Полимерные монолитные материалы для биочипов с контролируемой пористостью и различными реакционноспособными группами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

СИНИЦЫНА Екатерина Сергеевна

ПОЛИМЕРНЫЕ МОНОЛИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ БИОЧИПОВ С КОНТРОЛИРУЕМОЙ ПОРИСТОСТЬЮ И РАЗЛИЧНЫМИ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ГРУППАМИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

17 АПР 2014

005547162

Санкт-Петербург - 2014

005547162

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Тенникова Татьяна Борисовна

Официальные оппоненты:

Курганов Александр Александрович

доктор химических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук, заведующий лабораторией хроматографии

Карцова Людмила Алексеевна

доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт -Петербургский государственный университет», Институт химии, профессор кафедры органической химии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт-

Петербургский технологический институт (технический университет)».

Защита диссертации состоится «29» мая 2014 года в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О. д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высокомолекулярных соединений Российской академии наук (http://www.macro.ru/council/sinitsina_dis.pdf).

Автореферат разослан «03 » о^/^р2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук / // Виноградова Людмила Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Методология получения макропористых полимерных материалов, заключающаяся в одностадийном синтезе сильно сшитых сополимеров в виде монолитных блоков в форме выбранного размера и дизаина (монолитные сорбенты), была разработана и предложена в начале 90-х годов прошлого века. В настоящий момент подобные системы широко используются в качестве твердых сред (неподвижной фазы) при проведении ряда процессов, основанных на массообмене в условиях сквозного потока жидкости или газа (подвижной фазы). В качестве примеров можно привести жидкостную и газовую хроматографию, высокопроточные ферментные реакторы и тд. Повышенный' интерес к- монолитным носителям обусловлен их эффективностью и производительностью, связанной с высокой скоростью межфазового переноса вещества, основанного на механизме конвекции, и, в связи с этим возможностью скоростного разделения биологических объеетов различного строения и размера (белки, ДНК, РНК, вирусы), а также их механической и химической устойчивостью. Вышеперечисленные характеристики позволили данным материалам занять привилегированное место в ряду традиционно используемых сорбентов, получаемых в виде частиц, однако для решения более широкого круга задач необходимость продолжения исследований в области синтеза и применения полимерных монолитов не теряет своей актуальности. При этом одним из наиболее важных вопросов является получение материалов с прогнозируемой поровои структурой, и решение проблемы управления процессом порообразования.

Сравнительно недавно макропористые метакрилатные материалы монолитного типа были впервые предложены для использования в качестве основы при создании микрочипов, предназначенных для высокочувствительного анализа £

ш'сгоаггауз). При сравнении с широко используемыми в данном методе биологического анализа стеклянными носителями (двумерные, или 20-чипы) было установлено, что используемые в качестве операционного слоя макропористые монолитные матрицы (трехмерные, ЗО-чипы), имеют ряд преимуществ, позволяющих существенно повысить чувствительность анализа. Несмотря на высокую практическую значимость данной характеристики, существует ряд свойств обсуждаемых материалов, которые моп/т быть улучшены, например, введением в структуру полимерной матрицы групп, повышающих ее гидрофильность. Дополнительная гидрофилизация поверхности операционного слоя микрочипа арпоп приведет к улучшению условии Для пр™* белком необходимой для< последующего биоаффинного связывания информации, уменьшению влияния неспецифических гидрофобных взаимодеиствии, а также^ поскольку при работе с мйкрочипом используются водные растворы, к улучшению смачиваемости слоя. Также известно, что некоторые белки особенно чувствительны микроокружению. Для этой категории анализируемых объектов создание услов^ максимально приближенных к физиологическим, необходимо для предотвращения денатурации белка или инактивации активного центра в процессе иммобилизации на

пппопуиллтшТВОПППЙ

Там" ''образом,^ поиск ноаых макропористых полимерных материалов позволяющих осуществлять биофункционализацию матрицы в мягких условиях и в короткие промежутки времени, является, несомненно, актуальной задаче*

Цель настоящей работы состояла в разработке методов синтеза новых макропористых полимерных материалов (монолитов) на. основе

эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата), 2-цианозтил^етакрилата и 2 гидооксиэтилметакрила с гидрофильным сшивающим агентом глицерин-1,3-м^етакрилатшл (ГМД-ГДМА, • ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА, соответственно) с кооптируемой паровой структурой и заданной химической функциональностью

поверхности а также в выявлении факторов, определяющих перспективность использования монолитов для построения микроаналитических тест-систем (микрочипов).

Достижение поставленной цели определило следующие задачи:

• синтез новых гидрофильных метакрилатных сильно сшитых сополимеров и оптимизация условий «¡полимеризации, а именно, выбор эффеетивного инициатора, подбор его концентрации, времени реакции и системы порообразующих веществ;

. изучение влияния природы низкомолекулярных и полимерных порообразующих веществ на морфологию и другие характеристики монолитных сорбентов;

• разработка способов химической модификации сополимера на основе глицидилметакрилата и зтиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА); подтверждение введения в структуру матрицы альдегидных, сукцинимидилкарбонатных и имидазолкарбаматных групп;

• исследование факторов, оказыаающих влияние на эффективность введения в структуру макропористого сополимера биоаффинных лигандов;

. изучение закономерностей анализа белков на поверхности гидрофильных макропористых монолитов.

Объектами представленного исследования являлись синтетические макропористые гидрофильные материалы на основе метакрилатных сополимеров, содержащие на поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами молекул белков и ДНК-фрагментов.

В качестве методов исследования использовались: свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация в массе (синтез сильно сшитых гидрофильных метакрилатных сополимеров); методы твердофазного ядерного магнитного резонанса (ЗЭММИ), ИК-спектроскопии и элементного анализа (подтверждение химического спадения' полученных продуктов); интрузионная ртутная порометрия (определение среднего размера пор и распределения их по размерам); растровая (сканирующая) электронная микроскопия (качественная оценка поровой структуры полученных материалов); флуоресцентный анализ (оценка эффективности высокоспецифичных биологических взаимодействий на поверхности разработанных полимерных слоев).

Научная новизна работы состоит в следующем: . разработаны методы синтеза новых макропористых гидрофильных полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров глицидилметакрилата, 2-цианоэтилметакрилата или 2-гидроксиэтилметакрила с глицерин-1,3-диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА) с контролируемой поровой структурой;

• впервые исследована роль полистиролов с различной молекулярной массой как макромолекулярных порообразующих веществ в формировании морфологии монолитных продуктов (структур) и показано соответствие экспериментальных данных теории взаиморастворимости Гильдебранда;

• разработан и оптимизирован алгоритм высокочувствительного анализа ДНК на

_ . ^________. . _______,__>1пмпПит11и7 ППОТ(41ПП1* МШГППиИПа*

поверхности МсИфОПир*1ЫВ1Л ми[1ил»||Пм1л '"""^г...........— .....

• показана возможность создания высокочувствительной аптамер-содержащей тест-системы на основе разработанного микрочипа.

