Получение и сравнительная характеристика рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Сидорова Ольга Вениаминовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО OMPF ПОРИНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2011

1 6 июн 2011

4850532

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН), г. Владивосток.

Научные руководители: Новикова О.Д., доктор химических наук,

старший научный сотрудник;

Исаева М.П., кандидат медицинских наук, доцент.

Официальные оппоненты: Монастырная М.М., доктор химических

наук, старший научный сотрудник;

Гаврилова Е.М., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Биолого-почвенный институт ДВО РАН

Защита состоится 23 июня 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314050, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ). Текст автореферата размещен на сайте диссертационного совета http://www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан 23 мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, научный сотрудник

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Порины наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий существуют в интактной мембране в виде гомотримеров, образуют водонаполненные поры, или каналы, через которые осуществляется транспорт низкомолекулярных веществ. Особенности структуры поринов и их поверхностная локализация обуславливают наличие у них многочисленных функций, отличных от транспортной. С одной стороны, порины представляют собой молекулы-мишени для иммунной системы организма-хозяина, с другой - выступают как факторы вирулентности и патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме.

Получение рекомбинантных белков в клетках Е. coli в виде телец включения (ТВ), которые представляют собой ассоциаты нерастворимых интермедиатов белка - широко распространенный подход, используемый для получения индивидуальных белков в препаративных количествах. Недостатком данного метода является то, что белки в составе подобных ассоциатов не обладают функциональной активностью, поэтому для использования рекомбинантных белков в практических целях требуется восстановление их пространственной структуры.

Изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно определить функциональную значимость тех или иных участков белковой молекулы. Известно, что поверхностно локализованные структурные элементы молекулы порина, так называемые наружные петли, входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.

Получение рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Изучение взаимосвязи между структурой, функциональными и антигенными свойствами мутантных белков позволит, во-первых, расширить фундаментальные представления о свойствах поринов и, во-вторых, открыть новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иерсиниями.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами (участками наружных петель) пространственной и антигенной структуры OmpF порина из У. pseudotuberculosis и его функциональными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера) белка.

Изучение порообразующих и иммунобиологических свойств рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза.

2. Расчет антигенных В- и Т-клеточных эпитопов, входящих в состав аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica), и синтез соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических пептидов как иммуногенов и диагностических антигенов.

3. Сайт-направленный мутагенез белок-кодирующего участка ompF гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе делеции петельных участков аминокислотной последовательности OmpF порина У. pseudotuberculosis. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга мутантных белков. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера) мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических свойств.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено структурно-функциональное исследование рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Показана возможность его использования в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулеза.

С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные В- и Т-клеточные эпитопы, входящие в состав аминокислотной последовательности поринов патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica) и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Впервые изучены их иммуногенные свойства и возможность использования как потенциальных антигенов для диагностики иерсиниозов.

Проведён сайт-направленный мутагенез ompF гена и созданы экспрессионные конструкции для получения OmpF поринов Y. pseudotuberculosis, несущих делеции участков наружных петель LI, L6 и L8. Впервые получены мутантные OmpF порины с указанными мутациями, а также охарактеризованы их физико-химические, порообразующие и иммунохимические свойства.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены автором на следующих конференциях и симпозиумах: III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007; 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, 2008; XIII Всероссийской школе-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010.

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 4 статьи в отечественных журналах и 8 тезисов

докладов в сборниках трудов Всероссийских и Международных конференций.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов работы, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 140 ссылок. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 5 таблиц.

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научным руководителям д.х.н. Новиковой О.Д. и к.м.н. Исаевой М.П., сотрудникам ЛМОАБИ к.х.н. Хоменко В.А., к.б.л. Портнягиной О.Ю. и аспиранту Чистюлину Д.К., а также зав. лабораторией д.х.н. Соловьёвой Т.Ф. за постоянное внимание к работе, ценные замечания и полезные советы на всех этапах исследования. Автор чрезвычайно благодарен сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе и обсуждении полученных результатов: к.ф.-м.н. Лихацкой Г.Н., н.с. Ким Н.Ю., к.б.н. Стенковой A.M., м.н.с. Гузеву К.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 4-х разделов, обобщены литературные данные о нативных и рекомбинантных поринах НМ грамотрицательных бактерий. Представлены сведения об их структуре, функции и иммунобиологических свойствах, а также о механизмах фолдинга in vivo и методах рефолдинга in vitro. Проанализированы литературные данные о методах сайт-направленного мутагенеза и экспрессии белков, а также о свойствах мутантных поринов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и рефолдинг рекомбинантного OmpF порина НМ К pseudotuberculosis

Для экспрессии ompF гена Y. pseudotuberculosis была использована плазмида рЕТ41а-ш55, сконструированная нами. После экспрессии белка в лизате трансформированных клеток E.coli штамма BL21 (DE3) с помощью метода иммуноблоттинга была обнаружен белок с подвижностью 40 кДа, который взаимодействовал со специфическими антителами к термостабильному мономеру (ТМ) порина псевдотуберкулезного микроба. В лизате клеток, не подвергшихся трансформации, подобный белок не был выявлен (рис. 1). Таким образом обнаруженный белок с мол. массой 40 кДа является порином из Y. pseudotuberculosis. Поскольку последовательность зрелого порина не содержит сигнальной последовательности, при

экспрессии белок накапливается в цитоплазме в виде телец включения (ТВ).

Рис. 1. Иммуноблоттинг белковых фракций с антителами кролика, полученными при иммунизации TM: 1 - лизат трансформированных клеток Я со/г; 2- лизат ^трансформированных клеток Я coli.

Рис. 2. Электрофорез белковых фракций: 1

- белки-стандарты, 2, 3 - ТМ, 4 - РБ-1, 5 - ТВ в 8М мочевине (прогретые при 100°С), 6 - ТВ в 8М мочевине, 7 - осадок ТВ (прогретый при 100°С), 8

- осадок ТВ, 9 - супернатант после обработки микробной массы ферментами (лизоцим, ДНКаза), ингибитором протеаз (РМБР1) и детергентами (ЭДТА2, ДОХ3) (прогретый при 100°С), 10 -супернатант после обработки микробной массы ферментами (лизоцим, ДНКаза), ингибитором протеаз (РМвР) и детергентами (ЭДТА, ДОХ).

1 — фенилметилсульфонилфторид;

2

— этилендиаминтетрауксусная кислота; ' — дезоксихолат натрия

ТВ выделяли из микробной массы центрифугированием в присутствии ферментов (лизоцим, ДНКаза), ингибитора протеаз (РМЭР) и детергентов (ЭДТА, ДОХ). Осадок ТВ экстрагировали 8 М водным раствором мочевины при озвучивании (частота 44 МГц) (рис. 2). Мочевину удаляли с помощью диализа (в течение 4-х суток) против Тпэ-НСД буфера (рН 7.8), содержащего 0.1%-ный 2\уШег£еЩ 3-14 3-14). Полученный образец белка (26 мг/мл) по данным 808, ПААГ-электрофореза содержал целевой рекомбинантный белок (РБ-1) (рис. 3). Электрофоретическая подвижность РБ-1 совпадала с подвижностью ТМ порина. Рефолдинг белка проводили последовательной ионообменной хроматографией: на КМ Сефарозе ОЕАЕ СЬ 6В (анионообменник) и на Сефарозе СЬ 4В (катионообменник). Наличие белка контролировали с помощью 808, ПААГ-электрофореза. Фракции, полученные после двух циклов хроматографии, содержали олигомерную форму (тример) рекомбинантного порина (РБ-2).

щ М II щ Ш 15 6 7

Рис. 3. Электрофорез белковых фракций после двух циклов хроматографии: 1 - ТМ, 2 - белки-стандарты, 3 - РБ-1 (прогрет при 100°С), 4 - РБ-2.

2. Пространственная структура полученных рекомбинантных белков

Пространственная структура полученных реко!мбинантных белков была охарактеризована с помощью методов оптической спектроскопии.

Как видно из данных рис. 4, а-2, спектр КД образца РБ-2 в ближней УФ области не имеет четко разрешенных положительных полос, свидетельствующих, как правило, о жестко фиксированной третичной структуре белка. Тем не менее, величина амплитуды спектра указывает на достаточно сформированную пространственную структуру полученного олигомера порина. Подобные спектры характерны для частично свернутых интермедиатов фолдинга мультидоменных белков. Спектр КД РБ-1 в ближней УФ области имеет отрицательный максимум, что может указывать на значительную степень денатурации (качественно отличающуюся структуру) мономера порина по сравнению с олигомером.

