M.H.J. Weckesser J., Rietschel E.T., Seydel U. В/ Influence of the supramolecular structure of free lipid A on the its biological activity.// Eur. J. Biochem. 1993. V.218, N.2. P.555-563.

77. Kitchens R.L., Munford R.S. CD14-dependent internalization of bacterial lipopolysaccharide (LPS) is strongly influenced by LPS aggregation but not by cellular responses to LPS //J. Immunol. 1998. V.l 60, N.15. P. 1920-1928.

78. Shands J.W., Graham J.A., Nath K. The morphologic structure of isolated bacterial lipopolysaccharide//J. Mol. Biol. 1967. V.25, N.l. P. 15-21.

79. Wistrom C.A., Jones G.M., Tobias P.S., Sklar L.A. Fluorescence resonance energy transfer analysis of lipopolysaccharide in detergent micelles // Biophys. J. 1996. V.70, N.8 P. 988-997.

80. Olins A.L., Marner R.C. Physicochemical studies on a lipopolysaccharide from cell wall of Azotobacter vinelandii // J. Biol. Chem. 1967. V.242, N.21. P.4994-5001.

81. Lorinczy D., Kocsis B. Interaction between lipopolysaccharide and detergents detected by differential scanning calorimetry // Therm. Acta. 2001. V. 372, N.l. P.19-23.

82. Moriyon I., Berman D.T., Effects of nonionic, ionic, and dipolar ionic detergents and EDTA on the Brucella cell envelope // J. Bacteriol. 1982. V.l52, N. 2. P. 822-828.

83. Brandenburg К, Andra J, Muller M, Koch MHJ, Garidel P Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity // Carbohydr. Res. 2003. V.338, N. 23: P.2477-2489 .

84. Aurell C.A., Wistron A.O. Critical aggregation concentrations of gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS) //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.235, N.l. P.l 19-123.

85. Santos N.C., Silva A.C., Castanho M.A., Martina-Silva J., Salanha C. Evaluation of lipopolysaccharide aggregation by lithg sckattering spectroscopy // Chem. Biochem. J. 2003. V.4, N.l. P.96-100.

86. Coughlin R.T., Haug A. McGroarty E.J. Physical properties of defined lipopolysaccharide salts //Biochemistry. 1983. V.22, N.8. P.2007-2013.

87. Oh E.T., Yun H.S., Heo T.R., Koh S.C., Oh K.H., So J.S. Involvement of lipopolysaccharide of Bradyrhizobium japonicum in metal binding // J. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.12, N.2. P.296-300.

88. Brandenburg K., Seydel U.Investigation into the fluidly of lipopolysaccharide and free lipid A membrane systems by Fourief-transform interied spectroscopy and differential scanning calorimetry // Eur. J. Biochem. 1990. V. 191, N. 1. P. 229-236.

89. Brandenburg K., Funari S.S., Koch M.H., Seydel U. Investigation into the acyl chain packing of endotoxins and phospholipids under near physiological conditions by WAXS and FTIRspectroscopy // J. Struct. Biol. 1999. V.128, N.l. P.175- 186.

90. Brandenburg K., Seydel U. Orientation measurements on membrane systems made from Iipopolysaccharides and free lipid A by FT-IR spectroscopy // Eur. Biophys. J. 1988. V. 16, N.l. P. 83-94.

91. Brandenburg K., Seydel U. Thermodynamic investigations on mono- and bilayer membrane systems made from lipid components of gram-negative bacteria // Therm. Acta. 1985. V.85, N.3. P.437-476.

92. Brandenburg K., Kusumoto S., Seydel U. Conformational studies of synthetic lipid A analogues and partial structures by infrared spectroscopy // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.132, N.l. P. 193-201.

93. Israelachvili J. N., Marcelja S., Horn R.G. Physical principles of membrane organization //Biochim. Biophys. Acta. 1984. V.775, N.2. P.225-238.

94. Brandenburg K., Koch M.H., Seydel U. Fhase diagram of deep rough mutant lipopolysaccharide from salmonella minesota R 595 // J. Struct. Biol. 1992. V.108, N.2. P.93-106.

95. Mariani P., Luzzati V. Delacreix H. Cubic phases of lipid-containing systems. Structure analysis and biological implications // J. Mol. Biol. 1993. V.204, N.l. P.165-189.

96. Peterson A.A., Haug A., McGroarty E.J. Physical properties of short- and long-O-antigen-containing fractions of lipopolysaccharide from Escherichia coli0111 :B4 // J. Bacteriol. 1986. V.l65, N. 1. P.116-122.

97. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физические свойства липопо-лисахаридов грамотрицательных бактерий // Биолог, мембраны 1992. Т.9, Вып.З. С.245-258.

98. Coughlin R.T., Peterson A.A. Haug A., Pownall H.J.,McGroarty E.J. A pH titration study on the ionic bridging within lipopolysaccharide aggregates // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.821, N.3. P.404-412.

99. Като N., Ohta M., Kido N., Ito H., Natio S., In vitro hexagonal assembly of R-form lipopolysaccharides: effect of pH on the Mg+2- mediated hexagonal assembly // Microbiol. Immunol. 1988. V.32, N.2. P. 151-160.

100. Kislyuk V.V., Varbanets L.D., Kosenko L.D., Vasiliev V.N., Vinarskaya N.V., Pahuta I.M., Lozovski V.Z. The laser spectroscopy of glycopolymers // Synthetic metals 2002. V.127, N.l. P. 23-28.

101. Kastowsky M., Sabisch A., Gutberlet Т., Bradaczek H. Molecular modeling of bacterial deep rough mutant lipopolysaccharide of Escherichia coli //Eur. J. Biochem. 1991. V.197, N.3. P.707-716.

102. Kastowsky M., Gutberlet Т., Bradaczek H. Molecular modeling of the three -dimensional structure and conformational flexibility of bacterial lipopolysaccharide // J. Bacteriol. 1992. V.174, N.14. P.4798-4806.

103. Lins R.D., Straatsma T.P. Computer simulation of the rough lipopolysaccharide membrane of Pseudomonas aeruginosa II Biophys. J . 2001. V.81, N.2. P.l037-1046.

104. Beer H., Staehelin Т., Douglas H., Braude A.I. Relationship between particle size and biologic activity of Escherichia coli endotoxin // J. Clin. Invest. 1965. V.44, N. 6. P.592-602.

105. Brogden K.A., Philips M. The ultrastructural morphology of endotoxins and lipopolysaccharides // Electron. Microsc. Rev. 1988. V. 1, N. 1. P.261 -277.

106. Като N., Ohta M., Kido N. Ito H., Natio S., Kuno T. Formation of a hexagonal lattice structure by an R-form lipopolysaccharide of Klebsiella sp. II J. Bacteriol. 1985c. V.162, N.3. P.l 142-1150.

107. Okuda K., Fukumoto Y., Takazoe I. Structure of lipopolysaccharide from bacteroides gingivalis//Bull.TokyaDent.Coll. 1985. V.26, N.l. P.197-203.

108. Amano К., Fukushi К Amano. Chemical and ultrastructural differences in endotoxic glycolipids from Salmonella minnesota Re- mutant extracted with various solvent systems // Micribiol. Immunol. 1984. V. 28, N.2. P.135-148.

109. Amano K., Fukushi K. Electron microscopic studies of endotoxins treated with alkaline and acid reagent // Microbiol. Immunol. 1984d. V.28, N.2. P.161-168.

110. Amano K., Fukushi K., Willams J. Electron microscopic studies of lipopolysaccharides from phase 1 and phase 11 Coxiella burnetti И J. General Microbiol. 1985a. V.131, N.l 1. P.3127-3130.

111. Moriyon I., Montanes M. In vitro interactions between lipopolysaccharides and heterologous outer membrane porin proteins // Curr. Microbiol. 1985. V.12, N.l. P. 229-234.