Практическая значимость работы определяется тем, что:

• на основе данных по исследованию влияния низкомолекулярных и полимерных порогенов на поровые характеристики синтезированных монолитных сорбентов предложены научно-практические рекомендации, позволяющие направленно контролировать морфологию монолита и получать материалы с поровой структурой, необходимой для решения конкретных аналитических задач;

макропористые монолитные спои, закрепленные на поверхности стеклянной подложки, могут быть использованы в качестве основы как для высокочувствительного анализа белков, так и для анализа ДНК, по результатам разработанного анализа на определение тяжелого генетического заболевания муковисцидоза установлено, что гидрофильные^ макропористые материалы являются перспективными для анализа генных мутации. Положения, выносимые на защиту:

повышение гидрофильное™ одного мономера или сомономеров приводит к изменению термодинамической совместимости компонентов реакционной системы, и как следствие, оказывает существенное влияние на поровую структуру, . введение в полимеризационную смесь макропорогена полистирола не приводит к

изменению классической микроглобулярной структуры синтезированных образцов, . гидрофилизация поверхности макропористых монолитных матриц позволяет существенно повысить чувствительность биологического анализа на чипе, а также

расширить сферы его применения; . макропористые монолитные слои на основе синтезированных полимеров являются перспективными для высокочувствительного анализа ДНК. _

Обоснованность и достоверность данных и выводов настоящей работы подтверждается хорошей воспроизводимостью всех полученных результатов, их согласованностью при использовании независимых методов исследования полученных

П0ЛАпробВация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений «а спедащк ^^« симпозиумах и конференциях: Санкт-Петербургской конферен.молоды*ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007 2008 2010) International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006);; Balüc Polymer Symposia 2007 (Друскининкай Литва) и 2008 (Отеля Эстония); М=роднои конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва 2009), international Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург Россия, 2008); Monolith Summer Schools (Порторож, Словения, 2008 и 2010), 30* International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides and Polynucleotides

(БОЛПу6ликацииЯП2о°1атериалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых международных и отечественных изданиях, а также 14 тезисов докладов, представленных на вышеуказанных конференциях.

Личный вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в

подготовке докладов и публикаций. ,„«.„„

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (о&зор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение) выводов, списка использованной литературы (189 наименований) и приложении. Работа изложена на 141 странице, включает 11 таблиц и 47 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы, определена научная новизна, охарактеризована пражская значимость полученных результатов, изложены основные положения, выносимые на

ГЛАВА' 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ содержит аналитическое рассмотрение принципов формирования сильно сшитых полимерных сеток с постоянныГитп:0^тЬ071 характеристиками твердых фаз, получаемых в виде частиц и монолитов, методы

б

синтеза полимерных монолитов и области их применения. Проведен сравнительный анализ характеристик материалов, используемых в качестве основы микрочипов. ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ содержит описание методов синтеза гидрофильных полимерных монолитных материалов различного состава с варьируемыми поровыми характеристиками, а также способа получения трехмерного метакрилатного микрочипа на стеклянной подложке. Описаны методы полимераналогичных превращений на поверхности монолитных матриц. Представлены методы ковалентного связывания биолигандов (белков и олигонуклеотидов) с поверхностью макропористого носителя, а также биологического тестирования полученных чипов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Важной задачей при создании биочипов является получение материала, обладающего высокой проницаемостью в сочетании со значительной удельной площадью поверхности, гомогенностью (однородностью) поровой структуры, химической реакционной способностью, позволяющей легко вводить в структуру матрицы различные биологические молекулы. В настоящей работе разработаны методы синтеза на основе метакрилатных мономеров новых гидрофильных монолитных материалов с контролируемыми поровыми характеристиками и содержащих на поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами молекул белков и ДНК-фрагментов. Изучено влияние различных факторов на морфологию монолитных матриц и эффективное введение в её структуру биоспецифических лигандов. Проведена апробация полученных материалов в качестве основы для высокочувствительных тест-систем.

3.1 Синтез и исследование характеристик гидрофильных сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА

Метод свободно-радикальной фотоинициируемой полимеризации использовали для синтеза сополимеров на основе глицидилметакрилата (ГМА), 2-цианоэтилметакрилата (ЦЭМА) и 2-гидроксиэтилметакрила (ГЭМА); в качестве сшивающего агента применяли гидрофильный дивинильный мономер глицерин-1,3-диметакрилат (ГДМА). Формулы мономеров представлены на Рисунке 1.

Функциональные мономеры:

¿Х^о^ч^Ч но—<\А Рисунок 1 - Химические

Т о о структуры использованных

глицидилметакрилат 2-цианоэталметакрилат 2-гидроксиэтилметакрилат МОНОМерОВ.

(ГМА) (ЦЭМА) (ГЭМА)

Сшивающий агент:

аг^-о'

он

глицермИ.З-диметакрилат (ГДМА)

Образование сополимеров подтверждали методами ИК- и ЯМР-спектроскопии. Для сравнения были синтезированы два образца с более гидрофобным сшивающим агентом, а именно, сополимеры глицидилметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА, соответственно). Объёмное соотношение [функциональный мономер]:[сшивающий агент] во всех экспериментах было постоянным и равным 6:4. Выходы сополимеров составляли 8593%. В представленной работе для формирования структуры макропористых полимерных продуктов в качестве порообразующих растворителей были использованы

как низкомолекулярные вещества (додеканол, циклогексанол, гептан, полиэтиленгликоль (Ми = 200), толуол), так и растворы полимеров (полистирола (Ш -44x103; 382x103; 2х106) и полидиметилсилоксана (М\«= 90х103)).

При оптимизации условий синтеза существенным моментом является выбор эффективного инициатора, подбор его концентрации, вариация времени реакции, а также выбор системы порогенов. С этой целью, на примере наиболее гидрофильного ГЭМА-ГДМА сополимера, была исследована возможность использования трех известных фотоинициаторов радикальной полимеризации, а именно, бензофенона, 2-гидрокси-2-метилпропиофенона и 2-метокси-2-фенилацетофенона (Рисунок 2а). Из представленных зависимостей выхода полимерного продукта от времени процесса видно, что бензофенон демонстрирует наименьшую активность. В двух других случаях время' синтеза, обеспечивающее максимальный выход полимерного продукта, оказалось существенно более низким (15 и 20 мин, соответственно). Более универсальным инициатором оказался 2-гидрокси-2-метилпропиофенон.

Из представленной на следующем графике зависимости выхода сополимеров от концентрации выбранного инициатора установлена его оптимальная концентрация, равная 0.8-1.0 масс.% (Рисунок 26).

(а) (6)

—2 — ГМА-ГДМА

Рисунок 2 - Зависимость выхода сополимеров (а) от природы инициатора: 1 - 2-метокси-2-фенилацетофенон; 2 - 2-гидрокси-2-метилпропиофенон; 3 - бензофенон; (б) от концентрации инициатора.

