Порообразующие белки бактерий рода Yersinia. Структура и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

0034448Э0

Новикова Ольга Данииловна

ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 4 ИЮЛ 20PR

Владивосток, 2008 г

003444890

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Беседнова Н Н

доктор биологических наук, профессор Деев С М

доктор химических наук, профессор Каминский В А

Ведущая организация

Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита состоится « 3» июля 2008 г в 10 часов на заседании Диссертационн совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН адресу

690022, г Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232)314-050, e-mail science@piboc dvo ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиот ДВО РАН (г Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН)

Автореферат разослан « 3 » июня 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, дхн, снс

CA Авилов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Взаимоотношения поверхностных структур бактериальной клетки с организмом человека являются определяющими в развитии инфекционного процесса В связи с этим установление биологической функции отдельных компонентов наружной мембраны (НМ) бактерий имеет не только теоретический интерес, но и связано с решением целого ряда прикладных вопросов, таких, как создание эффективных вакцинных препаратов и усовершенствование диагностики заболеваний

Наряду с цитоплазматической мембраной грамотрицательные бактерии имеют НМ, характерный структурный элемент, отличающий их от клеток эукариот Главное предназначение дополнительного мембранного слоя состоит в барьерной функции, обеспечивающей селективную проницаемость оболочки микроорганизмов Мембранные белки, которые составляют около 30% от общего содержания протеинов клетки, достаточно сложны в структурном отношении и разнообразны по функциональным свойствам Среди белков НМ грамотрицательных бактерий доминируют интегральные (5-структурированные белки, так называемые неспецифические порины, которые осуществляют пассивную диффузию гидрофильных молекул с молекулярной массой <600 Да Они образуют трансмембранные водонаполненные каналы (или поры), через которые клетка обменивается с внешней средой низкомолекулярными веществами

К середине 80-х гг прошлого века исследователи уже располагали информацией об основных (фундаментальных) свойствах каналов, образуемых поринами Е соЬ (ОтрР и ОтрС белками), а также об асимметричном строении НМ за счет расположения ЛПС на ее внешней стороне За последующие 20 лет накопление знаний в исследовании структуры и функции поринов происходило очень быстро, порой взрывообразно Так, за этот период появилось более 650 статей, имеющих в заглавии термин «порин» По своим физико-химическим свойствам это слабокислые белки с необычайно большим для интегральных мембранных белков количеством полярных аминокислот Основным структурным элементом поринов является эллипсообразный в сечении (З-складчатый цилиндр (баррель), состоящий из антипараллельных (3-тяжей (или стрэндов), соединенных так называемыми петлями, участками полипептидной цепи белка с неупорядоченной и/или а-спиральной структурой В нативной мембране порины существуют в виде тримеров, которые рассматривают как основную функциональную единицу этих белков в структуре НМ В изолированном состоянии порины представляют собой олигомерные белки, в стабилизации пространственной структуры которых, помимо гидрофобных взаимодействий, существенную роль играют водородные и ионные связи Этим объясняется необычайная устойчивость поринов по отношению к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам

Показано, что структурная организация поринов в изолированном состоянии и в мембране во многом определяется другим основным компонентом НМ - ЛПС, специфическим амфифильным биополимером, чаще всего определяющим антигенную специфичность бактерий Взаимодействие с ЛПС влияет на тримеризацию поринов и встраивание их в мембрану До сих пор не существует единого мнения по поводу значения ЛПС для функциональной активности поринов

Согласно современным представлениям в процессе осуществления транспортной функции порины являются не просто статичным фильтром бактериальной мембраны, а проявляют себя как динамичная структура Известно, что тип популяции неспецифических поринов (ОтрР или ОтрС) может изменяться с изменением условий окружающей среды, что позволяет клетке регулировать проницаемость НМ Это происходит благодаря механизму «переключения» биосинтеза поринов, кодируемых различными генами, например, при переходе клетки из "непаразитического" состояния (в природных условиях) в "паразитическое" (в макроорганизме) В то же время один и тот же тип поринов может иметь два или более субсостояний, различающихся размером пор Это зависит от липидного состава мембраны и внешних факторов (рН среды, осмотического давления, мембранного

потенциала) Такой характер изменения проводимости каналов может реализоватьс только при условии конформационной пластичности поринов, те повышенно изменчивости молекулярной организации на уровне третичной структуры белка

При извлечении из мембраны p-баррельные белки частично денатурируют, а присутствии лилидного бислоя m vitro могут спонтанно восстанавливать нативну пространственную структуру В нативной мембране их сворачиванию и сборке, как правил способствуют шапероны, специальные молекулы липидной и белковой природы Согласи последним данным по исследованию термодинамической стабильности и механизмо встраивания поринов в модельные и биологические мембраны стабильность их не сто велика, как считалось ранее (меньше 10 ккал/моль), и она модулируется эластичным свойствами липидного матрикса

Поскольку сведения о кристаллической структуре доступны лишь для ограниченно числа белков, в том числе поринов, информация о первичной структуре как мож большего числа этих белков весьма желательна и полезна для моделирования пространственной организации Например, до сих пор не существует простого алгоритм с помощью которого можно было бы удовлетворительно определить местоположение стрэндов Одним из вариантов решения этой задачи является поиск наимен вариабельных участков аминокислотной последовательности при сравнен последовательностей близкородственных белков Несмотря на то, что способность порин к образованию множества стабильных конформационных состояний подтвержде экспериментально, установление элементов пространственной структуры этих белко ответственных за изменения их функциональных свойств, до сих пор остает предметом повышенного внимания исследователей Детальный кинетический анализ баррельных мембранных белков показал, что их сборка осуществляется в несколько этап с образованием целого ряда интермедиатов, которые могут быть зафиксированы m vit при этом образование барреля синхронизировано со встраиванием в мембрану Тем менее, многие вопросы, связанные с деталями фолдинга порообразующих белков in vi до сих пор остаются открытыми Неясно, например, что является определяющим д реконструкции порина в липидный бислой наличие определенной конформаци обеспечивающей термодинамически оправданный процесс встраивания, и/или присутств в мембране специфических липидов, играющих в данном процессе роль векторов

Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславлива наличие у бактериальных поринов различных биологических свойств, отличных транспортной функции Петли поринов являются потенциальными участками д контакта/связывания других клеток с поверхностью бактерии Как молекулы-мишени д системы иммунитета макроорганизма порины активируют факторы немедленной защи хозяина и включаются в формирование специфического иммунного ответа, направленн на освобождение от патогена С другой стороны, они выступают как эффекторы патогене подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина, и обеспечивая выживание патоге в макроорганизме Эти факты позволяют рассматривать порообразующие белки бактерий как весьма перспективные соединения (инструменты) для решения зад инфекционной иммунологии Прежде всего, это связано с выявлением сре поверхностных белков бактерий вероятных кандидатов для конструирования протективн и диагностических препаратов, а также с определением «ключевых» для патоген молекул в цепях реализации новых стратегий в борьбе с патогенами и создан лекарственных средств для терапии инфекционных болезней

Выбор иерсиний в качестве источника исследуемых поринов был обусловлен тем, иерсиниозы имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека Учиты растущую роль овощных культур в заболеваемости иерсиниозами, несомненна та эпизоотологическая актуальность вопроса о патогенных бактериях, общих для человек растений Кроме того, возбудители лсевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза име широкое распространение и особую эпидемиологическую значимость на террито Приморского края Многообразие клинических форм, часто маскирующих эти заболева под другие кишечные инфекции, осложняет их диагностику Более того, в силу ряда при фактическая заболеваемость иерсиниозами, в частности лсевдотуберкулезом, превыш

официально зарегистрированную Прежде всего, это объясняется недостаточной эффективностью лабораторной и клинической диагностики, а также модификацией эпидемиологических особенностей возбудителя Во-первых, в последние годы заболевание чаще всего протекает в виде спорадических случаев, а не эпидемических вспышек, характерных для Дальневосточного региона последней четверти прошлого века Во-вторых, значительные затруднения при установлении этиологии кишечных расстройств вызывает тот факт, что в современных условиях возбудитель псевдотуберкулеза «высевается» не более, чем в 5% случаев, т е не может быть определен с помощью бактериологического анализа Следует особо подчеркнуть, что согласно анализу возрастной и социальной структуры больных иерсиниозами основную часть заболевших составляют дети от 3-х до 14-ти лет (85 и 97% соответственно) В этих условиях увеличивается значимость лабораторной диагностики иерсиниозов, что, в свою очередь, определяет устойчивое внимание исследователей к совершенствованию и разработке новых методов диагностики этих заболеваний

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось комплексное исследование структуры и свойств неспецифических поринов иерсиний для установления взаимосвязи между пространственной организацией и функциональной активностью порообразующих белков НМ грамотрицательных бактерий, а также выяснения их роли в патогенезе инфекций, вызываемых микроорганизмами рода Yersinia

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• выделить и охарактеризовать физико-химические свойства поринов из 5-ти видов иерсиний 2-х видов, патогенных для человека (У pseudotuberculosis и У enterocolitica), и 3-х непатогенных видов (У intermedia, Y frederiksenu и Y knstensemi),

• установить первичную и пространственную структуру полученных белков,

• провести сравнительное изучение функциональной активности поринов патогенных и непатогенных иерсиний,

• изучить конформационные переходы поринов в растворе (на примере порина из псевдотуберкулезного микроба) под действием различных денатурирующих факторов и охарактеризовать пространственную структуру полученных денатурированных форм порина,

• определить роль ЛПС в стабилизации структуры и проявлении функциональной активности порина,

• изучить влияние условий культивирования бактерий псевдотуберкулеза (и связанного с ним изменения состава липидного матрикса НМ микроорганизма) на пространственную организацию и функциональные свойства поринов,

• охарактеризовать антигенную структуру и изучить иммуногенные свойства порина из псевдотуберкулезного микроба,

• выяснить роль поринов в процессе развития инфекционного процесса (патогенеза) иерсиниозов,

• получить рекомбинантный порин из НМ У pseudotuberculosis, подобрать условия рефолдинга функционально активной формы этого белка, охарактеризовать пространственную и антигенную структуру интермедиатов рефолдинга порина,

• показать возможность использования неспецифических поринов НМ иерсиний в качестве диагностических и протективных антигенов

Научная новизна исследования

Впервые проведено систематическое исследование неспецифических OmpF-подобных поринов НМ грамотрицательных бактерий рода Yersinia Установлена их аминокислотная последовательность, определена пространственная структура и охарактеризованы функциональные свойства этих белков, являющихся, наряду с ЛПС, основными компонентами НМ этих микроорганизмов

Определена роль ЛПС в поддержании функционально активной конформаци поринов Изучен процесс образования ЛПС-поринового комплекса in vitro и показано, чт характер взаимодействия белка и эндогенного ЛПС зависит от структуры последнего

Показано, что условия перевода поринов из мембраносвязанного состояния в раство влияют на стабильность и пространственную структуру изолированного порин Экспериментально продемонстрирована конформационная пластичность изолированны поринов в растворе на уровне третичной структуры белка

Выполнено систематическое исследование конформационных переходов Отр подобного порина из псевдотуберкулезного микроба (иерсинина) под действие денатурирующих факторов На его примере показано, что для поринов характерн множественность денатурированных состояний

Впервые на примере иерсинина показано, что при изменении значений рН сред порообразующие белки НМ грамотрицательных бактерий, подобно мультидоменны ферментам, имеют два конформационных перехода функциональный и денатурационны рН-Индуцированные интермедиаты порина охарактеризованы в терминах основнь переходных состояний белков, образующихся в процессе денатурации

Установлено, что изменение состава липидного матрикса НМ иерсиний коррелирует изменениями в пространственной организации и функциональной активное неспецифических OmpF-подобных поринов

Впервые получен функционально активный тример рекомбинантного порина псевдотуберкулезного микроба

Практическая значимость работы

Впервые показано, что OmpF-подобные порины НМ иерсиний являются видо-родоспецифическими белками этих бактерий и могут быть использованы в качест диагностических и протективных антигенов

Показано, что иммунизация порином эффективно защищает лабораторных животн от экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции Обнаружено, что как протективн антигены тримерная и мономерная молекулярные формы белка обладают различи эффективностью

Впервые на основе порина из НМ Y pseudotuberculosis разработ иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий достоверно и эффектив идентифицировать псевдотуберкулез, в том числе на ранних стадиях развит инфекционного процесса Данная тест-система может быть использована в клиническ практике для дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсинио а также выявления вторично-очаговых форм этих заболеваний Показано, ч рекомбинантный порин высокоэффективен в качестве диагностического антигена

Результаты и положения работы, выносимые на защиту

1 Бактерии рода Yersinia содержат в НМ порообразующие белки, обладающ высокой степенью гомологии первичной структуры Они являются родоспецифически белками иерсиний

2 Порины входят в состав ЛПБК - полного О-соматического антигена грамотрицательных бактерий

3 Способ (процедура) выделения белка влияют на стабильность и пространственн организацию функционально активной тримерной формы порина

4 Вторичная структура изолированных поринов отличается повышенн устойчивостью к денатурирующим факторам/агентам Для более высоких уровн пространственной структуры поринов (четвертичной и третичной) характер конформационная пластичность, обуславливающая образование различи конформационных интермедиатов, структуру которых определяют условия их получения

5 При изменении значения рН среды порообразующий белок псевдотуберкулезного микроба, иерсинин, претерпевает два конформационных перехо функциональный и денатурационный, что, вероятно, служит дополнительным механизм адаптации иерсиний к изменению условий внешней среды

6 Каналы, образуемые поринами патогенных и непатогенных иерсиний в искусственном бислое, отличаются по размеру и характеру распределения уровней проводимости

7 Порины патогенных видов иерсиний являются диагностическими и протективными антигенами Тримерная и мономерная молекулярные формы поринов существенно различаются по иммуногенным свойствам и, соответственно, по эффективности защиты лабораторных животных от экспериментальной иерсиниозной инфекции

8 ИФА тест-система на основе порина из НМ У pseudotuberculosis позволяет выявлять заболевание, вызываемое всеми сероварами псевдотуберкулезного микроба

9 Данная тест-система может использоваться как для дифференциальной диагностики острых форм иерсиниозов, так и для выявления некоторых иммунопатологии (вторично-очаговых форм), вызываемых иерсиниями

10 OmpF-подобный порин из HM Y pseudotuberculosis является фактором вирулентности псевдотуберкулезного микроба, способствуя адгезии и инвазии бактерий в макроорганизм

Апробация результатов работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены автором в виде устных докладов и постерных сообщений на следующих Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях Советско-Индийском симпозиуме по химии природных соединений (Тбилиси, Грузия, 1983), 1-ом и 2-ом Биохимических съездах (соответственно Киев, Украина, 1986 и Москва, Россия, 1997), Симпозиумах по химии белков и пептидов (Таллинн, Эстония, 1987, Москва, Россия, 2003, Москва, Россия, 2007), International Symposiums on Yersinia (Tokyo, Japan, 1995, Turku, Finnland, 2003), II и III Съездах биофизиков России (соответственно Москва, Россия, 1999 и Воронеж, Россия, 2004), XIX Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999), Международной научно-практической конференции "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, Россия, 2000), 7-th International Congress on Endotoxin (Washington, USA, 2002), 3-rd German-Polish-Russian Meeting on Bactenal Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004), International Congress "Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health" (Sudak, Ukraine, 2004), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Россия, 2005), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, Россия, 2006), V Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний» (Москва, Россия, 2006)

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 38 статей в отечественных и международных журналах и более 60 тезисов докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций Способ получения порина из псевдотуберкулезного микроба и способ диагностики псевдотуберкулеза защищены патентами РФ

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 9-ти глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего

источников Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 54 рисунка и 22 таблицы

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность научным консультантам дхн, профессору Т Ф Соловьевой и академику РАН Ю С Оводову за постоянное внимание к работе, ценные замечания и полезные советы на всех этапах исследования Автор чрезвычайно благодарен сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим непосредственное участие в работе или участвовавшим в обсуждении полученных

результатов кхн ВАХоменко, кхн Г М Фроловой, кф-мн ГН Лихацкой, не О Востриковой, кбн ОЮ Портнягиной, не Н Ю Ким, кхн ТИ Вакориной, кмн МП Исаево (особая благодарность), мне К В Гузеву, дхн П А Лукьянову, кф-мн В П Глазунову, кхн И Красиковой, кхн Г А Набережных, кхн В И Горбачу, кбн В А Рассказову, чл -корр РАН В Васьковскому

Автор также искренне признателен и благодарен за плодотворное сотрудничество рамках проведенных исследований кф-мн В И Емельяненко и не СМ Кузнецове сотрудникам Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г Пущин Московской области), кхн Н П Бажулиной, снс Института молекулярной биологии РАН ( Москва), дмн, проф Н Ф Тимченко, сотруднику-НИИЭМ РАМН, (г Владивосток), дбн, про Скок М Н, сотруднику Института биохимии им А В Палладина (г Киев, Украина), дмн, про А В Гордеец, кмн В Ю Малашенковой, дмн С Н Бениовой, сотрудникам кафедры детски инфекционных болезней ВГМУ (г Владивосток), И В Дармову, В И Дробкову, И Маракулину, И П Погорельскому и MB Супотницкому, сотрудникам Институт микробиологии МО РФ (г Киров) Особую благодарность автор выражает дф-мн, про С Ю Веньяминову (США) за чрезвычайно полезные замечания и советы при обсуждени результатов работы, а также Главному инфекционному врачу Приморского края, за кафедрой инфекционных болезней ВГМУ, дмн В А Иванис за искрению заинтересованность и неоценимую помощь при апробации и внедрении в клиническу практику ИФА тест-системы для диагностики псевдотуберкулеза

Сокращения, используемые в диссертационной работе АК - аминокислотнь (ая), БЛМ - бислойные липидные мембраны, ДМХ - диметиламинохалкон, ДОХ дезоксихолат натрия, ДСК - дифференциальная сканирующая микрокалориметрия, ДФГ дифосфатидилглицерин, КД - круговой дихроизм, ЛПБК - лилополисахарид-белковь комплекс, ЛПС - липополисахарид, ЛФЭ -лизофосфатидилэтаноламин, М - молекулярн масса, НЛ - нейтральные липиды, НМ - наружная мембрана, ОГ- p-D-окгилглюкозид, ПГ пептидогликан, ПГБК - пептидогликан-белковый комплекс, п н - пар нуклеотидов, ПЦР полимеразная цепная реакция, РНГА - реакция непрямой гемагглютинации, ТВ - тель включения, ТЛБ - термолабильная (-ные) и ТСБ - термостабильная (-ные) молекулярнь формы порина, ТХУ - трихлоруксусная кислота, ФГ - фосфатидилглицерин, ФЛ фосфолилиды, ФНА - l-N-фенилнафтиламин, ФП - фагоцитарный показатель, ФЧ фагоцитарное число,, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота, RMSD (root mean squa deviation) - среднее квадратичное отклонение, SDS - додецилсульфат натрия, SDS.nAA электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфа натрия, Zw 3-14 - цвиттерионный детергент Zwittergent 3-14

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 6 разделов, обобщены литературные сведения структуре и биологических свойствах неспецифических OmpF-подобных поринов Н грамотрицательных бактерий Охарактеризованы типы интегральных мембранных белков особенности их пространственной структуры, наиболее полно рассмотрены дета молекулярной организации p-структурированных порообразующих белков грамотрицательных бактерий Проанализированы имеющиеся в литературе данные функциональных свойствах неспецифических поринов и механизмах модуляции разме образуемых ими каналов в ответ на изменение условий окружающей сред Охарактеризована антигенная структура и иммуногенные свойства этих белков

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные о функциональн активности поринов не всегда могут быть исчерпывающе объяснены с точки зрен современных представлений о пространственной организации этих белков, так к рентгеноструктурный анализ высокого разрешения выполнен лишь для ограниченного чис поринов Тем не менее, именно благодаря сведениям о кристаллической структуре порин процесс диффузии низкомолекулярных веществ через пориновые каналы описан

настоящему времени в деталях на молекулярном уровне По этой же причине в современных исследованиях структуры и функции поринов существенно возросли доля и значение теоретических подходов, использующих методы молекулярной динамики Построение пространственных моделей поринов с помощью расчетных методов и оценка энергетических характеристик их различных конформационных форм позволяют объяснить многие структурно-функциональные особенности этих белков, однако в большинстве случаев теоретические методы анализа недостаточно эффективны и требуют корреляции с экспериментальными данными В связи с вышесказанным исследования, сочетающие в себе различные экспериментальные подходы, не утрачивают своего значения и на современном уровне развития знаний о порообразующих белках НМ грамотрицательных бактерий, этих «интригующих белках» по выражению Хироши Никаидо, одного из самых маститых исследователей поверхностных антигенов грамотрицательных бактерий 1 Выделение и характеристика OmpF-подобных поринов иерсиний Перевод мембранных белков из мембраносвязанного состояния в раствор сопряжен с определенными трудностями, связанными, прежде всего, с подбором подходящего солюбилизмрующего агента В зависимости от природы используемого детергента и условий экстракции, исследователи получают различные молекулярные формы и конформеры изолированных поринов, отличающихся друг от друга вторичной и третичной структурой

Порин НМ Y pseudotuberculosis (иерсинин) По данным SDS.nAAr-электрофореза в состав клеточной стенки псевдотуберкулезного микроба входит до 10 полипептидов, четыре из них, с М 60, 40, 35 и 14,5 кДа, преобладают Около 40% от общего содержания белка приходится на полипептид с М 40 кДа, основной белок НМ Y pseudotuberculosis Как показали предварительные исследования, этот полипептид в качестве основного белкового компонента присутствует в ЛПБК, извлекаемом ТХУ (антиген Буавена) и водным бутанолом, а при солюбилизации НМ псевдотуберкулезного микроба с помощью SDS доминирует во фракции белков, ассоциированных с ПГ

Известно, что в нативной мембране бактерий порины связаны с ПГ прочной (но не ковалентной) связью С целью получения изолированных белков для разрушения этого комплекса обычно используют два принципиально разных подхода (1) обработку комплекса раствором SDS при повышенной температуре (метод Розенбуша в модификации Райтмайера и Брага) и (2) расщепление ПГ слоя лизоцимом (метод Нюрминен) В первом случае в зависимости от температурного режима, используемого для диссоциации ПГ-белкового комплекса, порины могут быть получены в виде двух ТЛБ молекулярных форм, тримера и/или мономера (не выше 40°С) или в виде ТСБ формы, термоденатурированного мономера (при 70°С и выше) Это связано с тем, что порины являются термозависимыми белками и в растворах SDS сохраняют тримерную структуру до определенной, так называемой критической температуры Нагревание тримеров в растворах SDS при температуре выше критической приводит к образованию денатурированных мономеров, отличающихся от тримеров повышенной чувствительностью к протеолизу

Для получения препаративного количества иерсинина мы использовали оба вышеупомянутых метода Фракцию клеточных оболочек псевдотуберкулезного микроба, полученную после механической дезинтеграции клеток, экстрагировали тритоном Х-100, мягким детергентом, избирательно растворяющим белки цитоплазматической мембраны Осадок обрабатывали раствором SDS для получения комплекса ПГ с ассоциированными с ним белками НМ, тример иерсинина был выделен экстракцией комплекса 1-2% раствором SDS в присутствии 0,5 М NaCI при 37°С (Пор-SDS) Второй способ извлечения белка основан на устойчивости тримеров порина к трипсину Он включает в себя инкубацию обработанных ЭДТА и лизоцимом клеточных оболочек с трипсином в тритоне Х-100 (для очистки от сопутствующих белков) и осаждение олигомеров порина из полученного раствора в присутствии 0,5 М NaCI при 42°С и рН 6,0 (Пор-Lys)

Следует отметить, что экстракция поринов раствором SDS при повышенной температуре приводит к получению тримера и мономера порина (рис 1а, дорожка 1, показано на примере иерсинина) Напротив, использование метода Нюрминен позволяет, как правило, получить порин только в олигомерной форме (рис 16, дорожки 5-8, показано на

примере поринов из У. enterocolitica и непатогенных иерсиний). Очистку о] сопутствующих белков и разделение тримеров и мономеров иерсинина проводили гель-хроматографией на сефакриле S-300. Два цикла гель-хроматографии позволили получит^ обе молекулярные формы в индивидуальном состоянии (по данным SDS.nAAP! электрофореза). Кажущаяся М тримера иерсинина составляет 110-120 кДа, ТЛБ мономера J 33,5 кДа. Тримеры порина выявлялись на электрофореграмме в виде мультиплетных зон! что характерно для поринов энтеробактерий и объясняется присутствием в образцах белк; связанного ЛПС. Согласно аналитическим данным образец иерсинина содержал 5-8% моносахаридов. При предварительном кипячении образцов белка тример и мономер иерсинина превращались в мономер с М 40 кДа (рис. 1а, дорожка 2).

Дальнейшую препаративную очистку термоденатурированного мономера иерсининг проводили с помощью метода изоэлектрофокусирования. В результате был получе( образец порина, гомогенный по данным N-концевого анализа. N-Концевой аминокислота« иерсинина является аланин. Путем твердофазной автоматической деградации по Эдман;! была определена N-концевая аминокислотная последовательность иерсинина: Ala-Glu-lleuj Asn-Lys-Asp-Gly-Asn-Lys-Leu-Asp-Leu-Tyr-. Установленный участок аминокислотно( последовательности основного белка НМ У. pseudotuberculosis почти полностью совпадав' с N-концевой последовательностью Omp F порина из НМ E.coli.

Рис. 1.

Электрофореграммы (а) различных молекулярных форм иерсинина; (б) |

тримерных и (в) мономерных форм поринов из У. enterocolitica, У. intermedia, Y. kristensenii, Y. frederiksenii до нагревания (б - дорожки 5, 6, 7, 8; в -дорожки 1, 2, 3, 4 соответственно) и после нагревания при температуре 100°С (б -дорожки 1,2, 3, 4; в -дорожки 6, 7, 8, 9 |

соответственно); дорожка 5 (в) - белки-стандарты.

Для тримеров иерсинина, полученных разными способами, были определен' некоторые физико-химические параметры, характеризующие их макромолекулярну организацию. С помощью скоростной седиментации для Пор-SDS была выявлен гетерогенность по М. Так, на седиментограмме наряду с основным пиком с коэффициента} седиментации 7,2 S были обнаружены небольшие пики с коэффициентами седиментаци 5,2 и 2,6 S. Напротив Пор-Lys в этих же условиях был гомогенен и имел коэффицив | седиментации 7,2 S. Эта величина близка к таковой для тримера порина из £ соН. Эт данные позволяют предположить, что полипептиды 5,2 и 2,6 S представляют собо, соответственно, димер и мономер порина.

Сравнительный анализ пространственной структуры, выполненный с помощь методов оптической спектроскопии (КД и собственной белковой флуоресценции), показа, что Пор-SDS обладает менее фиксированной третичной структурой, нежели Пор-Lys. Этг вероятно, обусловлено нарушением (ослаблением) некоторых внутримолекулярных связ ■ в белке, произошедшим в результате сочетанного действия SDS и нагревания в процесс выделения.

12 3 4 s в ТI

110 кПа

110 кДз

40 кДз

38 кДа

33.5 кДз

12 3 4 5 6 7

30 кДа

36 кДа

Таблица 1 Термодинамические параметры* Пор-вОЭ и Пор^уБ, образцов иерсинина, выделенных разными способами

Образец ДНкал AG ДНзфф ДНкал / ДНзфф Td, °К

иерсинина кДж/моль

Пор-SDS 300 9,5 133 2,25 362,2

Пор-Lys 395 11,8 125 3,16 355,4

*ДНкал- калориметрическая энтальпия денатурации, AG - свободная энергия Гиббса, AH3tW - эффективная (Вант-Гоффа) энтальпия денатурации, Td - температура денатурации

Этот вывод был подтвержден данными сканирующей микрокалориметрии Анализ данных табл 1 показал, что величина свободной энергии перехода из нативного состояния в денатурированное, являющаяся мерой стабильности структуры белка, для Пор-SDS ниже, чем для Пор-Lys Известно, что по отношению ДНкал /ДНЭфф можно судить о количестве в молекуле белка областей, плавящихся независимо друг от друга, так называемых энергетических доменов Как видно из данных табл 1, для тримеров иерсинина характерна доменная структура, включающая в себя 2-3 области Можно предположить, что в случае Пор-SDS уменьшение числа доменов до 2-х свидетельствует о частичной денатурации белка

Порины из HM Y enterocolitica и непатогенных энтероколитикоподобных видов иерсиний Три вида непатогенных иерсиний (У intermedia, Y knstensenn, У frederiksenn) выделяют в особую группу энтероколитикоподобных, так называемых "редких" иерсиний Не существует единого мнения об участии У mtemiedia, Y knstensenu, Y frederiksenu в инфекционной патологии человека, однако отдельные случаи иерсиниозов, вызываемых этими видами иерсиний, отмечены несколькими авторами

При выделении поринов из НМ У enterocolitica и непатогенных видов иерсиний было обнаружено, что уже на первой стадии выделения (получение ПГ-белковых комплексов) происходят значительные потери белка за счет перехода его в супернатант В связи с этим, выделение комплексов проводили при более низкой температуре (22 - 37°С), а разрушение связи ПГ-белок - при комнатной температуре По данным БОЗ.ПААГ-электрофореза, фракции изолированных белков содержали две молекулярные формы поринов тримерную и мономерную с М порядка 100-110 и 30 кДа соответственно Очистку и разделение их проводили с помощью гель-хроматографии на сефакриле S-300 Полученные образцы белков были индивидуальны по данным БОЗ.ПААГ-электрофореза (рис 1 б и в), однако олигомеры поринов, подобно иерсинину, выявлялись на электрофореграмме в виде мультиплетных зон Обе формы поринов, подобно таковым иерсинина, были термолабильны и при кипячении растворов белка превращались в денатурированный мономер с М 38 кДа (рис 16 и в) Согласно аналитическим данным образцы поринов содержали до 10% моносахаридов N-Концевой аминокислотой поринов исследованных видов иерсиний, как и в поринах других энтеробактерий, являлся аланин

Таблица 2 Зависимость величин М (кДа) термолабильного (ТЛБ) и термостабильного (ТСБ) мономеров поринов НМ бактерий рода Yersinia от метода определения

Бактерии SDS,nAAI~-электрофорез ТЛБ мономер SDS.nAAr-электрофорез ТСБ мономер MALDI-TOF ТСБ мономер По данным АК состава белков

У pseudotuberculosis 35,5 40,0 не опред 37,6

У enterocolitica 30,6 38,2 37,8 38,9

У intermedia 30,6 37,2 37,5 38,2

У kristensenn 29,8 38,4 37,5 38,4

У frederiksenn 30,7 38,6 37,5 37,1

Как известно, ограниченная растворимость и склонность к агрегацм поринов вызывают серьезные затруднения при определении М этих белков. Эт1 особенности, а также зависимость электрофоретической подвижности белков о; конформации позволяют говорить только о кажущемся значении М поринов.

