Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека

Загряжская, Анна Николаевна

Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Загряжская, Анна Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека»

Автореферат диссертации на тему "Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека"

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

Загряжская Анна Николаевна

Исследование механизма действия липополисахаридовразличной структуры на функции нейтрофилов человека

02. 00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2009

003484205

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова и в отделе биокинетики Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук Судьина Галина Федоровна

кандидат химических наук Гришина Зоряна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич

кандидат химических наук Шрам Станислав Иванович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха

Защита состоится 24 ноября 2009 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. Автореферат разослан 23 октября 2009 года

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактериальные липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) или эндотоксины, входят в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий, и выделение LPS в свободном состоянии в процессе роста, деления бактерий, при действии антибиотиков и белков плазмы крови in vivo является ключевым звеном в индукции септического шока (Shenep et al., 1988; Zhang et al., 1998). Эндотоксины взаимодействуют со специфическими рецепторами клеток высшего организма и являются одними из наиболее сильных индукторов иммунного ответа (Rietschel et al., 1996). Учитывая высокую токсичность LPS для высшего организма, подробное изучение механизмов их воздействия на функции клеток, участвующих в иммунном ответе, является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

Показано, что структура эндотоксина играет важную роль в процессах фагоцитоза и разрушения бактерий (Friedberg et al., 1970). В полноразмерной структуре LPS выделяют 3 части: гидрофобный липнд А, центральный гетерополисахарид, и полисахарид О-антиген (Kastowsky et al., 1992). Однако роль центрального полисахарида в токсическом действии LPS на клетки иммунной системы не достаточно изучена. Поэтому исследование влияния различных форм LPS на функции нейтрофнлов для определения функциональной значимости центрального полисахарида, является актуальным.

Клетки крови нейтрофилы участвуют в неспецифическом иммунном ответе. Нейтрофилы первые мигрируют к очагу воспаления и осуществляют захват (фагоцитоз) микроорганизмов и чужеродных частиц. Фагоцитоз - комплексный процесс, который сопровождается образованием активных форм кислорода и азота, высвобождением цитокинов, протеолитических ферментов и синтезом липидных медиаторов воспаления, в частности, метаболитов 5-липоксигеназы (5-LO, КФ 1.13.11.34) лейкотриенов. Показано, что мыши (-/-) по 5-LO более чувствительны к бактериальной инфекции по сравнению с мышами дикого типа (Machado et al., 2005). В связи с этим актуальность исследований механизма действия хемотипов LPS на активность 5-LO и роли лейкотриенов в реализации эффектов LPS на процесс фагоцитоза вполне очевидна.

Важными факторами, регулирующими клеточные эффекты LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови. Несомненный интерес представляет изучение модуляции ответов нейтрофнлов на LPS этими липидами.

Цель и задачи исследования.

Целью работы стало комплексное исследование влияния LPS с различной длиной полисахаридной цепи из патогенной грамотрицательной бактерии Salmonella typhimuríwn на фагоцитоз и ряд функций нейтрофнлов человека, связанных с процессом фагоцитоза; а также изучение роли липидов в реализации действия LPS из патогенной грамотрицательной бактерии Pseudomonas Aeruginosa ¡0 на нейтрофилы.

Для выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать действие хемотипов LPS из Salmonella typhimuríum с различной длиной полисахаридной цепи: Re мутанта, (липид А и остатки 2-кето-З-дезокси- D-маннооктоновой кислоты); Ra мутанта (липид А и центральный полисахарид); и

полноразмерной S формы LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека;

- установить значимость активации 5-LO и последующего синтеза лейкотриенов для реализации эффектов хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз;

- определить влияние различных хемотипов LPS на образование химически активных радикалов кислорода и азота в нейтрофилах человека;

- исследовать механизм действия различных хемотипов LPS на активность 5-LO и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека;

- исследовать модуляцию эффекта LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на синтез лейкотриенов в нейтрофилах под действием природных липидов, в частности, холестерина и его производных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе впервые установлено, что LPS различной структуры в разной степени стимулируют фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана (OZ) нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re < S < Ra. Согласно полученным в работе данным, степень активации фагоцитоза различными формами LPS обусловлена способностью хемотипов LPS повышать синтез лейкотриенов в нейтрофилах.

Эффективность стимулирующего действия различных форм LPS на фагоцитоз OZ коррелировала с их эффектами на адгезию, синтез лейкотриенов и образование супероксид-иона в нейтрофилах человека: Re < S < Ra. Установлено, что способность разных форм эндотоксинов стимулировать данные функции нейтрофилов имеет противоположную направленность с их способностью увеличивать синтез оксида азота (N0) с эффективностью действия хемотипов LPS: Ra < S < Re.

Показано, что синтез N0 в нейтрофилах, стимулированный LPS и 0Z, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы (NOS). Продемонстрировано наличие в клетках изоформ NOSI и NOSII.

Установлено, что N0 ингибирует активность 5-L0 при непосредственном взаимодействии, а также через активацию растворимой гуанилатциклазы и протеинкиназы G (механизм sGC/cGK). Доказано, что в фагоцитирующих нейтрофилах под действием хемотипов LPS образуется эндогенный N0, который ингибирует активность 5-L0 по механизму sGC/cGK.

Предложена модель, описывающая действие различных форм эндотоксинов с возрастающей длиной цепи на опсонин-зависимый фагоцитоз и связанные с этим процессы образования N0 и синтеза лейкотриенов в нейтрофилах.

Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-L0 и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

Полученные в данной работе результаты расширяют представление о регулировании ряда функций нейтрофилов человека под действием бактериальных эндотоксинов; полученные данные также могут быть использованы в разработке новых препаратов для вакцинации против патогенных штаммов Salmonella.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на ASCB & European Cytoskeleton forum "Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems" (2007, Dijon, France), Четвертой крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (2008, Судак, Крым, Украина), Keystone symposium "Complex Lipids in Biology: Signaling, Compartmentalization and Disease" (2009, Olympic Valley, USA).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи: 2 статьи в отечественном сборнике и одна в иностранном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (208 наименований). Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 5 таблиц и 33 рисунка.

Список сокращений.

5-LO - 5-липоксигеназа (5-lipoxygenase);

АА - арахидоновая кислота (arachidonic acid), 5,8,11,14-г/г/с-эйкозатетраеновая кислота;

cGK - cGMP-зависимая протеинкиназа G (cGMP regulated protein kinase);

cGMP - циклический гуанозинмонофосфат (cyclic guanosine monophosphate);

cPLA: - цитоплазматическая фосфолипаза A2 (cytosolic phospholipase A2);

Choi - холестерин (cholesterol);

CP - фосфат холестерина (cholesterol phosphate);

CS - сульфат холестерина (cholesterol sulfate);

GTP - гуанозинтрифосфат (guanosine triphosphate);

HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография (high perfomance liquid chromatography).