Зависимости выхода сополимеров от времени полимеризации исследовали на примерах образцов, полученных в присутствии различных порообразующих агентов, а именно, низкомолекулярных веществ и растворов полимеров (Рисунок 3). Из графических данных видно, что для алифатических порогенных систем, а также однокомпонентного порогена толуола, оптимальное время полимеризации составляло 20 мин, тогда как в случае использования для порообразования растворов по л и сти р О Л э в толуоле максимальный выход сополимера достигался через 30 мин. Причина замедления скорости процесса полимеризации заключается в поглощении энергии УФ излучения толуолом и звеньями полистирола, что приводит к уменьшению эффективности инициатора. В случае использования низкомолекулярного толуола, также способного к УФ поглощению, скорость процесса разделения фаз оказывается выше таковой, наблюдаемой при использовании высокомолекулярного порогена полистирола, растворенного в том же толуоле. Наблюдаемое ускорение разделения фаз объясняется существенно более высокой вязкостью реакционной смеси, содержащей полимер, по сравнению с вязкостью смеси, в которой в качестве индивидуального порогена выступает толуол.

(а)

(б)

• so я

а. 7« ш | 60 § 50

с

О 4«

U

4 30 о £ 20 Л

Ш ю

- ГМА-ГДМА1% ПС в толуоле

- ГМА-ГДМА дадамиол/циклогекслнол 7

- ЦЭМА-ГДМА додеинол/ПЭГ-200 7:3

10 15 20 25 30 35 Время реакции, мин

100-, 90807060 50 40 30 2010

ГЗМА-ГДМА толуол —ГЭМА-ГДМА1% ПС в толуоле —л— ГЭМА-ГДМА 1% ПДМС в гептане/ додеканол 5:5

10 ' 15 20 25 30 35 Время реакции, мин

Рисунок 3 - Зависимости выхода сополимеров от времени реакции: (а) - ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА; (6)-ГЭМА-ГДМА.

В работе использовали теоретический подход, учитывающий значения параметров растворимости (6) индивидуальных компонентов смеси для оценки термодинамической совместимости порогенов и мономеров. Согласно теории Гильдебранда, возможно выразить количественно интенсивность межмолекулярных взаимодеисгаии компонентов реакционной смеси. Численное значение разницы параметров растворимости характеризует способность веществ к образованию гомогенной термодинамически устойчивой системы, а именно, чем меньше данная величина, тем лучше происходит смешивание компонентов, и наоборот, если-разница существенно больше нуля, система оказывается неустойчивой. В работе руководствовались известными величинами 5 для практически всех компонентов исследованных смесей (Таблица 1).

Таблица 1 - Параметры растворимости

Расчет суммарного вхлада мономеров и порогенов в величину параметра растворимости проводили, применяя формулу для смеси, т.е. рассчитывали произведения параметров растворимости индивидуальных компонентов на объем соответствующего вещества и результаты суммировали. В Таблице 2 приводятся данные сравнения рассчитанных величин и результатов интрузионной ртутной порометрии для сополимера 2-гидроксизтилметакрилата и глицерин-1.3-диметакрилата. Так как соотношение количеств функционального мономера и сшивающего агента в полимеризационных смесях оставалось постоянным, значение суммарного параметра растворимости смеси мономеров для всех систем также было постоянным и равным 22.2 МПа,и. Для формирования макропористых полимерных продуктов необходимо, чтобы разность параметров растворимости мономеров и порогенов существенно отличалась от нуля, т е имело место образование термодинамически неоднородной среды. В противном случае, разделение фаз будет происходить на поздних этапах синтеза с образованием непористой твердой массы. Вариация порогенов позволила получить материалы со

Вещество 5, МПа1'2

ГЭМА 23.3

ГДМА 20.5

Циклогексанол 22.5

Додеканол 21.3

Толуол 18.2

ПС 18.3

Гептан 15.4

ПДМС 14.9-15.5

средним размером пор от 400 до 2100 нм и удельной площадью поверхности от 17 до 40 мг/г (Таблица 2).

Таблица 2 - Характеристики образцов ГЭМА-ГДМА

Условия: время облучения - 20 и 30 мин (для систем с лолистирольными порогенами), концентрация инициатора - 1 масс.%, соотношение функциональный мономер/сшивающий агент - 60/40 об%, соотношение порогены/мономеры - 60/40 об%. Образцы ГЭМА-ГДМА монолита обозначены как Мгэ с соответствующим порядковым номером, (а) 61 ^суммарное значение параметра растворимости мономеров; (б) бг - суммарное значение параметра растворимости порогенов. Размер пор определяли методом интрузионной ртутной порометрии; погрешность измерения составляла 5-7%.

Образец Порогены Соотношение порогенов, об% /ба1-б62/ (МПа1й) Средний размер .пор, нм Удельная площадь поверхности, м2/г

Мгз1 додеканол 100 0.9 800 26

Мгэ2 циклогексанол /додеканол 50:50 0.3 400 40

МгэЗ толуол 100 4.0 2000 17

Мгэ4 1% ПС (Mw=44x103) в толуоле 100 4.0 2100 21

Мгэ5 1% ПС(М„= 382x103) в толуоле 100 4.0 1900 23

Мгэб 1% ПС (Mw=2x106) в толуоле 100 4.0 2000 25

Мгэ7 1% ПС (Mw = 44x103) в смеси толуол/додеканол 70:30 3.1 1450 25

Мгэ8 1% ПС (Mw = 44x103) в смеси толуол/додеканол 50:50 2.3 1250 27

МгэЭ 5% ПС (Mw =44х103) в толуоле 100 4.0 1250 26

Мгэ 10 5% ПС(Mw = 382x103) в толуоле 100 4.0 1200 29

Было установлено, что использование додеканола позволяет формировать материалы со средним размером пор 800 нм (Таблица 2, образец Мгэ1). Введение в полимеризационную смесь циклогексанола способствовало увеличению удельной площади поверхности при одновременном двукратном уменьшении размера пор (Таблица 2, образец Мгэ2). Таким образом, было показано, что уменьшение разности параметров растворимости для мономеров и смеси порогенов (Дб = 0.3) приводит к более позднему разделению фаз. Применение толуола в качестве индивидуального порогена позволило получить материалы со средним размером пор 2000 нм и площадью удельной поверхности 17 м2/г (Таблица 2, МгэЗ). Значение разности параметров растворимости для данного образца составляло Д5 = 4.0. Вероятно, из-за высокой термодинамической несовместимости образующегося полимера и толуола, мономеры стремятся проникнуть в растущие ядра с максимальной скоростью. При этом размеры ядер и образующихся на следующем этапе полимеризации кластеров оказываются больше размеров ядер, формирующихся при использовании более совместимых порообразующих агентов, что, соответственно, приводит к увеличению доли макропср. Таким образом, в случае низкомолекулярных порогенов увеличение

разности параметров растворимости между мономерами и порообраэующини агентами приводит к увеличению среднего размера пор и уменьшению удельной площади

поверхности. прат1чески отсутствуюх работы, посвященные использованию в

качестве порогенов синтетических полимеров при синтезе макропористых монолитов. Единичные исследования, как правило, не содержат систематического объяснения влияния полимера (раствора полимера) на процесс фазового разделения и как следствие, на конечные поровые характеристики материала. В настоящей работе было установлено, что при введении в полимеризационную смесь полистирола с различными молекулярными массами в виде раствора в толуоле с постоянной концентрацией средний размер пор существенным образом не изменялся,_а площадь удельной поверхности увеличивалась в - 1.5 раза (Таблица 2). Полученный результат может быть объяснен постоянством значения разницы параметров растворимости и следовательно, постоянством термодинамической совместимости компонентов. В присутствии полимера вязкость реакционной смеси возрастает, что приводит к увеличению количества растущих ядер и к уменьшению их размера.

