Кинетические закономерности и регуляция ферментативного синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯСРЬСКОИ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.в. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи БАРСКИЙ Олег Александрович

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И РЕГУЛЯЦИЯ «ЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА ЛЕИКОТРИЕНОВ В НЕИТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА

02.00.15 химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискьние ученей степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета и в секторе биокииетшш Межфакультетской проблемной НИЛ им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук С.Д. Варфоломеев кандидат химических наук Г.Ф. Судьина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.З. Ланкин доктор химических наук А.И. Яроголов

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ АН СССР

Защита состоится " " ¿2 И, ^Л 1991 года

в 16 часов на заседании специализированного совета Д, д£> У6 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: I19899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^ " ЬК-О- 1991 года

Ученый секретарь .совета,

кандидат химических наук

Кост

ХАРАКТЕРИСТИКА РАбОГЫ

Актуальность проблемы. Лейкотриены - недавно открытая группа физиологически активных веществ, выступающих в качестве медиаторов аллергических и воспалп'вльнчх реакций и выполняющих важные регу-ляторные функции в защитной система организма. Лейкотриены появляются в организм!1 при воспалениях, аллергиях, астме, артрите, сердечно-сосудистых заболеваниях. Исследование закономерностей образования лейкотриенов ь клетках человеческого организма представляет существенный интерес с точки зрения медицины, так как знание этих закономерностей позволяет воздействовать на процесс их синтеза. Нахождение способе подавления и активации процесса синтеза лейкотриенов открывает новые возможности ь лечении и диагностике аллергий, астмы, сердечно-сосудистых заболеваний, рака.

Важнейшим звеном б защите организма от проникновения инфекции являются клетки кроьи - нейтрофилы, которые уничтожают инфицированные вирусом и опухолевые клетки, проникающие в организм бактерии.

Лейкотриены используются как средство межклеточного общения, влияния на активность других клеточных популяций. Аллергия вызывает повышенную чувствительность нейтрофилов к стимулам и повышенное образование лейкотриенов; онкологические заболевания, напротив, связаны с пониженной способностью нейтрофилов к производству лейкотриенов и 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты. В связи с этим количественное определение 5-липоксигеназной активности в нейтро-филах может использоваться также в целях диагностики.

Цель работы. Целью работы является исследование механизма регуляции синтеза 5-липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты е. нейтрофилах. кинетическими методами.

Научная новизна работы. В литературе проводились кинетические исследования 5 лштоксигеназы на ферменте, выделенном из различных источников. В данной работе впервые предложена математическая модель действия 5-липоксигеназы в интактной клетке, включающая в себя регуляцию активности фермента изменяющимися концентрациями внутриклеточного месеендаера кальция - эффектора 5-липоксигеназы. Из анализа этой модели уетанозлено, что кальций по-разному влияет на липоксигеназну» и хлм,- синтазную активности фермента. Определена роль экзогенного и эндогенного арахидоната в биосинтезе лейкотриенов. Проведено исследование механизма действия стимула нейтрофилов

- кальциевого ионофора А23187, нг> каскад реакций, вовлеченных в отлез лейкотриенов в клйткв. Впервые изучено влияние адгезионных взаимодействий на биосинтез 5-липоксигеназных метаболитов арахидо-новсй кислоты в нейтрофилах и 1!редложена гипотеза, объясняющая это глияние.

Практическая ценность работы. Б работе исследованы фундаментальные закономерности образования в клетках человеческого организма - нейтрофилах, - регуляторов иммунного ответа - лейкотриенов. Механизм регуляции синтеза этих веществ открывает пути поиска способов усиления или подавления образования лейкотриенов, которые впоследствии могут быть использованы в медицинской практике. Отработанная методика определения 5-липоксигеназной активности !• нейтрофилах может быть использована для создания методов диагностики различных заболеваний и проверки эффективности или побочного действия различных лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Каунас, октябрь 1988г.) и на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, сентябрь 1989г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы из семи разделов, методической части, четырех разделов, в которых излагаются результаты и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы (117 наименований). Работа изложена на¿33 страницах машинописного текста, включает 24 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАбОТИ Литературный обзор.