В спектре КД РБ-2 в пептидной области (рис.4, 6-2) наблюдается отрицательная полоса небольшой интенсивности с максимумом при 217 ± 1 нм, форма которой свидетельствует о значительной доле (3-структуры в молекуле белка. Подобный спектр имел нативный порин НМ Y. pseudotuberculosis в присутствии неионного детергента октил-fi-D-глюкопиранозида (ОГ). В спектре КД РБ-1 отрицательная полоса с максимумом при 217 ± 1 нм имеет значительно большую интенсивность (рис. 4, 6-1), что указывает на присутствие в полипептидной цепи белка как Р-структурированных, так и а-спирализованных участков.

Качественный анализ спектров был подтверждён расчётами элементов вторичной структуры с использованием программы COTIN/LL-CONTIN (табл. 1). Как видно из таблицы, тримеры поринов, как нативного изолированного (ИТ), так и рекомбинантного (РБ-2), имеют практически одинаковое соотношение элементов вторичной структуры, тогда как ТМ порин, по сравнению с РБ-1, имеет почти втрое большее количество а-спирализованных участков. Возможно, это связано с более жесткими условиями (кипячение в присутствии SDS) получения ТМ.

120 кДа

40 кДа

12 3 4

Рис. 4. Спектры КД в ароматической (а) и пептидной (б) области. 1 — РБ-1, 2 - РБ-2, 3 - ТВ в 8 М мочевине.

Таблица 1. Элементы вторичной структуры (в единичных долях) рекомбинантных и изолированных поринов, рассчитанные по программе СОШ/Ы-СОЫШ (пакет программ СВРго)

Образец а -структура Р -структура Р- изгиб Неупоряд. структура Кол-во реперных белков Тип Р-структурир ованных белков

РБ-1 0,057 0,31 0,230 0,401 43 все р

ТМ 0,157 0,297 0,226 0,320 43 все р, а+р

РБ-2 0,038 0,402 0,218 0,341 43 все р

ИТ 0,043 0,421 0,219 0,318 48 все р,а/р

Особенности третичной структуры рекомбинантных поринов были исследованы методом собственной белковой флуоресценции. Обнаружено, что значительный вклад в суммарную флуоресценцию РБ-1 вносят остатки тирозина. Так, максимум суммарной флуоресценции РБ-1 смещен в коротковолновую область спектра на 20 нм по сравнению с максимумом в спектре ТМ порина. Известно, что коротковолновый сдвиг максимума спектра флуоресценции связан с увеличением вклада в эмиссию белков остатков тирозина за счет уменьшения их тушения боковыми группами аминокислотных остатков и/или за счет уменьшения передачи энергии возбуждения от тирозина к триптофану в результате увеличения расстояния между ними. В то же время, максимум суммарной флуоресценции РБ-2 смещен в длинноволновую область на 7 нм по сравнению с максимумом суммарной эмиссии ИТ, а ЛЛ,!/2 спектра РБ-2 больше соответствующего значения спектра ИТ на 12 нм. Таким образом,

третичные структуры изолированного и рекомбинантного тримеров порина различаются. Структура последнего носит черты денатурированного белка, возможно, она недостаточно сформирована.

Проведенные исследования подтвердили сделанные нами ранее выводы о различной степени стабильности пространственной организации поринов на уровне вторичной и третичной структуры белка. Вторичная структура поринов отличается высокой стабильностью и способностью к ренатурации. Для третичной структуры порина характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга белка.

3. Функциональная активность рекомбинантного порина

Методом реконструкции белка в бислойные липидные мембраны (БЛМ) проведено изучение порообразующей активности полученных рекомбинантных белков (РБ-1, РБ-2). В присутствии РБ-2 (концентрация белка 10 нг/мл) наблюдались единичные включения белка и ступенчатое изменение проводимости мембраны поринового типа (рис. 5, а). Увеличение концентрации порина до 16 нг/мл приводило к увеличению интегральной проводимости мембраны (рис. 5, б). Наиболее вероятная величина проводимости пор составляет 280-300 пСм.

Рисунок 5. Запись тока через БЛМ в присутствии образца РБ-2 при концентрации 10 нг/мл (а) и 16 нг/мл (б). Мембранный потенциал 50 мВ.

Флуктуации тока поринового типа обнаружены также в присутствии РБ-1. Наличие порообразующей активности у этого образца белка можно объяснить либо присутствием незначительного количества олигомерной формы порина (не выявляемой в условиях SDS, ПААГ-электрофореза), либо способностью мономера в присутствии липидного бислоя образовывать активные три меры. Таким образом, впервые получен рекомбинантный тример порина Y. pseudotuberculosis в функционально активной конформации.

- 104. Иммунобиологические свойства рекомбинантного мономера OinpF порина НМ Y. pseudotuberculosis

4.1. Изучение иммуногенной активности РБ-1. Как правило, для иммунизации экспериментальных животных используют либо белки в смеси с полным адьювантом Фрейнда, либо белки в растворах неионных детергентов. Для изучения иммуногенной активности РБ-1 использовали мышей линии СВА. Уровень образования специфических антител определяли с помощью иммунизации мышей белком в водных растворах 3-14 и ОГ, в смеси с адьювантом Фрейнда и в индивидуальном виде (суспензия в физиологическом растворе) (рис. 6). Титры антител пуловых иммунных сывороток (в определенные с помощью ИФА, находились в интервале от 1.90 до 3.55. Полученные результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантные белки в растворах неионных детергентов могут быть использованы для получения специфических иммунных сывороток без добавления адъюванта Фрейнда, применение которого в последнее время вызывает много споров ввиду его токсичности и аллергенности. Наибольший уровень антителообразования наблюдался при иммунизации животных порином в растворе Ъя 3-14 (рис. 6).

Для всех полученных сывороток были определены значения индекса авидности (ИА), который характеризует способность гетерогенной смеси антител связываться с конкретным антигеном и зависит от прочности комплекса антиген/антитело. Обнаружено, что значения ИА всех сывороток к рекомбинантному порину, находятся в интервале от 79 до 89 %. Это свидетельствует о высокой специфичности антител, полученных при иммунизации животных РБ-1 как в индивидуальном виде, так и в смеси с адьювантом или детергентом (рис. 7).

Рис. 6. Определение интенсивности иммунного ответа при иммунизации мышей линии СВА рекомбинантным мономером порина в растворе Ъм 314 (РБ/гуу), в растворе ОГ (РБ/ОГ), в смеси с адьювантом Фрейнда (РБ/Фр), в физиологическом растворе (РБ).

ИА%

Рис. 7, Определение индекса авидности (ИА, %) в сыворотках крови мышей, иммунизированных РБ-1 в растворе Zw 3-14 (РБ^), в растворе ОГ (РБ/ОГ), в смеси с адьювантом Фрейнда (РБ/Фр) и в физиологическом растворе (РБ).

4.2. Применение рекомбинантнго мономера порнна в качестве диагностического антигена. Известно, что применение рекомбинантных белков или синтетических пептидов в качестве компонентов диагностических тест-систем позволяет повысить чувствительность последних, а также избежать неспецифической гипердиагностики. В связи с этим была изучена возможность применения РБ-1 в качестве антигена в ИФА тест-системе для диагностики острых кишечных и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза. Необходимо отметить, что в настоящее время в клинической практике нет достаточно эффективных диагностических тестов для выявления острых кишечных форм иерсиниозов. Кроме того, полностью отсутствует систематическая диагностика вторично-очаговых форм (или иммунопатологий) псевдотуберкулеза, которые отличаются полиорганностью поражения организма и сопровождаются нарушениями функции сердечно-сосудистой и нервной систем, опорно-двигательного аппарата, мочевыделительной системы и желудочно-кишечного тракта.

ТМ РБ ТМ РБ

Рнс. 8. ИФА сыворотки больного псевдотуберкулезом при взаимодействии с различными антигенами: 1- ТМ и 2 - РБ (а). Выявление специфических антител к РБ в ИФА с сыворотками больных вторично-очаговыми формами псевдотуберкулеза: ряд 2- сыворотка крови больного с симптомами поражения опорно-двигательного аппарата; ряд 1, 4 - сыворотки крови больных с симптомами поражения периферической нервной системы; ряд 3 - контроль (б).

Было показано, что РБ-1 взаимодействует с антителами в сыворотках крови больных острой кишечной формой псевдотуберкулеза в

диагностическом разведении 1:800, т.е. проявляет активность, сравнимую с активностью ТМ порина (рис. 8, а). Последний используется как антиген в разработанной нами ИФА тест-системе для диагностики псевдотуберкулеза.

