Липиды некоторых наземных и морских грамотрицательных бактерий как факторы патогенности и потенциальные антагонисты эндотоксинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

КРАСИКОВА Инна Николаевна

ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ

02.00.10 —биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

0034 ГО^

Владивосток 2009

003478231

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Васьковский Виктор Евгеньевич

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Беседнова Наталья Николаевна

доктор химических наук, профессор Книрель Юрий Александрович

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится " 15 " октября 2009 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, пр. 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ. Факс: (4232) 314050; е-таН: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр. 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан " $ " С&у^С^ — 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник

Авилов С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На протяжении всей истории человечества инфекции являются одной из самых распространенных причин болезней с летальным исходом. По официальным данным ВОЗ с нею связано 25% смертности в мире. Доля инфекций в структуре смертности населения планеты существенно увеличивается и достигает 35%, если принимать во внимание результаты научных исследований последних лет, которые свидетельствуют об участии одного или нескольких инфекционных агентов в хронических заболеваниях легких (включая астму), развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а также болезней дыхательной, нервной и пищеварительной систем организма человека.

Большой проблемой в инфекционной патологии является снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Это связано с тем, что в результате генетической изменчивости бактерий появляются штаммы, устойчивые к действию лекарственных препаратов, или штаммы с измененным антигенным составом, например, так называемые госпитальные штаммы, которые формируются во время внутрибольничных инфекций. Антропогенная трансформация среды обитания человека, которая привела к выходу на эпидемическую «орбиту» более 30 патогенов, возбудителей так называемых «новых» инфекционных болезней, также значительно усложняет ситуацию.

Одним из широко распространенных проявлений заболеваний, ассоциированных с инфекциями различной этиологии, являются бактериемия и септический шок. Острота заболеваний и количество летальных исходов при бактериальном сепсисе значительно увеличиваются (до 45%), если в качестве возбудителя инфекции выступают грамотрицательные бактерии (ГОБ)* из-за присущей им повышенной устойчивости к антибиотикам.

Септический шок возникает в результате накопления в крови человека эндотоксинов, уникальных компонентов наружной мембраны ГОБ, что приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, синтезу эффекторны-ми клетками организма хозяина большого количества эндогенных цитокинов и, в конечном итоге, к серьезным нарушениям в организме, таким как гипотония и полиорганная дисфункция.

Высокая частота тяжелого течения грамотрицательного сепсиса делает жизненно необходимой разработку новых нестандартных подходов для его

Используемые сокращения: АсОН - уксусная кислота; ГОБ - грамотрицательные бактерии; С^ - глюкозамин; ДПС - деградированный полисахарид; ДФГ-дифосфатидилглицерин; ДЭФЗ -диметиловый эфир фосфатидипзтаноламина; ЖК - жирные кислоты; Кс!о - З-дезокси-О-манно-окт-2-улозоновая кислота; КПС - капсульный полисахарид; ЛА - липид А; ЛПС - липополисахарид; ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин; ЛФ - логарифмическая фаза роста; ЛХ - липид X; МС - масс-спектрометрия; НЛ - нейтральные липиды; МЭФЭ - монометиловый эфир фосфатидилэтанолами-на; О-ЛС - О-полисахарид; ПА - питательный агар; П5 - питательный бульон; ПСФ - поздняя стационарная фаза; РСФ - ранняя стационарная фаза; СА - степень аципироеания; СП - степень полимеризации; СФ - стационарная фаза; ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа; ФГ - фосфати-дилглицерин; ©Л - фосфопилиды; ФЛР - фаза линейного роста; ФЭ - фосфатидилэтаноламин; ХС - химический сдвиг.

предотвращения и/или лечения. Научные проблемы, связанные с развитием таких подходов, среди прочих включают изучение экологии патогенов, эволюции эпидемического процесса грамотрицательных инфекций и факторов патогенности микроорганизмов.

Особое место среди возбудителей грамотрицательных инфекций занимают факультативные патогены, обладающие двойственной (паразитической и сапрофитной) природой. Изучение экологии таких бактерий, позволяющее получать сведения о возможности обитания некоторых из них в окружающей среде, накоплении их в ее объектах, из которых происходит заражение людей, рассматривается сегодня как необходимое звено для понимания механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний.

Типичным примером таких бактерий является Yersinia pseudotuberculosis (сем. Enterobacteriaceae), внутриклеточный паразит, способный к эффективному размножению как в организме теплокровных, так и в объектах окружающей среды. Эта умеренно патогенная бактерия довольно интенсивно исследуется во всем мире, во многом потому, что в филогенетическом плане она является близким родственником и прародителем другой бактерии рода Yersinia, Y. pestis, возбудителя бубонной, легочной и септической чумы.

Устойчивость к факторам внешней среды и способность расти при низких температурах являются наиболее важными в эпидемиологическом отношении свойствами бактерий псевдотуберкулеза, которые приводят к возрастанию вирулентности популяции. Высокая приспособляемость факультативных паразитов, необходимая для в'ыШаания в столь различных внешних условиях, достигается, по-видимому, за счет наличия у них комплексных адаптивных реакций, отличных от таковых у облигатных патогенных бактерий. Отражением адаптационных процессов, в частности, является вариабельность химического состава бактериальной клетки.

Важную роль в экологической пластичности бактерий играют липиды -основные компоненты мембран, обеспечивающие структурно-функциональное соответствие клетки изменяющимся условиям среды обитания. Однако детальные исследования влияния экзогенных и эндогенных факторов на ли-пидный состав псевдотуберкулезного микроба не проводились. Мало известно и о химической природе факторов патогенности бактерий псевдотуберкулеза, связанных с их психрофильными свойствами. Среди прочих это могут быть ЛПС, известные как О-антигены и эндотоксины ГОБ, и ФЛ, наряду с ЛПС формирующие барьер проницаемости бактериальных клеток для различных химических веществ, в том числе антибиотиков.

Несмотря на значительный прогресс в антимикробной химиотерапии, количество летальных исходов при эндотоксикозе остается неприемлемо высоким. Решение этой важной проблемы инфекционной патологии должно предусматривать разработку и внедрение в практику новых антибактериальных препаратов. Основой для создания препаратов, эффективных при лечении грамотрицательного сепсиса, является понимание того, что медиатором септических заболеваний, вызванных ГОБ, являются эндотоксины, в норме проявляющие себя активаторами клеточных и гуморальных компонентов за-

щитной системы хозяина, а при неконтролируемой стимуляции иммунных реакций приводящие к эндотоксикозу.

В связи с этим весьма актуальным становится использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих выделение или иммунологическую реактивность последних. Потенциальным кандидатом на роль антагонистов эндотоксинов являются сами эндотоксины. В химическом плане они представляют собой ЛПС, включающие наряду О-ПС и олигосахаридом кора липид-ный домен, называемый ЛА, который считается эндотоксическим центром ЛПС.

Наиболее распространенным структурным вариантом ЛА, проявляющим ярко выраженные эндотоксические свойства («золотой стандарт» эндотоксинов), является дифосфорилированный дисахарид GlcN, имеющий шесть остатков ЖК. С другой стороны, производные ЛА с низкими степенями фосфорилирования и ацилирования проявляют слабую эндотоксическую активность (или не проявляют вовсе), что делает возможным их использование в качестве антагонистов эндотоксинов.

Особенности строения ЛА во многом определяются условиями роста ГОБ. В этом плане большой интерес представляют морские бактерии, которые в силу особых условий обитания (повышенное содержание солей, низкая температура, высокое гидростатическое давление, неравномерное поступление питательных веществ) могут синтезировать ЛА с.низким эндотоксическим потенциалом. До начала нынешнего века химии «морских» ЛА, как научного направления, практически не существовало. Единичные работы по изучению ЛА морских бактерий, датированные 2-ой половиной 20-го века, касались, в основном, характеристики состава их ЖК. Мало кто подозревал тогда, какое структурное разнообразие характерно для «морских» ЛА и какие широкие возможности открываются для структурно-функциональных исследований в этой области.

Цель и задачи исследования. Цель работы - установление корреляции между условиями культивирования бактерий псевдотуберкулеза, их ли-пидным составом и патогенными свойствами и поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов среди Л А морских ГОБ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

•Исследовать влияние температуры, источника углерода, способа культивирования и фазы роста на липидный состав (ФЛ, ЖК, ЛПС, ЛА) бактерий псевдотуберкулеза.

•Выяснить роль плазмидных ДНК в адаптационной изменчивости основных липидных компонентов У. pseudotuberculosis.

•Изучить характеристики патогенного потенциала псевдотуберкулезного микроба в зависимости от условий его культивирования и изменений липидного состава.

•Изучить химический состав и структуру ЛА морских бактерий различной видовой принадлежности.

•Определить эндотоксические свойства (острая токсичность, способность ин-

дуцировать синтез ФНО-а в клетках цельной крови человека) ЛА и ЛПС некоторых морских ГОБ.

Изучить способность нетоксичных форм ЛА и ЛПС морских ГОБ ингибиро-вать индуцированный эндотоксинами синтез ФНО-а.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение роли липид-ных компонентов в адаптации и патогенности психротрофной бактерии У. pseudotuberculosis. Показано, что липиды бактерий псевдотуберкулеза представляют собой динамичную систему, способную изменяться в широких пределах под воздействием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Установлено, что патогенный потенциал У. pseudotuberculosis коррелирует с изменением липидного состава клеток и в большой степени зависит от условий культивирования.

Проведено первое систематическое исследование состава и структуры ЛА морских ГОБ различных родов и семейств, которое расширило представление о структурном разнообразии этих соединений. Установлены структуры некоторых из них. В составе молекул ЛА бактерий рода Marinomonas обнаружена необычная ацилоксиалкановая кислота, состоящая из двух остатков 3-гидроксидекановой кислоты. Впервые описан ЛА (ЛА Marinomonas mediterránea), не содержащий нормальных ЖК. Впервые из клеток природных штаммов Chryseobacterium indoltheticum и С. scophthalmum выделен ЛА моносаха-ридной структуры. Показано, что бактерии рода Chryseobacterium имеют необычный состав полярных липидов и, по-видимому, не содержат ЛПС. Установлено, что ЛПС и ЛА ряда морских бактерий имеют низкую токсичность, являются слабыми индукторами ФНО-а и представляют теоретический и практический интерес как потенциальные антагонисты эндотоксинов универсального типа действия.

Практическая ценность работы. Новые данные о характере изменений в составе ФЛ, ЛПС и ЛА факультативных паразитов под воздействием различных экологических факторов, полученные в ходе настоящего исследования, вносят вклад в понимание механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний, что можно использовать для получения микроорганизмов с заданным липидным составом (например, при культивировании штаммов-продуцентов О-антигенов).

Изучение ЛА морских ГОБ продемонстрировало возможность использования бактерий морского происхождения в качестве источника нетоксичных форм ЛА - потенциальных антагонистов эндотоксинов, и перспективность их комплексного исследования с целью разработки препаратов для терапии грамотрицательного сепсиса и эндотоксикоза.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены лично автором в виде устных сообщений на: VI Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Ростов-на Дону, 1977); Всесоюзном симпозиуме «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980); XII Мехедународном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Баку, 1981); 2nd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Moscow, 2002); 3rd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates

(Wroclaw, Poland, 2004); IV-th European Conference on Natural Products (Paris, France, 2005), Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (Rostock, Germany, 2006).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 28 статей в ведущих отечественных и международных журналах, 19 тезисов докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций, получено 2 авторских свидетельства.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 499 источников. Диссертация изложена на 236 стр. машинописного текста, содержит 24 таблицы и 60 рисунков.

Автор выражает глубокую признательность д.х.н. Т.Ф. Соловьевой, академику В.А. Стонику и академику Ю.С. Оводову за всестороннюю поддержку на всех этапах работы. Автор благодарит к.х.н. В.В. Исакова и к.х.н. A.C. Дмитренка за проведение ЯМР-экспериментов, к.х.н. П.С. Дмитренка за проведение масс-спектрометрических исследований, д.б.н. А.Л. Дроздова и д.б.н. A.B. Реунова за консультации при проведении электронно-микроскопических исследований, д.б.н. О.И. Недашковскую за наращивание микробной массы, к.х.н. В.А. Хоменко за полезные советы при проведении ДСН-ПААГ-электрофореза, д.х.н. П.А. Лукьянова и к.х.н. И.В. Чикаловец за консультации при проведении экспериментов по индукции ФНО-а, a также проф. C.R.H. Raetz (Department of Biochemistry, Duke University Medical Center, Durham, USA) за обсуждение работ по ЛА бактерий рода Chryseobacterium. Автор выражает искреннюю благодарность своим коллегам по работе к.б.н. С.И. Ба-холдиной, к.х.н. Е.В. Воробьевой, Н.В. Капустиной, асп. A.C. Волк, сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИ-БОХ к.х.н. В.И. Горбачу, д.х.н. И.М. Ермак, д.х.н. О.Д. Новиковой, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов за предоставление образцов ЛА из некоторых морских бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 02-04-49466, № 05-04-48504), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и ДВО РАН (гранты № 03-3-А-05-081, № 05-3-А-05-061).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Литературный обзор

В литературном обзоре представлена информация о структуре клеточной стенки ГОБ, дана характеристика липидного состава ГОБ, рассмотрены особенности строения ЛА бактерий различной видовой принадлежности, приведены данные о влиянии структуры ЛА на биологические свойства эндотоксинов, описаны механизмы действия эндотоксинов на иммунокомпетент-ные клетки человека и способы нейтрализации эндотоксинов.

2. Объекты и методы исследования

В работе использовались дикие и лабораторные штаммы У. pseudotuberculosis 0:1b серовара с различным плазмидным профилем и морские ГОБ из Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Бактерии псевдотуберкулеза выращивали в аэробных условиях при температуре 4-8 («холодовой» вариант) или 37 °С («тепловой» вариант) в жидкой питательной среде различного состава и ага-ризованном питательном бульоне. Морские бактерии выращивали в аэробных условиях при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием в жидкой питательной среде, содержащей морскую воду.

Выделение липидов, ЛПС, КПС и ЛА проводили, используя стандартные методы. Характеристику экстрактов и индивидуальных соединений осуществляли с помощью одномерной и двумерной ТСХ, ДСН-ПААГ-электро-фореза с последующим окрашиванием солями серебра, гель-хроматографии на различных носителях, ГЖХ, ГЖХ-МС, FABMS, ESIMS, MALDI-TOFMS, спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 31Р (используя методики COSY, TOCSY, NOESY, НМВС и HSQC), а также иммуноферментного анализа.

Содержание ЛПС определяли по количеству 3-гидрокситетрадекановой (3-ОН-С14:0) кислоты в щелочных гидролизатах клеток. Модификации в структуре ЛПС оценивали по изменению СП О-специфических полисахаридов и СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты. СП рассчитывали из отношения числа молей маннозы, моносахарида, входящего в состав О-специфической боковой цепи ЛПС Y. pseudotuberculosis 0:1 b серовара, к сумме числа молей L-глицеро-О-манно- и О-глицеро-О-манно-гептоз, моносахаридов олигосаха-рида кора в ЛПС этого микроорганизма, в гидролизатах ЛПС по формуле: СП = 2(число молей маннозы/число молей гептозы).

СА ЛПС определяли по отношению додекановой (С12:0) и 3-ОН-С14:0 кислот, входящих в состав липидного фрагмента ЛПС псевдотуберкулезного микроба, по формуле:

СА = Wl2:o/W3-OH-C14:oX 100,

где W = содержание (в %) ЖК в гидролизатах ЛПС.

Для электронной микроскопии использовали клетки С. indoltheticum, негативно окрашенные фосфорно-вольфрамовой кислотой, и ультратонкие срезы клеток.

Токсичность ЛПС и ЛА проверяли на мышах линий С-57 и BALB/c, сенсибилизированных D-галактозамином. 50%-ные летальные дозы (LD5o) рассчитывали по методу Новотного.

Индукцию синтеза ФНО-а изучаемыми препаратами проводили in vitro на цельной крови человека. Содержание ФНО-а определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Влияние экзогенных и эндогенных факторов на липидный состав У. pseudotuberculosis

В жизненном цикле бактерий - факультативных паразитов, типичным представителем которых является Y. pseudotuberculosis, обязательна реализация двух фаз: фазы пребывания в организме хозяина (паразитической) и фазы существования во внешней среде (сапрофитной). Важная роль в адаптации бактерий к изменяющимся условиям роста принадлежит липидам. Сравнительный анализ липидов бактерий псевдотуберкулеза, испытывающих влияние различных абиотических (температура, источник углерода, способ культивирования и фаза роста) и биотических (плазмидные ДНК) факторов, был начат с характеристики липидного состава клеток холодовой культуры природного штамма, выращенных в жидкой питательной среде.

3.1.1 Характеристика липидного состава Y. pseudotuberculosis

Основными липидными компонентами ГОБ являются свободные липи-ды, которые легко извлекаются при экстракции бактерий органическими растворителями, и ЛПС, выделение которых требует особых подходов. В холодовых культурах бактерий псевдотуберкулеза на долю первых приходилось около 5% (в пересчете на сухую массу). Большая часть из них (90%) относилась к классу ФЛ и состояла из ФЭ (89%), ФГ (6,7%) и ДФГ (1,9%). Меньшая часть суммарной фракции свободных липидов (10%) представляла собой НЛ, основными компонентами которых были ЖК: С16:0, (31,4%), Е(9)-С16:1, (39,4%), Е(11)-С18:1 (27,5%) и С17:0су (1,5%).

Анализ клеточного лизата с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза показал, что ЛПС выращенных на холоду бактерий псевдотуберкулеза представляют собой семейство молекул различной молекулярной массы. Они состоят из ЛПС S-формы (им соответствуют полосы в верхней части геля), ЛПС переходных SR-форм и ЛПС R-формы (интенсивно окрашенные зоны в нижней части геля) (рис. 1, линия 1). Последовательная экстракция клеток смесью 90%-ный водный фенол-хлороформ-петролейный эфир (РСР-экстракция) и горячим 45%-ным водным раствором фенола (PW-экстракция) привела к выделению двух образцов ЛПС (ЛПС-РСР и ЛПС-PW соответственно; рис. 1, линии 4, 5; табл. 1). Они имели идентичные составы моносахаридов и ЖК (характерные для ЛПС У pseudotuberculosis 0:1b серовара), близкие значения СП О-полисахаридов и отличались по величине СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты.

Несмотря на применение двух методов экстракции, бактерии все еще содержали ЛПС. Возможной причиной неполного извлечения ЛПС может быть взаимодействие части его молекул с белками наружной мембраны клеток с образованием липополисахарид-белковых комплексов. Действительно, обработка бактерий, остающихся после выделения ЛПС, 5%-ной трихлорук-сусной кислотой (метод, используемый для извлечения комплексов ЛПС с

белком), привела к получению препарата, который по своим химическим характеристикам (содержание белка - 22,6%, углеводов - 43,5%) и поведению в условиях ДСН-ПААГ-электрофореза был подобен образцу, выделенному из нативных клеток.

Характеристики образцов ЛПС-РСР ЛПС-PW

Выход (%)* 1,3 1,0

СП 4,4 3,7

СА 53,3 36,7

Содержание (%)

С12:0 5,3 2,9

£(2)-С14:1 3,5 2,3

3-ОН-С14:0** 12,1 9,5

УЖК 17,5 12,4

1 2 3 4 5

* - В % на сухой вес бактерий ** - 3-ОН-С14.0 = 3-ОН-С14:0 + £(2)-С14:1 (продукт реакции 0-элиминирования эфиров ацилоксиалкановых кислот)

Таблица 1.

Выход и химическая характеристика различных молекулярных типов ЛПС У.

pseudotuberculosis

Рис. 1. Электрофореграмма лизатов клеток и ЛПС У. pseudotuberculosis: необработанные клетки (1), клетки после PW-экстракции (2), клетки после обработки 10%-ной АсОН (3), ЛПС-РСР (4), ЛПС-PW (5). Здесь и далее окрашивание солями серебра.

Таким образом, ЛПС «холодового» варианта суспензионных культур У. pseudotuberculosis различаются не только по длине цепи О-специфическо-го полисахарида и степени гидрофобности, но и по способу существования в клетке (в комплексе с белком или в свободном виде), т.е. имеют высокую степень гетерогенности, что делает реакцию на них организма-хозяина более дифференцированной и тем самым способствует сохранению их патогенное™ в течение более длительного времени.

3.1.2 Новые подходы к исследованию состава ЛПС

Одной из задач настоящей работы была оценка изменений в составе липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза, в том числе ЛПС, при изменении условий культивирования. Высокая степень гетерогенности ЛПС псевдотуберкулезного микроба, невозможность добиться их полного извлечения могли значительно затруднить характеристику изучаемых соединений и исказить полученные результаты. Для более точной оценки диапазона качественной и количественной вариабельности ЛПС под воздействием различных факторов среды были разработаны новые, менее деструктивные методы выделения и анализа его структурных элементов: О-полисахарида, ЛА и жирных кислот.

Состав ЖК ЛПС определяли, анализируя щелочные гидролизаты кле-

ток, предварительно обработанных смесью хпороформ-метанол для удаления свободных липидов. Такая обработка значительно облегчила последующий анализ ЖК ЛПС, чему способствовало то обстоятельство, что ЛПС псевдотуберкулезного микроба не содержат ЖК, входящих в состав других мембранных липидов.

Характеристику углеводных фрагментов ЛПС проводили на препаратах ДПС, полученных путем гидролиза микробной массы 10%-ной АсОН. Такой подход обеспечивает практически полное извлечение ДПС (элекгрофоре-грамма лизата клеток, обработанных 10%-ной АсОН (рис. 1, линия 3), не содержит полос ЛПС), повышает их выход и упрощает процедуру выделения. Сравнение ДПС, полученных гидролизом бактериальных клеток и ЛПС, показало, что они имеют идентичный моносахаридный состав, содержат равные количества высокомолекулярных фракций с близкими значениями СП (12,7 и 15,0 соответственно) и не подвергаются деградации в процессе выделения.

Упрощенная схема получения ЛА включала гидролиз обезжиренных бактерий 10%-ной АсОН и последующую экстракцию клеток смесью хлороформ-метанол. В результате был получен препарат (ЛАдсон, выход 0,14%, табл. 2), который по своим характеристикам оказался подобным ЛА, выделенному из ЛПС (ЛАппс).

Таблица 2.

Характеристики образцов липида А Y. pseudotuberculosis

Препарат Содержание (мкмоль)

Р* GlcN С12:0 3-ОН-С140 7 жк СА

ЛАдсОН 2,3 2,0 0,4 4.0 4,4 10,7

ЛА„а 1,0 2,0 0,3 4,4 4,7 6,4

ЛАппс 1,8 2,0 0,7 3,9 4,6 15,2

* - Р - содержание фосфора

Дополнительное, значительно большее количество ЛА (0,49%) было получено при последующей более жесткой обработке бактерий 1 М HCI (ЛАно). Эта часть молекул ЛА претерпевала более существенную деградацию (потеря гликозидносвязанного фосфата и части ЖК, табл. 2).

Достоинствами описанных выше подходов к исследованию состава ЛПС Y. pseudotuberculosis являются упрощение процедуры выделения и сокращение времени анализа, что оказалось очень полезным для последующей характеристики состава и структуры липидов бактерий псевдотуберкулеза, культивируемых в различных условиях.

3.1.3 Влияние фазы роста и способа культивирования на липидный состав холодовых культур Y. pseudotuberculosis

Сравнение параметров роста бактерий псевдотуберкулеза на ПБ и ПА выявило существенную разницу между ними: суспензионные культуры имели меньшее время генерации, большую удельную скорость роста и более высокий выход биомассы. Учитывая, что понятие «лучший рост» включает в себя укороченную продолжительность генерации и получение большего количе-

ства клеток в конце культивирования, можно сделать вывод, что более благоприятной средой для роста Y. pseudotuberculosis является ПБ.

При обоих способах культивирования экспоненциально растущие клетки Y. pseudotuberculosis характеризовались максимальным содержанием свободных липидов (рис. 2а), причем во всех фазах роста уровень HJ1 в клетках превышал уровень ФЛ (рис. 26). У суспензионных и колониальных культур изменение содержания ФЛ по мере старения клеток имело противоположную направленность: при росте клеток в ПБ наблюдалось уменьшение количества ФЛ, на ПА - увеличение.

Рис. 2. Содержание (а) липидов в клетках (в % на сухую массу) и относительное содержание (б) НЛ и ФЛ в липидных экстрактах (в % от суммы липидов) Y. pseudotuberculosis, выращенных на ПА и в ПБ и находящихся в разных фазах роста.

Суспензионные и колониальные культуры имели одинаковый качественный состав ФЛ (табл. 3). ФЭ был основным ФЛ на протяжении всего периода роста культур только на ПА. При росте клеток на ПБ, начиная с середины стационарной фазы, преобладающим ФЛ становился ДФГ. По мере старения клеток доля ФГ в общей фракции липидов уменьшалась. Обращает на себя внимание низкое содержание ФЭ на всех стадиях роста (25-44 и 26-51% для ПБ и ПА соответственно). Частично это компенсировалось высоким уровнем производных ФЭ, причем в суспензионных культурах их содержание было в 2-4 раза больше, чем в колониальных.

При культивировании иерсиний псевдотуберкулеза на плотной среде в фазе линейного роста и в ранней стационарной фазе наблюдался аномально высокий уровень ЛФЭ (35,9 и 18,2% соответственно, табл. 3). Присутствие ЛФЭ в липидных экстрактах, как известно, является результатом действия эндогенной фосфолипазы, активность которой зависит от возраста культуры и наиболее высока в конце экспоненциальной фазы и при переходе к стационарной фазе. Высокое содержание ЛФЭ в клетках, растущих на агаре, видимо, связано с более высокой ферментативной активностью колониальных культур и может способствовать повышению проницаемости клеточных мембран в период интенсивного деления клеток.

Таблица 3.

Влияние способа культивирования и фазы роста на содержание ФЛ и ЖК в клетках У. pseudotuberculosis.