112. Като N., Ohta M., Kido N., Ito H., Natio S., Kuno T. In vitro hexagonal assembly of lipopolysaccharide of Escherichia coli K-12. // Microbiol. Immunol. 1986 c. V.30, N1. P.25-33.

113. Amano K., Fukushi K. Chemical and ultrastructural composition of endotoxins extracted from Salmonella minnesita wild type and R-mutant // Microbiol. Immunol. 1984 b. V.28, N.2. P.149-159.

114. Като N., Ohta M., Kido N., Ito H., Natio S., Kuno T. Stability of the hexagonal lattice formed by an R- form lipopolysaccharide of Klebsiella: Study of long range stability // Micribiol. Immunol. 1986b V.30, N.l. P.13-23.

115. Risco C., Pinto da Silva P. J. Binding of bacterial endotoxins to the macrophages surface: visualization by fracture-flip and immunocytochemistry II J. Histochem. Cytochem. 1993. V.41, N.4. P.601-608.

116. Cox S.T., Eagon R.G. Action of ethylendiaminnetraacetic acid, tris (hydroxyl-methyl)-aminomethane and lysozyme on cell walls of Pseudomonas aeruginosa II Can. J. Microbiol. 1968. V.14, N.8. P.913-922.

117. Rogers S.W., Gilleland H.E., Eagon R.G. Characterization of a protein-Iipopolysaccharide complex released from cell walls of Pseudomonas aeruginosa by ethylendiaminnetraacetic acid // Can. J. Microbiol. 1969. V.l5, N.7. P.743-748.

118. Gmeiner J., Bergman H. and Schlecht S . Molecular organization of the outer membran of Salmonella typhimurium. Different release of lipopolysaccharide mutant cells by EDTA treatment//Arch. Microbiol. 1980.V.124, N. 1.Р. 69-71.

119. Matora L., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structural effects of the Azospirillium lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. 2001. V.2. P.402-406.

120. Novotny A. M., Thomas S., Duron O.S., Relation of structure to function in bacterial O-antigens. 1/ Isolation methods // J. Bacteriol. 1963. V. 85, N. 2. P.418-426.

121. Бондаренко О.Д., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Исследование белкового компонента липополисахарид-белкового комплекса Yersinia pseudotuberculosis II Химия природ, соедин. 1980. № 1. С. 92-97.

122. Wu А.М., MacKenzie N.E., Adams G., Pugh R. Structural and immunochemical aspects of Brucella abortus endotoxins // Adv. Exp. Med. Biol. 1988. V.228, N.4. P.551-576.

123. Brade H. and Galanos G. Isolation, purification, and chemical analysis of the lipopolysaccharide and lipid A of Acinobacter calcoaceticus TCTC 10305 // Eur. J. Biochem. 1982. V.122, N 2. P. 233-237.

124. Perera V.Y., Winter A.J., Ganem B. Evidence for covalent bonding of native hapten protein complexes to smooth lipopolysaccharide of Brucella abortus II FEMS Microbiol.Lett. 1984. V.21. N.2. P. 263-266.

125. Strittmatter W., Galanos C. Characterization of protein coextracted together with LPS in Escherichia coli, Salmonella Minnesota and Yersinia enterocoMtica И Microb.Pathog. 1987. V.2, N.l. P. 29-36.

126. Федореева JI.И., Соловьева Т.Ф., Оводов ЮС. Изучение комплекса липидА-белок из эндотоксина Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 1984. Т. 10, №1 С. 93-99.

127. Helenius A., Simons К. Solubilization of membrane by detergents // Biochim.Biophys.Acta. 1975.V.415, N.l. P.29-79.

128. Федореева Л.И., Соловьева Т.Ф., Оводов ЮС. Выделение и физико-химическая характеристика белка, входящего в состав эндотоксина из Yersinis pseudotuberculosis.И Биоорган, химия. 1989. Т.15, №6. С.737-745.

129. Yamada Н., Mizushima S. Interaction between major outer membrane protein (0-8) and lipopolysaccharide in Escherichia coli K-12 // Eur. J. Biochem. J. 1980. V.l03, Nl.P. 209-218.

130. Hedstrom R.C., Schockley P.K., Eagon R.C. Ethylendiamine-tetraacetate -extractable protein -lipopolysaccharide complex of Pseudomonas aeruginosa: characterization of protein components // J. Bacteriol. 1981. V. 148, N.3. P. 995-997.

131. Rocque W.J., Coughlin R.T., McGroarty E.J. Lipopolysaccharide tightly bound to porin monomers and trimers from Escerichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1987. V.l69, N.3. P.4003-4010.

132. Rosenbusch J.P. Structural and functional properties of porin channels in E.coli outer membranes // Experientia 1990. V.46, N.2. P.167-173

133. Bornelit p., Bleschmidt D., Kleber H.P Lipopolysaccharide-protein interactions: Determination of dissociation constants by affinity electrophoresis // Electrophoresis. 1989 V.10, N. 12. P. 848-852.

134. Набережных Г.А., Хоменко В.А., Красикова И.Н., Ким Н.Ю., Соловьева Т.Ф. Кооперативное взаимодействие между белком-порином и липополисахаридом. // Биоорган, химия. 1996. Т. 22, Вып. 9. С. 671-677 .

135. Stinnett J.D., Eagon R.G. A model system for studing protein-lipopolysaccharide synthesis, assembly, and insertion in the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa//Can. J. Micribiol.1975.V21, N.7. P. 1834-1841.

136. Ried G., Henning U. A unique amino acid substitution in the outer membrane protein OmpA causes conjugation deficiency in Escharichia coli K-12 // FEBS Lett. 1987. V.223, N.2. P.3 87-390.

137. De Cock H., van Blakland S., Tommassen J., In vitro insertion and assembly of outer membrane protein PhoE of Escherichia coli X-12 into the outer membrane // J. Biol. Chem. 1996. V.271, N.22. P.12885-12890.

138. Hagge S.J., De Cock H., Gotsmann Т., Beckers F., Seydel U., Wiese A. Pore formation and function of phosphoporin PhoE of Escherichia coli are determined by the core sugar moiety of lipopolysaccharide // J. Biol.Chem. 2002. V. 277, N.37. P.34247-34253.

139. Brandenburg K., Jurgens G., Andra J., Lindner В., Koch M., Blume A., Garide P. Biophysical characterization of the interaction of high-density lipoprotein (HDL) with endotoxins // Eur.J. Biochem. 2002. V. 269, N.23. P.5972-5981.

140. Pajkrt D., Doran J.W. Van de Poll Т., ten Cate J.W., Van Deventer S.J. Antiinflammatory effects of reconstituted high-density lipoprotein during human endotoxemia // J. Exp. Med. 1996. V.184, N.10.P. 1601-1608.

141. Tobias P.S., Ulevitch R.J. Lipopolysaccharide binding protein and CD 14 in LPS-dependent macrophage activation // Immunobiology. 1993. V.187, N 1. P. 227-232.

142. Little R.G., Kelner D.N., Lim E., Burke D.J., Conlon P.J. Functional domains of recombinant bactericida/permeability increasing protein ( rBPL23) // J. Biol. Chem. 1994. V. 269, N.6. P. 1865-1872.

143. Fray E.A., Miller D.S., Jahr T.G., Sundun A., Bazil V., Espevik Т., Finlay B.B. and Wright S.D. Soluble CD 14 participates in the response of cell to lipopolysaccharide //J. Exp. Med. 1992. V.176, N.6. P.1665-1671.

144. Yu В., and Wtight S.D. Catalytic properties of lipopolysaccharide ( LPS) binding protein //J. Biol. Chem. 1996. V.271, N.8. P. 4100-4105.

145. Tobias P.S., Soldau K., Gegner J.A., Mintz D., Ulevitgh RJ. Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD 14//J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N.18.P. 10482-10488.

146. Gegner J.A., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Lipopolysaccharide ( LPS) signal transduction and clearance //J. Biol. Che.m. 1995. V.270, N. 10. P.5320-5325.