Добавление в полимеризационную смесь более совместимого с образующимся полимером додеканола приводило к уменьшению среднего размера пор и увеличению удельной площади поверхности (Таблица 2). Увеличение концентрации растворов полистирола до 5% позволило получить образцы со средним размером пор 1200 нм, пои этом удельная площадь поверхности увеличивалась при постоянстве разности параметров растворимости для порогенов и мономеров. Экспериментальные данные указывают на то. что быстрое разделение фаз и образование макропор обусловлено влиянием используемого растворителя для полистирола - толуола. Также было выдвинуто предположение, что сам полимер является макропорогеном только в том случае, если добавление его в систему приводит к увеличению разницы между параметрами растворимости мономеров и смеси порогенов.

Для реакционных смесей с равными значениями разности параметров растворимости, в которых в качестве парообразующих агентов использовали толуол и растворы полистирола с разной концентрацией, изучали влияние вязкости в системе на размеры пор и величины удельной площади поверхности (Таблица 3). Установлено, что изменение вязкости в 7 раз приводит к увеличению удельной площади поверхности с 17 до 29 м2/г и соответственному уменьшению среднего размера пор с 2000 до 1/ии нм.

Таблица 3 - Зависимость поровых характеристик ГЗМА-ГДМА сополимера от динамической

язкости пол Образец имериэационь Вязкость, мПа-с ои смеси Относительное стандартное отклонение, % Средний размер пор, нм Удельная площадь поверхности, м2/г

МгзЗ 1.1 2 2000 17

Мгэ5 2.4 3 1900 23

МгаЮ 7.7 5 1200 29

Исследование морфологии полученных образцов методом сканирующей электронной микроскопии (Рисунок 4) подтвердило, что введение в полимеризационную смесь растворов полимеров или более совместимого растворителя (додеканола) приводит к уменьшению размера миклоглобул, их более плотной упаковке, и, как следствие, к увеличению удельной поверхности материалов.

Рисунок 4 - Микрофотографии внутренней поверхности (поперечного скола) образцов ГЭМА-ГДМА продукта: (а) пороген - толуол; (б) 1% ПС (Mw=44x103) в толуоле; (в) порогены - 1% ПС (М„ = 2x106) в толуоле; (г) порогены - 1 % ПС (М„ = 44x103) в смеси толуол/додеканол (5/5).

Анализ полученных экспериментальных данных позволил сделать предположение о перспективности матриц - основы микрочипа для синтеза которых была использована смесь порообразующих веществ, состоящая из «хорошего растворителя», отвечающего за образования микро- и мезопор, плохого растворителя (толуола), ответственного за формирование макропор, и полимерного порогена полистирола, введение которого замедляет процесс фазового разделения, что приводит к увеличению удельной площади поверхности макропористого продукта и упорядочению его морфологии.

Для подтверждения эффективного удаления полимерных порообразующих агентов из структуры синтезированного в присутствии 5% раствора ПС (Мл = 382х103) ГЭМА-ГДМА сополимера образец после завершения процесса полимеризации исследовали методом твердофазной ЯМР-спектроскопии. Так, в спектрах сополимеров не обнаружены дополнительные сигналы в области 127.8 м.д. и 146.3 м.д., отвечающие атомам углерода ароматических циклов полистирола.

Учитывая все известные преимущества мономера ГМА, в настоящей работе использовали гидрофильный сшивающий агент глицерин-1,3-диметакрилат (ГДМА). В Таблице 4 представлены данные по оценке поровых характеристик полученных образцов сополимера ГМА-ГДМА в зависимости от системы порогенов. Использования порогенной системы, состоящей из смеси циклогексанола и додеканола, позволило получить образцы со средним размером пор 950 и 1200 нм (Таблица 4, образцы Мгм2 и МгмЗ, соответственно). Согласно данным интрузионной ртутной порометрии образец, синтезированный с применением 1% ПС в толуоле, имел средний размер пор 2500 нм и площадь удельной поверхности 29 мг/г. Увеличение концентрации ПС в реакционной смеси (5% ПС) привело к уменьшению размера пор. Аналогичная тенденция была отмечена при синтезе матриц на основе сополимера 2-гидроксиэтилметакрилата и глицерин-1,3-диметакрилата. Показано, что при переходе от 1% к 5% раствору ПС значение среднего размера пор уменьшается с 2500 до 1500 нм (Таблица 4). Добавление додеканола в систему приводило к уменьшению размера пор. Образцы ГМА-ГДМА сополимера, синтезированные с использованием порообразующих смесей, полученных комбинацией растворов ПС в толуоле с додеканолом, имели значение среднего размера пор порядка 900 нм.

Таблица 4 - Характеристики образцов ГМА-ГДМА сополимера

Условия время облучения - 20 и 30 мин (для систем с полистирольными лорогенами) концентрация 'инициатора - 1 масс%, соотношение Функциональный мономер«ающии агент - 60/40 об%, соотношение порогены/мономеры - 60/40 об/о. ОбразцыI ГМ А Г ДМА монолита обозначены как Мгм с соответствующим порядковым номером^ Размер.пор определяли методом интрузионной ртутной порометрии; погрешность измерения составляла 5-

Образец Порогены Соотношение порогенов, об% Средний размер пор, нм Удельная площадь поверхности, м2/г

Мгм1 додеканол 100 800 33

Мгм2 циклогексанол/додеканол 30:70 950 29

МгмЗ циклогексанол/додеканол 50:50 1200 26

Мгм4 1%ПС (М<» = 382x103) в толуоле 100 2500 29

Мгм5 5% ПС (Ми = 382x103) в толуоле 100 1500 32

Мгмб 1%ПС (М* =382x10Э) в смеси толуол/додеканол 50:50 900 26

Мгм7 5% ПС (М» =382x103) в смеси толуол/додеканол 50:50 900 29

Важным условием использования макропористых монолитов в качестве основы микрочипов является гомогенность лоровой структуры по всему объему синтезированных матриц. На Рисунке 5 представлены микрофотографии образцов сополимера глицидилметакрилата с глицерин-1,3-диметакрилатом. Показано, что образцы полученные с использованием в качестве порообразующих веществ, комбинации циклогексанол/додеканол (30:70) и 1% ПС с = 382x10' в смеси толуол/додеканол (50:50) обладают идентичной структурой внешней поверхности и поперечного скола, и могут быть использованы в качестве операционных слоев биочипов.

12 3 4

Рисунок 5 - СЭМ-изображения образцов сополимера ГМА-ГДМА: (а) - внешняя поаерхность, (б) - поперечный скол. Образцы ГМА-ГДМА полимерного продукта. 1 - порогеньк циклогексайьл/додеканол, 30:70, 2 - лороген-толуол, 3 - порогены: 1% ПС с М« - 382х ,0 в толуоле, 4 - порогены: 1% ПС с Ми = 382х103 в смеси толуол/додеканол, 50:50.