При анализе сывороток крови больных с симптомами вторично-очаговой формы псевдотуберкулеза (поражения опорно-двигательного аппарата и периферической нервной системы) также были обнаружены специфические антитела к рекомбинантному порину Y. pseudotuberculosis. Показано, что РБ-1 выявляет специфические антитела в среднем в 1.3 раза эффективнее по сравнению с порином, изолированным из НМ псевдотуберкулезного микроба (рис. 8, б).

5. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний

Для поиска с помощью компьютерных программ консервативных участков, содержащих В- и Т-клеточные эпитопы, были использованы аминокислотные (АК) последовательности OmpF и ОтрС поринов патогенных иерсиний. Последовательности OmpF поринов Y. pseudotuberculosis (UniProt KB/Tr EMBL Q5EMM5) и Т. enterocolitica ранее были определены нами из нуклеотидной последовательности их генов. АК последовательности OmpF (Swiss-Prot Q8Zg94) и OmpC (NCBINP 404824) поринов Y. pestis, а также последовательности OmpC поринов Y. pseudotuberculosis (NCBI YP069796) и Y. enterocolitica (UniProt KB/TrEMBL A1JU47) были взяты из баз данных.

Сайты связывания с В-клетками для неспецифических поринов Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis были рассчитаны с помощью программы ADEPT. Для расчетов Т-эпитопов использовали программы ProPred, SYFPEITHI и RANKPEP. Указанные программы предназначены, в основном, для выявления эпитопов, специфичных к рецепторам лимфоцитов человека и имеют определенные ограничения в отношении экспериментальных животных. Поэтому при выборе эпитопов учитывали гипотезу Вольпиной с соавт. о том, что для эффективного взаимодействия с МНС II мыши и успешной индукции синтеза специфических антител у мышей инбредных линий пептиды должны содержать девятичленный фрагмент, имеющий в 1-м положении гидрофобный АК остаток, а в 9-м -положительно заряженный АК остаток

В результате были выбраны 4 пептида с различной степенью гомологии по отношению к соответствующим фрагментам молекул OmpC и OmpF поринов патогенных иерсиний (табл. 2). В - клеточные эпитопы представляли собой участки наружных петель, а примыкающие к ним консервативные трансмембранные участки р - барреля соответствовали Т-хелперным эпитопам. Предсказанные пептиды были синтезированы в

формате мультивалентных антигенных пептидов (МАП). Они включали 4 АК последовательности (соответствующие рассчитанным эпитопам), ковалентно связанные с иммунохимически инертным лизиновым кором.

Таблица 2. Степень гомологии (в %) АК последовательностей антигенных пептидов и фрагментов поринов патогенных видов иерсиний.

МАП Соответствующая МАП АК последовательность У. pseudotuberculosis Y.enterocolilica Y.peslis

OmpF OmpC OmpF OmpC OmpF OmpC

1 WEYQVNLNKAENEDGNHDSF 45 100 45 75 45 100

2 YTQTYNLTRFGDFSNRSSDA 45 100 40 85 35 100

3 LQYQGKNDRSEVKEANGDGF 100 90 85 65 100 35

4 RTLDQKYGSTAEGDKAQAWN 100 40 80 35 100 30

Наличие в составе МАП В-клеточных эпитопов было подтверждено с помощью взаимодействия пептидов с кроличьими антителами, полученными к тримерам ОтрС поринов НМ У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica, а также с сыворотками крови людей, переболевших псевдотуберкулезом или кишечным иерсиниозом. Как видно из графических данных (рис. 9, а, б), эффективность взаимодействия МАП с кроличьими антителами к тримерам и мономерам порина существенно ниже, чем эффективность реакции указанных антител с гомологичными антигенами. Тем не менее, все МАП реагируют с антителами в сыворотках крови пациентов при разведении 1:800 (диагностический титр в ИФА тест-системе на основе ТМ порина) (рис. 9, в). Полученные результаты (рис. 9, б) позволяют предположить, что теоретически рассчитанные эпитопы принимают минимальное участие в 4юРмиРовании гуморального иммунного ответа в организме животных при иммунизации обеими (ИТ и ТМ) молекулярными формами порина. Однако эти эпитопы проявляются как антигенные детерминанты и стимулируют выработку антител в организме человека при естественном течении заболевания (рис. 9, в).

Наибольшая эффективность МАП-1 в ИФА обусловлена, вероятно, наличием в составе данного пептида фрагмента АК последовательности, «универсального» для поринов патогенных иерсиний, на который в теплокровном организме вырабатываются антитела как при иммунизации (рис. 9, а), так и при естественном течении инфекции (рис. 9, в). Обнаружено существование взаимосвязи между конформацией порина, к

которому были получены антитела, и эффективностью взаимодействия этих антител с МАП. Так, МАП-!, в состав которого включены антигенные детерминанты петли Ь2, играющей важную роль в стабилизации тримерной структуры порина в НМ, максимально активно взаимодействует с антителами к комплексу пептидогликан-белок (ПГ-б), в составе которого порин сохраняет нативное окружение (рис. 9, г).

О МАП-1 □ МАП-2 □ МАП-3 □ МАП-4 И

□ МАП-2 □ МАП-3 □ МАП-4 Ого

лы

ОМАП-1 а МАП-2 О МАП-3 □ МАП-4

Y .pseudotuberculosis Y.enterocolltlca

1 0,5

Sm

" 0,3 О 0,2 ОД

антиген МАП-1

Рис. 9. ИФА взаимодействия МАП с антителами в сыворотках крови (разведение 1:800): а - кроликов, иммунизированных изолированными тримерами поринов Y'.pseudotuberculosis и Y. enterocolitica\ б - кроликов, иммунизированных изолированными тримерами и мономерами порина Y.pseudotuberculosis', в - больных кишечным иерсиниозом (Y. enterocolitica) и псевдотуберкулезом (У. pseudotuberculosis)', г - кроликов, иммунизированных поринами Y. pseudotuberculosis: мономером (АТ/ТМ), комплексом ПГ-б (АТ/ПГ-б) и изолированным тримером (АТ/ИТ).

Наличие в АК последовательности синтезированных МАП участков, соответствующих Т-клеточным эпитопам, определяли по способности пептидов индуцировать образование антител у экспериментальных животных. В результате трехкратной иммунизации мышей линии ВАЬВ/с были получены сыворотки, содержащие специфические антитела ко всем пептидам. Наиболее сильными иммуногенами оказались МАП-2 и МАП-4: титры антисывороток к ним в 1.3 раза и более превышали таковые к МАП-1 и МАП-3.

Таким образом показано, что пептиды, предсказанные с помощью компьютерных программ как антигенные детерминанты поринов патогенных иерсиний, вызывают синтез антител в организме. Данные

пептиды могут быть использованы в качестве диагностических антигенов. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов формирования специфического иммунитета против патогенных для человека иерсиний.

6. Получение мутантных OmpF поринов Y. pseudotuberculosis с делениями наружных петель

6.1 Компьютерное моделирование мутантных форм OmpF порина У. pseudotuberculosis. Методами компьютерного моделирования построены теоретические модели рекомбинантных мутантных поринов Y. pseudotuberculosis и получены данные об их пространственной структуре и свойствах. Оптимизация структуры молекул проводилась методом минимизации энергии с потенциалом сил AMBER99 в программе МОЕ. Для оценки энергии образования олигомеров мутантных форм порина были проведены расчеты энергии в вакууме для мономеров и тримеров белка с помощью программы GROMACS 3.3 и потенциалом сил G43bl (табл. 3).

Таблица 3. Потенциальная энергия мономеров и тримеров мутантных поринов и энергия образования тримеров белка (в вакууме)._

Мутация Энергия мономера, кДж/моль Энергия тримера, кДж/моль Энергия образования тримера, кДж/моль

Del LI -22120,072 -68703,133 -2342,914

Del L6 -22653,137 -70162,055 -2202,644

Del L8 -22185,885 -68701,742 -2144,087

Порин без мутаций -22428,176 -69447,758 -2163,230

6.2. Сайт-направленный мутагенез. Для получения мутантных поринов использовали плазмиду рЕТ41а-ш55, сконструированную для экспрессии полноструктурного рекомбинантного OmpF порина. Плазмида была трансформирована в клетки Е. coli штамма XL-1 Blue и затем выделена методом щелочного лизиса. Амплификацию со специально подобранными олигонуклеотидными праймерами проводили согласно протоколу для полимеразы Pfu Ultra II (Stratagene, США). Полученную после амплификации смесь мутантных и исходных плазмид обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Dpnl (Fermentas, Литва) для расщепления исходной («родительской») плазмидной ДНК. С целью оптимизации процесса получения мутантных рекомбинантных белков апробировали 2 различных подхода.

-166.2.1. Первый способ получения мутантных поринов Для получения мутантных белков по данному методу был проведен сайт-направленный мутагенез петель L6 и L8.