Фаза роста ЛФ ФЛР РСФ СФ ПСФ

Среда ПБ ПА ПБ ПА ПБ ПА ПБ ПА ПБ ПА

Время роста (сутки) 1 2 2 6 6 9 9 17 21 30

Фосфолипиды (% от суммы ФЛ)

ФЭ 25,6 30,3 30,5 33,6 44,1 26,0 36,5 51,6 33,9 50,8

ФГ 23,0 14,3 19,3 8,5 7,4 9,3 6,5 4,8 5,2 4,9

ДФГ 13,9 20,1 18,1 9,7 26,7 25,7 37,1 33,1 39,5 36,0

ФЛ-Х - 5,5 - 1,1 2,6 5,2 3,7 1,4 2,0 1,6

ФЛ-Х,+ФЛ-Х2 - 6,2 5,2 1,9 - 11,1 - - - -

ЛФЭ 7,2 8,4 6,1 35,9 5,5 18,2 4,5 6,5 4,6 3,2

МЭФЭ 18,5 10,3 16,3 7,0 10,0 4,3 6,4 2,6 12,7 3,5

ДЭФЭ 11,7 4,9 4,6 2,3 3,6 - - - 2,3 -

1ФЭ / ФГ+ДФГ 1,7 1,6 1,5 4,3 1,9 1,4 1,1 1,6 1,2 1,4

Жирные кислоты (% от суммы ЖК)

С12:0 3,4 2,7 2,6 2,7 2,6 2,2 3,4 2,4 3,7 3,8

С14:0 4,6 2,8 2,6 0,8 2,8 0,8 0,7 0,6 0,6 1,2

С15:0 4,5 2,4 1,4 2,4 1,8 5,0 1,7 6,8 2,7 6,7

£(2)-С14:1 1,6 1,4 1,2 1,3 1,6 1,1 1,4 1,0 1,8 1,2

30H-C14:0 1,5 8,0 4,5 6,3 6,1 4,7 3,3 6,3 7,2 6,4

I 3-ОН-С14:0 3,1 9,4 5,7 7,6 7,7 5,8 4,7 7,3 9,0 7,6

С16:0 37,0 24,6 19,5 16,0 18,2 14,4 20,6 13,9 19,9 15,2

£(9)-С16:1 15,0 33,7 40,8 43,0 28,1 36,4 30,0 30,8 24,2 28,8

С17:0 2,3 0,9 1,3 1,6 1,6 3,5 1,7 4,3 2,0 4,2

С17:0су 2,4 2,1 3,4 4,5 14,7 10,9 15,7 16,3 17,9 15,3

С18:0 11,5 4,1 0,9 1,0 0,8 0,9 1,0 0,9 1,1 1,7

Е(9)-С18:1 4,8 3,1 0,5 0,5 0,4 0,6 0,4 0,5 - 1,3

Щ11)-С18:1 6,0 12,8 20,7 19,2 19,4 18,7 19,0 15,1 17,4 13,2

Другие кислоты 5,4 1,4 0,6 0,7 1,9 0,8 1,1 1,1 1,5 1,0

U/S+C" 0,3 0,9 1,6 1,7 1,0 1,3 1,0 0,9 0,7 0,8

С12:0/С16:0 0,09 0,11 0,13 0,17 0,14 0,15 0,17 0,17 0,19 0,25

С14:0/С16:0 0,12 0,11 0,13 0,05 0,04 0,06 0,03 0,04 0,03 0,08

" - U/S+C - Индекс ненасыщенности ЖК, определяли как отношение ненасыщенных ЖК (U) к сумме насыщенных (S) и циклопропаноиых (С).

Преобладающими ЖК в клетках обеих культур были С16:0, £(9)-С16:1, £(11)-С18:1, С17:0су и 3-ОН-С14:0 кислоты (табл. 3). Общее содержание ненасыщенных ЖК на обеих средах и на всех стадиях роста заметно превышало содержание насыщенных, что, видимо, связано с низкой температурой культивирования бактерий в этих экспериментах. Колониальные культуры имели более высокий индекс ненасыщенности ЖК, чем суспензионные.

При обоих способах культивирования максимальное количество ненасыщенных ЖК наблюдалось в фазе линейного роста. Напротив, клетки в логарифмической фазе имели низкий индекс ненасыщенности. Таким образом, в клетках быстро растущих культур У. pseudotuberculosis при переходе от одной стадии роста к другой липидный состав клеточных мембран и, по-видимому, их свойства, претерпевают существенные изменения.

Содержание ЛПС в клетках (его определяли по количеству 3-ОН-С14:0 кислоты в щелочных гидролизатах бактерий, табл. 3) зависело от фазы роста, при этом динамика изменений у колониальных и суспензионных культур была различной (рис. 3).

У бактерий, растущих на ПБ, наблюдалось постепенное увеличение количества 3-ОН-С14:0 кислоты, которое достигало максимального значения в ранней стационарной фазе. В колониальных культурах ее содержание (с незначительными колебаниями) оставалось постоянным, но и в фазе линейного роста и в стационарной фазе было выше, чем в суспензионных культурах. В результате, в клетках, растущих на агаре, содержание ЛПС было выше, чем в клетках, растущих в ПБ.

Лизаты клеток суспензионных и колониальных культур У. pseudotuberculosis при проявлении их солями серебра давали подобные элеетро-фореграммы (рис. 4). По мере старения клеток у обеих культур наблюдалось увеличение количества высокомолекулярной фракции ЛПС, о чем свидетельствует усиление интенсивности окрашивания полос ЛПС в верхней части геля (рис. 4, линии 6-10 и 1-5 соответственно).

У лизатов колониальных культур интенсивность окрашивания полос ЛПС была выше, чем у суспензионных. Из этого следует, что клетки, растущие на агаре, синтезируют ЛПС с более длинными углеводными цепями, чем суспензионные. Действительно, ДПС бактерий псевдотуберкулеза, выращенных на плотной среде, имели более высокие значения СП (в среднем в 2 раза), чем ДПС клеток, растущих в жидкой питательной среде

о

Рис. 3. Содержание 3-ОН-С14Ю кислоты в клетках У. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне и на питательном агаре, в зависимости от фазы роста.

л* 4>ЛР РСФ С* ПС* фазы роста

(рис. 5). При обоих способах культивирования максимальные значения СП были у ДПС, выделенных из клеток, находящихся в стационарной фазе роста.

Рис. 4. Электрофореграммы лизатов клеток У. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне (1-5) и на питательном агаре (6-10) в разных фазах роста-, логарифмической (1, 6), линейного роста (2, 7), ранней стационарной (3, 8), стационарной (4, 9), поздней стационарной (5, 10).

Рис. 5. Степень полимеризации ДПС бактерий У. pseudotuberculosis, выращенных в питательном бульоне и на питательном агаре, в различные фазы роста.

Сравнительную характеристику ЛПС суспензионных и колониальных культур проводили на образцах, выделенных из клеток, находящихся в ранней стационарной фазе. Хотя содержание ЛПС у обеих культур в этой фазе роста было приблизительно одинаковым (рис. 3), из клеток, растущих в виде колоний, ЛПС выделялся с более высоким выходом (табл. 4).

ЛПС имели идентичный набор моносахаридов и близкие значения СА остатков 3-ОН-С14:0 кислоты. СП О-полисахаридов ЛПС, выделенных из клеток, растущих в виде колоний, в среднем более чем в два раза превышали СП полимеров, полученных из клеток, растущих на ПБ (табл. 4). Видимо поэтому из бактерий, растущих на плотной среде, ЛПС выделялись с более высоким выходом.

Таблица 4.

Характеристики ЛПС У. pseudotuberculosis, выращенной на ПБ и ПА

Характеристики ЛПС

ЛПС Выход3 , % СП СА

ПБ ПА ПБ ПА ПБ ПА

ЛПС-РСР 0,5 0,5 4,5 10,8 - -

ЛПС-PW 1,5 2,6 5,4 13,0 41,6 46,5

2 ЛПС6 2,0 3,1 5,2 12,6 41,6 46,5

а - В расчете на сухую микробную массу. 6- ХЛПС = ЛПС-РСР+ЛПС-Р\Л/.

ЩЩЩЩЩщ

Таким образом, в колониальных культурах У. pseudotuberculosis ли-пидный синтез проходит более интенсивно, чем в суспензионных: в них выше доля общих липидов и ФЛ; они имеют более высокий индекс ненасыщенности ЖК; ЛПС, выделенные из них, характеризуются более высокими значениями СП О-полисахаридов. При обоих способах культивирования содержание свободных липидов и ЛПС в клетках зависит от фазы роста бактерий.

3.1.4 Влияние температуры культивирования и плазмидного профиля на липидный состав бактерий псевдотуберкулеза

Роль температуры и плазмидных ДНК в биосинтезе липидов У. pseudotuberculosis изучали, используя изогенные штаммы: бесплазмидный (82~), с плазмидой р57 (57*), с плазмидой pVM82 (82*) и штамм, содержащий плаз-миды pVM82 и pYV (82*48*). Все эксперименты, описанные в этой главе, проводились на суспензионных культурах, находящихся в стационарной фазе роста, за исключением экспериментов по изучению роли плазмиды вирулентности, в которых использовались колониальные культуры в фазе линейного роста, выращенные на холоду.

«Холодовые» варианты всех изогенных производных давали более высокие выходы биомассы, чем соответствующие «тепловые» варианты (табл. 5). Тем не менее, на фоне общего для всех «тепловых» вариантов угнетения роста выход биомассы у штамма (82*) был на 25% выше.

Таблица 5.

Выход биомассы и состав липидов изогенных штаммов У. pseudotuberculosis

при различных температурах культивирования

Жидкая питательная среда 1 ПА

Липиды «Тепловой» вариант «Холодовой» вариант

I II III IV V VI VIII

82 57* 82* 82 57* 82* 32* 82*48*

Выход биомассы* 0,2 0,2 0,2 0,4 0,3 0,4 -

Выход липидов (в % на сухую массу клеток)

Общие липиды ФЛ 9.1 2.2 8,0 1,7 12,4 4,4 9,7 6,0 8,8 6,0 4,7 3,1 3,5 2,0 4,0 2,6

НЛ 6,9 6,3 8,0 3,8 2,8 0,9 1,5 1,4

Содержание индивидуальных липидов (в % от суммы ФЛ)

ФЭ 52,8 47,3 78,1 76,0 74,5 78,5 36,9 58,8

ФГ 8,9 4,8 12,9 9,1 10,2 10,8 13,4 14,5

ДФГ 25,8 25,9 4,6 12,3 13,2 6,0 15,3 13,7

ФС - - 2,0 - - 2,0 ■ -

ЛФЭ 5,1 9,8 2,3 2,3 2,0 2,3 34,4 8,2

МЭФЭ - - - - - - - 4,9

ФЛ-Х 7,3 12,3 - - - - - -

I ФЭ, ФГ, ДФГ 37,6 78,1 95,6 34,7 98,0 95,3 35,6 87,0

ФЭ/ФГ+ДФГ 1,6 1,5 4,5 3,6 3,2 4,7 2,5 2,5

* - Выход биомассы рассчитывали в г на 1 л культуральной жидкости.

Бесплазмидный штамм и штамм (57*), выращенные при 37 °С, имели высокое содержание ФЛ (табл. 5, колонки I, II и IV, V соответственно). При обеих температурах роста преобладающим ФЛ был ФЭ. Однако у «тепловых» вариантов бактерий его относительное содержание было значительно ниже. Количество ФГ в клетках оставалось постоянным при обеих температурах роста, в то время как уровень ДФГ увеличивался вдвое при повышении температуры до 37 °С. Напротив, количество ФЭ, а также отношение ФЭ к сумме ФГ и ДФГ в клетках штамма (82*) не зависело от температуры культивирования (табл. 5, колонки III, VI). Полученные данные позволяют говорить, что плазмида pVM82 отменяет отмеченную выше температурную регуляцию биосинтеза липидов у бактерий псевдотуберкулеза.

Важную роль в способности бактерий приспосабливаться к смене температуры играют ЖК. У бактерий У. pseudotuberculosis (табл. 6) наблюдалась обычная для ГОБ адаптивная реакция на повышение температуры роста: понижение уровня ненасыщенных ЖК и повышение содержания цикпо-пропановых и насыщенных кислот.

Степень ненасыщенности ЖК бактерий, культивируемых при 37 "С, зависела от их плазмидного профиля: плазмидосодержащий штамм (82*) имел в 3 раза более высокий индекс ненасыщенности ЖК, чем штаммы (57*) и (82"). Учитывая, что у иерсиний увеличение текучести и проницаемости бактериальных мембран для гидрофобных агентов коррелирует с инвазивно-стью бактерий, можно предположить, что плазмида pVM82, повышающая индекс ненасыщенности ЖК, играет важную роль в способности бактерий псевдотуберкулеза проникать в организм хозяина и в их вирулентности.

Таблица 6.

Влияние температуры и плазмидного профиля на состав жирных кислот У. pseudotuberculosis.

Содержание жирных кислот (в % от суммы жирных кислот)

Жидкая питательная среда

ПА

Жирные «Тепловой» вариант «Холодовой» вариант

кислоты До обработки После обработки До обработки После обработки Цо обработки

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV

82 57' 32' 32" 57' 32' 32 57' 32' 32 57' 32* 32' 32'45*

С12:0 2,63 2,53 3,32 4,20 5,63 5,86 4,69 8,82 5,34 13,82 12,53 15,43 2,71 3,32

Е(2)-С14:1 3,16 2,25 2,30 4,32 5,70 5,91 2,53 4,15 2,81 7,20 10,59 7,65 1,33 1,44

3-ОН-С14:0 26,87 20,72 26,05 58,38 53,76 53,72 13,30 23,41 14,64 37,14 32,40 41,35 6,31 5,74

£3-ОН-С14:СГ 30,03 22,97 28,35 32,70 59,46 59,63 15,83 27,56 17,45 44,34 42,59 49,00 7,65 7,15

С14:0 2,66 2,50 1,99 2,82 1,33 1,51 0,95 2,04 1,31 1,34 1,30 0,88 0,82 1,21

С16:0 24,51 24,58 20,24 11,88 18,00 13,86 16,35 11,79 19,31 11,35 10,97 8,70 16,01 16,93

Е(9)-С16:1 6,64 7,21 20,34 3,96 2,55 3,79 35,17 24,00 33,31 12,00 17,38 15,27 43,05 42,51

С 17:0 су 15,51 18,26 12,39 1,50 3,53 1,62 11,62 4,34 5,51 0,48 1,58 0,30 4,52 2,82

С18:0 2,37 2,22 1,03 1,58 4,20 3,94 0,82 1,01 1,36 3,75 2,34 2,67 1,03 1,11

Е(9)-С18:1 1,54 0,78 0,57 1,14 1,16 1,79 0,34 0,84 0,73 1,29 0,78 0,53 0,55 1,32

£(11)-С18:1 1,86 4,42 3,08 0,41 0,00 0,49 13,14 5,30 10,61 1,16 1,89 1,37 19,22 21,11

Мольные отношения жирных кислот

С12:0/3-0н-014:0 - - - 8,17 10,96 10,80 38,03 35,90 38,42 - -

£(2)-С14:1/3-ОН-С14:0 - - 7,43 9,73 9,68 17,60 26,81 16,83

С12:0/С16:0 3,107 3,103 3,164 - - 3,287 3,748 3,276 -

С14.0/С16.0 Э, 108 3,102 3,098 - - - 3,058 3,173 3,068 - - - -

U/S+C" 3,21 3,25 3,61 - - - 1,41 1,08 1,36 - 1,71 1,92

* - Количество 3-ОН-С14:0 кислоты определяли по сумме 3-ОН-С14:0 и £(2)-С14:1 кислот. - и/Б+С - Индекс ненасыщенности ЖК определяли как отношение ненасыщенных ЖК (и) к сумме насыщенных (Э) и циклопропано-вых (С) кислот.

Изменение температуры культивирования оказывало значительное влияние на ЛПС. В клетках «тепловых» вариантов У. pseudotuberculosis не синтезируются ЛПС с длинной углеводной цепью (рис. 6, линии 4-6). Это отличает их от других представителей сем. Enterobacteriaceae, синтезирующих при 37 °С длинноцепочечные ЛПС и, видимо, вызвано разной стратегией выживания различных патогенов в организме теплокровных.

ЛПС «холодовых» вариантов плазмидосодержащего (82+) штамма и бесплазмидного производного были во многом подобны. Лизаты клеток обоих штаммов давали идентичные ЛПС профили в ДСН-ПААГ электрофорезе (рис. 6, линии 1, 2), они содержали и из них извлекались равные количества ДПС, ЛПС-PW и ЛПС-РСР, характеристики которых (СП, СА, высокая активность в реакции с антителами к О-ПС) также были довольно близки (табл. 7).

te ш & ....... о-« Ш

11|1вД1|

Рис. 6. Электрофореграмма лиза-тов клеток изогенных штаммов У. pseudotuberculosis (1-3 - «холодовые» варианты штаммов (82*), (82") и (57*), 4-6 - «тепловые» варианты этих бактерий) и ЛПС-PW бесплазмидного штамма, выращенного (7) на холоду и (8) при 37 °С.

1 2 3 4 5 6 7 8

Таблица 7.

Характеристики ДПС и ЛПС изогенных штаммов У. pseudotuberculosis

Харак- Аналитические данные

Образец Жидкая питательная среда ПА

теристика «Тепловой » вариант» «Холодовой» вариант

82" 57* 82* 82" 57* 82* 82* 82*48*

ДПС 1,5 1,1 1,3 2,0 0,9 2,0 4,4 4,4

Выход" ППС-РСР 0,1 0,5 1,0 1,1 0,7 0,9 0,5 0,5

ППС-PW 1,3 0,4 0,9 0,8 0,4 0,8 [2.6 3,1

£ЛПС6 1,4 0,8 1,9 1,9 1,2 1,7 3,1 3,6

Содер- Й-ОН-С14:0 0,7 0,8 0,8 0,5 0,43 0,70 0,4 0,5

жание ППС 3,8 3,3 5,4 3,5 2,6 6,1

ЦПС 2,7 1,5 3,1 3,8 0,0 5,4 |8,8 8.6

СП ППС-РСР 3,8 1,1 1,3 5,0 0,0 3,8 10,8 10,7

ППС-PW 3,0 1,2 1,6 4,0 1,4 3,5 13,0 16,0

£ ЛПС6 3,0 1,1 1,4 4,5 0,5 3,6 12,6 14,0

ППС-РСР 21 30 20 33 32 66

СА ППС-PW 12 15 12 15 9 19 47 59

£ ЛПС" 12 19 16 39 25 43

* - В % на сухую массу бактерий; ** - £ ЛПС = ЛПС-РСР+ЛПС-PW.

Напротив, «тепловые» варианты штаммов (82*) и (82") проявляли существенные различия. В отличие от бесплазмидного производного, из которого извлекались только ЛПС-PW, клетки (82*) штамма содержали оба типа ЛПС молекул. «Тепловой» вариант плазмидосодержащего штамма (82*) характеризовался более высоким содержанием ЛПС и более высоким выходом ДПС и ЛПС, которые имели в своем составе короткие О-ПС, благодаря чему проявляли умеренную активность в реакции с антителами к О-специ-фическому полисахариду. ЛПС бесплазмидного производного были неактивны в этом тесте.

Следует сказать, что с повышением температуры культивирования штаммов (82*) и (82") уменьшалась СА остатков 3-OH-C14:Ó кислоты как в составе бактерий (С12:0/3-ОН-С14:0 и Е(2)-С14:1/3-ОН-С14:0, табл. 6), так и в составе ЛПС (табл. 7). Это объясняет, почему из тепловых культур не извлекались (или извлекались с низким выходом) ЛПС-РСР.

Наименьшее влияние температуры на ЛПС было обнаружено у штамма (57*). Оба температурных варианта этих бактерий характеризовались низким содержанием и низким выходом ЛПС, которые практически не содержали О-полисахаридов (СП ЛПС этих бактерий составляла acero 0,5-1,1) и имели низкие значения СА остатков 3-ОН-С14:0 (табл. 7).

Таким образом, низкая температура культивирования создает более благоприятные условия для репродукции бактерий псевдотубсркулеза, 'г,а может способствовать выживанию внеорганизменных популяций этого микроорганизма. Синтез липидов является термозависимым процессом и контролируется хромосомными генами. В присутствии плйзмиды pVM82 зависимость липидного биосинтеза от температуры не обнаружена. Наблюдаемые различия в составе ФЛ «тепловых» вариантов штаммов (57*) и (82 ), с одной стороны, и производного, содержащего плазмиду pVM82, с другой, позволяют сделать заключение, что за отмену терморегуляции отвечает фрагмент ллазмидной ДНК с молекулярной массой 25 мДа. Влияние температуры на синтез ЛПС снижалось в ряду: штаммы (82") > (82*) > (57*). На этом основании был сделан вывод, что гены, подавляющие зависимость синтеза ЛПС от температуры, находятся на 57 мДа фрагменте плазмиды pVM82, фрагмент 25 мДа частично восстанавливает терморегуляцию.

Что касается плазмиды вирулентности, сравнение липидных экстрактов штаммов (82*) и (82*48*) показало между ними мало различий, за исключением необычно низкого для колониальных культур в фазе линейного роста содержания ЛФЭ в клетках штамма (82*48*) (табл. 5, колонки VII, VIII). По-видимому, плазмида pYV не участвует в синтезе липидов бактерий псевдотуберкулеза (по крайней мере, при выращивании их на холоду), что согласуется с данными, полученными ранее для другой бактерии рода Yersinia, Y. enterocolitica. Присутствие плазмиды вирулентности не оказывало влияния и на ЛПС «холодовых» вариантов бактерий псевдотуберкулеза: содержание, выход и структурные характеристики (СА и СП) ЛПС, выделенных из штаммов (82*48*) и (82*), оказались идентичными (табл. 7).

3.1.5 Влияние глюкозы на состав липидов У. pseudotuberculosis

«Холодовые» варианты бактерий псевдотуберкулеза, культивируемые на белковом гидролизате (ПБ) и на белковом гидролизате с добавлением глюкозы (ПБ+Glc), содержали примерно равные количества свободных липидов (табл. 8). Однако относительное содержание ФЛ и НЛ в липидных экстрактах было разным. Максимальное количество ФЛ (4,6%) синтезировалось в клетках, культивируемых на среде, содержащей глюкозу (табл. 8). Преобладающим ФЛ, на долю которого приходилось 78,9% от суммарной фракции ФЛ, был ФЭ.

Таблица 8.

Выход микробной массы, свободных липидов и ЛПС и относительное содержание индивидуальных ФЛ для У. pseudotuberculosis, выращенных на глюко-зосодержащем и безглюкозном питательном бульоне при различных температурах

Выход (% на сухой вес бактерий)

Липиды «Холодовой » вариант «Тепловой» вариант

ПБ ПБ + Glc ПБ ПБ + Glc

Биомасса 0,8 0,7 0,08 0,15

Общие липиды 6,2 7,1 4,5 9,1

Нейтральные липиды 4,5 2,5 0,5 6,9

Фосфолипиды 1,7 4,6 4,0 2,2

3-ОНгС14:0 0,53 0,55 0,69 0,72

ЛПС 1,5 1,2

СГТППС 5,3 4,0 0,5 0,5

Содержание фосфолипидов (в % от суммы ФЛ)

ФЭ 44,1 78,9 72,4 52,8

ФГ 7,4 7,8 2,4 8,9

ДФГ 26,7 10,7 24,3 25,9

ЛФЭ 5,5 2,6 0,8 5,1

МЭФЭ 10,0 - - -

ДМФЭ 3,6 - - _

ФЛ-Х 2,6 - - -

ФЭЛФГ+ДФГ 1,3 4,3 2,7 1,5

На среде, не содержащей глюкозы, наблюдалось подавление синтеза ФЛ, количество которых уменьшалось до 1,7% (табл. 8). Доля ФЭ снижалась до 44%, уровень ФГ оставался неизменным, количество ДФГ увеличивалось. В результате в клетках, растущих на ПБ, отношение незаряженных цвитте-рионных ФЛ к сумме отрицательно заряженных оказалось более чем в три раза меньше, чем в клетках, выращенных на глюкозосодержащем ПБ.

В клетках «тепловых» вариантов бактерий присутствие глюкозы в среде роста ингибировало синтез ФЛ, количество которых значительно (в 2 раза по сравнению с клетками, растущими на безглюкозной среде) уменьшалось (табл. 8). Кроме ФЭ, ФГ и ДФГ, присутствующих в липидных экстрактах бактерий, выращенных на ПБ, в липидных экстрактах У. pseudotuberculosis, культивируемой на среде ПБ+Glc, были обнаружены ЛФЭ и ФЛ-Х.

Липидные экстракты этих клеток содержали значительно меньше ФЭ, количество ДФГ оставалось постоянным, доля ФГ увеличивалась с 2,4% (ПБ) до 8,9% (ПБ+Glc) (табл. 8). Отношение нейтральных липидов к кислым падало до величины, характерной для клеток, растущих на холоду в отсутствие глюкозы. На обеих средах уменьшение общего количества ФЛ происходило в основном за счет ингибирования синтеза ФЭ.

Присутствие глюкозы в среде роста не влияло на синтез ЛПС: на обеих средах синтезировалось одинаковое количество молекул ЛПС, которые извлекались с одинаковым выходом, имели один и тот же моносахаридный состав и близкие значения СП О-полисахарида (табл. 8). Сохранялась и обычная для У. pseudotuberculosis зависимость состава ЛПС от температуры: при 37 "С в клетках синтезировалось несколько больше молекул ЛПС, преобладающим становился синтез ЛПС с укороченной углеводной цепью.

3.2 Структура липида А У. pseudotuberculosis: влияние температуры

Как следует из представленных выше данных, условия культивирования бактерий псевдотуберкулеза оказывают большое влияние на состав ЖК липидного фрагмента ЛПС, ЛА. Изучение химического состава ЛА из холо-довой культуры показало, что он содержит два остатка глюкозамина (GlcN), - два (1,8 моля) остатка фосфорной кислоты, два остатка 3-ОН-С14:0 кислоты с амидным типом связи и по одному остатку 3-ОН-С14:0 и 3-додеканои-локситетрадекановой кислот, имеющих сложноэфирный тип связи.

В..спектре ЯМР 13С монофосфорилированного производного ЛА У. pseudotuberculosis область резонанса аномерных атомов С представлена синглетом при 92,4 м.д. (атом C1 GlcNI, находящегося в а-конфигурации и не имеющего заместителя при этом атоме углерода; табл. 9).

Таблица 9.

Данные спектров ЯМР 1Н и 13С монофосфорилированного ЛА «холодового» варианта суспензионной культуры У pseudotuberculosis

атом 6Н (мд); J (Гц) 6С (мд) атом 6Н (мд); J (Гц 5С (мд.)

1 5,04 (3,5) 5,04 92,3 92,3 Г 4,55 [8,2) 4,56 4,40 102,1 102,2 102,5

2 4,06 4,06 53,0 53,0 2' 3.94 3,91 3,75 54,6 54,7 54,4

3 5,12 3,68 74,8 39,7 3' 5,18 5.16 4,97 74,5 74,7 76,7

4 3,53 3,53 59,0 59,2 V 4.26 4,26 3,58 72,4* 72,4" 58,9

5 3,98 3,98 39,2 39,0 5' 3,42 3.42 3,45 76,1 76.1 75.7

5а/э 3,69/ 4,06 3,69/ 4,06 39,3 39,3 З'а/э 3,84/ 3,78 - - 31,4 31,4 51,4

* - Для этих сигналов Jc. р = 7,2 Гц.

Сигналы при 102,1, 102,2 и 102,5 м.д. соответствуют атомам С1' трех молекулярных форм ЛА, невосстанавливающий конец которых имеет (3-ориентацию. Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса атомов С2 3-гид-рокси- и 3-ацилоксиалкановых кислот и данные корреляционных спектров

ЯМР 1Н и 13С демонстрируют присутствие в ЛА остатков 3-гидроксикислот, имеющих сложноэфирный (43,0 - 43,5 м.д., ацилируют гидроксильные группы при атомах СЗ и СЗ' дисахаридной молекулы) и амидный (44,3 - 44,8 м.д., ацилируют аминогруппы при атомах С2 и С2') тип связи, а также слож-ноэфирносвязанной 3-ацилоксикислоты (39,0 м.д., ацилирует, предположительно, гидроксильную группу при атоме СЗ' глюкозаминобиозы).

(-) ESI масс-спектр монофосфорилированного ЛА (рис. 7а, табл. 10) содержит серию отличающихся по величине m/z гомологичных пиков. Они

(а)

»4

Ii'""

1323,86

1211,761279i84 1100 1200 1300

1403,82 1506,02158g 06 1400 1500 m/z 1600

Рис. 7. (-) ESI масс-спектры монофосфорилированного ЛА «холодового» (а) и «теплового» (б) вариантов Y. pseudotuberculosis.

Таблица 10.