Определение краевых углов смачивания для стандартной ГМА-ЭДМА матрицы и исследуемого ГМА-ГДМА сополимера проводили по методу «лежащей капли». Результаты измерений представлены в Таблице 5. Для проведения эксперимента использовали сополимеры ГМА-ЭДМА и ГМА-ГДМА, синтезированные а отсутствие порообразующих агентов. Показано, что введение в полимеризационную систему

сшивающего агента с большей гидрофильносгью приводит к изменение контактного угла смачивания на 15°.

Таблица 5 - Краевые углы смачивания для матриц на основе ГМА-ГДМА и ГМА-ЭДМА

сополимеров Образец CA (М) П

ГМА-ГДМА 50.6 + 0.46

ГМА-ЭДМА 66.8 ± 0.72

В представленной работе в качестве функционального мономера также использовали 2-цианоэтилметакрилат (ЦЭМА). В Таблице 6 приведены характеристики образцов сополимера цианоэтилметакрилата с глицерин-1,3-диметакрилатом. В качестве порообразующих агентов, помимо циклогексанола, додеканола и растворов полистирола, использовали полиэтиленгликоль (Ми = 200). Все образцы имели узкое распределение пор по размерам.

Таблица 6 - Характеристики образцов сополимера ЦЭМА-ГДМА

Условия: время облучения - 20 и 30 мин (для систем с полистирольными, ПС, порсгенами), концентрация инициатора - 1 масс%, соотношение функциональный мономер/сшивающий агент - 60/40 об%, соотношение порогены/монсмеры - 60/40 об%. Образцы ЦЭМА-ГДМА монолита обозначены как Мцэ с соответствующим порядковым номером. Размер пор определяли методом интрузионной ртутной порометрии; погрешность измерения составляла 57%.

Образец Порогены Соотношение порогенов, об% Средний размер пор, нм Удельная площадь поверхности, м2/г

Мцэ1 циклогексанол 100 100 68

Мцэ2 додеканол 100 550 40

МцэЗ циклогексанол/додекзнол 50:50 500 33

Мцэ4 ПЭГ200/додеканол 30:70 850 28

Мцэ5 ПЭГ 200/додеканол 50:50 550 25

Мцэб Толуол 100 - -

Мцэ7 1%ПС (Mw =382х10э) в толуоле 100

Мцз8 1%ПС (М» =382x103) в смеси толуол/додеканол 70:30 2250 27

МцзЭ 1%ПС (Mw =382x103) в смеси толуол/додеканол 50:50 1400 20

Путем вариации порообразующих агентов было получено девять образцов полимерного продукта ЦЭМА-ГДМА со средним размером пор в пределах 100-2250 нм и удельной площадью поверхности 20-68 м2/г (Таблица 6). Установлено, что использование в качестве индивидульного порогена циклогексанола приводило к получению материала со средним размером пор, равным 100 нм (Таблица 6, образец Мцз1). Полная замена циклогексанола на более гидрофобный додеканол способствовала увеличению среднего размера пор до 550 нм (Таблица 6, образец Мцэ2), в то время, как замещение части циклогексанола на додеханол приводило к формированию материала с близкой величиной среднего размера пор (500 нм, образец МцзЗ). Близкие значения размера пор были получены также при использовании комбинации в равных долях додеканола и ПЭГ 200 (образец Мцэ5). В то же время увеличение доли додеканола в данной смеси позволило получить образцы со

средним размером пор 850 нм (образец Мцэ4). Использование в качестве порогенов толуола, а также 1% раствора ПС в толуоле (образцы Мцэб и Мцз7) приводило к формированию неоднородной структуры сополимера при низком выходе продукта (менее 70%). Добавление додеканола в качестве сопорогена способствовало увеличению выхода продукта (85%). При этом средний размер пор уменьшался с увеличением доли додеканола, а именно, 2250 и 1400 нм для образцов Мцэ8 и МцэЭ, соответственно.

Для оценки количества нитрильных групп, введенных в структуру сополимера, использовали метод злементного анализа. Содержание мономера 2-цианоэтилметакрилата составляло 66±1 мол%.

3.2 Модификация ГМА-ЭДМА сополимера

В. работе также использована другая стратегия получения гидрофильных макропористых матриц, содержащих в структуре реакционные группы, а именно, химическая пост-модификация синтезированного ранее более гидрофобного сополимера глицидилметакрилата и зтиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА) путем полимераналогичных превращений эпоксидных групп твердого продукта. Достоинством использования полимераналогичных превращений для введения аысокореакционно-способных групп, предназначенных для последующей реакции с биоспецифическим лигандом, является сохранение поровой структуры исходного сополимера, что очень важно для стандартизации биологических анализов. В качестве вводимых в структуру ГМА-ЭДМА сополимера групп были выбраны альдегидные, сукцинимидилкарбонатные и имидазолкарбаматные. Введение указанных групп осуществляли двустадийными реакциями, представленными на Рисунке 6.

(а)

b

сн-^сн2 о

o.t м h2so<

-ск2 I

он

(6)

5% НЮ,

-сн, он

н

S»

[Л-О-С-О-Ч

jJSMlHa

2 N.B11,

■сн2—NH—iH

ДМАП

СгглЗ

сн-сн2-о—с-он Ä

-o-f

ДМАП

/^N I®—МНгп

AJ ~ ' П -

• Ц—сн—сн2-о-он

-с—NH-@

О

-сн2-о—с— о

Рисунок 6 - Схемы твердофазных полимераналогичных реакций, используемых для модификации ГМА-ЭДМА сополимера (а) кислотный гидролиз эпоксидных групп; (б) введение реакционных групп и иммобилизация аминосодержащего биологического лиганда. ДМАП - 4-(диметиламино)пиридин.

Первым этапом всех приведенных выше реакций является кислотный гидролиз нативных эпоксидных групп ГМА-ЭДМА сополимера с образованием вицинального диола. Для исследования данной реакции использовали метод ИК-спектроскопии. Количественную оценку степени гидролиза осуществляли, используя метод внутреннего стандарта. Степень конверсии эпоксидных групп составляла 80%.

Согласно данным, полученным методом интрузионной ртутной порометрии, средний радиус пор увеличивался на 50 нм, суммарная доля пор с размерами выше

500 им также возрастала от 87 до 90%. Важно отметить, что образцы макропористого материала, полученные после гидролиза эпоксидных групп ГМА-ЭДМА сополимера, сохраняли гомогенность и механические свойства исходной матрицы.

Для генерации альдегидных групп в структуре макропористого сополимера, полученного в результате гидролиза элоксигрупл ГМА-ЭДМА продукта, использовали метод окисления гидроксилов избытком йодной кислоты. Наличие альдегидных групп в окисленных образцах подтверждали качественно специфической реакцией с фуксинсернистой кислотой (реагент Шиффа).

Превращение гидроксильных групп сополимера 2,3-дигароксипропилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ДГПМА-ЭДМА) путем реакции с

дисукцинимидилкарбонатом проводили в ацетонитриле с использованием а качестве катализатора 4-(дшеталамино)пиридина (ДМАП). Количество модифицирующего агента соответствовало - 20%-ой конверсии гидроксильных групп. Данная степень конверсии должна обеспечивать достаточную поверхностную концентрацию шгандов и сохранить' необходимое количество интактных гидрофильных ОН-групп. Введение сукцинимидшжарбонатных групп подтверждали методом ИК-спектроскопии. Наличие полосы поглощения в области 1790 см"1 свидетельствует о появлении в составе

сополимера пятичленного имидного цикла.