Значения М мономерных форм поринов из 5-ти видов иерсиний, определенны« методом БОБ, ПААГ-электрофореза, оказались близкими (табл. 2). Эти величины хорошо коррелировали с величинами, полученными с помощью масс-спектрометрии (МАШ1-ТО! модификация) и рассчитанными из АК состава белков.

На примере иерсинина было показано, что порин входит в состав эндотоксина, ил классического антигена Буавена, извлекаемого из НМ микроорганизма раствором ТХУ, | также в состав ЛПБК, получаемого в более мягких условиях при обработке Нк псевдотуберкулезного микроба водным н-бутанолом. Идентификацию иерсинина ( белкового компонента ЛПБК проводили с помощью химического анализа. Иерсинин и бело с М 40 кДа имели близкий АК состав и идентичные пептидные карты продуктов триптического гидролиза (рис. 2). [

Рис. 2. Пептидные карты продукта триптического гидролиза иерсинина (а) и белка с М 40 кДа из ЛПБК (б)

2. Первичная и пространственная структура поринов иерсиний

Дизайн типоспецифических OmpF-праймеров. Для амплификации нуклеотидны] последовательностей генов OmpF поринов иерсиний были разработаны типоспецифически праймеры. С этой целью нами были проанализированы сигнальные пептиды известнь^ OmpF- подобных белков энтеробактерий (£. coli, Serratia marcescens, SalmoneU typhimurium, Salmonella typhi, Xenorhabdus nematophilus). Дополнительно был проведе поиск пориновых генов в геноме Y. pestis с помощью программных средст: поддерживаемых на сервере http://www.sanQer.ac.uk/ Proiects/Y. pestisl (Institute Sange Великобритания). В качестве зондируемой последовательности была использован нуклеотидная последовательность ompF гена S. marcescens (NCBI, U81967), поскольку эт бактерия филогенетически наиболее близка к роду Yersinia. В результате была обнаружен последовательность гена (Y01411), обозначенная как putative ОтрС porin, которая, KS следует из названия, не относится к определенному типу неспецифических поринов Н] грамотрицательных бактерий. Анализ промоторной области Y01411 гена показал наличи мотивов, характерных для промоторов ompF-подобных генов энтеробактерий, а имени определенное расположение OmpR-связывающих сайтов и наличие последовательное« комплементарной к 4.5 S micF RNAs. Все это позволило идентифицировать Y01411 ген KS ompF-подобный и использовать его для дизайна праймеров OmpF - подобных порин о" иерсиний. Праймеры были сконструированы на основе участков генаУ01411.

Клонирование иодирующих последовательностей и анализ аминокислотнь} последовательностей OmpF поринов бактерий рода Yersinia. В результате ПЦР быг получены ПЦР фрагменты для 5-ти видов иерсиний длиной приблизительно 1100 п.и которые были клонированы в вектор pBluescript SK(-). Полученные плазмиды быг секвенированы с помощью универсальных прямого и обратного М13-праймеров.

Первичные структуры поринов иерсиний были выведены из нуклеотиднс1 последовательности соответствующих ompF генов. Сравнительный анализ АК состав поринов исследованных иерсиний был проведен с привлечением соответствующих даннь для Y. pestis, взятых из банка Swiss-Prot (Q8ZG94). АК состав поринов из НМ бактерий ро£ Yersinia был характерен для порообразующих белков НМ энтеробактерий. Отмечег значительное содержание кислых аминокислот, аспарагиновой и глутаминовой (инде

полярности белков 43-45%), отсутствие цистеина и низкое содержание лизина (не более 5%) Относительное содержание ароматических аминокислот в поринах оказалось достаточно высоким, около 13% В состав мономеров исследованных поринов входит по 3 остатка триптофана и 26-27 остатков тирозина Суммарное количество остатков таких пар аминокислот, как Lys-Arg, Asp-Glu, lie-Leu для исследованных белков составляет порядка 30, 90, 30 соответственно Эти значения близки значениям подобных сумм, рассчитанным для Omp F поринов энтеробактерий, в частности трех видов сальмонелл

Для поринов патогенных иерсиний были определены теоретические изоэлектрические точки (ИЭТ) и рассчитаны М для OmpF У pseudotuberculosis эти величины составляют, соответственно, 4,45 и 37,7 кДа, а для OmpF У enterocolitica - 4,34 и 39,5 кДа Эти значения М хорошо согласуются с соответствующими величинами, ранее полученными экспериментально с помощью SDS, ПААГ-электрофореза и масс-спектрометрии MALDI-TOF (раздел 1, табл 2)

Результаты сравнительного анализа АК последовательностей поринов иерсиний, в том числе взятых из GeneBank (NCBI), представлены в виде таблиц, отдельно по У pseudotuberculosis и У pestis (табл 3) и по У enterocolitica и другим энтероколитикоподобным видам (табл 4) Как видно из данных таблиц, наиболее близкими между собой видами являются У pseudotuberculosis и У pestis Степень гомологии этих поринов (до 95%) близка к таковой для внутривидового подобия 98,6% - для серотипов У pseudotuberculosis и 99,2% для сероваров У pestis Эти данные подтверждают близкое эволюционное родство двух видов и гипотезу появления У pestis от У pseudotuberculosis

Таблица 3 Степень гомологии между OmpF поринами У pseudotuberculosis и У pestis (в %)

У pseudotuberculosis У pestis

Yps 3260 (1B) Yps 32953 (1B) Yp_C092 Yp_91001 (mediaevalis)

Yps 3260 100,0 98,6 95,0 94,8

Yps 32953 100,0 93,6 93,4

Yp С092 100,0 99,2

Yp_91001 100,0

Таблица 4 Степень гомологии между OmpF поринами У enterocolitica и другими энтероколитикоподобными видами иерсиний (в %)

У enterocolitica У intermedia У kristensenn У fredenksenn

Ye_164 Ye 8081 Yi 253 Yk 991 Yf 4849

Ye 164 100,0 93,2 84,1 84,5 85,7

Ye 8081 100,0 80,6 82,1 82,4

Yi 253 100,0 88,3 84,6

Yk 991 100,0 84,6

Yf 4849 100,0

При сравнении поринов второй группы бактерий (табл 4) была обнаружена высокая степень гомологии первичной структуры между поринами 2-х разных штаммов У enterocolitica (93,2%) Для представителей других вцдов энтероколитикоподобных иерсиний процент гомологии АК последовательности исследованных белков составил 80,6-88,3%, что укладывается в допустимый интервал разброса значений межвидового подобия

При сравнительном анализе первичной структуры поринов патогенных иерсиний и OmpF белков других энтеробактерий (табл 5) обнаружена достаточно высокая степень подобия поринов иерсиний с OmpF S marcescens (70%) и значительно меньшая гомология с OmpF Е coli (52-58%) Следует отметить, что степень гомологии, выявленная при сравнении OmpF-подобных белков,хорошо согласуется с данными, полученными при сравнении последовательностей 16S генов рРНК энтеробактерий

Таблица 5 Степень гомологии между OmpF- подобными поринами энтеробактерий (в %)

Y pseudotu berculosis Y pestis Y enterocohtic а S marcensens E coli

Y seudotuberculosis 100 95 83 70 55

Y pestis 100 82 70 58

Y enterocolitica 100 70 52

S marcensens 100 57

E coli 100

При множественном выравнивании АК последовательностей зрелых OmpF -подобных белков энтеробактерий (рис 3) были обнаружены следующие закономерности Во-первых, наблюдается наличие протяженных областей высокой и низкой гомологии, при этом консервативные участки приходятся на трансмембранные домены, а высоковариабельные участки на «внешние» петли OmpF Е coli Во-вторых, отмечается очевидная закономерность в распределении гидрофобных аминокислот и консервативных аминокислотных остатков, в первую очередь, глициновых, тирозиновых и фенилаланиновых Известно, что в поринах ароматические аминокислоты образуют два так называемых ароматических «пояса», один из которых находится на границе мембраны и периплазматического пространства, а второй - на границе мембраны и внеклеточного пространства Их функция заключается в удержании гомотримера в липидном слое мембраны

Вторичная структура и трансмембранная топология OmpF-подобных белков иерсиний. Вторичная структура иерсиниозных поринов (рис 3) была смоделирована при помощи программ, предназначенных для предсказания вторичной структуры белков (GOR, PredictProtein, Tmpred) с учетом данных рентгеноструктурного анализа, выполненного для OmpF Е coli Исходя из топологической модели, построенной для OmpF Е coli, ß-тяжи формируют трансмембранные участки белка, а неупорядоченные структуры - петли Распределение элементов вторичной структуры по полипептидной цепи исследованных поринов (рис 3) позволяет сделать следующие выводы Как и следовало ожидать, ß-тяжи приходятся на высококонсервативные участки, а элементы неупорядоченной структуры - на высоковариабельные участки АК последовательности белков Оказалось, что OmpF-подобные порины иерсиний состоят из 16 ß -тяжей и 8 «внешних» петель Результаты сравнительного анализа первичной структуры петель представляют наибольший интерес, поскольку гомология консервативных трансмембранных участков АК последовательности белков (ß -тяжей) составляет около 90% (ß 7, ß 14, ß 16) и 100% (ß 1, ß 6, ß 8, ß 13, ß 15), а гомология полипептидов в области петель - от 16% (петля L4) до 100% (петли L1, L3, L5)

YE AEIYNKD6NKLВЕ.YGKVDARHQFSDNAGQP-----GDESYVRFGFKGETQITDQtTGYGQWEYNV 60

YK AEIYNKDGNKLDLYöKVDARHQFSSNAGQO-----GDEEYVRFCFKGETQXTDQLTGYGQWEYNI 60

YI AEIYNKDGNKLDLYGKVDARHQFSDAKSQD-----GDETYVRFGFRGETQITDQLTGYGQWEYNV 60

YF AEIYNKDGNKLBE.YGRVDARHQFSDNAKQD-----SDKSYVRFGFKG£TQITDQLTGY6QWEYNV 60

YPS AEIYN KDGNKLDtYGKVDARH SF SDNN KQD-----GDKSYVRFGFRGETQITDQLTGYGQWEYNI 60

YP AEIYNKDGNKLDLYGKVDARM S FSDNN KQD-----GDKSYVRFGFKGETQITDQLTGYGQWEYNI 60

SMA AEIYN KDGNKLDLYGKVDGLH YFSK D KG N D-----GDQTYVRFGFKGETQITBQLTGY.GQWEYNV 60

ECF AEIYNKOGNKVE>LYGitAVGLHYFgKGNGENSYGGNG;PMTVARLGFKGgTQTNSDLTGYGQWEYNF 65 ßl6 ßl LI ß2 ß3

YE QANHAESQGD-KGfJKTRLGFAGLKFAEFGSLDYGRNYGVIYDVNAVJTDWLPVFGGDSISNSDNYM 124

YK ^ANNÄEAQGA-DG^mGFAGLKFAEFGSFDYGRWYGVIYDV№WD«UiVPQfiDSlSNSDNYH 124

YI CjAN^EAQEA-KGNKTRLGFAGLKFßQFGSLÖYGRMYGVIYDV^VmiHti^FeGQSISNSDNYM 124

YF QANNTEGGDAQDGNATRMGFAGLKFAEFGSFOYGRWYGVIYOVMAWTDMLPVFGGDSISMSONFH 125

YPS qAWAED SGAQDGNATRtGFAätKFAEFG S FDYGfthiYGVlYOVfMWTOMt?VFGGG$X$«SON FM 125

YP QA^NAEDTG AQOGfJATRLGFAGtKFAE FG 5 FOYGflNYGVI YOVMÄWTOMtPVFGGÜ$X$«$W FM 125

SMA qS№ÄESQGTE-GT«TFttGFAGLKfADYGSFDYORfiYGVLYWEGUrTOWti)EFGGOTYTY$t)NFM 124

ECF QGNNSEGADAQTGNK'rRLAFAGLKYADVGSFDYGRNYGWYDALGYTOWLPEFGOTT-AYSDDFF 129

L2 ß4 ßS L3

YE TGR$T<;tATVR^HFf<5VVC>GUiFAl,QVQeiiNENDR5AVANGVYTGDNLKDQ«&CKiFiISSTYt>i 189

YK TGRSTG LATYRNQNF FGt-VDSLN FALQYQGKN ENG RDG LL ST---------QNGDGFGLSSTYDI 180

YI TGRSTGtAXYRMTNF FGL.VDGLN FALQYQGKN ETGRDG LLTT---------QNGDGFGISSTYDI 180

YF TGRSTGLATYRNTNF FGLVDGLN FALQYQGKN E—RNGDVKE---------SNGQGFGIGSTYDL 179

YPS 4GRST&LATYRNNNF FGMVDGLN FALQYQGK.NDR------------SEVKEANGDGFGIGSTYDL 178

YP AGRSTGLATYRNN NF FGLVDGLN FALQYQGKN DR------------SEVKEAN&DG FGIGSTYDI 178

SMA TGRTNGVATYRMNNFFGLVDGLN FALQYQGKiJQN—DG--------RDVKKQNGDGWGISSTYDI 179

ECF VGRVGGVATYRMSWFFGLVDGLNFAVOYLGKNER------------DTARRSNGftGVGGSISYEY 182

p6 p7 L4 p8

YE GYGVNFGAGFSSSNRTDQQKRFS-----TAEGOKAQAWNVGAKYDAMNVYLAVMYAETQNMTPYG 249

YK. GYGVSFGAGYSTAHR.nAQKNAHLNTTPSAEGOKAQAWNVGAKYDA№JVYLAAMYAETQ«LTPFG 245

YI CYavNF^ASFSSAHRTTLQKDAHLTNSTFAEiOKAQAW^AKYtJA^mAWYAETqHLTPFO 245

YF GYGVNFGAGYSTA^RTTLQKD-----ASTAPGNqAQAW^AKYDAWmAWAEmNMtPYc; 239

YPS GNGXNFGAGFSSSmTLOQKYGS-----TAEGOKAQAWNVGAKYOAWJVYLAVMYAETQNLTPYG 238

YP GNGINFGAGF5SSNRTLDQICYGS-----TAEGOKAQAWNVGAKYOAMNVYLAVMYAETQNLTPYG 238

SMA <3EGVSFGAAYAS5NRTDDQKLRS-----NERG0KADAWTVGAKYDANNVYLAAMYAE7RNMTPFG 239

ECF -ESFGIVGAYGAADRTNLOEAOP-----LGNGKKAEOWATCРСУРАШ! YLA ANYGETRMATPIT 241

¡39 LS plO Pll

YE -DANDT-----------SANKXROTEITAQyQFOFGLftPS[.GYVQSKtSKUL.tiA—N GDNQOL.L K.Y 300

YK -N-DG------------1ANfCTRDTELTAQYiiFDFGLRPSf,G YVQStiGROLNN-NTDTNHDLL(CY 295

YI -EDS-------------VANKTKOTfirTAQYQFDFGLRP5LGYVQSKGKDLNNAT-DDNHDLVfCY 295

YF -TVANT-----------IANfCTR£JL£rTAQYCtFOFGLRP&f,GYVQSKGKOLMDAT-GDMHDLVEY 291

YPS -FYDFT-----------1ANKTROieiTAQYQFDFGLRPStGYVQSKGKDLNN--VDANHDLVK.Y 289

YP -SFSDT-----------IAKK.TM3tSITAWQF0faR^t.GYVQSKiSR0tND—VDANBOILKY 289

SMA -GGNFTNTCAATENCGGFASKTQNF£VTAQYOFDF6tRPEVSVLQSKGKNlNVPGVGSDQO(,VtiY 303

ECF NK.FTNTSG---------FAHK-TQtiVLLVAQYOFtiFGLRPSlAYTKSKAKOVEG---IGDVPLVNY 294

L6 pi2 pi3 L7

YE V$V$syyVFNKWSrYVOYKltit,t.OeNDFTRAN<51,NTEJE)VVi3VStVYaF 349

YK. vSVOTYYYF^K№4iirYVOYKIftLLOeDKFTRAfiOtNT[)NVV(9VGLVY<lF 344

YI VSVSSYyAFNKbWTTWDYKINtf-DEDNFTRNNNLMTD&VVGVBLVYQF 344

YF VSVGSYyYFNK№tSTyVDYKIfcH.LD6DTFTVKNGLNTDNVVQVGLVYQF 340

YPS VSVGTYYYFNKNMSTYVDYKXMtEOKDLFTEVfiRIMTDDVVAVGLVYQF 338

YP VSVGTYYYFNKfWSTYYDYKINL LDEDU. DKONtaLNTDNWAVGLVYQF 338

SMA VSVGTTYYFNKNHSTYVDYKIflLLDDNDFTKATGIATDDIVGVGl.VYQF 352

ECF FEVGATYYFmCWtSTWDYIIMOIflSD—-NKLGVGSDDTVAVGIVYQF 340 P14 plS LS P16

Рис 3. Множественное выравнивание AK последовательностей зрелых OmpF поринов иерсиний Серым фоном выделены идентичные АК остатки Жирным шрифтом выделены функционально значимые АК остатки, которые играют важную роль в размере поры YE - У enterocolitica, YK - У knstenseni ,YI - У intermedia, YPS - Y pseudotuberculosis YP - У pestis (Swiss-Prot Q8ZG94), SMA - S marcescens (Swiss-Prot 033980), ECF - E coll (Swiss-Prot Po2931)

При сравнении OmpF поринов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза обнаружено, что основные отличия между ними приходятся на петли L6 и L8 Скорее всего, именно они определяют основные антигенные различия этих белков Как видно из рис 3, петли поринов иерсиний отличаются не только первичной структурой, но и имеют различную длину Наибольшими по длине являются петля L1 OmpF £ со//, петля L4 OmpF У enterocolitica и петля L6 OmpF S marcescens

В стабилизации тримерной структуры огромное значение имеет петля L2 При анализе петель L2 поринов из У enterocolitica и S marcescens обнаружено значительно большее сходство в АК последовательности этих участков (70% идентичности), чем между аналогичными участками OmpF белков У enterocolitica и других иерсиний (45% идентичности) Это, несомненно, свидетельствуют о филогенетическом родстве микроорганизмов У enterocolitica и S marcescens

Известно, что петля L3 проникает внутрь поры и участвует в механизме «открытия-закрытия» канала Ключевыми аминокислотами во взаимодействии петли L3 с внутренней

стенкой (3-барреля являются Lys-16, Arg-41, Arg-82, Arg-132 ф-баррель) и Asp-113, Glu-117 (петля L3). Интересно, что все три порина иерсиний имеют одну и ту же замену в высококонсервативном пентапептиде PEFGG, где остаток Glu-117 заменен на Val-114/115. Остальные функционально значимые АК остатки у иерсиний являются одинаковыми (рис.3).

Теоретическая модель пространственной структуры тримера иерсинина.

Учитывая практически полную идентичность первичной структуры иерсинина и порина из У. pestis, пространственные модели мономерных форм поринов У. pseudotuberculosis (YPS) У. enterocolitica (YE) и У. pestis (YP) были построены с помощью метода гомологичного моделирования (с использованием серверов PredPort, 3DSSM и SWISS-MODEL). В качестве прототипа была использована 3-D структура Pho Е порина из Е. со//'. Суперпозиция Са атомов мономеров патогенных иерсиний и порина Pho Е имела среднее квадратичное отклонение 0.47 А и 0.43 А (для YPS и YE соответственно). Нами также была построена модель тримера OmpF У. pseudotuberculosis (рис. 4) с использованием в качестве матрицы пространственной структуры тримера порина OmpF Е. coli (ЗНХХ).

Рис. 4. Теоретическая модель пространственной структуры тримера и мономера порина

из У. pseudotuberculosis (А) и мономера У. enterocolitica (Б).

Верхний ряд - вид сбоку; нижний ряд - вид сверху.

Обнаружено, что порины иерсиний по пространственной структуре очень похожи на неспецифические порины других энтеробактерий и имеют те же самые особенности как в общей укладке p-стрэндов, так и в расположении петель, в частности петли L3, важной для функциональных свойств белка. Однако, несмотря на высокую степень структурного подобия, у поринов иерсиний были обнаружены необычные замены в функционально значимых консервативных сайтах АК последовательности. Так, упомянутая выше замена Glu на Val в высоко консервативном пентапептиде (Pro-Glu-Phe-Gly-Gly-Asp), расположенном в средней части петли L3, «разрушает» функционально важный кластер кислых АК в зоне констрикции (сужения) поры. Наибольшие различия наблюдались в области внешних петель, например для петель L6 и L8 степень идентичности составляла только 71.4 и 52.9% соответственно. Экспонированные на поверхности эти петли поринов являются потенциальными линейными антигенными детерминантами и обуславливают иммунохимическое различие белков.

последовательности, «просвета» поры и

Был проведен компьютерный анализ структурной организации Omp F Е coll и поринов патогенных иерсиний (У pseudotuberculosis и У pestis), а именно сайтов АК участвующих в субъединичной ассоциации, формировании структуры ее внутренней части В результате были обнаружены различия в полярном взаимодействии, играющем важную роль в стабилизации тримера белка, а также распределении отрицательных зарядов so внешнем «вестибюле» пориновых каналов На основании этого с помощью программы HOLE была предсказана проводимость порина из Y pseudotuberculosis При сравнении теоретических и экспериментальных данных, полученных ранее для иерсинина, обнаружено хорошее соответствие значений проводимости канала, образуемого иерсинином в БЛМ

3 Функциональная активность поринов иерсиний

Электрофизиологические свойства порина из НМ Y pseudotuberculosis (иерсинина) При добавлении иерсинина в водную фазу, окружающую БЛМ, мембранный ток изменялся дискретно с течением времени как для олигомерной, так и для мономерной формы белка (рис 5)

Рис 5 Флуктуации тока через БЛМ

(а) в присутствии олигомера иерсинина (10 нг/мл) и

(б) ТСБ мономера (100 нг/мл) Водная фаза 0,1 М №01 в 10"2 М трис-НС1 буфере, рН 8,0 Температура 25°С Сопротивление обратной связи 108 Ом

а

П-Г ъ

пгГ 6 Тт>,

оо зоо <1, псм

Рис 6. Гистограмма уровней проводимости, (а) индуцированной тримером иерсинина (20 нг/мл, п=157) и (б) ТСБ мономером (100 нг/мл, п=134)

Водная фаза 0,1 М №С1,102 М трис-НС!,рН 8,0

Подобный характер изменения проводимости БЛМ может быть обусловлен только возникновением в ней пор Наименьшие концентрации, при которых наблюдались флуктуации тока в БЛМ для обеих форм белка, отличались на два порядка для олигомера -0,1 нг/мл, для мономера - 10 нг/мл Тем не менее, анализ уровней проводимости, индуцированной иерсинином, показал, что наиболее вероятные каналы, образованные обеими формами белка, имеют одинаковую проводимость, порядка 240 пСм (рис 6) Это указывает на общий механизм порообразования под влиянием обеих форм иерсинина

Специальные эксперименты показали, что вопьт-амперная характеристика одиночного канала, индуцированного тримером иерсинина, линейна и симметрична относительно начала координат при изменении мембранного потенциала от -120 до +120 мВ На рис 7 приведена запись изменения тока в БЛМ, индуцированного одной «работающей» порой При потенциале больше 100 мВ обнаружено влияние знака мембранного потенциала на состояние одиночной поры наблюдались быстрые отключения одиночного канала Поскольку вероятность реконструирования белка при добавлении с обеих строн БЛМ была одинакова, нельзя точно сказать, потенциал какого знака инициирует «закрытие» канала

Мембрана с большим числом пор также имела линейную вольт-амперную характеристику, поэтому ее свойства определяются свойствами одиночного канала Диаметр такой поры можно оценить по формуле Л = сгхтосГ2/ L, где Л - наиболее вероятный

уровень проводимости поры, равный 240 пСм, а - удельная электропроводность 0,1 раствора ЫаС!, равная 10,6 мСм/см, I. - длина канала, равная 7,5 нм Диаметр порь иерсинина оказался равным 1,5 нм, что близко к величине диаметра пор други энтеробактерий

+100 МБ

-рРТГП рпт

Рис 7 Зависимость

вив проводимости одиночного

Г канала иерсинина

J(0,1 нг/мл) от знака 16 па мембранного потенциала, __вое приложенного к БЛМ

100 мВ

Рис 8 Зависимость

интегральной прово-димости БЛМ (через 10 мин после форми-рования мембраны) от

—""^-13......'.¡о-12 ....."' концентрации тримера иерси-

. с нина (1) и ТСБ мономера (2)

Каждая точка соответствует среднему из пяти измерений На рис 8 представлена зависимость интегральной проводимости БЛМ о концентрации иерсинина в двойном логарифмическом масштабе Наклон прямой на тако графике интерпретируют как число субъединиц, участвующих в образовании проводящег комплекса Как видно из рис 8, для тримера порина эта величина равна 2, а для мономера 1 Полученный результат можно объяснить включением в БЛМ либо двух тримеро одновременно, либо гексамеров иерсинина, образующихся в условиях проведени эксперимента Возможно, при данной концентрации белка и/или выбранном значении р буферного раствора иерсинин существует в виде агрегатов тримеров (см ниже раздел 4) Таким образом, канал иерсинина по своим размерам и электрическим характеристика подобен водонаполненным порам, образуемым в модельной мембране Отр Я поринам энтеробактерий

Парообразующие свойства изолированных поринов из У еп{егосо/1йса энтероколитикоподобных иерсиний При добавлении в водную фазу, окружающу БЛМ, изолированных тримеров поринов из НМ У ел(егосоМюа и непатогенных видо иерсиний наблюдались дискретные флуктуации тока с присущим для порообразующи белков ступенчатым характером изменения проводимости модельной мембраны Тримерные формы поринов проявляли высокую порообразующую активность в облает концентраций 5-10 нг/мл, и величина наиболее вероятной проводимости канала зависела о мембранного потенциала (табл 6) Наибольшая проводимость обнаружена для каналов образованных поринами из У Кебелквепи (480 пСм) и У еп1егосоЫ1са (400 пСм) Характерной особенностью пор, образованных тримерами белков из 3-х непатогенны иерсиний, являлось наличие 2-х популяций каналов с различным диаметром пор (табл рис 9 ) Для порина из энтероколитики подобная гетрогенность каналов проявлялась тольк при увеличении потенциала на мембране

Согласно данным табл 6, по величине пор, образуемых в модельной мембране исследованные белки можно отнести к Отр Р-подобным поринам НМ грамотрицательны бактерий, которые экспрессируются в мембране при низкой температуре и низко содержании солей в культуральной среде

Таблица 6 Проводимость и размер каналов, образованных поринами бактерий рода Yersinia, при мембранном потенциале -20 и -50 мВ

Образец порина (10 нг/мл) -20 мВ -50 мВ

д,пСм D, нм д, пСм D, нм

У enterocoltica 400 1,42 192, 240 0,99, 1,10

У intermedia 180, 360 0,96, 1,35 120, 172 0,78, 0,94

У knstensenn 180, 300 0,96, 1, 24 120, 192 1,10

Y frederiksenn 180, 480 0,96, 1,56 240 0,78, 0,99

Анализ гистограмм распределения пор по проводимости для поринов из У intermedia, У enterocolitica, У kristensenu и У fredenksenu (рис 9 и табл 6), показал, что увеличение мембранного потенциала до -50 мВ приводит к уменьшению наиболее вероятного уровня проводимости каналов до 120 - 240 пСм При этом в случае поринов из У intermedia и У knstensenn сохранялись две популяции каналов с различным диаметром пор, а доля пор малой проводимости, порядка 100 пСм, увеличивалась Подобная закономерность была обнаружена для каналов, образованных Omp F поринами из Е coli, для которых увеличение мембранного потенциала приводило к дестабилизации пор большого диаметра

б

Ui

Проводимость пор, пСм

тггптгтпттптгптп I Пни ifirii i ь.ш и Проводимость пор, пСм ~

402D-

iL

i-rrt IЯ И П1 W^H »Ч F«» >

— сч о» m -г w. Проаоанмость пор. иСм

OMfSSSONje®

— cc f> о r-

rl N г", -Г VI IT,

Проводимость пор, пСм

Рис 9 Гистофаммы уровней проводимости пор, образованных поринами НМ У intermedia (а), У enterocolitica (б), У knstensenn (в), У fredenksenu (г) в зависимости от мембранного потенциала -20 мВ - черные колонки, -50 мВ - серые колонки, ширина колонок 24 пСм По оси ординат указано число каналов (N), по оси абсцисс - проводимость пор (А) Отмеченные уровни проводимости кратны А„ин, равной 80 пСм

4 Конформационная пластичность неспецифических поринов НМ грамотрицательных бактерий (на примере конформационных превращений иерсинина в присутствии денатурантов)

Согласно современным представлениям отдельные области олигомерной структуры порина отличаются устойчивостью к действию различных денатурирующих агентов Это обстоятельство предопределяет множественность денатурированных состояний поринов, отличающихся между собой по конформации Структура и функциональная активность этих конформационных интермедиатов изучены слабо, хотя информация такого рода необходима для понимания молекулярных механизмов транспорта веществ через пориновые каналы и особенностей фолдинга мембранных белков