Состав ионов в (-) ESI и MS2 ESI масс-спектрах липида А

m/z I (%)* Ион (ESIMS)

1775,3 20 [М (2'GlcN + 6*3-ОН-С14:0 + 1«Н3Р04)- НГ

1758,9 20 [М (2-GlcN+4'3-OH-C14:0 + 1-С12:0 + 1>С13:0 + 1'Н3Р04)-Н]-

1688,7 10 [(2'GlcN + 4*3-ОН-С14:0 + 2-С12:0 + 1-Н3Р04) - НГ

1563,4 20 [М (2-GlcN + 4-3-ОН-С14:0 + 1-С16:0 + 1-Н3Р04)- Н]~

1507,0 70 [М (2-GlcN + 4*3-ОН-С14:0 + 1*С12:0 + 1-Н3Р04)- Н]"

1325,0 100 [М (2'GlcN + 4-3-ОН-С14:0 + 1-Н3Р04) - Н]"

1280,8 15 [М (2-GlcN + 3-3-ОН-С14:0 + 1-С12:0 + 1»Н3Р04) - НГ

1098,7 35 [М (2-E(2)-C14:1GlcN + 3*3-ОН-С14:0 + 1«Н3Р04)-НГ

872,1 2 [М (2-GlcN + 2»3-ОН-С14:0 + 1-Н3Р04) - Н]"

Ион (MS2 ESIMS)

1306,8 20 [М - Н]" - С12.0 — Н20

1061,6 100 [М - Н]-- (3-ОН-С14:0 + С12:0)

853, 80 [М - НГ- (3-ОН-С14Ю + С12:0) - Е(2)-С14:1

835,5 90 [М - НГ - (3-ОН-С14.0 + С12.0) - Е(2)-С14:1 -Н20

526, 50 [М - НГ- (3-ОН-С14:0 + С12:0) - 2>Е(2)-С14:1

508,4 50 [М-Н]"-(3-ОН-С14:0 + С12:0)-2'Е(2)-С14:1 -2-НгО

*- Интенсивность сигнала

соответствуют гекса-, лента-, тетра-, три- и диацильным молекулам (табл. 10), что указывает на высокую степень гетерогенности изучаемого образца. Анализ состава фрагмент-ионов, образующихся при распаде молекулярного иона с m/z 1506,0, в спектре MS2 ESIMS (табл. 10) показывает, что три из пяти остатков ЖК ЛА У pseudotuberculosis имеют сложноэфирный тип связи, два (остатки 3-ОН-С14:0 кислоты, ион при m/z 872,1) — амидный. Присутствие в спектре пиков ионов с m/z 835 и 508, которые образуются при фрагментации молекулы ЛА по типу04Аг, доказывает, что 3-додеканоилокси-тетрадекановая кислота находится при атоме СЗ' GlcNII.

На основании полученных данных предлагается вариант структуры ЛА У. pseudotuberculosis, изображенный на рис. 8.

О- >:

Рис. 8. Структура ЛА «холодового» варианта суспензионной культуры У pseudotuberculosis.

Анализ монофосфорилированного ЛА, выделенного из клеток «теплового» варианта У. pseudotuberculosis методом ESIMS (рис. 76) показал, что основной молекулярной формой этого образца является тетраацильное производное, не содержащее остатков ацилоксиалкановой кислоты. Таким образом, повышение температуры культивирования бактерий псевдотуберкулеза приводит к уменьшению СА ЛА и ЛПС в целом.

Следует сказать, что в отличие от ЛПС некоторых других бактерий сем. Enterobacteriaceae, в которых на холоду синтезируется С16:1 кислота, ЛПС и ЛА обоих температурных вариантов У. pseudotuberculosis не содержат ненасыщенных ЖК. Можно предположить, что в ЛПС этих бактерий функции мононенасыщенных ЖК, препятствующих плотной упаковке углеводородных цепей и способствующих уменьшению температуры фазовых переходов, выполняют 3-ацилоксиалкановые кислоты, количество которых в холодовых культурах значительно увеличивается.

3.3 Влияние условий культивирования на патогенный потенциал У. pseudotuberculosis

Значительные изменения в составе липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза, происходящие под воздействием различных факторов, дают основание предполагать, что клетки, выращенные в разных условиях, будут отличаться по своему патогенному потенциалу. Степень патогенности

бактерий рода Yersinia характеризуют, используя С12:0/С16:0 и С14:0/С16:0 отношения ЖК. При этом бактерии с максимальным патогенным потенциалом имеют минимальные значения этих отношений.

«Холодовые» варианты Y. pseudotuberculosis имеют более низкие значения отношения С14:0/С16:0 (табл. 6, рис. 9а), что свидетельствует об их более высоком патогенном потенциале в сравнении с бактериями, выращенными при 37 °С. Это хорошо согласуется с ранее полученной информацией о том, что бактерии псевдотуберкулеза, выращенные на холоду, имеют значительно более низкую LD5o, чем их «тепловые» варианты.

При культивировании на ПА наибольший патогенный потенциал псевдотуберкулезный микроб имел в фазе линейного роста, ранней стационарной и стационарной фазах роста (табл. 6, рис. 96). Бактерии, выращенные на ПБ, обладали высоким патогенным потенциалом, сравнимым с таковым для колониальных культур, только в стационарной фазе роста.

о.: ■ а

0.16

я о 82-т

о * «

~"о.С8 ■ 57т

Q.04 ■

♦ 57х

,82+х ♦82-х

0,16

0,14

0,12

о 0,1

о

н 0.08

а •i 0,06

и 0,04

0,02

0

ПБ-ЛФ ♦

4 ПБ-РСФ ♦ ПБ-ФЛР < ПА-ЛФ

ПА-ПС Ф +

ПА-РСФ

4 НА-1 «

ПА-СФ ПЕ-СФ

, ПА-ФЛР ► ПБ-ПСФ

0.4

12:0/16:0

0Д5

0,1 0,13 0,2 12:0/16:0

ОД! 0,3

Рис. 9. Графическое изображение степени патогенности Y. pseudotuberculosis как отношение жирных кислот С12:0/С16:0 и С14:0/С16:0 в зависимости от (а) плаз-мидного профиля бактерий и температуры культивирования («х» и «т» -«холодовой» и «тепловой» варианты соответственно) и (б) способа культивирования и фазы роста.

Роль эндотоксически активного фрагмента ЛПС выполняет ЛА, который для проявления максимального токсического эффекта должен иметь гексаацильный тип структуры (СА остатков 3-ОН-С14.0 кислоты в таких молекулах близка к 50%). Определение острой токсичности ЛПС различного состава показало, что ЛПС-1, 2 и 3, имеющие высокие значения СА (55, 41, 45% соответственно), были более токсичны (в 28, 5 и 1,5 раза соответственно), чем ЛПС-4, СА которого составляет всего 28,5%) (табл. 11).

Таблица 11.

Влияние различных факторов на величину LDso ЛПС Y. pseudotuberculosis _Характеристики ЛПС_

Препарат Температура Среда роста Способ СП СА LDso

роста, °С выделения нг/мышь

ЛПС-1 5 ПА PW 16,0 55,0 10

ЛПС-2 5 ПА РСР 12,0 41,2 35

ЛПС-3 5 ПБ+Glc РСР 2,4 45,0 112

ЛПС-4 37 ПБ+Glc PW 1,0 28,5 281

Несмотря на довольно близкие значения СА, ЛПС-1, 2 и 3 проявляли различную токсичность, которая усиливалась по мере увеличения СП О-по-лисахарида (табл. 11). Максимальной токсичностью обладал ЛПС-1, имеющий самую длинную углеводную цепь (СП=16). Следовательно, длина цепи О-ПС играет важную роль в проявлении ЛПС токсических свойств.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что низкая температура и рост У. pseudotuberculosis на плотных агаризованных средах, условия, при которых клетки быстрее достигают максимального патогенного потенциала и дольше его сохраняют, являются селективными факторами, усиливающими патогенность этих бактерий. Способность колониальных культур, растущих на холоду, синтезировать ЛПС с длинной О-специфиче-ской цепью, высокой СА остатков 30H14:0 и высокой токсичностью делает клетку более устойчивой к действию защитных факторов макроорганизма и, следовательно, более вирулентной.

Таким образом, липиды У. pseudotuberculosis представляют собой динамичную систему, способную изменять свой состав и свойства под влиянием различных факторов среды. Особый интерес вызывает структурная модификация ЛПС и его липидного фрагмента, поскольку именно они участвуют в развитии процессов, приводящих к эндотоксическому шоку. Анализ литературы показывает, что природные штаммы ГОБ синтезируют нетоксичные формы ЛА, способные ингибировать эндотоксические реакции патогенных микроорганизмов, т.е. выступать в роли антагонистов эндотоксинов, поиск которых в последнее время значительно активизировался. Перспективным источником аитагонистов эндотоксинов на основе ЛА необычной структуры могли бы быть морские бактерии, которые стали объектом представленных ниже исследований.

3.4 Липиды А морских грамотрицательных бактерий

3.4.1 Общая характеристика пипидов А морских ГОБ

Первичная характеристика ЛА разнообразных морских бактерий (17 видов, принадлежащим трем семействам и одном роду), типичных обитателей морской среды, проводилась с помощью ТСХ (рис. 10), которая выявила существенные различия между ними.

В зависимости от хроматографического поведения и степени гетерогенности изучаемые ЛА условно можно разделить на четыре группы. Максимальную хроматографическую подвижность проявляют ЛА бактерий рода Chryseobacteríum (рис 10, линия 2). Вторая группа включает ЛА бактерий рода Marinomonas (М. communis и М. vaga, рис. 10, линии 4,5), которые также имеют высокую подвижность. ЛА бактерий родов Alteromonas, Idiomarina и Pseudoalteromonas с низкой хроматографической подвижностью (рис. 10, линии 7-15) образуют третью группу. В отличие от относительно гомогенных ЛА трех вышеперечисленных групп бактерий, ЛА четвертой группы (в ее состав входят ЛА Marinomonas mediterránea, Shewanella algae и Vibrio fluvialis), проявляют высокую степень гетерогенности (рис. 10, линии 3, 1, 16).

-Rf= 0,65

- R,= 0,37

Рис. 10 TCX липидов А морских грамотрицательных бактерий, где 1 — S. algae, 2 — С. indoltheticum, 3 — М. mediterránea, 4 — М. communis, 5 — М. vaga, 6— Y. pseudotuberculosis, 7 — A. macleodii, 8- P. nigrifaciens, 9 —P. tetraodonis, 10 - P. atlantica, 11 - I. zobellii, 12 - P. espejiana, 13 - Я haloplanktis, 14 - P. elyakovii, 15 — P. undina, 16 — V. fluvialis.

Как было сказано выше, морские бактерии, из которых были выделены изучаемые ЛА, принадлежат трем семействам (Alteromonadaceae, Flavobacteriaceae и Vibrionaceae) и одному роду (Marinomonas), что соответствует количеству (четыре) наблюдаемых ТСХ-профилей. По-видимому, существует корреляция между таксономическим положением бактерий и поведением выделенных из них ЛА в условиях ТСХ. С другой стороны, многообразие. ТСХ-профилей ЛА морских бактерий предполагает разнообразие соответствующих им химических структур, что делает перспективным их дальнейшее более детальное исследование.

«Морские» ЛА содержат GlcN, фосфатные группы и ЖК (табл. 12). Состав ЖК зависит от видовой принадлежности микроорганизмов. ЛА бактерий рода Marinomonas оказались гомогенными по составу 3-гидроксиалкановых кислот. ЛА бактерий рода Chryseobacterium содержали два вида кислот этого типа. Другие ЛА имели более сложные профили 3-гидроксиалкановых кислот. Особенно сложный состав жирных кислот (до шести ЖК этого типа) был обнаружен в ЛА бактерий рода Pseudoalteromonas.

Таблица 12.

Химический состав ЛА некоторых морских протеобактерий

Компонент Содержание (мкмоль)

сл. C.s. I.Z. М.с. Aim. Мм. P.h. Р. п. S.a. v-f-

Р 0,7 0,7 1,2 1,0 1,2 1,9 1,9 1,1 1,0 1,9

GlcN 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

ЕЖК 1.6 1,4 5,1 4,8 4,8 4,8 4,9 5,0 6,1 6,1

Кислота С12:0 была основной и единственной нормальной кислотой в большинстве изучаемых образцов. ЛА бактерий рода Chryseobacterium и ЛА М. mediterránea не содержали нормальных ЖК. Гидролизаты ЛА морских бактерий практически не содержали транс-£(2)-ненасыщенные ЖК, что является косвенным доказательством отсутствия ацилоксиалкановых кислот со сложноэфирным типом связи в составе молекул «морских» ЛА.

— — — - — -

«N» Zü T ZZ — mm mmm. II |i и 1 II Г III II 1 11 1 ■V

-mm

i 2 3 4 5 Б 7 В 9* 10 11 Í2 13 14 15 16

3.4.2 Липиды А бактерий рода Рзеис1оа11еготопаз 1АМ 14160Т

В настоящем исследовании представлены данные структурного изучения ЛА трех видов бактерий рода РзеибоаНеготопаз: Р. Ьа1ор1ап№з 1АМ 127915т, Р. л/дп/ас/еля 1АМ 13010ти Р. ¿е^аос/ол/г 1АМ 14160х.

Как следует из данных, представленных в табл. 12, ЛА Р. Ьа1ор1апкИз содержит два остатка С1с1М, две фосфатные группы и пять остатков ЖК. Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса карбонильных атомов С (табл. 13а) подтвердил наличие пяти остатков ЖК. Четыре сигнала в области резонанса атомов С2 3-гидроксиалкановых кислот (41 — 44 м.д.) указывают на присутствие в молекуле ЛА четырех остатков упомянутых кислот. Три из них имеют свободные гидроксильные группы (в спектре присутствует по три сигнала в области резонанса атомов СЗ (- 68 м.д.) и С4 (- 37 м.д.) З-гидрокси-апкановых кислот).

Таблица 13.

Данные спектров ЯМР "С и 1Н липида А Р. ШорШМт

ЖК Химический сдвиг атома "С (5, м.д.)

Неразветвленные кислоты Изо-кислоты

С1 С2 СЗ С4 СЗ, С5 С-ы4 | -СНз

43,8 58,7 37,6

-о-з-он 175,2 42,6 38,4 37,4 25,2

174,3 42,1 В8,3 37,3 24,9 39,3 21,8

-1М-3-ОАС 173,8 41,1 71,1 34,7* 24,7

173,1 172,9 24,7 24,4 14,2

нормальная

34,3* -

* - Отнесение сигналов может быть взаимозаменямым. 6).

Химический сдвиг атома "С (6, м.д.)

Глюкозамин С1 С2 СЗ С4 С5 С6

В-0-в1срМр(1-> 100,8 54,0 72,4 73,8 75,1 30,6

а-0-61срМ-(1->Р 94,9 51,9 73,3 38,0 71,2 58,1

в).

Химический сдвиг атома 'Н (5, м.д.)

Н1 5,55 НГ 4,75

Н2 4,18 Н2' 3,85

НЗ 5,17 НЗ' 5,23

Н4 3,57 Н4' 4,05

Сигналы атомов СЗ и С4 четвертого остатка 3-гидроксикислоты смещены в слабое и сильное поля (71 и 34 м.д. соответственно), что доказывает присутствие ацильного заместителя в этом остатке кислоты. Ацилоксикисло-та имеет амидный тип связи, о чем свидетельствует величина ХС сигнала (41 м.д.) одного из атомов С2 3-гидроксиалкановых кислот.

В спектрах ЯМР ЛА Р. Ла/ор/ал/йю в области резонанса аномерных атомов С (табл. 136) и Н (табл. 13в) ФсМ присутствует по два сигнала, ве-

личины ХС которых свидетельствуют об а- (94,9 и 5,5 м.д., Jm, нг = 3,0 Гц) и ß- (100,8 и 4,7 м.д.; Jhv.h? =7,9 Гц) конфигурациях остатков GIcNI и GIcNII соответственно. Сдвиг сигнала атома С1 в слабое поле, мультиплетность сигналов атомов C1 (Jci.p = 4,6 Гц), С2 (Jczp = 8,4 Гц) и H1 (Jm.p = 6,5 Гц) указывают на присутствие фосфатной группы при атоме С1.

Положение второго остатка фосфорной кислоты определяли, анализируя область резонанса кольцевых атомов СЗ — С5 GIcN в спектре ЯМР 13С (табл. 136). Расщепление сигналов при 72,4 (Jc3\P = 4,6 Гц), и 75,1 м.д. (Jcs.p = 2,3 Гц), которые были отнесены к атомам СЗ' и С5, указывает на присутствие остатка фосфорной кислоты в положении С4' (73,8 м.д.). Более узкие сигналы при 73,3, 71,2 и 68,0 м.д. принадлежат атомам СЗ, С5 и С4 GIcNI, который имеет гидроксильную группу при атоме С4. Величина ХС метино-вого протона Н4 (3,57 м.д., табл. 13в) также указывает на отсутствие заместителя в этом положении.

Значения ХС атомов Н2, Н2', НЗ, НЗ' и Н4' показывают, что обе аминогруппы, а также гидроксильные группы при атомах СЗ, СЗ' и С4' глюкозами-нобиозы имеют замещение. Анализ области резонанса атомов С2 GIcN (52-58 м.д., табп. 136) спектра ЯМР 13С подтверждает выводы о замещении гидроксильных групп при атомах С2 и СЗ обоих остатков GIcN. Область резонанса атомов С6 GIcN со свободной гидроксильной группой представлена одним сигналом (60,6 м.д.). Сигнал второго атома Сб., согласно данным DEPT-135 экспериментов, смещен в область 68,2 м.д., что демонстрирует наличие р-1,6-связи в ЛА Р. haloplanktis.

Расположение ЖК в дисахаридной молекуле определяли с помощью масс-спектрометрии (рис. 11), используя образец ЛА, полученный обработкой 0,1 М HCl для удаления гликозидносвязанного фосфата.

Рис. 11 (слева). (-) FAB масс-спектр монофосфорилированного производного липида А P. haloplanktis ATCC 143991".

Рис. 12 (справа). Структуры липидов А (а) P. haloplanktis, (б) P. nigrifaciens и (в) P. tetraodonis, где

(а) R = З-ОН-ПД 3-ОН-12Д 3-ОН-13:0, 3-OH-iso-11:0, 3-OH-/so-12:0,

(б) R = 3-ОН-10:0, 3-ОН-11:0, 3-ОН-12:0, 3-ОН-13:0, 3-ОН-14:0, 3-OH-/so-12:0,

(в) R = 3-014-10:0, З-ОН-11:0, 3-ОН-12:0, 3-ОН-13 0, 3-OH-/so-11:Q, 3-OH-/so-12:Q.

В (-) FAB масс-спектре полученного препарата присутствуют пики фрагмент-ионов (m/z 626, 640, 654, 668), которые состоят из одного остатка GlcN, одного остатка фосфорной кислоты и двух остатков 3-гидроксиалкано-вых кислот. Поскольку все четыре иона имеют в своем составе фосфатную группу, был сделан вывод, что они принадлежат GlcNI, который, таким образом, содержит два из пяти присутствующих в J1A остатков ЖК. Три других ацильных заместителя локализуются на восстанавливающем конце ЛА.

Мягкая щелочная обработка с последующим более жестким щелочным гидролизом полученного частично дезацилированного препарата позволила установить, что аминогруппы ЛА ацилированы остатками 3-ОН-С12:0 и 3-до-деканоилоксидодекановой кислот, остальные ЖК имеют сложноэфирный тип связи.

С учетом этой информации был предложен вариант структуры ЛА Р. haloplanktis, изображенный на рис. 12а. Согласно данным общего химического анализа (табл. 12), спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии липиды А P. nigrifaciens и P. tetraodonis имеют аналогичные структуры, но отличаются набором ЖК (рис. 126 и 12в соответственно).

3.4.3 Липид А бактерии Idiomarina zobellii КММ 231Т

ЛА I. zobellii содержит два остатка GlcN, один остаток фосфорной кислоты и пять остатков ЖК (табл. 12). В (-) MALDI-TOF масс-спектре этого ЛА (рис. 13) присутствуют серии пиков, соответствующие его пента-, тетра-и триацильным формам.

[M(lxClcN + 1х3-0н-13:0 + 1*Л-01 I 31:11

[MCSxdcN ~ 2x3-ОН-13:0 + 2x3-OH-U:D + 1x10 :0 1хН,РО.) - II] - 3-ОЫ-11;0

Рис. 13. (-) MALDI-TOF масс-спектр липида АI. zobellii

Частично дезацилированные производные образуются в результате последовательной потери двух остатков 3-ОН-С11:0 кислот, что свидетельствует о сложноэфирном типе связи этой кислоты. Остатки более длинной 3-гидрокси-изо-тридекановой кислоты, по-видимому, ацилируют аминогруппы глюкозаминобиозы. Присутствие в спектре иона с m/z 654,1 позволяет сделать заключение, что фосфорилированный остаток GlcN несет два остатка ЖК, 3-ОН-С11:0 и 3-ОН-С13:0, нефосфорилированный -три.

3.4.4 Липид А бактерии Shewanella algae 48055

ЛА бактерии S. algae состоит из двух остатков GlcN, одного остатка фосфорной кислоты и шести остатков ЖК (табл. 12) и, таким образом, в отличие от ранее изученных «морских» ЛА имеет гексаацильный тип структуры. Он характеризуется высокой степенью гетерогенности как по составу 3-гидроксиалкановых ЖК, так и по разнообразию молекулярных форм (рис. 14). Анализ (-) ESIMS спектра ЛА S. algae подтверждает его дисахаридную природу, наличие одной фосфатной группы и гексаацильный тип структуры (рис. 14).

|M(2xí ¡IcN -t- 4x3-Ol 1-1 3.U + 1x12:0

IDO ; 90

6050 40 30 20

i 619.6 §<Í7.5 ' -"Ц*--"-T

1033.9

JSLÜiu

M11CZ

600 SÖO 1000 1200 14Ö0 1600 1800

m/z

Рис. 14. (-) ESI масс-спектр липида A S. algae.

В масс-спектре присутствуют также ионы пента- и тетраацильных форм ЛА. Они образуются в результате потери остатков С13:0 и 3-ОН-С13:0 кислот, которые, по-видимому, являются вторичными ЖК, ацилирующими сложноэфирносвязанные 3-гидроксиалкановые кислоты.

3.4.5 Липиды А бактерий рода Marinomonas

В рамках данной работы было предпринято изучение ЛА трех видов бактерий рода Marinomonas: М. communis АТСС 27118Т (ЛА М.с.), М. mediterránea АТСС 700492т (ЛА М.т.) и М. vaga АТСС 27119Т (ЛА M.v.).

Общий химический анализ (табл. 12) изучаемых соединений показал, что каждое из них содержит два остатка GlcN, пять остатков ЖК и одну (ЛА М.с. и ЛА M.v.) или две (ЛА М.т.) фосфатных группы.

3.4.5.1 Липиды А бактерий М. communis и М. vaga

Спектры ЯМР 31Р ЛА М.с. и M.v. содержат по одному сигналу, значения ХС которых (-0,36 и -2,0 м.д. соответственно) предполагают, что фосфатные группы являются монофосфатами и находятся при атоме С1 глюкозамино-биозы. Дублетные сигналы атомов Н1,С1иС2 в спектрах ЯМР 1Н и 13С

Таблица 14.

Данные спектров ЯМР 1Н и 13С липидов А М. communis и М. vaga

Положение 6С 6Н (J, Гц)

М.с. M.v. М.с. M.v.

1 2 94.5 52.6 95,3 51,9 5,42 дд (3,3; 7,0) 4,16 м 5,42 дд (3,6; 6,2) 4,14

3 4 5 74,8 69,8 73,8 74,6 68,8 73,5 5,20 дд (9,2; 10,7) 3,43 т (10,4; 9,2) 4,16 м 5,22 дд (9,5; 10,5) 3,61 т (9,4) 4,09

6а 6э 69,4 68,9 3.88 дд Í6.7: 11.9) 4,05 м 3.89 4,06

GlcNII

Г 2' 3' 4' 5' 102,5 56,6 75.4 71.5 77,0 101,3 56,6 74,8 71,2 76,5 4.65 д (8,5) 3.66 дд (8,5; 10,4) 3,48 дд (8,6; 10,4) 3,38 дд (8,6; 10,4) 3,31 ддд 10,0; 4,9; 2,4) 4,71 д (7,8) 3,62 3,56 3,38 3,36

6 а 6'э 69,5 61,9 3,75 дд (6,7; 11,9) 3,88 дд (2,4; 11,8) 3,89 3,73

жк

CONH 172,2 171,3

2 (а-21 42,5 41,6 2.50 м 2,51

3(р-2) 71,8 71,4 5,19 м 5,16

4 (у-2) 5 (6-2) 34,9 26,1 34,5 26,1 1,ССм 1,29 м 1,56 1,29

СОО 174,6

2 (о -2) 35,0 34,2 2,30 м 2,28

3 (Р'-2) 25,8 25,6 1,62 м 1,62

4 (у -2) 30,0 29,8 1,38 м 1,30

СОО 173,1 172,9

2 (а-3) 43,1 42,7* 2,46 м 2,52

3(р-3) 69,5 68,8* 4,05 м 4,04

4 (Y-3) 37,9 37,5* 1,51 м 1,50

CONH 173,3 172,7

2'-(а-2) 41,7 41,1 2,62 м 2,65

ЗЧР-2) 72,4 72,2 5,28 м 5,29

4'-(у-2) 34,9 34,5 1,57 м 1,69

5'-(5-2) 27,9 27,9 1,29 м 1,29

СОО 173,1 173,0

2'-(а'-2) 43,1 42,5* 2,46 м 2,52

3'-(Р'-2) 69,5 68,8* 4,05 м 4,04

4 -(V "2) 37,9 37,8* 1,51 м 1,50

ы 14,2 14,1 0,89 т 0,89

UJ-1 23,4 22,7 1,33 м 1,31

ш-2 32,5 32,0 1,29 м 1,27

* - Отнесения этих сигналов могут быть взаимообратимыми.

(табл. 14) также указывают на присутствие гликозидносвязанного фосфата.

Восстанавливающий и невосстанавливающий концы глюкозаминобиозы имеют а- и 3-пиранозидные конфигурации, о чем свидетельствуют величины ХС аномерных атомов Н и С ЛА М.с. и M.v. Поскольку спектры ЯМР 1Н и 13С ЛА М.с. и M.v. оказались очень похожи (табл. 14), дальнейшее их описание проводилось на примере ЛА М.с.

Величины ХС сигналов протонов Н2 и Н2' (4,16 и 3,66 м.д. соответственно) указывают на присутствие в ЛА двух ациламиногрупп. В ^-"С HSQC спектре эти сигналь! коррелируют с сигналами атомов С2 GlcN, положение которых (52,6 м.д. и 56,6 м.д. соответственно) подтверждает наличие связей углерод - азот, а также позволяет сделать заключение, что гидрок-сильная группа при атоме СЗ восстанавливающего конца ЛА М.с. имеет заместитель, в то время как гидроксильная группа при атоме СЗ' GlcNII не замещена Положение сигналов атомов НЗ и НЗ' хорошо согласуется с таким предположением.

Сигналы метиновых Н4, НЗ', и Н4' и двух метиленовых протонов Н6' находятся в области 3-4 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при атомах С4, СЗ', С4' и С6'. Корреляция протонов Нба и Нбэ с атомом С6' указывает на 1',6-гликозидную связь между остатками GlcN.