L-NAME - метиловый эфир Ыв-нитро-Ь-аргинина (NM-Nitro-L-arginine methyl ester);

LPS - липополисахариды (lipopolysaccharides), эндотоксины;

LTB4 - лейкотриен B^, 58,12Я-5,12-дигидрокси-6-//г/е-8,10-ягранс-14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

NO - оксид азота;

NOS - синтеза оксида азота (nitric oxide synthase);

OZ - опсонизированный зимозан (opsonized zymosan);

PC - фосфатидилхолин (phosphatidylcholine);

PKC - протеинкиназа С (protein kinase C);

sGC - растворимая гуанилатциклаза (soluble guanylate cyclase);

SOD - супероксид дисмутаза (superoxide dismutase);

Abe 'i

Man —> Rha —> Gal

-V-

О-антиген

Glc NAc

Glc-> Gal-

Центральный полисахарид

Gal i

Glc-

Hep I (или

I HepppEtN} Hep/j —> Hepp

Ra мутант (ТУ119)

KDOp i

> КООр-^ЛипидА Re мутант (SL1181)

S (полноразмерная форма)

Схематическая структура LPS (S) из Salmonella typhimurwm с указанием мутантных хемотипов Re и Ra, использованных в данной работе. Обозначения: Abe (abequose), абеквоза (3, б-дидезокси-О-галактоза); Man (D-mannose), D-манноза; Rha (L-rhamnose), L-рамноза (6-дезоксиманноза); Gal (D-galactose), D-галактоза; GlcN (D-glucosamine), D-глюкозамин; Hep (L-glycero-D-manno-heptose), Ь-глицеро-О-манногептоза; KDO (3-deoxy-D-marmooctulosonic acid), 2-кето-З-дезокси- D-маннооктоновая кислота; EtN (ethanolamine), этаноламин; Ac (acetyl), ацетил; p (phosphate), фосфат.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Часть 1. Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры ш Salmonella íyphinturium на функции нейтрофилов человека.

Грамотрицательные бактерии экспрессируют как полноразмерную форму LPS, так и мутантные формы эндотоксинов, в структуре которых отсутствуют О-антиген и/или элементы центрального полисахарида (Garcia-Verdugo et al., 2005). LPS, выделившиеся в свободном состоянии из клеточной стенки бактерий, признаны более биологически активными по сравнению с эндотоксинами, связанными с бактериальной мембраной (Leeson et al., 1994). Предполагается, что токсичность LPS как в составе цельной бактерии, так и в свободном состоянии (после гибели и лизиса бактерий), обусловлена, главным образом, липидом А; структура О-антигена определяет антигенную специфичность бактерий. Роль центрального полисахарида в патогенезе не изучена подробно. Много работ посвящено изучению рецепторного комплекса, обуславливающего многообразные эффекты действия эндотоксинов на клетки высшего организма. Однако биосинтез физиологически активных веществ лейкотриенов и образование активных форм кислорода и азота в ответ на действие LPS различной структуры, которая характеризуется одинаковым липидом А и разной длиной полисахаридной цепи, не изучена. Поэтому исследование эффектов разных хемотипов LPS на ряд клеточных процессов в нейтрофилах представляет несомненный интерес.

В данной работе были смоделированы условия захвата инородных частиц (зимозана) нейтрофилами человека по опсонин-зависимому механизму в присутствии свободных бактериальных эндотоксинов с различной длиной полисахаридной цепи. Центральным вопросом исследования была роль лейкотриенов в эффектах разных хемотипов LPS на

фагоцитоз опсонизированного зимозана (OZ). Было также проведено исследование влияния хемотипов LPS на клеточные процессы, тесно связанные с 5-липокснгеназной активностью: высвобождение АА - субстрата 5-LO, транслокацию 5-LO к ядерной мембране и синтез активных форм кислорода и азота. Изучение описанных ниже эффектов хемотипов LPS на функции нейтрофилов: фагоцитоз OZ, адгезию нейтрофилов, синтез лейкотриенов, а также активных форм кислорода и азота проведено впервые. 1.1. Эффекты различных хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов к коллагену.

Было исследовано влияние мутантных форм LPS из Salmonella enierica серотипа typhimurium (Ra и Re), а также полноразмерной формы (S) на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами человека. Фагоцитоз - процесс захвата чужеродной частицы клеткой-фагоцитом, который начинается с прикрепления частицы-мишени к специфическим клеточным рецепторам и последующим поглощением и разрушением частицы. Широко используемой моделью частицы-мишени для изучения процессов фагоцитоза являются частицы зимозана (высушенные клеточные стенки дрожжей Saccharomyces cerevistae). В данной работе было проведено исследование опсонин-зависимого фагоцитоза, поэтому в качестве частицы-мишени использовали опсонизированный зимозан. Для получения OZ гомогенную суспензию частиц зимозана инкубировали 30 мин с аутологической сывороткой крови и тщательно промывали физиологическим буферным раствором. В результате опсонизации частица зимозана покрывается иммуноглобулинами и белками комплемента, которые распознаются, соответственно, FcyR (Fc-gamma receptors) и CR (complement receptors) рецепторами на поверхности нейтрофилов, направляя процесс фагоцитоза по опсонин-зависимому механизму. Для исследования эффектов различных хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз нейтрофилы человека преинкубировали (праймировали) 30 мин с LPS, затем добавляли OZ на 3 мин, фиксировали клетки и определяли индекс фагоцитоза. Из рис. 1А видно, что все тестируемые хемотипы LPS стимулируют фагоцитоз, при этом форма Ra, в составе которой липид А и центральный полисахарид, вызывает максимальное увеличение индекса фагоцитоза OZ, а полноразмерная форма S и форма Re, образуемая липидом А с остатками KDO, менее эффективны.

Известно, что в процессах фагоцитоза и адгезии нейтрофилов задействованы, по крайней мере, частично, одни и те же рецепторы и сигнальные каскады (Ross et al., 1993). Поэтому было исследовано влияние 30 мин инкубации клеток с Re, Ra и S формами LPS на прикрепление (адгезию) нейтрофилов к поверхности, покрытой коллагеном. Из рисунка 1В видно, что все тестируемые хемотипы LPS стимулируют адгезию, при этом Ra форма LPS приводит к наибольшему прикреплению клеток (~ в 8 раз выше, чем в контроле), S и Re формы LPS, соответственно, менее эффективны. Таким образом, хемотипы LPS из Salmonella typhimurium в различной степени стимулируют опсонин-зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов человека с эффективностью: Re < S < Ra.

3" 2 О

Контроль Re

Контроль

Рис. I. Влияние Re, Ra и S хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами (А) и адгезию нейтрофилов к поверхности, покрытой коллагеном (В). А. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 1 мкг/мл хемотипов LPS, затем добавляли OZ (~12 частиц/клетку) на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза методом фазово-контрастной микроскопии. В. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с хемотипами LPS и определяли % клеток, прикрепившихся к поверхности. * Р < 0.05, ** Р<0.01 к контролю.

1.2. Роль 5-LO в эффектах хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами.

При активации нейтрофилы синтезируют ряд липидных медиаторов, участвующих в

регулировании процесса воспаления. Один из наиболее физиологически значимых медиаторов - LTB4 является сильнейшим хемоаттрактантом и играет роль в привлечении дополнительного пула лейкоцитов к очагу воспаления. Ключевым ферментом в синтезе лейкотриенов является 5-LO, которая в интактных клетках локализована в цитоплазме, при увеличении внутриклеточной концентрации Са2+ (Са2^) транслоцируется к ядру, связывается с ядерной мембраной и включается в белковый комплекс с FLAP (5-lipoxygenase activating protein) и цитозольной фосфолипазой А2 (cPLA?) (Peters-Golden et al., 2005). CPLA2 катализирует высвобождение из фосфолипидов мембран АА — субстрата 5-LO, a FLAP связывает и "презентирует" АА для 5-LO (Abramovitz et al., 1993). С целью выяснения связи эффектов Re, Ra и S форм LPS на фагоцитоз OZ нейтрофилами с 5-липоксигеназной активностью нейтрофилов, клетки инкубировали в присутствии хемотипов LPS и ингибитора синтеза 5-LO метаболитов МК886, затем добавляли OZ и определяли индекс фагоцитоза. Известно, что МК886 блокирует FLAP в каталитическом комплексе синтеза 5-LO продуктов (Werz, 2002). Из рис. 2 видно, что МК886 приводит к снижению индекса фагоцитоза и значительному нивелированию эффектов эндотоксинов на фагоцитоз. Эти данные позволяют сделать вывод, что способность разных форм LPS активировать фагоцитоз OZ зависит от стимуляции ими синтеза лейкотриенов в клетках.