147. Wurfel M.M., Wright S.D. Lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD 14 transfer lipopolysaccharide to phospholipid bilayers . Preferential interaction with particular classes of lipid//J. Immunol. 1997. V.158, N.8. P.3925-3934.

148. Helmann D., Adachi Y.Le ., Ohno N., Yadomae Т., Glauser M.P., Calandra T. Role of plasma, lipopolysaccharide-binding protein, and CD 14 in response of mouse peritoneal exudates macrophages to endotoxin // Infect. Immun. 2001. V.69, N.l. P.378-385.

149. Wurfel M.M., Kunitake S.T., Lichenstein H.S., Kane J.P. and Wright S.D. Lipopolysaccharide (LPS)- binding protein is carried on lipoproteins and acts as cofactor in the neutralization of LPS //J. Exp. Med. 1994. V.180, N.3.P. 1025-1035.

150. Scott M.G. Vreugdenhil A.C., Buurman W.A., Hancock R.E. Gold M. Cationic antimicrobial peptides block the binding of lipopolysaccaharide 9 LPS) to LPS binding protein // J. Immunol. 2000. V.l64. N.2, P.549- 553.

151. Vreugdenhil A.C. Rousseau C.H., Hartung Т., Greve J.W.M., van't Veer C., Buurman W.A. Lipopolysaccharide ( LPS)- binding protein mediates LPS detoxification by chylomicrons //J. Immunol. 2003. V.l 70, N.3. P.1399-1405.

152. Massamiri Т., Tobias P.S., Curtiss L.K. Structural determinants for the interaction of lipopolysaccharide binding protein with purified density lipoproteins: Role of apolipoprotein A-l //J. Lipid Res. 1997. V.38, N.3. P.516-525.

153. Heinzelmann M., Bosshart H. Heparin binds to lipopolysaccharide (LPS) -binding protein, facilitates the transfer of LPS to CD 14, and enhances LPS-induced activation of peripheral blood monocytes // J. Immunology. 2005. V.174, N.4. P.2280-2287.

154. Iovin N., Eastvold J., Elsbach P., Weiss J.P., Gioannini T.L. The carboxyl-terminal domain of closely related endotoxin-binding proteins determines the target of protein-lipopolysaccharide complexes // J.Biol. Chem. 2002. V. 277, N.10. P.7970-7978.

155. Elsbach P., Weiss J. The bactericida/permeability-increasing protein (BPI), a potent element in host-defense against gram-negative bacteria and lipopolysaccharide // Immunobiology. 1993. V.187. N.3, P.417-429.

156. Kellogg T.A., Lazaron V., Wasiluk K.R., Dunn D.L. Binding specificity of polymyxin B, BPI, LALF, and anti-deep core/Iipid a monoclonal antibody to lipopolysaccharide partial structures //J. Biochem. 2001. V.15. N.2. P.124-129.

157. Yoshida M., Roth R.I, Levin J. The effect of cell-free hemoglobin on intravascular clearance and cellular, plasma, and organ distribution of bacterial endotoxin in rabbits //J. Lab. Clin. Med. 1995. V. 126, N 2. P.151-160.

158. Amberson W., Jennings J., Rhode C. Clinical experience with hemoglobin-saline solutions//J. Appl. Physiol. 1949. V.l, N.2. P.469-489.

159. Marks D.H., Cooper Т., Makovec Т., Okerberg C., Lollini L.O. Effect of polymyxin В on hemoglobin- mediated hepatotoxicity // Mil. Med. 1989. V.l54, N.l. P. 180-184.

160. Su D.H., Roth R.I., Levin L. Hemoglobin infusion augments the tumor necrosis factor response to bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) in mice // Crit. Care Med. 1999. V.27, N.3. P.771-778.

161. Whiteford M., Spirig A., Rudolph A., Neville L., Abdullah F., Feuerstein G., Rabinovici. R. Effect of liposome-encapsulated hemoglobin on the development of endotoxin-induced shock in the rat // Shock . 1998. V.9. P. 428-433.

162. Ohno N and Morrison D. Effect of lipopolysaccharide chemotype strucrure on binding and inactivation of hen egg lysozyme // Eur. J. Biochem.1989. V.186, N.3. P. 621-627.

163. Ohno N and Morrison D. Lipopolysaccharide interaction with lysozyme // J. Biol. Chem. 1989. V. 264, N.8. P. 4434-4441.

164. Roth R., Wong J.S., Hamilton R.L. Ultrastructural changes in bacterial lipopolysaccharide induced by human hemoglobin // J. Endotoxin Res. 1996. V.3, N 4. P. 361-366.

165. Akhrem A.A., Andreyuk G.M., Kisel M.A., Kiselev P.A. Hemoglobin conversion to hemichrome under the influence of fatty acids // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 99, N2. P. 191-194.

166. Jurgens G., Muller M., Koch M., Brandenburg K. Interaction of hemoglobin with enterobacterial lipopolysaccharide and lipid A: physicochemical characterization and biological activity // Eur. J. Biochem. J. 2001. V.268, N.l 1. P.4233-4242.

167. Grenier D., Leduc A., Mayrand D. Interaction between Actinobacillus actinomycetemcomitans lipopolysaccharide and human hemoglobin // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V.151, N.l. P.77-81.

168. Gorbenko G.P. Resonance energy transfer study of hemoglobin complexes with model phospholipids membranes // Biophys. Chem. 1999. V.81, N.l. P. 93-105.

169. Archambault M., Olivier M., Foiry В., Diarra M.S, Paradis. SE., Jacques M. Effect of pig hemoglobin binding on some physical and biological properties of Actinobacillus pleuropneumoniae lipopolysaccharide // J. Endotoxin Res. 1997. V.4, N.l. P.53-65.

170. Elass E., Masson M., Mazurier J., Legrand D. Lactoferrin inhibits the lipopolysaccharide-inducec expression and proteoglycan-binding ability of interleukin-8 in human endothelial cells // Infect.Immun. 2002. V.70, N.4. P. 1860-1866.

171. Takayama K., Din Z.Z., Mukerjee P.,Cookt P.H., Kirkland T.N. Physicochemical properties of the lipopolysaccharide units that activates В lymphocytes // J. Biol. Chem. 1990. V.265, N.23. P.14023-14029.

172. Hejna J., and Cameron J.A. Effect on particle size of solubilization of wild-type and re chemotype lipopolysaccharides solubilized with bovine serum albumin and triethylamine//Infect.Immun. 1978.V.l9, N1. P.187-193.

173. Jurgens G., Muller M., Gardiel P., Koch MNJ., Nakakubo H., Blume A., Brandenburg K. Investigation into the interaction of recombinant human serum albumin with Re-lipopolysaccharide and lipid A//J. Endotoxin Res. 2002. V.8, N.2. P.l 15-126.

174. Aguilera O., Quiros L.M., Fierro J.F. Transferrins selectively cause ion efflux through bacterial and artificial membranes // FEBS Lett. 2003. V.548, N.l. P.5-10.

175. Zhang C., Mann D. and Tsai C. Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by a human lactoferrin-derived peptide. // Infect. Immun. 1999. V.67, N.3.1. P. 1353-1358.1

176. Baveye S., Elass E., Mazurier J., Lagrand D. Lactoferrin inhibits the binding of lipopolysaccharides to L-selectin and subsequent production of reactive oxygen species by neutrophils //FEBS Lett. 2000. V. 469, N.l. P.5-8.

177. Tanida N., Ohno N., Adachi Y., Matsuura M., Nakano M., Kiso M., Hasegawa A., Yadomae T. Binding of lysozyme with synthetic monosaccharide lipid A analogue, GLA60 // Biol. Pharm. Bull.1993. V.l6, N.3. P.288-292.

178. Kurasawa Т., Takada K., Ohno N., Yadomae T. Effects of murine lysozyme on lipopolysaccharide-induced biological activities // FEMS Immunol. Med. Microbiol.1996. V.13, N.4. P. 293-301.