В обзоре литературы основное внимание уделяется ключевому ферменту б синтезе лвйкотриентов - 5-липоксигеназе, которая катализирует две первые реакции цепочки синтеза лейкотриенов: превращение арахвдоновой кислоты (АА) в 5-гидропероксиэйкозатетраеновую кислоту (5-НРЕТЕ! и 5-НРЕТЕ в лейкотриен А4(ЬТА4), обсувдается регуляция ее активности под действием различных эффекторов и приведены имеющиеся в литературе сведения о кинетическом механизме ее

действия. Большая глава посвящена взаимодействию всех факторов, влиянии на активность ферментов лейкотриенового каскада в целой клетке и воздействию стимулов нейтрофилов (главным образом применяемого в работе кальциевого ионофора A23I87) на эти факторы.

Методическая часть.

Нейтрофилы человека выделяли из свехеотоОранной донорской крови и m жизнеспособность проверяли по распластыванию на стекле под микроскопом. В качестве стимула клеток использовался ионофор A23I87. Методом определения количества образущихся 5-липоксигеназных метаболитов в работе служила обращэнно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЗНОС ) с детекцией по УФ поглощению на 280 и 235 нм, а также по радиоактивности, проводимая после ряда стадий предварительной очистки проб. По хроматограмме определяли: 20-С00Н и 20-0Н - лэйкотриен в4, лейкотриен вд (ьтвд), его изомеры: 5(S),l2(R)-all-tranB-di НЕГЕ и 5(S), 12(S) - all-trans-di HETE и 5(S)-гидроксиэйкозатэтраэновую кислоту (5-НЕТЕ). В элюате определяли радиоактивность по фракциям жидкосцинташшцион-ным методом (рис.1). В методической части также описаны применявшиеся в работе метода измерения внутриклеточного рН с помошью флюоресцентного красителя 2',7•-бис(карбоксиэтил)-5,6-карбоксифлюо -ресцеин (всеор) в суспензии и в отдельной клетке .

РЕЗУЛЬТАТЫ РА60ТЫ Роль экзогенной арахидоновой кислоты.

Предшественник лейкотриенов в организме - арахидоновая кислота (АА) - является физиологически активным веществом, стимулятором многих процессов в клетке. В очагах воспаления арахидоновая кислота может содержаться в плазме (во внеклеточной среде) и действовать синергично с другими стимулами синтеза лейкотриенов, поэтому важно выяснить, какую роль (субстрата или дополнительного стимула) играет экзогенная арахидоновая кислота и иметь количественную меру ее участия в биосинтезе. Для определения роли экзогенного арахи-доната в биосинтезе была получена зависимость удельной радиоактивности лейкотриена в4 от концентрации добавляемой арахидоновой кислоты с постоянной удельной радиоактивностью (рис. 2). Наличие радиоактивности в продукте уже говорит об участии экзогенной кислоты

-з-

Рис.Г.

Б

5" 1

н

10 20 30 40 50

10

20

30

Ив М&

Типичная хроматограмма продуктов липоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах при стимуляции кальциевым ионобором А23157. А - УФ-де-текция на 280 и 235 нм. Б - детекция по радиоактивности в элюате при инкубации нейтрофилов с 3Н СГВ^. Стрелками помечены времена выхода: а- РЙ^, б- ЦГВ^, в- 5-НЕТЕ, г- 12-НЕТЕ, д- £0-С00Н-1.ТВ4, е- ^0~0Н-1ТВ4)

1,11 - изомерыЬТВ^.

У,%

100

20 «0 60 ЮТЩГм

Рис.2. График эависикости у - доли "экзогенного синтеза" ЪТВд от концентрации арахидоновой кислоты (А) и его линеаризация (В). Условия инкуба-у

ций: 1.710 клвток/нл, концентрация ионофора

А23187 5 ккН, ареыя икку-баций - 10 хин.

в реакции синтеза лейкотриенов в качестве субстрата. График зависимости доли "экзогенного синтеза" от концентрации экзогенной арахидоновой кислоты имеет вид гиперболической кривой, стремящейся к у=1 при высоких концентрациях АА. Это указывает на то, что эндогенный субстрат конкурентным образом вытесняется экзогенным, и при высоких концентрациях арахидоновой кислоты синтез идет преимущественно из экзогенного субстрата. Кривая линеаризуется в координатах - АА. (где у - доля синтеза из экзогенного субстрата в У УРтти

суммарном синтезе продукта, у= урдд , УР - удельная радиоактивность).

Доля синтеза из экзогенной кислоты, у, определяется соотношением концентрацией арахидоната из вне- и внутриклеточного источни-

АА.