OZ »

100 нМ МК886 + OZ .

]

Рис. 2. Эффект МК886 на фагоцитоз OZ нейтрофилами. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 1 мкг/мл Re, Ra и S форм LPS в присутствии или в отсутствие 100 нМ МК886, затем добавляли OZ на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза методом фазово-контрастной микроскопии. * Р < 0.05 по сравнению с соответствующим контролем.

Контроль Re Ra S

1.3. Исследование синтеза 5-LO метаболитов в нейтрофилах, стимулированных OZ.

Учитывая взаимосвязь между процессами образования лейкотриенов и эффектами

разных форм LPS на фагоцитоз, было исследовано влияние хемотипов LPS на синтез

лейкотриенов, стимулированный OZ. Предварительные эксперименты показали, что

соотношение эффектов хемотипов LPS на синтез лейкотриенов сохраняется при действии

0.5-5 мкг/мл LPS, а в интервале концентраций LPS 2-5 мкг/мл синтез не зависит от

концентрации LPS, поэтому дальнейшие эксперименты проводили при концентрации

эндотоксинов 5 мкг/мл. Как видно из рис. 3, в нейтрофилах, инкубированных только с

LPS, не происходит активация 5-LO. Добавление OZ, вызывающее повышение Ca2+j,

приводит к активации 5-LO, и

исследуемые формы LPS в

Ц 80 1 различной степени стимулируют

s т образование 5-LO метаболитов с

-oz эффективностью, аналогичной

+ 02 - действию хемотипов LPS на

фагоцитоз OZ и адгезию

с; t нейтрофилов: Re < S < Ra.

Контроль

Рис. 3. Влияние хемотипов LPS на образование 5-липоксигенгазных

метаболитов в нейтрофилах. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл различных форм LPS, затем добавляли 2 мг/мл OZ (где указано) на 30 мин, количество продуктов определяли методом HPLC. * Р < 0.05, ** Р < 0.01 к соответствующему контролю.

1.4. Действие хемотипов LPS на высвобождение АА и транслокацию 5-LO к ядру в нсйтрофилах.

Следующим этапом данной работы было исследование механизма действия Re, Ra и S форм LPS на активность 5-LO. Анализ работ, посвященных регуляции активности 5-LO, позволяет выделить следующие основные факторы: доступность свободного субстрата -АА, Са2+-зависимая транслокация фермента к ядру и связывание с ядерной мембраной, внутриклеточный уровень гидропероксидов и химически активных радикалов. В интактных клетках 5-LO не активна и локализована в цитоплазме, а ее субстрат АА находится в составе фосфолипидов мембран. При повышении внутриклеточной концентрации ионов Са2+ происходит активация и транслокация ферментов 5-LO и cPLA2 к ядерной мембране, где они объединяются в белковый комплекс с FLAP. cPLA2 катализирует высвобождение АА. В ходе реакции диоксигенирования АА акцептором электронов является негемовый ион железа 5-LO, который взаимодействует с гидропероксидами и химически активными радикалами, регулирующими активность фермента. В свою очередь OZ стимулирует 5-липоксигеназную активность, повышая Ca2+i (Werz, 2002). Как LPS может воздействовать на активность 5-LO? Эндотоксины взаимодействуют с клеточными рецепторами, вызывая активацию сигнальных каскадов в клетке, что приводит к фосфорилированию CPLA2, увеличению ее активности и высвобождению АА (Doerfler et al., 1994). Возможно, отличия в эффектах разных форм LPS на синтез лейкотриенов обусловлены их потенцией высвобождать АА. Чтобы проверить это предположение, нентрофилы инкубировали с радиоактивно меченой [|4С]-АА для включения в состав мембран ([14С]АА-нейтрофилы) и, после добавления хемотипов LPS и OZ, детектировали суммарную метку совокупности свободной АА и метаболитов 5-LO. Из рис. 4А видно, что все тестируемые формы LPS стимулировали высвобождение АА, однако в данном случае эффективность разных эндотоксинов не сопоставима с их эффективностью по повышению синтеза лейкотриенов. Таким образом, действие хемотипов LPS именно на высвобождение АА не вносит значимый вклад в их эффекты на синтез лейкотриенов в нейтрофилах.

При активации лейкоцитов 5-LO Са2+-зависимо транслоцируется к ядру (PetersGolden et al., 2000). Для выяснения, обусловлены ли различия в эффектах хемотипов LPS их воздействием на связывание 5-LO с мембраной, нейтрофилы инкубировали с эндотоксинами и OZ, затем разрушали клетки, выделяли отдельно мембранную и цитоплазматическую фракции и определяли внутриклеточную локализацию фермента. На рис. 4 (В, С) представлен типичный результат иммуноблотгинга 5-LO. Из рис. 4 видно, что в интактных клетках (контроль) этот белок локализован в цитоплазме. Под действием кальциевого ионофора А23187, обычно используемого для гарантированной стимуляции синтеза лейкотриенов, фермент практически полностью локализован в ядерной фракции. При действии только хемотипов LPS 5-LO была детектирована в цитоплазматической фракции, как и в интактных клетках. Как видно из рис. 4С, добавление к клеткам OZ приводит к частичной транслокации 5-LO к ядерной мембране, однако эндотоксины не оказывают значительного влияния (сопоставимого с действием форм LPS на синтез лейкотриенов) на перераспределение фермента между цитозольной и мембранной

фракцией. Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность хемотнпов LPS стимулировать синтез лейкотриенов не связана с их влиянием на доступность субстрата и связывание 5-LO с ядерной мембраной.

Ш z 5-LO метаболитов .* ' 1=1 [14CJAA5-LO метаболиты ♦ [МС]АА

Контроль Re Ra

цитоплазматическая фракция

8 S *

^97,6 КДа

маркер

97,6 кДа маркер

Рис. 4. Влияние хемотипов LPS на высвобождение арахидоновой кислоты (А) и внутриклеточную локализацию 5-LO (В, С) в нейтрофилах. А. [|4С]АА-нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл хемотнпов LPS, затем добавляли 2 мг/мл OZ; анализировали методом HPLC. * Р < 0.05, ** Р < 0.01 по сравнению с соответствующим контролем. В, С. Детекция 5-LO в цитоплазматической (В) и мембранной (ядерной) (С) фракции нейтрофилов. Концентрации агентов: 5 мкг/мл LPS; 2 мг/мл OZ; 3 мкМ ионофора А23187.

мембранная (ядерная) фракция

1.5. Образование активных форм кислорода и азота в нейтрофилах под действием различных форм LPS.