Реакцию модификации ДГПМА-ЭДМА карбонилдиимидазолом проводили в условиях, аналогичных предыдущему случаю. Процесс осуществляли в условиях недостатка и избытка модифицирующего агента по отношению к содержанию гидроксиильных групп. Введение в структуру сополимера имидазолкарбаматных групп подтверждали методом ИК-спеетроскопии (появление характеристических полос в области 1804 см-1) Для количественной оценки имидазолкарбаматных групп, введенных в структуру метакрилатного сополимера, использовали метод элементного анализа Содержание азота в образце, полученном при использовании двукратного избытка реагента, составляло 2.2 % при степени конверсии, равной 30 %.

С целью оптимизации процесса биофункциолизации поверхности модифицированных образцов изучено влияния факторов, а именно, времени реакции модификации и последующей иммобилизации белка, рН реакционной среды и концентрации раствора лиганда, а также температуры. Для определения оптимального времени ковалентного связывания бшлиганда с полученными полимерными материалами была исследована зависимость количества иммобилизованного белка (бычьего сывороточного альбумина, БСА) от времени реакции. Как видно из данных, представленных на Рисунке 7, максимальное значение связанного БСА достигается через 6 ч для всех грех модифицированных форм полимерного материала.

Рисунок 7 - Зависимость количества ковалентного присоединенного БСА к поверхности модифицированных

материалов от времени реакции.

Время реакции иммобилизации, ч

Максимальное связывание, равное 0.2 мкмоль белка/г сорбента и достигаемое при реакции е-аминогрупп БСА с эпоксидными группами ГМА-ЭДМА сорбента за 16 ч, в

случае превращения эпоксидов в альдегидные группы составляет всего 2 ч, а для сукцинимидкарбокатных для имидазолкарбаматных носителей количество иммобилизованного белка через 2 ч оказалось в полтора раза выше по сравнению с количеством, иммобилизованном на эпоксисодержащем носителе. Таким образом, показано, что применение модифицированных матриц позволяет значительно уменьшить время биофункционализации, при этом емкость макропористых материалов может быть существенно увеличена.

3.3. Апробация разработанных материалов в режиме биологического анализа в

формате микрочипов

3.3.1. Анализ белков на поверхностях гидрофильных платформ биочипа

Сополимер 2-гидроксиэтипметакрилата и глицерин-1,3-диметакрилата не содержит в своем составе групп, которые могут непосредственно вступать в реакцию с аминогруппами белка. Проблема может быть решена двумя путями: модификацией сополимера путем введения имидазолкарбоматных групп или активацией карбоксильных групп белка с использованием реакции с гидроксибензотриазолом и водорастворимым карбодиимидом. В обоих случаях время иммобилизации лиганда составляло 4 ч. Разработанные гидрофильные материалы были апробированы в качестве операционных слоев микрочипа для анализа белков и ДНК. В случае анализа белков мышиный иммуноглобулин выполнял функцию биоспецифического лиганда, иммобилизованного на поверхности полимерной матрицы, тогда как растворенный коньюгат антител против мышиного иммуноглобулина С с флуоресцентной меткой СуЗ рассматривался как комплементарный биоаналит. Полученные результаты для модифицированных ГМА-ЭДМА и ГЭМА-ГДМА, а также синтезированных ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА полимерных матриц сопоставлены как с данными для широко применяемых на практике двухмерными стеклянными чипами с реакционно-способными альдегидными группами, так и с результатами, полученными на ЭР чипах на основе исследованных ранее ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА сополимеров. Для оценки потенциала разработанных тест-систем исследовали несколько критериев, а именно, абсолютную интенсивность флуоресцентного сигнала, относительную интенсивность сигнала, и соотношение сигнал/шум. В сериях синтезированных образцов был проведен отбор наиболее перспективных носителей. На Рисунке 8 представлены данные для серии лучших гидрофильных матриц, коммерческих стеклянных слайдов, а также исследованных ранее слоев на основе сополимера ГМА-ЭДМА. Показано, что при увеличении концентрации лиганда на поверхности монолитных слоев возрастает значение величины соотношения сигнал/шум. Этот результат противоположен данным, полученным на двумерных стеклянных подложках, где увеличение концентрации связываемого с поверхностью белка приводит к значительному увеличению поверхностной плотности привитых макромолекул лиганда, что, в свою очередь создает стерические затруднения при образовании комплементарных биологических пар. Как следствие, чувствительность (эффективность) анализа падает. В случае макропористых 30 платформ имеет место распределение белка в объеме слоя и, таким образом, поверхностная концентрация лиганда оказывается оптимальной для преодоления стерических эффектов.

Представленные результаты свидетельствуют о более высокой эффективности макропористых гидрофильных материалов по сравнению как с двумерным стеклянным микрочипом, так и более гидрофобным монолитным носителем на основе сополимера глицидилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом. Сравнение 20 чипа с лучшим образцом ГМА-ГДМА полимерного материала показывает 10-кратное увеличение аналитической чувствительности.

Для синтеза ГМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА операционных слоев (платформ) использовали порообразующую систему 1% ПС в толуоле с добавлением додеканола (50:50 об. %).

Рисунок 8 - Зависимость параметра сигнал/фон от концентрации наносимого раствора мышиного иммуноглобулина в Условия: концентрация наносимого лиганда варьировалась от 0.2 до 1.0 мг/мл, объем наносимой пробы 200 пиколитров, каждую концентрацию наносили в серии 10 повторов; буферный раствор для иммобилизации - ФСБ (рН 7.5); время реакции связывания лиганда: стеклянный слайд - 2 ч, ГМА-ЭДМА и ГМА-ГДМА - 16 ч, модифицированные 1,1-карбонилдиимидозолом ГМА-ЭДМА и ГЭМА-ГДМА -4 ч, карбодиимидная иммобилизация белка на поверхности ГЭМА-ГДМА -4 ч; температура реакции - 37°С, концентрация комплементарных антител - 200 нг/мл.

£ >х

3

3

о ж

I-

о о о

0.2 0.4 0.6 0.8

Концентрация мышиного !дС,

мг/мл

3.3.2. Применение макропористых монолитов для создания ДНК-чипов

Учитывая большой практический интерес к системам, предназначенным для анализа ДНК, перспективной представлялась идея впервые использовать монолитные носители для конструирования ДНК-чипа. Разработка алгоритма анализа ДНК на поверхности монолитных слоев включала несколько стадий: оптимизацию условий иммобилизации биологических лигандов; подбор условий блокирования поверхности, снижающей влияние шумового сигнала, а также условий аффинного связывания иммобилизованного нуклеотида с ДНК. Протокол ДНК-анализа с использованием модельной пары был разработан и оптимизирован на ГМА-ЭДМА матрице. Сравнительный анализ результатов тестирования разных образцов монолитных материалов, используемых в качестве платформ для ДНК-чипов, показал, что наиболее эффективными являются образцы ГМА-ГДМА И ГЭМА-ГДМА материалов, полученных с использованием в качестве порообразующих веществ: 1% раствора ПС в толуоле в сочетании с додеканолом (5:5, Рисунок 9). Аналогично анализу белков, более гидрофильные матрицы демонстрируют преимущество и в данном виде биотеста.