Последовательность стадий получения мутантных белков:

• трансформация полученной мутантной плазмидной ДНК компетентных клеток Тор 10 Е. coli;

• ПЦР-скрининг колоний, содержащих мутантные плазмиды;

• выделение плазмидных ДНК из положительных колоний и трансформация ими экспрессионного штамма Rosetta Е. coli;

• поиск «функциональных» колоний, экспрессирующих целевой белок, с помощью данных SDS, ПААГ-электрофореза;

• секвенирование «функциональных» плазмид.

Трансформаг^ия и ПЦР колоний. Трансформацию клеток Тор-10 Е. coli проводили полученной после сайт-направленного мутагенеза (делеции петель L6 и L8) плазмидной ДНК. Наличие делеций проверяли при помощи ПЦР колоний. Для контроля мутаций использовали по 2 пары праймеров для каждой петли. Для петли L8: праймеры L6-for/L8-rev (проверка колоний на наличие делеции) и праймеры L6-for/OmpF-cds-rev (положительный контроль реакции, ожидаемый фрагмент 307 п.н.). Результаты ПЦР показали, что для выделения плазмидной ДНК наиболее подходящими являются колонии 4 и 5 (рис.10). Для петли L6 проверка проводилась аналогичным образом с теми же праймерами (ожидаемый фрагмент 342 п.н.).

Рис. 10. Результаты ПЦР-скрининга на наличие делеции петли L8. А: проверка колоний на наличие делеций; Б: положительный контроль.

Выделение и трансформация плазмидной ДНК. Выделенными плазмидами трансформировали клетки Е. coli штамма Rosetta, которые затем помещали на чашки с питательной средой, содержащей канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (34 мг/мл). Выросшие колонии были отобраны для экспрессии.

Экспрессия мутантных поринов. Аналитическую экспрессию проводили в 30 мл среды. Отбор экспрессионных колоний осуществляли с помощью SDS, ПААГ - электрофореза (в качестве контроля был использован полноструктурный мономер рекомбинатного OmpF порина) (рис. 11). Как видно из рисунка, белок экспрессировался в двух формах, одна из которых имеет подвижность несколько большую, нежели у контрольного белка. Мы предположили, что именно эта полипептидная зона (колонии 3, 8 и 9) соответствует порину с целевыми мутациями.

Рис. 11. Результаты экспрессии мутантных поринов: 1 - плазмида рЕТ41а без вставки ompF гена; 2-5 -колонии с делецией петли L6; 710 - колонии с делецией петли L8; 6 - полноструктурный OmpF порин (контроль); 11 - контрольная плазмида рЕТ41а-т55 со вставкой ompF гена.

6.2.2. Второй метод получения рекомбинантного белка. Для получения мутантных белков по данному методу был проведён сайт-направленный мутагенез по петлям LI, L6 и L8.

Последовательность стадий получения рекомбинантных белков:

• трансформация полученной после мутагенеза плазмидной ДНК экспрессионного штамма Rosetta Е. coli Dpnl-обработанной смесью полученных после мутагенеза плазмид;

• экспрессия белка с целью отбора колоний, экспрессирующих мутантный целевой порин;

• наработка ПЦР-фрагментов с помощью стандартных Т7-праймеров для идентификации мутаций в отобранных «функциональных» колониях;

• очистка и секвенирование ПЦР-продукта плазмид.

Предварительная экспрессия. С целью отбора колоний, содержащих мутантные плазмиды, была проведена аналитическая экспрессия белков в 30 мл среды. Результаты экспрессии оценивали с помощью ЗББ, ПААГ-электрофореза (рис. 12). Колонии 1 и 2 (рис. 12, А), а также колонии 6 и 812 (рис. 12, Б) были отобраны для дальнейшей работы.

Рис. 12. А. Результаты экспрессии мутантного OmpF порина, несущего делецию петли LI. 1 - 6 - колонии с делецией петли L1; 7 - полноструктурный OmpF порин Y. pseudotuberculosis (контроль). Б. Результаты экспрессии мутантного OmpF порина, несущего делеции петли L6 (колонии 8-12) и L8 (колонии 5, 6).

ПЦР колоний, выделение ПЦР-фрагментов и их секвенирование. Колонии, предположительно экспрессирующие белки с мутациями, были отобраны для выделения ПЦР-фрагментов и их секвенирования с помощью праймеров T7prora/T7term. Амплификация проводилась согласно протоколу для Go Taq полимеразы (Fermentas. Литва). ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Литва) и секвенировали (рис. 13) на автоматическом ДНК анализаторе 3130XL (Applied Biosystems, США). С помощью секвенирования устанавливали не только наличие мутаций (рис. 13), но и целостность остальной части белок-кодирующей последовательности ompF.

Рис. 13. Результаты секвенирования (на примере образцов с делецией петли Ь6). Выравнивание олигонуклеотидной последовательности выполнено в программе МЕ6А4.

Таким образом, показано, что «функциональные» колонии, продуцирующие целевые мутантные белки, имеются в экспрессионных конструкциях, полученных обоими методами. Это позволяет считать оба способа результативными и эффективными, но второй метод существенно более экономичен как по времени (меньшее число этапов эксперимента),

так и по расходу реактивов, необходимых для получения целевых мутантных белков.

6.3. Выделение и рефолдинг мутантных форм рекомбннантного OmpF порина К pseudotuberculosis.

Выделение белков с мутациями петель LI, L6 и L8 (далее -образцы del 1, del 6 и del 8) проводили аналогично выделению полноструктурного рекомбинантного OmpF порина за исключением того, что при этом использовали удвоенное количество лизоцима и ДНКазы. В качестве контроля параллельно с мутантными белками выделяли и полноструктурный рекомбинантный OmpF порин Y. pseudotuberculosis (рис. 14 и 15).

Рис. 14. Электрофорез мутантных белков: 1 и 2 - осадок образца полноструктурного OmpF порина после двукратной обработки Triton X-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно); 3 - рекомбинантный OmpF порин Y. pseudotuberculosis (контроль, экспрессия в другом штамме); 4 и 5 - осадок образца del 8 после двукратной обработки Triton Х-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно).

Рис. 15. Электрофорез мутантных белков: 1 и 2 - супернатант после отмывки образца del 1 от Triton Х-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно); 3 и 4 - супернатант после отмывки образца del 6 от Triton Х-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно); 5 и 6 - осадок образца del 1 после обработки Triton Х-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно); 7 - ТВ OmpF в 8 М мочевине (экспрессия в штамме Rosetta Е. coli); 8 и 9 - осадок образца del 6 после обработки Triton Х-100 (непрогретый и прогретый при 100°С соответственно).

Очистку ТВ, содержащих мутантные порины, от мочевины проводили методом диализа против Т™-НС1 буфера (рН 7.8), содержащего 0.1% Ъп 3-14. После длительного (в течение 4-х суток) диализа были получены целевые мутантные белки в мономерной форме. Их

элекгрофорегическая подвижность по данным SDS, ПААГ-электрофореза совпадала с подвижностью РБ-1. Результаты рефолдинга мономеров мутантных поринов были подтверждены с помощью иммуноблоттинга в реакции с кроличьими антителами к нативному мономеру порина и с мышиными антителами к РБ-1.

Тримеры мутантных поринов получали, как описано выше (раздел 1). Результаты сборки олигомерной формы белков были подтверждены данными SDS, ПААГ - электрофореза (рис. 16).

Рис. 16. Сборка образцов мутантных белков после диализа и ионообменной хроматографии: 1, 2, 3 -тримеры del 1, del 6 и del 8 соответственно; 4 -контроль (тример полноструктурного OmpF порина); 5,6,7- мономеры del 1, ^чокда del 6 и del 8 соответственно (до ионообменной хроматографии); 8 -контроль (мономер полноструктурного OmpF порина).

6.4. Пространственная структура мутантных поринов

Круговой дихроизм. Для спектров КД мутантных поринов по сравнению со спектром полноструктурного рекомбинантного тримера РБ-2 наблюдается более низкая амплитуда (del 6 и del 8) и меньшая степень разрешенное™ (del 1, del 6 и del 8) полос, что указывает на более рыхлую третичную структуру тримеров мутантных белков.