ЛА М.с. и M.v. содержат по пять остатков ЖК (табл. 12). Три (один -двойной интенсивности) а-СН2-мультиплета в спектре 1Н-13С HSQC указывают на присутствие четырех остатков 3-гидроксиалкановых кислот. Два из них не имеют замещения (им соответствует сигнал атома Н2 двойной интенсивности при 4,05 м.д., образующий COSY кросс-пики с мультиплетами протонов а-СНг-звена при 2,43-м:д. и сигналами протонов у-СНг-звена при 1,51 м.д. Сигналы при 5,19 и 5,28 м.д., перекрестно взаимодействующие с мультиплетами протонов а-СН2-звена (2,50 и 2,62 м.д.) и сигналами протонов у-СНг-звена (1,60 и 1,57 м.д.), принадлежат протонам 3-СН-звеньев от двух остатков 3-ацилоксидекановой кислоты. Обе ацилоксиалкановые кислоты имеют амидный тип связи.

Более точно положение остатков ЖК было определено с помощью МС (рис. 15). В (-) FAB масс-спектрах обоих ЛА присутствуют фрагмент-ионы,

(б)

[М„- щ-

[М, - Н]-

,485.41 090i,4J 502.43

1253 9

1231.9

751.74

779.55 .911.349298

1081.9

1093.81 1111 85

1065 4 и i 1099.99 ¿м^л uH

[Мц+Na]* 13060g 1278.06

11. <M0

?o0 900 moo m,z 1300 joo 600 ' i vki wiz

Рис. 15. FAB масс-спектры отрицательных (а) и положительных (6) ионов липи-да А М. communis.

которые соответствуют монофосфорилированным производным GlcNI, аци-

лированным одним (фрагмент-ионы с m/z 428,3 и 410,9) или двумя (фрагмент-ионы o m/z 598,4 и 580,7) остатками 3-ОН-С10:0 кислоты и одним остатком негидрокси кислоты (С10:0 или С12:0; фрагмент-ионы с m/z 751,7, 752,5). Следовательно, три из пяти присутствующих в ЛА ЖК находятся на восстанавливающем конце молекулы. Одна из них (3-ОН-С10:0) имеет амидный тип связи, две других (С12:0 (С10:0) и 3-ОН-С10:0) - сложноэфир-ный.

В (+) FAB масс-спектрах ЛА М.с. (рис. 156) и M.v. присутствуют важные для их структурной оценки диагностические пики ионов с m/z 520,56 (ЛА M.v.) и 502,43 и 502,59 (для ЛА М.с. и M.v. соответственно). Они состоят из одного остатка GlcN и двух остатков 3-ОН-С10:0 кислоты и являются оксони-евыми ионами, получающимися из невосстанавливающего конца дисаха-ридной молекулы (GlcN II) в результате разрыва гликозидной связи. Оба остатка 3-ОН-С10:0 кислоты находятся при атоме С2', поскольку, как следует из данных спектроскопии ЯМР (табл. 14), гидроксильные группы при атомах СЗ', С4' и С6' GlcN II являются свободными. Присутствие в (+) FAB масс-спектре ЛА М. vaga пиков с m/z 332,41 и 314,41, которые получаются из фрагмент-ионов с m/z 520,56 и 502,59 в результате потери остатка 3-ОН-¿10:0 кислоты, показывает, что этот остаток кислоты имеет сложноэфирный тип связи и ацилирует гидроксильную группу амидносвязанной 3-ОН-С10:0 кислоты.

Исходя из совокупности полученных данных, предлагается следующий вариант структуры для ЛА М. communis и М. vaga (рис. 16а и 166 соответственно). ......*'

Рис. 16. Структуры липидов А

(а) М. communis (R = С10:0 или С12:0 кислоты)

(б) М. vaga (R = С10:0, С12:0 или С12:1 кислоты)

(в) М. mediterránea (R = 3-ОН-С10:0 кислота; при атоме С4' этого ЛА находится остаток фосфорной кислоты).

3.4.5.2 Л ипид А бактерии М. mediterránea АТСС 700492т

ЛА М.т. состоит из двух остатков GlcN, двух остатков фосфорной кислоты и пяти остатков (R)-3-OH-C10:0 кислоты (табл. 12). MALDI-TOF и FAB масс-спектры отрицательных ионов этого ЛА (рис. 17) содержат пик молекулярного иона (m/z 1350), состав которого хорошо согласуется сданными химического анализа. Ионы низкой интенсивности с m/z 1546 и 1530 указывают на присутствие в анализируемом образце некоторого количества гексаа-цильных молекул.

И

Рис. 17. (-) MALDI-TOF (а) и (-) FAB (б) масс-спектры липида А М. mediterránea.

Величины ХС атомов С1 (95,0 м.д.) и СГ (101,3 м.д.) в спектре ЯМР "С (рис. 18а) предполагают, что GIcNI и GIcNII ЛА М.т. имеют а- и р-конфигура-ции соответственно. Присутствие в области резонанса атомов С6 одного сигнала (62 м.д.) свидетельствует о том, что атом С6' участвует в образовании (3-(1',6)-связи между остатками GIcN. ХС сигналов атомов С2 (51,8 м.д.) и С2' (53,9 м.д.) указывают на присутствие в данном ЛА двух ациламино-групп, а также позволяет сделать заключение, что гидроксильная группа при атоме СЗ восстанавливающего конца ЛА М.т. ацилирована остатком ЖК, в то время как гидроксильная группа при атоме СЗ' GIcNII не имеет заместителя.

(б)

Рис. 18. Спектры ЯМР ,3С (а) и 3,Р (б) липида А М. mediterránea

В спектре ЯМР 31Р ЛА М.т. (рис. 186) присутствуют два сигнала, что предполагает наличие двух фосфатных групп в составе его молекул. Одна из фосфатных групп находится при атоме С1 молекулы ЛА (в спектре ЯМР 31Р присутствует сигнал с величиной ХС - 1,60 м.д.), другая, предположительно, фосфорилирует атом С4'дисахаридной молекулы.

Анализ спектра ЯМР 13С в области резонанса атомов С2 3-гидроксиал-кановых кислот (рис. 18а) подтвердил наличие пяти остатков ЖК такого типа. Три из них имеют сложнозфирный тип связи (в спектре присутствуют три сигнала при 41,6, 41,9 и 42,0 м.д.), два других - амидный (сигнал двой-

ной интенсивности при 40,5 м.д. для атомов С2 3-гидроксикислот с амидным типом связи). Отсутствие в спектре ЛА сигнала с величиной ХС 44 м.д. позволяет сделать вывод о том, что обе амидносвязанные ЖК имеют замещение по гидроксильной группе. Гидроксильная группа ЖК со сложноэфирным типом связи не замещена (в спектре нет сигнала с величиной ХС 38 м.д.).

На основании полученных данных для ЛА М. mediterránea предлагается структура, изображенная на рис. 16в, которая отличается от структуры ЛА двух других бактерий рода Marinomonas наличием двух (а не одной, как у других ЛА) фосфатных групп и отсутствием нормальных ЖК. Следует отметить одну особенность, общую для всех изученных ЛА бактерий рода Marinomonas: присутствие в составе их молекул необычной амидносвязан-ной ацилоксиалкановой кислоты, состоящей из двух остатков 3-ОН-С10:0 кислоты, которая ранее в составе ЛА не встречалась.

3.4.6 Липиды А бактерий рода Chryseobacterium

Объектами исследований в этой части работы стали ЛА типовых штаммов С. indoltheticum CIP 103168т (ЛА C.i.) и С. scophthalmum CIP 104199т (ЛА C.s.)

Попытки выделить ЛА из бактерий C.i. и C.s стандартным для этого класса соединений подходом, в основе которого лежит гидролиз ЛПС, изолированных из клеток фенол-содержащими системами различной степени гидрофобности, разбавленной АсОН, оказались неудачными. Обработка клеток 10%-ной АсОН (100 °С) с последующей экстракцией смесью хлороформ-метанол была более эффективной и привела к выделению препаратов (выходы 0,65 и 0,60% для C.i. и C.s. соответственно), содержащих фосфор, D-GlcN и ЖК ((К)-3-ОН-изо-15:0 и (Я)-3-ОН-изо-17:0, табл. 12), что указывает на принадлежность полученных соединений к ЛА.

В (-) FAB масс-спектрах ЛА C.i. и C.s. (рис. 19а и 196 соответственно) присутствуют пики молекулярных ионов с т/г 766,3 и 766,2, содержащих по одному остатку GlcN, по одной фосфатной группе, а также 3-ОН-изо-С15:0 и 3-ОН-(/зо-С17:0 кислоты.

(а)'

^ttfmu.......it

(6)4

[М(GlcN ♦ 3-OIU*»-l5Q • H)ll «w-]7 0 Hl.íPCM H]"

NU1

{М-НГ-ЮН-кл-ИО

z «Н

! )-ОНл«И5 0

1 | JWJ

liÉLIi 1

«м ко

«ошяотеочотят

Рис. 19. FAB масс-спектры отрицательных ионов липидов А (а) С. indoltheticum и (б)

С. scophthalmum.

Молекулярная масса 767,4948 Да, рассчитанная для формулы СзвЬ^О-ггЫР, хорошо согласуется с данными ЯАВМЭ. САО-Эксперименты с пиком молекулярного иона ЛА С./., а также результаты обработки ЛА 0,12%-ным МНЦОН указывают на сложноэфирный тип связи 3-ОН-изо-С15:0 кислоты. 3-ОН-шо-С17:0 кислота имеет амидный тип связи.

Более детальная структурная характеристика ЛА С./, и С.я. была получена с помощью спектроскопии ЯМР (табл. 15), описание данных которой проводится на примере ЛА С./.

Таблица 15.

Данные спектров ЯМР 1Н, 13С, и 31Р" липидов А С. ¡пдоМеисит и С. зсорМЬа1тит.

Поло- бН[(мульт.), ^ (Гц)] 5С [(мул ьт.), 7 (Гц)]

жение аси

С. /. С. э. С. /. С. 5.

1 5,58 [уш.сигнал] 5,48 [уш.с.] 95,3 [дд, 6,7] 94,0 [дд, 4,8]

2 4,23 [дд, 5,3, 10,0] 4,11 [дд] 52,3 [дд, 7,6] 51,6 [дд, 7,68]

3 5,19 [т, 10,0] 5,08 [т] 74,1 [д] 73,2

4 3,60 [вд, 10,0, 8,7] 3,45 [од] 68,8 [д] 68,5

5 4,00 [м] 3,83 [м] 73,7 [д] 73,1

6а 3,93 [м] 3,66 [м] 62,0 [т] 61,4.

6э 3,70 [дд, 11,0, 5,2] 3,75 [дд]

ЖК

соын 173,7 [с] 173,1

а-2а 2,33 [м] 2,14 [м] 44,0 [т] 43,4

а-2Ь 2,25 [дд, 9,7, 13,8] 2,23 [дд]

(3-2 3,93 [м] 3,83 [м] 69,3 [д] 68,1

р-2 1,45 [м] 1,37 [м] 37,9 [т] 37,2

СОО 173,4 [с] 172,7

а-За 2,51 [ОД, 3,7, 15,5] 2,41 [дд] 42,7 [д] 42,0

а-ЗЬ 2,45 [дд, 9,0, 15,5] 2,33 [цд]

Р-з 3,99 [м] 3,89 [м] 68,8 [д] 68,3

р-з 1,48 [м] 1,38 [м] 37,5 [т] 36,8

(СН2)„ 1,25 [м] 1,15 [м] 30,4 [т] 29,4

ш-2 1,15 [м] 1,05 [м] 39,5 [т] 38,9

ш-1 1,52 [м] 1,43 [м] 28,7 [ц] 28,1

ш 0,87 [д, 6,81 0,78 [д] 22,3 22,3

* - Спектры ЯМР 31Р: 6Р -0,83 и -0,61 м.д. для ЛА С. МЫШеИсит и С. $сорЫЬа1тит соответственно.

В спектре ЯМР 13С этого ЛА в области резонанса атомов С С1сЫ присутствуют шесть сигналов, что подтверждает его моносахаридную природу. Сдвиг в слабое поле сигналов протонов Н1 (5,58 м.д.), Н2 (4,23 м.д.) и НЗ (5,20 м.д.) указывает на ацилирование гидроксильных и аминогрупп при атомах С1, СЗ и С2. Сигналы остальных протонов С1сЫ (Н4, Н5, Нба и Нбэ) на-

ходятся в области 3,60-3,90 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при соответствующих гидроксильных группах.

Корреляция сигналов атомов НЗ, Н4, Н5 с индивидуальными углеродными резонансами при 74,1, 68,8, 73,7 м.д. и сигналов атомов Нба и Нбэ с сигналом атома С6 при 62,0 м.д. подтверждает отсутствие заместителей в положениях С4 и Сб. Сдвиг сигналов атомов С2 и СЗ в сильное и слабое поля соответственно демонстрирует наличие ацильного заместителя при атоме СЗ. Малая (Лст.сг = 5,3 Гц) и большие (Лег,сз, Лсз.м и Jc4.cs = 8,7-10,0 Гц) величины констант расщепления указывают на то, что остатки С1сЫ имеют а-аномерную конфигурацию с аксиальными протонами Н2-Н5. Положение сигналов атомов С1 (95,3 м.д.) и С2 (52,3 м.д.) подтверждает а-конфигура-цию остатка ФсМ.В спектре ЯМР 1Н-13С НБОС протон Н2 коррелирует со сдвинутым в сильное поле сигналом при 52,3 м.д., что указывает на наличие связи углерод-азот при атоме С2. Сдвиг сигналов атомов С1 и Н1, а также расщепление сигналов атомов С1 (.Уа.р = 5,5 Гц), С2 (./сг.р = 8,2 Гц) и Н1 (./ж, р = 6,7 Гц) указывают на присутствие фосфатной группы при атома С1 С1с1М. Действительно, спектры ЯМР 31Р изученных ЛА содержат по одному сигналу с величинами ХС -0,83 и -0,61 м.д., что однозначно свидетельствует о присутствии гликозидносвязанных фосфатных групп в составе их молекул.

Два сигнала в области резонанса атомов С карбонильных групп (около 174 м.д.) и кросс-пики протонов а-СНг-звена (2,45 и 2,51 м.д.; 2,25 и 2,33 м.д.), р-СН-звена (3,93 и 3,99 м.д.) и у-СНг-звена (1,45 и 1,48 м.д.) с сигналами атомов С при 44,0, 42,7, 69,3, 68,8,37,9 и 37,5 м.д. указывают на присутствие в ЛА 3-гидроксиалкановых кислот со сложноэфирным и амидным типом связи. Сигналы при 23,0 и 39,5 м.д. для терминальных СНз- и (ш-1)-СН-групп позволяют отнести их к ЖК изо-серии.

На основании полученных данных для ЛА С. ¡пс1о101еИсит. и С. всорМ11а1тит предлагается следующая структура (рис. 20).

(а)

Рис. 20. Структуры (а) липидов А С. indoltheticum и С. scophthalmum и (б) липида X Е. coli К-12.

3.5 Некоторые особенности состава наружной мембраны бактерий рода Chryseobacterium

Как видно на рис. 20, ЛА С./, и C.s. структурно подобны биосинтетическому предшественнику ЛА, так называемому ЛХ. ЛХ накапливается в му-тантных штаммах бактерий Е. coli, у которых синтез ЛА блокируется на ста-

дии моносахаридного предшественника. Присутствие ЛХ в клетках коррелирует с дефицитом ФГ, анионного ФЛ, который является обязательным для нормального функционирования ГОБ. Можно предположить, что бактерии рода ОигузеоЬасАепит, синтезирующие ЛХ-подобный ЛА, также не имеют ФГ в составе своих клеточных мембран. Чтобы убедиться в этом, был изучен липидный состав этих бактерий.

3.5.1 Характеристика липидного состава бактерий С. ¡псМИпейсит и

С. зсорМЬа1тит

Общее содержание свободных липидов в клетках изучаемых бактерий оказалось довольно высоким (10,5 и 10,1% на сухую массу для С./, и С.в. соответственно). Значительную часть из них (7 и 5%) составляли полярные липиды. Изучение фракции полярных липидов С./', с помощью метода (-) ЕБ-1МЭ (рис. 21) показало наличие шести компонентов. В (-) Б^МБ/МБ спектрах двух из них (пики с т/г 688,46 и 714,48) присутствуют фрагмент-ионы с т/г 140 и 196, состав которых ([НРО^НгСНгМНг]) и ([СНгСрьОСНгРОдСНгО-ЫЧ-Н2] соответственно) позволяет считать их производными ФЭ.

/ I

Сул*»фс£>ацин Б

Сульфсбацин Д /

ш,л*% ФЭ-1

Сульфс€ацин А* \

JJJJ_.

и/-а ыш мм ш! ах

Л.1

л/a

ФЭ-И

\—ii i. л.... L,

Рис. 21. ESI масс-спектр отрицательных ионов фракции полярных липидов С. indoltheticum.

Три других компонента (ионы с т/г 618,45, 604,45 и 574,43) в условиях (-) ESIMS/MS образуют фрагмент-ионы с т/г 79, 333 и 350. Эти ионы являются диагностическими для редких, необычных в структурном отношении липидов, содержащих N-ацилсфингозин, замещенный остатком серной кислоты, и получивших название сульфобацинов А и Б. Ионы с т/г 604,7 и 618,7 были отнесены к двум молекулярным формам сульфобацина А (для них характерен распад с образованием фрагмент-ионов с т/г 350 (максимальная интенсивность), 392 и 333), имеющих в своем составе остатки 3-ОН-С17:0 и 3-ОН-С16:0 кислот. Общий вид ESIMS/MS спектра иона с т/г 574,7 и характер фрагментации доказывает принадлежность этого иона сульфобацину Б, аминогруппа которого ацилирована остатком С15:0 кислоты. Ионы, соответствующие ФГ и ДФГ, в спектрах фракции полярных липи-

дов C.i. и C.s. обнаружены не были.

Таким образом, в отсутствие ФГ в клетках как мутантных (Е. coli), так и диких (C.i. и C.s.) бактерий синтезируется ЛХ-подобный ЛА. Однако, если для Е. coli отсутствие ФГ есть результат направленной мутации, то отсутствие ФГ в клетках C.i. и C.s. является особенностью липидного состава этих микроорганизмов и, возможно, бактерий рода Chryseobacterium в целом (близкородственная С. defiuvii sp. также не содержит ФГ). Есть еще одна особенность, которая отличает бактерии рода Chryseobacterium от мутантных клеток Е. coli: первые, несмотря на отсутствие ФГ и ЛА (в его каноническом структурном варианте), сохраняют жизнеспособность, в то время как мутантные Е. coli растут только при непермиссивных температурах.

3.5.2 Наружная мембрана бактерий рода Chryseobacterium не содержит ЛПСМ

Необычная моносахаридная структура ЛА C.i. и C.s. в сочетании с не совсем обычным способом их выделения ставит вопрос о наличии Л ПС в клетках бактерий рода Chryseobacterium. Надежным способом обнаружения ЛПС в составе ГОБ является электрофорез в полиакриламидном геле. На первый взгляд данные ДСН-ПААГ-электрофореза указывают на присутствие в клетках бактерий рода Chryseobacterium ЛПС R-формы: электрофореграм-мы лизатов исходных и обезжиренных клеток C.i. содержат одиночные полосы слабой интенсивности, совпадающие по подвижности с полосой R-ЛПС Е. coli (рис. 22а, линии 2,3 и 9).

Рис. 22. Электрофореграмма лизатов клеток, ЛПС и КПС С. indoitheticum:

(а) 1 - лизат клеток Y. pseudotuberculosis, 2 - лизат исходных клеток C.i. 3 - лизат обезжиренных клеток C.i., 4 - лизат обезжиренных клеток C.i. после выделения из них ЛПС, 5 - «ЛПС»-РСР C.i., 6 - «ЛПСк-PW C.i., 7 - ЛПС Е. со//';

(б) 1 - «ЛПС»-Р\А/ C.i., 2 - КПС C.i.

Препараты(ЛПС-Р\Л/ и ЛПС-РСР), выделенные из клеток C.i. и C.s. традиционными для ЛПС методами экстракции, дают полосы, совпадающие по подвижности между собой и с полосами клеточных лизатов (рис. 22а, линии 5, 6). Однако химический анализ PW- и РСР-экстрактов показал, что они не

1 2 3 4 5 6 7 12

содержат гептоз и Кдо, практически не содержат ЖК, в том числе 3-гидрок-сиалкановых, и из них не выделяется ЛА, из чего можно заключить, что они не являются ЛПС (в дальнейшем они будут обозначаться как «ЛПС»). Что касается природы веществ, экстрагируемых из бактерий фенол-содержащи-ми системами, они могут быть КПС, которые часто извлекаются вместе с ЛПС.

Исследование строения клеточной стенки бактерий С. ЫоМейсит с помощью электронной микроскопии (рис. 23) показало наличие наружной и цитоплазматической мембран, а также капсулы на поверхности клеток. Обработка бактерий горячей водой (один из способов получения КПС) привела к выделению препарата, который по своим характеристикам (поведение в условиях ДСН-ПААГ-электрофореза (рис. 226, линии 2 и 1 соответственно), отсутствие ЖК и ЛА, идентичный моносахаридный состав) оказался подобным «ЛПС», выделенному ранее из этих клеток фенол-водной экстракцией.

Совокупность полученных данных показывает, что препараты, выделенные стандартными для ЛПС методами экстракции, на самом деле являются КПС. Этот факт косвенно подтверждает отсутствие (или очень низкое содержание, см. рис. 22) ЛПС в клетках изученных бактерий. Несмотря на отсутствие ЛПС, бактерии рода Chryseobacterium остаются жизнеспособными. По-видимому, присутствующие на поверхности клеток КПС берут на себя часть функций ЛПС, подобно тому, как это происходит у мутантной ЛПС-дефицитной N. meningitidis, содержащей КПС. Возможно также, что функции ЛПС (ЛА) частично выполняют сульфобацины.

3.6 Особенности структуры липидов ЛА морских ГОБ

Исследование «морских» ЛА показало, что по своему химическому составу они подобны ЛА из наземных бактерий: и те, и другие содержат GlcN, фосфатные группы и ЖК, основными среди которых являются С12:0 и 3-гид-роксиалкановые кислоты. В то же время «морские» ЛА имеют ряд специфических особенностей. Наиболее значимыми среди них являются пентаа-цильный тип структуры и низкая степень фосфорилирования многих из них (табл. 12).

(б)

К

Рис. 23. Данные электронной микроскопии клеток С. lndoltheticum: (а) -ультратонкий срез клеток; (б) - клетки, негативно контрастированные фосфорно-вольфра-мовой кислотой.

Низкая степень ацилирования ЛА морских бактерий, по-видимому, обусловлена условиями их обитания. Большинство из них живет в открытом океане с его относительно низкой температурой и в силу этого проявляет свойства психротолерантных микроорганизмов, которые, как это было показано на других бактериях, синтезируют неполные, ацилдефицитные ЛА. Возможно, недоацилированый тип структуры ЛА морских бактерий определяется отсутствием ферментативных систем (или их ингибированием), участвующих в присоединении вторичных ЖК на одной из последних стадий биосинтеза ЛА и ЛПС.

Интересно, что наибольшее сходство с ЛА наземных бактерий кишечной группы проявляют ЛА S. algae и V. fluvialis, которые в отличие от других морских бактерий являются мезофилами и, как другие мезофилы, синтезируют ЛА с гексаацильным типом структуры. Некоторое сходство в структуре с ЛА наземных бактерий проявляет и ЛА М. mediterránea.

Особое место среди изученных морских микроорганизмов занимают бактерии рода Chryseobacterium, имеющие ряд особенностей, которые отличают их от большинства других ГОБ. Они не имеют ЛПС, не синтезируют ФГ и ДФГ, содержат значительные количества весьма редких сульфосодержа-щих липидов, ЛА, выделенный из них, обладает необычной моносахаридной структурой. Причина и биологический смысл столь значительных изменений в составе наружной мембраны бактерий рода Chryseobacterium остаются пока невыясненными.

3.7 Антиэндотоксические свойства ЛА и ЛПС некоторыхморских

бактерий

Конечной целью структурных исследований ЛА морских бактерий был поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов. Наличие у «морских» ЛА необычных структурных особенностей делает перспективным изучение их антиэндотоксической активности. В рамках настоящей работы были изучены некоторые биологические свойства ЛПС и ЛА морских бактерий и проведена оценка возможности их использования в качестве антагонистов эндотоксинов.

Известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов являются слабо токсичными или нетоксичными соединениями. Определение острой токсичности «морских» ЛА и ЛПС показало, что многие из них имели значительно более высокие 50%-ные летальные дозы для мышей, чем ЛПС энте-робактерий, а «ЛПС» и ЛА С. indoltheticum были нетоксичны во всех исследованных концентрациях (рис.24).

ЛшшдыА.

í.ps. Ч

М.с.

лпс

■ М.т. lili

Препарат LD5O

М. с. ЛПС 12,65

М. т. ЛПС 2,73

У. ps. ЛПС 0,06

Е. с. ЛПС 0,012

Р. h. ЛА 4,85

/. г. ЛА 3,12

М. v. ЛА 2,00

S. а. ЛА 1,46

V. f. ЛА 0,17

Рис. 24. Острая токсичность ЛПС и липидов А морских ГОБ. Для дальнейшей характеристики антиэндотоксического потенциала «морских» ЛА и ЛПС была определена их способность индуцировать синтез ФНО-а в клетках цельной крови человека (рис. 25).

1.1 1 10 100 1000 «ООО 100000

СЛПС' нг/мл

о о.| i ю ico rao ¡сссо Слпс, нг/мл

Рис. 25. Индукция синтеза ФНО-а в клетках цельной крови человека ЛПС морских ГОБ: (а) 1 - ЛПС Е. coli 055: В5; 2 - ЛПС S. а/дае; 3 - ЛПС Р. haloplanktis] 4 -ЛПС М. vaga\ 5 - ЛПС I. zobellii; (б): 1 - ЛПС Е. coli 055: В5; 2 - «ЛПС» С. indoltheticum; 3 - ЛПС М. mediterránea; 4 - ЛПС М. communis. Различия между исследованными препаратами и контролем были достоверными при * - р<0,01, ** - р<0,02, *** - р<0,05.

ЛПС S. algae, ЛА которого в структурном отношении наиболее близок ЛА Е. coli (оба ЛА имеют гексаацильный тип структуры), проявлял умеренную активность в этом тесте: при низких концентрациях его индуцирующая способность была сравнима с активностью ЛПС Е. coli (рис. 25а, линии 2 и 1). ЛПС, ЛА которых являются дифосфорилированными производными с пятью остатками ЖК (ЛПС Р. haloplanktis и М. mediterránea) были активными только в высоких концентрациях (рис. 25а, линия 3 и рис. 256, линия 3 соответственно). Минимальную эндотоксическую активность проявляли ЛПС М. communis (рис. 256, линия 4), М. vaga и /. zobellii (рис. 25а, линии 4 и 5 соответственно), ЛА которых имеют пентаацильный тип структуры и содержат одну фосфатную группу.

Наиболее активным индуктором синтеза ФНО-а из всех тестируемых образцов оказался «ЛПС» С. indoltheticum (рис. 256, линия 2), который, как было показано выше, ЛПС не является. Следовательно, высокая индуцирующая способность этого препарата определяется не липидным фрагментом его молекулы, который в ней отсутствует, а другими особенностями его состава или структуры. В отличие от «ЛПС», ЛА С. indoltheticum не индуцировал синтез ФНО-а в клетках крови человека в исследованном диапазоне концентраций (данные не приводятся).