179. Brandenburg K., Koch M.H.J., Seydel U. Biophysical characterizations of lysozyme binding to LPS Re and lipid A // Eur. J. Biochem. 1998. V.258, N.2. P. 686695.

180. Ohno N., Tanida N. and Yadomae T. Characterization of complex formation between lipopolysaccharide and lysozyme // Carbohydr. Res. 1991. V.214, N.l.1. P. 115-130.

181. Jolles P., and Jolles J. What's new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday//Mol. Cell. Biochem. J. 1984. V.63, N.2. P.165-189.

182. Takada K., Ohno N., and Yadamae T. Binding of lysozyme to lipopolysaccharide suppresses tumor necrosis factor production in vivo II Infect. Immun. 1994. V.62, NAP. 1171-1175.

183. Thomas C.J, Surolia A. Kinetic of the interaction of endotoxin with polymyxin В and its analogs: a surface plasmon resonance analysis //. FEBS Lett. 1999. V.445, N.2. P.420-424.

184. Brade L., Hoist 0., Brade H. An artificial glycoconjugate containing the bisphosphorylated glucosamine disaccharide backbone of lipid A binds monoclonal antibodies //Infect. Immun. 1993. V.61, N.10. P. 4514-4517.

185. Wakabayashi G., Gelfand J.A., Burke J.F., Thompson R.C., Dinarello C.A. A specific receptor antagonist for interleukin 1 prevents Escherichia coli - induced shock in rabbits //FASEB J. 1991. V.5, N.3. P.338-343.

186. Storm D.R., Rosenthal К. Polymyxin and related peptides antibiotics // Annu. Rev. Biochem. J. 1977. V.46, N1. P.723-763.

187. Vaara M., Vaara Т. Polycations as outer membrane disorganizing agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1983. V.24, N.2. P. 114-122.

188. Morrison D.C. and Jacobs D.M. Binding of polymyxin В to the lipid A portion of bacterial lipopolysaccharides // Immunochemistry. 1976. V.13, N 10.1. P.813-818.

189. Bhor V.M., Thomas C.J., Surolia N., Surolia A. Polymyxin В : An ode to an old antidote for endotoxic shock // Molecular Biosystems. 2005. V.382, N.3. P. 213-222.

190. Brandenburg K., Arraiza M.D., Lehwark-Ivetot G., Moriyon I., Zahringer U. The interaction of rough and smooth form lipopolysaccharides with polymyxins as studied by titration calorimetry // Therm. Acta. 2002. V.382, N.l. P.53-61.

191. Moore R.A., Bates N.C., and Hancock R.E. Interaction of polycationic antibiotics with Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide and lipid A studied by using dansyl-polymyxin // Antimicrob. Agents Chemoter. 1986. V.29, N3. P.496-500.

192. Kahle C., Koch P.J., Durr W., Kastowsky M., Bradaczek H. Active penetration of charged peptides into monomolecular films of deep rough mutant lipopolysaccharide// Thin Solid Films. 1996. V.284/285, N.4. P.802-804.

193. Koch P.J., Frank J., Schuler J., Kahle C. and Bradaczek H. Thermodynamics and structural studies of the interaction of polymyxin В with deep rough mutant lipopolysaccharides//J. Colloid. Interface Sci. 1999.V.213, N.3. P.557-564.

194. Srimal S., Surolia N., Balasubramanian S. And Surolia A. Titration calorimetric studies to elucidate the specificity of the interactions of polymyxin В lipopolysaccharides and lipid A // Biochem. J. 1996. V.315, N2. P.679-686.

195. Kaca W., Radzitjewska-Lebrech M., Bhal U. Effect of polymyxins on the lipopolysaccharide-defective mutants of Proteus mirabilis И 1990. Microbios. V.61, N.l. P. 23-32.

196. Pristovsek P., Kidric J. Solution structure of polymyxins В and E effect of binding to lipopolysaccharide: An MMR and molecular modeling study // J. Med. Chem. 1999. V.42, N.22. P.4604-4613.

197. Yin N., Marshall R.L., Matheson S., and Savage P.B. Synthesis of lipid A derivatives and their interactions with polymyxin В and polymyxin nonapeptide // J. Am. Chem. Soc. 2003. V.125, N.9. P.2426-2435.

198. Lopes J. and Innis W. Electron microscopy of effect of polymyxin on Escherichia coli lipopolysaccharide // J. Bacterid. 1969. V.l00, N. 2. P. 1128-1130.

199. Hanasawa K., Tani Т., Kodama M. New approach to endotoxin and septic shock by means of polymyxin В immobilized fiber // Surg. Cynecol Obstet. 1989. V. 168, N.2. P.323-331.

200. Boons M.A., Verhoeven M.L. Sluyterman L.A. and Buck H.M. Mechanism and improvement of complex formation between LPS and polymyxin В that is immobized in an ion exchanger// Appl. Biochem. J. Biotechnol. 1989. V.2, N.l.1. P. 95-107.

201. Drabick J.J., Bhattacharjee A.K., Williams W„ Siber G. and Cross A.S. Covalent polymyxin S- starch and polymyxin B- immunoglobulin G conjugates as novel antiendotoxin reagents // Clin. Res. 1992. V.40, N.2. P. 289-293.

202. Bucklin S.E., Lake P., Logdberg L. and Morrison D.C. Therapeutic efficacy of a polymyxin B- dextran 70 conjugate in experimental model; of endotoxemia // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. V. 39, N.7. P.1462-1466.

203. Issekult A.C., Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography//J. Immunol. Methods. 1983. V.61, N.3. P. 275-281.

204. Nakamura Т., Kawagoe Y., Suzuki Т., Shoji H., Ueda Y., Kobayashi N. , Koide H. Change in plasma interleukin -18 by direct hemoperfusion with polymyxin B-immobilized fiber in patients with septic shock // Blood purif. 2005. V.23, N.6. P.417-420.

205. Васильева Г.И., Беспалова И.А., Киселева A.K., Веркине JI.M., Дорошенко Е.П., Пятибратов A.M. Влияние модификации липополисахарида чумного микроба на нейтрофилокининдуцирующую активность // Микробиол. журн. 1997. Т.59, №2. С.61-67.

206. Andersson М., Giorard R., Cazenave P. Interaction of NK-lysine, a peptide produced by cytolytic lymphocytes, with endotoxin//Infect. Immun. 1999. V.67, N. 1. P. 201-205.

207. Andra J., Lamata M., de Tejada G.M., Bartels R., Koch M.H., Brandenburg K. Cyclic antimicrobial peptides based on Limulus anti-lipopolysaccharide factor for neutralization of lipopolysaccharide //Biochem. Pharm. 2004. V.68, N.7. P.1297-1307.

208. Minobe S., Watanabe Т., Sato Т., Tosa T. and Chibata I. Preparation of absorbents for pyrogen adsorption // J. Chromatogr. 1982. V.248, N.3. P.401-408.

209. Minobe S., Watanable Т., Sato Т., Tosa Т., Characteristics and applications of absorbents for pirogen removal // Biotechnol. Appl. Biochem. J. 1988. V.10, N.l. P.143-149.

210. Darkow R., Groth Th., Albrecht W., Lutzow K., Paul D. Functionalized nanoparticles for endotoxin binding in aqueous solution // Biomaterials. 1999. V.2, N.14. P. 1277-1283.

211. Ding J.L. Zhu Yong, Ho Bow. High-performance affinity capture-removal of bacterial pyrogen from solutions // J. Chromatogr. 2001. V.759, N.2. P.237-246.

212. Zhang J.P. Wang Q., Smith T.R., Hurst W.E. Sulpizio T. Endotoxin removal using a synthetic absorbent of crystalline calcium silicate hydrate // Biotechnolog. Progress. 2005. V.21, N.4. P.1220-1225.