Спектры КД образцов мутантных поринов в области поглощения пептидных связей являются характерными для (^-структурированных белков а+Р типа. Однако форма спектров белков с делециями различных петель (интенсивность отрицательных и положительных полос) несколько различаются. Расчет содержания элементов вторичной структуры исследованных поринов. выполненный по программе CDPro, позволил выявить указанные различия. Так, мутантные порины с делециями петель L1 и L6 содержат насколько большее (соответственно в 1.8 и 2.5 раза) количество а-спиральных участков по сравнению с РБ-2 и мутантным порином del 8. Мутантный порин с делецией петли L6, несмотря на высокое содержание а-спирали (характерного признака денатурации поринов), содержит наименьшее количество неупорядоченной структуры. Именно этот образец порина имеет сходное с РБ-2 соотношение двух типов Р-структуры (Р денат./р неденат.): 0.5 и 0.55 соответственно. Для других мутантных белков (del 1 и del 8) эти соотношения имеют большую величину и равны, соответственно, 0.66 и 0.70. Таким образом, отсутствие

120 кДа

той или иной наружной петли влияет на соотношение элементов регулярной вторичной структуры порина.

Собственная белковая флуоресценция. Спектры суммарной эмиссии тримеров исследованных поринов и их аппроксимация спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина указывают на значительные различия в микроокружении ароматических флуорофоров. Отсутствие петли L8 в наименьшей степени приводит к изменениям в третичной структуре рекомбинантного тримера (РБ-2) порина. В то же время в случае мутантных поринов с делениями петель L1 и L6 по сравнению с РБ-2 наблюдается существенное увеличение доли триптофановых остатков спектральной формы I (в 1.8 и 2.2 раза соответственно). Тем не менее, в отличие от нативного порина все мутантные белки имеют более длинноволновое положение максимумов как суммарной, так и триптофановой флуоресценции. Это может быть обусловлено увеличением вклада триптофана спектральной формы II и уменьшением вклада триптофана спектральной формы S в эмиссию мутантных белков.

Таким образом, пространственная структура полученных мутантных белков по сравнению с таковой полноструктурного рекомбинантного порина имеет свои особенности на уровне как вторичной, так и третичной структуры белка.

Изучение термоустойчивости мутантных поринов методом SDS, ПААГ-электрофореза показало, что в случае отсутствия петли L1 диссоциация тримеров белка начинается при температуре 60°С, что на 10°С ниже, чем в случае полноструктурного рекомбинантного и мутантных (del 6 и del 8) поринов.

6.5. Функциональная активность мутантных поринов

Функциональная активность мутантных поринов была охарактеризована с помощью техники БЛМ. При добавлении белков (10-20 нг/мл) в водную фазу наблюдались ступенчатые изменения проводимости мембраны, характерные для порообразующих белков. Анализ записей тока через БЛМ показал, что величины наиболее вероятного уровня проводимости пор рекомбинантного и мутантных поринов близки и составляют 360±60 пСм. Это значение соответствует проводимости канала тримера нативного порина из НМ Y. pseudotuberculosis. Таким образом, отсутствие петель LI, L6 и L8 не влияет на размер каналов OmpF порина псевдотуберкулезного микроба.

-226.6. Иммунохимическая характеристика мутантных поринов

Антигенная структура мутантных белков была охарактеризована с помощью ИФА. Обнаружено, что мутантные порины с делециями наружных петель взаимодействуют со специфическими антителами к полноструктурному рекомбинантному и к нативному OmpF поринам (рис. 17).

Результаты реакции связывания полноструктурного OmpF порина и мутантных белков с антисывороткой к РБ-1 аналогичны (рис. 18, А). Это свидетельствует о том, что участки последовательности порина, соответствующие наружным петлям L8, LI, L6, не участвуют в формировании антигенных детерминант мономера полноструктурного рекомбинантного порина. Подобная картина наблюдается и при взаимодействии мутантных поринов del 1 и del 6 с антителами к нативному OmpF порину (рис. 18, Б). Напротив, белок del 8 взаимодействует с этими антителами на 30-40% менее эффективно.

Как было показано ранее, структура антигенных детерминант рекомбинантного и нативного поринов имеет лишь частичное соответствие за счет недостаточно сформированных конформационных детерминант, образующихся в результате сближения отдельных участков молекулы в процессе сборки третичной и четвертичной структуры белка. Полученный результат может свидетельствовать о том, что участки последовательности белка, соответствующие петле L8, входят в состав конформационных антигенных детерминант нативного порина.

Рисунок 17. ИФА взаимодействия мутантных поринов со специфическими антителами к полноструктурному рекомбинантному (А) и к нативному (Б) OmpF поринам.

Таким образом, отсутствие в структуре белка наружных петель, за исключением L8, мало изменяет антигенную структуру OmpF порина НМ Y. pseudotuberculosis. Этот результат согласуется с данными теоретических расчётов антигенных детерминант OmpF порина. Использование таких программ, как ProPred, SYFPEITHI и RANKPEP, показало, что менее 20%

от общего количества рассчитанных пептидов, взаимодействующих с Т-рецепторами на поверхности человеческих лимфоцитов, приходится на участки наружных петель. Среди них, в свою очередь, более 70% пептидов приходится на петлю Ь8.

ВЫВОДЫ

1. Из трансформированных клеток Е. coli получен рекомбинантный OmpF порин наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis в мономерной форме (РБ-1). С помощью ионообменной хроматографии в присутствии детергента Zwittergent 3-14 осуществлена сборка полученного мономера в олигомерную структуру (рекомбинантный тример РБ-2).

2. Методами оптической спектроскопии охарактеризована пространственная структура полученных рекомбинантных белков. Показано, что вторичная структура поринов отличается высокой стабильностью и способностью к ренатурации. Для третичной структуры этих белков характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга.

3. Изучены иммунобиологические свойства рекомбинантного мономера порина. Установлено, что РБ-1 вызывает продукцию IgG антител как в смеси с адъювантом Фрейнда, так и в растворе неионного детергента Zwittergent 3-14. Продемонстрирована эффективность использования РБ-1 в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза.

4. С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные Т- и В-эпитопы поринов патогенных видов иерсиний и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Изучены иммунобиологические свойства полученных пептидов и показана возможность их использования как диагностических антигенов для верификации иерсиниозов.

5. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены плазмиды, несущие мутантные ompF гены порина Y. pseudotuberculosis. Наличие делеций петель LI, L6 и L8 подтверждено секвенированием.

6. Проведена экспрессия мутантных белков с делециями петель LI, L6 и L8. Из трансформированных клеток Е. coli штамма Rosetta получены белки с данными мутациями. Подобраны условия выделения и рефолдинга мономерной и тримерной форм мутантных белков.

7. Выявлены особенности пространственной структуры мутантных поринов. Показано, что все мутантные белки имеют выраженную, но

менее жесткую (по сравнению с полноструктурным рекомбинантным OmpF порином) третичную структуру. Отсутствие наружных петель петель LI, L6 и L8 приводит к изменению соотношения элементов регулярной вторичной структуры порина. Обнаружено, что только отсутствие петли L1 снижает термоустойчивость мутантного белка.

8. Фунциональная активность полученных полноструктурного и мутантных поринов изучена с помощью техники бислойных липидных мембран. Показано, что отсутствие петель LI, L6 и L8 не влияет на размер каналов OmpF порина псевдотуберкулезного микроба.

9. Изучение антигенных свойств мутантных поринов показало, что наружные петли LI, L6 и L8 не участвуют в формировании антигенных детерминант рекомбинантного порина. Тем не менее, участок аминокислотной последовательности белка, соответствующий петле L8, входит в состав конформационных антигенных детерминант нативного тримера порина.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. О.В. Сидорова, О.Ю. Портнягина, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, В.А. Хоменко. Использование компьютерных программ для расчётов антигенных детерминант порообразующих белков наружной мембраны патогенных иерсиний // В: Сб. тезисов докладов II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток. 19-22 декабря 2006 г. С. 91.

2. Д.В. Антонец, А.Ю. Бакулина, О.Ю. Портнягина, О.В. Сидорова, О.Д. Новикова, А.З. Максютов. Предсказание антигенно-активных районов OmpF-подобного порина // Доклады АН. 2007. Т. 414. № 4 . С. 1-3.

3. О.Ю. Портнягина, В.А. Хоменко, О.П. Вострикова, М.П. Исаева, Н.Ю. Ким, Г.Н.Лихацкая, О.В. Сидорова. О.Д. Новикова, Т.Ф. Соловьева. Выделение, рефолдинг и практическое применение рекомбинантного порина наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // В: Сб тезисов дакладов III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. 2007 г. С. 105.

4. О. Ю. Портнягина, В. А. Хоменко, О.В. Сидорова, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, Т.Ф. Соловьева. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Рус. журн. иммунологии. 2008. № 2-3. Т. 2(11). С. 145.

5. О. Sidorova, О. Portnyagina, V. Khomenko, О. Novlkova. Antigenic properties of the recombinant OmpF-like porin of Yersinia pseudotuberculosis

// In: Proceed of 1-st International Symposium on Life Sciences, Part I. Vladivostok. 2008, September, 2-7. P. 70.