Слабая индуцирующая активность ЛПС некоторых морских бактерий в сочетании с высокими значениями LD5o позволяет предполагать, что они могут проявлять антиэндотоксические свойства и препятствовать связыванию эндотоксинов со специфическими рецепторами на клетках-мишенях макроорганизма и последующей активации синтеза цитокинов.

Изучение антиэндотоксической активности «морских» ЛА и ЛПС в экспериментах in vitro показало, что ЛА М. communis и С. indoltheticum ингиби-ровали индуцированный ЛПС Е. coli (10 нг/мл) синтез ФНО-а только при максимально высокой концентрации (рис. 26а, линии 2 и 3). В отличие от ЛА, ЛПС М. communis проявлял ярко выраженные антагонистические свойства: ингибирование синтеза ФНО-а под действием этого препарата наблюдалось уже в концентрации 10 нг/мл, достигая максимального значения (80%) в концентрации 1000 нг/мл (рис. 26а, линия 1). Столь же высокую ин-гибирующую активность проявляли ЛПС М. vaga и I. zobellii: в дозе 1000 нг/мл они ингибировали индуцированный синтез ФНО-а на 90 и 80% соответственно (рис. 266, линии 1,2).

ЮЮО КС'ХО

Сшитбитора, НГ/МЛ

Рис. 26. Ингибирование синтеза ФНО-а в клетках цельной крови человека, индуцированного ЛПС Е. coli 055:В5 (10 нг/мл), ЛПС и ЛА морских ГОБ: (а) 1 - ЛПС М. communis] 2 - ЛА М. communis-, 3 - ЛА С. indoltheticum; (б) 1 - ЛПС М. vaga] 2 - ЛПС I. zobellii.

Следует сказать, что уже при 10-кратном увеличении содержания индуктора (ЛПС £. coli) в тест-системе ингибирование синтеза ФНО-а «морскими» ЛПС (на примере ЛПС М communis, рис. 27) уменьшалось на 15%. При

концентрации индуктора 10 мкг/мл ингибирование составляло всего 40%. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование цитокин-индуцирую-щей активности эндотоксина (ЛПС Е. coli) «морскими» ЛПС происходит в результате конкурентного взаимодействия со специфическими рецепторами.

На примере ЛПС М. communis была изучена универсальность ингиби-рующего действия «морских» ЛПС по отношению к эндотоксинам различного происхождения и структуры. В этих экспериментах в качестве индуктора синтеза ФНО-а использовали ЛПС У. pseudotuberculosis (ЛПС S-формы) и S. minnesota R7 (ЛПС R-формы) в сравнении с уже изученным ЛПС Е. coli 055: В5 (ЛПС S-формы). Во всех изученных случаях ЛПС М. communis инги-бировал продукцию ФНО-а в клетках крови человека, индуцированную перечисленными выше эндотоксинами (рис. 28). Эти данные, а также конкурентный характер ингибирующего действия ЛПС М. communis (рис. 27), хорошо согласуются с общепринятыми представлениями о механизмах стимуляции синтеза цитокинов в иммунокомпетентных клетках, которые включают взаимодействие эндотоксинов с рецепторами, специфичными к ЛА.

о

S

2000 4000 6000 8000 10000 ^индуктора1 НГ/МЛ

1 10 10J 1000 Chic и] м . «шпини, кг/мл

Рис. 27 (справа). Увеличивающиеся концентрации эндотоксина (ЛПС Е. coll 055: В5) блокируют ингибирование ЛПС М. communis индуцированного синтеза ФНО-а.

Рис. 28 (слева). Ингибирование ЛПС М. communis синтеза ФНО-а в пробах цельной крови человека, индуцированного ЛПС (10 нг/мл) У. pseudotuberculosis, S. minnesota R7 и Е. coli 055: В5. 1 - ЛПС S. minnesota R7; 2 - ЛПС У. pseudotuberculosis', 3 - ЛПС £ coli.

Таким образом, ЛПС и ЛА некоторых морских бактерий, будучи слабыми индукторами синтеза провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а, проявляют свойства универсальных антагонистов эндотоксинов, что делает перспективным их дальнейшее комплексное изучение.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние экзогенных (температура, способ культивирования, фаза роста, источник углерода) и эндогенных (плазмидные ДНК) факторов роста и условий обитания на липидный состав некоторых морских и наземных грамотрицательных бактерий.

2. Показано, что холодовые культуры Yersinia pseudotuberculosis, в отличие от культур, выращенных при 37 °С, имеют более высокое общее содержание фосфолипидов и липополисахаридов, более высокий индекс ненасыщенности жирных кислот и более высокое значение отношения цвитте-рионных фосфолипидов к анионным. Липополисахариды «холодовых» вариантов бактерий, в сравнении с липополисахаридами «тепловых» вариантов, имеют более длинные О-специфические углеводные цепи и более высокую степень ацилирования остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты. Липид А бактерий, выращенных на холоду, имеет, в основном, пентаациль-ный тип структуры, тепловые культуры бактерий синтезируют тетраациль-ный липид А. Терморегуляция состава липидов контролируется хромосомными генами и подавляется в присутствии плазмиды pVM82. Плазмида вирулентности не влияет на состав липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза.

3. Показано, что присутствие глюкозы в питательной среде оказывает существенное влияние на состав фосфолипидов Yersinia pseudotuberculosis, характер которого зависит от температуры: на холоду (8 °С) глюкоза стимулирует синтез фосфолипидов, при 37 °С - ингибирует этот процесс.

4. Найдено, что колониальные культуры Yersinia pseudotuberculosis содержат больше общих липидов и фосфолипидов и имеют более высокий индекс ненасыщенности жирных кислот, чем суспензионные. Липополисахариды, выделенные из колониальных культур, в сравнении с липополисахаридами суспензионных культур, имеют более длинные углеводные цепи. При обоих способах культивирования липополисахариды с максимальной длиной цепи О-полисахаридов синтезируются в стационарной фазе роста.

5. Показано, что низкая температура и рост в виде колоний являются факторами, усиливающими патогенный потенциал бактерий псевдотуберкулеза: липополисахариды колониальных культур, выращенных на холоду, в сравнении с липополисахаридами «тепловых» вариантов суспензионных культур, обладают более высокой острой токсичностью для теплокровных животных.

6. Показано, что липиды А морских бактерий имеют преимущественно пентаацильный тип структуры и часто содержат одну фосфатную группу. Установлена корреляция между хроматографическими (ТСХ) профилями липидов А, составом их жирных кислот, с одной стороны, и таксономическим положением бактерий, с другой.

7. Показано, что липиды А морских бактерий Marinomonas communis АТСС 27118т и Marinomonas vaga АТСС 27119т представляют собой 1-фос-фаты Р-1'—>6-связанного дисахарида D-глюкозамина, ацилированного остатками редких короткоцепочечных (Я)-З-додеканоилоксидекановой (или (/?)-3-деканоилоксидекановой) и (RJ-3-гидроксидекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно и (Я?)-3-{(Я)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положении 2". Липид А бактерий Marinomonas mediterranea АТСС 700492т не содержит нормальных жирных кислот и представляет собой 1,4'-дифосфат глюкозаминобиозы, ацилированный остатками (К)-3-{(Я)-3-гид-роксидеканоил}оксидекановой кислоты в положениях 2, 2' и (Я)-З-гидрокси-декановой кислоты в положении 3.

8. Показано, что липиды А бактерий рода Marinomonas - первые представители соединений этого класса, содержащие необычную 3-ацилоксиал-кановую кислоту, состоящую из двух остатков (Я)-З-гидроксидекановой кислоты.

9. Впервые из природных штаммов бактерий (морские бактерии Chry-seobacterium indoitheticum CIP 103168т и Chryseobacterium scophthaimum CIP 104199т), выделен липид А, структурно подобный моносахаридному биосинтетическому предшественнику липида А мутантных клеток Escherichia coii. Показано, что липиды А этих бактерий представляют собой 1-фосфаты D-глюкозамина, ацилированные остатками (Я)-З-гидрокси-изо-пентадекановой и (Я)-З-гидрокси-изо-гептадекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно.

10. Изучены эндотоксические свойства липидов А и липополисахари-дов ряда морских бактерий. Показано, что многие из них являются слабо токсичными соединениями и не индуцируют синтез фактора некроза опухоли альфа клетками периферической крови человека при всех изученных концентрациях.

11. На примере липополисахарида Marinomonas communis показано, что липиды А и липополисахариды морских бактерий проявляют свойства антагонистов эндотоксинов универсального типа действия и могут представлять интерес для терапии грамотрицательного сепсиса и эндотоксикоза.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Studies on lipid A from Y. pseudotuberculosis. Isolation and general characterization // Eur. J. Biochem. 1978. V. 89, No 2. P. 287-289.

2. Gorbach V.I., Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Razmakhnina O.Yu., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Structural studies of the immunodominant group of lipid A from lipopolysaccharide of Y. pseudotuberculosis II Eur. J. Biochem. 1979. V. 98, No. 1.P. 83-86.

3. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Isakov V.V., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. The application of ,3C-NMR spectroscopy to study lipid A from Yersinia pseudotuberculosis II Eur, J. Biochem. 1982. V. 126, No 2. P. 349-351.

4. Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. D-3-Dodecanoyloxytetradecanoic acid as a constituent of lipid A from the lipopolysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis II Experientia. 1984. V. 40, No. 7. P. 709-710.

5. Горбач В.И., Лукьянов П.А., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез аналогов липида А. Получение серологически активных глико-липидов на основе р-1,4-глюкозаминобиозы (хитобиозы) // Биоорган, химия. 1987. Т. 13, № 10. С.1409-1415.

6. Красикова И.Н., Федореева Л.И., Исаков В.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Использование спектров 13С-ЯМР липополисахарид-белковых комплексов для установления строения О-специфических полисахаридов // Биоорган, химия. 1988. Т. 14, № 3. С. 419-420.

7. Ермак И.М., Мороз С.И., Красикова И.Н., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Фролова Г.М., Иванова Е.П., Тимченко Н.Ф., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние температуры культивирования на состав основных компонентов внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол. мембраны. 1988. Т. 5, № 5. С. 492-500.

8. Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Структура и свойства липида А - компонента эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Химия природ, соедин. 1989. № 5. С. 601-616.

9. А.С. № 1514782 СССР, МКИ4 C12Q 1/00. Способ обнаружения бактериального эндотоксина / Воинов В.Г., Красикова И.Н., Елькин Ю.Н. - № 4285899/31-13. Заявл. 16.07.87;//Опубл. 15.10.89. Бюлл. № 38.-2с.

10. Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Хотимченко С.В., Оводов Ю.С. Влияние температуры культивирования на липидный состав бактерий Yersinia pseudotuberculosis II Химия природ, соедин. 1991. № 4. С. 579-580.

11. А.С. № 1652319 СССР, МКИ5 С07Н 13/06. Производные хитоолигоса-харидов, обладающие иммуномодулирующей и противоопу-холевой активностью / Горбач В.И., Красикова И.Н., Лукьянов П.А., Лоенко Ю.Н., Соловьева Т.Ф., Мороз Л.В., Пименов А.А., Грубова Е.А., Деев В.В., Кириллова И.В.,

Рахмилевич А.Л., Мигдал Т.Л., Фукс Б.Б., Рахимова М.С. Заявл. 25.07.88; Опубл. 01.02.91. Бюлл. № 20.-4с.

12. Gorbach V.I., Krasikova I.N., Luk'yanov Р.А., Loenko Yu.N., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S., Deev V.V., Pimenov A.A. New glycolipids (chitooligosaccha-ride derivatives) possessing immunostimulating and antitumor activities // Carbo-hydr. Res. 1994. V. 260, No. 1. P. 73-82.

13. Krasikova I.N., Khotimchenko S.V., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. // Mutual influence of plasmid profile and growth temperature on the lipid composition of Yersinia pseudotuberculosis bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1257, No. 2. P. 118-124.

14. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Новый способ выделения О-специфического полисахарида из грамотрицательной бактерии Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 1998. Т. 24, № 7. С. 549-553.

15. Красикова И.Н., Бахолдина СМ., Соловьева Т.Ф. Быстрый способ получения липида А из бактерии Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган, химия. 1999. Т. 29, № 4. С. 293-298.

16. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Хотимченко С.И., Соловьева Т.Ф. Влияние температуры роста и плазмиды pVM82 на жирнокислотный состав липида A Yersinia pseudotuberculosis Н Биохимия. 1999. Т. 64, № 3. С. 404-411. "

17. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Гетерогенность липо-■ полисахаридов из Yersinia pseudotuberculosis: химическая характеристика различных молекулярных типов // Биохимия. 1999. Т. 64, № 11. С. 1519-1526.

18. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Синтез лилополиса-харидов у бактерий У. pseudotuberculosis: влияние плазмиды pVM82 и температуры роста бактерий II Биохимия. 2000. Т. 65, № 11. С. 1507-1515.

19. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липополисахаридный состав Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 2001. Т. 27, № 2. С. 151-155.

20. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2001. Т. 66, № 4. С. 1511- 519.

21. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Глюкоза как фактор среды роста, регулирующий липидный состав Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия. 2001. Т. 66, № 8. С. 1122-1127.

22. Красикова И.Н., Капустина Н.В., Светашев В.И., Горшкова Р.П., Том-шич С.В., Назаренко Е.Л., Командрова Н.А., Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Романенко Л.С., Михайлов В.В., Соловьева Т.Ф. Химическая характеристика липида А некоторых морских протеобактерий // Биохимия. 2001. Т. 66, № 9. С. 1286- 1294.

23. Капустина Н.В., Красикова И.Н., Исаков В.В., Горшкова Н.М., Соловьева Т.Ф. Структура липида А из липополисахарида морской гамма-протеобак-

терии Marinomonas vaga АТСС 27119т // Биохимия. 2004. Т. 69, № 4. С. 504-510.

24. Красикова И.Н., Капустина Н.В., Исаков В.В., Горшкова Н.М., Соловьева Т.Ф. Установление структуры липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis АТСС 14393т II Биоорган, химия. 2004. Т.ЗО, №4. С. 409-416.

25. Krasikova I.N., Kapustina N.V., Isakov V.V., Dmitrenok A.S., Dmitrenok P.S., Gorshkova N.M., Solov'eva T.F. Detailed structure of lipid A from lipopolysaccharide from the marine proteobacterium Marinomonas vaga ATCC 27119T // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271, No. 14. P. 2895-2904.

26. Воробьева E.B., Дмитренок A.C., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Marinomonas communis АТСС 27118т // Биоорган, химия. 2005. Т.31, № 4. С. 404-413.

27. Воробьева Е.В., Красикова И.Н., Дмитренок А.С., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Недашковская О.И., Соловьева Т.Ф. Характеристика необычного липида А моносахаридной природы из морской бактерии Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199т II Биоорган, химия. 2006. Т.32, № 5. С. 538-545.

28. Воробьева Е.В., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Влияние липополиса-харидов и липидов А из некоторых морских бактерий на индукцию спонтанного и индуцированного липополисахаридом из Escherichia coli синтеза ФНО-а клетками периферической крови человека II Биохимия. 2006. Т. 71, № 7. С. 936-944.

29. Воробьева Е.В., Красикова И.Н., Дроздов А.П., Реунов А.В., Лапшина Л.А., Соловьева Т.Ф. Некоторые особенности состава наружной мембраны морской грамотрицательной бактерии Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199х II Биол. мембраны. 2007. Т. 24, № 2. С. 132-141.

30. Волк А.С., Красикова И.Н., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Соловьева Т.Ф. Структура липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas nigrifaciens IAM 13010т II Химия природ, соедин. 2007. Т. 43, № 5. С. 519-524.

Соискатель

Красикова И.Н.

КРАСИКОВА Инна Николаевна

ЛИПИДЫ НЕКОТОРЫХ НАЗЕМНЫХ И МОРСКИХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ КАК ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ЭНДОТОКСИНОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 2 сентября 2009 г. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 2,0. Уч.-изд. л. 1,45. Тираж 100 экз. Заказ 209350

Отпечатано в типографии «Краски» 690048, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 43, 36-26-16, 55-95-31

www.kpacku.com

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1 Структура клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

2.2 Состав и свойства свободных липидов грамотрицательных бактерий.

2.3 Общая характеристика липополисахаридов.

2.4 Липид А

2.4.1 Общая характеристика липида А.

2.4.2 Биосинтез липида А.

2.4.3 Модификации структуры липида А.

2.4.3.1 Вариации в структуре гидрофильной части молекулы. липида А.

2.4.3.2 Модификации гидрофобной (область жирных кислот) части. липида А.

2.4.4 ЛПС-дефицитные грамотрицательные бактерии.

2.4.5 Функциональная геномика: липиды А растений?.

2.4.6 Взаимосвязь структуры и биологической активности липида А.

2.5 Механизм токсического действия эндотоксинов.

2.6 Механизм распознавания бактериальных эндотоксинов.

2.7 Стратегии нейтрализации эндотоксинов.

2.7.1 Иммунотерапия с использованием специфических антител к. липиду А.

2.7.2 Блокирование эндотоксина (липида А) в местах его клеточной. рецепции с помощью синтетических антагонистов.

2.7.3 Другие способы нейтрализации эндотоксинов.

3. Экспериментальная часть.

3.1 Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий.

3.2 Выделение компонентов наружной мембраны бактериальных клеток.

3.3 Методы химического анализа.

3.4 Образцы жирных кислот.

3.5 Получение производных D-глюкозамина.

3.6 Общие экспериментальные условия.

3.7 Инструментальные методы анализа.

4. Результаты и обсуждение.

4.1 Влияние экзогенных и эндогенных факторов на липидный состав бактерий Yersinia pseudotuberculosis.

4.1.1 Липиды бактерий Y. pseudotuberculosis. Общая характеристика.

4.1.1.1 Свободные липиды.

4.1.1.2 Липополисахариды.

4.1.1.3 ЛипидА.

4.1.2 Новые подходы к анализу состава липополисахаридов.

4.1.3 Влияние способа культивирования и фазы роста на состав липидов.

Y. pseudotuberculosis.

4.1.4 Роль температуры культивирования и плазмид в регуляции липидного. состава Y. pseudotuberculosis.

4.1.5 Влияние глюкозы на состав липидов Y. pseudotuberculosis.

4.2 Влияние условий культивирования на вирулентные свойства.

Y. pseudotuberculosis.

4.3 Липиды А морских грамотрицательных бактерий.

4.3.1 Характеристика липидов А морских грамотрицательных бактерий.

4.3.2 Липиды А бактерий рода Pseudoalteromonas.

4.3.2.1 RAP. haloplanktis АТСС 14393т.

4.3.2.2 ЛА P. nigrifaciens IAM 13010т.

4.3.3 Липид А бактерии Idiomarina zobellii КММ 231т.

4.3.4 Липид А бактерии Shewanella algae 48055.

4.3.5 Липиды А бактерий рода Marinomonas.

4.3.5.1 Липиды А бактерий М. communis АТСС 27118т и М. vaga.

АТСС 27119т.

4.3.5.2 Липид А бактерии М. mediterranea АТСС 700492т.

4.3.6 Липиды А бактерий рода Chryseobacterium.

4.3.7 Некоторые особенности состава наружной мембраны бактерий рода. Chryseobacterium.

4.3.7.1 Характеристика липидного состава С. indoltheticum и.

С. scophthalmum.

4.3.7.2 Бактерии рода Chryseobacterium не содержат ЛПС!?.

4.3.8 Особенности строения «морских» липидов А.

4.3.9 Липиды А и ЛПС морских бактерий - потенциальные антагонисты. эндотоксинов.

5. Выводы.

Липиды являются одним из основных классов биомолекул, интерес к которым обусловлен целым рядом важных обстоятельств. Эти близкие по своей химической природе вещества участвуют в построении биологических мембран всех клеточных систем, обеспечивая универсальность их функционирования. Будучи структурной основой клеточных мембран, липиды определяют степень их жидкостности, латеральную и трансбислойную асимметрию и другие параметры.

In vivo липиды также чрезвычайно интересны. Они участвуют практически во всех физиологических процессах (иммунном ответе, передаче нейрональной информации, регуляции сосудистого и мышечного тонуса, гомеостазе, воспалении и т.д.) [1] и имеют практическое применение. Например, изменение в составе липопротеинов человеческой крови свидетельствует о развитии сосудистых заболеваний и используется для их диагностики. Диацилглицериды выполняют функции молекул-мессенджеров, участвующих в механизмах передачи сигналов [2]. Лизофосфолипиды, концентрация которых в клеточных мембранах при стрессовых ситуациях значительно возрастает, являются важными маркерами некоторых заболеваний, таких как атеросклероз [3] и ревматоидный артрит [4] (Механизм образования лизофосфатидов в разных случаях может иметь различные биохимические сочетания, но всегда должен включать активизацию фосфолипазы Аг, гидролизующей ФЛ [5]. Присутствие лизофосфатидов в мембране делает ее непрочной и увеличивает вероятность нарушения целостности внутренней среды клетки.).

Многогранность функций липидов связана с разнообразием их состава. Липиды подразделяют на полярные и нейтральные. К полярным липидам относятся фос-фолипиды и холестерин, которые являются основными структурными составляющими биологических мембран и во многом определяют свойства последних. Молекулы ФЛ имеют единую структурную организацию, при которой полярная и гидрофобная области оказываются разделенными. Полярная и гидрофобная (углеводородная) части молекулы, как правило, обладают достаточной гибкостью и подвижностью, что позволяет им принимать наиболее выгодную форму, соответствующую минимуму энергии, а жидкому бислою - сохранять барьерные свойства при изменении в широких пределах липидного состава, температуры, ионной силы водной среды и т.д.

Нейтральные липиды являются наиболее доступными источниками энергии, обеспечивающими обменные процессы. Запасы нейтральных липидов могут служить источником структурных элементов - глицерина, ЖК, холестерина, являющихся исходными продуктами при биосинтезе многих других необходимых для жизнедеятельности соединений: углеводов, мембранных липидов, желчных кислот, простаг-ландинов, стероидных гормонов и др.

Функциональные особенности липидов во многом определяются их жирнокис-лотным составом. Существует большое число разнообразных молекул ЖК: нормального строения и разветвленных, с четным и нечетным числом углеродных атомов в алифатической цепи, насыщенные и ненасыщенные, с разным позиционным расположением двойных связей и с различной длиной цепи. ЖК, кроме обеспечения целостности мембран и оптимального уровня ненасыщенности, обусловливают включение и диффузионное перемещение мембранных компонентов, активность мембраносвя-занных ферментов, мембранную проницаемость и транспортные свойства.

Большой прогресс в липидологии произошел после объединения исследований химии и биологии липидов в одно направление, которое получило название «lipidom-ics» (липидомика) [6]. Хотя по количеству статей (около 200) липидомика пока значительно уступает геномике (около 25000) и протеомике (около 13000) [7], интерес к липидам и их анализу в последние 10 лет значительно увеличился [8]. В настоящее время всесторонний анализ липидных молекул, липидомика, в дополнение к геномике и протеомике, является одним из важнейших условий для понимания клеточной физиологии и патологии.

Важность липидных молекул в осуществлении клеточных функций и патологии, их многообразие породили настоятельную потребность в создании хорошо организованной базы данных по липидам и их классификации. В 2005 г. Международный комитет по классификации и номенклатуре липидов предложил ввести в действие Всеобщую систему классификации липидов (Comprehensive Classification System for Lipids) (см. [82]), основанной на четких химических и биохимических принципах, которые учитывают различия в составе и структуре гидрофобных и гидрофильных доменов липидных молекул. Единый способ представления химических структур индивидуальных липидов и их производных, цифровые идентификаторы для каждой уникальной липидной молекулы делают предлагаемую систему совместимой с требованиями информатики [9] и с базами данных других макромолекул. В 2009 г. опубликована усовершенствованная версия этой классификации, более полно представляющая структурное разнообразие липидов и их производных [10].

Многочисленными исследованиями показана важная роль липидов в развитии приспособительных реакций у организмов при экологических модуляциях. К настоящему времени как в отечественной, так и в зарубежной литературе накоплен значительный материал по вопросам, касающимся участия липидов в адаптивных реакциях организмов в ответ на изменение разнообразных условий окружающей среды [11]. Адаптации осуществляются преимущественно за счет модификаций мембранных липидов и углеводородных радикалов их ЖК. Ведущая роль в запуске адаптационных механизмов отводится физическому состоянию мембран, зависящему от степени ненасыщенности ЖК в мембранных липидах.

Наряду с общими закономерностями адаптационных механизмов на уровне липидов должны существовать и специфические реакции для разных видов, позволяющие особи поддерживать жизнедеятельность в разнообразных условиях, которые в полной мере еще не изучены. Бактерии, структурной единицей которых является про-кариотическая клетка, представляют собой обширную группу живых организмов, населяющих нашу планеты. В отличие от животных и растений микроорганизмы чрезвычайно разнообразны по своей физиологии. Структурная организация мембран микроорганизмов, во многом обусловленная составом липидов, которые у бактерий характеризуются чрезвычайно высоким разнообразием [12], и соотношением их с белками, определяет разнообразные функциональные свойства бактериальных клеток, такие как механизмы транспорта, регуляция активности ферментов и метаболических процессов, вирулентность, резистентность и др. Благодаря высокой скорости размножения, бактерии быстро эволюционизируют и в течение короткого времени могут приспособиться к жизни даже в мало пригодных для этого условиях.

До недавнего времени почти весь научный и практический интерес был сосредоточен, что вполне понятно, на изучении микроорганизмов, использующих человека и животных как среду обитания. Существенно меньший интерес вызывала интерес группа микроорганизмов, часто родственных тем, о которых говорилось выше, но обитающих в иных экологических условиях и являющихся сапрофитами. С точки зрения экологии они являются факультативными психрофилами с температурным диапазоном существования от 0 до 30 °С. Многие сапрофитные организмы при изменении условий среды переходят к паразитическому существованию и инфицируют различные виды рыб, теплокровных животных и человека. Остается неясным, как изменяется качественный состав и количественные соотношения липидных компонентов у таких микроорганизмов под влиянием разных факторов окружающей среды и при переходе от одной среды обитания к другой. Поэтому исследование приспособительных реакций на молекулярном и физиологическом уровнях организации у организмов разной таксономической принадлежности, в том числе у микроорганизмов, остается актуальной задачей экологической и эволюционной физиологии и биохимии.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

185 ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние экзогенных (температура, способ культивирования, фаза роста, источник углерода) и эндогенных (плазмидные ДНК) факторов роста и условий обитания на липидный состав некоторых морских и наземных грамотрицательных бактерий.

2. Показано, что холодовые культуры Yersinia pseudotuberculosis, в отличие от культур, выращенных при 37 °С, имеют более высокое общее содержание фосфоли-пидов и липополисахаридов, более высокий индекс ненасыщенности жирных кислот и более высокое значение отношения ФЭ/ФГ+ДФГ. Липополисахариды «холодовых» вариантов бактерий, в сравнении с липополисахаридами «тепловых» вариантов, имеют более длинные О-специфические углеводные цепи и более высокую степень аци-лирования остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты. Липид А бактерий, выращенных на холоду, имеет, в основном, пентаацильный тип структуры, тепловые культуры бактерий синтезируют тетраацильный липид А. Терморегуляция состава липидов контролируется хромосомными генами и подавляется в присутствии плазмиды pVM82. Плазмида вирулентности не влияет на состав липидных компонентов бактерий псевдотуберкулеза.