Пространственная структура молекулярных форм иерсинина, получаемых при солюбилизации мембраны, и различных денатурированных форм порина была охарактеризована с помощью методов оптической спектроскопии и сканирующей микрокалориметрии Согласно литературным данным вторичная структура порина из Е coli в липосомальной мембране характеризуется повышенным содержанием ß-структуры (80±5%) и почти полным отсутствием а-спирали (не более 4%) Указанное выше соотношение элементов вторичной структуры мы рассматривали как своеобразную «точку отсчета», так как пространственная организация белка в искусственном бислое максимально приближена к таковой в нативной мембране

Сравнительная характеристика пространственной структуры молекулярных форм поринов иерсиний Как было сказано в разделе 1, образование ТСБ мономерных форм поринов иерсиний сопровождалось изменением величины кажущейся М в условиях SDS, ПААГ - электрофореза, что обусловлено конформационными изменениями на различных уровнях пространственной организации белка Обнаружено, что спектры КД тримеров, мономеров и термоденатурированных мономеров поринов исследованных видов иерсиний в дальней (190-240 нм) и ближней (250-300 нм) УФ-областях различаются между собой, в то время как спектры соответствующих молекулярных форм поринов из разных видов иерсиний подобны В качестве примера на рис 10 представлены спектры КД поринов из У knstensenii

Анализ данных рис 10 позволяет заключить, что при переходе тримерной формы поринов в денатурированный мономер регулярная вторичная структура белков сохраняется, однако форма и амплитуда полос в спектре КД изменяется Помимо минимума при X = 218 нм, характерного для Р- структурированных белков, появляется второй минимум при X = 207 нм, что свидетельствует об увеличении в полипептидной цепи порина доли а- спирализованных участков Расчеты содержания элементов вторичной структуры исследованных поринов, выполненные с помощью метода Провенчера-Глокера для иерсинина (табл 7) и пакета программ СРРго для остальных поринов (табл 8), подтверждают этот вывод Так, по сравнению с гримером и мономером в полипептидной цепи ТСБ мономера иерсинина содержится в 2-2,5 раза больше а-спиральных участков и соответственно меньше (5-структуры (табл 7) В случае поринов из энтероколитики и непатогенных иерсиний (табл 8) наблюдается та же тенденция, но для этой группы белков

(190-240 нм) УФ-областях термолабиль-ные тример (1) и мономер (2), термоденатурированный

Рис 10 Спектры КД разных молекулярных форм порина НМ У /ff7sfeлseл// в ближней (250300 нм) и дальней

мономер (3) в 0,25%-ном растворе SDS

она более выражена и приводит к тому, что в отличие от тримеров, относящихся к полностью р- структурированным белкам, ТСБ мономеры этих поринов ближе по структуре к белкам а+р класса Изменения в содержании неупорядоченной структуры в полипептидной цепи поринов из всех видов иерсиний при диссоциации тримеров на мономеры оказались незначительными

Таблица 7 Характеристика нативного и денатурированного иерсинина в присутствии различных детергентов

Детергент Содержание элементов вторичной

Флуоресценция Явозб , нм структуры по данным спектров КД ( в %)

Образец белка 280 296 а-спи раль ß-струк тура ß-изгиб Неупоря доченная структура

0,1 % Тримердо 322±2 328±2 23 42 14 21

SDS нагревания Мономер до 327±1 328±2 12 48 21 19

нагревания Гример после 315±1 337±1 32 34 14 20

нагревания

0,2 % Гример до 326±2 330±2 4 48 23 25

ОГ нагревания Гример после нагревания 334±1 337±1 2 51 23 24

Таблица 8 Содержание элементов вторичной структуры поринов из У intermedia (У/), У enterocolitica (Уе), У knstensenn (Ук), У frederiksemi (Yf), рассчитанное по спектрам

а- ß- Р- неупорядоченная

Образец порина* спираль структура изгиб структура

У/ тример 17 33 24 26

У е тример 8 32 27 33

У к тример 7 42 21 30

У f тример 8 34 26 32

Yi ТСБ мономер 22 21 27 30

Уе ТСБ мономер 12 30 29 29

У к ТСБ мономер 15 37 19 29

Yf ТСБ мономер 38 20 12 30

• - образцы поринов в 102 М трис-HCI буфере, рН 7,4, 0,25%-ный SDS

Согласно данным спектров КД поринов в ближней УФ-области третичная структура поринов исследованных видов иерсиний оказалась более чувствительной к действию температуры Помимо потери жесткости пространственной организации белковой молекулы в целом ТСБ мономеры отличались от тримеров и по микроокружению ароматических флуорофоров Следует отметить несколько большую устойчивость третичной структуры иерсинина по сравнению с таковой других исследованных поринов (за исключением белка из У frederiksenii) к изменению температуры Для термоденатурированных мономеров поринов из У pseudotuberculosis и У fredenksenii наблюдался наименьший сдвиг максимума спектра суммарной флуоресценции в коротковолновую область спектра (до 315±1 нм) по сравнению со спектрами других поринов (до 310+2 нм) Как известно, это явление носит название «голубого сдвига» максимума суммарной эмиссии белка и обусловлено увеличением вклада остатков тирозина в суммарное излучение белка за счет увеличения расстояния между ароматическими флуорофорами и/или тушения их флуоресценции растворителем при экспонировании на поверхности белковой глобулы (табл 7 и 9)

На примере иерсинина было показано существенное влияние природы используемого для экстракции поринов детергента на пространственную структуру белка Как видно из данных табл 7, в присутствии неионного детергента ОГ пространственная структура порина максимально приближена к таковой в липосомальной мембране, то есть к нативной, и обладает большей стабильностью при увеличении температуры

Таблица 9 Параметры спектров флуоресценции поринов У intermedia (У/), У enterocolitica (Уе), У knstensenn (Yк), У frederiksenn (Yf)

Образец Хвогб Я»макс, / ДА.1/2, Я(/з2[Лз5о)

порина* НМ НМ фл отн ед НМ

У ( тример 280 328±2 224 3 63 1 35

296 337+1 66 0 64 0 94

Уе тример 280 330+1 142 2 64 1 29

296 340±2 49 1 72 0 75

Yk тример 280 330±1 215 2 61 1 30

296 335+2 62 1 59 0 97

Yf тример 280 330±1 181 3 61 1 32

296 337±2 52 8 61 0 93

У / ТС Б 280 310±1 138 9 78 1 28

мономер 296 339±1 46 6 67 0 82

У/ТСБ 280 312±1 96 1 69 1 20

мономер 296 340±1 34 9 70 0 80

У/гТСБ 280 310+1 90 2 73 1 13

мономер 296 341 ±2 33 8 72 0 67

yfTCB 280 315±1 127 9 74 1 28

мономер 296 337±1 41 8 64 0 87

* образцы поринов в 102 М трис-НС1 буфере, рН 7,4, 0,25%-ный БОЭ

Температурная денатурация поринов иерсиний Влияние изменения температуры на пространственную структуру тримеров поринов иерсиний было исследовано в динамике в диапазоне температур 20-90°С Согласно данным БОЗЛААГ-электрофореза нагревание тримеров не приводит к появлению мономерной формы белка, наблюдаемой в процессе выделения поринов, а только к образованию денатурированного мономера (рис 11) 123 4 5678 9

■ • 3 Рис 11 Элекгрофореграмма

тримеров поринов У еМегосоЫюа при различной __ температуре 1 - 25-40°С, 2 -

*"* 45'С, 3 - 50'С, 4 - 55°С, 5 -

60°С, 6 - 65"С, 7 - 7СГС, 8 -80°С, 9 - 90°С

Этот результат позволяет предположить, что при термоденатурации поринов, представляющей собой двухстадийный процесс (диссоциация - денатурация), скоро сто конформационных превращений, происходящих на каждой из стадий, существенно отличаются Другое объяснение может быть основано на предположении, что диссоциация тримера на мономеры происходит одновременно с денатурацией мономерной формы белка

3303283262 324-

i 322" 1 3202 318-I 316-| 314312310-

IS-J

40 50 6 Температура, "С

Рис 12. Изменение Лмакс суммарной флуоресценции (Авозб 280 нм) поринов из У « intermedia (кривая 1), У

enterocolitica (кривая 2), У knstensenn (кривая 3), У то frederiksenu (кривая 4) в зависимости от температуры

3553501

i 345-

I : «

§ 335330-

.551

Температура, С

Рис 13 Изменение А„акс триптофановой флуоресценции (АВОзб 296 нм) поринов из У intermedia (1) У enterocolitica (2), У knstensenn (3), У frederiksenu (4) в зависимости от температуры

Как показали наши исследования, при нагревании до 50°С денатурация поринов была обратимой, а в интервале 50-70сС наблюдался конформационный переход (рис 12,13) Об этом свидетельствовало резкое изменение положений максимумов спектров эмиссии белка при обеих длинах волн возбуждения, что указывает на появление качественно нового состояния порина - денатурированного мономера (ТСБ мономера) Температура конформационного перехода, определяемая как средняя точка S-образной кривой (отображающей термозависимость А„а11С спектров флуоресценции белков), для поринов разных видов иерсиний оказалась различной В случае порина НМ У enterocohtica термопереход происходил при 55°С, что на 7-10°С меньше по сравнению с термопереходами поринов из непатогенных видов иерсиний (62-65°С) Самым термоустойчивым из поринов оказался иерсинин, который необратимо денатурировал при 76'С За точкой термоперехода поринов (в диапазоне от критической температуры до 90°С) параметры спектров суммарной эмиссии белков не изменялись Согласно данным рис 13, порин из У kristensenn в отличие от поринов других видов иерсиний претерпевает два температурных перехода (при 50° и 70°С), причем оба носят кооперативный характер

В спектрах триптофановой флуоресценции термоденатурированных мономеров поринов наряду с основными полосами, приведенными в табл 7 и 9, наблюдались «плечи» при 350±1 нм (для иерсинина и поринов НМ непатогенных иерсиний) и 355±1 нм (в случае порина НМ У enterocohtica), что свидетельствует о появлении остатков триптофана, доступных растворителю Очевидно, вследствие конформационных изменений в пространственной структуре поринов при увеличении температуры только часть остатков триптофана оказывается на поверхности белковой молекулы, а другая остается в гидрофобном окружении, в структурном домене, устойчивом к нагреванию

Конформационные переходы иерсинина при изменении значений рН среды

Денатурация иерсинина в кислой среде Изменения в структуре иерсинина, происходящие при изменении значений рН среды (в диапазоне 8,0 - 2,0) на уровне третичной и вторичной структуры белка, определяли методами сканирующей микрокалориметрии, флуоресцентной спектроскопии и КД С помощью SDS.nAAf-

электрофореза оценивали изменение молекулярной структуры иерсинина. Для анализа изменений в функциональной активности иерсинина использовали технику БЛМ.

Динамика изменений молекулярной структуры иерсинина при изменениии значений рН среды от 8,0 до '2,0 (рис. 14) показала, что уже при рН 4,5 наряду с тримерной формой иерсинина в образце присутствует мономер белка, а в интервале значений рН 3,5 - 2,0 иерсинин существует только в мономерной форме. Значение ее кажущейся М составляет около 40 кДа, что, как было показано ранее, соответствует М денатурированного мономера иерсинина. На основании этих данных можно утверждать, что с увеличением концентрации ионов Н+в растворе белка происходит диссоциация тримеров порина.

Рис. 14. ЭОЗ.ПААГ-электрофорез образцов

иерсинина, полученных при рН-титровании (дорожки 2-8): 2 - рН 7,5; 3- рН 6,3; 4 - рН 5,8; 5 - рН 5,0; 6 - рН 4,5; 7 - рН 3,5; 8 - рН 8,0 -> 2,0; 1 -белки-маркеры (М, кДа): ингибитор трипсина (20), карбогидраза (30), яичный альбумин (45), бычий сывороточный альбумин (67), фосфорилаза В (94).

Присутствие только денатурированного мономера свидетельствует, скорее всего, о том, что и в кислой среде, подобно температурной денатурации (см. выше), разрушение молекулярной целостности тримера порина сопровождается одновременной денатурацией составляющих его мономеров. Об этом же свидетельствует изучение термостабильности иерсинина с помощью сканирующей микрокалориметрии при различных значениях рН. Как показали наши исследования, иерсинин при рН 7,6 имеет четко выраженный термопереход при температуре 75°С. При нагревании раствора порина при рН 3,5 и 2,2 характерное плавление образцов не наблюдалось. В связи с этим можно предположить, что изменения в пространственной структуре иерсинина под действием кислоты приводят к значительным нарушениям молекулярной организации порина на уровне третичной структуры белка.

На рис.15 приведены рН-зависимости параметров спектров флуоресценции (I, \тах, Я, ДЯ.1/2) иерсинина. Характер изменения этих параметров свидетельствует о том, что при рН-титровании порин образует целый ряд переходных конформационных состояний. В интервале значений рН 7,5 - 4,5 минимумы и максимумы кривых рН-зависимост отдельных параметров спектров флуоресценции (при обеих длинах волн возбуждения) не всегда совпадают. Это, скорее всего, свидетельствует о некооперативном характере" изменений в структуре белка, которые связаны с постепенным изменением микроокружения ароматических флуорофоров по мере увеличения доли протонированных кислых: аминокислотных остатков в белке. Анализ кривых, приведенных на рис. 15, позволяет выделить две области структурных перестроек в молекуле иерсинина: в интервале значений рН 8,0 - 5,0 (со средней точкой при рН 6,5 - 6,0) и в интервале значений рН 4,0 -2,0 (со средней точкой при рН 3,5 - 3,0). При низких значениях рН (4,0 - 2,0) изменение; суммарного заряда молекулы порина сопровождается более значительными нарушениями в' локальной третичной структуре иерсинина, что приводит к диссоциации тримера белка на,-мономеры. Конформация иерсинина при рН 4,5 соответствует некоему переходному состоянию белка, которое, вероятно, предшествует более выраженным структурным изменениям в молекуле порина при увеличении кислотности среды. Как было показано ранее (раздел 2), теоретическая изоэлектрическая точка иерсинина лежит именно в этой области и равна 4,45. Известно, что вблизи изоточки белки агрегируют, и, как правило, это

1 2 3 4 5 6 7 8

___«I «4

штщ

сопровождается резким увеличением тушения флуоресценции белка

Действительно, при рН 4,5 мы наблюдали наибольшую интенсивность Релеевского рассеяния в УФ спектре иерсинина

при нн

-о- при нм

3 4 5 8

Рис 15 рН-Зависимости параметров спектров флуоресценции иерсинина а - интенсивность флуоресценции (I), б - максимум спектра (Хтах >, в - отношение ЬгЛбо г - полуширина спектра (ДЯ.1/2)

Как видно из данных таблЮ, максимум суммарной эмиссии порина при рН 2,0 смещается в коротковолновую область вплоть до 310 нм, а в спектре триптофановой флуоресценции белка, наряду со сдвигом максимума спектра в длинноволновую область на 5 нм, появляется плечо при Я=343±5 нм Подобные изменения в спектре триптофановой флуоресценции белка, приводящие к уменьшению эффективности передачи энергии флуоресценции от тирозина к триптофану, мы наблюдали и при повышении температуры раствора порина (см выше раздел 4) Действительно, наши расчеты, показали, что для слабоосновных и слабокислых растворов иерсинина эти величины составляют 0,5 и 0,35 соответственно К такому же выводу приводит и сравнительный анализ относительного вклада различных спектральных форм триптофана в суммарное излучение иерсинина при разных значениях рН Оказалось, что спектры флуоресценции иерсинина описываются суммой вкладов форм триптофана Б и II1 6 интервале значений рН 7,5 - 3,5 вклады этих форм практически равновелики (в среднем 0,51 и 0,49 соответственно), а при рН 2,5 - 2,0 вклад индольного хромофора, находящегося на поверхности белка в контакте с молекулами связанной воды, увеличивается до 0,60 и, соответственно, уменьшается вклад остатков триптофана, локализованных в гидрофобной части (3-барреля

Для выяснения, насколько обратим процесс денатурации порина в кислых условиях, раствор белка был оттитрован от рН 2,0 до рН 8,0 Как следует из данных ЗОЭ.ПААГ-электрофореза (рис 14), тример порина при этом не образуется Полученный интермедиат

' Кюх S-формы = 315-317 нм, Ama, формы I = 330-332 нм, А™* формы II = 340-343 нм, Л™, формы III = 350-353 нм

белка является мономером, но его локальная третичная структура отличается от структуры конечного продукта «прямого» рН-титрования (табл 10)

На рис 16,6 приведены спектры КД иерсинина в пептидной области в интервале значений рН 7,5 - 2,0 Увеличение концентрации ионов Н* в растворе иерсинина приводило к уменьшению эллиптичности полос в ближней УФ-области спектра КД (рис 16,а) Это является следствием увеличения степени симметричности окружения ароматических аминокислотных остатков и, соответственно, уменьшения жесткости третичной структуры белка

Таблица 10 Параметры спектров флуоресценции рН - индуцированных интермедиатов порина из псевдотуберкулезного микроба

Образец Я-возб нм Я-макс НМ 1фл отн ДЯ.1/2 нм R (I320/I350)

иерсинина* ед

рН 7,5 280 324±2 339,1 59 1,54

296 332+1 84,8 60 1,19

рН 6,5 280 322+3 356,5 59 1,56

296 332+1 92,0 59 1,19

рН 4,5 280 320±1 300,0 59 1,60

296 332±1 74,3 58 1,22

рНЗ,0 280 319+1 321,7 60 1,64

296 335±2 83,5 61 1,15

рН 2,0 280 309+1 236,9 73 1,90

296 337+2 44,9 55 1,11

343+2

рН 2,0 —>рН 7,5 280 336+1 202,1 64 0,92

296 343+1 36,5 66 0,68

*тример иерсинина (50 мкг/мл) в 102 М фосфатно-цитратном буфере

Таблица 11 Содержание элементов вторичной структуры образцов порина из псевдотуберкулезного микроба по спектрам КД (в %)

№ п/п Образец иерсинина* а-спираль Р" структура Р- изгиб Неупорядочен ная структура

1 рН 7,5 14 50 12 24

2 рН 4,5 14 45 19 22

3 рНЗ,0 24 34 12 30

4 рН 2,0 26 17 3 54

5 рН 2,0-»8,0 18 33 23 26

*порин (150 мкг/мл) в фосфатно-цитратном буфере (10 2М, рН 7,4)

В интервале значений рН 7,5 - 3,5, т е до завершения диссоциации тримера белка, эти изменения незначительны Так, эллиптичность спектра белка при рН 4,5 по сравнению с таковой исходного порина уменьшается всего на 20% В то же время для иерсинина при рН 3,0 наблюдается существенное уменьшение (в 2,5 раза) эллиптичности полосы при А=274 нм по сравнению с таковой в спектре исходного белка В табл 11 представлено содержание элементов вторичной структуры иерсинина в зависимости от величины рН, рассчитанное по

методу Провенчера-Глокера Как видно из данных табл 11, при низких значениях рН наблюдается существенное (до 50%) уменьшение содержания регулярной структуры, преимущественно р-типа, Наибольшее увеличение а-спиральных участков в полипептидной цепи белка отмечено в интервале значений рН 4,0-3,0, а резкое увеличение содержания неупорядоченной структуры с одновременным уменьшением р-структуры происходит в интервале значений рН 3,0-2,0

Рис 16 Спектры кругового дихроизма образцов иерсинина в растворах при разных значениях рН в ароматической (а) и пептидной (б) областях спектра

Денатурация иерсинина в щелочной среде Мы провели исследование конформационной стабильности иерсинина в диапазоне значений рН 12,0-13,0 Оказалось, что при инкубировании белка при рН 12,3 и выше, его регулярная вторичная структура не претерпевает заметных изменений Обнаружено, что структура «щелочного интермедиата» порина зависит от исходного состояния белка в образце, которое, как было показано ранее (раздел 1), определяется способом его солюбилизации Расчеты элементов вторичной структуры порина, выполненные по спектрам КД с помощью пакета программ СОРго, показали, что под действием щелочи в полипептидной цепи порина с более «разрыхленной» структурой, полученного при солюбилизации НМ псевдотуберкулезного микроба с помощью БРЭ (Пор-Эйв), увеличивается доля нерегулярной а-спирали Наблюдаемые изменения в структуре иерсинина необратимы В то же время структура тримеров иерсинина с компактной нативоподобной структурой, полученных при расщеплении ПГ слоя лизоцимом (Пор-Ьуэ), практически не изменяется Очевидно, агрегация белковых макромолекул в растворе, свойственная данному образцу порина, повышает его устойчивость к действию щелочи Конформационные превращения белка в щелочной среде инициируются, по-видимому, ионизацией остатков тирозина

Конформационные превращения иерсинина под действием мочевины При исследовании процесса «разворачивания» иерсинина под действием мочевины (от 0 до 8 М) обнаружено, что денатурация белка влияет на спектры эмиссии белка при обеих длинах волн возбуждения В спектрах суммарной и триптофановой флуоресценции порина наблюдался батохромный сдвиг эмиссии ароматических флуорофоров При этом изменение положения максимумов флуоресценции в обоих случаях носило ступенчатый характер Этот факт свидетельствует о множественности конформационных состояний порина при постепенном увеличении концентрации мочевины в растворе белка

По данным ЭОЗ.ПААГ-электрофореза и спектроскопии КЦ в ароматической области спектра, в присутствии 4,5 М мочевины порин сохранял тримерную структуру

Последующее увеличение концентрации мочевины (от 4,0 до 7,0 1У1) в растворе белка приводило к существенному ослаблению связей между мономерами в тримере порина вплоть до полной диссоциации тримера белка Для интермедиата порина в присутствии 8 М мочевины характерна максимальная доступность остатков триптофана для растворителя (максимум эмиссии этого флуорофора находился при 350 нм)

Анализ спектров КД в пептидной области показал, что в присутствии 4,0 М мочевины существенных изменений в соотношении элементов вторичной структуры белка не происходит В полипептидной цепи мономера порина, под воздействием мочевины, увеличивалось содержание а-спиральных участков и неупорядоченной структуры Эти изменения наблюдались в разбавленных растворах порина (до 60 мкг/мл), в более концентрированных растворах (выше 100 мкг/мл) нарушение соотношения элементов вторичной структуры порина было минимальным

Характеристика рН-индуцированных конформационных интермедиатов иерсинина Физико-химическая характеристика отдельных рН-индуцированных интермедиатов иерсинина была проведена методами КД и флуоресцентной спектроскопии Суммарная эмиссия изолированных тримеров иерсинина характеризуется существенным вкладом флуоресценции тирозина На рис 17 приведены спектры флуоресценции иерсинина при рН 7,5 при обеих длинах волн возбуждения (280 и 296 нм), нормированные таким образом, чтобы в длинноволновой области формы спектров совпадали, поскольку при А>370 нм вклад флуоресценции тирозина отсутствует, а вклад триптофанилов не изменяется Полученный таким образом разностный спектр представляет собой вклад флуоресценции тирозина в суммарное излучение белка Проведенная нами исследования показали, что появление «голубого сдвига» в спектре суммарной эмиссии белка в результате повышения концентрации ионов Н* в растворе связано с тем, что в этих условиях значительно увеличивается относительный вклад излучения тирозина при рН 2,0 вклад триптофана уменьшается на 20%, а вклад тирозина только на 5%

Фазовый график флуоресценции иерсинина, приведенный на рис 18, имеет два излома при рН 6,5 и при рН 3,0 Следовательно, именно этим значениям рН соответствуют два промежуточных состояния порина в ходе рН-титрования Этот результат согласуется с данными других методов исследования молекулярной структуры порина По данным ЭОЗЛААГ-электрофореза в процессе рН-титрования при рН 6,5 наблюдалось разрушение ассоциатов порина, а при рН 3,0 происходила диссоциация тримеров белка При рН 6,5 с помощью техники БЛМ мы фиксировали уменьшение кооперативное™ включения белка по сравнению с порином в буфере с рН 8,0-7,5

С помощью тушителей различной природы (ионных и гидрофобных) было проведено картирование микроокружения остатков триптофана в иерсинине, изменяющегося в завимости от величины рН среды

рН б 5

К

рН 3,0 /

I/

400 А, мм

Рис 17 Спектры флуоресценции тримера иерсинина при рН 7,5, полученные при А возв 280 нм (1) и при А зозб 296 нм (2) Разностный спектр излучения остатков тирозина (3)

320 340 '320

Рис 18 Фазовый график рН-зависимости и интенсивности флуоресценции иерсинина

РН

рн

рН

Рис 19 Зависимость скорости тушения собственной флуоресценции иерсинина от величины рН среды, заряда и гидрофобности тушителя

В качестве тушителей флуоресценции использовались иодистый калий (а), хлористый цезий (б), диметилхалкон (в) и 1М-фенилнафтиламин(г)

Как видно из рис 19, кривые, выражающие зависимость величин констант тушения этого флуорофора от величины рН, которые были получены при взаимодействии порина как с ионными, так и гидрофобными тушителями при значении рН около 4,5, проходят, соответственно, через минимум или максимум Это свидетельствует о существовании иерсинина в этой области значений рН среды в некоем переходном информационном состоянии Судя по величине констант Штерна-Фольмера (рис 19, а и б), остатки триптофана в образце порина при рН 4,5 характеризуются малой доступностью для ионов цезия и иода Тем не менее, значение Ктуш для иодистого калия примерно в 6 раз выше, чем значение КтуШ для хлористого цезия, т е в окружении остатков триптофана в белке при этом значении рН преобладают положительно заряженные группы В случае гидрофобных положительно заряженных акцепторов флуоресценции - ДМХ и ФНА (рис 19, в и г), в слабощелочной и кислой областях шкалы значений рН константы тушения флуоресценции порина этими тушителями соответственно в 2,5-3 раза выше, чем для интермедиата порина при рН 4,5 Кроме того, как видно из рис 19, в, кривая тушения флуоресценции триптофана ДМХ имеет два максимума один при рН 6,5, а другой в кислой области шкалы значений рН (в интервале рН 3,0-2,0) При этих же значениях рН мы наблюдали увеличение интенсивности флуоресценции иерсинина Очевидно, как разрушение четвертичной структуры иерсинина (диссоциация ассоциатов тримера при рН 6,5), так и диссоциация тримеров белка на мономеры) сопровождаются увеличением числа гидророфобных сайтов в микроокружении остатков триптофана, доступных гидрофобным акцепторам излучения белка

Для выявления характерных особенностей вторичной структуры конформационных интермедиатов порина, образующихся в процессе рН-титрования иерсинина, мы воспользовались современным пакетом программ СОРго Расчеты, выполненные с помощью этой программы, позволяют определить не только содержание отдельных элементов вторичной структуры белка, но и соотношение регулярной и нерегулярной структуры каждого из элементов Кроме того, можно определить количество сегментов отдельных элементов вторичной структуры белка, приходящихся на 100 АК остатков, и длину этих сегментов Совокупный анализ изменений выше указанных величин в процессе денатурации белка позволяет судить о возможном механизме разворачивания его полипептидной цепи

Таблица 12 Расчет содержания элементов вторичной структуры иерсинина

пп«,п.„„л„ ГПОгл /и о/ \

рН а г а а Рг Рч Ризгиб неупоряд структура

7,5 10,0 12,0 13,7 8,6 24,0 31,6

4,5 6,3 16,1 9,3 10,1 25,7 42,4

3,0 12,4 13,3 12,3 7,5 23,2 31,3

2,5 11,4 12,8 11,3 7,3 23,1 34,0

8,0 —»2,0 9,0 10,2 13,9 9,1 22,0 35,8

аг, (Зг - регулярные а-спирали, (3-структуры, аа, Ра - нерегулярные а-спирали, р-структуры

Как следует из данных табл 12, конформационное состояние иерсинина при рН 4,5 можно квалифицировать как переходное Оно характеризуется наименьшим количеством регулярной р-структуры, наибольшим количеством как р-изгибов, так и неупорядоченной структуры Последнее может служить свидетельством нестабильности молекулы порина в этих условиях

Таблица 13 Расчет среднего количества и средней длины сегментов элементов вторичной структуры иерсинина по программам СОРго

рН 7,5 4,5 3,0 2,0

п а 2,43 1,44 2,72 2,54

Р 4,21 5,21 4,25 3,93

1 а 7,34 6,12 7,94 8,11

Р 4,95 4,49 5,14 4,93

п - среднее количество элементов вторичной структуры, приходящихся на 100 АК остатков, / - средняя длина сегмента элементов вторичной структуры

Согласно литературным данным в процессе изменения конформации прионовых белков образованию их фибриллярной нейротоксичной формы предшествует появление конформации прионов, обогащенной р-изгибами С другой стороны, для порина при рН 4,5 характерно максимальное число р-структурированных фрагментов и их минимальная длина (табл 13) Это может быть свидетельством увеличения количества межмолекулярных р-связей, что подтверждается образованием агрегатов порина в этих условиях

Мономерные формы иерсинина, образующиеся при рН 3,0 и 2,0, имеют существенные отличия в содержании элементов вторичной структуры белка (табл 12) Кроме того, как видно из данных табл 13, для мономера при рН 3,0 характерно максимальное число а-спиральных участков, а мономер при рН 2,0 имеет максимальную их длину и минимальное количество Р-структурированных фрагментов Эти данные, а также тот факт, что доля неупорядоченной конформации в составе порина при рН 2,0 возрастает почти вдвое, позволяют предположить, что при денатурации порина в присутствии кислоты по крайней мере половина полипептидной цепи белка, образующей р-баррель, разворачивается При этом р-стрэнды до значения рН 3,0 трансформируются преимущественно в а-спиральные участки, а в интервале значений рН 3,0 - 2,0 — в неупорядоченную структуру

Изменение амфифильности поверхности иерсинина при рН-титровании (взаимодействие с пиреном) Известно, что тонкая структура флуоресценции пирена зависит от полярности его микроокружения соотношение интенсивностей (К) излучательных полос при 393 и 372 нм (393/372) увеличивается с уменьшением полярности