Активность 5-LO чувствительна к внутриклеточному уровню гидропероксидов и свободных радикалов, который во многом определяется образованием химически активных форм кислорода. Продукция активных форм кислорода в клетке начинается с образования супероксид-радикала под действием NADPH-оксидазы. Было проведено исследование влияния хемотипов LPS на образование супероксид-иона (радикала) Ог'- в нейтрофилах человека. Измерение количества восстановленного цитохрома С является селективным методом детекции образования Ог"' среди всех активных форм кислорода. LPS способны вызвать активацию NADPH-оксидазы, и из рис. 5А видно, что тестируемые хемотипы LPS стимулируют продукцию супероксид-иона как в интактных клетках, так и при активации клеток OZ с эффективностью Re < S < Ra. Из рис. 5А видно, что восстановление цитохрома С было полностью блокировано в присутствии супероксид дисмутазы (SOD), вызывающей дисмутацию Ог'-, что свидетельствует о супероксид-зависимом восстановлении цитохрома С в данных условиях.

Помимо активации NADPH-оксидазы, LPS способны стимулировать образование NO в клетке. В отличие от NADPH-оксидазной системы, синтез NO в нейтрофилах человека не изучен подробно. В данной работе образование NO в нейтрофилах определяли по накоплению метаболитов NO нитрита N0:" и нитрата NO3" в среде инкубации. В отличие от эффектов LPS на образование супероксида, основные эффекты хемотипов LPS на

синтез N0 в нейтрофилах были обнаружены в присутствии 0Z (рис. 5В). Примечательно, что Re форма LPS, которая оказывает минимальное воздействие на фагоцитоз, адгезию, образование LTs и Ог наиболее эффективна в стимуляции синтеза N0 в фагоцитирующих нейтрофилах, и напротив, Ra форма LPS наименее эффективна, т.е. в данном случае Ra < S < Re.

Биосинтез N0 в клетке осуществляется под действием N0 синтазы; было также показано неферментативное образование N0 в нейтрофилах человека в патологических условиях (Tse et al., 2001). В данной работе было обнаружено значительное снижение накопления метаболитов N0 в присутствии ингибитора NOS - метилового эфира Nm-нитро-Ь-аргинина (L-NAME), что позволяет сделать вывод о ферментативном синтезе N0 с участием NOS в нейтрофилах человека под влиянием LPS.

о-s

s -

- oz

+ 0Z + SOD

о 2

о z

Контроль

1=1 - OZ

3 L-NAME (-OZ) J +0Z

i L-NAME за 30 мин ; до добавления OZ

Рис. 5. Влияние хемотипов LPS на продукцию супероксид-иона (А) и синтез N0 (В) в нейтрофилах. А. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл Re, Ra и S форм LPS в присутствии или в отсутствие 300 ед/мл SOD, затем добавляли OZ (указано) на 30 мин; исследовали поглощение Д(550/535) нм. В. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл хемотипов LPS в присутствии или в отсутствие 100 мкМ L-NAME, затем добавляли OZ (указано) на 30 мин; исследовали с использованием тест-набора Nitrate/Nitrite fluorometric assay kit (Cayman Chemical, США). * P < 0.05, ** P < 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.

1.6. Детекция NO синтазы в нейтрофилах человека.

Известно три изоформы N0 синтазы, конститутивные NOSI и NOSIII, а также индуцибельная изоформа NOSI1 (Alderton et al., 2001). Анализ литературных данных позволяет говорить о низком уровне экспрессии NOS в нейтрофилах человека, однако данные об экспрессии изоформ NOS противоречивы (Cedergren et al., 2003; de et al., 2001; Wallerath et al., 1997; Molero et al., 2002). В связи с этим мы определили наличие изоформ NOSI и NOSII в нейтрофилах человека. На рис. 6 представлены типичные результаты иммуноблоттинга (А, В) и флуоресцентного окрашивания (С, D) NOSI и NOSII, соответственно. В данной работе

Контроль

показано присутствие нейрональной конститутивной изоформы NOSI в интактных клетках (рис. 6А) и индуцибельной изоформы NOSII (рис. 6В) в интактных клетках, а также в клетках, инкубированных с LPS и OZ. Специфичность антител была подтверждена с использованием лизатов клеточных линий, содержащих NOSI (А-673), и NOSII (RAW264.7 + LPS/IFN-y). На рис. 6С1 и 6D1 представлено окрашивание NOS! и NOS11 в нейтрофилах при помощи флуоресцентных антител, 6С2 и 6D2 - окрашивание ядер красителем Хёхста (Hoechst), 6СЗ и 6D3 - фазово-контрастные изображения клеток. Сравнительный анализ рис. 6С1 и 6С2, а также рис. 6D1 и 6D2, позволил установить, что белки NOSI и NOSII локализованы преимущественно в цитоплазме.

■ , j* i* #f % S

Щ-яо- »

VI i

02 щ À m • m

Hf m ** 4k ^UÀ A * w Щ* * #

■ft % " ■к *

C3 D3 "t; '. VfS Sy ».V

10 lfm 10 urn

155 КДа NOSI

А-673

PMNLs

Рис. 6. Детекция NOSI (А, С) и NOSII (В, D) в нейтрофилах человека. А. Детекция NOSI методом Western blotting в нейтрофилах (PMNLs) и в лизате клеток А-673 (Santa Cruz Biotechnology, Inc; Германия). В. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с Re формой LPS, добавляли 2 мг/мл OZ (указано) на 30 мин, лизировали клетки и детектировали NOSII методом Western blotting. Для контроля использовали лизат макрофагов RAW264.7, стимулированных LPS/IFN-y (Santa Cruz Biotechnology, Inc; Германия). CI, Dl - результаты обнаружения NOSI и NOSII, соответственно, методом флуоресцентного окрашивания клеток. С2, D2 - визуализация клеточных ядер под действием красителя Хёхста. СЗ, D3 - фазово-контрастные изображения клеток.

1.7. Роль NO синтазы в функциях нейтрофилов человека, праймированных различными хемотипами LPS.

В данной работе были изучено влияние хемотипов LPS на ферментативное образование N0 и присутствие NOS в нейтрофилах человека и показано, что разные формы LPS различаются по способности активировать NOS нейтрофилов. Роль NOS в эффективности действия хемотипов LPS на фагоцитоз и связанные с процессом фагоцитоза функции нейтрофилов была исследована с использованием L-NAME, конкурентного ингибитора NOS. Как видно из таблицы 1, действие различных форм LPS на фагоцитоз 0Z, образование супероксид-иона и лейкотриенов заметно нивелируется в присутствии 100 мкМ и 500 мкМ L-NAME. Таким образом, можно заключить, что действие хемотипов LPS на функции нейтрофилов обусловлено их влиянием на активность цитоплазматичсской NOS.

Таблица 1. Влияние L-NAME на ряд функций нейтрофилов, праймированных хемотипами LPS. Клетки инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл LPS в присутствии или в отсутствие L-NAME и определяли % прикрепившихся клеток (адгезия); либо добавляли OZ на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза; либо добавляли OZ на 30 мин и исследовали образование метаболитов 5-LO и супероксид-иона.