213. Jacobs E.R. Overview of mediators affecting pulmonary and systemic vascular changes in endotoxemia // In: Handbook of endotoxin . Eds. Hinshaw J.B. Elsevier: Amsterdam-New York-Oxford. 1985. V.2. P. 1-10.

214. Bone R.C. The pathogenesis of sepsis// Ann. Inter. Med. 1991. V.l 15, N.6. P. 457-469.

215. Малеев B.B., Полякова A.M., Кравченко A.B. Некоторые механизмы возникновения и развития ДВС-синдрома при бактериальных инфекциях // В кн.: Нарушение гемостаза при инфекционных заболеваниях. ДеНова: Москва. 2005. С. 49-61.

216. Benner R., Van Oudenaren A. Antibody formation in mouse bine marrow. V. The response to the thymus-independent antigen Escherichia coli lipopolysaccharide // Immunology. 1976. V.30, N. 1. P. 49-57.

217. Rudbuch J.A., Molecular immunogenicity of bacterial lipopolysaccharide antigens : establishing a quantitative system // J. Immunol. 1971. V.l06. N.4. P. 993-998.

218. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Успехи соврем, биол. Т.90. Вып. 1(4), С.62-79.

219. Morrison D.C., Kline L.F. Activation of the classical and proper din pathways of complement by bacterial lipopolysaccharides // J. Immunol. 1977. V.l 18, N.2. P. 362-368.

220. Chen Y.C., Wang S.Y. and King C.C. Bacterial lipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD 14-dependent mechanism//J. Virol. 1993. V.73, N.4. P.2650-2657.

221. Telepnev М., Golovlev I., Grundstrom T Francisella tularensis inhibits Tolllike receptor-mediated activation of intracellular signaling and secretion of TNF-a and IL-1 from murine macrophages //Cell Microbiol. 2003. V.5, N. 1. P. 41-51.

222. Loppnow H., Libby P. Adult human vascular endothelial cells express the IL-6 gene differently in response to LPS and IL-1 // Cell Immunol. 1989. V.122. P. 493-503.

223. Friedman H., Klein Т., Specter S., Newton C. and Nowotny A. Immunoadjuvanticity of endotoxins and nontoxic derivatives for normal and leukemic immunocytes // Adv. Exp. Med. Biol. 1990. V.256, N.3. P.525-535.

224. Qureshi N., Kutuzova G., Takayama K., Rice P.A., and Golenbock D.T. Structure of lipid A and cell activation//J. Endotoxin Res. 1999. V.5, N.3. P.147-150.

225. Seydel U., Wiese A., Schramm A.B., Brandenburg K. A biophysical view on the function and activity of endotoxins // In Endotoxin in Health and Disease. Eds. Morrison D., Brade H., Opal S., Vogel S. Marcel Dekker: New York. 1999. P. 195-220.

226. Seydel U., Oikawa M., Fukase K., Kusumoto S., Brandenburg K. Intrinsic conformation of lipid A is responsible for agonistic and antagonistic activity // Eur. J. Bacterid. 2000 b-. V.267, N.21. P.3032-3039.

227. Shnyra A., Hultenby K., Lindberg A.A. Role of the physical state of Salmonella lipopolysaccharide in expression of biological and endotoxic properties // Infect. Immun. 1993. V.61, N.12. P.5351-5360.

228. Mueller M., Scheel O., Lindberg В., Gulsmann Т., Seydel U. The role of membrane-bound LBP, endotoxin aggregates, and the Maxik channel in LPS-induced cell activation // J. Endotoxin Res. 2003. V.9, N.2. P.181-186.

229. Mueller M., Lindner В., Kusumoto S., Fukases K., Schramm А.В/ Seydel U. Aggregates are the biologically active units of endotoxin // J. Biol. Chem. 2004. V.279, N. 25. P.26307-26313.

230. Toman R., Garidel P., Andra J., Slaba K., Hussein A., Koch M.H., Brandenburg K. Physicochemical characterization of the endotoxins from Coxiella burnetii strain Priscilla in relation to their bioactivities // BMC Biochemistry. 2004. V.5, N.l. P. 1-11.

231. Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека // Автореф. дис. д-ра мед. наук. 1993. М.: РАМПО. 58С.

232. Yakovlev M. Elements of endotoxin theory of human physiology and pathology: systemic endotoxinemia, endotoxin aggression and endotoxinm insufficiency // J. Endotoxin Res. 2000. V.6, N.2. P. 120

233. Вышегуров Я.Х., Яковлев М.Ю. Эндотоксиновая агрессия в патогенезе левитов неясной этиологии // Успехи соврем, биол. 2004. Т. 124, № 6. С. 581-588.

234. Чижиков Н.В., Аниховская И.А., Лиходед В.Г., Салахов И.М., Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия в патогенезе атеросклероза // Успехи соврем, биол. 2001. Т.121, №3. С. 266-274.

235. Wiederman С.J., Kiechl S., Dunzendorfer S., Schratzberger P., Rgger G., Oberhollenzer F., Willeit J. The role of immune activation in endotoxin-induced parthenogenesis //J. Endotoxin Res. 2001. V.7, N.4. P.322-326.

236. Ахмина Н.И. Перитональная охрана здоровья детей с конституциональной предрасположенностью к заболеваниям // Автореф. дис. д-ра мед. Наук М.: РАМПО. 2000. 48С.

237. Анохин В.А. Патогенетическое значение эндотоксинемии и изменений активности антиэндотоксиновой защиты при ОРВИ у детей // Автореф. дис. д-ра мед. наук М.: РАМПО. 1994.48С.

238. Domszy J.G., Roberts G.A. Evaluation of infrared spectroscopic techniques for analyzing chitosan//Makromol. Chem. 1985. V. 186, N. 8. P.1671-1677.

239. Anthonsen M. W., Varum К. M., and O. Smidsrod. Solution properties of chitosans: conformation and chain stiffness of chitosans with different degrees of N-acetylating // Carbohydr. Polym. 1993. V.22, N.2. P. 193-201.

240. Гамзазаде А.И., Шлимак B.M., Склар A.M., Штыкова Э.В., Павлова С.-С.А., Рогожин С.В. Исследование гидродинамических свойств растворов хитозанов. //Высокомолекул. соед. 1985. Т.36, № 8. Р. 420-424.

241. Гамзазаде А.И., Склар A.M., Павлова С.-С.А., Рогожин С.В. О вязкостных свойствах растворов хитозана// Высокомолекул. соед. А. 1981. Т 23,1. N. 3. Р. 594-597.

242. Colfen Н., Berth G., Dautzenberg Н. Hydrodynamic studies on chitosans in aqueous solution // Carbohydr. Polym. 2001. V.45, N.4. P.373-383.

243. Ehrlich H., Krajewska В., Hanke Т., Born R., Heinemann S., Knieb C., Worch H. Chitosan membrane as a template for hydroxyapatite crystal growth in model dual membrane diffusion system // J. Membrane Science. 2006. V. 273, N.l. P.124-128.

244. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects an update // J. Pharm. Pharmacol. 2001. V.53, N.8. P. 1047-1067.

245. Vila A., Sanchez A., Janes K., Behrens I., Kissel T. VilaJato J.L., Alonso M.J. Low molecular weight chitosan nanoparticles as new carriers for nasal vaccine delivery in mice//Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V.57, N.l. P.123-131.

246. Thanou M., Florea Bi., Geldof M., Junginger H.E., Borchard G. Quaternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials. 2002. V.23, N.l. P.153-159.

247. Ильина A.B., Варламов В.П. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41, №1. С. 9-16.

248. Чернецкий В.Н., Нифантьев Н.Э Хитозан вещество XXI. Есть ли у него будущее в России? // Российский хим. жур. 1997. Т. 41. С. 80-85.

249. Muzzarelli С., Muzzarelli R.A.A. Natural and artificial chitosan-inorganic composites // J. Inorg. Biochem. 2002. V.92, N.l. P. 89- 92.