При сравнении со стандартным стеклянным слайдом установлено, что макропористые полимерные слои демонстрируют более высокую чувствительность анализа, а рН 7.0 и концентрация 50 мкмоль/л олигонуклеотидов являются оптимальными для иммобилизации коротких лигандов. Показано, что время иммобилизации нуклеотидного лиганда на поверхности макропористых матриц по сравнению со временем иммобилизации на стеклянных платформах а 2.5 раза меньше и составляет б ч против 16 ч, обычно используемых для 20 чипа (Таблица 7). Процесс гибридизации на поверхности монолитных носителей также протекает в 3.5 раза быстрее, чем на двумерной поверхности.

Таблица 7

Рисунок 9 - Сравнение параметра чувствительности при детектировании ДНК на различных чипах

Условия: для ГМА-ЭДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ЭДМА

использовали коэффициент

усиления ФЭУ, равный 350, для ГЗМА-ГДМА - 400, для стеклянных слайдов - 600.

Концентрация В 4142 GroES , мкмоль/л - Времена иммобилизации и гибридизации, коэффициенты изменчивости (лиганд ■

тагонуклеотид В 4142 с Матрица rots) Время иммобилизации лиганда, ч Время гибридизации, ч Ki, % Кг, %

Стеклянный слайд 16 14 16 19

ГМА-ЭДМА 6 4 S 10

ГМА-ГДМА 6 4 6 11

ЦЭМА-ЭДМА 6 4 12 13

ЦЭМА-ГДМА . 6 4 ' 9 10

ГЭМА-ГДМА 6 4 5 11

Важным параметром воспроизводимости результатов микроанализа, полученных с использованием той или иной поверхности, является коэффициент изменчивости (К), который представляет собой отношение стандартного отклонения значения интенсивности Флуоресценции к значению интенсивности флуоресценции. Различают коэффициент изменчивости сигналов, полученных в одном эксперименте на одном носителе (К,) и коэффициент изменчивости сигналов, полученных при исследовании ряда носителей данного типа (Кг). В Таблице 7 представлены коэффициенты изменчивости, рассчитанные для синтезированных сополимеров и стеклянных 2D платформ Установлено, что все полученные образцы удовлетворяют требованиям, предъявляемым к материалам платформы биочипа, а значения коэффициентов изменчивости не превышают 13%. Воспроизводимость для разработанными макропористыми матриц оказалась лучше по сравнению с стеклянными тест-системами.

Созлание тест-системы на основе монолитов для выявления муковисцидоза. Муко'висцидоз (MB) представляет собой одну из наследственных оолезнеи. для определения возможности использования разработанных материалов е качестве платформ для диагностики данного генетического заболевания анализировали два вида продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно, продует, содержащим широко распространенную мутацию del21 kb. а также аналогичный фрагмент гена без мутации. В качестве зондов (лигандов) на поверхность мак

наносили олигонуклеотиды: Y1 (ТСАТССТССЬЬАААА iaiij, m.

(CATCCTCTGGAAAATATTC) и Y3 (GGCTTGTCTTTTACCCTGC). Установлено что, в случае мутации гена происходит его связывание с комплементарным

олигонуклеотидным зондом УЗ, (Рисунок 10а). Разработанный метод анализа позволил достоверно различать отрицательные (фрагменты здоровой ДНК (Рисунок 10а 1)) и положительные (Рисунок 10а 2), т. е. содержащие мутацию пробы генного материала. Показано (Рисунок 106), что, как и в случае модельных биокомплементарных пар, максимальная чувствительность обнаружена на гидрофильных матрицах на основе ГМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА сополимеров, синтезированных с использованием комбинации порообразующих веществ 1% раствора ПС в толуоле и додеканола соотношение 5:5 об/об. I Г

(а) (б)

1 2 У1У2УЗ У1У2УЗ

норма

мутация

Концентрация УЗ, мкмоль/л

Рисунок 10 - Диагностика муковисцидоза, выполненная на монолитных чипах: (а) изображение ГМА-ЭДМА чипа после гибридизации иммобилизованных лигандов Y1, Y2 и УЗ с ПЦР продуктами, содержащими генетический материал без мутаций (1, отсутствие флуоресцентных зон) и аналогичного фрагмента гена с мутацией (2, светящиеся зоны, подтверждающие образования специфического связанного с лигандом УЗ комплекса); (б) сравнение эффективности теста в зависимости от природы используемого материала чипа. Условия: буфер для иммобилизации пробы - 0.45 М натрим-хлоридно-цитратный буфер (НХЦБ), рН 7.0; все зонды (Y1, Y2, и УЗ) наносили в серии из 10 повторов; время иммобилизации -2ч при 80 °С и 4 ч при комнатной температуре; время гибридизации - 4 ч; для ГМА-ЭДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ЭДМА чипов использовали коэффициент усиления ФЭУ 550, для ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА - 450 и 600, соответственно.

Аптамер-содержащие микроаналитические линейки для детектирования белков. Этапом работы, представляющим практический интерес, являлся поиск возможностей получения биочипа с иммобилизованными в качестве лиганда аптамерами, олигонуклеотидами, способными к специфическому связыванию как с белком, так и с нуклеиновой кислотой. В работе в качестве детектируемой молекулы-мишени использовали белок. Необходимым условием для связывания с анализируемым объектом является принятия олигонуклеотидом трехмерной конформации. С этой целью в структуру полимерной матрицы предварительно вводили спейсер (полиэтиленимин, модифицированный по концам аминогруппами, Mw = 800), обеспечивающий пространственную подвижность короткоцепочечного лиганда.

Концентрационный интервал для аптамера 6Н7 составлял от 100 до 400 мкмоль/л, а для флуоресцентно меченого 6Н7-СуЗ - от 10 до 200 мкмоль/л. Иммобилизацию проводили в фосфатно-солевой буфере (ФСБ), рН 7.5. в течение 14 ч. С целью, дезактивации остаточных аминогрупп на поверхности макропористых матриц слои

помещали в раствор янтарного ангидрида в ДМСО, затем, для снижения влияния анализа.

(а) <6>

6Н7

вН7

■ 1Ж

ДНИ

С 1 Нв

ян шшш

ВДВ

Вя №

100

200 300 400

Концентрация 8Н7, мкыоль?п

6Н7СуЗ бНТСуЗ оеэспейсера со спенсером

Р,Я„о.11-Аптэ»-сол«В».».™№С.сте»» „„„и» лиг.»., с

для стеклянной платформы - 400.

Рисунок г,б показывает результаты, полученные на трех видах платформ^ ста—го слайда, содержащего на поверхности альдегиду матицы и гидрофильной ГМА-1ДМА подложки, о ы.умсв ;;--■■•

достигнуты при использовании гидрофильнои платформы.