3. Показано, что присутствие глюкозы в питательной среде оказывает существенное влияние на состав фосфолипидов Yersinia pseudotuberculosis, характер которого зависит от температуры: на холоду (8 °С) глюкоза стимулирует синтез фосфолипидов, при 37 °С — ингибирует этот процесс.

4. Найдено, что колониальные культуры Yersinia pseudotuberculosis содержат больше общих липидов и фосфолипидов и имеют более высокий индекс ненасыщенности жирных кислот, чем суспензионные. Липополисахариды, выделенные из колониальных культур, в сравнении с липополисахаридами суспензионных культур, имеют более длинные углеводные цепи. При обоих способах культивирования липополисахариды с максимальной длиной цепи О-полисахаридов синтезируются в стационарной фазе роста.

5. Показано, что низкая температура и рост в виде колоний являются факторами, усиливающими патогенный потенциал бактерий псевдотуберкулеза: липополисахариды колониальных культур, выращенных на холоду, в сравнении с липополисахарида-ми «тепловых» вариантов суспензионных культур, обладают более высокой острой токсичностью для теплокровных животных.

6. Показано, что липиды А морских бактерий имеют преимущественно пентаа-цильный тип структуры и часто содержат одну фосфатную группу. Установлена корреляция между хроматографическими (ТСХ) профилями липидов А, составом их жирных кислот, с одной стороны, и таксономическим положением бактерий, с другой.

7. Показано, что липиды А морских бактерий Marinomonas communis АТСС 27118т и Marinomonas vaga АТСС 27119 представляют собой 1-фосфаты р-Г—>6-связанного дисахарида D-глюкозамина, ацилированного остатками редких короткоцепочечных (-Я)-З-Додеканоилоксидекановой (или (-Я)-З-деканоилоксидекановой) и С#)-3-гидроксидекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно и (R)-3-{(R)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положении 2'. Липид А бактерий Mari-nomonas mediterranea АТСС 700492 не содержит нормальных жирных кислот и представляет собой 1,4'-дифосфат глюкозаминобиозы, ацилированный остатками (R)-3-{(7?)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положениях 2, 2' и (R)-3-гидроксидекановой кислоты в положении 3.

8. Показано, что липиды А бактерий рода Marinomonas - первые представители соединений этого класса, содержащие необычную 3-ацилоксиалкановую кислоту, состоящую из двух остатков (/?)-3-гидроксидекановой кислоты.

9. Впервые из природных штаммов бактерий (морские бактерии Chryseobacterium т т* indoltheticum CIP 103168 и Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199 ), выделен липид А, структурно подобный моносахаридному биосинтетическому предшественнику липида А мутантных клеток Escherichia coli. Показано, что липиды А этих бактерий представляют собой 1-фосфаты D-глюкозамина, ацилированные остатками (R)-3-гидрокси-шо-пентадекановой и (7?)-3-гидрокси-мзо-гептадекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно.

10. Изучены эндотоксические свойства липидов А и липополисахаридов ряда морских бактерий. Показано, что многие из них являются слабо токсичными соединениями и не индуцируют синтез фактора некроза опухоли альфа клетками периферической крови человека при всех изученных концентрациях.

11. На примере липополисахарида Marinomonas communis показано, что липиды А и липополисахариды морских бактерий проявляют свойства антагонистов эндотоксинов универсального типа действия и могут представлять интерес для терапии грамот-рицательного сепсиса и эндотоксикоза.

188

1. Sheridan М.A. Lipid dynamics of fish: aspects of absorbtion, transportation, deposition and mobilization // Сотр. Biochem. Physiol. 1988. V. 90, No. 4. P. 679-690.

2. Wymann M.P., Schneiter R. Lipid signalling in disease // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. V. 9, No. l.P. 162-176.

3. Matsumoto Т., Kobayashi Т., Kamata K. Role of lysophoshatidylcholine (LPC) in atherosclerosis // Curr. Med. Chem. 2007. V. 14, No. 30. P. 3209-3220.

4. Ferooque A.A., Yang H.-C., Rosenberger T.A., Horrock R.A. Phospholipase A2 and its role in brain tissue // J. Neurochem. 1997. V. 69, No. 9. P. 889-901.

5. Wenk M.R. The emerging field of lipidomics // Nat. Rev. Drug Discov. 2005. V. 4, No. 7. P. 594-610.

6. Fuchs В., Schiller J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics // Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2009. V. 111, No. 1. P. 83-98.

7. Wolf C., Quinn P.J. Lipidomics: Practical aspects and applications // Prog. Lipid Res.2008. V. 46, No. l.P. 15-36.

8. Yetukuri L., Ekroos K., Vidal-Puig A., Oresic M. Informatics and computational strategies for the study of lipids // Mol. Biosyst. 2008. V. 4, No. 2. P. 121-127.

9. Fahy E., Subramaniam S., Murphy R.C., Raetz C.R., Shimitzu Т., Spener F., Meer G., Wakelam M.J., Dennis E.A. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids // J. Lipid Res. 2009. V. 50 Suppl. P. S9-S14.

10. Озернюк Н.Д. Температурные адаптации. M.: Изд-во МГУ, 2000. 205 стр.

11. Dowhan W. Molecular genetic approaches to defining lipid function // J. Lipid Res.2009. V. 50 Suppl. P. 305-310.

12. Koch A.L. The biophysics of the Gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1998. V. 24, No. 1. P. 23-59.

13. Plutz B.M., Lindner В., Stetter K.O., Hoist O. Characterization of a novel lipid A containing D-galacturonic acid that replaces phosphate residues. The structure of the lipid

14. A of the lipopolysaccharide from the hyperthermophilic bacterium Aquifex pyrophilus II J. Biol. Chem. 2000. V. 275, No. 15. P. 11222-11228.

15. Brakstad O.G., Bonaunet K. Biodegradation of petroleum hydrocarbons in seawater at low temperatures (0-5 degrees C) and bacterial communities associated with degradation // Biodegradation. 2006. V.17, No. 1. P. 71-82.

16. Harrison A.P. The acidophilic Thiobacillus and other acidophilic bacteria that share their habitat // Annu. Rev. Microbiol. 1984. V. 38. P. 265-292.

17. Koch A.L., Woeste S.W. The elasticity of the sacculus of Escherichia coli I I J. Bacterid. 1992. V. 174, No. 14 . P. 4811-4819.

18. Beveridge T.J. Structures of Gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles // J. Bacteriol. 1999. V. 181, No. 16. P. 4725-4733.

19. Gupta R.S. Protein phylogenies and signature sequences: a reappraisal of evolutionary relationships among archaebacteria, eubacteria, and eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62, No. 4. P. 1435-1491.

20. Hoiczuk E., Hansel A. Cyanobacterial cell walls: news from an unusual prokaryotic envelope // J. Bacteriol. 2000. V. 182, No. 5. P. 1191-1199.

21. Beveridge T.J. The periplasmic space and the concept of the periplasm in Gram-positive and Gram-negative bacteria // ASM News. 1995. V. 61. P. 125-130.

22. Raetz C.R.H., Reynolds C.M., Trent M.S., Bishop R.E. Lipid A modification systems in Gram-negative bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2007. V. 76. P. 295-329.

23. Beveridge T.J. Mechanism of gram variability in select bacteria // J. Bacteriol. 1990. V. 172, No. 3. P. 1609-1620.

24. Beveridge T.J., Schultze-Lam S. The response of selected members of the Archaea to the Gram stain // Microbiology. 1996. V. 142, No. 10. P. 2887-2895.

25. Salton M.R.J. The bacterial cell envelope a historical perspective // In: Ghuysen J.-M., Hakenbeck R. (Eds.) Bacterial cell wall. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier. 1994. P. 1-22.

26. Книрель Ю.А., Кочетков H.K. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия. 1993. Т. 58, № 2. С. 166-200.

27. Rietschel E.T., Brade H., Hoist O. Bacterial endotoxin: chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification // Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 1996. V. 216, No. 1. C. 39-81.

28. Brade H., Opal S.M. // In: Vogel S.N., Morrison D.C. (Eds.) Endotoxin in Health and Disease. New York: Marcel Dekker. 1999. 950 pp.

29. Lazar K.,Walker S. Substrate analogues to study cell-wall biosynthesis and its inhibition // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. V. 6, No. 6. P. 786-793.

30. Kennedy E.P., Rumley M.K. Osmotic regulation of biosynthesis of membrane-derived oligosaccharides in Escherichia coli И J. Bacteriol. 1988. V. 170, No. 6. P. 2457-2461.

31. Wu H.C. // In: Neidhardt F.C. (Ed.) Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. Washington, DC: Am. Soc. Microbiol. 1996. P. 1005-1014.

32. Raetz C.R.H. Molecular genetics of membrane phospholipid synthesis // Annu. Rev. Genet. 1986. V. 20. P. 253-295.

33. Cronan J.E. Bacterial membrane lipids: where do we stand // Annu. Rev. Microbiol. 2003. V. 57. P. 203-224.

34. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revised // Microbiol. Mol. Rev. 2003. V. 67, No. 4. P. 593-656.

35. Smit J., Kamio Y., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium-. chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants // J. Bacteriol. 1975. V. 124, No. 2. P. 942-958.

36. Kamio Y., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: accessibility of phospholipid head groups to phospholipase С and cyanogen bromide activated dextran in the external medium II Biochemistry. 1976. V. 15, No. 12. P. 2561-2570.

37. Shukla S.D., Green C., Turner J.M. Phosphatidylethanolamine distribution and fluidity in outer and inner membranes of the gram-negative bacterium Envinia carotovora II Biochem. J. 1980. V. 188, No. 1. P. 131-135.

38. Paul S., Chaudhuri K., Chatterjee A.N., Das J. Presence of exposed phospholipids in the outer membrane of Vibrio cholerae II J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138, No.4. P. 755761.

39. Peng D., Hong W., Choudhury B.P., Carlson R.W., Gu X.-X. Moraxella catarrhalis bacterium without endotoxin, a potential vaccine candidate // Infect. Immun. 2005. V. 73, No. 11. P. 7569-7577.

40. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. V. 49, No. 1. P: 1-32.

41. Leive L. Release of lipopolysaccharide by EDTA treatment of E. coli II Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1965. V. 21, No. 4. P. 290-296:

42. Vaara M. Antibiotic-supersusceptible mutants of Escherichia coli and: Salmonella ty-phimurium // Antimicrob. Agents Chemother. 1993. V. 37, No. 11. P. 2255-2260.

43. Lysko P.G., Morse S.A. Neisseria gonorrhoeae cell envelope permeability to hydrophobic molecules III. Bacterid. 1981. V. 145, No. 2. P. 946-952.

44. Huijbregts R.P:H., de Kroon A.I.P.M., de Kruijff B. Topology and transport of membrane lipids in bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1469, No. 1. P. 43-61.

45. Dowhan W. Genetic analysis of lipid-protein interactions in Escherichia coli membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1376, No. 3. P. 455-466.

46. Rietveld A.G., Killian J;A., Dowhan W., de bCruijff B. Polymorphic regulation of membrane phospholipid composition in Escherichia coli //J. Biol.Chem. 1993. V. 268, No. 17. P. 12427-12433.

47. Lugtenberg В., van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other gram-negative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1983; V. 737, No. 1. P. 51-115.

48. Correa O.S., Rivas Е.А., Barneix A.J. Cellular envelopes and tolerance to acid pi I in Mesorhizobium loti И Current Microbiol. 1999. V. 38; No. 2. P. 329-334.

49. Tornabene T.G. Lipid composition of selected strains of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis И Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 306, No. 2. P. 173-185:

50. Rodionov D.G., Ishiguro E.E. Dependence of peptidoglycan metabolism on phospholipid synthesis during growth of Escherichia coli II Microbiology-UK. 1996. V. 142, No. 10. P. 2871-2877.

51. Ohta Т., Okuda S., Takahashi H. Relationship between phospholipid compositions and transport activities of amino acids in Escherichia coli membrane vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 466, No. 1. P. 44-56.

52. Mikhaleva N.I., Santini C.L., Giordano G., Nesmeyanova M.A. Requirement for phospholipids of the translocation of the trimethylamine N-oxide reductase througth the Tat pathway in Escherichia coli IIFEBS Lett. 1999. V. 463, No. 3. P. 331-335.

53. Rietveld A.D., Koorengevel M.C., de Kruijff B. Non-bilayer lipids are required for efficient protein transport across the plasma membrane of Escherichia coli II EMBO J. 1995. V. 14, No. 22. P. 5506-5513.

54. Pugsley A.P., Cole S.T. An unmodified form of the ColE2 lysis protein, an envelope lipoprotein, retains reduced ability to promote colicin E2 release and lysis of producing cells // J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133, No. 9. P. 2411-2420.

55. Gmeiner J., Schlecht S. Molecular organization of the outer membrane of Salmonella typhimurium И Eur. J. Biochem. 1979. V. 93, No. 2. P. 609-620.

56. Yao X., Jericho M., Pink D., Beveridge T.J. Thickness and elasticity of gram-negative murein sacculi measured by atomic force microscopy // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181, No. 22. P. 6865-6875.

57. Luderitz O., Ruschmann E., Westphal O., Raff R., Wheat R. Occurrence of 3-amino-3,6-dideoxyhexoses in Salmonella and related bacteria // J. Bacteriol. 1967. V. 93, No. 5. P. 1681-1687.

58. Moran A.P., Prendergast M.M., Appelmelk B.J. Molecular mimicry of host structures by bacteria lipopolysaccharides and its contribution to disease // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. V. 16, No. 2. P. 105-115.

59. Frosch M., Muller A. Phospholipid substitution of capsular polysaccharides and mechanisms of capsule formation in Neisseria meningitidis group В // Mol. Microbiol. 1993. V. 8, No. 3. P. 483-493.

60. Yeh H.Y., Jacobs D.M. Characterization of lipopolysaccharide fractions and their interactions with cells and model membranes // J. Bacteriol. 1992. V. 174, No. 1. P. 336341.

61. Barua S., Yamashino Т., Hasegawa Т., Yokoyama K., Torii K., Ohta M. Involvement of surface polysaccharides in organic acid resistance of Shiga toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 // Mol. Microbiol. 2002. V. 43, No. 3. P. 629-640.

62. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. V. 4, No 12. P. 495-503.

63. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides — themes and variations // Prog. Lipid Res. 1996. V. 35, No. 3. P. 283-343.

64. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. V. 7, No. 3. P. 167-202.

65. Schnaitman C.A., Klena J.D. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria // Microbiol. Rev. 1993. V. 57, No. 3. P. 655-682.

66. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 635-700.

67. Heinrichs D.E., Yethon J.A., Whitfield C. Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica И Mol. Microbiol. 1998. V. 30, No 2. P. 221-232.

68. Bos M.P., Robert V., Tommassen J. Biogenesis of the gram-negative bacterial outer membrane // Annu. Rev. Microbiol. 2007. V. 61. P. 191-214.

69. Trent M.S. Biosynthesis, transport, and modification of lipid A // Biochem. Cell Biol. 2004. V. 82, No. 1. P. 71-86.

70. Westphal O., Liideritz O. Chemische erfoschung von lipopolysacchariden gram-negativer bacterien // Angew. Chem. 1954. B. 66. S. 407-417.

71. Gmeiner J., Simon M., Liideritz O. The linkage of phosphate group and 2-keto-3-deoxyoctonate to the lipid A component in a Salmonella minnesota lipopolysaccharide //Eur. J. Biochem. 1971. V. 21, No. 3. P. 355-356.

72. Galloway S.W., Raetz C.R.H. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265, No. 11. P. 6394-6402.

73. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Быстрый способ получения липида А из бактерии Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 1999. Т. 29, № 4. С. 293-298.

74. Hamidi A.E., Tirsoaga A., Novikov A., Hussein A., Caroff M. Microextraction of bacterial lipid A: easy and rapid method for mass spectrometric characterization // J. Lipid Res. 2005. V. 46, No. 8. P. 1773-1778.

75. Gmeiner J., Liideritz O., Westphal O. Biochemical studies on lipopolysaccharides of Salmonella R mutants. 6. Investigation on the structure of the lipid A component // Eur. J. Biochem. 1969. V. 7, No. 3. P. 370-379.

76. Wilkinson B.J., Hindahl M.S., Galbraith L., Wilkinson S.G. Lipopolysaccharide of Paracoccus denitrificans ATCC 13543 // FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 37, No. 1. P. 63-67.

77. Sledjeski D.D., Weiner R.M. Hyphomonas spp., Shewanella spp., and other marine bacteria lack heterogeneous (ladderlike) lipopolysaccharides // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57, No. 7. P. 2094-2096.

78. Strain S.M., Fesik S.W., Armitage I.M. Characterization of lipopolysaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance // J. Biol. Chem. 1983. V. 258, No. 5. P. 2906-2910.

79. Guan Z., Breazeale S.D., Raetz C.R.H. Extraction and identification by mass spectrometry of undecaprenyl diphosphate-MurNAc-pentapeptide-GlcNAc from Escherichia coli II Anal. Biochem. 2005. V. 345, No. 2. P. 336-339.

80. Qureshi N., Takayama K., Heller D., Fenselau C. Position of ester groups in the lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. 1983. V. 258, No. 12. P. 12947-12951.

81. Chain S., Reinhold V.N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry // Anal. Biochem. 1994. V. 218, No. l.P. 63-73.

82. Johnson R.S., Her G.-R., Grabarek J., Hawiger J., Reinhold V.N. Structural characterisation of monophosphoryl lipid A homologs obtained from Salmonella minnesota Re595 lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 1990. V. 265, No. 14. P. 8108-8116.

83. Radziejewska-Lebrecht J., Bhat U.R., Brade H., Mayer H. Structural studies on the core and lipid A region of a 4-amino-L-arabinose-lacking Rc-type mutant of Proteus mirabi-lisll Eur. J. Biochem. 1988. V. 172, No. 3.P. 535-541.

84. Steeghs L., de Cock H., Evers E., Zomer В., Tommassen J., van der Ley P. Outer membrane composition of a lipopolysaccharide-deficient Neisseria meningitidis mutant // EMBO J. 2001.V. 20, No. 24. P. 6937-6945.

85. Meredith T.C., Aggarwal P., Mamat U., Lindner B.,Woodard R.W. Redefining the requisite lipopolysaccharide structure in Escherichia coli II ACS Chem. Biol. 2006. V. 1, No. l.P. 33-42.

86. Belunis C.J., Clementz Т., Carty S.M., Raetz C.R.H. Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and cell-growth following inactivation of the KdtA gene in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1995. V. 270, No. 46. P. 27646-27652.

87. Radika K., Raetz C.R.H. Purification and properties of lipid A disaccharide synthase of Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1988. V. 263, No. 29. P. 14859-14867.

88. Babinski K.J., Ribeiro A.A., Raetz C.R.H. The Escherichia coli gene encoding the UDP-2,3-diacylglucosamine pyrophosphatase of lipid A biosynthesis // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, No. 29. P. 25937-25946.

89. Babinski K.J., Kanjilal S J., Raetz C.R.H. Accumulation of the lipid A precursor UDP-2,3-diacylglucosamine in an Escherichia coli mutant lacking the lpxH gene // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, No. 29. P. 25947-25956.

90. Bulawa C.E., Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin. Identification and function of UDP-2,3-diacylglucosamine in Escherichia coli H J. Biol. Chem. 1984. V. 259, No. 8. P. 4846-4851.

91. Ray B.L., Painter G., Raetz C.R.H. The biosynthesis of Gram-negative endotoxin. Formation of lipid A disaccharides from monosaccharide precursors in extracts of Escherichia coli Hi. Biol. Chem. 1984. V. 259, No. 8. P. 4852-4859.

92. Ray B.L., Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin. A novel kinase in Escherichia coli membranes that incorporates the 4'-phosphate of lipid A // J. Biol. Chem. 1987. V. 262, No. 3. P. 1122-1128.

93. Garrett T.A., Kadrmas J.L., Raetz C.R.H. Identification of the gene encoding the Escherichia coli lipid A 4-kinase. Facile phosphorylation of endotoxin analogs with recombinant lpxK // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, No. 35. P. 21855-21864.

94. Brozek K.A., Hosaka K., Robertson A.D., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipopolysac-charide in Escherichia coli. Cytoplasmic enzymes that attach 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid to lipid A // J. Biol. Chem. 1989. V. 264, No. 12. P. 6956-6966.

95. Gronow S., Brade H. Lipopolysaccharide biosynthesis: which steps do bacteria need to survive? // J. Endotoxin Res. 2001. V. 7, No. 1. P. 3-23.

96. Meredith T.C., Woodard R.W. Escherichia coli YrbH is a D-arabinose 5-phosphate isomerase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278, No. 35. P. 32771-32777.

97. Sperandeo P., Pozzi C., Deho G., Polissi A. Non-essential KDO biosynthesis and new essential cell envelope biogenesis genes in the Escherichia coli yrbG-yhbG locus // Res. Microbiol. 2006. V. 157, No. 6. P. 547-558.

98. White K.A., Kaltashov I.A., Cotter R.J., Raetz C.R.H. A mono-functional 3-deoxy-D-wawwo-octulosonic acid (Kdo) transferase and a Kdo kinase in extracts of Haemophilus influenzae II J. Biol. Chem. 1997. V. 272, No. 26. P. 16555-16563.

99. Belunis C.J., Mdluli K.E., Raetz C.R.H, Nano F.E. A novel Ъ-д&оху-О-таппо-octulosonic acid transferase from Chlamydia trachomatis required for expression of the genus-specific epitope // J. Biol. Chem. 1992. V. 267, No. 26. P. 18702-18707.

100. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate // J. Biol. Chem. 1990. V. 265, No. 26. P. 15410-15417.

101. Tharanathan R.N., Weckesser J., Mayer H. Structural studies on the D-arabinose-containing lipid A from Rhodospirillum tenue 2761 // Eur. J. Biochem. 1978. V. 84, No. 2. P. 385-394.

102. Hoist O., Borowiak D., Weckesser J., Mayer H. Structural studies on the phosphate-free lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100 // Eur. J. Biochem. 1983. V. 137,No. l.P. 325-332.

103. Urbanik-Sypniewska Т., Seydel U., Greek M., Weckesser J., Mayer H. Chemical studies on the lipopolysaccharide of Rhizobium meliloti 10406 and its lipid A region // Arch. Microbiol. 1989. V. 152, No. 4. P. 527-532.

104. Roppel J., Mayer H., Weckesser J. Identification of a 2,3-diamino-2,3-dideoxyhexose in the lipid A component of lipopolysaccharides of Rhodopseudomonas viridis and Rhodopseudomonas palustris // Carbohydr. Res. 1975. V. 40, No. 1. P. 31-40.

105. Choma A., Sowinski P. Characterization of Mesorhizobium huakuii lipid A containing both D-galacturonic acid and phosphate residues // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271, No. 7. P. 1310-1322.

106. Wilkinson S.G., Taylor D.P. Occurrence of 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose in lipid A from lipopolysaccharide of Pseudomonas diminuta // J. Gen. Microbiol. 1978. V. 109, No. 2. P. 367-370.

107. Carrion M., Bhat U.R., Reuhs В., Carlson R.W. Isolation and characterization of the lipopolysaccharides from Bradyrhizobium japonicum И J Bacterid. 1990. V. 172, No. 4. P. 1725-1731.

108. Rae H., Seydel U., Freudenberg M., Weckesser J., Mayer H. Lipopolysaccharide Rhodospirillum salinarium 40: structural studies on the core and lipid A region // Arch. Microbiol. 1996. V. 164. P. 280-289.

109. Kato H., Iida Т., Haishima Y., Tanaka A., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum lipopolysaccharide // J. Bacteriol. 1998. V. 180, No. 15. P. 3891-3899.

110. Moran A.P. Biological and serological characterization of Campylobacter jejuni lipopolysaccharides with deviating core and lipid A structures // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. V. 11, No. 2. P. 121-130.

111. Ahamed N.M., Mayer H., Biebl H., Weckesser J. Lipopolysaccharide with 2,3-diamino-2,3-dideoxyglucose containing lipid A in Rhodopseudomonas sulfoviridis II FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 14, No. 1. P. 27-30.

112. Bellmann W., Lingens F. Structural studies on the core oligosaccharide of Phenylobac-terium immobile strain K2 lipopolysaccharide. Chemical synthesis of 3-hydroxy-5c-dodecenoic acid // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1985. V. 366, No. 6. P. 567-575.

113. Salimath P., Weckesser J., Strittmatter W., Mayer H. Structural studies on the nontoxic lipid A from Rhodopseudomonas spaeroides ATCC 17023 // Eur. J. Biochem. 1983. V. 136, No. 1. P. 195-200.

114. Masoud H., Lindner В., Weckesser J., Mayer H. The structure of lipid A component of Rhodocyclus gelatinosus Dr2 // System. Appl. Microbiol. 1990. V. 13, No. 3. P. 227233.

115. Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4 // Eur. J. Biochem. 1989. V. 180. No. 3. P. 519-526.

116. Pietsch K., Weckesser J., Fischer U., Mayer H. The lipopolysaccharides of Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum molischianum, and Rhodophila globiformis II Arch. Microbiol. 1990. V. 154, No. 5. P. 433-437.

117. Mayer H., Bock E., Weckesser J. 2,3-Diamino-2,3-dideoxyglucose containing lipid A in the Nitrobacter strain X14 // FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 17, No. 1-3. P. 93-96.

118. Moran A.P., Lindner В., Walsh E.J. Structural characterization of the lipid A component of Helicobacter pylori rough- and smooth-form lipopolysaccharides // J. Bacteriol. 1997. V. 179, No. 20. P. 6453-6463.

119. Weintraub A., Zahringer U., Wollenweber H.-W., Seydel U., Rietschel E.T. Structural characterization of the lipid A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1989. V. 183, No. 2. P. 425-431.

120. Hashimoto M., Asai Y., Tamai R., Jinno Т., Umatani K., Ogawa T. Chemical structure and immunobiological activity of lipid A from Prevotella intermedia ATCC 25611 lipopolysaccharide // FEBS Lett. 2003. V. 543, No. 1-3. P. 98-102.

121. Wang X., Ribeiro A.A., Guan Z., McGrath S., Cotter R., Raetz C.R.H. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida // Biochemistry. 2006. V. 45, No. 48. P. 14427-14440.

122. Воробьева, E.B., Дмитренок A.C., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Красикова И.Н.,

123. Соловьева Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Marinoтmonas communis АТСС 271181 // Биоорган. химия. 2005. Т. 31, № 4. С. 404-413.

124. Kumada H., Haishima Y., Umemoto Т., Tanamoto K. Structural study on the free lipid A isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis II J. Bacteriol. 1995. V. 177, No. 8. P. 2098-2106.

125. Silipo A., Lanzetta R., Garozzo D., Cantore P.L., Iacobellis N. S., Molinaro A., Parrilli M., Evidente A. Structural determination of lipid A of the lipopolysaccharide from Pseudomonas reactans И Eur. J. Biochem. 2002. V. 269, No. 10. P. 2498-2505.

126. Ray M.K., Kumar G.S., Shivaji S. Phosphorylation of lipopolysaccharides in the Antarctic psychotroph Pseudomonas syringae: a possible role in temperature adaptation // J. Bacteriol. 1994. V. 176, No. 14. P. 4243-4249.