250. Anthonsen M. W., Varum К. M., and O. Smidsrod. Solution properties of chitosans: conformation and chain stiffness of chitosans with different degrees of N-acetylating // Carbohydr. Polym. 1993. V. 22, N.3. P.193-201.

251. Беркович Л.А., Тимофеева Г.И., Цюрупа М.П., Даванков В.А. Гидродинамические и конформационные параметры хитозана // Высокомолекул. соед. А. 1980. Т. 22, N8. Р.1834-1841.

252. Sorlier P., Denuziere A., Viton С., Domard A Relation between the degree of acetylation and the electrostatic properties of chitin and chitosan // Biomacromolecules. 2001. V.2, N.3. P. 765-772.

253. Chuang W.Y., Young Т.Н., Yao C.H., and Chiu W.Y. Properties of the poly(Vinyl-alcohol)/chitosan blend and its effect on the culture of fibroblast in vitro II Biomaterials. 1999. V.20, N.16. P.1479-1487.

254. Wang W., Во S., Li S., and Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degrees of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. 1991. V.13, N. 2. P.281-285.

255. Philippova O., Volkov C.,Sitnikova N., Khokhlov A. Two types of hydrophobic aggregates in aqueous solutions of chitosan and its hydrophobic derivative // Biomacromolecules. 2001. V.2, N.2. P.483-490.

256. Amiji M.M. Pyrene fluorescence study of chitosan self-association in aqueous-solution // Carbohydr. Polym. 1995. V. 26, N. 3. P.211-213.

257. Нудьга JI.A., Петрова B.A., Бочек A.M., Каллистов O.B., Петрова С.Ф., Петропавловский Г.А. Макромолекулярные и надмолекулярные превращения в растворах хитозана и аллилхитозана // Высокомолекул. соед. Б. 1997. Т. 39, № 7.1. С. 1232-1236.

258. Chapman, V.J. and D.J. Chapman // In: Seaweeds and Their Uses. Eds H. Gooa Chapman and Holl: London. New York. 1980.334P.

259. Craigie J.S. Cell wall // Biology of the Red Algae; Cambridge: Cambridge University Press, 1990. P. 221-257.

260. Falshaw R. and R. Furneaux. Carrageenan from the tetrasporic stage of Gigartina decipiens (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. 1994. V.252, N. 1. P. 171-182.

261. Falshaw R., Richard H. Furneaux and David E. Stevenson. Structural analysis of carrageenans from the red alga, Callophyllis hombroniana Mont. KTjtz (Kallymeniaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Research: 2005. V. 340, N.6. P. 1149-1158

262. Stortz C., Bacon В., Cherniak R., Cerezo A. High field NMR spectroscopy of cystocarpic and tetrasporic carrageenans from Iridaea undolosa II Carbohyd. Res. 1994. V. 261, N.2. P.317-326.

263. Bulboa C.R., Macchiavello J.E. The effects of light and temperature on different phases of the life cycle in the carrageenan producing alga Chondracanthus chamissoi (Rhodophyta, Gigartinales) // Bot. Marina. 2001. V. 44, N.4. P.371-374.

264. Bixler, H.J. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan //Hydrobiologia 1996. V.326/327, N.l. P. 35-57.

265. Ekstrom, L.-G. Molecular weight distribution and the behavior of kappa-carrageenan on hydrolysis//Carbohydr. Res. 1985.V.135, N.2. P.283-289.

266. Ueda, K. and J. Brady. Molecular dynamics simulations of carrabiose// Biopolymers. 1997. V.41, N2. P. 323-330.

267. Borgstrom J., L. Piculell, C. Viebke, and Y. Talmon. On the structure of aggregated kappa- carrageenan helices. A study by cryo-TEM, optical rotation and viscometry // Int. J. Biol. Macromolecules .1996. V.18. N1. P. 223-229.

268. Borgstrom, J., P., Quist, and L. Piculell. A novel chiral nematic phase in aqueous к-Carrageenan//Macromolecules 1996a V.29, N. 10. P.5926-5933.

269. Piculell, L. Gelling carrageenans // In: Food Polysaccharides and Their Applications. Ed A.M. Stephen. Marcel Dekker: New York. 1995. P. 205-244.

270. Hosseinzadeh H., Pourjavavdi A;. Zohuriaan-Mehr M.J. Modified carrageenan. 2. Hydrolyzed crosslinked JC-carrageenan-g-PAAm as a novel smart superabsorbent hydrogel with low salt sensitivity // J. Biomater. Sci. 2004. V.15, N.l2. P. 1499-1511.

271. National Research Council. Food Chemical Codex. 4th ed. Washington, DC: National Academy of Science. 1996

272. Nacife V.P., Soeiro M.N., Araujo-Jorde T.C., Neto H.C., Meirelles M.N. Ultrastructural, immunocytochemical and flow cytometry study of mouse peritoneal cells stimulated with carrageenan // Cell Struct. Funct 2000. V.24, N.2. P.337-350.

273. Nacife V.P., Soeiro M.N., Gomes R.N., Avilla H.D., Neto H.C., Meirelles M.N. Morphological and biochemical characterization of macrophage activated by carrageenan and lipopolysaccharide in vivo II Cell Struct. Funct .2004. V.29, N.l. P.27-34.

274. Food and Drugs: 21 C.F.R. 133.178, 133.179, 136.110, 139.121, 139.122, 150.141, 150.161, 176.170 (2000b)

275. Food and Drugs: Substances Generally Regarded as Safe. 21 C.F.R. 182.7255 (1999b).

276. Tobacman, J.K., R.B. Wallace, and M.B. Zimmerman. Consumption of carrageenan and other water-soluble Polym. J. s used as food additives and incidence of mammary carcinoma//Med. Hypothesis. 2001 V.56, N.3. P.589-598.

277. Tache, S., G. Peiffer, A.-S. Millet, and D.E. Corpet. Carrageenan gel and aberrant cryptofoci in the colon of conventional and human flora-associated rats // Nutr. Cancer 2000. V.37, N.l. P.75-80.

278. Tateda, К., K. Irifune, K. Tomono, Y. Hirakata, T. Matsumoto, M. Kaku, and Yamaguchi. Potential activity of carrageenen to enhance antibacterial host-defense system in mice // J. Infect. Chemother. 1995. V.l, N 1. P. 59-63.

279. Sugita-Konishi Y., Yamashita S., Amano F., Shimisu M. Effect of carrageenans on the binding, phagocytotic and killing abilities of macrophages to Salmonella // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V.67, N.6. P.1425-1428

280. Abe Т., Kawamura H., Kawabe S. Watanable H., Gejyo F., Abo T. Liver injury due to sequential activation of natural killer cells and natural killer T cells by carrageenan // J. Hepatol. 2002. V.36, N. 5. P. 614 623.

281. Carlucci M. J., Ciancia M., Matulewicz M. C., Cerezo A. S., Damonte E. B. Antherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types //Antiviral. Res. 1999a. V. 43, N.l. P. 93 102.

282. Carlucci M. J., Scolaro L. A., Damonte E. B. Inhibitory action of natural carrageenans on Herpes simplex virus infection of mouse astrocytes // Chemotherapy. 1999b. V. 45, N.6. P. 429-436.

283. Carlucci M. J., Scolaro L. A., Damonte E. B. Herpes simplex virus type 1 variants arising after selection with an antiviral carrageenan: Lack of correlation between drug susceptibility and syn phenotype // J. Med. Virol. 2002. V.68, N.l. P.92 98.

284. Kolender, A.A., M.C. Matulevicz, and A.S. Cerezo. Structural analysis of antiviral sulfated alpha-D-( 1-3)-linked mannans // Carbohydr. Res. 1995. V.273, N.2. P.179-185.