ка в зоне реакции: у = (1)

где а^- концентрация внутри клетки высвободившейся эндогенной, а аа^- проникшей в клетку экзогенной кислоты. Обнаружено, что УР продукта не изменяется во времени в течение реакции (данные приведены в диссертации). Это говорит об отсутствии кинетических затруднений в проникновении арахидоновой кислоты через плазматическую мембрану и дает нам возможность ввести постоянный коэффициент распределения арахидоната между внутри- и внеклеточным пространством и перейти от внутриклеточных концентраций к общим: аа0 и а0.

Уравнение (I) в преобразованном видэ будет выглядеть следующим об-аа

разом: = АА0+а0

а0 и а1 могут изменяться в зависимости от концентрации добавленной

арахидоновой кислоты, если экзогенная арахидоновая кислота влияет

на высвобождение эндогенного арахидоната. Из экспериментальных

АА

данных, представленных на рис.гв, видно, что зависимость - аао представляется прямой с тангенсом угла наклона, равным 0.99-0.09. Это говорит о том, что а0 не является функцией концентрации экзогенной арахидоновой кислоты. Определенная из графика на рис.2В величина а0 составляет ю.8±з.9 мкм.

Из приведенных данных следует, что экзогенная арахидоновая кислота является субстратом в реакциях синтеза лейкотриенов, параллельным эндогенной, и ве оказывает существенного влияния на процесс высвобождения эндогенной арахидоновой кислоты. Приведенные в работе экспериментальные данные позволяют оцределить количественно вклад экзогенной арахидоновой кислоты в суммарный биосинтез продукта, что важно знать при выяснении кинетического механизма действия 5-липоксигеназы нейтрофилов.

Зависимость скорости синтеза 1дц.4 от концентрации нейгроЗилов

3 (0 15

КОНЦЕНТРАЦИЯ КЛЕТОК, МЛН/МЛ

Рис.3. Зависимость начальной скорости синтеза ЪТАД от концентрации нейтрофилов в суспензии. Условия инкубаций: 5 ккМ А23187, 37%.

Зависимость скорости образования ьтад от концентрации ней-трофилов в оуопэнзии прэдотавлена на рис.3. Зависимость нелинейна и не является прямой, выходящей из начала координат, как можно было бы ожидать, если рассматривать клетки только как носители фермента. Нелинейность зависимости говорит о существовании взаимодействия между нейтрофилами, которое проявляется при малых концентрациях клеток в параболическом росте скорости синтеза. Ключ к объяснению природы этого взаимодействия дает информация о свободном проникновении арахидоновой кислоты через плазматическую мембрану, полученная ранее. Параллельно с увеличением концентрации клеток растут концентрация субстрата и фермента в системе: [Э] = кАо; [Е] = 1^0, где о - концентрация клеток, и кА - коэффициенты пропорциональности, [Е] и [з] - концентрации фермента и субстрата. Подставив эти выражения в управление Нихаэлиса-Мэнтен, получим формулу для зависимости начальной скорости синтеза от концентрации клеток, успешно описывающую экспериментальные данные:

т. _ кат

Функция имеет асимптоту V = ккаткв о - ккдгкЕкы/кА,

пересекающую ось абсцисс в точке о0=км/кА. При концентрации клеток, равной о0, концентрация субстрата в системе равна ку. Значение о0 уменьшается с увеличением количества эндогенной арахидоновой кислоты, высвобождающейся в клетках при активации. Методом нелинейной регрессии определены параметры функции (г), проведенной через экспериментальные точки: множитель перед о2: (4.4+0.5)"Ю-9 (нМ мл/мин); о0=(б.о±1.1 )• юб (мл-1). Приведенная экспериментальная зависимость еще раз подтверждает гипотезу о том, что арахидоновая кислота может свободно проникать через клеточную мембрану и распределяться между внутри- и внеклеточным пространством.

Кинетика действия 5-липоксигеназн.

В этой части работы внимание сосредоточено на первом и ключевом ферменте полиферментной системы синтеза лейкотриенов - 5-липоксигеназе.

На рис. 4,6 представлены экспериментальные данные по синтезу

двух 5-лшкжсигеназных метаболитов арахидоковой кислоты в зависимости от времени и от концентрации субстрата.

В кинетическом поведении исследуемой ферментативной системы были обнаружены следующие характерные моменты-.