127. Wang X., McGrath S.C., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Expression cloning and periplasmic orientation of the Francisella novicida lipid A 4'-phosphatase LpxF // J. Biol. Chem. 2006. V. 281, No. 14. P. 9321-9330.

128. Wang X., Ribeiro A.A., Guan Z., Abraham S.N., Raetz C.R.H. Attenuated virulence of a Francisella mutant lacking the lipid A 4-phosphatase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104, No. 10. P. 4136-4141.

129. Huber R., Langworthy T.A., Konig H., Thomm M., Woese C.R., Sleytr U.B., Stetter K.O. Thermotoga maritima sp. nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90 °C // Arch. Microbiol. 1986. V. 144. P. 324-333.

130. Lehmann V., Redmond J., Egan A., Minner I. The acceptor for polar head groups of the lipid A component of Salmonella lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1978. V. 86, No. 2. P. 487-496.

131. Volk W.A., Galanos C., Ltideritz O. The occurrence of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose as a constituent in Salmonella lipopolysaccharide preparations // Eur. J. Biochem. 1970. V. 17, No. 2. P. 223-229.

132. Soncini F.C., Groisman E.A. Two-component regulatory systems can interact to process multiple environmental signals // J. Bacteriol. 1996. V. 178, No. 23. P. 6796-6801.

133. Gunn J.S., Miller S.I. PhoP-PhoQ activates transcription of pmrAB, encoding a two-component regulatory system involved in Salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance //J. Bacteriol. 1996. V. 178, No. 23. P. 6857-6864.

134. Gunn J.S., Lim K.B., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resistance // Mol. Microbiol. 1998. V. 27, No. 6. P. 1171-1182.

135. Groisman E.A., Kayser J., Soncini F.C. Regulation of polymyxin resistance and adaptation to low-Mg2+ environments // J. Bacteriol. 1997. V. 179, No. 22. P. 7040-7045.

136. Gibbons H.S., Kalb S.R., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Role of Mg2+ and pH in the modification of Salmonella lipid A after endocytosis by macrophage tumour cells // Mol. Microbiol. 2005. V. 55, No. 2. P. 425^140.

137. Guo L., Lim K.B., Gunn J.S., Bainbridge В., Darveau R.P., Hackett M., Miller S.I. Regulation of lipid A modifications by Salmonella typhimurium virulence genes phoP-phoQ // Science. 1997. V. 276, No. 5310. P. 250-253.

138. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner В., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature // Infect. Immun. 2002. V. 70, No. 8. P. 4092-4098.

139. Kim S.H., Jia W., Parreira V.R., Bishop R.E., Gyles C.L. Phosphoethanolamine substitution in the lipid A of Escherichia coli 0157 : H7 and its association with PmrC // Microbiology. 2006. V. 152, No. 3. P. 657-666.

140. Suda Y., Ogawa Т., Kashihara W., Oikawa M., Shimoyama Т., Hayashi Т., Tamura Т., Kusumoto S. Chemical structure of lipid A from Helicobacter pylori strain 206-1 lipopolysaccharide//J. Biochem. 1997. V. 121, No. 6. P. 1129-1133.

141. Hase S., Rietschel E.T. The chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides from Chromobacterium violaceum NCTC 9694 // Eur. J. Biochem. 1977. V. 75, No. l.P. 23-34.

142. Marr N., Tirsoaga A., Blanot D., Fernandez R., Caroff M. Glucosamine found as a sub-stituent of both phosphate groups in Bordetella lipid A backbones: role of a BvgAS-activated ArnT ortholog // J. Bacteriol. 2008. V. 190, No. 12. P. 4281-4290.

143. Rietschel E.T. Absolute configuration of 3-hydroxy fatty acids present in lipopolysaccharides from various bacterial groups // Eur. J. Biochem. 1976. V. 64, No. 2. P. 423428.

144. Bishop D.G., Hewett M.J., Knox K.W. Occurrence of 3-hydroxytridecanoic and 3-hydroxypentadecanoic acids in the lipopolysaccharides of Veillonella II Biochim. Bio-phys. Acta. 1971. V. 231, No. 2. P. 274-276.

145. Wilkinson S.G., Caudwell P.F. Lipid composition and chemotaxonomy of Pseudomo-nas putrefactions (Alteromonas putrefactions) // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118, No. 2. P. 329-241.

146. Choma A. Fatty acid composition of Mesorhizobium huakuii lipopolysaccharides. Identification of 27-oxooctacosanoic acid // FEMS Microbiol. Lett 1999. V. 177, No. 2. P. 257-262.

147. Iida Т., Haishima Y., Tanaka A., Nishiyama K., Saito S., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Comamonas testosteroni lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1996. V. 237, No. 5. P. 468-475.

148. Masoud H., Urbanik-Sypniewska Т., Lindner В., Weckesser J., Mayer H. The structure of the lipid a component of Sphaerotilus natants II Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 167-175.

149. Bryn K., Rietschel E.T. L-2-Hydroxytetradecanoic acid as a constituent of Salmonella lipopolysaccharides (lipid A) // Eur. J. Biochem. 1978. V. 86, No. 2. P. 311-315.

150. Gibbons H.S., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Oxygen requirement for the biosynthesis of the S-2-hydroxymyristate moiety in Salmonella typhimurium lipid A // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, No. 42. P. 32940-32949.

151. Guo L., Lim K.B., Poduje C.M. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides // Cell. 1998. V. 95, No. 2. P. 189-198.

152. Arata S., Hirayama Т., Kasai N., Itoh Т., Ohsawa A. Isolation of 9-hydroxy-(delta-tetradecalactone from lipid A of Pseudomonas diminuta and Pseudomonas vesicularis II FEMS Microbiol. Lett 1989. V. 51, No. 1. P. 219-222.

153. Bhat U.R., Mayer.H., Yokota A., Hollingsworth R.I., Carlson R.W. Occurrence of lipid A variants with 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from members of the family Rhizobiaceae II J. Bacteriol. 1991. V. 173, No. 7. P. 2155-2159.

154. Vedam V., Kannenberg E.L., Haynes J.G., Sherrier D.J., Datta A., Carlson R.W. A Rhizobium leguminosarum AcpXL mutant produces lipopolysaccharide lacking 27-hydroxyoctacosanoic acid // J. Bacteriol. 2003. V. 185, No. 6. P. 1841-1850.

155. Carlson R.W., Busch M., Mayer H. Distribution and phylogenetic significance of 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from bacteria belonging to the a-2 subgroup of Proteobacteria // J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41, No. 2. P. 213-217.

156. Kropinski A.M.B., Lewis V., Berry D. Effect of growth temperature on the lipids, outer membrane proteins, and lipopolysaccharides of Pseudomonas aeruginosa РАО // J. Bacteriol. 1987. V. 169, No. 5. P. 1960-1966.

157. Kumar G.S., Jagannadham M.V., Ray M.K. Low-temperature-induced changes in composition and fluidity of lipopolysaccharides in the antarctic psychrotrophic bacterium Pseudomonas syringae II J. Bacteriol. 2002. V. 184, No. 23. P. 6746-6749.

158. Tegtmeyer В., Weckesser J., Mayer H., Imhoff J.F. Chemical composition of the lipopolysaccharides of Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas acidophila, and Rhodopseudomonas blastica II Arch. Microbiol. 1985. V. 143, No. LP. 32-36.

159. Rottem S., Markowitz O., Rasin S. Thermal regulation of the fatty acid composition of lipopolysaccharides and phospholipids of Proteus mirabilis II Eur. J. Biochem. 1978. V. 85, No. 2. P. 445-450.

160. Aussel L., Therisod H., Karibian D., Perry M.B., Bruneteau M., Caroff M. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species // FEBS Lett. 2000. V. 465, No. l.P. 87-92.

161. Carty S.M., Sreekumar K.R., Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli. Induction at 12 °C of an acyltransferase specific for palmitoleyla-cyl carrier protein // J. Biol. Chem. 1999. V. 274, No. 14. P. 9677-9685.

162. Wollenweber H.-W., Schlecht S., Luderitz O., Rietschel E.T. Fatty acid in lipopolysaccharides of Salmonella species grown at low temperature: identification and position. //Eur. J. Biochem. 1983. V. 130, No. 1. P. 167-171.

163. Zhou Z., White K.A., Polissi A., Georgopoulos C., Raetz C.R.H. Function of Escherichia coli MsbA, an essential ABC family transporter, in lipid A and phospholipid biosynthesis // J. Biol. Chem. 1998. V. 273, No. 20. P. 12466-12475.

164. Caroff M., Aussel L., Zarrouk H., Perry M.B., Karibian D. Contribution of 252Cf-plasma desorption mass spectrometry to structural analysis of lipids A: examples of non-conservatism in lipid A structure // J. Endotoxin Res. 1999. V. 5, No. 1. P. 86-89.

165. Rund S., Lindner В., Hoist O. Structural analysis of the lipopolysaccharide from Chlamydophilapsittaci strain 6BC // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267, No. 18. P. 57175726.

166. Murphy R.C., Raetz C.R.H., Reynolds C.M., Barkley R.M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo(2)-lipid A // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2005. V. 77, No. 1. P. 131-140.

167. Bath U.R., Kontrohr Т., Mayer H. Structure of Shigella sonnei lipid A // FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 40, No. 2. P. 189-192.

168. Moran A.P., O'Malley D.T., Kosunen T.U., Helander I.M. Biochemical characterization of Campylobacter fetus lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1994. V. 62, No. 9. P. 3922-3929.

169. Makimura Y., Asai Y., Sugiyama A., Ogawa T. Chemical structure and immunobi-ological activity of lipid A from Serratia marcescens LPS // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56, No. 11. P. 1440-1446.

170. Mohan S., Raetz C.R.H. Endotoxin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa: enzymatic incorporation of laurate before 3-deoxy-D-manno-octulosonate // J. Bacteriol. 1994. V. 176, No. 22. P. 6944-6951.

171. Tsukioka D., Nishizawa Т., Miyase Т., Achiwa K., Suda Т., Soma G.-I., Mizuno D. Structural characterization of lipid A obtained from Pantoea agglomerans lipopolysac-charide // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 149, No. 2. P. 239-244.

172. Helander I.M., Hirvas L., Touminen J., Vaara M. Preferential synthesis of heptaacyl lipopolysaccharide by the ssc permeability mutant of Salmonella typhimurium I I Eur. J. Biochem. 1992. V. 204, No. 3. P. 1101-1106.

173. Bishop R.E., Gibbons H.S., Guina Т., Trent M.S., Miller S.I., Raetz C.R.H. Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of Gram-negative bacteria // EMBO J. 2000. V. 19, No. 19. P. 5071-5080.

174. Gibbons H.S., Kalb S.R., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Role of Mg2+ and pH in the modification of Salmonella lipid A after endocytosis by macrophage tumour cells // Mol. Microbiol. 2005. V. 55, No. 2. P. 425-440.

175. Winfield M.D., Groisman E.A. Phenotypic differences between Salmonella and Escherichia coli resulting from the disparate regulation of homologous genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101, No. 49. P. 17162-17167.

176. Bishop R.E. The lipid A palmitoyltransferase PagP: molecular mechanisms and role in bacterial pathogenesis // Mol. Microbiol. 2005. V. 57, No. 4. P. 900-912.

177. Pilione M.R., Pishko E.J., Preston A., Maskell D.J., Harvill E.T. pagP is required for resistance to antibody-mediated complement lysis during Bordetella bronchiseptica respiratory infection // Infect. Immun. 2004. V. 72, No. 5. P. 2837-2842.

178. Rebeil R, Ernst R.K., Gowen B.B., Miller S.I., Hinnebusch B.J. Variation in lipid A structure in the pathogenic yersiniae // Mol Microbiol. 2004, V. 52, No. 5. P. 1363— 1373.

179. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Хотимченко C.B., Соловьева Т.ф. Влияние температуры роста и плазмиды pVM82 на жирнокислотный состав липида А Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия 1999. Т. 64, № 4. С. 404-411.

180. Красикова И.Н., Капустина H.B., Исаков B.B., Горшкова Н.М., Соловьева Т.Ф. Установление структуры липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis АТСС 14393 // Биоорган, химия. 2004. Т. 30, №. 4. С. 409-416.

181. Caroff М., Deprun С., Richards J.C., Karibian D. Structural characterization of the lipid A of Bordetella pertussis 1414 endotoxin // J. Bacteriol. 1994. V. 176, No. 16. P. 5156-5159.

182. Corsaro M.M., Dal Piaz F., Lanzetta R., Naldi Т., Parrilli M. Structure of lipid A from Pseudomonas corrugata by electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004. V. 18. P. 853-858.

183. Somerville J.E., Cassiano L., Bainbridge B. Cunningham M.D., Darveau R.P. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an anti-inflammatory lipopolysaccharide // J. Clin. Invest. 1996. V. 97, No. 2. P. 359-365.

184. Reynolds C.M., Ribeiro A.A., McGrath S.C., Cotter R.J., Raetz C.R.H., Trent M.S. An outer membrane enzyme encoded by Salmonella typhimurium IpxR that removes the 3'-acyloxyacyl moiety of lipid A // J. Biol. Chem. 2006. V. 281, No. 31. P. 21974-21987.

185. Qureshi N., Takayama K., Ribi E. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium И J. Biol. Chem. 1982. V. 257, No. 19. P. 11808-11815.

186. Basu S.S., White K.A., Que N.L., Raetz C.R.H. A deacylase in Rhizobium legumino-sarum membranes that cleaves the 3-0-linked beta-hydroxymyristoyl moiety of lipid A precursors // J. Biol. Chem. 1999. V. 274, No. 16. P. 11150-11158.

187. Ernst R.K., Guina Т., Miller S.I. How intracellular bacteria survive: surface modifications that promote resistance to host innate immune responses // J Infect Dis. 1999. V. 179, No. 2. P. 326-330.

188. Oyston P.C. Francisella tularensis: unravelling the secrets of an intracellular pathogen // J. Med. Microbiol. 2008. V. 57, No. 8. P. 921-930.

189. Zarrouk H., Karibian D., Bodie S., Perry В., Richards J.C., Caroff M. Structural characterization of the lipids A of three Bordetella bronchiseptica strains: variability of fatty acid substitution // J. Bacteriol. 1997. V. 179, No. 11. P. 3756-3760.

190. Mattsby-Baltzer I., Mielniczuk Z., Larson L., Lindgren K., Goodwin S. Lipid A in Helicobacter pylori // Infect. Immun. 1992. V. 60, No. 10. P. 4383-4387.

191. Trent M.S., Stead C.M., Tran A.X., Hankis J.V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis // J. Endotoxin Res. 2006. V. 12, No. 4. P. 205-223.

192. Schultz C.P., Wolf V., Lange R., Mertens E., Wecke J., Naumann D., Zahringer U. Evidence for a new type of outer membrane lipid in oral spirochete Treponema denti-cola II J. Biol. Chem. 1998. V. 273, No. 25. P. 15661-15666.

193. Fraser C.M., Norris S.J., Weinstock G.M., White O., Sutton G.G., Dodson R., Gwinn M., Hickey E.K., Clayton R., Ketchum K.A., Sodergren E., Hardham J.M., McLeod

194. Kawasaki S., Moriguchi R., Sekyya K., Nakai Т., Ono E., Kume K., Kawahara K. The cell envelope structure of the lipopolysaccharide-lacking gram-negative bacterium Sphingomonaspaucimobilis И J. Bacteriol. 1994. V. 176, No. 2. P. 284-290.

195. Naka Т., Fujiwara N., Yabuuchi E., Doe M., Kobayashi K., Kato Y., Yano I. A novel sphingoglycolipid containing galacturonic acid and 2-hydroxy fatty acid in cellular lipids of Sphingomonas yanoikyuae II J. Bacteriol. 2000. V. 251, No. 9. P. 2660-2663.

196. Abbanat D.R., Godchaux W., Ill, Leadbetter E.R. Surface-induced synthesis of new sulfonolipids in the gliding bacterium Cytophaga johnsonae И Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 358-364.

197. Wilkinson B.J., Sment K.A., Mayberry W.R. Occurrence, localization, and possible significance of an ornitin-containing lipid in Paracoccus denitrijicans II Arch. Microbiol. 1982. V. 131. P. 338-343.

198. Wilkinson S.G. Gram-negative bacteria // In: Ratledge C., Wilkinson S.G. (Eds.) Microbial lipids, Vol 1. London, United Kingdom: Academic Press, Ltd. 1988. P. 299488.

199. Steeghs L., Den Hartog R., Den Boer A., Zomer В., Roholl P., Van der Ley P. Meningitis bacterium is viable without endotoxin // Nature. 1998. V. 392, No. 2. P. 449-450.

200. Beutler В., Rietschel E.T. Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin // Nat. Rev. ImmunoL 2003. V. 3, No. 2. P 169-176.

201. Rudbach J.A., Akiya F.I., Elin R.J., Hochstein H.D., Luoma M.K., Milner C.B., Milner K.C., Thomas K.R. Preparation and properties of a national reference endotoxin // J. Clin. Microbiol. 1976. V. 3, No. 1. P. 21-25.

202. Nowotny A. Molecular aspects of endotoxic reactions // Bacteriol. Rev. 1960. V. 34, No. 2. P. 72-98.

203. Moran A. Structure-bioactivity relationships of bacterial endotoxins // J. Toxicol. -Toxin Rev. 1995. V. 14, No. 1. P. 47-83.

204. Ribi E. Beneficial modification of the endotoxin molecule // J. Biol. Response Mod. 1984. V. 3,No. l.P. 1-9.

205. Tanamoto K., Kato H., Haishima Y., Azumi S. Biological properties of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. V. 8, No. 3. P. 522-527.

206. Flad H.-D., Loppnow H., Rietschel E.T., Ulmer A.J. Agonists and antagonists for lipopolysaccharide-induced cytokines // Immunobiology 1993. V. 187, No. 3-5. P. 303316.

207. Tanamoto K., Azumi S. Salmonella-type heptaacylated lipid A is inactive and acts as an antagonist of LPS action on human line cells // J. Immunol. 2000. V. 164, No. 6. P. 3149-3156.

208. Strittmatter W., Weckesser J., Salimath P.V., Galanos C. Nontoxic lipopolysaccharide from Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023 // J. Bacteriol. 1983. V. 155, No. l.P. 153-158

209. Golenbock D.T., Randolph Y., Hampton Q., Qureshi N., Takayama K., Raetz C.R.H. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes 1П. Biol. Chem. 1991. V. 266, No. 29. P. 19490-19496.

210. Muotiala A., Helander I.M., Pyhala L., Kosunen T.U., Moran A.P. Low biological activity of Helicobacter pylori lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1992. V. 60, No. 4. P. 1714-1716.

211. Tanamoto K. Production of nontoxic lipid A by chemical modification and its antagonistic effect on LPS action // Prog. Clin. Biol. Res. 1998. V. 397, No. 3. P. 269-280.

212. Nair B.C., Mayberry W.R., Dziak R., Chen P.B., Levine M.J., Hausmann E. Biological effects of a purified lipopolysaccharide from Bacteroides gingivalis II J. Periodont. Res. 1983. Y. 18, No 1. P. 40-49.

213. Asai N., Arata S., Hashimo J., Akiyama Y., Tanaka C., Egawa K., Tanaka S. Pseudomonas diminuta LPS with a new endotoxic lipid A structure // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 142, No. 3. P. 972-978.

214. Chase J.J., Kubey W., Dulen M.H., Holmes C.J., Salit M.G., Pearson F.C., III, Ribi E. Effect of monophosphoryl lipid A on host resistance to bacterial infection // Infect. Immun. 1986. V. 53, No. 3. P. 711-712.

215. Matsuura M., Kiso M., Hasegawa A. Activity of monosaccharide lipid A analogues in human monocytic cells as agonists or antagonists of bacterial lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1999. V. 67, No. 12. P. 6286-6292.

216. Proctor A.R., Will J.A., Burhop K.E., Raetz C.R.H. Protection of mice against lethal endotoxemia by a lipid A precursor // Infect. Immun. 1986. V. 52, No. 3. P. 905-907.

217. Loppnow H., Brade H., Durrbaum I., Dinarello C.A., Kusumoto S., Rietschel E.T., Flad H.-D. Interleukin 1 induction-capacity of defined lipopolysaccharide partial structures // J. Immunol. 1989. V. 142, No. 9. P. 3229-3238.

218. Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. 2003. V. 348, No. 2. P. 138-150.

219. Opal S.M. The host response to endotoxin, anti-lipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis // Int. J. Med. Microbiol. 2007. V. 297, No. 5. P. 365-377.

220. Opal S.M., DePalo V.A. Anti-inflammatory cytokines // Chest. 2000. V. 117, No. 4. P. 1162-1172.

221. Angus D.C., Linde-Zwirble W.T., Lidicker J., Clermont G., Pinsky M.R. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care// Crit. Care Med. 2001. V. 29, No. 7. P. 1303-1310.

222. Шевченко Ю.Л., Онищенко Г.Г. Микроорганизмы и человек. Некоторые особенности их взаимососуществования на современном этапе // Журн. Микробиол. 2001. №2. С. 94-104.

223. Cohen J. The immunopathogenesis of sepsis // Nature. 2002. V. 420, No. 6917. P. 885891.

224. Braude A.J. Treatment of Gram-negative bacteremia and shock with antimicrobial drugs and antiserum // Chemotherapy. 1980. V. 28, No 24. P. 610-618.

225. Khan S.A., Everest P., Servos S., Foxwell N., Zahringer U., Brade H., Rietschel E.T., Dougan G., Charles I.G., Maskell DJ. A lethal role for lipid A in Salmonella infections // Mol. Microbiol. 1998. V. 29, No. 2. P. 571-679.

226. Morrison, D.C., Bucklin S.E. Evidence for antibiotic-mediated endotoxin release as a contributing factor to lethality in experimental gram-negative sepsis // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 1996. V. 101. P. 3-8.

227. Baumgartner J.-D., Calandra T. Treatment of sepsis. Past and future avenues // Drugs1999. V. 57, No. 2. P. 127-132.

228. Dinarello C.A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996. V. 216, No. 2. P. 133-165.

229. Hesse D.G., Tracey K.J., Fong Y., Manogue K.R., Palladino M.A., Cerami A., Shires G.T., Lowry S.F. Cytokine appearance in human endotoxemia and primate bacteriemia // Surg. General Obstet. 1988. V. 166, No. 1. P. 147-153.

230. Diks S.H., van Deventer S.J.H., Peppelenbosch M.P. Lipopolysaccharide recognition, internalization, signaling and other cellular effects // J. Endotoxin Res. 2001. V. 7, No. 5. P. 335-348.

231. Kirkland T.N., Finley F., Leturq D., Moriarty A., Lee J.D., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Analysis of lipopolysaccharide binding by CD14 // J. Biol. Chem. 1993. V. 268, No. 33. P. 24818-24823.

232. Ziegler-Heitbrock H.W., Ulevitch R.J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker//Immunol. Today. 1993. V. 14, No. 3. P. 121-125.

233. Gegner J.A., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Lipopolysaccharide (LPS) signal transduction and clearance. Dual roles for LPS binding protein and membrane CD 14 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, No. 10. P. 5320-5325.

234. Viriyakosol S., Mathison J.C., Tobias P.S., Kirkland T.N. Structure-function analysis of CD14 as a soluble receptor for lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, No. 5. P. 3144-3149.

235. Tobias P.S., Soldau K., Gegner J.A., Mintz D., Ulevitch RJ. Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, No. 18. P. 10482-10488.

236. Gordon B.R., Parker T.S., Levine D.M., Saal S.D., Wang J.C., Sloan, B.J., Barie P.S., Rubin A.L. Low lipid concentrations in critical illness: implications for preventing and treating endotoxemia // Crit. Care Med. 1996. V. 24, No. 4. P. 584-589.

237. Cantrell D., O'Neill L., Welham M. Signal transduction during innate and adaptive immunity // Biochem. Society Transact. 2001. V. 29, No. 5. P. 853-859.

238. Munford R.S., Varley A.W. Shield as signal: lipopolysaccharides and the evolution of immunity to Gram-negative bacteria // PLoS Pathog. 2006. V. 2. No. 6. P. e67.

239. Munford R.S. Sensing Gram-negative bacterial lipopolysaccharides: a human disease determinant? // Infect. Immun. 2008. V. 76, No. 2. P. 454-465.

240. Post D.M.B., Phillips N.J., Shao J.Q., Entz D.D., Gibson B.W., Apicella M.A. Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: Importance of a hexaacyl lipid A// Infect. Immun. 2002. V. 70, No. 2. P. 909-920.

241. Ernst R.K., Yi E.C., Guo L., Lim K.B., Burns J.L., Hackett M., Miller S.L. Specific lipopolysaccharide found in cystic fibrosis airway Pseudomonas aeruginosa И Science. 1999. V. 286, No. 5444. P. 1561-1565.

242. Lukasova M., Baumann M., Brade L., Mamat U., Brade H. Lipopolysaccharide smooth-rough phase variation in bacteria of the genus Chlamydia И Infect. Immun. 1994. V. 62, No. 6. P. 2270-2276.

243. Hajjar A.M., Ernst R.K., Tsai J.H., Wilson C.B., Miller S.I. Human Toll-like receptor 4 recognizes host-specific LPS modifications // Nat. Immunol. 2002. V. 3, No. 4. P. 354359.

244. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Raetz C.R.H., Wright S.D. Human phagocytes have multiple lipid A-binding sites // Infect Immun. 1990. V. 58, No. 12. P. 4069^1075.

245. Backhed F., Normark S., Schweda E.K., Oscarson S., Richter-Dahlfors A. Structural requirements for TLR4-mediated LPS signalling: A biological role for LPS modifications //Microbes Infect. 2003. V. 5, No. 12. P. 1057-1063.

246. Darveau R.P. Lipid A diversity and the innate host response to bacterial infection // Curr. Opin. Microbiol. 1998. V. 1, No. 1. P. 36-42.

247. Miller S.I., Ernst R.K., Bader M.W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3, No. 1. P. 36-46.

248. Munford R.S. Severe sepsis and septic shock: The role of Gram-negative bacteremia // Annu Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006. V. 1. P. 467-496.

249. Matsuura M., Kawahara K., Ezaki Т., Nakano M. Biological activities of lipopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 137,No. l.P. 79-83.

250. Phillips N.J., Schilling В., McLendon M.K., Apicella M.A., Gibson B.W. Novel modification of lipid A of Francisella tularensis II Infect. Immun. 2004. V. 72, No. 9. P. 5340-5348.

251. Hackstadt T. The role of lipopolysaccharides in the virulence of Coxiella burnetii II Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. V. 590. P. 27-32.

252. Persing D.H., Coler R.N., Lacy M.J., Johnson D.A., Baldridge J.R., Hershberg R.M., Reed S.G. Taking toll: Lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators // Trends Microbiol. 2002. V.10, No. 10 (Suppl). P. S32-S37.

253. Mazmanian S.K., Liu C.H., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system // Cell. 2005. V. 122, No. l.P. 107-118.

254. Rodriguez A., Rello J., Maskin В., Ceraso D., Vasta L., Palizas F. Effects of high-dose of intravenous immunoglobulin and antibiotics on survival for severe sepsis undergoing surgery // Shock. 2005. V. 23. No. 4. P. 298-304.

255. David S.A. Towards a rational development of anti-endotoxin agents: novel approaches to sequestration with small molecules // J. Mol. Recogn. 2001. V. 14, No. 6. P. 370-387.

256. Tate W.J., Douglas H., Braude A.I., Wells W.W. Protection against lethality of E. coli endotoxin with «О» antiserum // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1966. V. 133, No. 2. P. 746761.