6. O.Yu.Portnyagina, O.V. Sidorova, O.D. Novikova. Immunoactive synthetic fragments of the outer membrane porins of pathogenic Yersinia // In: Proceed of 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Part I, Vladivostok. 2008, September, 2-7. P. 62.

7. O.B. Сидорова. Obtaining of Yersinia pseudotuberculosis porin using biotechnology method // In: Proceed of 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Part II. Vladivostok. 2008, September, 2-7. P. 48. Конкурс «У.М.Н.И.К.».

8. 0.10. Портнягина, O.B. Сидорова, B.A. Хоменко, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, Т.Ф. Соловьева. Иммуногенные свойства рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Бюлл. эксп. биол. мед. 2009. №7. С. 85-88.

9. О.В. Сидорова. М.П. Исаева, В.А. Хоменко, О.Д. Новикова. Конструирование мутантных OmpF поринов наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и отработка условий их экспрессии // В: Сб. тезисов докладов XII Всероссийской молодёжной школы-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 7-14 сентября 2009 г. С. 67

10. 0.10. Портнягина, О.П. Вострикова, О.Д. Новикова, М.П. Исаева, A.M. Стенкова, К.В. Гузев, В.Г. Малашенкова, В.А. Хоменко, О.В. Сидорова. Т.А. Горбач, Т.Ф. Соловьева. Разработка и апробация высокоэффективных тест-систем для диагностики иерсиниозов // Тихоокеан. мед. журн. 2010. №3. С. 85-90.

11. O.IO. Портнягина, О.В. Сидорова. О.Д. Новикова, О.П. Вострикова, В.А. Хоменко, Т.Ф. Соловьева. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний // Биоорган, химия. 2010. Т. 36. №5. С. 1-10.

12. О.В. Сидорова, Д.К. Чистюлин, М.П. Исаева, О.Д. Новикова. Получение мутантных OmpF поринов Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель // В: Сб. тезисов докладов XIII Всероссийской школы-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 7-14 сентября 2010 г. С. 65.

-26-

Сидорова Ольга Вениаминовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО OMPF ПОРИНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата наук

Подписано в печать 19.05.2011 Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 404

Отпечатано в типографии ДВГТУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Состав и строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2 Порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1 Общая характеристика.

1.2.2 Структура и функция поринов.

1.2.3. Использование физико-химических методов для характеристики пространственной структуры поринов.

1.3 Получение и свойства рекомбинантных поринов.

1.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков.

1.3.2. Механизмы фолдинга белков.

1.3.2.1. Фолдинг белков in vivo.

1.3.2.2. Методы рефолдинга белков in vitro.

1.3.3. Сайт-направленный мутагенез.

1.3.4. Исследование свойств мутантных поринов.

1.3.4.1. Потенциалозависимость.

1.3.4.2. рН — чувствительность.

1.3.4.3. Чувствительность к антибиотикам.

1.4. Иммунологические свойства порообразующих белков грамотрицательных бактерий.

1.4.1. Антигенные свойства нативных поринов.

1.4.2. Иммунологические свойства нативных поринов.

1.4.3. Иммунологические свойства рекомбинантных поринов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Экспрессия и выделение рекомбинантного OmpF порина наружной мембраны

Y. pseudotuberculosis.

2.2. Рефолдинг и сборка рекомбинантного порина.

2.3 Пространственная структура полученных рекомбинантных белков.

2.4. Функциональная активность рекомбинантных поринов.

2.5. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

2.5.1. Изучение иммуногенной активности РБ-1.

2.5.2. Применение рекомбинантного мономера порина в качестве диагностического антигена.

2.6. Предсказание антигенных детерминант неспецифических поринов патогенных видов иерсиний и иммунохимическая характеристика соответствующих им синтетических пептидов.

2.6.1. Предсказание антигенно-активных участков OmpF порина К pseudotuberculosis.

2.6.2. Предсказание Т- и В-клеточных эпитопов неспецифических поринов патогенных видов иерсиний.

2.6.3. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включаю-щих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний.

2.7. Получение и характеристика мутантных поринов с делециями наружных петель.

2.7.1. Компьютерное моделироване мутантных форм OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

2.7.2.Сайт-направленный мутагенез.

2.7.3. Выделение и рефолдинг мутантных форм рекомбинантного OmpF порина.

2.7.4. Пространственная структура мутантных поринов.

2.7.5. Функциональная активность мутантных поринов.

2.7.6. Иммунохимическая характеристика мутантных поринов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

ВЫВОДЫ.

Порообразующие белки (порины) наружной мембраны (НМ) грамотрица-тельных бактерий существуют в интактной мембране в виде гомотримеров, образуют водонаполненные поры, или каналы, через которые осуществляется транспорт низкомолекулярных веществ. Особенности структуры поринов и их поверхностная локализация обуславливают наличие у них многочисленных функций, отличных от транспортной. С одной стороны, порины представляют собой молекулы-мишени для иммунной системы организма-хозяина, с другой — выступают как факторы вирулентности и патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме.

Получение рекомбинантных белков в клетках Е. coli в виде телец включения (ТВ), которые представляют собой ассоциаты нерастворимых интермедиа-тов белка - широко распространенный подход, используемый для получения индивидуальных белков в препаративных количествах. Недостатком данного метода является то, что белки в составе подобных ассоциатов не обладают функциональной активностью, поэтому для использования рекомбинантных белков в практических целях требуется восстановление их пространственной структуры.

Изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно определить функциональную значимость тех или иных участков белковой молекулы. Известно, что поверхностно локализованные структурные элементы молекулы порина, так называемые наружные петли, входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.

Получение рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Изучение взаимосвязи между структурой, функциональными и антигенными свойствами мутантных белков позволит, во-первых, расширить фундаментальные представления о свойствах поринов и, во-вторых, открыть новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иер-синиями.

Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами (участками наружных петель) пространственной и антигенной структуры OmpF поринашз Y. pseudotuberculosis и его функциональными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиа-тов рефолдинга (мономера и тримера) белка. Изучение порообразующих ^ иммунобиологических свойств рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза.

2. Расчет антигенных В- и Т-клеточных эпитопов, входящих в состав аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y pestis, Y. enterocolitica), и синтез соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических пептидов как иммуно-генов и диагностических антигенов.

3. Сайт-направленный мутагенез белок-кодирующего участка ompF гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе делеции петельных участков аминокислотной последовательности OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга му-тантных белков. Характеристика пространственной структуры полученных ин-термедиатов рефолдинга» (мономера и тримера) мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических свойств. фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицери-ном, или кардиолипином. ЛПС, занимающий около 45% поверхности НМ бактерий, является специфическим компонентом. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. В НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками (в частности, с поринами) [2].

В НМ, по сравнению с внутренней, обнаружен небольшой набор белков, содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные кана-лообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку в соответствии с химической природой составляющих ее липидов НМ малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляющие собой своеобразную транспортную систему, были открыты в 1976 году [3]. С тех пор термин «порины» стал использоваться для обозначения целого класса белков, образующих в НМ диффузионные каналы для осуществления неспецифического транспорта небольших гидрофильных молекул, участвующих в метаболизме бактерий. Впоследствии порины были обнаружены во всех исследованных видах грамотрицательных бактерий [4].

ВЫВОДЫ

1. Из трансформированных клеток Е. coli получен рекомбинантный OmpF по-рин наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis в мономерной форме (РБ-1). С помощью ионообменной хроматографии в присутствии детергента Zwittergent 3-14 осуществлена сборка полученного мономера в олигомерную структуру (рекомбинантный тример РБ-2).

2. Методами оптической спектроскопии охарактеризована пространственная структура полученных рекомбинантных белков. Показано, что вторичная структура поринов отличается высоко» стабильностью и способностью к ре-натурации. Для третичной структуры этих белков характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга.

3. Изучены иммунобиологические свойства рекомбинантного мономера по-рина. Установлено, что РБ-1 вызывает продукцию IgG антител как в смеси с адъювантом Фрейнда, так и в растворе неионного детергента Zwittergent 3-14. Продемонстрирована эффективность использования РБ-1 в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза.

4. С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные Т- и В- эпито-пы поринов патогенных видов иерсиний и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Изучены иммунобиологические свойства полученных пептидов и показана возможность их использования как диагностических антигенов для верификации иерсиниозов.

5. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены плазмиды, несущие мутантные ompF гены порина Y. pseudotuberculosis. Наличие делеций петель LI, L6 и L8 подтверждено секвенированием.