1. Количество накопленного в инкубационной смеси 5-нрете проходит через максимум; количество ЬТА^ монотонно возрастает (рис.4). При стимуляции нэйтрофилов кальциевым ионофором а2э187 максимум на кинетических кривых накопления 5-нрете приходится на времена 2-5 мин. В последующие времена наблюдается резкий спад концентрации

5-ярете.

2. Зависимости количества продуктов, образовавшихся за определенное время в инкубационной смеси, от концентрации арахвдоновой кислоты различны для ьтв4 и 5-нрете (рис.6). В то время как при 40-50 мкМ экзогенно добавленного арахидоната накопление эдв^ достигает предела, количество 5-нрете при тех же концентрациях субстрата возрастает пропорционально росту концентрации арахвдоновой кислоты.

Лейкотриен Ад определялся как сумма продуктов его ферментативного ( ьтв4) и неферментативного (изомеры игв4) превращения. Количество детектируемой 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты характеризует количество 5-НРЕТЕ, образовавшейся в результате 5-липоксигеназной реакции.

Исследуем возможные причины появления максимума на кинетической кривой 5-НРЕТЕ. 5-НРЕТЕ является промежуточным продуктом в реакциях, катализируемых 5-лшгоксигеназой, поэтому максимум может возникать в том случае, если биосинтез идет в условиях лимитирования по количеству субстрата, тогда при истощении субстрата начинает расходоваться промежуточный продукт. Однако степень конверсии арахидоновой кислоты в процессе биосинтеза составляла всего 1-2% (это видно из рис.4), и форма кривых накопления 5-нрете принципиально не менялась с ростом концентрации экзогенно добавленной арахидоновой кислоты (рис.4).

Максимум также мог бы быть обусловлен дальнейшим метаболизмом продукта восстановления 5-гидрошроксикислотн - 5-НЕТЕ. Для доказательства отсутствия стока 5-НЕТЕ был поставлен специальный эксперимент. В суспензию клеток после добавления стимула (5 мкМ А23187 + 40 мкМ АА) в разные моменты времени добавляли 5-НЕТЕ (4,8 мкМ). Реакцию останавливали во всех случаях через 10 мин после

■ в-

Р НМ0,1Ь

Рис .4. Кинетические

3.4'10 /ил.

4 б а т^мин юо

Йтс. 4 р!ю. 5

кривые накопления 5-НРЕТЕ (•) и

концентрации арахидоновой кислоты ДО лиМ, и 5-НРВТЕ центрации ДА 10 ккМ. Концентрация нейтрофилов 5 икЯ.

Рис .5. Расчетные зависимости р( —) и х величины к^ [Ед] на кинетику накопления

указывают величину к1 1Е03 в с-1 .

ШЕТС,

1Т»„

НМОПЬ

( — ) от продуктов.

времени Цифры

(.л) при

при кон-А23187 -

Влияние на кривых

Рис.7

Рис.б. Сравнение экспериментальных и расчетных кривых зависимости количеств Р (А,---) и 2 (♦,-). образовавшихся за 10 мин, от концентрации субстрата. На оси абсцисс внизу указана концентрация экзогенно добавленной арахидоновой кислоты. Теоретические кривые накопления р и х в зависимости от зо соответствуют следующим параметрам: т=1г. а=о.оог/%. к,[Еоз=о.1/т. 1^=1/1, к^г/т.

к_3[Ео]=0.5/Т;. к4=0.5/Т. к^к^О.ООБ/Т. кб=1/Т.

Рис.7. Сравнение экспериментальных и расчетных кинетических кривых накопления продуктов Р (А,---) и I (•■-). Теоретические кривые накопления р и х рассчитаны для зо=10; 1=1 .2, 0=0.002/Т.

к_1=1/Т. ¿2=1/1:. к^г/Т, к_3[Ео]=0.5/Т. к4=0.5/Т.

к1 [Ео]=0.1/1:. к^=к^=0.01/Т,

-я-

стимуляции. Количество 5-НЕТЕ в пробе не зависело от времени ее добавления к клеткам и примерно равнялось сумме добавленной и синтезировавшейся в клетках 5-гидроксикислоты (данные приведены в диссертации). Этот результат позволил сделать вывод о том, что 5-НЕТЕ в указанных условиях не встраивается в клеточные липиды и не трансформируется по ш-оксидазному или какому-либо другому пути. Определяемое в эксперименте количество 5-нете является мерой того количества 5-гидропероксинислоты, которое образуется в 5-липоксигеназной реакции в нейтрофилах. Следовательно, причина появления максимума на кинетических кривых накопления 5-нете и дальнейшего спада количества этого продукта во времени заключена в особенностях кинетического поведения самого фермента 5-липоксигеназы.