257. Stenutz R., Weintraub A., Widmalm G. The structures of E. coli O-polysaccharide antigens // FEMS Microbiol. 2006. V. 30, No. 3. P. 382-403.

258. Hoist O. The structures of core regions from enterobacterial lipopolysaccharides an update // FEMS Microbiol Lett. 2007. V. 271, No. 1. P. 3-11.

259. Chedid L., Parant M., Parant F., Boyer F. A proposed mechanism for natural immunity to enterobacterial pathogens // J. Immunol. 1968. V. 100, No. 2. P. 292-301.

260. Wardle E.N. The importance of anti-lipid A antibodies (anti-endotoxin): prevention of "shock lung" and acute renal failure // World J. Surg. 1982. V. 6, No. 5. P. 616-623.

261. Ziegler E.J., Mc Cutchan J.A., Fierer J., Glauser M.P., Sadoff J.C., Douglas H., Braude A.I. Treatment of Gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant E. coli II N. Engl. J. Med. 1982. V. 307, No 20. P. 1225-1230.

262. Chedid L., Audibert F., Bona C., Domais C., Parant F., Parant M. Biological activities of endotoxins detoxified by alkylation // Infect. Immun. 1975. V. 12, No. 4. P. 714721.

263. Chedid L., Parant M., Domais C., Parant F., Juy D., Galelli A. Failure of endotoxin to increase nonspecific resistance to infection of lipopolysaccharide low-responder mice // Infect. Immun. 1976. V. 13, No. 3. P. 722-727.

264. McCabe W.R., Bruins S.C., Craven D.E., Johns M. Cross-reactive antigens: their potential for immunization-induced immunity to Gram-negative bacteria // J. Infect. Dis. 1977. V. 136. P. S161-S166.

265. Nowotny A., Behling U.H. Studies on host defences enhanced by endotoxin: a brief review //Klin. Wochehschr. 1982. V. 60. P. 735-739.

266. Ziegler E.J., McCutchan J.A., Douglas H., Braude A.I. Prevention of lethal Pseudomonas bacteremia with epimerase-deficient E. coli antiserum // Trans. Ass. Am. Phys. 1975. V. 88. P. 101-108.

267. Marks M.I., Ziegler E.J., Douglas H., Corbeil L.B. Induction of immunity against lethal Haemophilus influenzae type b infection by Escherichia coli core lipopolysaccharide // J. Clin. Invest. 1977. V. 69, No. 4. P. 742-749.

268. Davis C.E., Ziegler E.J., Arnold K.F. Neutralization of meningococcal endotoxin by antibody to core glycolipid // J. Exp. Med. 1978. V. 147, No. 4 . P. 1007-1017.

269. Lachman E., Pitsoe S.B., Gaffin S.L. Anti-lipopolysaccharide immunotherapy in management of septic shock of obstetric and gynaecological origin // Lancet. 1984. V. 1, No. 8384. P. 981-983.

270. Teng N.H., Kaplan H.S., Hebert J.M., Moore C., Douglas H., Winderlich A., Braude A.I. Protection against Gram-negative bacteremia and endotoxemia with human monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82, No. 6. P. 1790-1794.

271. Baumgartner J.D., O'Brien T.X., Kirfland T.N., Glauser M/P., Ziegler E J. Demonstration of cross-reactive antibodies to smooth gram-negative bacteria in antiserum to Escherichia coliJS II J. Infect. Dis. 1987. V. 56, No. 1. P. 136-143.

272. Brauner A., Kallenius G., Wrangsell G., Wretlind В., Swenson S.B. Antibody respon-ces to Escherichia coli J5 lipopolysaccharide and to Salmonella porin in patients with bacteremia // Microb. Pathogen. 1986. V. 1, No. 5. P. 475-481.

273. Pollack M., Raubitschek A.A., Larrick J.W. Human monoclonal antibodies that recognize conserved epitopes in the core-lipid A region of lipopolysaccharides // J. Clin. Invest. 1987. V. 79, No. 5. P. 1421-1430.

274. Galanos C., Liideritz O., Westphal O. Preparation and properties of antisera against the lipid A-component of bacterial lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1971. V. 24, No. l.P. 116-122.

275. Johns M.A., Bruins S.C., McCabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. II. Serological response to lipid A and lipopolysaccharide of Re mutants 11 J. Infect. Dis. 1977. V.17, No. 1. P. 9-15.

276. Greer G.G., Rietschel E.T. Inverse relationship between the susceptibility of lipopolysaccharide (lipid A)-pretreated mice to the hypothermic and lethal effect of lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1978. V. 20, No. 2. P. 366-374.

277. Chase J.J., Kubey W., Dulek M.H., Holmes С J., Salit M.G., Rearson F.C., III, Ribi E. Effect of monophosphoryl lipid A on host resistance to bacterial infection // Infect. Immun. 1986. V. 53, No. 3. P. 711-712.

278. Marget W., Mar PJ., Jaspers L., Possinger K., Haslberger H. Preliminary study on administration of high-titer lipid A antibody serum in sepsis and septic shock patients // Infection. 1985. V. 13, No 3. P. 120-124.

279. Kuhn H.M., Brade L., Appelmelk B.J., Kusumoto S., Rietschel E.T., Brade H. Characterization of the epitope specificity of murine monoclonal-antibodies directed against lipid A // Infect. Immun. 1992. V. 60, No. 6. P. 2201-2210.

280. Brade L., Brade H. Characterization of two different antibody specificities recognizing distinct antigenic determinants in free lipid A of Escherichia coli II Infect. Immun. 1985. V. 48, No. 3. P. 776-781.

281. Brade L., Hoist O., Brade H. An artificial glycoconjugate containing the bisphos-phorylated glucosamine disaccharide backbone of lipid A binds lipid A monoclonal antibodies // Infect. Immun. 1993. V. 61, No. 10. P.4514-4517.

282. Brade L., Engel R., Christ W.J., Rietschel E.T. A Nonsubstituted primary hydroxyl group in position 6' of free lipid A is required for binding of lipid A monoclonal antibodies // Infect. Immun. 1997. V. 65, No. 9. P. 3961-3965

283. Schussler P., Kruis W., Marget W. Lipid A antibody titers in Crohn's disease // Klin. Wochenschr. 1976. V. 54, No. 21. P. 1055-1056.

284. Marget W., Weiss M., Ruhland B. Lipid A antibody determinations using ELISA on patients at a children's hospital: a preliminary report // Infection. 1983, V. 11, No. 2. P. 84-86.

285. Fink P.C., Galanos C. Serum anti-lipid A antibodies in multiple myeloma and Waldenstrom's macroglobulinaemia//Immunobiology. 1985. V. 169, N. l.P. 1-10.

286. Baldridge J.R., Crane R.T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines // Methods. 1999. V. 19, No. 1. P. 103-107.

287. Sato K., Yung Y.C., Fukushima A., Saiki I., Takahashi T.A., Fujihara M., Tonooka S., Azuma I. A novel synthetic lipid A analog with low endotoxicity, DT-5461, prevents lethal endotoxemia // Infect. Immun. 1995. V. 63, No. 8. P. 2859-2866.

288. Wy C.A., Goto M., Young R.I., Myers T.F. Prophylactic treatment of endotoxic shock with monohosphoryl lipid A in newborn rats // Biol. Neon. 2000. V. 77, No. 2. P. 191195.

289. Hawkins L.D., Christ W.J., Rossignol D.P. Inhibition of endotoxin response by synthetic TLR4 antagonists // Curr. Topics Med. Chem. 2004. V. 4, No. 11. P. 1147-1171.

290. Danner R.L., Van Dervort A.L., Doerfler M.E., Stuetz P., Parrillo J.E. Antiendotoxin activity of lipid A analogues: requirements of the chemical structure // Pharm. Res. 1990. V. 7, No. 3. P. 260-263.

291. Miyajima K., Achiwa K. Lipid A and related compounds. XXXII. Synthesis of biologically active N-acylated homoserine-containing D-glucosamine-4-phosphate derivatives structurally related to lipid A // Chem. Pharm. Bull. 1997. V. 45, No. 2. P. 312320.

292. Seydel U., Hawkins L., Schromm A.B., Heine H., Scheel O., Koch M.H., Brandenburg K. The generalized endotoxic principle // Eur. J. Immunol. 2003. V. 33, No. 6. P. 15861592.

293. Krisovitch S.M., Regen S.L. Nearest-neighbor recognition in phospholipid membranes: a molecular-level approach to the study of membrane suprastructure // J. Amer. Chem. Soc. 1992. V. 114, No. 25. P. 9828-9835.

294. Watanabe Y., Mochizuki Т., Shiozaki M., Kanai S., Kurakata S.I., Nishijima M. Synthesis of lipid A type pyran carboxylic acids with ether chains and their biological activities // Carbohydr. Res. 2001, V. 333, No. 3. P. 203-301.

295. Imoto M., Yoshimura H., Sakaguchi N., Kusumoto S., Shiba T. Total synthesis of Escherichia coli lipid A, the endotoxically active principle of cell-surface lipopolysaccharide // Bull. Chem. Soc. Japan. 1987. V. 60, No. 6. P. 2205-2214.

296. Hochstein H.D., Fitzgerald E.A., McMahon F.G., Vargas R. Properties of US standard endotoxin (EC-5) in human male volunteers // J. Endotoxin Res. 1994. V. 1, No. 1. P. 52-56.

297. Rossignol D.P., Jynn MJ. Antagonism of in vivo and ex vivo response to endotoxin by E5564, a synthetic lipid A analogue // J. Endotoxin,Res. 2002. V. 8, No. 6. P. 483-488.

298. Jemmett К., Macagno A., Molteni М., Heckels J.E., Rossetti С., Christodoulides М. А cyanobacterial lipopolysaccharide antagonist inhibits cytokine production induced by

299. Neisseria meningitidis in a human whole-blood model of septicemia // Infect. Immun. 2008. V. 76, No. 7. P. 3156-3163.

300. David S.A., Bechtel В., Annaiah C., Mathan V.I., Balaram P. Interaction of cationic amhpiphilic drugs with lipid A: implications for development of endotoxin antagonists //Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1212, No. 2. P. 167-175.

301. Andra J., Gutsmann Т., Garidel P., Brandenburg K. Mechanisms of endotoxin neutralization by synthetic cationic compounds // J. Endotoxin Res. 2006. V. 12, No. 5. P. 261277.

302. Barb A.W., McClerren A.L., Snehelatha K., Reynolds C.M., Zhou P., Raetz C.R. Inhibition of lipid A biosynthesis as the primary mechanism of CHIR-090 antibiotic activity in Escherichia coli И Biochemistry. 2007. V. 46, No. 12. P. 3793-3802.

303. Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ulevitch R.J. Antibodies against CD 14 protect primates from endotoxin-induces shock // J. Clin. Invest. 1996. V. 98, No. 7. P. 1533-1538.

304. Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ulevitch R.J. Therapeutic strategies to block LPS interactions with its receptor // Prog. Clin. Biol. Res. 1995. V. 392. P. 473-477.

305. Gallay P., Heumann D., Le Roy D., Barras C., Glauser M.-P. Mode of action of anti-lipopolysaccharide-binding protein antibodies for prevention of endotoxemic shock in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91, No. 17. P. 7922-7926.

306. Tracey К.J., Fong Y., Hesse D.J., Manogue K.R., Lee A.T., Juo G., Lowry S.F., Ce-rami A. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteremia//Nature. 1987. V. 330, No. 6149. P. 662-664.

307. Шубин Ф.Н., Китаев B.M. Молекулярная эпидемиология псевдотуберкулеза // Юбил. сборник НИИ эпидемиол. и микробиол. СО АМН. 1991. С. 41-47.

308. Север И.С., Ильина Т.С., Мотин В.Л., Смирнов Г.Б. Фенотипические особенности штамма Yersinia pseudotuberculosis с плазмидой pVM82, обнаруживаемой в очагах вспышек псевдотуберкулеза// Мол. генетика. 1991, № 12. С. 10-14.

309. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия. 2001. Т. 66, №. 4. С. 511-519.

310. Вестфаль О., Янн К. Методы химии углеводов. М.: Мир. 1967.

311. Galanos С., Luderitz О., Westphal О. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. V. 9. No. 1. P. 245-249.C.

312. Qureshi N., Takayama K. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. 1982. V. 257, No. 19. P. 11808-11815.

313. Boivin A., Messrobeanu J., Messrobeanu L. Technique pour la preparation des polysaccharides microbiens specifiques // Compt. Rend. Soc. Biol. 1933. V. 113, No. 21/24. P. 490-492.

314. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Новый способ выделения 0-специфического полисахарида из грамотрицательной бактерии Yersinia pseudotuberculosis //Биоорган, химия. 1998. Т. 24, № 7. С. 549-553.

315. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // J. Biochem. 1959. V. 37, No. 8. P. 911-917.

316. Nishijima M., Raetz C.R.H. Membrane lipid biogenesis in Escherichia coli: identification of genetic loci for PG-synthetase and construction of mutants lacking PG // J. Biol. Chem. 1979. V. 254, No. 16. P. 7837-7844.

317. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Isakov V.V., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. The application of 13C-NMR spectroscopy to study lipid A from Yersinia pseudotuberculosis II Eur. J. Biochem. 1982. V. 126, No 2. P. 349-351.

318. Wollenweber H.W., Rietschel E.Th. Analysis of lipopolysaccharide (lipid A) fatty acids // J. Microbiol. Methods. 1990. V. 11, No. 2. P. 195-211.

319. Odham G., Stenhagen E. Biochemical application of mass spectrometry // Waller G.R. (Ed.) New York: Wiley. 1972. P. 211-228.

320. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars // Anal. Chem. 1956. V.28, No 2. P. 350-356.

321. Lowry O.H., Rosebrough N.I., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193, No. 1. P. 265-275.

322. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 28, № 5. С. 656-662.

323. Burtseva T.I., Glebko L.I., Ovodov Yu.S. A method for separative quantitative determination of 2-keto-3-deoxy-oktonate and 3,6-dideoxyhexose in mixture // Anal. Biochem. 1975. V. 64, No. 1. P. 1-4.

324. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.A., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis// J. Chromatogr. 1975. V. 114, No. 1. P. 129-141.

325. Leontein K., Lindberg В., Lunngren J. Assignment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides from chiral alcohols // Carbohydr. Res. 1978. V. 62, No. 3. P. 359-362.

326. Vaskovsky V.E., Terekhova T.A. HPTLC of phospholipid mixtures containing phos-phatidylglycerol // High. Resol. Chrom. 1979. V. 2, No. 11. P. 671-672.

327. Vaskovsky V.E., Khotimchenko S.V. HPTLC of polar lipids of algae and other plants // J. Chromatogr. 1982. V. 5, No. 1. P. 635-636.

328. Peterson A.A., McGroarty E.J. High-molecular weight components in lipopolysaccharides of Salmonella typhimurium, Salmonella minnesota and Escherichia coli II J. Bacteriol. 1985. V. 162, No. 2. P. 738-745.

329. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature. 1970. V. 227, No. 5259. P. 680-685.

330. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. V. 154, No. l.P. 269-277.

331. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharide in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. V. 119, No. 2. P. 115-119.

332. Tomshich S.V., Gorshkova R.P, El'kin Yu.N., Ovodov Yu.S. Lypopolysaccharide from Yersinia pseudotuberculosis, type IB. A structural study of O-specific chains // Eur. J. Biochem. 1976. V. 65, No. 1. P. 193-199.

333. Томшич C.B., Горшкова Р.П., Оводов Ю.С. Структурное исследование кора ли-пополисахаридов Yersinia pseudotuberculosis II Химия природ, соедин. 1985. № 6. Р. 751-755.

334. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Studies on lipid A from Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1978. V. 89, No. 1. P. 287-289.

335. Фролова Г.М., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Динамика гуморального иммунного ответа на липополисахарид-белковый комплекс Yersinia pseudotuberculosis II Журн. микробиол. 1980. № 8. С. 118-119.

336. Galanos С., Freudenberg I. A., Reutter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76, No. 11. P. 59395943.

337. Nowotny A. Determination of toxicity // In: Basic exercises in immunochemistry: A laboratory manual. Heidelberg; Berlin; New York: Springer-Verlag. 1979. P. 303-305.

338. Apicella M.A. Isolation and characterization of lipoplysaccharisdes // Meth. Mol. Biol. 2008. V. 431, No l.P. 3-13.

339. Goverde R.L.J., Kusters J.G., Huis in't Veld J.H.J. // Growth rate and physiology of Yersinia enterocolitica: influence of temperature and presence of the virulence plasmid // J. Appl. Bacteriol. 1994. V. 77, No. 1. P. 96-104.

340. Ермак И.М., Мороз С.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Сравнительная характеристика эндотоксинов, выделенных последовательной экстракцией из Yersinia pseudotuberculosis И Биол. мембраны. 1991. Т. 8, № 2. С. 128-133.

341. Dixon D.R., Darveau R.P. Lipopolysaccharide heterogeneity: innate host responses to bacterial modification of lipid A structure // J. Dent. Res. 2005. V. 84, No. 7. P. 584595.

342. Silipo A., Lanzetta R., Amoresano A., Parrilli M., Molinaro A. Ammonium hydroxide hydrolysis: a valuable support in the MALDI-TOF mass spectrometry analysis of lipid A fatty acid distribution // J. Lipid Res. 2002. V. 43, No. 12. P. 2188-2195.

343. Kuhlradt P.F., Wray V., Lehmann V.A. P-nuclear-magnetic resonance. Study of the phosphate groups in lipopolysaccharide and lipid A from Salmonella II Eur. J. Biochem. 1977. V. 81, No. 1. P. 193-203.1 1

344. Tulloch A.P., Mazurek M. С nuclear magnetic resonance spectroscopy of saturated, unsaturated, and oxygenated fatty acid methyl esters // Lipids. 1976. V. 11. P. 228-234.

345. Baltzer L.H., Mattsby-Baltzer I. Heterogeneity of lipid A: structure determination by

346. С and P NMR lipid A fraction from lipopolysaccharide of Escherichia coli 0111 // Biochemistry. 1986. V. 25, No. 12. P. 3570-3575.

347. Costello C.E., Vath J.E. // In: McCloskey J.A. (Ed.) Methods of Enzymology. San Diego: Academic Press. 1990. P. 738-768.

348. Kussak A., Weintraub A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria // Anal. Biochem. 2002. V. 307, No. l.P. 131137.

349. Wang Y., Cole R.B. Acid and base hydrolysis of lipid A from Enterobacter agglomer-ans as monitored by electrospray ionization mass spectrometry: pertinence to detoxification mechanisms // J. Mass Spectrom. 1996. V. 31, No. 1. P. 138-149.

350. Hisatsune K., Iguchi Т., Kondo S. A rapid method for sugar analysis of lipopolysaccharides of gram-negative bacteria // System. Appl. Microbiol. 1990. V. 13, No. 2. P. 320-326.

351. Исаков B.B., Горшкова Р.П., Томшич C.B. 13С-ЯМР-анализ полисахарида О-специфических боковых цепей липополисахарида из Yersinia pseudotuberculosis И Биоорган, химия. 1981. V. 7, № 4. Р. 559-562.

352. Krasikova I.N., Gorbach V.I, Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. Studies on lipid A from Y. pseudotuberculosis. Isolation and general characterization // Eur. J. Biochem. 1978. V. 89, No l.P. 287-289.

353. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. М.: Медицина, 1979. С. 1-20.

354. Montille T.J. Principles which influence microbial growth, survival, and death in foods // In: Doyle M.P., Beuchat L.R., Montille T.J. (Eds.) Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Washington. DC: ASM Press. 1997. P. 13-29.

355. Potera C. Forging a link between biofilms and disease // Science. 1999. V 283, No. 5409. P. 1837-1839.

356. Cronan J.E., Jr. Phospholipid alterations during growth of Escherichia coli II J. Bacterid. 1968. V. 95, No. 6. P. 2054-2061.

357. Oliver J.D., Stringer W.F. Lipid composition of a psychrophilic marine Vibrio sp. during starvation-induced morphogenesis 11 Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47, No. 3. P. 461-466.

358. Oliver J.D., Colwell R.R. Extractable lipids of gram-negative marine bacteria: phospholipid composition // J. Bacterid. 1973. V. 114, No. 3. P. 897-908.

359. Schmiel D.H., Young G.M., Miller V.L. The Yersinia enterocolitica phospholipase gene yplA is part of the flagellar regulon // J. Bacteriol. 2000. V. 182, No 8. P. 23142320.

360. Gilbert P., Brown R.W. Influence of growth rate and nutrient limitation on the gross cellular composition of Pseudomonas aeruginosa and its resistance to 3- and 4-chlorophenol //J. Bacteriol. 1978. V. 133, No. 3. P. 1066-1072.

361. Skurnik M., Zhang L. Molecular genetics and biochemistry of Yersinia lipopolysaccharide // APMIS. 1996. V. 104, No. 12. P. 849-872.

362. Rohde J.R., Fox J.M., Minnich S.A. Thermoregulation in Yersinia enterocolitica is coincident with changes in DNA supercoiling // Mol. Microbiol. 1994. V. 12, No. 2. P. 187-199.

363. Gounot A.-M. Psychrophilic and psychrotrophic microorganisms // Experientia. 1986. V. 42, No. 11-12. P. 1192-1197.

364. Gerday C. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology // Trends Bio-technol. 2000. V. 18, No. 3. P. 103-107.

365. Гинцбург A.JI., Шубин Ф.Н., Шовадаева Г.А., Куличенко А.Н., Янишевский Н.В., Смирнов Г.Б. Новый признак патогенности, кодируемый плазмидой pVM82 Yersinia pseudotuberculosis // Генетика. 1988. Т. 24, № 9. С. 1562-1571.

366. Portnoy D.A., Wolf-Watz Н., Bolin I., Beeder A.B., Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins // Infect. Immun. 1984. V. 43, No. 1. P. 108-104.

367. Варвашевич Т.Н. Изучение изменчивости псевдотуберкулезного микроба. Дис. .канд. биол. наук. Владивосток. НИИ ЭМ СО РАМН. 1978. С. 90.

368. Leclercq A., Wauters G., Decallonne J., El Lioui M., Vivegnis J. Usefulness of cellular fatty acid patterns for identification and pathogenicity of Yersinia species // Med. Microbiol. Lett. 1996. V. 5, No. 1. P. 182-194.

369. Leclercq A., Guiyoule A., ElLioui M., Carniel E., Decallonne J. High homogeneity of the Yersinia pestis fatty acid composition // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38, No. 4. P. 1545-1551.

370. Сомов Г.П. Психрофильность патогенных микроорганизмов и ее эпидемиологическое и патогенетическое значение // Вестн. АМН СССР. 1985. № 1, С. 58-65.

371. Шубин Ф.Н., Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Плазмиды Yersinia pseudotubercido-sis и их значение в реализации эпидемического процесса при псевдотубер-кулезе // Журн. микробиол. 1985. № 12. С. 53-56.

372. Scandella C.Y., Kornberg, A. A membraine-bound phospholipase A\ purified from Escherichia coli II Biochemistry. 1971. V. 10, No. 24. P. 4447-4456.

373. Shijder H.J., Dijkstra B.W. Bacterial phospholipase A: structure and function of an integral membrane phospholipase // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1488, No. 1. P. 91-101.

374. Weibe W.J., Chapman G.B. Fine structure of selected marine pseudomonads and achromobacters // J. Bacteriol. 1968. V. 95, No. 5. P. 1862-1873.

375. Mac Leod R.A. The question of the existence of specific marine bacteria // Bacteriol. Rev. 1965. V. 29. P. 9-24.

376. Forsberg C.W., Casterton J.W., Mac Leod R.A. Separation and localization of cell layers of a gram-negative bacterium // J. Bacteriol. 1970. V. 104, No. 3. P. 1338-1353.

377. Moule A.L., Wilkinson S.G. Composition of lipopolysaccharides from Alteromonas pufrefaciens (Shewanella pufrefaciens) II J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135, No. 1. P. 163-173.

378. Leone S., Silipo A., Nazarenko E.L., Lanzetta R., Parrilli M., Molinaro A. Molecular structure of endotoxins from gram-negative marine bacteria: An Update // Mar. Drugs. 2007. V. 5, No. 3. P. 85-112.

379. De Ley J. // In: Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harber H., Schleifer K.-H. (Eds.) The Prokaryotes. Berlin: Springer Verlag. 1992. P. 2111-2140.

380. Reyes E.D., Carballeira N.M. Total synthesis of the antimicrobial fatty acid (5Z,9Z)-14-methylpentadeca-5,9-dienoic acid and its longer chain analog (5Z,9Z)-24-methylpentacosa-5,9-dienoic acid//Synthesis. 1997. V. 10, P. 1195-1198.

381. Ribeiro A.A., Zhou, Z., Raetz, C.R.H. Multi-dimensional NMR structural analyses of purified lipid X and lipid A (endotoxin) // Magn. Reson. Chem. 1999. V. 37, No. 8. P. 620-630.

382. Jennings H., Smith I.C. Polysaccharide structures using carbon-13 nuclear magnetic resonance // Methods Enzymol. 1978. V. 50. P. 39-50.

383. Горбач В.И., Иванчина E.B., Исаков B.B., Лукьянов П.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Синтез аналогов липида А. Получение производных б'-фосфата (pi—»6)-дисахарида 2-ациламино-2-дезокси-£)-глюкозы // Биоорган, химия. 1982. Т. 8, № 12. С. 1409-1415.

384. Gauthier M.J., Breittmayer V.A. // In: Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harber H., Schleifer K.-H. (Eds.) The Prokaryotes: the genera Alteromonas and Marinomonas. New York: Springer-Verlag. 1992. P. 3046-3070

385. Andersson B.A., Holmann R.T. Pyrrolidides for the mass spectrometric determination of the position of the double bond in monounsaturated fatty acids // Lipids. 1974. V. 9, No. 3. P. 185-190.

386. Bernardet J.-F., Nakagawa Y., Holmes B. Proposed minimal standards for the describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52, No. 9. P. 1049-1070.

387. Nishijima M., Raetz C.R.H. Characterization of two membrane-associated glycolipids from an Escherichia coli mutant deficient in phosphatidylglycerol // J. Biol. Chem. 1981. V. 256, No. 20. P. 10690-10696.

388. Smith P.B.W., Snyder A.P., Harden C.S. Characterization of bacterial phospholipids by electrospray ionization tandem mass spectrometry // Anal. Chem. 1995. V. 67, No. 11. P. 1824-1830.

389. Nishijima M., Bulawa C.E., Raetz C.R.H. Two interacting mutations causing temperature-sensitive phosphatidylglycerol synthesis in Escherichia coli membranes // J. Bacteriol. 1981. V. 145, No. l.P. 113-121.

390. Kampher P., Dreyer U., Neef A., Dott W., Busse H.-J. Chryseobacterium defluvii sp. nov., isolated from wastewater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53, No. 2. P. 93-97.

391. Aurell C.F., Wistrom А.О. Critical aggregation concentrations of gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS) // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 253. No. l.P. 119-123.

392. Seydel U., Hawkins L., Schromm A.B., Heine H., Scheel O., Koch M.H., Brandenburg K. The generalized endotoxic principle // Eur. J. Immunol. 2003. V. 33. No. 6. P. 15861592.

393. Wiese A., Brandenburg K., Ulmer A.J., Seydel U., Muller-Loennies S. The dual role of lipopolysaccharide as effector and target molecule // Biol. Chem. 1999. V. 380. No. 78. P. 767-784.