Тестированные Добавление Эффект различных хемотипов LPS (в

функции PMNL L-NAME % от соответствующего контроля)

__Re Ra S

Фагоцитоз OZ, _ 164 + 9 265 ±15 207 ±12

+ 100 мкМ L-NAME 193111 226 ± 14 195 + 12

+ 500 мкМ L-NAME 197 ±11 212 ±12 187 + 11

Адгезия т 128 ±8 912 ±51 202 ± 13

+ 100 мкМ L-NAME 157 ± 12 786 1 47 191 ±12

+ 500 мкМ L-NAME 159 ± 12 708 ± 42 178111

Синтез метаболитов ш 116 ± 8 273 ± 18 209113

5-LO, + 100 мкМ L-NAME 189 ± 10 255 ±15 207112

стимулированный 0Z + 500 мкМ L-NAME 191 + 11 243 ±15 217115

Образование _ 114 + 7 169 ±10 14118

супероксид-нона. + 100 мкМ L-NAME 142 + 9 160 ±10 14718

стимулированное 0Z * 500 мкМ L-NAME 145 + 9 156 ±9 14419

1.8. Прямое действие N0 на активность 5-1,0 в бесклеточной системе.

При рассмотрении эффекта Ле формы ЕР8 видно, что увеличение образования N0 приводит к подавлению синтеза лейкотриенов и фагоцитоза 02 нейтрофилами человека (таблица 1). Учитывая связь процессов фагоцитоза и синтеза лейкотриенов, был исследован эффект действия N0 на активность 5^0. Для того, чтобы определить непосредственное влияние N0 на активность 5-липоксигеназы, нейтрофилы человека разрушали под действием ультразвуковых импульсов. Полученный клеточный лизат инкубировали с донором N0 диэтилaминo-NONOaтoм (сНеШукгшпе NONOate, ШЕ1К0Ж)а1е), который при физиологических рН разлагается с выделением N0. В качестве контроля использовали его неактивный аналог сульфо-МОЫОат (эЫрЬо

МСМСЫе, Б-МОЫСЫе). Реакцию образования метаболитов 5-Ш инициировали добавлением АА. Из рис. 7 видно, что преинкубация лизата клеток в течение 30 мин с донором N0 приводит к значительному концентрационно-зависимому ингибированшо активности 5-Ш. При добавлении 1ЙЕ11чЮ1чЮа1е одновременно с АА ингибироваиие донора ЫО на активность 5-ЬО сохранялось, но уменьшалась величина эффекта. Это можно объяснить существованием определенного промежутка времени, необходимого для распада с^ЫОЫСМе и накопления достаточного количества N0. В то же время, Э-ЬЮЫСМе не оказывает влияния на синтез лейкотриенов (рис. 7). Следовательно, подавление активности 5-Ш обусловлено выделением N0 при распаде с^Е!ЮМОа(е. Полученные данные говорят о том, что N0 может быть прямым эндогенным ингибитором 5-липоксигеназной активности в нейтрофилах человека.

S-NONOate - diEtNONOate(3a30MHHflo добавления 20 мкМ АА) diEtWONOate + 20 мкМ АА

200

Рис. 7. Эффекты доноров оксида азота (МСЖСЫе) на активность 5-ЬО в бесклеточной системе. Лизат нейтрофилов инкубировали с исследуемыми агентами 30 мин. Синтез лейкотриенов инициировали добавлением 20 мкМ арахидоновой кмслоты (АА) на следующие 30 мин. Количество продуктов определяли методом НРЬС.

ЛЮЛ/Oate, мкМ

1.9. Роль гуанилатцнклазы и протеин киназы G в эффектах хемотипов LPS на активность 5-LO в нейтрофилах.

Для реализации ингибирующего эффекта N0 на активность 5-LO необходимы высокие (мкМ) концентрации N0 (рис. 7). Поэтому было выдвинуто предположение о существовании более чувствительного механизма действия N0 на активность этого фермента в нейтрофилах человека. Известно, что N0 уже в наномолярных концентрациях стимулирует активность растворимой гуанилатцнклазы (sGC), которая осуществляет конверсию гуанозинтрифосфата (GTP) в циклический гуанозинмонофосфат (cGMP), что приводит к активации cGMP-завиеимой протеинкиназы G (cGK). Было показано, что активация sGC и cGK в альвеолярных макрофагах крыс приводит к ингибированию активности 5-LO (Coffey et al., 2008). Известно 2 формы гуанилатцнклазы: мембранносвязанная и растворимая. N0 не взаимодействует с мембранносвязанной гуанилатциклазой (membrane-bound GC, mGC), активация mGC происходит под действием ряда гормональных пептидов, одним из которых является ANF (atrial natriuretic peptide (factor)). Помимо NO, стимулирующего активность растворимой гуанилатцнклазы (sGC), синтетический эффектор YC-1 является преимущественно аллостерическим, N0-независимым активатором sGC. В данной работе было исследовано действие N0-

независимых активаторов гуанилатциклазы на активность 5-ЬО в нейтрофилах в присутствии СК. Как видно из таблицы 2, УС-1 вызывает подавление активности 5-ЬО; в то же время, в присутствии А№ не наблюдается изменений активности фермента. Вероятно, нейтрофилы человека не экспрессируют твС. Полученные данные свидетельствуют о том, что система растворимой гуанилатциклазы функционирует в нейтрофилах человека и приводит к подавлению активности 5-Ш.

PMNLs + Y. 5-LO метаболитов, (нг/107 PMNLs)

2 мг/мл OZ. 24,3 ±1,7

1 мкМ YC-1 + OZ 7,2 + 0,3"

3 мкМ YC-1 + OZ 3,3 ± 0,2**

IOhMANF + OZ 24,6 ±1,4

30 нМ ANF + OZ 24,9 ±1,4

Таблица 2. Влияние активаторов гуанилатциклазы УС-1 и А№ на синтез метаболитов 5-ЬО, стимулированный OZ, в нейтрофилах. Клетки инкубировали в течение 30 мин с 2 мг/мл ОХ в присутствии или в отсутствие агентов (указано). Продукты исследовали методом НРЬС. ** Р < 0.01 к контролю.

Было проведено исследование роли растворимой гуанилатциклазы (sGC) в эффектах хемотипов LPS на синтез лейкотриенов в нейтрофилах, при использовании специфичных ингибиторов. Из рис. 8А видно, что ингибитор sGC (LY83583) вызывает увеличение образования лейкотриенов и, в значительной степени, нивелирует различия в эффектах хемотипов LPS на активность 5-LO. Так же, ингибитор cGK. (КТ5823) приводит к увеличению активности 5-LO и некоторому "сглаживанию" эффективности разных эндотоксинов (рис. 8В). Из сравнения рис. 8 и таблицы 1 видно, что действие ингибиторов sGC и cGK на синтез лейкотриенов, стимулированный OZ, в праймированных LPS нейтрофилах, аналогично действию L-NAME, ингибитора NOS. Поэтому можно предположить, что эндогенный N0, который в процессе фагоцитоза OZ образуется в нейтрофилах, праймированных LPS, ингибирует активность 5-LO, главным образом, посредством активации sGC и cGK.

I + oz

1 + 1 мкМ LY83583 (за 30 мин до добавления OZ} , *

Л * lil

Рис. 8. Действие ингибитора sGC LY83583 (А) и ингибитора cGK К.Т5823 (В) на синтез метаболитов 5-LO, стимулированный OZ в нейтрофилах, праймированных Re, Ra и S формами LPS. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл хемотипов LPS в присутствии или в отсутствие 1 мкМ LY83583 (А) или 2 мкМ КТ5823 (В), затем добавляли OZ

Контроль Re

I *oz

1 * 2 мкМ KT5823 (30 мин до добавления OZ)

Контроль Re

на 30 мин; количество продуктов определяли методом НРЬС. * Р < 0.05, ** р < 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.