6. Проведена экспрессия мутантных белков с делециями петель LI, L6 h L8. Из трансформированных клеток Е. coli штамма Rosetta получены белки с данными мутациями. Подобраны условия выделения и рефолдинга мономерной и тримерной форм мутантных белков.

7. Выявлены особенности пространственной структуры мутантных поринов. Показано, что все мутантные белки имеют выраженную, но менее жесткую (по сравнению с полноструктурным рекомбинантным ОшрР порином) третичную структуру. Отсутствие наружных петель петель Ы, Ь6 и Ь8 приводит к изменению соотношения элементов регулярной вторичной структуры по-рина. Обнаружено, что только отсутствие петли Ы снижает термоустойчивость мутантного белка.

8. Фунциональная активность полученных полноструктурного и мутантных поринов изучена с помощью техники бислойных липидных мембран. Показано, что отсутствие петель 1Л, Ь6 и Ь8 не влияет на размер каналов ОшрР порина псевдотуберкулезного микроба.

9. Изучение антигенных свойств мутантных поринов показало, что наружные петли Ь1, Ь6 и Ь8 не участвуют в формировании антигенных детерминант ре-комбинантного порина. Тем не менее, участок аминокислотной последовательности белка, соответствующий петле Ь8, входит в состав конформацион-ных антигенных детерминант нативного тримера порина.

1. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channels // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 21762178.

2. Cowan S. W., Schirmer Т., Rummel G., Steriert M., Ghosh R., Pauptit R. A., Jansonius J. N., Rosenbusch'J. P. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins // Nature. 1992. V. 358. P. 727-733.

3. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. & Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 593-656.

4. Prilipov A., Prashan S., Phale R., Widner C., Jurg P., Rosenbusch J.P. Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE // J. Bacteriol. 1998. V. 180. N. 13. P. 3388-3392.

5. Achouak W., Heulin T. Pages J.M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. Is. 1. P. 1-7.

6. Palva E.T. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a-major outer membrane protein of Eschericha coli II J.'Bacteriol. 1979. V. 138: N. LP. 3842.

7. Benson S.A., Occi L.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K-12 // J. Mol. Biol. 1988. V. 20. N. 4. P. 961-970.

8. O.Basle A., Qutub R., Mehrazin M., Wibbenmeyer J., Delcour A. Deletions of single extracellular loops affect pH sensitivity, but not voltage dependence, of the E. coli porin OmpF// Prot. Engineering, Design and Selection. 2004. V. 17. N. 9. P. 665-672.

9. Delcour A.H. Solute uptake through general porins // Front. Biosci. 2003. N. 8. P. 1055-1071 .

10. Фрайфелдер Д. Физическая бохимия. М.: «Мир», 1980. 582 с.

11. Minetti C.A.S.A., Tai J.Y., Blake M.S., Pullen J.K., Liang S.M., Remeta D.P. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria meningitides / // J. Biol. Chem. 1997. N 272. P. 1071010720.

12. Пермяков E.A. Метод собственной люминесценции белка.М.: «Наука»,2003.190 с.

13. Studier F. W., Moffatt B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. N. l.P. 113-130.

14. Dubendorff J.W., Studier F.W. Creation of a T7 autogene: cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase under control of its cognate promoter // J. Mol. Biol. 1991. V. 219.1. 1. P. 61-68.

15. Betts S., King J. There's a right way and a wrong way: In vivo and in vitro folding, misfolding and subunit assembly of the P22 tailspike // Structure. 1999. N. 15. P. 131-139.

16. Blackwell J.R., Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form // FEBS Lett. 1991. N. 295. P. 10-12.

17. Singh J.P.N., Verma R. Cloning and molecular characterization of outer membrane protein A (ompA) gene from Mycobacterium bovis II Microbiol. Immunol. 2008. N. 52. P. 410-417.

18. Kumar V.S., Gautam V., Balakrishna K., Kumar S. Overexpression, purification and immunogenicity of recombinant porin proteins of Salmonella enterica serovar typhi {Salmonella typhi) // J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 19. N. 9. P. 1034-1040

19. R. Singh, P.K. Gupta, V. Durga; P. Rao. Expression and characterization of the major outer membrane protein (OmpH) of Pasteurella multocida P52 from Escherichia coli.// Vet. Arhiv. 2009. V.79. N.6. P. 591-600

20. Hockney R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli II Trends biotechnol. 1994. N. 12. P. 456-463.

21. Parra L.P., Reyes F., Acevedo J.P., Salazar A., B.A. Andrews, J.A. Asenjo. Cloning and fusion expression of a cold-active lipase from marine Antarctic origin//Enz. and Microbial; Technol. 2008. V. 42.1. 4. P. 371-377.

22. Kapust R.B., Waugh D.S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting solubility of polypeptides to which it is fused 11 Protein Sei. 1999. N. 8. P. 1668-1674.

23. Mogensen J.E., Otzen D.E. Interactions between folding factors and bacterial outer membrane proteins // J. Mol. Microbiol. 2005. N. 57 (2). P. 326-346.

24. Cantor R.S. The influence of membrane lateral pressures on simple geometric models of protein conformatioanal equillibria // Chem. Phys. Lipids. 1999. N. 101. P. 45-56.

25. Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов // Биохимия. 1998. Т.63. №. 4. С. 491-499.

26. Курганов Б.И. Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шапе-ронной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков // Биохимия. 2002. Т. 67. №. 4. С. 492-507

27. Hartl F.U., Hayer-Hartl М. Molecular chaperones in the cytosole: from nascent chain to folded protein // Science. 2002. V.295. P.1852-1858.

28. Van der Berg В., Ellis R.J., Dobson C. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation // EMBO J. 1999. V.18. P. 6927-6933.

29. Solomon В., Schwarz F. Chaperone-like effect of monoclonal antibodies on refolding of heat-denatured carboxypeptidase // J. Mol. Recognit. 1995. V. 8. N. -1-2. P. 72-76.

30. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Popov V.O. Antibodies as specific chaperones //Biochem. 2002. V. 291. N.4. P. 959-963

31. Воробьёва Е.В., Дмитренок А.С., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Красикова И.Н., Соловьёва Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Marinomonas communis АТСС 27118Т // Биоорган, химия. 2005. Т.31. № 4. С. 404-413.

32. Galanos C., Freudenberg I.A., Reutter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin // Proc. Natl. Sci. USA. 1979. V. 76. N.ll. P. 5939-5943.

33. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N., Takayama K., Raetz C.R.H. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. V.256. P. 19490-19497.

34. Moran A. Structure bioactivity relationships of bacterial endotoxins // J. Toxicol.-ToxinRev. 1995. V. 14. N. 1. P. 47-83.

35. Sen K., Nikaido H. In vitro trimerization of OmpF porin secreted by sphero-plasts of Escherichia coli И Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. N. 87. P. 743747.

36. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transitions of porin, a transmembrane protein // FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

37. Datta может убрать ссылку?

38. Sen К., Nikaido H. Trimerization of an in vitro synthesized OmpF porin of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1991. V. 266. N. 17. P. 11295-11300.

39. Bogdanov M., Dowhan W. Lipid-assisted protein folding II J. Biol. Chem. 1999. N. 274. P. 36827-36830.

40. N. Cosby, S. Lesley. Site-directed mutagenesis // Promega Notes. 1997. N. 61. P. 12

41. Edelheit O., Hanukuglu A., Hanukuglu I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies // BMC Biotechnol. 2009. V. 9. N. 61.

42. Liu H., Naismith J.H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol // BMC Biotechnol. 2008. V. 8.N. 91.

43. Kunkel T.A., Loeb L.A., Goodman M.F. On the fidelity of DNA replication. The accuracy of T4 DNA polymerases in copying phi XI74 in vitro II J. Biol. Chem. N. 259. P. 1539-45.

44. Li J., Li C., Xiao W., Yuan D., Wan G., Ma L. Site-directed mutagenesis by combination of homologous recombination and Dpnl digestion of the plasmid template in Escherichia coli II Anal. Biochem. 2008. V. 373. N. 2. P. 389-391

45. Shenoy A.R., Visweswariah S.S. Site-directed mutagenesis using a single mutagenic nucleotide and Dpnl digestion of template DNA // Anal. Biochem. 2003. V. 319. N. 2. P. 335-336.

46. Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) Catalog #200523

47. Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) Catalog #200524

48. Lewis M.K., Thompson D.V. Efficient site-directed in vitro mutagenesis using ampicillin selection //Nucl. Acids Res. 1990. N. 18. P/ 3439.

49. Bohnsack R.N. Site-directed mutegenesis using positive antibiotic selection // Meth. Mol. Biol. 1996. N. 57. P. 1-12.