окружения Зависимость этого параметра от величины рН (в диапазоне 8,0 - 2,0) для пирена в растворе тримера иерсинина приведена на рис 20

я

о аз

*

0 75-' £

Рис 20 Влияние величины рН на микроокружение пирена в тримере иерсинина

07°12 3 4 4 б 7 '¿ а рН

Как видно из рис 20, в кислой и нейтральной областях шкалы значений рН поверхность молекулы тримера порина гидрофобна При рН 4,3 связанный с белком пирен имеет минимальное значение вышеуказанного характеристического соотношения, что предполагает его полярное окружение С учетом особенностей молекулярной организации р-структурированных белков можно предположить, что при значениях рН раствора белка 3,0 и 7,0 - 8,0 гидрофобные сайты полипептидной цепи р-барреля порина, специфичные для взаимодействия с пиреном, максимально доступны Тот факт, что величина соотношения Я для порина при рН 3,0 больше, чем для этого белка в нейтральной и слабощелочной областях шкалы значений рН, возможно, объясняется нарушением плотности упаковки р-барреля порина в кислой среде Напротив, при рН 4,3 пространственная организация иерсинина соответствует, вероятно, конформации белка с минимально доступными для пирена сайтами связывания

Согласно литературным данным максимальное значение соотношения И является признаком состояния расплавленной глобулы, а его минимальное значение характерно для нашивного и денатурированного состояний белка В соответствии с этим при анализе кривой рН-титрования иерсинина в присутствии пирена (рис 20) можно выделить три различных конформационных состояния молекулы белка, соответствующих минимуму (при рН 4,3), максимуму (при рН 3,0) и среднему значению соотношения полос 393/372 (при рН 7,0 - 6,5) Интермедиат иерсинина при рН 4,5, как было сказано выше, по данным КД спектроскопии представляет собой некое промежуточное состояние белка с минимальным содержанием регулярной Р-структуры и наибольшим количеством р-изгибов Для иерсинина при рН 3,0 характерно, с одной стороны, значительное уменьшение степени упорядоченности окружения боковых цепей белка, а, с другой, максимальное увеличение аффинности взаимодействия с гидрофобными акцепторами излучения белка (рис 19, в, г) Таким образом, по степени разрушения третичной структуры белка и по эффекту взаимодействия с гидрофобными флуоресцентными зондами (сравнимым с экспонированием «гидрофобных карманов» при разворачивании водорастворимых белков), молекулярная организация иерсинина при рН 3,0 более всего удовлетворяет конформационному интермедиату белка, подобному расплавленной глобуле

Иерсинин при рН 2,0 (конечный продукт воздействия кислоты на порин в исследованном диапазоне значений рН) по степени упорядоченности третичной структуры белка практически подобен порину при рН 3,0, однако по содержанию регулярной вторичной структуры отличается от него Учитывая эти данные, интермедиат белка при рН 2,0 можно рассматривать как одну из форм конформационных состояний порина, образующихся в кислых условиях В литературе известны подобные примеры образования при рН-титровании интермедиатов белков, отличающихся друг от друга по степени структурирования молекулы Например, при исследовании денатурации стафилококковой нуклеазы наблюдалось образование различных компактных денатурированных форм этого фермента Более структурированную форму стафилококковой нуклеазы авторы квалифицировали как расплавленную глобулу, а интермедиат, отличающийся меньшей степенью компактности и большей степенью разрушения вторичной структуры белка, как конформационное состояние белка, предшествующее расплавленной глобуле

В связи с вышесказанным, можно предположить, что информационные изменения молекулы порина под действием кислоты в интервале значений рН 8,0 - 5,0 подобны разворачиванию мультидоменных водорастворимых белков, образующих в процессе денатурации целый ряд конформационных интермедиатов с различной третичной структурой Совокупность полученных данных позволяет представить информационные изменения порина из псевдотуберкулезного микроба при изменении кислотности среды в виде следующей схемы

рН 8,0-7,5 рН 7,0-6,0 рН 4,5 рН 3,5 рН2,0

РР1-1 — Р01-2 — А, Аг

кП/Ю

где N - нативная конформация порина, Р01-1 и Р01-2 - частично развернутые информационные формы порина, А1 (кИЮ) - конформация порина, подобная «расплавленной глобуле» водорастворимых белков, Аг - денатурированная форма порина, подобная так называемой А-форме водорастворимых белков

Согласно литературным данным, особенностью фолдинга поринов, имеющих структуру типа (3-бочонка (в отличие от глобулярных белков), является то, что в ходе сворачивания их полипептидной цепи не просматривается четких стадий и стабильных интермедиатов В то же время, в литературе существуют данные в пользу того, что процессы разворачивания/сворачивания мембранных белков проходят через промежуточное состояние, во многом похожее на расплавленную глобулу водорастворимых глобулярных белков Именно это обстоятельство позволило нам использовать терминологию, применяемую при описании конформационых превращений водорастворимых белков, для характеристики конформационных состояний иерсинина, прежде всего для характеристики интермедиата иерсинина при рН 3,0

Анализ окружения остатков Тгр и Туг в полипептидной цели иерсинина с привлечением компьютерной модели пространственной структуры белка Согласно компьютерной модели пространственной структуры иерсинина (раздел 2), остатки Тгр56 и Тгр211 локализованы в (3-барреле Тгр56 расположен в области контакта мономеров, а остатки Тгр211 - на внешней поверхности тримера белка Оба остатка находятся в гидрофобном окружении, причем Тф56 - в более гидрофобном Это было показано ранее при сравнительном исследовании полярности окружения остатков триптофана, входящих в состав Отр Я порина из Е сои, выполненного с использованием мутантных штаммов данного микроорганизма, у которых остатки триптофана были частично или полностью заменены на РЬе Анализ контактов остатков триптофана в тримере иерсинина, проведенный с помощью программы МОЕ, показал, что каждый из остатков Тгр56 образует гидрофобные связи с остатком Рйе38, а также с остатками ПебО и \/а136 соседнего мономера Остатки ТгрЮб находятся в петлях 1.3, внутри полости поры, и потому более доступны молекулам растворителя (рис 21,А) Таким образом, по степени увеличения гидрофобное™ микроокружения в тримере порина эти остатки располагаются следующим образом ТгрЮб-Тгр211 -Тгр56

Количество остатков тирозина в иерсинине (26 остатков) значительно превышает число остатков триптофана Они расположены в разных частях молекулы белка Остатки тирозина в положениях 101 и 199 находятся, соответственно, в петлях 1.3,1.5, а Туг 237 и Туг 249 - в петле 16 Боковые цепи остатков тирозина, расположенных в (3-барреле, либо находятся на поверхности тримера (в положениях 153, 228, 269, 308 и 135, 176, 217, 257), где они, соответственно, формируют две регулярные полосы, либо обращены внутрь поры (в положениях 14, 35, 53, 97, 289, 295, 297, 305), либо локализованы в областях контакта между мономерами (Туг4, Туг58, Туг93, Туг296, ТугЗЗб) Остатки тирозина, формирующие две регулярные полосы, которые взаимодействуют с окружающим липидным бислоем, показаны на рис 21, Б Как видно из рисунка, остаток Тгр211 локализован в цепочке остатков тирозина вблизи наружных петель, достаточно близко к остатку Туг 228 Поскольку эти остатки расположены в разных (3-стрэндах, разрыхление структуры порина (изменение

растояния между |3-стрэндами) под действием кислоты может привести к изменению спектра суммарной эмиссии белка.

Переход в области значений рН 4,5-4,0-3,0, как было сказано выше, вызван диссоциацией тримера на мономеры. Мономеризация иерси'нина может быть следствием разрыва гидрофобных связей между остатком Тгр56 и остатками ИебО и \/а136 соседнего мономера. Этот процесс может привести к уменьшению тушения индольных хромофоров и некоторому увеличению полярности окружения остатка Тгр56. Данное предположение подтверждается сравнительной оценкой доступности остатков триптофана в тримере и мономере иерсинина с помощью программы ЭРОЕЛ/ и соответствующимирасчетами, выполненными с помощью программы Мо1то1.

Степень доступности остатков Тгр56 и Тгр211 при диссоциации тримера иерсинина становится почти одинаковой (35 и 39,5% соответственно), а доступность остатка ТгрЮб не изменяется и составляет около 50%.

При уменьшении значения рН среды от 3,0 до 2,0 по данным флуоресценции происходит конформационный переход, сопровождающийся резким изменением всех параметров спектра излучения белка при обеих длинах волн возбуждения. Появление в спектре триптофановой флуоресценции иерсинина «плеча» при 345 нм свидетельствует о том, что не все три остатка триптофана находятся в одинаковом окружении. Как уже было сказано выше, остатки Тгр56 и Тгр211 остаются в более гидрофобном окружении по сравнению с остатком ТгрЮб. Микроокружение последнего остановится еще более полярным, и этот эффект может быть связан с титрованием остатка Азр102, который находится вблизи ТгрЮб, и должен иметь аномально низкое значение рКа в силу его локализации в а-спирализованном участке петли 13 и образования солевого мостика с остатком Агд136.

Рис. 21. Теоретическая модель пространственной структуры иерсинина: локализация остатков триптофана (А) и тирозина (Б).

Конформационный переход в области низких значений рН может быть также обусловлен и титрованием карбоксильной группы С-концевой аминокислоты Phe338. Аномально низкое значение рКа этого остатка, возможно, связано с наличием солевого мостика между ним и А1а1 при образовании псевдоциклической структуры. Связь между Си N-концами полипептидной цепи белка в бактериальных поринах играет важную роль для сохранения стабильности их структуры. В соответствии с этим, разрыв данной связи в иерсинине может вызвать существенные и необратимые нарушения в структуре молекулы. Действительно, как показали наши исследования, при рН меньше 3,0 иерсинин денатурирует необратимо.

Структурно-функциональные перестройки молекулы порина при изменении кислотности среды (на примере конформационых переходов иерсинина). Методом реконструкции белка в БЛМ из моноолеоилглицерина мы проанализировали изменение функциональной активности иерсинина при изменении величины рН среды. Реконструкцию белка проводили, добавляя порин с обеих сторон мембраны в водную фазу с заданным значением рН (4,5; 5,0; 5,8; 6,3; 7,5; 8,0). Анализ распределения уровней проводимости БЛМ

А

Б

показал, что размеры пор иерсинина в слабокислой и слабощелочной средах различаются В интервале значений рН 8,0 - 6,3 наибольшее количество каналов в мембране имело уровень проводимости 240 - 160 пСм, а при рН 5,0 наиболее вероятный уровень проводимости был равен 12 пСм (рис 22) Кроме того, в кислой области шкалы значений рН (5,0 - 4,5) снижалась кооперативность образования пор и наблюдались случаи закрытия каналов В этих условиях также происходило существенное уменьшение эффективности встраивания порина, даже при увеличении концентрации белка

30 с

ВнСм

5,0

Рис 22 Влияние моноолеоилглицерина

ш

рНЗО (80 пСм)

ГПТ^

+ 4 # & & 4 а.псм N

рН7,6 (80 пСм)

ш

Ш

-Н-1

# # (? «е # д, ПСм

ць.

рН 5 3 (80 пСм)

О-

* # # 4 <г ф 3, пСн

N

рН 5 0 (12 пСм)

Шоа.

величины

рн РН

» « « * 0 д пСм

а проводимость БЛМ

из 1%-ного

в н-гептане, индуцируемую иерсинином Водная фаза 0 1М ЫаС1 в 10 мМ фосфатно-цитратном буфере с заданным значением рН Мембранный потенциал 20 мВ (А) - изменение проводимости мембран в присутствии порина (5нг/мл) в водной фазе при рН 8,0 и 5,0, (Б) - гистограммы распределения проводимости пор иерсинина при различных значениях рН водной фазы, (В) - наиболее вероятная проводимость порина в зависимости от величины рН среды

Таким образом, при уменьшении значения рН среды наблюдались существенные изменения в функциональных свойствах иерсинина Самым заметным проявлением этих изменений являлось уменьшение на порядок величины проводимости пор в слабокислой среде (при рН 5,0) Как видно из рис 22, наиболее резкое изменение активности иерсинина наблюдалось при рН 5,8, в отличие от Отр Р и Отр С поринов £ со//, для которых подобное изменение в порообразующих свойствах происходило, соответственно, при рН 7,2 и 6,5

Обнаруженная нами взаимосвязь между изменениями в структуре и функциональной активностью исследуемого порина согласуется с общепринятым в литературе мнением о том, что функционально активные белки имеют два типа конформационных перестроек Денатурационный переход связан, как правило, с глубокими конформационными изменениями в структуре белка, сопровождающимися утратой его функциональной активности Функциональный переход наблюдается между двумя активными формами белка, степень денатурации которого при этом незначительна Такой переход служит обычно в качестве эффективного регуляторного механизма

В случае иерсинина денатурационный переход приводит к диссоциации тримеров на мономеры с последующим частичным разупорядочиванием структуры мономеров Этот переход мы наблюдали только в области низких значений шкалы рН (4,0 - 2,0) Примером же функционального перехода в порине может служить резкое уменьшение его активности,

обнаруженное нами в достаточно узком интервале значений рН, от 5,8 до 5,0 Эти изменения в порообразующих свойствах иерсинина не связаны со сколько-нибудь значительными перестройками в молекулярной организации белка

5 Влияние липидного матрикса НМ на структуру и функциональную активность порина из Y pseudotuberculosis

Роль ЛПС в стабилизации структуры и проявлении функциональной активности порина Известно, что сборка порина и присоединение ЛПС сопровождаются изменением конформации белка Нами были исследованы изменения конформации иерсинина и его функциональной активности, происходящие в результате отделения связанного с ним ЛПС С помощью оптической спектроскопии охарактеризована пространственная организация ЛПС-содержащего порина (Пор-ЛПС) и порина, очищенного от ЛПС (Пор) Методом реконструкции в БЛМ проведено сравнительное изучение порообразующей активности этих образцов белка

Очистка белка от связанного ЛПС, достигнутая при обработке иерсинина 30%-ным раствором SDS, приводила к значительным изменениям в пространственной организации тримера порина (рис 23) На уровне третичной структуры белка наблюдалось уменьшение передачи энергии возбуждения флуоресценции от тирозина к триптофану и увеличение доли остатков триптофана, экранированных от поверхности белковой глобулы Как показали расчеты по спектрам КД, удаление ЛПС приводит к уменьшению суммарной доли p-структуры Очищенный от ЛПС порин (Пор) представляет собой полностью р-структурированный белок, отличающийся от Пор-ЛПС большей конформационной нестабильностью и склонностью к агрегации Примечательно, что, несмотря на жесткость обработки, не происходит полного «разворачивания» полипептидной цепи порина с образованием статистического клубка Напротив, денатурированный белок имеет высокоорганизованную p-структуру Можно предположить, что образование этой структуры происходит через ассоциацию молекул, которая сопровождается трансформацией неупорядоченной вторичной структуры в p-структуру и образованием межмолекулярных р-связей Поскольку «выраженность» гидрофобных участков на поверхности белка в процессе денатурации увеличивается (по данным УФ-спектроскопии происходит увеличение светорассеяния растворов иерсинина), можно предположить, что самоассоциацию белка инициируют гидрофобные взаимодействия

Для выяснения роли ЛПС в проявлении порином функциональной активности мы провели сравнительное изучение порообразующих свойств 3-х образцов белка Пор-ЛПС, Пор и комплекса (Пор+ЛПС), полученного при молярном соотношении белок/ЛПС 1 200 (рис 24) Анализ флуктуаций тока показал, что исследованные образцы различаются по эффективности и характеру функционирования в БЛМ Активность Пор-ЛПС достаточно высока реконструкция его происходит при концентрациях белка порядка 10-100 нг/мл Наиболее вероятная проводимость пор составляет 140+20,240+20 и 480±20 пСм

Рис 23 Пространственная структура образцов порина до и после отделения от связанного ЛПС Пор-ЛПС в 0,25% SDS <-> b0,1%SDS (--) Пор в 0,25% SDS (■—)

в 0,25% ОГ Пор/ЛПС (1 30, моль/моль) в 0,25% SDS ' '

Удаление ЛПС приводило к увеличению действующей концентрации н два порядка до 2 мкг/мл Характер распределения пор по размерам указывает н увеличение кооперативности их работы, что согласуется с данными УФ-спектроскопии о агрегации белка Образование комплекса Пор с ЛПС не влияет на величину действующе' концентрации белка Но в отличие от образца Пор, реконструкция комплекса (Пор+ЛПС) БЛМ вызывает образование пор преимущественно малого диаметра При этом почти н наблюдалось флуктуаций тока, характерных для кооперативно работающих пор, которы свойственны агрегированному состоянию белка в образце Пор

Ранее нами было показано, что в присутствии ОГ структура тримера иерсинин максимально приближена к таковой в НМ бактерий (раздел 1} В связи с этим был проверена порообразующая активность образца Пор после экспозиции в 2%-ном раствор ОГ Оказалось, что белок Пор в присутствии ОГ проявляет порообразующую активность сравнимую с активностью Пор-ЛПС Встраивание порина в модельную мембран наблюдалось при концентрации белка порядка 10 нг/мл Проводимость наиболее вероятно' поры образца (Пор+ОГ) находилась в том же интервале проводимостей, что и дл исходного Пор-ЛПС Расчет содержания элементов вторичной структуры свидетельствует том, что замена БРЭ на ОГ приводит к восстановлению некоторой доли неупорядоченно структуры, присущей нативному тримеру, возможно, за счет потери части межмолекулярно р-структуры

Рис 24 Гистограммы уровней проводимости каналов,

индуцируемых в БЛМ образцами иерсинина с различным содержанием ЛПС а - Пор-ЛПС, 0,1 мкг/мл, б - Пор, 2 мкг/мл, в - Пор/ЛПС, 2 мкг/мл, г - Пор/ОГ, 0,01 мкг/мл Потенциал на мембране 50 мВ По оси ординат приведено число пор (N), по оси абсцисс -проводимость БЛМ (величина одного уровня проводимости 48 пСм)

Таким образом, можно говорить о ренатурирующем действии ОГ Как известно спектроскопия КД дает усредненные данные о содержании той или иной каноническо" вторичной структуры в белке и не может выявить конформационную гетерогенност образца Недавно было показано, что многие частично денатурированные белки не имею стабильной конформации и существуют в двух или более конформационных состояниях переходящих друг в друга Можно предположить, что белок Пор в ОГ гетерогенен, при это в образце имеются конформеры с содержанием неупорядоченной структуры более 5%, том числе достаточно близкие по вторичной структуре к Пор-ЛПС Возможно, в присутстви БЛМ равновесие сдвигается в сторону этих конформеров (поскольку они могут лучш встраиваться в бислой) В таком случае понятно восстановление активности образца Пор д уровня активности исходного белка Пор-ЛПС В пользу этого свидетельствует и тот факт, что вторичная структура исходного белка Пор-ЛПС в определенных условиях, например О 1%-ном SDS, может быть похожа на структуру белка в образце Пор в ОГ

Проведенные эксперименты продемонстрировали, что существуют определенны «требования» к конформации порина, например, наличие неупорядоченных участков полипептидной цепи белка При этом, если т vivo роль "промотора" в процессе "обретения"

белком этой функционально активной конформации выполняет ЛПС, то в опытах in vitro ЛПС может быть с успехом заменен неионным детергентом, например ОГ

Влияние условий культивирования на структуру и порообразующие свойства иерсинина Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что качественный состав фосфолипидов и жирных кислот бактерий псевдотуберкулеза мало зависит от способа культивирования бактерий Однако количество свободных липидов и относительное содержание ФЛ и НЛ в липидных экстрактах У pseudotuberculosis варьируют в зависимости от возраста культуры и способа выращивания на питательном бульоне (ПБ) или питательном агаре (ПА) Содержание ФЛ и характер его изменения по мере старения клеток у суспензионных (ПБ) и колониальных (ПА) культур имели различные тенденции Бактерии в стационарной фазе (СФ), растущие на ПА, содержат заметно большее количество ФЛ, чем клетки, растущие на ПБ (2,6 и 1,7% соответственно) Особенно ярко эта тенденция проявляется в изменении содержания ЛФЭ Так, у прикрепленных бактерий в фазе линейного роста и в ранней стационарной фазе в клетках наблюдается аномально высокий уровень ЛФЭ (35,9 и 18,2% соответственно) по сравнению с уровнем ЛФЭ свободноживущих иерсиний (6,1 и 5,5% соответственно) В рамках проведенного исследования сравнивалась пространственная организация и функциональная активность поринов в зависимости от (1) температуры выращивания при 4°С, «холодовой» вариант (X), и при 37°С, «тепловой» вариант (Т), (2) среды культивирования в виде колониальной (ПА) и суспензионной (ПБ) культур и (3) возраста культуры стационарная (СФ) и логарифмическая (ЛФ) фазы роста Как показали предварительные исследования, в случае теплового варианта псевдотуберкулезного микроба плотность среды культивирования не имеет решающего значения

По данным SDS, ПААГ-электрофореза порины, выделенные по методу Нюрминен из микробной массы, культивируемой в различных условиях (образцы 1-4), находились в олигомерной форме с М порядка 105-120 кДа Сравнительное изучение их пространственной структуры было проведено с помощью оптических методов

Таблица 14 Фосфолипидный состав клеток псевдотуберкулезного микроба, из которых выделены исследованные образцы порина

Образец порина Содержание фосфолипидов, % ЛФЭ ФЭ/ФГ+ДФГ

(1)Х-ЛФ-ПА 8,4 1,6

(2)Х-СФ-ПА 35,9 4,3

(З)Х-СФ-ПБ 5,5 1,9

(4)Т-СФ-ПА/ПБ не опред

Спектры КД образцов поринов «холодового» варианта (1, 2 и 3) в ближней УФ-области (240-320 им) имеют полосы положительного знака при 290 нм, относящуюся к Тгр, при 280 и 268 нм, относящиеся к Туг и/или РИе (рис 25,а и б) Спектр КД порина 2 по сравнению со спектрами других образцов белка в указанной области имеет более тонкую структуру (рис 25,а) Это свидетельствует об асимметричном окружении боковых групп вышеназванных ароматических аминокислот, об их жесткой фиксации и, как следствие, о высокоорганизованной третичной структуре этого белка Спектр КД порина из «теплового» варианта указывает на отсутствие выраженной третичной структуры у порина 4

Расчет содержания элементов вторичной структуры поринов по данным спектров КД в дальней УФ-области, выполненный по методу Провенчера и Глокера, показал, что содержание регулярной р-структуры в образце 2 несколько выше, чем в остальных образцах порина, а порин 4, имеет в полипептидной цепи в 2,5 раза больше р-изгибов по сравнению с образцами 1, 2 и 3, что, согласно литературным данным, может служить свидетельством большей нестабильности молекулы белка Так, в случае белков-прионов образованию их фибриллярной нейротоксической формы предшествует появление конформации, обогащенной р-изгибами

Рис 25 Спектры КД исследованных образцов поринов при 25°С в ближней УФ-области, а - образцы 1 и 2, б - образцы 3 и 4

Содержание и соотношение вкладов остатков триптофана двух классов (S и III) у белков, выделенных из «холодового» варианта колониальной культуры клеток на ЛФ и СФ фазах роста (образцы 1 и 2), очень близки Отличаются эти белки только по вкладу остатков триптофана класса I Спектр порина (образец 3), выделенного из «холодового» варианта суспензионной культуры, отличается от спектров образцов 1 и 2 уменьшением вклада тирозина, а также увеличением вклада остатков триптофана формы III, очевидно, за счет уменьшения содержания S-формы этого флуорофора (табл 15)

Можно предположить, что изменение даже одного из условий способа выращивания, а именно среды культивирования, приводит к изменению как микроокружения остатков триптофана, так и взаиморасположения остатков тирозина и триптофана в структуре белка Наибольший вклад в спектр порина, выделенного из клеток «теплового» варианта псевдотуберкулезного микроба (образец 4), обусловлен излучением остатков триптофана класса III, соответствующим эмиссии свободного триптофана Наименьший вклад в спектр флуоресценции этого образца белка вносят остатки триптофана S-формы и формы I, эмиссия которых определяется расположением внутри молекулы белка и гидрофобным микроокружением, экранирующим флуорофоры от растворителя

Таблица 15 Характеристика пространственной структуры и термостабильности образцов порина, полученных из бактерий, культивируемых в различных условиях

Образец Туг Классы триптофана Температура

порина S-форма I форма II форма III форма термоперехода,°С

(1) Х-ЛФ-ПА 0,19 0,22 0,48 0 0,11 69* 72**

(2) Х-СФ-ПА 0,23 0,26 0,39 0 0,12 74# 71* 75**

(3) Х-СФ-ПБ 0,13 0,14 0,40 0 0,33 76# 75* 77"

(4) Т-СФ-ПА/ПБ 0,25 0,04 0,22 0 0,49 70# 62* 68**

# - Определено по данным сканирующей микрокалориметрии, *- Определено поданным собственной белковой флуоресценции, ** - Определено по данным спектров КД

Таким образом, пространственная организация молекулы порина на уровне третичной структуры оказалась чувствительной к изменению условий культивирования, которые, как было сказано выше, вносят определенный вклад в изменения липидного состава и, соответственно, строения и свойств НМ бактерий

На следующем этапе исследования с помощью методов оптической спектроскопии и сканирующей микрокалориметрии были определены точки термоперехода у изученных образцов порина и проанализированы изменения в пространственной организации молекулы белка на уровне третичной и вторичной структур (рис 26) Характер изменений вторичной структуры поринов 2 (рис 26,а), а также 1 и 4 (рис 26,6) в процессе нагревания оказался подобным Тем не менее, качественный анализ спектров КД образцов белка, снятых при 85°С, позволяет отметить различия в степени этих изменений

Точки конформационных переходов на уровне вторичной структуры были определены из графика зависимости эллиптичности полос при 222 нм от температуры Как известно, эта величина является мерой упорядоченности вторичной структуры белка Для образцов 1-4 термопереход происходил, соответственно, при 72, 75, 77 и 68°С (табл 15)

Рис 26 Спектры КД исследованных образцов

поринов, а - образец 2, б - образец 4

Кривые 1-3 - при 25, 70 и 85°С соответственно

Как видно из рис 26,а, кривые в спектрах порина 2, вторичная структура которого подверглась тепловой денатурации, проходят через изодихроичную точку при 211 нм, тогда как таковая отсутствует в спектрах КД других образцов белка На рис 26,6 в качестве примера приведен спектр порина 4, структура которого также подвергалась тепловой денатурации Наличие изодихроичной точки в спектрах порина 2 означает, что его конформационный переход из нативного состояния в денатурированное проходит как двухстадийный кооперативный процесс Отсутствие ее в спектрах КД поринов 1, 3 и 4 (рис 26,6) указывает на то, что в случае этих поринов в растворе белка кроме основных форм присутствуют интермедиа™ порина

С помощью метода сканирующей микрокалориметрии были определены точки плавления образцов порина 2, 3 и 4 (рис 27) Анализ полученных термограмм позволил сделать следующие выводы Изменение среды культивирования практически не влияет на термостабильность белка, максимум кривых плавления образцов 2 и 3 приходится на 74 и 76°С соответственно (таблица 2) В то же время, повышение температуры выращивания бактерий псевдотуберкулеза снижает температуру термоперехода белка на 5 - 6° С (табл 13) и, кроме того, почти в 2 раза увеличивает температурный диапазон плавления порина Для образцов 2 и 3 он лежит между 72 и 80° С и протяженность его составляет 8°С, а порин из «теплового» варианта бактерий плавится в диапазоне 60 - 75°С и, соответственно, протяженность его равна 15°С (рис 27)

Рис. 27. Температурная зависимость избыточного удельного теплопогло-щения ' образцов порина в трис-H'CI буфере (10"2 М, ( рН 7,6), выделенных из культур У. pseudotuberculosis, выра-щенных при различных условиях: 1 - «холодовой» вариант колониальной культуры (образец 2), 2 - «холодовой» вариант суспензионной куль-! туры (образец 3),

3 - «тепловой» вариант суспензионной ' культуры (образец 4).

Размерность оси ординат - 1000 Дж / кг х | град. ;

На рис. 28 приведена зависимость квантового выхода флуоресценции исследованны)! образцов порина от температуры. Как видно из рисунка, температуры термопереходо1 белков, определяемые по приведенным кривым, несколько ниже соответствующи* значений, полученных из данных микрокалориметрии и спектров КД (табл. 15). Н;з основании этого можно предположить, что тотальному плавлению молекулы белк? (фиксируемому методом микрокалориметрии) и изменениям на уровне вторичной структуру порина предшествуют изменения в отдельных доменах молекулы белка, которые приводят (| изменению взаиморасположения ароматических флуорофоров и, соответственно интенсивности флуоресценции. Как можно видеть, Э-образный участок на кривы> зависимости квантового выхода флуоресценции исследованных поринов от температурь' как раз «заканчивается» при значении температуры, соответствующей точке плавлений белка (рис. 28). Следует заметить, что в случае образца 2 этот участок на кривой анализируемой зависимости наиболее выражен, что свидетельствует о высокой степени кооперативности термоперехода.

Qo

1.00,80,60,40.20

-а- 1

---2

-г- 3

—г— 4

"в--,2 ' *

i "Ч.