1.10. Роль цитоплазматической фосфолипазы А2 и протеин киназы С в эффектах различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

В данном исследовании было показано, что различия в эффектах разных форм LPS на ряд функций нейтрофилов главным образом связаны с различной степенью активации NOS под действием тестируемых хемотипов LPS. Регуляция активности NOS в нейтрофилах человека практически не изучена. Известно, что АА является мощным ингибитором NOSI в нервных клетках (Palomba et al., 2004). В данной работе было обнаружено ингибирование NOS в нейтрофилах при добавлении экзогенной АА, а также при блокировании фосфолипазы А2 (cPLA2), высвобождающей АА в клетке, с помощью ингибитора cPLA2. В присутствии ингибитора cPLA2 наблюдалось сглаживание эффективности хемотипов LPS (данные не приведены).

Известно, что LPS активируют протеинкиназу С (protein kinase С, РКС) в макрофагах и нейтрофилах (Paul et al., 1995; Tepperman et al., 2000). Мы исследовали роль протеинкиназы С в эффектах хемотипов LPS. Обнаружено, что стауроспорин - мощный ингибитор РКС, приводит к выравниванию величины эффектов различных форм LPS на синтез NO (данные не приведены). Полученные результаты позволяют предположить участие цитоплазматической фосфолипазы А2 и протеинкиназы С в действии различных форм LPS на образование NO в нейтрофилах человека.

1.11. Предлагаемый механизм действия липополисахаридов различной структуры на фагоцитоз частиц OZ и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека.

В данной работе установлено, что стимулирующее действие LPS различной структуры на процесс фагоцитоза в нейтрофилах обусловлено их действием на синтез 5-липоксигеназных метаболитов (рис. 2). На основе экспериментальных данных предложена модель, описывающая регуляцию активности 5-LO под действием LPS с увеличением длины полисахаридной цепи в нейтрофилах, фагоцитирующих частицы OZ (рис. 9).

Рис. 9. Схема модулирования активности 5-LO под действием LPS с увеличивающейся длиной полисахаридной цепи в нейтрофилах, фагоцитирующих частицы OZ. В клетках OZ вызывает транслокацию 5-LO к ядерной мембране, активацию 5-LO и синтез лейкотриенов.

A. Липид А (на примере исследования Re формы LPS) запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению активности цитоплазматической NOS нейтрофилов, что вызывает повышение уровня эндогенного N0 и подавление синтеза 5-липоксигеназных метаболитов, преимущественно посредством активации sGC и cGK.

B. Центральный олигосахарид LPS (на примере исследования Ra формы LPS) способен стимулировать дополнительный сигнал, приводящий к подавлению активности NOS, что ведет к уменьшению синтеза N0,

увеличению активности 5-L0 и образования лейкотриенов. Указано, что запуск сигнала на подавление активности NOS в клетках сопровождается увеличением образования супероксид иона Oi"-, которое было максимальным при действии Ra и S форм LPS. При взаимодействии 0{- и N0 образуется пероксинитрит 00N0', обладающий нитрующими и окислительными свойствами.

LT s

Часть 2. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием LPS из Pseudomonas aeruginosa холестерином и другими липидами.

Важными факторами, регулирующими клеточные ответы на действие LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови человека. Сравнение действия LPS из двух источников: Salmonella tvphimurium и Pseudomonas Aeruginosa, показало, что эффекты LPS из Р. Aeruginosa более чувствительны к добавлению липидов (данные не приведены). Нейтрофилы играют ключевую роль в выведении из легких патогенных бактерий Р. Aeruginosa, вызывающих пневмонию (Seeger and Lasch, 1987). В данной работе было

показано стимулирующее действие LPS из Pseudomonas Aeruginosa 10 на фагоцитоз OZ нейтрофнлами человека (данные не приведены). Учитывая роль лейкотрненов в процессе фагоцитоза, было исследовано влияние LPS и ряда липидов на активность 5-LO в нейтрофилах. Для изучения совместного действия липидов и LPS на активность 5-LO использовали более мощный (по сравнению с OZ) стимул для активации 5-LO -кальциевый ионофор А23187, что позволяло снизить количество клеток в инкубации. 30 мин прединкубации нейтрофнлов с LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 приводили к увеличению продукции 5-LO метаболитов на ~ 30% при активации клеток А23187 (рис. 10).

Роль липидов в регуляции клеточных ответов изучена значительно меньше, чем генная и белковая регуляция. Основная сложность, но вместе с тем и преимущество, липидного воздействия состоит в том, что липиды оказывают глобальный эффект на регулировку всей клеточной машины. В экспериментах с липидными везикулами в бесклеточной системе недавно было показано, что флюидизация мембран является одним из ключевых факторов, способствующих связыванию 5-LO с мембраной и последующей активации фермента. Одним из самых распространенных фосфолипидов клеточных мембран является 1,2-диацил-5п-глицеро-3-фосфохолнн или фосфатидилхолнн (PC). Известно, что PC способствует связыванию 5-LO с мембраной. В физиологических условиях содержание PC в околоядерных мембранах выше, чем в плазматической мембране. В экспериментах с использованием везикул различного состава было показано, что наличие в них катионных липидов (1,2-димиристоил-глицеро-З-этилфосфохолин) увеличивает, а анионных (1-пальмитоил-2-олеил-глицеро-глицерин-3-фосфат) - снижает активность 5-LO (Pande et al., 2004). Ранее в нашей группе было обнаружено, что анионные производные галактоцереброзидов - сульфатиды, также подавляют активность этого фермента (Sud'ina eí al., 2001).

Уникальное положение среди прочих липидов занимает холестерин (Chol), который является важным структурообразующим компонентом клеточных мембран и воздействует на процессы флюидизации мембран. Отношение PC/Chol в клетках организма зависит от типа клеток и колеблется около 30 % Chol (PC/Chol = 70:30) в плазматической мембране. Также холестерин присутствует в плазме крови, где происходит его этерификация. Известно, что сульфат холестерина, аналогично холестерину, взаимодействует с фосфолипидами и участвует в организации липидного бислоя мембраны (Kitson et al., 1992).

Недавно было обнаружено, что 5-LO вовлечена в развитие атеросклероза (Mehrabian et al., 2003). В последнее время широко обсуждается инфекционная природа атеросклероза (Cullen et al., 2005), поэтому изучение регуляции эффекта бактериальных эндотоксинов на активность 5-LO под действием липидов плазмы крови представляет большой интерес. В данной работе проведено исследование совместного воздействия LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 и следующих липидов: холестерина (Chol), его сульфата (cholesterol sulfate, CS) и фосфата (cholesterol phosphate, CP). На рис. 10 (слева) видно, что холестерин и его производные вызывают подавление синтеза лейкотрненов с эффективностью ингибирования CP > CS > Chol. Ранее в нашей лаборатории был исследован механизм

о.

ш о 15

с; о ю го 1-о

s о

ULI

- LPS + LPS

Контроль Chol, (-липиды) 75

PC PC/Chol PC/CS PC/CP

250 175:75 175:75 175:75 ыкМ 100% 70:30 70:30 70:30

подавления активности 5-LO под действием холестерина и его эфиров (Aleksandrov et al., 2006). Из рис. 10 (слева) видно, что Chol снижает уровень синтеза лейкотриенов как в интактных клетках, так и в праймированных LPS даже на фоне увеличения активности 5-LO под действием LPS. Добавление клеткам сульфата холестерина (CS) или фосфата холестерина (PC) также приводит к снижению синтеза лейкотриенов, кроме того, LPS в присутствии этих липидов не вызывает дополнительную активацию 5-LO по сравнению с интактными клетками.