285. Pratt-Pearce, R. and D. Phillips. Sulfated polysaccharides inhibit lymphocyte to epithelial transmission of HIV // Biol. Reprod. 1996. V.54, N.l. P. 173-182

286. Shimotoyodome, A., S. Meguro, T. Hase, I. Tokimitsu, and T. Sakata. Sulfated polysaccharides, but not cellulose, increase colonic mucus in rats with loperamide-induced constipation//Dig. Dis. Sci. 2001. V.46, N.7. P.1482-1489.

287. Irifune, K. Alveolar destruction in experimental Klebsiella pneumonia II Acta Pathol. Jpn. 1987. V.37, N.2. P. 475-486.

288. Fujiki K., Shin Dong-Ho, Nakao M., Yano T. Protective effect of к-carrageenan against bacterial infections in carp Cyprinus carpio II J.Fac.Agr. Kyushu Univ. 1997. V. 42, N.l/2. P.I 13-119.

289. Tsubakura M., Itagaki K., Kamawura K., Sasaki Т., Magai T. Studies on Yersinia (Pasteurella) pseudotuberculosis. 11. A new type of Y. pseudotuberculosis, type 11, and subdivision of type Y. strains//Jap. J. Vet. Sci. 1971. V.33, N3. P. 137-144.

290. Leive L., Shovlin U.K. Physical, chemical and immunological property of lipopolysaccharide released from Escherichia coli by EDTA acid //J. Biol.Chem., 1968. V.2, N.23. P.6384- 6391.

291. Marvin H.J.P. Ter Beest M.B.A. Witholt B. Release of outer membrane fragments from wild-type Escherichia coli and from several E. coli lipopolysaccharide mutants by EDTA and heat shock treatments // J.Bacteriol.1989. V.l71, N.10.1. P. 5262-5267.

292. Brown M.R.W., Williams P. The influence of environmental on envelope properties affecting survival of bacteria in infections // Ann. Rev. Microbiol. 1985. V. 39, N.2. P.527-556.

293. Тимченко Н.Ф., Сомов Г.П. Патогенетическое значение психрофильности Yersiniapseudituberculosis Н Журн.микробиол. 1986. № 3. С. 3438.

294. Galanos С., Luderitz О., and Westphal О. A new method for the extraction of R-lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. J. 1969. V.9, N.l. P. 245-249.

295. Kawaoka Y. Otsuki K., Tsubokura M. Growth temperature- dependent variation in the bacteriophage -inactivating capacity and antigenicity of Yersinia enterocolitica lipopolysaccharide // J. Gen Microbiol. 1983. V.129, N.12. P.2739-2747.

296. McConnel M., Wright AJ Variation in the structure and bacteriophage-inactivating capacity of salmonella anatum lipopolysaccharide as a function of growth temperature //J. Bacterid. 1979. V.l 37, N.2. P. 746-751.

297. Burclay A.B., Eason R. A quantitative study of binding of glycine-arginine rich histone to DNA // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V.269, N.l. P. 37-46.

298. Coughlin R.T., Tonsager S., McGroarty E.J. Quantitation of metal cations bound to membranes and extracted lipopolysaccharide of Escherichia coli II Biochemistry. 1983. V.22, N.8. P.2002-2007.

299. Raetz C.R.H. and Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71, N. 3. P. 635-700.

300. Jackson J.J., Kropp H. Differences in mode of action of p-lactam antibiotics influence morphology, LPS release and in vivo antibiotic efficacy // J. Endotox. Res. 1999. V.3, N. 3. P.201 -218.

301. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия //. М.: Мир. 1984. Т.2. С. 222-308.

302. Maghami G.G., and Roberts G. A. F. // Evaluation of the viscometric constants for chitosan//Makromol.Chem. 1988. V.l89, N.L P. 195-200.

303. Глазунов В.П., Горбач В.И. Спектрофотометрическое определение содержания аминогрупп в хитозане // Биоорган, химия 1999. Т. 25. N 3. С. 216-219.

304. Маршел Э. Биофизическая химия // М.: Мир 1981.Т.1. С. 80-96

305. Stincon R.A. Holbrook J.J. Equilibrium binding of nicotinamide nucleotides to lactate dehydrogenases//Biochem. J. 1973. V.l31, N.l. P.80-89.

306. Craigie J.S. Cell wall // In : Biology of the Red Algae. Eds.: K.M. Cole and R.V. Sheath. Cambridge University Press: Cambridge. 1990. P. 221-257.

307. Falshaw, R. and R. Furneaux. Carrageenans from the tetrasporic stages of Gigartina clavifera and Gigartina alveate (Gigartinaceae, Rhodophyia) // Carbohydr. Res. 1995. V276, N.l. P.155-165.

308. Takano R., Nose Y., Hayashi К., Hara S., Hirase S. Agarose-carrageenan hybrid polysaccharide from Lomentaria catenata //Vhytochemistry. 1994. V.37, N.9.1. P. 1615-1619.

309. Miller I.J. The chemotaxonomic significance of the water-soluble red algal polysaccharides // Recent Research Developments in Phytochemistry. 1997. V. 1. P. 531565.

310. Khavryutchenko V.D.,. Khavryutchenko A. V. DYQUAMOD: Dynamic quantum modeling software for personal computers // Joint Inst. Nucl. Researches., Dubna and Inst. Surf. Chemistry, Nat. Acad. Sci. Ukraine: Kiev, 1993. P. 13

311. Augusto, L.A., Li, J., Synguelakis, M., Johansson, J., and Chaby, R. Structural basis for interactions between lung surfactant protein С and bacterial lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, N.26. P. 23484-23492.

312. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. // Биокинетика. Фаир-пресс: Москва. 1999. 395С.

313. Novotny, A. Determination of toxicity // In: Basic Exercises in Immunochemistry. Springer-Verlag: Berlin-Heidelberg. N.York . 1979. P.303-304.

314. Otterlei M., Varum K.M., Ryan L., Espevik T. Characterization of binding and TNF-a-inducing ability of chitosans on monocytes: the involvement of CD 14 //Vaccine. 1994. V.12, N. 9. P. 825-832.

315. Chou T.-C., Fu E., Shen E.-C. Chitozan inhibits prostaglandin E2 formation and cyclooxygenase-2 induction in lipopolysaccharide-treated RAW 264.7 macrophages. //Biochem. Biophys. Res. Com. 2003. V. 308, N.l. P. 403-407.

316. Кузнецова T.A Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства липополисахарида псевдотуберкулезного микроба // Автореф. дис. к -та мед.наук. -Владивосток, 1987. 39С.

317. Steidler L. Microbiological and immunological strategies for treatment of inflammatory bowel disease// Microb. Infection. 2001. V.3, N.13. P. 1157-1166.

318. Потиевский Э.Г. О возможных механизмах антимикробного действия пектина при острых инфекционных диареях // Антибиотики и химиотерапия. 1996. Т.41, № 7/8. С. 40-42.

319. Tateda К. Matsumoto Т., Yamaguchi К. Acute induction of interleukin-6 and biphasic changes of serum complement C3 by carrageenan in mice // Mediators Inflamm. 1998. V.7. P. 221-223.

320. Wahl A.F., Wallace P.M. Oncostatin M in the anti-inflammatory response // Ann. Rheum. Dis. 2001. V.60, N.3. P. 75-80

321. Симбирцев А.с. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета// Иммунология 2005. №.6. С.368-377.

322. Risco С., Dominguez J.E., Bosch М.А., Carrascosa J.L. Biochemical and electron microscopy analysis of the endotoxin binding to microtubules in vitro И Mol. Cellular Biochem. 1993. V. 121, N.l. P. 67-74.

323. Vanneste K. et al Light scattering studies of the dilute solution behavior of kappa, iota and lambda carrageenan // Food Hydrocolloids. 1996. V.l0, N.l. P. 151 -159.

324. Girod S., Cara L., Maillols H., Salles J.P., Devoisselle J.M. Relationship between conformation of polysaccharides in the dilute reqime and their interaction with a phospholipids bilayer // Luminescence. 2001. V. 6. N.l. P. 109-116.