50. Vavra S., Brondyk W.H: // Promega Notes. 1996. N. 58. P. 30.

51. Altered Sites II in vitro Mutagenesis Systems Technical Manual- #TM001, Promega Corp.

52. Higuchi R., Krummel B., Saiki R. A' general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study, of protein' and1 DNA intarac-tions // Nucl. Acids Res. 1988. N. 16. P. 7351

53. Shimada A. PCR-based site-directed mutagenesis // Meth. Mol. Biol. 1996. N. 57. P. 157-165.

54. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed, mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. 1989. N. 77. P. 51-59.

55. Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension // Gene. 1989. N. 77. P. 61-68.

56. Sarkar, Sommer S.S. The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis // BioTechniques. 1990. N. 8. P. 404-407.

57. Schindler H., Rosenbusch J.P. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled channels in lipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. N. 75. P. 3751-3755.

58. Basle A., Delcour A.H., Benz R. Bacterial and Eukaryotic Porins // Wiley-VCH. Weinheim. 2004. P. 79-98

59. Eppens E.F., Saint N., Van Gelder P., van Boxtel R., Tommassen J. . Role of the constriction loop in the gating of outer membrane porin PhoE of Escherichia coli IIFEBS Lett. 1997. N. 415. P. 317-320.

60. Phale P.S., Schirmer T., Prilipov A., Lou K.L., Hardmeyer A., Rosenbusch J.P. Voltage gating of E. coli porin channels: Role of the constriction loop // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 6741-6745.

61. Müller D.J., Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 13471351.

62. Todt J.C., McGroarty EJ. Effects of pH on bacterial porin structure. Involvement of HIS21 in a pH induced conformational change // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 189. P. 1498-1502.

63. Nestorovich E.M., Rostovtseva T.K., Bezrukov S.M. Residue ionization and ion transport through OmpF channels // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 3718-3729.

64. Kuusi М., Nurminen М., Saxon Н., Valtoneri М., Makela Р.Н. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonelesis of mice // Infect. Immun. 1979. V. 25. P. 857-562.

65. Neary J.M., Yi K.S., Karalus R.J., Murphy T.F. Antibodies to loop 6 of the P2 porin protein of nontypeable Haemophilus influenzae are bactericidal against multiple strains // Infect. Immun. 2001. V.69. P. 773-778.

66. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep // Vet. Microbiol. 1995. V. 43. P. 21-32.

67. Vonspecht B.U., Lucking H.C., Blum В., Schmitt A., Hungerer K.D., Domdey

68. H. Safety and immunogenity of a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein I vaccine in human volunteers // Vaccine. 1996. V. 14. N. 12. P. 11111117.

69. Jansen C., Kuipers B., van der Biezen J., de Cock H., van der Ley P., Tomassen J. Immunogenicity of in vitro folded outer membrane protein PorA of Neisseria meningitidis II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V. 27. P. 227-233.

70. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an Enteribacterial porin protein domain // APMIS. 1991. V. 99. P. 49-54.

71. Gupta S., Xia D., Jiang M., Lee S., Pernis. A.B. Signaling pathways mediated by the TNF- and cytokine-receptor families target a common cis-element of the IFN regulatory factor 1 promoter // J. Immunol. 1998. V. 161. N. 11. P. 5997-6004.

72. Wetzler L.M., Ho Y., Reiser H. Neisserial porins induce B lymphocytes to express costimulatory B-2 molecules and proliferate // J. Exp. Med. 1996. V. l.P. 1151-1159.

73. Massari P., Ho Y., Wetzler L.M. Neisseria meningitidis porin PorB interacts with mitochondria and protects cells from apoptosis// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97 (16). P. 9070-9075.

74. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H.J., Sparling P.F. Immunobiology of purified'recombinant outer membrane porin protein I of Neisseria gonorrhoeae II Mol. Microbiol. 1994. V. 14. P. 1059-1075.

75. Peeters C.C.A.M., Claassen I. J.T.M., Schuller M., Kersten G.F.A., van der Voort E.V.R., Poolman J.T. Immunogenicity of various presentation formsof Рог A outer membrane protein of Neisseria meningitidis in mice // Vaccine. 1999. V. 27. P. 2702-2712.

76. Wright J.C., Williams J.N., Christodoulides M., Heckeis J.E. Immunization with the recombinant PorB outer membrane protein induced a bactericidal immune response against Neisseria meningitidisS II Infect. Immun. 2002. V. 70. N. 8. P. 4028-4034.

77. Shaw J., Grund V., Durling L., Crane D., Caldwell H.D. Outer membrane protein antigen elicit a CD4+-type 2 rather than type 1 immune response that is not protective // Infect. Immun. 2002. P. V. 70. N. 3. 1097-1105.

78. Mansouri E., Blome-Eberwein S., Gabelsberger J., von Specht B.U. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. V. 37. N. 2-3. P. 161-166.

79. Humphries H.E., Christodoulides M., Heckels J.E. // Protein Expression and Purification. 2002. N. 26. P. 243-248.

80. Qi H.L., Tai J.Y., Blake M.S. Expression of large amounts of neisserial porin proteins in Escherichia coli and refilding of the proteins into native trimers // Infect, and Immunity. 1994. V. 62. N. 6. P. 2432-2439.

81. Koebnik R., Locher K.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Vicrobiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253.

82. Provencher S.W., Glocker J. Estimation of globularcal В outer membrane vesicle vaccine // Infect. Immun. 2002. V.70. N.2. P. 584-590

83. Ценева Г.Я., Солодовников Н.Ю., Воскресенская E.A. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. антимикроб, хим. 2002. Т. 4. № 3, С. 248-266

84. FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 1-7.

85. Tusnady G.E., Dosztanyi Z., Simon I. Transmembrane proteins in the Protein Data Bank: identification and classification. //Bioinformatics. 2004. V. 20. P. 2964-2972.

86. Гузев K.B., Исаева М.П., Новикова О.Д. и др. Молекулярная характеристика ompf-подобных поринов патогенных Yersinia II Биохимия. 2005. Т. 70. В. 10. С. 1338-1345.

87. Maksyutov A.Z., Zagrebeinaya E.S. ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants// Comput. Appl. Biosci. 1993. V. 9. P. 291-297.

88. Neary J.M., Murphy T.F. Antibodies directed at a conserved motif in loop 6 of outer membrane protein P2 of nontypeable Haemophilus influenzaerecognize multiple strains in immunoassays // FEMS Immunol, and Med. Mi-crobiol.//2006. V. 46. P. 251-259.

89. Maksyutov AZ, Bachinskii AG, Bazhan SI, Ryzhikov EA, Maksyutov ZA. Exclusion of HIV epitopes shared with human proteins is prerequisite for designing safer AIDS vaccines // J Clin Virol. 2004 Dec;31 Suppl l:S26-38.

90. Singh H., Raghava G.P.S. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites //Bioinformatics. 2001. V. 17. P. 1236-1237.

91. Rammensee H.G., Bachmann J., Emmerich N.P.N., Bachor O.A., Stvanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. // Immunogenetics. 1999. V. 50. P. 213-219.

92. Reche P.A., Reinherz E.L. Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide binding to MHC molecules using profiles. // J. Mol. Biol. 2003. V. 331. P. 623-641.

93. Гузев K.B., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia II Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 10. С. 1338- 1345.

94. Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. С. 387-395.

95. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Umesh C.K., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi. 11 J. Struct. Biol. 2004. V. 148. P. 22-33.

96. Стенкова A.M. Молекулярно-генетическая характеристика OmpF поринов бактерий рода Yersinia и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов: автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток. 2009. 24 с.

97. МОЕ (Molecular Operating Environment): http://www.chemcomp.com/Co^orateInformation/MOE.htm/

98. SPDBV: http://expasy.org/spdbv

99. Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. N. 24. P. 1596-1599.

100. Winder A.F., Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spec-trophotometric protein determinations // Biopolymers. 1971. V. 10. N. 7. P. 1243-1251.

101. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. Fluorescence and the location of triptophan residues in protein molecules // Photochem. Photobiol. 1973. N. 8. P. 263-279.

102. Marquardt D.W. An algorithm for least-squares estimation og nonlinear parameters // J. Soc. Indust. Appl. Math. 1963. N. 11. P. 431-441.

103. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vivo and its transformation inti an excitable system. // Nature. 1962. V. 194. P.979-980.

104. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. N. 5259. P. 680-685.

105. Sandt C.H., Wang Y.-D., Wilson R.A., Hill C.W. Escherichia coli strains with nonimmune immunoglobulin-binding activity // Infect. Immun. V. 65. N. 11. P. 4572-4579.

106. Маниатис Т., Фрич 3, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир,. 1984. 480 е.