_ ... Рис. 10. Влияние LPS из

Pseudomonas Aeruginosa на синтез 5-LO метаболитов и модулирование эффекта LPS под действием липидов. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл LPS и 75 мкМ липидов (слева) или с 12 мкг/мл LPS и 250 мкМ липидов (справа), затем добавляли 2 мкМ ионофора А23187 на 10 мин. Отношение липидов указано в мольных %. Количество продуктов определяли методом HPLC. * Р < 0.05 к с соответствующему контролю.

Следующая серия экспериментов по изучению эффекта LPS на активность 5-LO была проведена в присутствии характерных для клеточных мембран комбинаций PC с Chol или его эфирами (PC/Chol, PC/CS, PC/CP в соотношении 70:30). Как видно из рис. 10 (справа), активность 5-LO выше в присутствии PC, а ингибирующие эффекты холестерина и его эфиров сохраняются независимо от присутствия PC в липидных везикулах. Однако, стимулирующий эффект LPS на активность 5-LO не наблюдается в присутствии 100% PC. Примечательно, что введение Chol в состав везикул (PC.Chol = 70:30) восстанавливает и усиливает стимулирующее влияние LPS на активность 5-LO (рис. 10, справа), несмотря на ингибирующий эффект самого липида.

Экзогенно добавленные липиды могут влиять как на структуру агрегатов LPS, так и на состав клеточных мембран. Известно, что PC способен извлекать Chol из мембраны клетки (Borodin et al., 1985). Нейтрализация активности LPS под действием ряда катионных пептидов и липидов основана на их взаимодействии с отрицательно заряженными фосфатными группами в составе LPS. Изменения в составе плазматической мембраны и положительно заряженные группы холина в составе PC могут ингибировать активность LPS. Везикулы PC, содержащие 30 % Chol, что соответствует среднему соотношению PC и Chol в клеточных мембранах, не способны экстрагировать Chol. Данные об увеличении активности 5-LO под действием LPS в присутствии везикул PC/Chol позволяют сделать вывод, что присутствие Chol в мембране клетки необходимо для поддержания биологической активности LPS. Однако замена Chol в составе везикул

на CS или CP приводит к элиминированию стимулирующего влияния LPS на активность 5-LO, аналогично эффекту эфиров Chol в отсутствие PC.

Принимая во внимание гипотезу об инфекционной природе атеросклероза (Cullen et al., 2005), полученные данные позволяют предположить, что Chol поддерживает эффекты LPS и может служить медиатором развития воспалительного процесса. Но сульфат холестерина элиминирует активность Chol и нейтрализует активность LPS. Присоединение сульфо-группы к липидам является физиологически значимой модификацией липидов, таких как, Chol (Roberts and Lieberman, 1970) и галактоцереброзиды (Honke et al., 2004). Предположительно, сульфатированные липиды являются специфическими эндогенными регуляторами синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. Таким образом, в данной работе было выявлено двоякое действие

1) Выявлен стимулирующий эффект различных форм эндотоксинов из Salmonella typhiraurium на фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re < S < Ra.

2) Показано, что действие хемотипов LPS на фагоцитоз OZ нейтрофилами в значительной степени обусловлено их воздействием на синтез продуктов 5-липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты - лейкотриенов.

3) Показано, что эффективность стимулирующего действия различных форм LPS на фагоцитоз OZ коррелирует с их эффектами на адгезию, синтез LTs и образование супероксид-иона в нейтрофилах человека.

4) Установлено, что способность хемотипов LPS с различной эффективностью стимулировать фагоцитоз OZ, образование супероксид-иона и синтез LTs обусловлена различиями по эффективности активации синтеза оксида азота (Ra < S < Re).

5) Показано, что синтез NO в нейтрофилах, стимулированный LPS и OZ, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы. Продемонстрировано присутствие в клетках изоформ NOSI и NOS11.

Chol на активность 5-LO (рис. I I).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая разнонаправленные эффекты холестерина на синтез лейкотриенов нейтрофилами в присутствии LPS. Холестерин ингибирует 5-липоксигеназную активность, но поддерживает стимулирующий эффект LPS на синтез LTs.

ВЫВОДЫ

6) Установлено, что эндогенный оксид азота ингибирует активность 5-липоксигеназы непосредственно, а также через активацию растворимой гуанилатциклазы и протеинкиназы G (sGC/cGK).

7) На основе анализа всей совокупности экспериментальных и литературных данных предложена модель, описывающая действие различных форм эндотоксинов с возрастающей длиной цепи на опсонин-зависимый фагоцитоз и связанные с этим процессом функции нейтрофилов человека. Предполагается, что центральный полисахарид инициирует сигнальный каскад, приводящий к подавлению стимулирующего эффект липида А на активность NOS, вызывая увеличение активности 5-LO.

В) Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-LO и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pushkareva М.А., Zagryagskaya A.N., Aleksandrov D.A., Sud'ina G.F. Cholesterol Sulfate Inhibits 5-lipoxygenase Activation in Human Polymorphonuclear Leukocytes and Abolishes Effect of Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharides on Leukotriene Synthesis. // Abstracts of the ASCB & European Cytoskeleton forum "Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems". 2007. P.26-27.

2. Загряжская A.H., Гришина 3.B., Галкина С.И., Судьина Г.Ф. Действие липополисахаридов из Pseudomonas aeniginosa на фагоцитоз и синтез лейкотриенов в полиморфноядерных лейкоцитах человека. // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2007. С.431-433.

3. Судьина Г.Ф., Александров Д.А., Гришина З.В., Пушкарева М.А., Загряжская А.Н., Галкина С.И. Синтез лейкотриена В4 и его роль как сигнальной молекулы. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием холестерина и других липидов. // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2007. С.387-390.

4. Загряжская А.Н., Галкина С.И., Пушкарева М.А., Гришина З.В., Судьина Г.Ф. Фагоцитоз и синтез лейкотриенов полиморфноядерными лейкоцитами человека. // Тезисы Четвертой крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии". 2008. С.49.

5. Zagryagskaya A.N., Aleksandrov D.A., Pushkareva М.А., Galkina S.I., Grishina Z.V., Sud'ina G.F. Biosynthesis of Leukotriene B4 in Human Polymorphonuclear Leukocytes: Regulation by Cholesterol and Other Lipids. // Journal of Immunotoxicology. 2008. V.5. N.04. P.347-352.

6. Zagryagskaya A.N., Golenkina E.A., Galkina S.I., Grishina Z.V., Sud'ina G.F. Effect of Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharides on Leukotriene Synthesis in Human Polymorphonuclear Leukocytes: Regulation by Cholesterol and Other Lipids. // Abstracts of the Keystone symposium "Complex Lipids in Biology: Signaling, Compartmentalization and Disease". 2009. P. 135.

Заказ № il 1-a/l 0/09 Подписано в печать 16.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Загряжская, Анна Николаевна

Условные обозначения.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Часть 1. Функции нейтрофилов в организме.

Часть 2. Регуляция активности 5-липоксигеназы и синтеза лейкотриенов.

1.2.1. Метаболизм арахидоновой кислоты и физиологическая активность лейкотриенов.

1.2.2. Особенности строения и экспрессии фермента 5-липоксигеназы.