4 -"hC

Рис. 28. Зависимость квантовой: выхода флуоресценции исследо-' ванных образцов порина от температуры. I

Линии 1-4 соответствуют номерам, образцов порина из У( pseudotuberculosis, выращенных прь< различных условиях (см. табл. 15)

20

40

60

80

100

Температура. С

Порообразующие свойства исследованных образцов иерсинина в составе ПГБК. Реконструкция в липидный бислой этого фрагмента бактериальной мембраны являете.« разработанным нами подходом к изучению поринов с помощью техники БЛМ| Преимущество такого подхода состоит в том, что порин в комплексе с ПГ сохраняет важное окружение и связи, имеющиеся в нативной мембране. ПГБК, в состав которых входилу! образцы порина 1-3 из «холодовых» вариантов У. pseudotuberculosis, были высокоактивны.1 Наибольшая частота встраивания наблюдалась для ПГБК, в состав которого входиг1 образец 2. I

В случае образца 4, полученного из «теплового» варианта культивирования микроорганизма, при реконструкции в БЛМ характерные включения наблюдались лишь при

увеличении концентрации комплекса до максимального значения в исследованном диапазоне концентраций (0,01 - 1,5 мкг/мл). Полученные данные свидетельствуют о значительном снижении функциональной активности поринов при увеличении температуры выращивания микроорганизмов. Возможно, неактивные в БЛМ комплексы содержат порины в конформации, соответствующей «закрытому» состоянию (конфигурации) поры. Как показал анализ флуктуации тока через БЛМ (рис. 29), для активных ПГБК из "холодовых" вариантов псевдотуберкулезного микроба наиболее вероятный уровень проводимости пор соответствует значению 240-300 пСм, а для комплексов из "тепловых" вариантов - 120 пСм. В порядке уменьшения величины наиболее вероятной проводимости, индуцируемой в БЛМ, исследованные образцы ПБГК можно расположить следующим образом: Х/СФ/ПА (2) 2 Х/СФ/ПБ (3) > Х/ЛФ/ПА (1) > Т/СФ/ПБ/ПА (4).

Обнаруженная нами корреляция между повышенным содержанием ЛФЭ в клетках «холодового» варианта колониальной культуры У. pseudotuberculosis и особенностями пространственной структуры выделенного из них порина заслуживает особого внимания. Белок из клеток, выращенных в условиях, максимально соответствующих природным, отличается наиболее компактной пространственной структурой и наибольшей порообразующей активностью. В свою очередь, ЛФЭ, как известно, являясь молекулярным шапероном интегральных мембранных белков, защищает их от термического шока, препятствует агрегации и способствует образованию функционально активной формы белка. В связи с этим, высокое содержание ЛФЭ у бактерий иерсиний при сапрофитном способе существования может представлять собой своеобразный «инструмент», способствующий поддержанию стабильной конформации поринов и, соответственно, увеличению адаптационных возможностей микроорганизма.

40 N

20 10 О

15 10

JW

¿ell...

шИши

80 60 4G -20 О

JlcE

jj

tag да

Проводимость канала, пСм

Рис. 29. Гистограммы уровней проводимости пор, образованных

исследованными образцами порина в составе ПГБК при мембранном потенциале 20 мВ (черные колонки) и 50 мВ (белые колонки), ширина колонок - 24 пСм, N - количество каналов, а - Образец 3 в составе ПГБК.

б - Образец 4 в составе ПГБК.

в - Образец 2 в составе ПГБК.

6. Получение и характеристика рекомбинантного порина из У. pseudotuberculosis

Порин НМ У. pseudotuberculosis был экспрессирован путем трансформации кодирующей последовательности гена этого белка в клетках Е. coli. Кодирующая последовательность ompF гена была получена методом ПЦР при использовании типоспецифических праймеров к хромосомной ДНК, выделенной из микробной массы У. pseudotuberculosis. Повышенный уровень экспрессии целевого белка был достигнут путем размещения гена после сильного промотора, индуцируемого IPTG. По данным иммуноблота

(рис. 30) в лизате трансформированных клеток Е. соН штамма BL21 (DE3) обнаруже»! белок, имеющий подвижность в области значений М 40 кДа, который взаимодействовал со

специфическими антителами к термостабильному мономеру порина Y. pseudotuberculosis. J то же время, в лизате клеток, не подвергшихся трансформации, подобный белок не был) выявлен. На основании этих данных сделан вывод, что обнаруженный белок соответствуе порину из У. pseudotuberculosis.

Тельца включения (ТВ) выделяли из микробной массы центрифугированием ; присутствии ферментов (лизоцима и ДНК-азы), ингибитора протеаз и детергентов (ЭДТА ДОХ). Осадок ТВ экстрагировали 8 М раствором мочевины при озвучивании с частотой 4' МГц. Концентрация белка, определенная спектрофотометрически (при 280 нм), составил: 26 мг/мл. Согласно данным ЗОЗ.ПААГ-электрофореза (рис. 30,а) и иммуноблота (рис. 30,6)' полученные ТВ содержали белок, по величине М соответствующий полипептиду с М 40 кД"' (денатурированному мономеру порина из У. pseudotuberculosis).

Учитывая устойчивость порина Y. pseudotuberculosis к действию SDS, для рефолдинг« рекомбинантного порина использовали гель-хроматографию на Сефакриле S-300 е присутствии SDS. Как видно из рис. 30,6, очищенный от мочевины белок являетс-мономером порина (РБ-1). Окраска ионами серебра не выявила присутствия ЛПС в образц : РБ-1. Для получения порина в олигомерной форме использовали ионообменнук хроматографию и неионный детергент Zw 3-14, который, согласно литературным данным-дает хорошие результаты при сборке рекомбинантных мембранных белков in vitro.

Рис. 30. (а) Иммуноблоттинг белковых фракций с кроличьими антисыворотками, полученными при иммунизации ТСБ мономером: 1 - лизат нетрансформированных клеток Е. coh) 2 - лизат трансформированных клеток Е. coli. (б) Электрофорез белковых фракций:

1 - маркеры, 2 - РБ-2,

3 - РБ-2 (прогретый при 100°С), ,

4 - ТСБ мономер иерсинина, 5-РБ-1,

6 - ТВ в 8М растворе мочевины,

7 - ТВ в 8М растворе мочевины ' (прогретые при 100°С).

Последовательная хроматография на DEAE-сефарозе CL 6В и СМ-сефарозе CL 4В в присутствии Zw 3-14 позволила получить рекомбинантный белок (РБ-2), совпадающий по подвижности в условиях ЗОЗ.ПААГ-электрофореза стримерной формой порина (рис. 30,6). i

Пространственная структура рекомбинантных белков была охарактеризована с" помощью методов оптической спектроскопии. Как следует из спектров КД в пептидной области, РБ-1 имеет регулярную вторичную структуру, подобную структуре изолированного мономера порина. В этой области спектр КД рекомбинантного тримера РБ-2 подобен спектру порина, изолированного из псевдотуберкулезного микроба в растворе ОГ. Данные, расчетов элементов вторичной структуры по спектрам КД с использованием программы CONIN/LL (пакет программ CDPro) приведены в табл. 16.

Как следует из данных табл. 16, содержание а-спирали в структуре РБ-1 больше, чем у рекомбинантного тримера, но меньше, чем у ТСБ формы изолированного мономера.' Известно, что в процессе выделения порина из НМ бактерий небольшая часть тримеров' диссоциирует на мономеры, но это не приводит к нарушениям регулярной структуры белка,1 Только совместное воздействие нагревания и детергента приводит к появлению в молекуле

порина дополнительных участков а- структуры за счет уменьшения количества (3-и неупорядоченной структуры

Эти наблюдения дают возможность предположить, что пространственная организация РБ-1 ближе к структуре мономера, полученного при солюбилизации порина из НМ бактерий Большая электрофоретическая подвижность РБ-1 по сравнению с таковой нативного мономера объясняется тем, что рекомбинантный мономер не содержит ЛПС, который, как известно, приводит к уменьшению подвижности образца в условиях SDS.nAAl"-электрофореза Таким образом, полученные рекомбинантные белки достаточно близки к изолированным поринам по содержанию элементов вторичной структуры, небольшие различия отмечаются только в количестве неупорядоченной структуры

Анализ спектров КД образцов РБ-1 и РБ-2 в ароматической области спектра позволяет говорить о недостаточно сформированной, более «рыхлой» третичной структуре интермедиатов рефолдинга порина по сравнению со структурой изолированных белков Так, спектр КД образца РБ-2 не имеет четко разрешенных положительных полос, свидетельствующих о жестко фиксированной третичной структуре белка, а спектр КД РБ-1 подобен спектру полностью p-структурированного мономера порина, структура которого была восстановлена при добавлении эндогенного ЛПС (раздел 5) Подобные спектры характерны для частично свернутых интермедиатов фолдинга мультидоменных белков, так называемых «misfolded proteins»

Исследования структуры РБ-1 и РБ-2 методом собственной белковой флуоресценции подтвердили данные КД, однако различия в пространственной структуре изолированных и рекомбинантных поринов в случае мономера оказались более выраженными Для спектра РБ-1 характерно значительное увеличение вклада остатков тирозина в суммарную флуоресценцию белка В спектрах триптофановой флуоресценции обоих рекомбинантных белков был отмечен значительный сдвиг максимумов в длинноволновую область спектра и существенное уменьшение интенсивности излучения этого флуорофора, что характерно для белков, у которых остатки триптофана находятся на поверхности молекулы белка и не экранированы от растворителя белковой матрицей

Таблица 16 Соотношение элементов вторичной структуры рекомбинантных и изолированных поринов по данным программы CONT1N/LL*

Образец а- структура (3-структура Р-изгиб Неупоря доченная структура Кол-во реперных белков Тип белка

РБ-1 0,057" 0,31 0,230 0,401 43 все р

ТСБ 0,157 0,297 0,226 0,320 43 все р, а+р

РБ-2 0,038 0,402 0,218 0,341 43 все р

ТЛБ 0,043 0,421 0,219 0,318 48 все р, а/р

* Программа, входящая в пакет программ СОРго

# Содержание элементов вторичной структуры белка приведено в единичных долях

Рис 31 Флуктуации тока в БЛМ, индуцируемого тримером иерсинина (а) и РБ-2 (б) Концентрация белка в образцах порина 50 нг/мл

20 UB^J— ■о

Порообразующая активность рекомбинантных поринов РБ-1 и РБ-2 была

изучена методом реконструкции в БЛМ. При введении в водную фазу РБ-2 в кoнцeнтpaциJ 50 нг/мл в БЛМ наблюдались долгоживущие дискретные флуктуации тока поринового тип^_ (рис. 31,6). Наиболее вероятная проводимость пор, образованных РБ-2, составляла 240±4( пСм, что сравнимо с проводимостью каналов изолированного тримера порин^ псевдотуберкулезного микроба (рис. 31,а). Однако в случае РБ-2 наблюдалась менына? частота включения белка в модельную мембрану и менее эффективный рост интегрально.': проводимости БЛМ. В случае РБ-1 наблюдалось включение только единичных пор, чт. можно объяснить либо присутствием незначительного количества олигомерной формь порина, либо способностью мономера образовывать в присутствии липидного бисло; активные тримеры.

Антигенная структура рекомбинантных белков была охарактеризована с помощьк[ ИФА. Результаты реакции (рис. 32) свидетельствуют о том, что структура антигенные детерминант РБ-1 и РБ-2 лишь частично соответствует структуре аналогичных детерминан \ изолированных мономера и тримера иерсинина. Общими, скорее всего, являются так называемые «линейные» антигенные детерминанты, формирующиеся на уровне первичной и/или вторичной структуры порина (см. ниже в разделе 7). В то же время, «составные», илМ «прерывистые», антигенные детерминанты, образующиеся за счет участков последовательности белка, сближенных в процессе формирования его пространственное структуры, вероятно, не совпадают с таковыми для изолированных форм порина. Этот вывод подтверждается данными исследования структуры рекомбинантных белков приведенными выше. !

тсв

1.6 — 1.6

1.21 1,2

0,8 I ш ■

I Е й 0.4!

о ■ _] & — 0 - _

Рис. 32. Иммуноферментный анализ взаимодействия

сывороток кроликов,

иммунизированных ТСБ

мономером (а) и тримером (б) иерсинина, с гомологичными антигенами и образцами рекомбинантного белка.

7. Антигенная структура иерсинина

Идентификация линейных и конформационных антигенных детерминанЩ иерсинина Изменения антигенной структуры порина, связанные с изменение условий его выделения. Сравнительный анализ антигенной структуры 3-х изолированны молекулярных форм иерсинина, полученных при солюбилизации НМ, был проведен д-помощью ИФА. В качестве антигена сравнения был взят ПГБК, в составе которого тример порина, как было сказано выше, находится в конформации, близкой к нативной.

Тримерная форма порина имеет два типа антигенных детерминант: непрерывные, (линейные) и прерывистые (составные, или информационные). Этим объясняется большая степень ингибирования выбранной нами тест-системы тримером порина (рис. 33, кривая 1).; Конформационные детерминанты формируются на уровне третичной структуры белка и разрушаются при диссоциации тримера белка на мономеры. Поэтому у мономерных форм, порина обнаружены только линейные детерминанты, которые определяются АК-последовательностью и вторичной структурой белка и сохраняются при термоденатурации порина (рис. 33, кривые 2 и 3).

Рис. 33. Ингибирование реакции связывания ПГБК с поликлональной кроличьей антисывороткой к тримеру иерсинина Ингибиторы тример (1), мономер (2) и денатурированный мономер (3) иерсинина, по оси X - концентрация белка, 10"11 М

О 23 О 93 3,1 6,25 25 МНГИбктор, MKT

Рис 34 Ингибирование реакции связывания Пор-Суэ (а) и Пор-БОв (б) с гомологичными антисыворотками

Ингибиторы Пор-ЭОв (1), Пор-Ьуэ (2) и денатурированный мономер иерсинина (3)

Сравнительное исследование серологической активности Пор-SDS и Пор-Lys (рис 34) выявило существенные различия между ними Гетерологичные антигены ингибируют гомологичные тест-системы (для обоих образцов иерсинина) только на 30-40% Таким образом, различия в пространственной организации этих белков (раздел 2), обусловленные способом получения поринов, существенно влияют и на антигенную структуру Пор-SDS и Пор-Lys

Предсказание антигенно-активных участков OmpF-подобного порина Y pseudotuberculosis, потенциально способных индуцировать протективный иммунный ответ к патогенным иерсиниям. Как было сказано выше (раздел 2), основные отличия между поринами У pseudotuberculosis и У pestis приходятся на петли L6 и L8, которые определяют антигенные различия этих белков Известно, что именно эпитопы поринов, экспонированные на поверхность белка, могут быть использованы в качестве компонентов вакцинных препаратов

С помощью программы ProPred (МНС Class-II Binding Peptide Server) были проанализированы АК последовательности 5-ти поринов патогенных иерсиний Ниже приведены источники первичной структуры белков, использованные при расчетах порин OmpF У pseudotuberculosis (UniProt КВ/Тг EMBL Q5EMM5), OmpF У enterocolitica (Гузев К В , Исаева М П , Новикова О Д, Соловьева Т Ф , Рассказов В А II Биохимия 2005 Т 70 Вып 10 С 1338-1345), OmpF Ypestis (SwissProt Q8ZG94), OmpC У pseudotuberculosis (NCBI YP069796), OmpC У pestis (NCBI NP404824)

Таблица 17 Локализация гомологичных пептидов в пределах вторичной структуры поринов,

OmpF Р-тяжи, % L-петли, % Р + L участки, %

У pseudotuberculosis 63,0 13,0 24,0

У pestis 71,0 <85 20 5

У enterocolitica 74,0 <8,0 < 18,0

OmpC

У pseudotuberculosis 66,0 105 23 5

У pestis 66,0 105 23 5

Для всех OmpF поринов патогенных иерсиний выявлены гомологичные пептиды YGKVDARHS, YVQSKGKD, YVSVGTYYYFNK Для OmpF и ОтрС поринов У pestis и У pseudotuberculosis полностью совпали три пептида FNKNMSTYV, YNKDGNKLD, YVDYKINLL Пептид YNKDGNKLD оказался общим для всех 5-ти проанализированных поринов Основное количество пептидов, выявленных для OmpF и ОтрС поринов, находится в трансмембранных участках молекулы белка

С помощью программы ADEPT2 были предсказаны В-клеточные антигенные детерминанты поринов У pseudotuberculosis и У pestis Основные предсказанные эпитопы OmpF У pseudotuberculosis локализованы в петлях, экспонированных в периплазматическое и внеклеточное пространство В результате анализа полученных данных были определены максимально доступные для взаимодействия с антителами антигенно-активные участки исследованных поринов, наиболее перспективные для индукции протективного гуморального ответа

Поскольку в ряде работ была показана важная роль Т-клеточного иммунного ответа для защиты животных от патогенных иерсиний, решено было проанализировать АК последовательности обсуждаемых OmpF поринов на наличие эпитопов как для CD4+, так и для CD8+ Т-лимфоцитов человека Анализ проводился с помощью программы PLSpred2, предназначенной для предсказания Т-клеточных антигенных детерминант Для этой цели в данной программе используются матрицы, полученные в результате анализа с помощью метода частных наименьших квадратов экспериментальных данных, взятых из базы IEDB, содержащей сведения о взаимодействии пептидов с различными аллелями HLA (Human Leukocyte Antigen)

С помощью PLSpred в составе первичной структуры поринов У pseudotuberculosis и У pestis были идентифицированы Т-клеточные эпитопы для 35 аллелей HLA класса I и 50 аллелей HLA класса II Особое внимание уделялось консервативным пептидам поринов патогенных иерсиний, обладающим широким спектром специфичности по отношению к различным аллелям HLA С помощью программы BLAST, с использованием матрицы антигенного сходства аминокислот, предсказанные эпитопы были проанализированы на наличие локальной гомологии с белками человека (использовалась база данных RefSeq из Proteinbank за 10 04 2006, содержащая 34066 записей) Пептиды, имевшие локальное сходство с белками человека свыше 88%, были исключены из полученной выборки Пептцдные фрагменты исследованных поринов, наиболее перспективные для индукции Т-кпеточного иммунного ответа, приведены в таблице 18

Таблица 18 Локализация и АК последовательность потенциально иммуногенных пептидов

HLA класса I (35 аллелей)

Фрагмент OmpF Последовательность Кол-во аллелей, взаимодействующих с пептидом HLApred^ HLAatl*

313-321 YVDYKINLL 12 26/35

263-271 AQYQFDFGL 9

46-54 FGFKGETQl 7

234-242 VMYAETQNL 6

225-233 YDANNVYLA 4

251-259 RDIEITAQY 4

HLA класса II (50 аллелей)

303-311 YYYFNKNMS 32 46/50

297-305 YVSVGTYYY 22

121-129 FGGDSISNS 10

Все указанные пептиды обладают широкой МНС-специфичностью Все указанные пептиды консервативны у поринов У pseudotuberculosis и У pestis Нумерация фрагментов по последовательности OmpF У pseudotuberculosis (Q5EMM5) •Отношение количества аллелей HLA, взаимодействующих хотя бы с одним из предсказанных эпитопов (HLApred), к общему количеству аллелей, использованных для предсказания (HLAal)

2 Этот раздел работа выполнен совместно с группой А М Максютова, ВНИИ молекулярной биологии НПО «Вектор»

Таким образом, в рамках проведенного исследования осуществлен выбор антигенно-активных участков OmpF поринов У. pseudotuberculosis и У. pestis, перспективных для последующего конструирования перекрестно реактивных полиэпитопных синтетических I вакцин. Выявленные идентичные участки удовлетворяют требованиям, предъявляемым к потенциально иммуногенным пептидам, и могут быть использованы для дизайна вакцинных I препаратов и разработки диагностических тест-систем нового поколения.

8. Иммунобиологические свойства иерсинина

Антигенное родство поринов рода Yersinia. Как показали наши исследования, обе молекулярные формы иерсинина являются иммуногенными для кроликов. По данным ИФА титры полученных антисывороток составляли 1/51200 - 1/102400. ЛПС из бактерий j соответствующих сероваров У. pseudotuberculosis реагировали с антисыворотками на i уровне фона, то есть поликлональные специфические сыворотки к порину практически не j содержали антител к ЛПС. Антитела к поринам образовывались также при иммунизации ; животных целыми клетками и фракцией белков НМ.

i Обнаружено, что порины являются видо- и родоспецифическими антигенами. Так, I методом ИФА показано, что с помощью порина из Y. pseudotuberculosis выявляются антитела в антисыворотках кроликов, полученных ко всем 6-ти сероварам псевдотуберкулезного микроба. В то же время порин из бактерий У. pseudotuberculosis реагирует с антисыворотками к бактериям различных сероваров У. enterocolitica, У. I kristensenii, У. intermedia и У. frederiksenii (рис. 35).

Рис. 35. Результаты взаимодействия иерсинина с кроличьими антисыворотками (АС) к различным бактериям рода Yersinia,

полученные методом ИФА: 1-6 - АС к 3; 5; 6; 8; 6.30; 6.31 сероварам У. enterocolitica', 7-10 АС к 16f; 28d; 11.246с; 12.25е сероварам У. kristensenii; 11 - АС к 17 серовару У. intermedia; 12 - к 5 серовару У. frederiksenii; 13 - АС к иерсинину.

. , it ix гг -;.>. я «х лг ;<»

и Ъ. ?« 3*. Si it 1» •)» 5х 5т

Ш

s ? 10 и 1? (3

Hfe'ft ixSi ЫтН

шш

* .. sKv?'-.

Ш%,'

is ¡§ 3 .5- ■ jtii

! ,'>: | §:## - -

Ш Ш •■•'■.

Ig^».*»» ' a Ж

Рис. 36. Иммуноблоттинг сывороток кроликов, иммунизированных (а) мономером иерсинина; (б) фракцией белков НМ У.pseudotuberculosis; (в) целыми микробными клетками У. kristensenii.

] Электрофореграмма лизатов клеток: 1 - У. intermedia; 2 - У. enterocolitica; 3 - У. kristensenii, 4 - У. frederiksenii] 5 - У. pseudotuberculosis. Микроорганизмы выращены при 4-6°С (х); при 37° С (т).

Однако при исследовании взаимодействия иерсинина и порина из У. enterocolitica с антителами к некоторым микроорганизмам семейств Enterobacteriaceae и Brucellaceae ! обнаружен значительно более низкий уровень перекрестных реакций (рис, 37).

Вывод о родоспецифичности поринов Yersinia подтвержден методом ' иммуноблоттинга. Кроличьи антисыворотки, полученные к иерсинину, фракции белков НМ псевдотуберкулезного микроба и целым клеткам У. kristensenii, выявляют гетеропогичные порины из других бактерий рода Yersinia (рис. 36).

Титру яитимворсяш

• Si

3.1 f ».»Л,»,«,.» «Ill,)

! 2 5 4 5 « Т 12 3 4 5 8 7 8 9« 11 (213 1 2 3 4 5 S ? 8 S »11121314 Рис. 37. Результаты взаимодействия поринов из У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica с кроличьими антисыворотками к бактериям семейств Enterobacteriacae, Brucellaceae, полученные методом И ФА:

А: взаимодействие порина из У. enterocolitica с антисывороткой к порину из У. pseudotuberculosis (1), с антисыворотками к бактериям 1-6 сероваров У. pseudotuberculosis (2-7) соответственно.

Б: взаимодействие иерсинина с антисыворотками к 3, 5, 8, 9, 6.30, 6.31 сероварам У. enterocolitica (1-6) соответственно; с антисыворотками к 16.f, 28d, 11.246с, 1225е сероварам Y.kristensenii (7-10) соответственно; с антисывороткой к 17 серовару У. intermedia (11); с антисывороткой к 5 серовару У. frederiksenii (12); с антисывороткой к иерсинину (13);

В: взаимодействие иерсинина с антисыворотками к Shigella dyzenteriae (1); S. sonnei (2); S. flexneri (3); Salmonella ABODE (4); S. typhimurium (5); S. paratyphi В (6); S. paratyphi A (7); S. anatum (8); S.heidelberg (9); S. enteritidis (10); S. choleraesuis (11); £ coli (12); Brucella sp. (13); 14 - нормальная кроличья сыворотка.

Иммуногенные свойства поринов иерсиний (на примере порина из Y. pseudotuberculosis)

Иммунный ответ к иерсинину у человека и животных. С целью выявления видовых различий формирования гуморального иммунного ответа к иерсинину с помощью иммуноблоттинга были изучены антисыворотки белых беспородных мышей, морских свинок и обезьян, полученные от животных, выживших после перорального введения агаровой культуры возбудителя псевдотуберкулеза (У. pseudotuberculosis 1В серовара, штамм 680), а также сыворотки людей, переболевших этой инфекцией. Поскольку показано, что развитие псевдотуберкулеза у человекоподобных обезьян является адекватной моделью развития этой инфекции у людей, особое внимание было уделено изучению иммунного ответа к иерсинину у павианов гамадрилов (рис. 38).

В качестве контрольных сывороток использовали сыворотки интактных животных, а в качестве контрольных антигенов в иммуноблоттинге, помимо ТСБ мономера иерсинина, использовали лизаты клеток У.pseudotuberculosis 1В серовара (штамм 680).

К Рис. 38. Иммуноблоттинг иммунных

сывороток людей (7,8), павианов гамадрилов (5,6), морских свинок (3,4) и мышей 0 .2) с иерсинином (нечетные дорожки) и лизатом клеток У. pseudotuberculosis 1 В серовара, штамм 680 (четные дорожки).

У мелких лабораторных животных, перенесших псевдотуберкулез, через 21 сутки выявлялись специфические антитела к ТСБ мономеру иерсинина Заражение этих видов животных культурой У pseudotuberculosis индуцировало образование специфических антител к ограниченному количеству антигенов псевдотуберкулезного микроба, в том числе к ТСБ мономеру иерсинина При этом доминирующими по интенсивности на иммуноблотах были зоны, соответствующие антигенам с М больше 60 кДа (у морских свинок) или антигенам с М 20 - 14 кДа (у неинбредных мышей)

В сыворотках обезьян, переболевших псевдотуберкулезом, также были обнаружены специфические антитела, взаимодействующие с антигенными детерминантами ТСБ мономера иерсинина, причем в случае клеток У pseudotuberculosis зона с М 40 кДа преобладала Это, очевидно, свидетельствует о происходящих при псевдотуберкулезной инфекции иммунных перестройках, которые сопровождаются в организме обезьян выработкой значительного количества антител к линейным детерминантам иерсинина Подобная закономерность наблюдалась и у людей, переболевших псевдотуберкулезом (для анализа были использованы сыворотки с титром специфических антител в реакции непрямой гемагтлютинации 1 180 - 1 3200) В исследованных сыворотках среди антител к другим поверхностным антигенам НМ бактериальной клетки преобладали специфические антитела к ТСБ мономеру иерсинина

Различия, обнаруженные в интенсивности гуморального ответа к ТСБ мономеру иерсинина у мелких экспериментальных животных, с одной стороны, и у обезьян павианов гамадрилов и людей, с другой стороны, свидетельствуют о том, что у последних этот ответ более выражен

Динамика иммунного ответа к иерсинину (на мышиной модели) Известно, что "представление" белкового антигена в макроорганизме во многом зависит от способа введения антигена и определяется степенью денатурации белка, которая, в свою очередь, характеризует "выраженность" тех или иных антигенных детерминант

Динамика развития гуморального ответа на белковые антигены достаточно хорошо изучена Как правило, изменение количества антител описывается кривой, состоящей из участка логарифмического роста уровня антител, участка их стабильного накопления (плато) и участка, соответствующего постепенному снижению количества специфических иммуноглобулинов Ответ начинается с синтеза антител класса IgM, а затем происходит переключение на синтез антител класса IgG В зависимости от природы антигена, дозы, а также состояния иммунной системы организма значительный уровень антител может иногда сохраняться на протяжении недель и даже месяцев после иммунизации

Исследование динамики индукции иммуноглобулинов у мышей двух линий (СБА и BALB/c) при иммунизации животных тримером и ТСБ мономером иерсинина показало, что у мышей обеих линий наблюдается невысокий уровень антител к иерсинину Так, максимальное значение оптической плотности в ИФА для специфических сывороток мышей линии СВА составляло 1,0, а у мышей линии BALB/c - 1,2 При этом значение оптической плотности нормальной сыворотки не превышало 0,2

Зависимость иммунного ответа от дозы обеих молекулярных форм порина характерна для мышей обеих линий, однако при иммунизации тримером иерсинина она выражена в большей степени (рис 39) В этом случае при увеличении дозы антигена наблюдалось не только увеличение интенсивности иммунного ответа, но и изменение формы кривой антителообразования При иммунизации мономером увеличение дозы антигена практически не изменяло характера кривой динамики иммунного ответа, но влияло на напряженность и длительность ответа У мышей линии BALB/c значительный уровень антител наблюдался в течение полутора месяцев после начала иммунизации

Можно предположить, что наблюдаемая зависимость от дозы и колебательный характер иммунного ответа на порин обусловлены несколькими причинами Одна из них, очевидно, состоит в том, что различные антигенные детерминанты тримера и мономера белка распознаются независимо и ответ к ним формируется в разное время Например, обнаружено, что в процессе формирования иммунного ответа к иерсинину уменьшается количество антител, специфичных к олигомерной форме белка (тек "конформационным" детерминантам) и возрастает количество антител, специфичных к мономеру (те к

"линейным" детерминантам) Антитела к тримеру преобладают в первые две недел от начала иммунизации, максимальное их количество приходится на 9-10-й день (ри 39,д)

В эксперименте на мышах линии ВА1.В/С было установлено, что на ранних стади иммунного ответа (до 12-го дня) у мышей вырабатываются иммуноглобулины класса М, затем происходит переключение на индукцию иммуноглобулинов класса в (рис 39е) Пр этом повторное введение антигена не вызывает образования у животных 1дМ антите Следует отметить, что заметное увеличение уровня антител наблюдается на 3-й - 4-неделе после начала иммунизации только в случае введения антигена в ТСБ форме

Как известно, появление антител в результате иммунизации белковыми антигенам может стимулировать синтез антиидиотипов, которые, в свою очередь, стимулируют синт антител к антигену Наблюдается автоколебательный процесс, где каждая новая волн определяется подключением новых генераций клеток, при этом меняется изотип антите как от 1дМ к (дС, так и в пределах 1дС класса