5-липоксигенаэа катализирует две последовательные реакции: реакцию оксигенирования арахидоновой кислоты с образованием 5~ НРЕТЕ и реакцию дегидратации 5-НРЕТЕ с образованием ХЯ?АД, причем синтез 1/ГАд возможен с использованием в качестве субстрата как 5-НРЕТЕ, так и арахидоновой кислоты. Кинетическая схема, приведенная на рис 8, была составлена на основании всей совокупности литературных и экспериментальных данных. При этом за основу была взята схема Вейсмана с соавторами (в!осЬет1з^у 1987.V.26.р.5684-5689). Сигналом к началу реакции в живой клетке слукит резкий подъем концентрации свободного кальция (кофактора 5-липоксигиназы) в цитозо-ле после действия стимула. Формально начальные условия можно выразить следующим образом: 1;<0, 3=0, Е=0; t=0, Е=Ео, ,3=8о.

Кинетическая модель действия Б-липоксигеназы

в

Рис.8. Кинетическая схема действия Б-липоксигеназы. 5 - арахидоновая кислота x - 5-нрете р - г/га.

4

к

А

е.

'1

'1

■■ 1С-

Теоретический анализ модели.

Аналитическое исследование.

Кинетическая схема описывается соответствующей ей системой дифференциальных уравнений и уравнений массобаланса.

Аналитическое исследование проводилось с целью определения принципиальной возможности существования максимума на кривой накопления 5-нрете в рамнах рассматриваемой кинетической модели и нахождения необходимых условий его существования. При этом принималось во внимание, что скорость работы фермента в клетке меняется во времени за счет инактивации фермента в процессе реакции, накопления промежуточного продукта х и изменения концентрации эффектора с. Из литературы известно, что концентрация основного эффектора 5-липоксигеназы - Саг+ скачкообразно возрастает в результате стимуляции клетки Са2+ ионофором А23187, а затем постепенно возвращается к Оазальному уровню. Предметом исследования является наличие максимума во внутренних точках функции (теоретическая функция накопления 5-НРЕТЕ во времени) в условиях убывания концентрации эффектора в рамках кинетической схемы.

В результате исследования сформулировано и доказано необходимое условие существования максимума на кривой накопления X :

Если на кривой накопления X: [Х]=ХШ имеется максимум и концентрация эффектора не возрастает в зависимости от времени, то эффектор неодинаково влияет на взаимодействие 5-липоксигеназы с ара-хидоновой кислотой и 5-НРЕТЕ.

Доказательство этого утверждения осуществляется в 3 этапа.

1) На первом этапе доказывается, что в рамках схемы 1 с учетом только обратимости отщепления х и инактивации фермента в процессе реакции существование максимума во внутренних точках кривой х(1) невозможно.

2) на втором этапе доказыватеся, что если субстрат э и промежуточный продукт X могут взаимодействовать только с комплексом фермент-эффектор, т.е.ферментом б активном состоянии, то существование максимума также невозможно.

3) на третьем этапе находятся принципиальные условия существования максимума.

Доказательство первых двух утверждений осуществляется методом "от противного". Для доказательства рассматриваются функции обра/ ! -

зования и расходования X: v+=k3[ex], v~=k_3IE]tx]. Если максимум существует в точке tm, то в некоторой ее окрестности справедливо неравенство:

£ж =w+_dr£0 (3)

dt dt dt

Доказательство основано на анализе возможности выполнения неравенства (3) путем исследования частных производных функций v+ и v- по концентрациям промежуточного продукта x (5-нрете), эффектора (С) и суммы неинактивировавшихся форм фермента (Е ):

d У- av- d[Ea] эг* d[X] ¿»V* d[0]

dt a[Ej* dt a[X] ' dt ale] ' dt

a

Численное исследование.