325. Porcar I., Garcia R, Gomez C, Campos A, Abad C. Macromolecules in ordered media: 7. Influence of ionic strength and bilayer composition on the association ofpolyelectrolytes to mixed liposomes//Polymer J. 1997. V.38, N.20. P.5107-5113.

326. Dubois M ,Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F Colororimetric method for determination of sugar and related substances.// Anal. Chem. 1956. V.28. P. 350-356.

327. Elson L.A., Morgan W.T. Colorimetric method for determination of hexosamine //Biochem. J. 1933. V.27, N.ll.P. 1824-1826.

328. Burtseva T.I., Glebco L.I., and Ovodov Yu.S. A method for separative quantative determination of 2-keto-3-deoxyoktolonate and 3,6-dideoxyhexose in mixture //Anal. Biochem. J. 1975. V. 65, N. 1. P. 1-4 .

329. Lowry O.H., Rosebrough N/I. Farr A.L. Randall R.I. I. Protein measurement with Folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. V.193, N.l. P.265-275.

330. Sawardeker J.S. Sloneker J.H., Jlanes A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromotograhhy // Anal.Chem.1965. V.37, N.12. P. 602-1604.

331. Englyst, H.N., Cumming, J.H. Simplified Method for the Measurement of Total Non-Starch Polysaccharides by Gas Liquid-Chromatography of Constituent Sugars As Alditol Acetates//Analyst. 1984. V.109, N.7. P.937-942.

332. Усов, А.И., Элашвили, М.Я. Количественное определение производных 3,6-ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красныхводорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорган. Химия. 1991. Т. 17, №6. Р. 839-848.

333. Dodgson, K.S., Price, R.G. A note on the determination of the ester sulphate content ofsulphated polysaccharides//Biochem. J. 1962. V.84, N.l. P.106-110.

334. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. 1970. V.227, N.5259. P.680-685.

335. Wolfrom M.,L. and Shen Han T.M The sulfonation of chitosan / J.Am. Chem. Soc. 1959. V.8. P.1764-1677.

336. Inman J. and Dintzis H. Analitical determination of NH2- groups // Biochem. J. 1969. V.8, N.10. P.4074-4082.

337. Бейли H. Статистические методы в биологии // М.: Мир. 1963. 224С.

338. Elias Y.D. Ultrazentrifugen methoden // Beckman Instruments-Munchen.1961.573P.

339. Меньшов B.M. Методы определения средних молекулярных масс из данных седиментационного равновесия в ультрацентрифуге // В кн.: Аналитическое ультрацентрифугирование в химии и биохимии. Душанбе: Дониш. 1987. С.26-378.

340. Боуэн Т. Введение в ультрацентрифугирование // М.:Мир. 1973 356С.

341. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия // М.: Мир.1984. Т.З. 458С.

342. De Haas C.J.C., van Leeuwen H.J., Verhoef J., van Kessel K., van Strijp J. Analysis of lipopolysaccharide (LPS)- binding characteristics of serum components using gel filtration of FITC-labeled LPS // J. Immunol. Methods. 2000. V.242, N.L P. 79-89.

343. Galanos C., Freudenberg M.A., Reutter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V.76. P. 5939-5943.

344. Novotny, A. Determination of toxicity // In: Basic Exercises in Immunochemistry. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg. N.York 1979. P. 303-304.

345. Wu. W. Home F., Williams C. Immune paralysis induced by pneumococcal polysaccharide. 1. peritoneal cell phagocytic activity and interaction with spleen cells // J. Immunol. 1971.V.107, N.12. P. 1545-162.

346. Borsas Т., Dunkel V.C. Langone J.J. Immunoassay of antigens and haptens by inhibition of passive immune hemolysis // J. Immunol. Meth. 1980. V.32, N.2. P. 105-114.

347. Engvall E. Enzyme immunoassay ELISA and EMIT // Methods in Ensymol. Eds. H. Van Vinakis, J.J.Langone New York: Academic Press. 1980. V.70, P.419-438.

348. Lagrange P.H., Maskaness G.B., Miller T.E . Effects of bacterial lipopolysaccharide on the induction and expression of cell-mediated immunity // J. Immunol. 1975. V. 114, N.l/2. P.442-446.

349. Машковский М.Д. Фармакологическое и токсическое изучение химиотерапевтических препаратов // В кн.: Методы экспериментальной химиотерапии. М.: Медицина. 1971. С. 524-537.

350. Jerne N. and Nordin. Plague formation in agar by single antibody production cell//J, Immunol. 1975. V. 139.N.3.P. 223-240.

351. Lasfargues A., and Chaby R. Endotoxin-induced tumour necrosis factor (TNF): selective triggering of TNF and interleukin-1 production by distinct glucosamine-derived lipids// Cell. Immun. 1988. V.l 15, N.L P. 65-178.

352. Manna S.K., Aggarwal B.B. Lipopolysaccharide inhibits TNF-induced apoptosis: Role of nuclear factor-kappa В activation and reactive oxygen intermediates // J. Immunol. 1999. V.l62, N.3. P.1510-1518.

353. Bienvenu J., Doche Ch., Gutowski M., Lenoble M., Pedrix J. Production of proinflammatory cytokines and cytokines involved in the TH1/TH2 balance is modulated by pentoxifylline //J. Cardiovasc. Pharmacol. 1995. V.25, N2. P.80-84.

354. Born J. Aggregation of blood platelets by adenosine diphoshate and its reversal // Nature. 1962. V. 194, N. 2. P.504-511.

355. Gardenfors A., Nilsson F., Skagerberg G. et al. Cerebral physiological and biochemical changes during vasogenic brain oedema induced by intrathecal injection of bacterial lipopolysaccharides in piglets.// Acta Neurochir 2002. V.144, N.6. P. 601 -609.

356. De Moore P., Stoeno O., Raskin M., Hehorix A. Fluorimetric determination of the plasma 11-hydroxysteroids in man // Acta Endocrino.l 1960.V. 33, N.2 P. 297-307.

357. Фурдуй Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов. Кишинев: Штиинца. 1986.240С.

358. Seifter S., Dayton S., Novic В., Muntwyler E. The estimation of glycogen with the antrone reagent // Arch. Biochem. 1950. V.25, N1. P.828-835.

359. Hohorst H.J. L-Lactat. Bestimmung mit Lactate-Dehydrogenase und NAD // In: Methoden der enzymatischen Analyse. Ed. Bergmeyer H.U. Berlin: Akademie-Verlag, 1970. B.2. P.1425- 1429.

360. Hunter F.E., Gebecki J.M., Hoffsten P.E., Swelling and lysis of rat liver mitochondria induced by ferrous ions // J. Biol. Chem. 1963. V.238, N.3. P. 828-835.

361. Carlberg Y., Mannerwik B. Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver//J. Biol. Chem. 1975. V.250, N.14.1. P. 5475 -5480.

362. Bonn R.C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modem medicine // Clin. Microbiol. Rev. 1993. V.6, N.l P.57-68.

363. Bik W., Wolinska-Witort E., Chmielowska M et al. Vasoactive intestinal peptide can modulate immune and endocrine responses during lipopolysaccharide-induced acute inflammation //Neuroimmunomodulation. 2004. V.l 1, N.l. P.358 364.

364. Пермитина М.И., Полякова A.M., Венгеров Ю.Я. Особенности тромбогеморрагического синдрома у больных острыми клиническими инфекциями //Клин. мед. 1988. Т.6/7,№2. С. 117-121.

365. Покровский В.И., Гордиенко С.П., Литвинов В.И. Иммунология инфекционного процесса.// Руководство для врачей. 1994. М.; Медицина. 307С.

366. Couland J.M., Labrousse J., Salmona J.P. Plasma fibronection concentration in critically ill patient // Ric. Clin. Lab. 1982. V.l2, N1. P. 113-130.