В связи с этим, окончательная форма кривой иммунного ответа к иерсинину являете результатом наложения независимых ответов на разные антигенные детерминант переключения изотипов антител, а также идиотип-антиидиотипической регуляции Скоре всего, переключение изотипов иммуноглобулинов в после 12-го дня от начала иммунизаци является определяющим в формировании колебаний уровня антител к иерсинину

о 3 6 9 12 15 18 21 24 0 6 12 18 24 30 36

Дни забора крови

Рис. 39 Динамика антителообразования у мышей (а-г) линий СВА (а, в) и

ВА1.В/С (б, г) а, б - иммунизация тримером иерсинина 10 мкг (кривая 1), 100 мкг (кривая 2

в, г - иммунизация ТСБ мономером 10 мкг (кривая 3), 100 мкг (кривая 4),

(д) - динамика изменения специфичности антител у мышей линии ВА!_В/с взаимодействие антисыворотки к тримеру с гомологичным антигеном (кривая 1), взаимодействие той же сыворотки с ТСБ мономером (кривая 2),

(е) - динамика индукции класс-специфических иммуноглобулинов у мышей линии ВАиЗ/с при иммунизации ТСБ мономером однократная иммунизация,

100 мкг (кривая 1), двукратная иммунизация, 100 мкг (кривая 2) Время второй иммунизации - 9-й день

Для выявления различий в иммуногенной активности нашивной (тримерной) денатурированной (мономерной) форм иерсинина у людей в процессе развития инфекци сравнивали сыворотки больных псевдотуберкулезом на первой и третьей неделя заболевания Иммуноблоттинг изолированных молекулярных форм иерсинина с пулово"

сывороткой и индивидуальными сыворотками больных людей выявил

наличие специфических антител к нативной тримерной и денатурированной мономерной формам белка на первой неделе заболевания В то же время в более поздние сроки заболевания (через три недели) в сыворотках больных выявлялись антитела только к ТСБ мономеру иерсинина

Таким образом, на ранних стадиях заболевания псевдотуберкулезом в макроорганизме вырабатываются специфические антитела к обоим типам антигенных детерминант иерсинина, что способствует формированию полноценного антительного ответа к этому белку ИМ У pseudotuberculosis Однако значительно большая длительность и напряженность иммунного ответа к термоденатурированному мономеру порина по сравнению с тримером позволяют рассматривать его в качестве наиболее перспективной формы антигена для разработки и создания вакцинных препаратов

Протективная активность иерсинина продемонстрирована в тесте активной защиты мышей (линии СБА) и морских свинок Исследования показали, что при заражении двукратно иммунизированных мышей бактериями 1 серовара Y pseudotuberculosis (в дозе, равной 10-30 LD5o) защитная доза (EDso) порина оказалась равной в среднем 0,13 мкг/20 г, а при заражении такой же дозой бактерий 3 серовара У pseudotuberculosis среднее значение ED5o составило 6,3 мкг/20 г Значение летальной дозы (LDSo) при заражении бактериями псевдотуберкулеза 1 серовара мышей, предварительно двукратно иммунизированных порином (10-100 мкг), превышало значение LDso для неиммунных мышей примерно в 100-1000 раз Тример иерсинина по сравнению с ТСБ мономером белка оказался менее эффективным при защите от экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции у мышей и морских свинок

Другие биологические свойства иерсинина Известно, что значительную роль в иммунном ответе макроорганизма на псевдотуберкулезную инфекцию играют клетки системы мононукпеарных и полинуклеарных фагоцитов, в частности макрофаги В связи с этим, было исследовано взаимодействие бактерий псевдотуберкулеза с перитонеальными макрофагами мышей, иммунизированных иерсинином Установлено, что иммунизация животных порином увеличивает фагоцитарный показатель (ФП) - количество макрофагов, участвующих в фагоцитозе Усиливалась также поглотительная и переваривающая активности макрофагов ФП клеток иммунизированных мышей увеличивался в среднем на 10% по сравнению с ФП клеток контрольных животных, а фагоцитарное число (ФЧ), те число бактерий, обнаруженных на одном макрофаге у иммунизированных мышей, увеличивалось в 2-3 раза по сравнению с ФЧ контрольных животных

Было изучено также влияние тримерной и мономерной форм порина на адгезию и инвазию псевдотуберкулезного микроба в эпителиальные клетки Rhta Предварительная обработка культуры клеток тримером иерсинина приводила к проникновению на два порядка большего числа бактерий псевдотуберкулеза, нежели соответствующая обработка мономерной формой белка Полученные данные позволяют рассматривать нативную (олигомерную) форму иерсинина как один из факторов вирулентности псевдотуберкулезного микроба

В настоящее время вирулентность иерсиний связывают с наличием так называемой плазмиды вирулентности, кодирующей ряд термостабильных белков с М 120-240 кДа Установлено, что из трех слагаемых вирулентности (способности к адгезии и инвазии, способности к внутриклеточному размножению и цитотоксического действия на клетки животных тканей) только два обусловлены присутствием плазмиды вирулентности Первый этап инфекции - прикрепление и проникновение возбудителя - не зависит от плазмиды, и пока нет прямых экспериментальных доказательств участия в этом процессе упомянутых выше высокомолекулярных полипептидов, кодируемых плазмидой В связи с этим полученные нами результаты позволяют предположить, что порины играют важную роль в развитии инфекционного процесса

9. Порин из У. pseudotuberculosis как диагностический антиген

ИФА тест-система для дифференциальной диагностики иерсиниозов. Пр

исследовании иммунобиологических свойств иерсинина было показано, что иерсини. является видо- и родоспецифическим антигеном.'Кроме того, антитела к нему присутствую в сыворотках, полученных при иммунизации экспериментальных животных, и в сыворотка больных псевдотуберкулезом. Эти факты послужили предпосылкой для использовани иерсинина в качестве диагностического антигена.

Нами разработана диагностическая тест-система на основе ИФА с использование: ТСБ мономера иерсинина. При проверке возможности использования тест-системы дл выявления псевдотуберкулеза у людей были исследованы сыворотки 114 больных характерными клиническими признаками и 79 индивидуальных донорских сывороток. Кром того, учитывая выраженный полиморфизм псевдотуберкулезной инфекции, при апробаци тест-системы были обследованы больные другими инфекционными заболеваниям^, сходными по клинической картине с псевдотуберкулезом (сальмонеллез, иерсиниоз гепатит) (рис. 40).

Сыворотки больных иерсиниозом и сальмонеллезом взаимодействуют с порином I диагностических разведениях, однако значения оптической плотности псевдотуберкулезны сывороток выше в среднем почти в 3 раза (рис. 40). Это позволяет эффективно достоверно осуществлять дифференциальную диагностику псевдотуберкулеза.

Рис. 40. Исследование сывороток крови больных и здоровых людей на наличие антител к возбудителю псевдотуберкулеза в ИФА с использованием иерсинина в качестве антигена: 1-й ряд контроль; 2-й ряд - больные псевдотуберкулезом с

1:200 1:400 Т:800 " ТТТеоо бактериологически подтвержденным Разведение антисыворотки диагнозом; 3-Й ряд - больные

кишечным иерсиниозом; 4-й ряд -больные сальмонеллезом; 5-й ряд -больные гепатитом.

На следующем этапе исследования было проведено сравнение статистически достоверных результатов серологического обследования больных псевдотуберкулезом помощью разработанного нами ИФА и РИГА на основе коммерческого типоспецифическогс; диагностикума (в состав которого входит антиген Буавена из Y. pseudotuberculosis 10 серовара). Для этой цели были использованы 46 образцов сывороток крови людей бактериологически подтвержденным диагнозом. Оказалось, что эффективность ИФА почти в два раза выше: с помощью РНГА положительная реакция обнаружена только в 52% случаев, а с помощью ИФА - в 98%, причем при использовании коммерческого; диагностикума заболевание не выявлялось именно в тех случаях, когда возбудител., псевдотуберкулеза принадлежали к 3-му и 5-му сероварам. Полученные результаты особенно важны для Дальневосточного региона России, где циркулируют возбудители 1-ro,j 3-го и 5-го сероваров псевдотуберкулеза. Преимуществом разработанной нами тест-системы является также возможность диагностики заболевания на ранних стадиях развития инфекционного процесса (7-10 дней от начала проявления клинических признаков).

При иерсиниозах часто отмечаются поражения опорно-двигательного аппарата (артрозы и артралгии неясной этиологии) и токсическое поражение сердечной мышцы (инфекционно-аллергический миокардит). Впервые с помощью разработанной нами тест-! системы в сыворотках крови больных (65 человек) с различными формами артралгий в 42% случаев были обнаружены антитела к У. pseudotuberculosis (рис. 41). Исследование сывороток крови детей с кардиологическими патологиями с помощью данной тест-системы

показало, что в 10 % случаев причиной заболевания мог быть перенесенный ранее псевдотуберкулез.

Определение антител к порина« mpcmw в сыворотках крови больных с кардиопатологиями Антитела кпоринуи» У. pseudotuberculosis и Y.cnterocolitica 10,4 ^^ больных ж Опредзление антител кпоринам иерсиний в еыеорогках кроеи дольны:« с заболеваниями опорно-айкгзтвпьмого аппарата Антитела к перину из У. psettdatoherctilosis

Кол ичество исследованных сывороток - 40 Количество исследованных сывороток -65

Рис. 41. Эффективность ИФА тест-системы на основе порина из У. pseudotubercuiosi

при диагностике вторично-очаговых форм иерсиниозов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из 5-ти видов бактерий рода Yersinia, 2-х патогенных для человека (У. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) и 3-х непатогенных видов (У. intermedia, У. frederiksenii, Y. kristensenii), выделены неспецифические порообразующие белки наружной мембраны. Показано, что способ извлечения поринов влияет на стабильность и пространственную | организацию функционально активной (тримерной) формы белка. Определены

молекулярные массы и физико-химические свойства изолированных поринов иерсиний. I 2. Установлена аминокислотная последовательность поринов из указанных выше

видов иерсиний, а для поринов из У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica построены теоретические модели пространственной структуры.

3. Показано, что тримеры исследованных белков в искусственном бислое образуют каналы, по размерам и электрическим характеристикам типичные для OmpF-подобных поринов энтеробактерий. Обнаружено, что, несмотря на высокую степень подобия первичной и пространственной структуры, порины патогенных и непатогенных иерсиний образуют каналы, отличающиеся по размеру и характеру распределения уровней проводимости.

4. Исследованы конформационные превращения порина из псевдотуберкулезного ) микроба под действием различных денатурирующих агентов. Показано, что вторичная

структура белка обладает повышенной устойчивостью, а для более высоких уровней пространственной структуры порина (четвертичной и третичной) характерна конформационная пластичность, обуславливающая образование частично развернутых конформационных интермедиатов, структуру которых определяют условия денатурации.

5. Обнаружено, что при изменении значений рН среды в диапазоне от 6,0 до 3,0 порин из У. pseudotuberculosis имеет два конформационных перехода: функциональный и денатурационный. Первый происходит в слабокислой среде и проявляется в уменьшении проводимости пор на порядок (при рН 5,8) с последующим закрытием канала при рН 5,0. Денатурационный переход (при рН 4,0 - 3,5) связан с диссоциацией тримера на мономеры. Резкое изменение порообразующей активности в узком диапазоне значений рН может служить дополнительным механизмом адаптации иерсиний к изменению условий внешней среды.

6. На примере порина из псевдотуберкулезного микроба показано, что в качестве основного белкового компонента порины входят в состав липополисахарид-белкового комплекса - эндотоксического иммуногенного комплекса наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Характер взаимодействие порина с липополисахаридом in

vitro является специфическим и зависит от структуры липополисахарида Взаимодействие липополисахаридом поддерживает порин в функционально активной конформации

7 Обнаружено, что условия культивирования псевдотуберкулезного микроба влияю на пространственную структуру и функциональные свойства порина Показана корреляци между липидным составом наружной мембраны и температурой выращивания бактерий, одной стороны, и степенью упорядоченности пространственной структуры белка и ег функциональными свойствами, с другой

8 Показано, что порообразующие белки наружной мембраны иерсиний являютс родоспецифическими белками этих бактерий Порины патогенных видов иерсиний могу быть использованы в качестве диагностических и протективных антигенов Обнаружено чт тримерная и мономерная молекулярные формы порина существенно различаются п эффективности защиты лабораторных животных от экспериментальной иерсиниозно инфекции

9 Впервые на основе порина из наружной мембраны У pseudotuberculosi разработана иммуноферментная тест-система для диагностики псевдотуберкулез Предлагаемая тест-система позволяет выявлять заболевание, вызываемое всем сероварами псевдотуберкулезного микроба По эффективности она в два раза превышав применяемый в клинической практике сухой эритроцитарный диагностикум на основ антигена Буавена и может быть использована как для дифференциальной диагностик псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, так и для выявления некоторы иммунопатологий (вторично-очаговых форм иерсиниозов)

10 Впервые методом экспрессии в клетках Б colt получен рекомбинантный порин и У pseudotuberculosis, подобраны условия рефолдинга мономера и сборки функциональн активного рекомбинантного тримера этого белка Показана возможность использовани рекомбинантного порина в качестве диагностического антигена

11 Обнаружено, что порин из Y pseudotuberculosis является факторо вирулентности псевдотуберкулезного микроба, способствующим адгезии и инвази бактерий в макроорганизм

Список статей, опубликованных по теме диссертации, и патентов

1 Бондаренко (Новикова) О Д , Соловьева Т Ф , Шеховцева М Ф , Недашковская Г М , Гладки Р В, Сорочан В Д Исследование липополисахарид-белкового комплекса из Yersini pseudotuberculosis методом светорассеяния // Химия природ соедин 1979 №1 С 51-53

2 Solov'eva Т F , Yermak I М , Bondarenko (Novikova) О D , Frolova G М , Ovodov Yu S Studies о lipopolysacchande-protein complex from Yersinia pseudotuberculosis II Microbios 1979 V25, No1 P 133 144

3 Бондаренко (Новикова) О Д, Соловьева Т Ф, Оводов Ю С Исследование белково компоненты липополисахарид-белкового комплекса Yersinia pseudotuberculosis II Химия природ соедин 1980 №1 С 92-97

4 Новикова О Д, Набиуллин А А, Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Выделение и характеристик белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis И Химия природ соедин 1983 №3 С 359 366

5 Лихацкая Г Н , Новикова О Д , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Выделение порообразующег белка из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis и изучение его действия на проводимост бислойных липидных мембран//Биол мембраны 1985 Т 2, №12 С 1219-1224

6 Новикова ОД, Зыкова ТА, Ядыкина Г М, Глазунов ВП, Соловьева ТФ, Оводов ЮС Изучение иерсинина - основного полипептида внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол мембраны 1985 Т 2, №7 С 714-723

7 Новикова О Д , Урих Е В , Тимченко Н Ф , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Использование иммуноферментного анализа для антигенной характеристики пептидогликан-ассоциированного белка из внешней мембраны У pseudotuberculosis и обнаружения псевдотуберкулезного микроба в окружающей среде // В сб Вопросы микробиологии, патогенеза и лабораторной диагностики иерсиниозов Новосибирск, 1985 С 33-38

8 Тимченко Н Ф , Новикова О Д , Ермак И М , Соловьева Т Ф Компоненты наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и их роль в патогенезе псевдотуберкулеза // Журн микробиол 1986 №6 С 38-41

9 Хоменко В А , Новикова О Д , Тимченко Н Ф , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С , Шубин Ф Н Изучение зависимости полипептидного состава внешней мембраны бактерий псевдотуберкулеза от температуры культивирования микроорганизмов II В сб Психрофильность патогенных микроорганизмов Новосибирск, 1986 С 46-50

10 Соловьева ТФ, Ермак ИМ, Мороз СИ, Красикова ИН, Новикова ОД, Хоменко В А, Фролова Г М , Иванова Е П , Тимченко Н Ф , Оводов Ю С Влияние температуры культивирования на состав основных компонентов внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол мембраны 1988 Т 5, №5 С 492-500

11 Новикова ОД, Соловьева ТФ, Оводов ЮС, Тимченко НФ Патент 1415496 Российская Федерация, МКИ4 А 61 К 39/02 Способ получения антигена из внешней мембраны бактериальных клеток, заявители и патентообладатели ТИБОХ ДВНЦ СО РАН СССР и НИИЭМ СО АМН СССР - № 4010846/28-14, Заявл 0512 85,0публ 07 08 88,Бюлл №29 Зс

12 Новикова О Д , Фролова Г М , Вакорина Т И , Таранкова 3 А , Глазунов В П , Соловьева Т Ф, Оводов Ю С Конформационная стабильность и иммунохимические свойства иерсинина - основного белка внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба // Биоорган химия 1989 Т15, № 6 С 763-772

13 Новикова О Д , Лихацкая Г Н , Фролова Г М , Вострикова О П , Хоменко В А, Тимченко Н Ф , Соловьева Т Ф, Оводов Ю С Молекулярная организация и биологические свойства иерсинина -порина из псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis // Биол мембраны 1990 Т 7, №5 С 453-461

14 Тимченко Н Ф , Новикова О Д , Павлова Т Н , Венедиктов В С , Соловьева Т Ф Протективные свойства порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis //Журн микробиол 1990 № 11 С 48-50

15 Ovodov Yu S , Solovjeva TF, Khomenko VA, Novikova OD, Frolova GM, Yermak IM, Naberezhnykh G A Poriri as a component of Yersinia pseudotuberculosis endotoxin // Adv Exp Med Biol 1990 V 256, No 1 P 185-187

16 Новикова О Д , Федореева Л И , Хоменко В А, Портнягина О Ю , Ермак И М , Лихацкая Г Н , Мороз С В , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган химия 1993 Т 19, № 5 С 536-547

17 Хоменко ВА, Новикова ОД, Федореева ЛИ, Лихацкая ГН, Борисова МП, Вострикова О П , Вакорина Т И , Тимченко Н Ф , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С Порин из Yersinia enterocolitis 0 3 Выделение и характеристика //Биол мембраны 1994 Т 11, №1 С 68-79

18 Новикова ОД, Портнягина ОЮ, Фролова ГМ, Соловьева ТФ, Павлова ТН, Тимченко Н Ф, Прокопенкова А П, Оводов Ю С Использование порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis для серодиагностики псевдотуберкулеза // Бюлл эксп биол мед 1995 № 8 С 199-202

19 Тимченко Н Ф , Павлова Т Н , Андрюков Б Г, Венедиктов В С , Новикова О Д Использование родоспецифического эритроцитарного диагностикума для выявления псевдотуберкулеза и иерсиниоза//Клин лаб диагностика 1998 №7 С 32-34

20 Дармов И В , Маракулин И В , Погорельский И П , Новикова О Д, Портнягина О Ю , Соловьева ТФ Профилактика экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции с помощью иммунизации порином из Yersinia pseudotuberculosis II Бюлл эксп биол мед 1999 Т 127, №2 С 221-223

21 Новикова ОД, Ким НЮ, Глазунов ВП, Вакорина ТИ, Набережных ГА, Лихацкая ГН, Хоменко В А, Соловьева Т Ф Влияние липополисахарида на конформационное состояние и функциональную активность порина из Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган химия 1999 Т 25, № 2 С 97-106

22 Новикова ОД Порины рода Yersinia // Успехи в изучении природных соединений -Владивосток Дальнаука, 1999 С 178-201

23 Портнягина О Ю , Новикова О Д, Вострикова О П , Соловьева Т Ф Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Бюлл эксп биол мед 1999 Т 128, №10 С 437-440

24 Вострикова О П , Лихацкая Г Н , Новикова О Д , Соловьева Т Ф Антигенное родство и функциональные свойства поринов рода Yersinia//Биол мембраны 2000 Т 17, №4 С 399-409

25 Вострикова О П , Новикова О Д , Дробков В И, Дармов И В , Маракулин И В , Соловьева Т Ф Иммунный ответ к основному лорообразующему белку наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis у людей и экспериментальных животных / Ред журн «Иммунология» - М , 2000 -15 с Деп в ВИНИТИ 28 03 00, № 795-В

26 Портнягина О Ю , Вострикова О П , Хоменко В А, Новикова О Д , Соловьева Т Бениова С Н , Малашенкова В Г, Гордеец А В Апробация иммуноферментной тест-системы основе белка порина из Yersinia pseudotuberculosis для диагностики псевдотуберкуле (экстраинтестинального иерсиниоза) у детей//Иммунология 2000 №2 С 59-61

27 Гордеец А В, Портнягина О Ю, Вострикова О П , Малашенкова В Г, Бениова С Н , Новико ОД, Соловьева ТФ Патент 2153172 Российская Федерация, МПК7 G 01 N 33/53, 33/569 Спос диатостики псевдотуберкулеза, заявители и патентообладатели ВГМУ и ТИБОХ ДВО РАН -98122085/14, Заявл 02 12 98, Опубл 20 07 00, Бюлл №20 8 с

28 Портнягина О Ю , Вострикова О П , Хоменко В А, Новикова О Д , Соловьева Т Ф , Бенио С Н, Малашенкова В Г, Гордеец А В Диагностика псевдотуберкулеза с помощь иммуноферментной тест-системы на основе белка порина из Yersinia pseudotuberculosis Тихоокеан мед журн 2001 №2 С 23-25

29 Вакорина Т И , Новикова О Д , Красикова И Н , Набережных Г А , Соловьева Т Ф , Овод Ю С Взаимодействие порина из Yersinia pseudotuberculosis с различными структурными варианта эндогенных липополисахаридов//Биохимия 2003 Т 68, вып 9 С 1193-1202

30 Issaeva М Р , Guzev К V , Novikova О D , Solovjeva Т F , Degtyarev S V , Rasskazov V А Ро from Yersinia pseudotuberculosis cloning and analysis of pnmary structure II Adv Exp Med Biol 2003 529, No 2 P 257-260

31 Vostnkova О P , Novikova О D , Kim N Yu , Likhatskaya G N , Solovjeva T F Pore-forming protei of genus Yersinia II Adv Exp Med Biol 2003 V 529, No 2 P 261-263

32 Ли И A, Попов A M , Санина H M , Костецкий Э Я , Новикова О Д , Реунов А В , Нагорска В П , Портнягина О Ю, Хоменко В А , Шныров В Л Физико-химические и иммунологические свойств гликоглицеролипидов из Laminana ¡apornca в составе иммуностимулирующих комплексов (ISCOM) Изв РАН Сер биол 2004 № 3 С 299-304

33 Портнягина О Ю , Новикова О Д, Вострикова О П , Хоменко В А, Соловьева Т Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактик инфекционных заболеваний // Вестник ДВО РАН 2004 № 3 С 35-44

34 Lee IА, Popov А М , Sanina N М , Kostetsky Е Y, Novikova О D , Reunov А V, Nagorskaya V Р Shnyrov V L Morphological and immunological characterization of immunostimulatory complex based о glycoglycerolipids from Laminana japonica // Acta Biochim Polonica 2004 V 51, No 1 P 263-272

35 Гузев К В , Исаева М П , Новикова О Д , Соловьева Т Ф , Рассказов В А Молекулярна характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia // Биохимия 2005 Т 70, вып 10 1338-1345

36 Likhatskaya G N , Solov'eva Т F , Novikova О D , Issaeva М Р , Guzev К V, Kryzhko I В , Tnfono Е V, Nurminski Е A Homology models of the Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis gener porins and comperative analysis of their functional and antigenic regions // J Biomol Struct Dyn 2005 23, No 2 P 163-174

37 Вострикова О П , Ким Н Ю , Лихацкая Г Н , Гузев К В , Вакорина Т И , Хоменко В А , Новиков О Д, Соловьева Т Ф Структура и функция парообразующих белков бактерий рода Yersinia 1 Выделение и сравнительная характеристика физико-химических свойств и функционально активности поринов иерсиний//Биоорган химия 2006 Т 32, №4 С 371-383

38 Антонец Д В , Бакулина А Ю , Портнягина О Ю, Сидорова О В , Новикова О Д , Максюто А 3 Предсказание антигенно-активных районов OmpF-подобного порина Yersinia pseudotuberculosi II Докл АН 2007 Т 414, №4 С 1-3

39 Ким Н Ю , Новикова О Д , Хоменко В А, Лихацкая Г Н Вострикова О П , Емельяненко В И Кузнецова С М , Соловьева Т Ф Влияние рН на структуру и функциональную активность порина и наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis 1 Функционально значимые информационны переходы иерсинина//Биол мембраны 2007 Т 24, №2 С 150-158

40 Новикова О Д , Ким Н Ю , Лукьянов П А , Емельяненко В И , Кузнецова С М , Лихацкая Г Н Соловьева ТФ Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружно мембраны Yersinia pseudotuberculosis 2 Характеристика рН-индуцированных конформационны интермедиатов иерсинина II Биол мембраны 2007 Т 24, №2 С 159-168

Соискатель ^'' Новикова О Д

!

ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

Новикова Ольга Данииловна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Подписано в печать 02 июня 2008 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Уел печ л 20 Зак.№ 15721

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел 36-26-16,55-95-31 www kpacku com

1. ВВЕДЕНИЕ . g

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Структура и функция неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий

2.1. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий. Структура и свойства

2.2. Принципы построения интегральных мебранных p-структурированных белков

2.2.1. Асимметрия в распределении аминокислотных остатков

2.2.2. Пространственная структура (3-баррельных белков

2.3. Пространственная структура поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий

2.3.1. Структурные особенности неспецифических поринов

2.3.1.1. Основные элементы пространственной организации пориновых белков

2.3.1.2. Геометрия поры

2.3.2. Конформационные переходы изолированных поринов

2.3.2.1. Способы солюбилизации пориновых белков

2.3.2.2. Влияние денатурирующих факторов/агентов на структуру поринов

2.3.3. Подходы к построению теоретических моделей пространственной структуры поринов

2.4. Функциональные свойства неспецифических поринов грамотрицательных бактерий

2.4.1. Статические и динамические и свойства каналов неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий

2.4.1.1. Методы исследования функциональной активности поринов

2.4.1.2. Структурно-фукциональный анализ поринов с помощью химических модификаций и генно-инженерных подходов

2.4.1.3. Модуляция функциональных свойств поринов в экспериментах in vitro

2.4.2. Участие поринов в формировании устойчивости бактерий к антибиотикам

2.4.3. Влияние внешних факторов на функциональные свойства неспецифических поринов (экспрессия OmpF и ОшрС белков)

2.5. Биогенез интегральных белков наружной мембраны бактерий на примере неспецифических поринов

2.5.1. Механизмы биогенеза интегральных (3-баррельных белков наружной мембраны бактерий

2.5.2. Факторы фолдинга поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий небелковой природы

2.6. Биологические свойства неспецифических поринов

2.6.1. Антигенная структура поринов

2.6.1.1. Типы антигенных детерминант неспецифических поринов

2.6.1.2. Методы идентификации антигенных детерминант поринов

2.6.2. Порины как протективные и диагностические антигены

2.6.3. Порины как рецепторы

2.6.4. Порины как эффекторы патогенеза

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение и характеристика OmpF- подобных поринов бактерий рода Yersinia

3.1.1. Порин наружной мембраны У. pseudotuberculosis (иерсинин)

3.1.2. Порины из наружной мембраны У. enterocolitica и непатогенных энтероколитикоподобных видов иерсиний

3.1.3. Полипептид с молекулярной массой 40 кДа - основной белковый компонент липополисахарид-белкового комплекса

3.2. Первичная и пространственная структуры поринов иерсиний

3.2.1. Дизайн типоспецифических OmpF-праймеров

3.2.2. Клонирование кодирующих последовательностей и анализ аминокислотных последовательностей OmpF-подобных поринов бактерий рода Yersinia

3.2.3. Вторичная структура и трансмембранная топология OmpF-подобных белков иерсиний

3.2.4. Теоретическая модель пространственной структуры поринов иерсиний

3.3. Функциональная активность поринов иерсиний

3.3.1. Электрофизиологические свойства порина из наружной мембраны

У. pseudotuberculosis (иерсинина)

3.3.2. Порообразующие свойства изолированых поринов из наружных мембран

Y. enterocolitica и энтероколитикоподобных иерсиний

3.4. Конформационная пластичность неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий (на примере конформационных превращений иерсинина в присутствии денатурантов)

3.4.1. Сравнительная характеристика пространственной структуры молекулярных ' форм поринов иерсиний

3.4.2. Исследование температурной денатурации поринов иерсиний в динамике

3.4.3. Конформационные переходы иерсинина при изменении значений рН среды

3.4.3.1. Денатурация иерсинина в кислой среде

3.4.3.2. Денатурация иерсинина в щелочной среде

3.4.4. Конформационные превращения иерсинина под действием мочевины

3.5. Характеристика рН-индуцированных конформационных интермедиатов иерсинина

3.5.1. Физико-химическая характеристика рН-индуцированных интермедиатов иерсинина методами собственной белковой флуоресценции и кругового дихроизма

3.5.2. Изменение амфифильности поверхности иерсинина при рН-титровании (взаимодействие с пиреном)

3.5.3. Анализ окружения остатков Тгр и Туг иерсинина с привлечением компьютерной модели пространственной структуры белка

3.5.4. Характеристика конформационных интермедиатов иерсинина в терминах, используемых при описании денатурации водорастворимых белков

3.5.5. Структурно-функциональные перестройки в молекуле порина при изменении рН среды (на примере конформационых переходов иерсинина)

3.6. Влияние липидного матрикса на структуру и функциональной активность порина из Y. pseudotuberculosis

3.6.1. Роль липополисахарида в стабилизации структуры и проявлении функциональной активности порина

3.6.2. Взаимодействие порина и липополисахарида in vitro

3.6.3. Влияние условий культивирования на структуру и порообразующие свойства иерсинина

3.6.3.1. Порообразующие свойства образцов иерсинина в составе пептидогликанбелковых комплексов

3.7. Получение и характеристика рекомбинантного порина из Y. pseudotuberculosis

3.8. Биологические свойства иерсинина

3.8.1. Антигенная структура иерсинина

3.8.1.1. Антигенное родство поринов рода Yersinia

3.8.1.2. Идентификация линейных и конформационных антигенных детерминант иерсинина

3.8.1.3. Предсказание антигенно-активных участков OmpF-подобного порина

У. pseudotuberculosis, потенциально способных индуцировать протекгивны иммунный ответ к патогенным иерсиниям

3.8.2. Иммуногенные свойства иерсинина

3.8.2.1. Иммунный ответ к иерсинину

3.8.2.2. Динамика иммунного ответа к иерсинину

3.8.2.3. Протективная активность иерсинина

3.8.3. Другие биологические свойства иерсинина

3.9. Иммуноферментная тест-система для дифференциальной диагностики иерсиниозов

Среди различных биологических макромолекул белки не имеют себе равных по каталитическому и регуляторному потенциалу. Это в равной степени относится и к интегральным мембранным белкам, закодированным в 2-3% генома бактериальной клетки и составляющим около 30% от общего содержания в ней протеинов [1].