Целью численного исследования является демонстрация возможности возникновения максимума функции x(t) в рамках рассматриваемой модели при выполнении необходимого условия - т.е. поиск достаточных условий существования максимума. Также выясняются причины различного вида концентрационных зависимостей образования 5-нреге и г/га4-

Система уравнений, описывающих кинетическую схему, была приведена к безразмерному виду путем нормирования концентраций различных форм фермента на [Еп],а концентраций [s],[p] и [XI на вели-к_ +к 0 чину —-—- и численно решена (проинтегрирована). Исследовано

ki

влияние всех констант на форму кривых x(t) и p(t) и найдено, что, несмотря на наличие большого числа стадий взаимодействия, вид кинетических кривых накопления продуктов устойчив и практически не меняется при изменении значений параментов в большом диапазоне. Продемонстрировано, что, действительно, в рамках кинетической схемы действия липоксигеназы и системы уравнений, ее описывающих, максимума во внутренних точках функции x(t) не наблюдается, что находится в сответствии с выводами предыдущей части.

В то же время обнаружено, что различный вид зависимостей количества синтезированных за время t продуктов х и Р от концентрации субстрата s обусловлен обратимостью диссоциации промежуточного продукта х (5-нрете) с фермента. Расчеты показывают, что зависимость р от s имеет вид кривой, выходящей на плато, а зависимость х

- т-

от s почти линейна в больпом диапазоне концентраций субстрата (рис.6).

Введение в расчеты влияния изменяющейся концентрации эффектора на стадию взаимодействия Eus приводит к появлению максимума на крявой S(t).

Роль эффекторов в регуляции кинетического поведения 5-лшо-ксигоназы в нейтрофилах.

После начального скачка, вызванного действием стимула на клетку, концентрация э^фэктора 5-липоксигеназной реакции, Са2+, вместе с сопутствующими скачку Са?+ изменения!.® ряда других пара-мэтров, харахтерязукждах состояние клетки, постепенно возвращается к исходному уровню за время порядка нескольких минут. Такой se'характер ж»«эноний сбпчрукявавт и потенциал плазматической мембраны, концентрации различных ионов. Кинетику релаксации системы после действия стимула мозно аппроксимировать экспоненциальной функцией Af=A£°exp(-at), где Af - текущее и Af° - максимальное отклонение параметра от базального уровня, а - константа, характеризующая скорость возврата к базальному уровню, t - время.

В соответствии со сделанным ранее выводом наиболее чувствительным к эффектору долзшо быть взаимодействие фермента с арахидо-новой кислотой. Известно, что присутствие Саг+ уменьшает константу связывания арахидоновой кислоты в опытах на выделенном ферменте. В предположении, что с уменьшением Ai пропорциональным образом уменьшается скорость образования Е5, к, допустимо рассмотреть как эффективную константу взаимодействия 3 и з, зависящую от концентрации эффектора и ввести экспоненциальную функцию ее изменения во времени:

k, = к° exp(-at)

С учетом этого условия расчетные кинетические кривые накопления продукта X принимают характерный вид, наблюдаемый в экспериментах. Меняя константы скоростей отдельных стадий можно менять уровни накогкч-'п-ш продуктов я локализацию шксшума на кривой накопления X во времени (рас.5).

Подобран :*:Сор коястгяг, при которое, эксп&ралеитальше квиетические к :со!1ц?"1Тра!ц:о:г:2г.:. :ф:пзко обрззовсняя двух последовательных продуктов Б-якохслгегозкой рэакцпн удсвлгтвсрительно описыва-

- J 5-

ются в рамках предложенной схемы. На рис.(6, 7) проведено сравнение расчетных зависимостей с экспериментом.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что существенным моментом в кинетическом поведении животной 5-липоксигеназы является регуляция ионами кальция и, возможно, другими внутриклеточными мессенджерами, взаимодействия фермента с субстратом и промежуточным продуктом х. При этом ионы кальция играют основную роль в запуске 5-лшоксигеназной реакции и в комплексе с другими эффекторами - в остановке реакции. Что характерно, времена, в течение которых идет биосинтез, коррелируют с временами возврата концентрации кальция, мембранного потенциала к базальному уровню. Таким образом, экспериментальные данные по кинетике накопления 5-липоксигеназных метаболитов позволяют утверждать, что изменение концентрации ионов кальция в клетке играет основную регуляторную роль в кинетике образования двух последовательных продуктов 5-липоксигеназного окисления арахидоната, решающим образом влияя на первую стадию реакции, стадию образования 5-НРЕТЕ, и в значительно меньшей степени на вторую - стадию трансформации 5-НРЕТЕ в ИА4.

Зависимость начальной скорости синтеза лейкотриенов от концентрации кальциевого ионофора А23187.