1.2.3. Регуляция активности 5-липоксигеназы в клетке.

Часть 3. Бактериальные липополисахариды (эндотоксины).

1.3.1. Строение и биологическая активность липополисахаридов.

1.3.2. Взаимодействие липополисахаридов с клеткой иммунной системы.

Часть 4. Биосинтез оксида азота (N0).

1.4.1. Общие сведения о синтазах оксида азота.

1.4.2. Некоторые факторы, регулирующие активность синтаз оксида азота.

1.4.3. Физиологические свойства оксида азота.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Подготовка рабочих препаратов.

2.3. Методы исследования.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Часть 1. Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры из Salmonella typhimurium на функции нейтрофилов человека.

3.1.1. Эффекты различных хемотипов LPS из Salmonella enterica серотипа typhimurium на опсонин-зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов к коллагену.

3.1.2. Роль 5-липоксигеназы в эффектах хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами.

3.1.3. Исследование 5-липоксигеназной активности в нейтрофилах, стимулированных OZ.

3.1.4. Эффекты хемотипов LPS на высвобождение арахидоновой кислоты и транслокацию 5-липоксигеназы к ядру в нейтрофилах.

3.1.5. Образование активных форм кислорода и азота в нейтрофилах под действием различных форм LPS.

3.1.6. Детекция N0 синтазы в нейтрофилах человека.

3.1.7. Роль NO синтазы в функциях нейтрофилов человека, праймированных различными хемотипами LPS.

3.1.8. Прямое действие N0 на активность 5-липоксигеназы в бесклеточной системе.

3.1.9. Роль гуанилатциклазы и протеин киназы G в эффектах хемотипов LPS на активность 5-L0 в нейтрофилах.

3.1.10. Роль цитоплазматической фосфолипазы А2 в действии различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

3.1.11. Роль протеин киназы С в эффектах различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

3.1.12. Предлагаемый механизм действия липополисахаридов различной структуры из Salmonella typhimurium на фагоцитоз опсонизированного зимозана нейтрофилами человека.

Часть 2. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием LPS из Pseudomonas aeruginosa холестерином и другими липидами.

3.2.1. Влияние LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами человека.

3.2.2. Влияние LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на синтез 5-липоксигеназных метаболитов в нейтрофилах человека.

3.2.3. Эффекты LPS и липидов на активность 5-липоксигеназы в нейтрофилах человека.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека"

Бактериальные липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) или эндотоксины, входят в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий, и выделение LPS в свободном состоянии в процессе роста, деления бактерий, при действии антибиотиков и белков плазмы крови in vivo является ключевым звеном в индукции септического шока. Эндотоксины взаимодействуют со специфическими рецепторами клеток высшего организма и являются одними из наиболее сильных индукторов иммунного ответа. Учитывая высокую токсичность LPS для высшего организма, подробное изучение механизмов их воздействия на функции клеток, участвующих в иммунном ответе, является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

Структура липополисахарида играет важную роль в процессах фагоцитоза и разрушения бактерий. В полноразмерной структуре LPS выделяют 3 части: гидрофобный липид А, центральный гетерополисахарид, и полисахарид О-антиген. Однако роль центрального полисахарида в действии LPS на клетки иммунной системы не достаточно изучена. Поэтому исследование влияния различных форм LPS на функции нейтрофилов для определения функциональной значимости центрального полисахарида, является актуальным.

Клетки крови нейтрофилы участвуют в неспецифическом иммунном ответе. Нейтрофилы первые мигрируют к очагу воспаления и осуществляют захват (фагоцитоз) микроорганизмов и чужеродных частиц. Фагоцитоз — комплексный процесс, который сопровождается образованием активных форм кислорода и азота, высвобождением цитокинов, протеолитических ферментов и синтезом липидных медиаторов воспаления, в частности, метаболитов 5-липоксигеназы (5-LO) лейкотриенов. Machado Е. R. и соавт. продемонстировали, что мыши (-/-) по 5-LO более чувствительны к бактериальной инфекции по сравнению с мышами дикого типа. В связи с этим актуальность исследований механизма действия хемотипов LPS на активность 5-LO и роли лейкотриенов в реализации эффектов LPS на процесс фагоцитоза вполне очевидна. Важными факторами, регулирующими клеточные эффекты LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови. Несомненный интерес представляет изучение модуляции ответов нейтрофилов на LPS этими липидами.

Целью настоящей работы стало комплексное исследование влияния LPS с различной длиной полисахаридной цепи из патогенной грамотрицательной бактерии Salmonella typhimnrium на фагоцитоз и ряд функций нейтрофилов человека, связанных с процессом

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

1) Выявлен стимулирующий эффект различных форм эндотоксинов из Salmonella typhimurium на фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re < S < Ra.

5) Показано, что синтез N0 в нейтрофилах, стимулированный LPS и 0Z, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы. Продемонстрировано присутствие в клетках изоформ NOSI и NOSII.

8) Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-L0 и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Загряжская, Анна Николаевна, Москва

1. Kennedy A.D., Deleo F.R. Neutrophil apoptosis and the resolution of infection. // 1.munol Res. 2009. V.43. N.l-3. P.25-61.

2. Schymeinsky J., Mocsai A., Walzog B. Neutrophil activation via beta2 integrins (CD11/CD18): molecular mechanisms and clinical implications. // Thromb Haemost. 2007. V.98. N.2. P.262-73.

3. Swanson J.A., Hoppe A.D. The coordination of signaling during Fc receptor-mediated phagocytosis. // J Leukoc Biol. 2004. V.76. N.6. P. 1093-103.

4. Brown E.J. Complement receptors, adhesion, and phagocytosis. // Infect Agents Dis. 1992. V.l.N.2. P.63-70.

5. Ravetch J.V., Bolland S. IgG Fc receptors. //Annu Rev Immunol. 2001. V.19. P.275-90.

6. Kennedy A.D., Deleo F.R. PI3K and NADPH oxidase: a class act. // Blood. 2008. V.l 12. N.13. P.4788-9.

7. Segal A.W. How neutrophils kill microbes. // Annu Rev Immunol. 2005. V.23. P. 197223.

8. Fialkow L., Wang Y., Downey G.P. Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil function. // Free Radic Biol Med. 2007. V.42. N.2. P.153-64.

9. Yamaoka K.A., Claesson H.E., Rosen A. Leukotriene B4 enhances activation, proliferation, and differentiation of human В lymphocytes. // J Immunol. 1989. V.143. N.6. P.1996-2000.

10. Salmon J.A. Role of arachidonic acid metabolites in inflammatory and thrombotic responses. // Biochem Soc Trans. 1987. V.l5. N.3. P.324-6.

11. Hill E., Maclouf J., Murphy R.C., Henson P.M. Reversible membrane association of neutrophil 5-lipoxygenase is accompanied by retention of activity and a change in substrate specificity. //J Biol Chem. 1992. V.267. N.31. P.22048-53.

12. Hansson G., Lindgren J.A., Dahlen S.E., Hedqvist P., Samuelsson B. Identification and biological activity of novel co-oxidized metabolites of leukotriene B4 from human leukocytes. //FEBS Lett. 1981. V.l30. P. 107-12.

13. Kalsotra A., Strobel H.W. Cytochrome P450 4F subfamily: at the crossroads of eicosanoid and drug metabolism. // Pharmacol Ther. 2006. V.l 12. P.589-611.15.