Несмотря на относительную простоту их пространственной организации, мембранные белки выполняют в клетке самые разнообразные функции, являясь структурными компонентами наружной мембраны (НМ) бактерий, диффузионными порами, адгезинами, рецепторами, каналами для транслокации белков, а также ферментами, среди которых обнаружены липазы, протеазы, пальмитоилтрансферазы.

Среди белков НМ бактерий доминируют интегральные р-структурированные белки, так называемые неспецифические порины, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул с молекулярной массой не более 600 Да. Они образуют трансмембранные водонаполненные каналы (или поры), которые обеспечивают обмен низкомолекулярными веществами между клеткой и внешним окружением. Кроме того, особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславливают наличие у бактериальных поринов других свойств, отличных от транспортной функции. Например, экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, являются потенциальными сайтами взаимодействия для функционально важных контактов с другими клетками. С одной стороны, порины представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета макроорганизма, активируя факторы немедленной защиты и включаясь в формирование специфического иммунного ответа, направленного на освобождение от патогена. С другой стороны, они выступают как эффекторы патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макроорганизме. Это позволяет рассматривать порообразующие белки НМ бактерий весьма перспективными для решения целого ряда задач инфекционной иммунологии. Прелоде всего, следует назвать выявление среди поверхностных бактериальных антигенов веществ, максимально эффективных в качестве компонентов протективных и диагностических препаратов, а также определение «ключевых» для патогенеза молекул в целях разработки и реализации принципиально новых подходов в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний.

К середине 80-х годов прошлого столетия исследователи уже располагали информацией об основных свойствах неспецифических порообразующих белков (поринов) Е. coli и специфических каналов (LamB) для осуществления транспорта мальтозы, а также об асимметричном строении наружного липидного бислоя [2]. Последнее обусловлено тем, что внутренний слой НМ состоит из фосфолипидов, а внешняя ее часть образована липополисахаридом (ЛПС). Именно этот факт служит объяснением аномально низкой проницаемости мембраны для липофильных веществ. В течение следующих 20 лет в исследовании структуры и функции поринов происходило очень быстрое (порой взрывообразное) накопление знаний. К настоящему времени процесс диффузии низкомолекулярных веществ через неспецифические и специфические пориновые каналы описан в деталях на молекулярном уровне благодаря данным о кристаллической структуре этих белков. Кроме того, в результате установления большого числа различных геномных последовательностей подобные порообразующие белки, осуществляющие транспортную функцию, были идентифицированы, помимо энтеробактерий, во многих микроорганизмах. В некоторых случаях это позволило пролить свет на особенности физиологии различных организмов в естественных условиях обитания. Свидетельством масштабных исследований в этой области может служить тот факт, что только за последние пять лет появилось более 650 статей, в заголовках которых фигурирует термин «порин». И сегодня проведение литературного поиска по информационным базам данных с использованием в качестве ключевых слов терминов «порин» и «ЛПС» даст вам сотни ссылок как на оригинальные работы, так и на обзорные статьи.

Термин «порин» чрезвычайно популярен и часто используется исследователями не только по отношению к неспецифическим поринам. Например, мальтопорином называют специфический порообразующий белок (1атВ), а для обозначения Р1юЕ порина применяют название фосфопорин, хотя этот белок специфичен по отношению к анионам, а не к фосфату. В целях единообразия в терминологии один из корифеев в области исследования белков НМ бактерий Хироши Никаидо рекомендует называть поринами только неспецифические каналообразующие белки НМ грамотрицательных бактерий. В рамках настоящего обзора, большая часть которого посвящена особенностям структуры и функции именно этой группы порообразующих белков-поринов, мы, по возможности, постараемся следовать данной рекомендации

222 ВЫВОДЫ

1. Впервые из 5-ти видов бактерий рода Yersinia: 2-х патогенных для человека (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) и 3-х непатогенных видов (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii) выделены неспецифические порообразующие белки НМ. Показано, что способ извлечения поринов влияет на стабильность и пространственную организацию функционально активной (тримерной) формы белка. Определены молекулярные массы и физико-химические свойства изолированных поринов иерсиний.

2. Установлена аминокислотная последовательность поринов из 5-ти видов иерсиний, и для поринов из У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica, построены теоретические модели пространственной структуры.

3. Показано, что тримеры исследованных белков в искусственном бислое образуют каналы, по размерам и электрическим характеристикам типичные для OmpF подобных поринов энтеробактерий. Обнаружено, что, несмотря на высокую степень подобия первичной и пространственной структуры, порины патогенных и непатогенных иерсиний образуют каналы, отличающиеся по размеру и характеру распределения уровней проводимости.

4. Исследованы конформационные превращения порина из псевдотуберкулезного микроба под действием различных денатурирующих агентов. Показано, что вторичная структура белка обладает повышенной устойчивостью, а для более высоких уровней пространственной структуры порина (четвертичной и третичной) характерна конформационная пластичность, приводящая к образованию частично развернутых 1 конформационных интермедиатов, структуру которых определяют условия денатурации.

5. Обнаружено, что при изменении значений рН среды в дипазоне от 6,0 до 3,0, порин из У. pseudotuberculosis имеет два конформационных перехода: функциональный и денатурационный. Первый происходит в слабокислой среде и проявляется в уменьшении проводимости пор на порядок (при рН 5,8) с последующим закрытием канала при рН 5,0. Денатурационный переход (при рН 4,0 - 3,5) связан с диссоциацией тримера на мономеры. Резкое изменение порообразующей активности в узком диапазоне значений рН может служить дополнительным механизмом адаптации иерсиний к изменению условий внешней среды.

6. На примере порина из псевдотуберкулезного микроба показано, что в качестве основного белкового компонента порины входят в состав ЛПБК - эндотоксического иммуногенного комплекса НМ грамотрицательных бактерий. Характер взаимодействие порина с ЛПС in vitro является специфическим и зависит от струкутуры ЛПС. Взаимодействие с липополисахаридом поддерживает порин в функционально активной конформации.

7. Обнаружено, что условия культивирования псевдотуберкулезного микроба влияют на пространственную структуру и функциональные свойства порина. Показана корреляция между липидным составом НМ и температурой выращивания бактерий с одной стороны и степенью упорядоченности пространственной структуры белка и его функциональными свойствами с другой.

8. Показано, что порообразующие белки НМ иерсиний являются родоспецифическими белками этих бактерий. Порины патогенных видов иерсиний могут быть использованы в качестве диагностических и протективных антигенов. Обнаружено что тримерная и мономерная молекулярные формы порина существенно различаются по эффективности защиты лабораторных животных от экспериментальной иерсиниозной инфекции.

9. Впервые на основе порина из НМ У pseudotuberculosis разработана ИФА тест-система для диагностики псевдотуберкулеза. Предлагаемая тест-система позволяет выявлять заболевание, вызываемое всеми сероварами псевдотуберкулезного микроба. По эффективности она в два раза превышает применяемый в клинической практике сухой эритроцитарный диагностикум на основе антигена Буавена и может быть использована как для дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, так и для выявления некоторых иммунопатологий (вторично-очаговых форм иерсиниозов).

10. Впервые методом экспрессии в клетках Е. coli получен рекомбинантный порин из У. pseudotuberculosis, подобраны условия рефолдинга мономера и сборки функционально активного рекомбинантного тримера этого белка. Показана возможность использования рекомбинантного порина в качестве диагностического антигена.

11. Обнаружено, что порин из У. pseudotuberculosis, является фактором вирулентности псевдотуберкулезного микроба, способствующим адгезии и инвазии бактерий в макроорганизм.

1. Wimley W.C. The versatile ß-barrel membrane protein. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. N. 4. P. 404-411.

2. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. // Microbiol. Rev. 1985. V. 49. N. 1. P. 1-32.

3. Gupta R.S. Protein phylogenies and signature sequences: a reappraisal of evolutionary relationships among archaebacteria, eubacteria, and eukaryotes. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. N. 4. P.1435-1491.

4. Lugtenberg В., Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria. // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 737. N. 1. P. 51-115.

5. Bayer M.E. The fusion sites between outer membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection. // In: Outer membrane. Biogenesis and function. Inouye M. ed. N.-Y.: Wiley-lnterscience. 1979. P. 167-202.

6. Miura Т., Mizushima S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membranes from spheroplast membrane of Escherichia coli K-12. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 150. N. 1. P. 159-161.4

7. Osborn M., Gander J.E., Parisi E., Carson J. Mechanism of assembly of the membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of the cytoplasmic and outer membrane. // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. N. 12. P. 39623972.

8. Schnaitman C.A. Solubilization of the cytoplasmic membrane of Escherichia coli by triton X-100. //J. Bacterid. 1971. V. 108. N. 1. P. 545-552.

9. Schweizer M., Schwarz H., Sonntag I., Henning U. Mutational change of membrane architecture. Mutants of Escherichia coli K-12 missing major proteins of the outer cell envelope membrane. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 448. N. 3. p. 474-491.

10. De Leij L., Witholt B. Structural heterogeneity of the cytoplasmic and outer membranes of Escherichia coli. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 471. N. 1. P. 92-104.

11. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. N. 1. P. 265-275.

12. Smit J., Kamio J., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants. // J. Bacteriol. 1975. V. 124. N. 2. P. 942-958.

13. Van Alphen L., Verkleij A., Leunissen-Bijvelt J., Lugtenberg B. Architecture of the outer membrane of Escherichia coli. 111. Protein-lipopolysaccharide complex in intramembraneous particles. //J. Bacteriol. 1978. V. 134. N. 3. P. 1089-1098.

14. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channels. // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. N. 7. P. 21762178.

15. Schein S. J., Colombini M., Finkelstein A. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from Parameciiim mitochondria. II J. Membr. Biol. 1976. V. 30. N. 2. P. 99-120.

16. Ulmschneider M.B., Sansom M.S. Amino acid distributions in integral membrane protein structure. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1512. N. 1. P. 1-14.

17. Chamberlain A.K., Bowie J.U. Asymmetric amino acid compositions of transmembrane p-strands. // Protein Sci. 2004. V. 13. N. 8. P. 2270-2274.

18. Schulz G.E. The structure of bacterial outer membrane proteins. II Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1565. N. 2. P. 308-317.

19. Arora A., Abildgaard F., Bushweller J.H., Tamm L.K. Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR spectroscopy. // Nature Struct. Biol. 2001. V. 8. N. 4. P. 334-338.

20. Pautsch A., Schulz G.E. High-resolution structure of the OmpA membrane domain. // J. Mol. Biol. 2000. V. 298. N. 2. P. 273-282.

21. Conlan S., Zhang Y., Cheley S., Bayley H. Biochemical and biophysical characterization of OmpG: a monomeric porin. // Biochemistry. 2000. V. 39. N. 39. P. 11845-11854.

22. Cowan S.W., Garavito R.M., Jansonius J.N., Jenkins J.A., Karlsson R., Konig N., Pai E.F., Pauptit R.A., Rizkallah P.J., Rosenbusch J.P. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. // Struct. Fold. Design. 1995. V. 3. N. 10. P.1041-1050.

23. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structure explain functional properties of two Escherichia coli porins. // Nature. 1992. V. 358. N. 6389. P. 727-733.

24. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N. Egmond M.R., Gros P. Crystal structure of the outer membrane protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site. // EMBO J. 2001. V. 20. N. 18. P. 5033-5039.

25. Hwang P.M., Choy W.Y., Lo E.I., Chen L„ Forman-Kay J.D., Raetz C.R., Prive G.G., Bishop R.E., Kay L.E. Solution structure and dynamics of the outer membrane enzyme PagP by NMR. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. V. 99. N. 21. P. 13560-13565.

26. Schirmer T., Keller T.A., Wang Y.F., Rosenbusch J.P. Structural basis for sugar translocation through maltoporin channels at 3.1 A resolution. II Science. 1995. V. 267. N. 5197. P. 512-514.

27. Forst D., Welte W., Wacker T., Diederichs K. Structure of the sucrose-specific porin SerY from Salmonella tuphimurium and its complex with sucrose. // Nature Struct. Biol. 1998. V. 5 N. 1. P. 37-46.

28. Ferguson A.D., Hofmann E., Coulton J.W., Diederichs K., Welte W. Siderophore-mediated iron transport: crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide. II Science. 1998. V. 282. N. 5397. P. 2215-2220.

29. Chimento D.P., Monanty A.K., Kadner R.J, Wiener M.C. Crystallization and initial X-ray diffraction of BtuB, the integral membrane cobalamin transporter of Escherichia coli. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2003. V. 59. N. 3. P. 509-511.

30. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. Principles determing of ß-sheet barrels in proteins. II. The observed structure. // J. Mol. Biol. 1994. V. 236. N. 5. P. 13821400.

31. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Three-dimensional crystals of an integral membrane protein: an initial X-ray analysis. // J. Cell Biol. 1980. V. 86. N. 1. P. 327-329.

32. Weiss M.S., Kreusch A., Schiltz E., Nestel U., Welte W., Weckesser J., Schulz G.E. The structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 1.8 A resolution. // FEBS Lett. 1991. V. 280. N. 2. P. 379-382.

33. Weiss M.S., Wacker T., Weckesser J., Welte W„ Schulz G.E. The three-dimensional structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 3 A resolution. II FEBS Lett. 1990. V. 267. N. 2. P. 268-272.

34. Weiss M.S., Abele U., Weckesser J., Welte W., Schiltz E., Schulz G.E. Molecular architecture and electrostatic properties of a bacterial porin. // Science. 1991. V. 254. N. 5038. P. 1627-1630.

35. Jap B.K., Walian P.J. Structure and functional mechanism of porins. II Physiol. Rev. 1996. V. 76. N. 4. P. 1073-1088.

36. Koebnick R., Locher K.P., van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253.

37. Schulz G.E. (B-Barrel membrane proteins. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. N. 4. P. 443-447.

38. Jap B.K. Molecular design of PhoE porin and its functional consequences. // J. Mol. Biol. 1989. V. 205. N. 2. P. 407-419.

39. Phale P.S., Philippsen A., Kiefhaber T., Koebnik R., Phale V.P., Schirmer T., Rosenbusch J.P. Stability of trimeric OmpF porin: the contributions of the latching loop L2. // Biochemistry. 1998. V. 37. N. 45. P. 15663-15670.

40. Jeanteur D., Lakey J. H., Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction. // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. N. 9. P. 21532164.

41. Delcour A.H. Function and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology. // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. N. 2. P. 115-125.

42. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study. //J. Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286.

43. Jap B.K. Wallia P.J., Gehring K. Structural architecture of an outer membrane channel as determined by electron crystallography. // Nature. 1991. V. 350. N. 6314. P. 167-170.

44. Sipos L., von Heijne G. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. N. 3. P. 1333-1340.

45. Jaenicke R. Do ultrastable proteins from hyperthermophiles have high or low conformational rigidity? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. N. 7. P. 29622964.

46. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. N. 3. P. 715-728.

47. Daggett V., Fersht A.R. Is there a unifying mechanism for protein folding? // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. N. 1. P. 18-25.

48. Sivaraman T., Kumar T.K., Jayaraman G., Han C.C., Yu C. Characterization of a partially structured state in an all p-sheet protein. // Biochem. J. 1997. V. 321. N. 2. P. 457-464.

49. Pawar S.A., Deshpande V.V. Characterization of acid-induced unfolding intermediates of glucose/xylose isomerase. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. N. 21. P. 6331-6338.

50. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Isolation and crystallization of bacterial porin. II Methods Enzymol. 1986. V. 125. P. 309-328.

51. Kleinschmidt J.H. Membrane proteins Introduction. // Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. N. 8. P. 1527-1528.

52. Eriks L. R., Mayor J.A., Kaplan R.S. A strategy for identification and quantification of detergents frequently used in the purification of membrane proteins. // Anal. Biochem. 2003. V. 323. N. 2. P.234-241.

53. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. //J. Biol. Chem. 1974. V. 249. N. 24. P. 8019-8029.

54. Nurminen M. Isolation of porin trimers. II In: Enterobacterial surface antigen methods for molecular characterization. Korhonen T.K., Dawes E.A., Makela P.H. eds. N.-Y.: Elsevier Science Publ. 1985. P. 293-300.

55. Rosenbusch J.P. Structural and functional properties of porin channels in E. coli outer membranes. // Experientia. 1990. V. 46. N. 2. P. 167-173.

56. Bolla J.-M., Loret E., Zalewsky M., Pages J.-M. Conformational analysis of the Campylobacter jejuni porin. //J. Bacteriol. 1995 V. 177. N. 15. P. 4266-4271.

57. Eisele J.L., Rosenbusch J.P. In vitro folding and oligomerization of a membrane protein. Transition of bacterial porin from random coil to native conformation. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 18. P. 10217-10220.

58. Markovic-Housley Z., Garavito R.M. Effect of temperature and low pH of matrix porin in micellar detergent solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 869. N. 2. P. 158-170.

59. Minetti C.A.S.A., Blake M.S., Remeta D.P. Characterization of the structure, function, and conformational stability of PorB class 3 protein from Neisseria meningitidis. //J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 39. P. 25329-25338.

60. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transition of porin, a transmembrane protein. // FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

61. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Tracking the unfolding and refolding pathways of outer membrane protein porin from Paraccocus denitrificans. // Biochemistry. 2006. V. 45. N. 12. P. 3972-3980.

62. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Structure-function correlation of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans. // Biopolymers. 2006. V. 82. N. 4. P. 344-348.

63. Мажуль В.М., Кананович С.Ж. О возможности белка существовать во множестве частично свернутых состояний. // Биофизика. 2004. Т. 40. № 3. С. 413-423.

64. Gnanasekarean T.V., Peri S., Arockiasamy F., Krishnaswamy S. Profiles from structure based sequence alignment of porins can identify (3-stranded integral membrane proteins. // Bioinformatics. 2000. V. 16. N. 9. P. 839-842.

65. Ferenci T. From sequence alignment to structure prediction: the case of the OmpF porin family. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. N. 1. P. 188-189.

66. Kreusch A., Neubuser A., Schiltz E., Weckesser J., Schulz G.E. Structure of the membrane channel porin from Rhodopseudomonas baltica at 2.0 A resolution. // Protein Sci. 1994. V. 3. N. 1. P. 58-63.

67. Heringa J. Computational methods for protein secondary structure prediction using multiple sequence alignments. // Curr. Protein Pept. Sci. 2000. V. 1. N. 3. P. 273-301.

68. Berven F.S., Flikka K., Jensen H.B., Eidhammer I. BOMP: a program to predict integral p-barrel outer membrane proteins encoded within genomes of Gramnegative bacteria. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. N. (Web Server). P. W394-399.

69. Jackups R.Jr., Liang J. Interstrand pairing patterns in p-barrel outer membrane proteins: the positive outside rule, aromatic rescue, and strand registration prediction. // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. N. 4. P. 979-993.

70. Waldispuhl J., Berger B., Clote P., Steyaert J.M. transFold: a web server for predicting the structure and residue contacts of transmembrane p-barrels. // Nucleic Acid Res. 2006. V. 34. N. (Web Server). P. W189-W193.

71. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 676. N. 4. P. 593-656.

72. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. N. 6. P. 3905-3908.

73. Nakae T. Identification of the outer membrane proteins of Escherichia coli that produced transmembrane channels in reconstituted vesicle membrane. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 71. N. 3. P. 877-884.

74. Tokunaga M., Tokunaga H., Nakae T. The outer membrane permeability of Gram-negative bacteria. Determination of permeability rate in reconstituted membrane vesicles. // FEBS Lett. 1979. V. 106. N. 1. P. 85-88.

75. Nakae T. Outer membrane of Salmonella typhymurium: Reconstitution of sucrose-permeable membrane vesicles. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. N. 4. P. 1224-1230.

76. Nikaido H., Rosenberg E.Y. Porin channels in Escherichia coli: studies with liposomes reconstituted from purified proteins. // J. Bacterid. 1983. V. 153. N. 1. P. 241-252.

77. Nikaido H., Rosenberg E.Y. Effect on solute size on diffusion rates through the transmembrane pores of the outer membrane of Escherichia coli. II J. Gen. Physiol. 1981. V. 77. N. 2. P. 121-35

78. Zimmermann W., Rosselet A. Function of the outer membrane of Escherichia coli as a permeability barrier to beta-lactam antibiotics. // Antimicrob. Agents Chemother. 1977. V. 12. N. 3. P. 368-372.

79. Nikaido H., Song S.A., Shaltlel L., Nurminen M. Outer membrane of Salmonella. XIV. Reduced transmembrane diffusion rate in porin-deficient mutants. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 76. N. 2. P. 324-330.

80. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vivo and its transformation into an excitable system. // Nature. 1962. V. 194. N. 4832. P. 979-980.

81. Montal M., Muller P. Formation of bimolecular membranes from lipid bilayers and study of their electrical properties. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. N. 12. P. 3561-3566.

82. Schindler H. Formation of planar bilayer from artificial or native membrane vesicles. // FEBS Lett. 1980. V. 122. N. 1. P. 77-79.

83. Schindler H., Rosenbusch J. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled channels in lipid bilayers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. N. 8. P. 3751-3755.

84. Benz R., Schmid A., Hancock R.E. Ion selectivity of Gram-negative bacterial porins. //J. Bacteriol. 1985. V. 162. N. 2. P. 722-727.

85. Dargent B., Hofmann W., Pattus F., Rosenbusch J.P. The selectivity filter of voltage-dependent channels formed by phosphoporin (PhoE) from E. coli. // EMBO J. 1986. V.5. N. 4. P. 773-778.

86. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F.J. Improved patchiclamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches. // Pflugers Arch. 1981. V. 391. N. 2. P. 85-100.

87. Martinac B., Buechner M., Delcour A.H., Adler J., Kung C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. N. 8. P. 2297-2301.

88. Buechner M., Delcour A.H., Martinac B., Adler J., Kung C. Ion channel activity in the Escherichia coli outer membrane. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1024. N. 1. P. 111-121.

89. Delcour A.H., Martinac B., Kung C., Adler J. A modified reconstitution method used in patch-clamp studies of Escherichia coli ion channels. // Biophys. J. 1989 V. 56. N. 3. P. 631-636.

90. Berrier C., Coulombe A., Houssin C., Ghazi A. A patch-clamp study of ion channels of inner and outer membranes and of contact zones of E. coli fused into giant liposomes. // FEBS Lett. 1989. V. 259. N. 1. P. 27-32.

91. Delcour A.H., Martinac B., Kung C., Adler J. Voltage-sensitive ion channel of Escherichia coli. //J. Memb. Biol. 1989. V. 112. N. 3. P. 267-275.

92. Karshikoff A., Spassov V., Cowan S.A., Ladenstein R., SchirmerT.J. Electrostatic properties of two porin channels from Escherichia coli. // Mol. Biol. 1994. V. 240. N. 4. P. 372-384.

93. Brunen M., Engelhardt H. Significance of positively charged amino acids for the function of the Acidovorax delafieldii porin Omp34. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 212. N. 1. P. 129-135.

94. Phale P.S., Philippsen A., Widmer C., Phale V.P., Rosenbusch J.P., Schirmer T. Role of charged residues at the OmpF porin channel constriction probed by mutagenesis and simulation. // Biochemistry. 2001. V. 40. N. 21. P. 6319-6325.

95. Liu N., Samartzidou H., Lee K.W., Briggs J.M., Delcour A.H. Effect of pore mutation and permeant ion concentration of the spontaneous gating activity of OmpC porin. // Protein Eng. 2000. V. 13. N. 7. P. 451-500.

96. Miedema H., Vrouenraets M., Wierenga J., Eisenberg B., Schirmer T., Basle A., Meijberg W. Conductance and selectivity fluctuations in D127 mutants of the bacterial porin OmpF. // Eur. Biophys. J. 2006. V. 36. N. 1. P. 13-22.

97. Van Gelder P., Saint N., Phale P., Eppens E.F., Prilipov A., van Boxtel R. Voltage sensing in the PhoE and OmpF outer membrane proteins of Escherichia coli. Role of charged residues. //J. Mol. Biol. 1997. V. 269. N. 4. P. 468-472.

98. Benson S.A., Occi J.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K12. // J. Mol. Biol. 1988. V. 203. N. 4. P. 961970.

99. Miedema H., Vrouenraets M., Wierenga J., Gillespie D., Eisenberg B., Meijbergand W., Nonner W. Ca2+ Selectivity of a chemically modified OmpF with reduced pore volume. // Biophys. J. 2006. V. 91. N. 12. P. 4392-4400.

100. Vrouenraets M., Wierenga J., Meijberg W., Miedema H. Chemical modification of the bacterial porin OmpF: gain of selectivity by volume reduction. // Biophys. J. 2006. V. 90. N. 4. P. 1202-1211.

101. Delcour A.H. Solute uptake through general porins. // Front. Biosci. 2003. V. 8. P. d1055-d1071.

102. Benz R., Janko K., Lauger P. Ionic selectivity of pores formed by the matrix protein (porin) of Escherichia coli. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 551. N. 2. P. 238-247.

103. Nestorovich E.M., Rostovtseva T.K., Bezrukov S.M. Residue ionization and ion transport through OmpF channels. // Biophys. J. 2003. V. 85. N. 6. P. 3718-3729.

104. Buehler L.K., Kusumoto S., Zhang H., Rosenbusch J.P. Plasticity of Escherichia coli porin channels. Dependence of their conductance on strain and lipid environment. //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. N. 36. P. 24446-24450.

105. Schirmer T. General and specific porins from bacterial outer membrane. // J. Struct. Biol. 1998. V. 121. N. 2. P. 101-109.

106. Muller D.J., Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. //J. Mol. Biol. 1999. V. 285. N. 4. P. 13471351. '

107. Todt J.C., Roque W.J., McGroarty E.J. Effects of pH on bacterial porin function. // Biochemistry. 1992. V. 31. N. 43. P. 10471-10478.

108. Xu G., Shi B., McGroarty E.J., Tien H.Y. Channel-closing activity of porins from E. coli in bilayer lipid membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 862. N. 1. P. 57-64.

109. Alcaraz A., Nestorovich E. M., Aguilella-Arzo M., Aguilella V. M., Bezrukov S. M. Salting out the ionic selectivity of a wide channel: the asymmetry of OmpF. // Biophys. J. 2004. V. 87. N. 2. P. 943-957.

110. Ashish A., Rinehart D., Szabo G., Tamm L.K. Refolded outer membrane protein A of Escherichia coli forms ion channels with two conductance states in planar lipid bilayers. //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N. 3. P. 1594-1600.

111. Schindler H., Rosenbusch J.P. Matrix protein in planar membranes: Clusters of channels in native environment and functional reassembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. N. 4. P. 2302-2306.

112. Eppens E.F., Saint N., Van Gelder P., van Boxtel R., Tommassen J. Role of the constriction loop in the gating of outer membrane porin PhoE of Escherichia coli. // FEBS Lett. 1997. V. 415. N. 3. P. 317-320.

113. Bainbridge G., Mobasheri H., Armstrong G.A., Lea E.J., Lakey J.H. Voltage-gating of Escherichia coli porin: a cystine-scanning mutagenesis study of loop 3. //J. Mol. Biol. 1998. V. 275. N. 2. P. 171-176.

114. Liu N., Delcour A. The spontaneous gating activity of OmpC porin is affected by mutation of putative hydrogen bond network or of a salt bridge between the L3 loop and the barrel. // Protein Eng. 1998. V. 11. N. 9. P. 797-802.

115. Basle A. Deletions of single extracellular loops affect pH sensitivity, but not voltage dependence, of the Escherichia coli porin OmpF. // Protein Eng. Design Select. 2004. V. 17. N. 9. P. 665-672.

116. Arbing M.A., Dahan D., Boismenu D., Mamer O.A., Hanrahan J.W., Coulton J.W. Charged residues in surface-located loops influence voltage gating of porin from Haemophilus influenzae type b. //J. Membr. Biol. 2000. V. 178. N. 3. P. 185-193.

117. Schabert F.A., Henn C., Engel A. Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy. // Science. 1995. V. 268. N. 5207. P. 92-94.

118. Heyde M., Portalier R. Regulation of major outer membrane porin proteins of Escherichia coli K 12 by pH. // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. N. 3. P. 511-517.

119. Chevalier J., Pages J.M., Mallea M. In vivo modification of porin activity conferring antibiotic resistance to Enterobacter aerogenes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 266. N. 1. P. 248-251.

120. Simonet V., Mallea M., Pajes J.M. Substitutions in the eyelet region disrupt cefepime diffusion through the Escherichia coli OmpF channel. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V. 44. N. 2. P. 311-315.

121. Mallea M., Chevalier J., Bornet C., Eyraud A., Davi-Regli A., Bollet C., Pages J.M. Porin alteration and active efflux: two in vivo drug resistance strategies used by Enterobacteraerogenes. //Microbiol. 1998. V. 144. N. 11. P. 3003-3009.

122. Hernandez-Allez S., Alberti S., Alvarez D., Domenech-Sanchez A., Martinez-Martinez L., Tomas J.M., Benedi V.J. Porin expression in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. // Microbiol. 1999. V. 145. N. 3. P. 673-679.