В работе исследовались зависимости начальной скорости синтеза и удельной радиоактивности ьтв4 от концентрации ионофора Д23187 в интервале концентраций 0,1 -10 мкМ в присутствии и отсутствии экзогенной арахвдоновой кислоты (рис.9). Весь подъем скорости происходит при концентрациях до I мкМ, после этого зависимость выходит на плато. Кинетические эксперименты, которые обсуждались в предыдущих разделах, проводились при концентрации ионофора 5 мкМ, т.е. в условиях максимальной стимуляции нейтрофилов.

Зависимость скорости синтеза от концентрации стимула имеет ярко выраженный пороговый характер с коэффициентом Хилла 14±4. Эта кооперативность могла бы быть связана с тем, что ионофор одновременно активирует как минимум 2 процесса: высвобождение арахидоно-вой кислоты из фосфолипидов и переход 5-липоксигеназы в активное состояние. Действительно, падение удельной радиоактивности исв4 ( которое отражает высвобождение эндогенного арахидоната) при прозе-

V Ум

У

ур1тв,

./»'«¡Х/Ы

дении эксперимента в присутствии меченой арахидоновой кислоты происходит в том же интервале концентраций ионофора, что и нарастание скорости синтеза 5-липоксигеназных ме таболитов. Но оказалось, что в присутствии избытка экзогенной арахидоновой кислоты, являющейся субстратом реакции, высокая степень коопе-ративности сохраняется. Следовательно, существует дополнительная причина кооперативнос-ти, связанная с механизмом активации 5-липоксигеназы.

В результате исследования литературы выяснено, что величина подъема уровня внутриклеточного кальция линейно зависит от концентрации ионофора в интересующей нас области. Не обнаружено в экспериментах и существенного влияния ионофора на внутриклеточный рН при всех его концентрациях при рН среды 7,4. (Известно, что защелачивание цитозоля усиливает активность 5-липоксигеназы). Следовательно, наблюдаемую кооперативность действия А23187 нельзя объяснить кооперативным характером изменения концентраций арахидоновой кислоты, кальция или рН. Она может быть следствием сложного каскада реакций, запускаемого ионофором, суперпозиция которых дает высокий коэффициент Хилла.

начальной 5-НЕТЕ

и

Рис.9. Зааисккость скорости синтеза ЬТВд (а) и удельной радиоактивности ЪТВ. (б) от концентрации ионо-

4 7

фора А2318Т. 10 клеток/нл. 40 икМ АА. 1 .5 ыин.

Взаимосвязь адгезионных взамиодействий и синтеза лейкотриенов.

Известно, что в аргашзме существует два пула нейтрофилов -свободно циркулирующих в крови и прикрепленных к клеткам в тканях. В последней части работы исследуется, может ли прикрепление клетки

• ЛИ-

к поверхности , состояние ее адгезионных рецепторов, оказывать воздействие на синтез лейкотриенов. В работе показано, что адгезия нейтрофилов к стеклу неспособна сама по себе "включить" синтез лейкотриенов, но уменьшает синтез ьтв4, иад, а также 5-нрете под действием ионофора (табл.I).

Таблица 1. Сравнение синтеза лейкотриенов в суспензии и прикрепленными клетками.

Синтез ъта4 нмоль ив4 нмоль 5-НЕТЕ нмоль

Прикрепленными клетками 0.64±0.07 0.39±0.06 о

Нейтрофилами в суспензии 1.45±ОИ5 0.63±0.10 0.37±0.01

р<0.01 р<0.05

Параметр р характеризует первой и во второй строке значимость различия между величинами в

Это говорит о том, что прикрепление клеток к стеклу мешает активации 5-липоксигвназы - первого фермента синтеза лейкотриенов. Блокаторы адгезии короткоцепочечные пептида rgd и kgds в концентрациях 1СГ4-10~3М не оказывают воздействия на синтез липоксиге-назных продуктов нейтрофилами. Чем может быть вызвано такое действие адгезии?

Адгезия нейтрофилов к поверхностям опосредуется интегральными белками-гликопротеинами, являющимися рецепторами к белкам экстраклеточного матрикса и связывающимися с Arg-Giy-Asp (RGD) содержащими фрагментами этих белков. Эти рецепторы - интегрины - также могут проводить сигнал внутрь клетки.