123. Bornet C., Davi-Regli A., Bosi C., Pages J.M., Bollet C. Imipenem resistance of Enterobacter aerogenes mediated by outer membrane permeability. // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. N. 3. P. 1048-1052.

124. Tomassen J., van der Ley P., van Zzeiji M., Agterberg M. Localization of functional domains in E. coli outer membrane porins. // EMBO J. 1985. V. 4. N. 6. P. 1583-1587.

125. Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Siihavy T.J. From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of OmpF and OmpC porin in Escherichia coli. // Mol. Microbiol. 1996. V. 20. N. 5. P. 911-917.

126. Mizuno T., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis of the osmotic regulation of the porin genes. // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. N. 7. P. 1077-1082.

127. Lan C.Y., Igo M.M. Differential expression of the OmpF and OmpC porin proteins in Escherichia coli K-12 depends upon the level of active OmpR. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. N. 1. P. 171-174.

128. Slauch M., Garrett S., Jackson D.E., Siihavy T.J. EnvZ functions through OmpR to control porin gene expression in Escherichia coli K-12. // J. Bacteriol. 1988. V. 170. N. 1. P. 439-441.

129. Batchellor E., Walthers D., Kenney L.J., Goulian M. The Escherichia coli CpxA-CpxR envelope stress response system regulate expression of the porins OmpF and OmpC. II J. Bacteriol. 2005. V. 187. N. 16. P. 5723-5731.

130. Achouak W., Heulin T., Pages J.P. Multiple facets of bacterial porins. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. N. 1. P. 1-7.

131. Tamm L.K., Hong H., Liang B. Folding and assembly of (5-barrel membraneiproteins. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1666. N. 1-2. P. 250-263.

132. Bernstein H.D. The biogenesis and assembly of bacterial membrane proteins. // Curr. Opin. Microbiol. 2000. V. 3. N. 2. P. 203-209.

133. Paetzel M., Darbey R.E., Strinadka N.C. The structure and mechanism of bacterial type I signal peptidases. A novel antibiotic target. // Pharmacol. Ther. 2000. V. 87. N. 1. P. 27-49.

134. Surrey T., Jahnig F. Refolding and oriented insertion of a membrane protein into a lipid bilayer. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. N. 16. P. 7457-7461.

135. Kleinschmidt J.H., Tamm L.K. Folding intermediates of a (3-barrel membrane protein. Kinetic evidence of a multi-step membrane insertion mechanism. // Biochemistry. 1996. V. 35. N. 40. P. 12993-13000.

136. Conlan S., Bayley H. Folding of a monomelic porin, OmpG, in detergent solution. // Biochemistry. 2003. V. 42. N. 31. P. 9453-9465.

137. Surrey T., Jahnig F. Kinetics of folding and membrane insertion of a ß-barrel membrane protein. //J. Biol. Chem. 1995. V. 270. N. 47. P. 28199-28203.

138. Struyve M., Moons M., Tommassen J. Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein. // J. Mol. Biol. 1991. V. 218. N. 1. P. 141-148.

139. Bosch D., Schölten M., Verhagen C., Tommassen J. The role of the carboxy-terminal membrane-spanning fragment in the biogenesis of Escherichia coli K12 outer membrane protein PhoE. // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 216. N. 1. P. 144148.

140. Schäfer U., Beck K., Müller M. Skp, a molecular chaperone of Gram-negative bacteria, is required for the formation of soluble periplasmic intermediates of outer membrane proteins. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N. 35. P. 24567-24574.

141. Korndörfer I.P., Dommel M.K., Skerra A. Structure of the periplasmic chaperone Skp suggests functional similarity with cytosolic chaperones despite differing architecture. // Nature Struct. Mol. Biol. 2004. V. 11. N. 10. P. 1015-1020.

142. Walton T.A., Sausa M.C. Crystal structure of Skp, a prefolding-like chaperone that protects soluble and membrane proteins from aggregation. // Moll. Cell. 2004. V. 15. N. 3. P. 367-374.

143. Nakamoto H., Bardwell J.C. Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in the Escherichia coli periplasm. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1694. N. 1-3. P. 111-119.

144. Voulhoux R., Bos M.P., Geurtsen J., Mols M., Tommassen J. Role of high conserved bacterial protein in outer membrane protein assembly. II Science. 2003. V. 299. N. 5604. P. 262-265.

145. Voulhoux R., Tommassen J. Omp85, an evolutionary conserved bacterial protein involved in outer-membrane-protein assembly. // Res. Microbiol. 2004. V. 155. N. 3. P. 129-135.

146. Bulieris P.V., Behrens S., Hoist O., Kleinschmidt J.H. Folding and insertion of the outer membrane protein OmpA is assisted by the chaperone Skp and by lipopolysaccharide. //J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N. 11. P. 9092-9099.

147. Новикова О.Д. Порины рода Yersinia II Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. - С. 178-201.

148. Rawling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF. II Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42.

149. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucarie S., Pages J.M. Immunological analysis of porin polymorphism in Escherichia coli В and K-12. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P. 1027-1036.

150. Singh S.P., Singh S.R., Williams Y.U., Jonnes L., Abdullach Т. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium. U Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 12. P. 4600-4605.

151. Дельвиг A.A., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1997. № 6. С. 92-96.

152. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Immunogenicity expressed in patients with bacteraemia of an epitope shared by enterobacterial and neisserial porin proteins. //APMIS. 1995. V. 103. N. 5. P. 388-394.

153. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Katpally U.C., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi. // J. Struct. Biol. 2004. V. 148. N. 1. P. 22-33.

154. Hopp T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein antigenic determinants. // Mol. Immunol. 1983. V. 20. N. 4. P. 483-489.

155. Вольпина O.M., Титова M.A., Жмак M.H., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способныхиндуцировать образование антител у мышей. // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. № 5. С. 387-395.

156. Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway D.R. Antibody response of infected mice to outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa. // Infect. Immun. 1984. V. 43. N. 1. P. 49-53.

157. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep. // Vet. Microbiol. 1995. V. 43. N. 1. P. 21-32.

158. Henriisen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an enterobacterial porin protein domain. // APMIS. 1991. V. 99. N. 8. P. 49-57.

159. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H.J., Sparling P.F. Immunobiology of purified recombinant outer membrane porin protein I of Neisseria gonorrhoeae. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. N. 5. P. 1059-1075.

160. Nandakumar K.S., Muthukkaruppan V.R. Influence of immunopotentiators on the antiporin immunoglobulin G subclass: distribution and protective immunity against murine salmonellosis. //Scand. J. Immunol. 1999. V. 50. N. 2. P. 188-194.

161. Jansen С., Kuipers В., van der Biezen J., de Cock H., van der Ley P., Tomassen J. Immunogenicity of in vitro folded outer membrane protein PorA of Neisseria meningitidis. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V. 27. N. 3. P. 227-233.

162. Wright J.C., Williams J.N., Christodoulidis M., Heckeis J.E. Immunization with the recombinant PorB outer membrane protein induces a bactericidal immune response against Neisseria meningitides. // Infect. Immun. 2002. V. 70. N. 8. P. 4028-4034.

163. Wetzler L.M., Ho Y., Reiser H. Neisserial porins induce В lymphocytes to express costimulatory B7-2 molecules and to proliferate. H J. Exp. Med. 1996. V. 183. N. 3. P. 1151-1159.

164. Massari P., Ho Y., Wetzler L.M. Neisseria meningitidis porin PorB interacts with mitochondria and protects cells from apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. N. 16. P. 9070-9075.

165. Супотницкий M.B. Эффективное патентование средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. // Биотехнология. 1997. № 9-10. С. 56-79.

166. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1996. Т. 126. № 6. С. 657-660.

167. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий. // Успехи соврем, биол. 1980. Т. 90. Вып. 1. С. 62-79.

168. Schweizer М., Hindennach I., Garten W., Henning U. Major proteins of the Escherichia coli outer cell envelope membrane. Interaction of protein II with lipopolysaccharide. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 82. N. 1. P. 211-217.

169. Alukar V., Kamat R. Immunomodulatory properties of some members of the family Enterobacteriaceae. // Infect. Immun. 1996. V. 65. N. 6. P. 2382-2388.

170. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны. // Журн. микробиол. 1999. Т. 128. № 10. С. 437-440.

171. Kuusi N., Nurminen M., Saxen H., Valtonen M., Makela P.H. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonellosis of mice. // Infect. Immun. 1979. V. 25. N. 3. P. 857-862.

172. Wyllie S., Longbottom D., Herring A.J., Ashley R.H. Single channel analysis of recombinant major outer membrane porins from Chlamidia psittaci and Chlamidia pneumonia. IIFEBS Lett. 1999. V. 445. N. 1. P. 192-196.

173. Lutwiche P., Exner M.M., Hancock R.E., Trust T.J. A conserved Aeromonas porin provides protective immunity to rainbow trout. // Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 8. P. 3137-3142.

174. Marandi M.V., Mittal K.R. Role of outer membrane protein H (OmpH)- and OmpA-specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida. II Infect. Immun. 1997. V. 65. N. 11. P. 4502-4508.

175. Singh S.P., Williams Y.U., Benjamin W.H., Klebba P.E., Boyd D. Immunoprotection by monoclonal antibodies to the porins and lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium. // Microb. Pathogen. 1996. V. 21. N. 4. P. 249-263.

176. Simón M., Jofre J., Blanch A.R., Evaluation of the immunospecificity of the porin Om1 of Vibrio anguillarum serotype 01. // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84. N. 5. P. 709-714.

177. Sheikhian A., Mustafaie Z.M.H.A., Shokri F., Malekzadeh R., Siavoshi F. Extraction of the outer membrane proteins of H. pylori and evaluation of their presence in stool of the infected individuals. // Iran. Biomed. J. 2004. V. 8. N. 2. P. 83-88.

178. Joossens S., Colombel J.-F., Landers C., Poulain D., Geboes K., Bossuyt X., Targan S., Rutgeerts P., Reinisch W. Anti-outer membrane of porin C and anti-12 antibodies in indeterminate colitis. // Gut. 2006. V. 55. N. 11. P. 1667-1669.

179. Muthukkumar S., Muthukkaruppan V.R. Detection of porin antigen in serum for early diagnosis of mouse infections with Salmonella typhimurium. // FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 89. N. 3. P. 147-154.

180. Dover L.J, Evans L.A.A., Fridd S.L., Bainbridge G., Raggett E.M., LakeyJ.N. Colicin pore-forming domains bind to Escherichia coli trimeric porins. // Biochemistry. 2000. V. 39. N. 29. P. 8632-8637.

181. Traurig M., Misra R. Identification of bacteriophage K20 binding regions of OmpF and lipopolysaccharide in Escherichia coli K-12. II FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 181. N. 1. P. 101-108.

182. Ho T.D., Slauch J.M. OmpC is the receptor for Gifsy-1 and Gifsy-2 bacteriophages of Salmonella. //J. Bacteriol. 2001. V. 183. N. 4. P. 1495-1498.

183. Alberti S., Marcurs G., Hernande-Alles S., Rubires X., Tomas J.M., Vivanco F., Benedi V.J. Interaction between complement subcomponent C1q and the Klebsiella pneumoniae porin OmpK36. // Infect. Immun. 1996. V. 64. N. 11. P. 4719-4725.

184. Payne N.R., Horwitz M.A. Phagocytosis of Legionella pneumophila is mediated by human monocyte complement receptors. // J. Exp. Med. 1987. V. 166. N. 5. P. 1377-1389.

185. Azghani A.O., Idel S., Bains M., Hancock E.W. Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein F is an adhesin in bacterial binding to lung epithelial cells in culture. II Microb. Pathogen. 2002. V. 33. N. 3. P. 109-114.

186. Bacon D.J., Johnson W.M., Rodgers F.G. Identification and characterisation of a cytotoxic porin-lipopolysaccharide complex from Campylobacter jejuni. // J. Med. Microbiol. 1999. V. 48. N. 2. P. 139-148.

187. Bauer F.J., Rudel Т., Stein M., Meyer T.F. Mutagenesis of the Neisseria gonorrhoeae porin reduces invasion in epithelial cells and enhances phagocyte responsiveness. // Mol. Microbiol. 1999. V. 31. N. 3. P. 903-913.

188. Roy S., Biswas T. Murine splenocyte proliferation by porin of Shigella dysenteriae type 1 and inhibition of bacterial invasion of HeLa cell by anti-porin antibody. II FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 141. N. 1. P. 25-29.

189. Тимченко Н.Ф., Новикова О.Д., Павлова Г.Н., Венедиктов B.C., Соловьева Т.Ф. Протективные свойства порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. //Журн. микробиол. 1990. № 11. С. 48-50.

190. Bernardini M.L., Sanna M.G., Fontaine A., Sansonetti P.J. OmpC is involved in invasion of epithelial cells by Shigella flexneri. // Infect. Immun. 1993. V. 61. N. 9. P. 3625-3635.

191. Müller A., Günther D., Brinkmann V., Hurwitz R., Meyer T.F., Rudel Т. Targeting of the pro-apoptotic VDAC-like porin (PorB) of Neisseria gonorrhoeae to mitochondria of infected cells. // EMBO J. 2000. V. 19. N. 20. P. 5332-5343.

192. Gorga F., Galdiero M., Buommino E., Galdiero E. Porins and lipopolysaccharide induce apoptosis in human spermatozoa. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. V. 8. N. 1. P. 206-208.

193. Buommino E., Morelli F., Metafora S., Rossano F., Perfetto В., Baroni A., Tufano M.A. Porin from Pseudomonas aeruginosa induces apoptosis in an epithelial cell line derived from rat seminal vesicles. // Infect. Immun. 1999. V. 67. N. 9. P. 4794-4800.

194. Galdiero M., D'Amico M., Gorga F., Di Filippo С., D'lsanto M., Vitiello M., Longanella A., Tortora A. Haemophilus influenzae porin contributes to signaling of the inflammatory cascade in rat brain. // Infect. Immun. 2001. V. 69. N. 1. P. 221227.

195. Hemandez-Alles S., Alberti S., Alvarez D., Domenech-Sanchez A., Martinez-Martinez L., Gil J., Tomas J.M., Benedi V.J. Porin expression in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. // Microbiology. 1999. V. 45. N. 3. P. 673-679.

196. Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. Химическая характеристика и биологическая активность: Автореф. дис. .канд. хим. наук. Владивосток. 1986. 23 с.

197. Hancock R.E., Carey A.M. Outer membrane of Pseudomonas aeruginosa: heat and 2-mercaptoethanol-modifiable proteins. // J. Bacteriol. 1979. V. 140. N. 3. P. 902-910.

198. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. Purification and characterization of heat-modifiable protein from outer membrane of Escherichia coli. // FEBS Lett. 1974. V. 41. N. 2. P. 195-198.

199. Новикова О.Д., Зыкова T.A., Ядыкина Г.М., Глазунов В.П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Изучение иерсинина основного полипептида внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. // Биол. мембраны. 1985. Т. 2. № 7. С. 714-723.

200. Ichihara S., Mizushima S. Characterization of major outer membrane proteins 0-8 and 0-9 of Escherichia coli K-12. //J. Biochem. 1978. V. 83. N. 4. P. 1095-1100.

201. Старостина H.B. Эпидемиологические и экологические особенности заболеваний, вызываемых Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii и Yersinia intermedia. Автореф. дис. .канд. биол. наук. Москва. 2000. 25 с.

202. Solov'eva T.F., Ermak I.M., Bondarenko (Novikova) O.D., Frolova G.M., Ovodov Yu.S. Studies on a lipopolysaccharide-protein complex from Yersiniapseudotuberculosis. Isolation and characterization. // Microbios. 1979. V. 25. N. 101-102. P. 133-144.

203. Новикова О.Д., Набиуллин A.A., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Выделение и характеристика белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. // Химия природн. соедин. 1983. № 3. С. 359-366.

204. Sproer С., Mendrock U., Swiderski J., Lang E., Stackebrandt E. The phylogenetic position of Serratia, Buttiauxella and some other genera of the family Enterobacteriaceae. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. N. 4. P. 1433-1438.

205. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. N. 24. P. 1404314048.

206. Гузев K.B., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia. // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 10. С. 1338-1345.

207. Capaldi R.A., Vandercooi G. The polarity of many membrane proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA/1972. V. 69. N. 4. P. 930-932.

208. Kyte J and Doolittle RF: A simple method for displaying the hydropathic character of a protien. J Mol Biol 157:105, 1982.

209. Tieleman D.P., Berendsen H.J. A molecular dynamics study of the pores formed by Escherichia coli OmpF porin in a fully hydrated palmitoyloleoylphosphatidylcholine bilayer. // Biophys. J. 1998. V. 74. N. 6. P. 2786-2801.

210. Pagel M., Simonet V., Li J., Lallemand M., B. Lauman, A. H. Delcour Phenotypic Characterization of Pore Mutants of the Vibrio cholerae Porin OmpU/ // J. Bacterid. 2007. Vol. 189. N. 23. P. 8593-8600.

211. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. // J. Mol. Mod. 2001. V. 7. N. 8. P. 307-316.

212. Smart O.S., Goodfellow J.M., Wallace B.A. The pore dimensions of gramicidin. // Biophys. J. 1993. V. 65. N. 6. P. 2455-2460.

213. Smart O. S., Breed J., Smith G. R., Sansom M. S. P. A novel method for structure-based predictions of ion channel conductance properties. // Biophys. J. 1997. V. 72. N. 3. P. 1109-1126.

214. Vostrikova О.Р., Novikova O.D., Kim N.Yu., Likhatskaya G.N., Solovjeva T.F. Pore-forming proteins of genus Yersinia II Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529, No 2. P. 261-263.

215. Benz R., Hancock R.E.W. Properties of the large ion-permeable pores formed from protein F of Pseudomonas aeruginosa in lipid bilayer membranes. // Biochim. Biophys Acta 1981. V. 646. N. 2. P. 298-308.

216. Hall J.E. In: Concepts and Models. Berlin, Heidelberg, New York:Springer-Verlag. 1978. P. 374-531.

217. Vogel H., Jahnig F. Models for the structure of outer-membrane proteins of Escherichia coli derived from raman spectroscopy and prediction methods. // J. Mol. Biol. 1986. V. 190. N. 1. P. 191-199.

218. Финкелыитейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. М.: Книжный дом «Университет», 2002. 376 с.

219. Provencher C.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 34-37.

220. Sreerama N., Woody R.W. Estimation protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON and CDSSTR methods with an expanded reference set. //Anal. Biochem. 2000. V. 287. N. 2. P. 252-260.

221. Brandt J.G., Cagan R.H. Fluorescence characteristics of native and denatured monellin. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 493. N. 1. P. 178-187.

222. Saito J., Tochibana H., Hayashi H., Wada A. Excitation-energy transfer between tyrosine and tryptophan in proteins evaluated by the simultaneous measurement of fluorescence and absorbance. // Photochem. Photobiol. 1981. V. 33. N. 3. P. 289-295.

223. Davoodi J., Wakarchuk W.W., Campbell R.L., Carey P.R., Surewicz W.K. Abnormally high pKa of an active-site glutamic acid residue in Bacillus circulans xylanase. The role of electrostatic interactions. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 232. № 3. P. 839-843.

224. Kleinschmidt J.H., Tamm L.K. Secondary and tertiary structure formation of the 3-barrel membrane protein Omp A is synchronized and depends on membrane thickness. //J. Mol. Biol. 2002. V. 324. N. 2. P. 319-330.

225. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Ким Н.Ю., Василенко А.А. Денатурация OmpF-подобного порина из Yersinia pseudotuberculosis // В кн.: Сообщ. Ill Всеросс. симп. «Белки и пептиды». Пущино. 2007. С. 49.

226. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 1986. С. 262305.

227. Бурштейн Э.А. Люминесценция белковых хромофоров. Природа и применение. Итоги науки и техники. Биофизика. Т.6. М.: ВИНИТИ 1976. 121 е.

228. Mitaku S., Ishido S., Hirano V., Itih H., Kataoka R., Satto N. Hydrophobic core of molten-globule state of bovine carbonic anhydrase B. // Biophys. Chem. 1991. V. 40. N. 3. P. 217-222.

229. Engelhardt M., Evans P. A. Kinetics of interaction of partially folded proteins with a hydrophobic dye: evidence that molten globule character is maximal in early folding intermediates. //Protein Sci. 1995. V. 4. N. 8. P. 1533-1562.

230. O'Keffe A.H., East J.M., Lee A.G., Selectivity in lipid binding in the bacterial outer membrane protein OmpF. // Biophys. J. 2000. V. 79. N. 4. P. 2066-2074.

231. МОЕ (Molecular Operating Environment): http://www.chemcomp.com/Corporate Information/MOE.html

232. Chehin R., Iloro I., Marcos M. J., Villar E., Shnyrov V.L., Arrondo J.L.R. Thermal and pH- induced conformational changes of a (B-sheet protein monitored by infrared spectroscopy. // Biochemistry. 1999. V. 38. N. 5. P. 1525-1530.

233. Уверский B.H. Равновесное разворачивание частично свернутых форм А2 и A3 стафилококковой нуклеазы сопровождается формированием промежуточного состояния. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 4. С. 557-562.

234. Пфайл В. Стабильность и кооперативные свойства частично свернутых белков. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 3. С. 349-359.

235. Дамашун Г., Дамашун X., Гаст К., Цирвер Д. Денатурированные состояния дрожжевой фосфоглицераткиназы. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 3. С. 308-326.

236. Overbeeke N., van Scharenburg G., Lugtenberg U. Antigenic relationships between pore proteins of Escherichia coli K12.// Eur. J. Biochem. 1980. V.110. P.247-254.

237. Roque W.J., Coughlin R.T., McGroarty E.J. Lipopolysaccharide tightly bound to porin monomers and trimers from Escherichia coli K-12. // Bacteriol. 1987. V. 169. N. 9. P. 4003-4010.

238. Safar J., Roller P.P., Gajdusek D.C., Gibbs J.C.,Jr. Scrapie amyloid (prion) protein has the conformational characteristics of an aggregated molten globule folding intermediate. // Biochemistry. 1994. V. 33. N. 27. P. 8375-8383.

239. De Cock H., van Blokland S., Tomassen J. In vitro insertion and assembly of outer membrane protein PhoE of Escherichia coli K-12 into the outer membrane. Role of Triton X-100. // J. Biol. Chem. V.271. N. 22. P. 12885-12890.

240. Sen K., Nikaido H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin. // J. Bacteriol. 1991 V. 173. N. 2. P. 926-928.

241. Diedrich D.L Associations of Escherichia coli K-12 OmpF trimers with rough and smooth lipopolysaccharides. //J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 5307-5311.

242. Федореева Л.И., Горбач В.И. Взаимодействие порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis с липидом А и его синтетическими аналогами. // Биоорган, химия 1993. Т. 19. N.10. С. 933-940.

243. Krasikova I.N., Luk'yanov P.A., Gorbach V.l., Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. D-3-Dodecanoyltetradecanoic acid as a constituent of lipid A from Yersinia pseudotuberculosis. // Experientia. 1984. V. 40. N. 7. P. 709-710.

244. Krasikova I.N., Gorbach V.l., V.V. Isakov, Solov'eva T.F., Ovodov Yu.S. The application of 13C-NMR spectroscopy to study lipid A from Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide. // Eur. J. Biochem. 1982. V. 126. N. 2. P. 349-351.

245. Westphal O., Jann. K. In: Methods in Carbohydrate Chemistry. Whistler R.L., ed. N. Y.: Academic Press. 1965. V.5. P.82-91.

246. Galanos C., Luderitz О., Westphal О. A new method for the extraction of R-lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. V.9. N.2. P.245-249.

247. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Фаир -Пресс., 1999. С. 390-400.

248. Mendel C.M., Licko V., Копе J.P. The effect of ligand heterogeneity on the Scatchard plot. Particular relevance to lipoprotein binding analysis. // J. Biol. Chemistry. 1985. V. 260. N. 6. P. 3451-3455.

249. Aurell C.A., Wistrom A.O. Critical aggregation concentrations of Gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS). // Biochem. Biophys. Res. Com. 1998. V. 253. N. 1. P. 119-123.

250. Блюменфельд Jl.A. Проблемы биологической физики. М.: Наука. 1977. 336 с.

251. Ohno N., Morrison D.C. Lipopolysaccharide interaction with lysozyme. Binding of lipopolysaccharide to lysozyme and inhibition of lysozyme enzymatic activity. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. N. 8. P. 4434-4441.

252. Федореева Л.И., Соловьева Т.Ф. Связывание порина с липополисахаридом из Yersinia pseudotuberculosis. // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. N. 1. С. 17-23.

253. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variations. // Prog. Lipid Res. 1996. V. 35. N. 3. P. 283-343.

254. Fukuoka S., Brandenburg K. Physico-chemical analysis of lipid A fractions of lipopolysaccharide from Erwinia carotovora in relation to bioactivity. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1510. N. 1-2. P. 185-197.

255. Marsh D. Protein-lipid interactions. // In: New Comprehensive Biochemistry. Watts A., ed. Amsterdam: Elsevier. 1993. P. 41-66.

256. Selinsky B.S. Protein-lipid interactions and membrane function. // In: The Structure of Biological Membranes. Yeagle P., ed. Boca Raton: CRC Press. 1992. P. 603-651.

257. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis. // Биохимия. 2001. Т. 66. Вып. 4. С. 511-519.

258. Вострикова О.П., Лихацкая Г.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Антигенное родство и функциональные свойства поринов рода Yersinia. // Биол. мембраны. 2000. Т. 17. № 4. С. 399-409.

259. Arockiasamy A., Kumar P.D., Sundara Baalaji N., Rukmini M.R.,Krishnaswamy S. Folding and structural stability of OmpC from Salmonella typhi: Role of LPS and environment//Curr. Sci. 2004. V.87. P. 197-202.

260. Watanabe Y. Effect of various mild surfactants in the reassembly of an oligomeric integral membrane protein OmpF porin. J.Protein Chem. 2002. V.21. P.169-175.

261. Антонец Д.В., Бакулина А.Ю., Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Новикова О.Д., Максютов А.З. Предсказание антигенно-активных районов OmpF-подобного порина Yersinia pseudotuberculosis // Докл. АН. 2007. Т. 414, № 4. С. 1-3.

262. Schoppet М., Huppertz H.I. Differential stimulation of helper and cytotoxic T cells by dendritic cells after infection by Yersinia enterocolitica in vitro. // Cell Inmmunol. 2001. V. 28. N. 1. P. 43-51.

263. Peters B, Sidney J, Bourne P, Bui HH, Buus S, Doh G, Fieri W, Kronenberg M,

264. Kubo R, Lund O, Nemazee D, Ponomarenko JV, Sathiamurthy M, Schoenberger S, Stewart S, Surko P, Way S, Wilson S, Sette A. The immune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint // PLoS Biol. 2005 Mar;3(3):e91

265. Skok M.V., Komissarenko S.V. Immune response to cytochrome с in BALB/c mice is delayed due to inability of non-specific fntigen-presenting cells to provide its immunodominant epitope. // Immun. Lett. 1995. V. 47. P.87-92.

266. Bolin I, Norlander L, Wolf-Watz H.Temperature-inducible outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid. Infect Immun. 1982 V. 37. N. 2. P. 506-12.

267. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, N 5259. P. 680-685.

268. Гааль Э., Медьеши Гю, Верецкеи Лю Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. 1982. С. 157.

269. Hitchcock P.J., Brown Т.М. Abberant migration of lipipilysaccharide in sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis. // J. Bacteriol. 1983. V. 154. P. 269-277.

270. Markwell MA, Haas SM, Bieber LL, Tolbert NE. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. //Anal. Biochem. 1978. Vol. 87. N 1. P. 206-210.

271. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology / Eds. Hirs C.H.W., Timasheff S.N. N.Y., London: Acad. Pres, 1972. V. 25B. P. 121-139.

272. Беленький Б.Г., Ганкина Е.С., Нестеров В.В. Экспрессный ультра-чувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // ДАН СССР. 1967. Т. 172. С. 91-93.

273. Allen G. Amino acid analyses // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Sequencing of proteins and peptides / Burdon R.H., van Knippenberg P.H., eds. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier, 1989. P. 40.

274. Ichikawa T, Terada H. Second derivative spectrophotometry as an effective tool for examining phenylalanine residues in proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 494, N 1. P. 267-270.

275. Hunkapiller M.W., Hood L.E. Direct microsequence analysis of polypeptides using an improved sequenator, a nonprotein carrier (polybrene), and high pressure liquid chromatography// Biochemistry. 1978. Vol. 17, N. 11. P. 21242133.

276. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, N 3. P. 403-410.

277. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALW windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, N 24. 4876-4882.

278. Towbin H., Stackelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyaorylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications/ // Proc.Natl. Acad. Sci Usa/1979. V. 76. N 9. P. 1621-1629.

279. Winder A.F., Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spectrophoto-metric protein determinations//Biopolymers. 1971. Vol. 10. N. 7. P. 1243-1251.

280. Oberfelder R.W., Lee J.C. Measurement of ligand-protein interaction by electrophoretic and spectroscopic techniques.Meth. Enzymol. -1985. -V. 117. -P. 381-399..342. BaxopuHa

281. Mc Laughlin S.G.A., Szabo G., Eisenman G., Ciani S.M. Surface charge and the conductance of phospholipid membranes //Proc. Nat. Acad. Sci. 1970. Vol. 67, N 3. P. 1268-1275.

282. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 86, N 3. P. 665-684.

283. Lumry R, Biltonen R. Validity of the «two-state» hypothesis for conformational transitions of proteins // Biopolymers. 1966. Vol. 4, N 8. P. 917-944.

284. Sanchez R., Sali A. Advances in comparative protein-structure modelling // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 2. P. 206-214.

285. Baker D., Sali A. Protein structure prediction and structural genomics // Science. 2001. Vol. 294, N 5540. P. 93-96.

286. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H„ Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, N 1. P. 235-242.

287. Guex N. Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis. 1997. Vol. 18, N 15. P. 2714-2723.