В работе показано, что адгезия к стеклу, а также низкомолекулярные лиганда интегринов rgd и rgds индуцируют повышение рн цкто-золя. Также показано, что повышение рн среды, следствием которого является повышение внутриклеточного рн, увеличивает синтез лейкотриенов. Бели бы следствием адгезионных контактов было рН-уцравляемое изменение активности, то адгезия должна была бы стимулировать синтез 5-липоксигеназных продуктов. Реально действующий механизм регуляции не только компенсирует положительный эффект заболачивания, но и вызывает существенное снижение синтеза.

Хорошо объясняет полученные данные гипотеза о роли интегринов

как регуляторах транспорта кальция. Известно, что рецептор тромбоцитов к фибриногену Нь/Ша, имеющий много общего в строении с рецепторами, опосредующими адгезии нейтрофилов, при активации функционирует как кальциевый канал, причем его способность пропускать Са2+ в клетку ингибируется связыванием лиганда. Уровень свободного кальция в цитозолв играет центральную роль в регуляции шс-тивности 5-липоксигеназы в клетке. Адгезия на стекле, вовлекая в адгезионные контакты большой пул рецепторов, монет снижать поступление кальция в клетку и ингибировать синтез. Короткоцепочечные пептиды гни и Е?(Ж не ингибируют синтез лейкотриенов и, как показано в литературе, в роли блокаторов транспорта кальция не выступают. Заполнения участков интегринов, связывающих аргинин - глицин - аспартат, видимо, недостаточно для осуществления физиологических изменений в клетке, способных заметно повлиять на активность 5-липоксигеназы.

Интегринн, являясь, по-видимому, относительно слабыми модуляторам транспорта ионов кальция в клетку, благодаря компартмента-лизации всех процессов в живой клетке могут существенно влиять на процессы, сильно зависящие от концентрации свободного кальция.

В плане физиологическом снижение синтеза 5-липоксигеназных продуктов при прикреплении клеток может означать, что секреция нэйтрофалами оксикислот и лэйкогриенов эффективна только тогда, когда клетки находятся в потоке, что обеспечивает быстрый транспорт и действие этих короткокивущих липидных медиаторов, и малоэффективна, если они выделяются нейтрофилвми в плотную ткань.

" ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что экзогенная и эндогенная арахидоновая зга-слота являются параллельными взаимонезависимыми субстратами в реакции синтеза лейкотриенов нейтрофилами. Количественно определен вклад экзогенного субстрата в зависимости от его концентрации в суммарный биосинтез продукта.

2. На основе анализа всей совокупности литературных и экспериментальных дшш предложена кинетическая схема действия 5-

липоксигеназы, включающая в себя обратимую диссоциацию промевуточ-

-

ного продукта 5-нрете с фермента и инактивацию фермента в процессе реакции. Из анализа кинетической схемы установлено, что кофактор 5-липоксигеназы - ион Са2+ - решающим образом влияет на связывание фермента с субстратом - арахидоновой кислотой, и в значительно меньшей степени - на взаимодействие с промежуточным продуктом 5-нрете.

3. Найдено, что зависимость начальной скорости синтеза лейко-триенов от концентрации кальциевого ионофора A23I87 носит пороговый характер с коэффициентом Хилла более 10.

4. Установлено, что адгезия нэйтрофилов к поверхности понижает синтез лейкотриенов по сравнению с клетками в суспензии. Выдвинута гипотеза, что понижение может быть связано с уменьшением поступления кальция в клетку через кальциевые каналы, сопряженные с адгезионными рецепторами.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Судьина Г.Ф., Барский O.A., Варфоломеев С.Д. Роль экзогенного арахидоната в биосинтезе 5-липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты голиморфноядерными лейкоцитами человека при стимуляции кальциевым ионофором A23I87. // Биохимия.- 1990. - т.55, N 9, сЛ655-1659.

2. Судьина Г.Ф., Кобельков Г.М., Барский O.A., Варфоломеев С.Д. Кинетическая схема действия 5-липоксигеназы нэйтрофилов человека. // Биохимия.- 1990. - Т. 55, N 10, С. I795-I8II.

3. Судьина Г.Ф., Барский O.A. Закономерности ферментативного синтеза лейкотриенов нейтрофилами человека.// Материалы УI Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". Вильнюс - 1988.- часть П, С. 142-143.

4. Судьина Г.Ф., Кобельков Г.М., Барский O.A., Варфоломеев С.Д. Регуляция 5-липоксигеназной активности и кинетики биосинтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. // Тезисы докладов х симпозиума биохимических обществ СССР- ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности". Москва - 1989.- с. 74-75.