ВЫВОДЫ

1 Ппи использовании свободно-радикальной фотоинициируемой полимеризации разработаны методы синтеза новых макропористых гидрофильных полимерных материалов (м0нолитов) на основе сополимеров 2,3-зпоксипропилметакрилата

(глицидилметакрилата), 2-цианозтилметакрилата и 2-гидрохсиэтилметакрила с глицерин-1,3-диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА, соответственно) с контролируемой поровой структурой. 2 Установлены основные закономерности формирования поровой структуры монолитов на стадии синтеза в зависимости от условий полимеризации. Впервые исследована роль полистиролов с различной молекулярной массой как макромолекулярных порообразующих веществ в формировании морфологии монолитных структур. Показано, что экспериментальные данные согласуются с теорией взаиморастворимости Гильдебранда.

3. Путем химических превращений эпоксидных групп сополимера глицидилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом получены макропористые монолитные носители, содержащие реакционные альдегидные, сукцинимидилкарбонатные и имидазолкарбаматные группы. Оптимизированы условия введения в структуру матрицы биоаффинных адсорбционных центров (лигандов).

4. Показано, что монолитные слои сополимеров, синтезированных на поверхности специальных стеклянных пластин, могут быть использованы в качестве универсальной основы при создании аналитических тест-систем (биочипов), предназначенных для детектирования наноколичеств белков и ДНК.

5. Установлено, что разработанные гидрофильные макропористые материалы обеспечивают более высокую чувствительность анализа по сравнению с двумерным стеклянным чипом и тест-системой на основе более гидрофобного монолита глицидилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом.

6. На примере решения практической задачи диагностики муковисцидоза показана перспективность синтезированных материалов для анализа генных мутаций.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1 Синицынз, Е.С. Монолитные метакрилатные полимерные сорбенты: разработка методов химической модификации поверхности для последующей биоаффиннои функционализации / Е.С. Синицына, E.H. Власова, Е.Г. Влах, Т.Б. Тенникова // Журнал прикладной химии. - 2008. - Т. 81, № 8. - С. 1326-1332.

2. Sinitsyna, E.S. New platforms for 3-D microarrays: Synthesis of hydrophilic polymethacrylate monoliths using macromolecular porogens / E.S. Sinitsyna, Yu.N. Sergeeva, E.G. Vlakh, N.N. Saprikina, T.B. Tennikova // Reactive and Functional Polymers. -

2009.-V. 69.-P. 385-392. .

3 Sinitsyna, E.S. Hydrophilic methacrylate monoliths as platforms for protein microarray / E.S. Sinitsyna, E.G. Vlakh, M.Yu. Rober, T.B. Tennikova II Polymer. - 2011. - V. 52. - P. 2132-2140.

4 Синицына, E С. Макропористые полимерные материалы для биоаналитических микрочипов I Е.С. Синицына, М.Ю. Робер, Е.Г. Влах, Т.Б. Тенникова II Журнал

прикладной химии.-2011.-Т. 84, №6.-С. 988-994.

5 Sinitsyna ES. Macroporous methacrylate-based monoliths as platforms for DNA microarrays I E.S. Sinitsyna, J.G. Walter, E.G. Vlakh, F. Stahl, С. Kasper, T.B. Tennikova II Taianta. - 2012.-V. 93. - r.139-146.

6 Slabospitskaya, M.Yu. Bioanalytical test-systems based on polymer monolithic matenais / M Yu Slabospitskaya. E.S. Sinitsyna, E.G. Vlakh, T.B. Tennikova II International Congress on Analytical Sciences. 25-30 June, - 2006. - Moscow. - Book of abstracts. - P 248.

7 Синицына E С. Модификация макропористого сополимера, предназначенного для биологического микроанализа / Е.С. Синицына, Е.Г. Влах, Т.Б. Тенникова И 3-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». 17-19 апреля, - 2007. - Санкт-Петербург. - С. 124.

8 Vlakh, E. Rigid macroporous methacrylate-based copolymers for 3-D protein microarray / E Vlakh M. Slabospitskaya, E. Sinitsyna, T. Tennikova II Baltic Polymer Symposium 2007. Seotember 19-21 - 2007. - Druskinikai. - Book of abstracts. - P. 38. Г sTnitsyna, E Macroporous methacryalte-based polymer supports: differen modification techniques for 3-D biochips preparation / E. Sinitsyna. E. Vlakh, ^Tenn.kova. II Proceed,ngs of Baltic Polymer Symposium 2007. September 19-21, - 2007. - Druskm.ka,. -P та-76

10 Sinitsyna, E. Synthesis and investigation of macroporous solid copolymer based on 2 3-epoxypropyl methacrylate-co-glycerol dimetahcrylate I E. Sinitsyna, YuS.^rgeeva E Vlakh T Tennikova II 4-th Saint-Petersburg Young Scientists Conference «Modem Problems of Polymeric Science». April 15-17, - 2008. - St.-Petersburg. - Book of abstracts. - P. 50.

11 Vlakh E. Hydrophilic macroporous polymer monoliths: synthesis and investigation / E. Vlakh, E. Sinitsyna, Yu. Sergeeva, T. Tennikova II Baltic Polymer Symposium 2008. - May 13-16 - 2008. - Otepaa. - Book of abstract. - P. 70.

12 Slabospitskaya, M. Novel functional methacrylate monoliths bearing reactive cyano groups / M Slabospitskaya, E. Maksimova, E. Sinitsyna, E. Vlakh, T. Tennikova //3d International Monolithic Summer School and Symposium: Applications in Biochromatography Bioconversion and Solid Phase Synthesis. May 30-June 4, - 2008. - Portoroz. - Book of

13StrSteyPna36E. Application of polymeric porogens for slynthesis f ^drophüic methacrylate-based monoliths / E. Sinitsyna, Yu. Sergeeva E. Vlakh T. Tennikova // 3d International Monolithic Summer School and Symposium: Appl,cations ,n B.ochrom t hy Bioconversion and Solid Phase Synthesis. May 30-June 4, - 2008. - Portoroz. - Book of

14StrSinitsyna! E.S. Synthesis and investigation macroporous solid copolymer based on 2,3 epoxypropyl methacrylate-co-glycerol dimethacrylate / E.S. Sinitsyna Yu.N fergeeva, Ig vfakh T.B Tennikova II 6th International Symposium «Molecular Order and Mobilrty ,n Polymer Systems». June 2-6, - 2008. - Saint-Petersburg. - Book of abstracts. - P. 228.

15 Синицына, E.C. Синтез полимерных материалов монолитного типа с использованием макромолекулярных порогенов / Е.С. Синицына, Е.Г Вла>,/ 16 Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых

«Ломоносов». 14-17 апреля,-2009.-Москва. Р-119.

16 Sinitsyna, Е. Macroporous monolithic materials: universal platforms for protein and DNA microarray / Ё. Sinitsyna, M. Rober, E. Vlakh, J. Walter, C. Kasper, Т. Tennikova II 4th Monolith Summer School and Symposium: Applications m Biochromatography Bioconversion and Solid Phase Synthesis. May 29 - June 2, - 2010. - Portoroz. - Book of

,17StrsStsyna,3E.' Macroporous monolithic materials as platform for three-dimensional DMA microarrays / E. Sinitsyna, E. Vlakh, J. Walter, C. Kasper, Т. Tennikova // 30th International Symposium on the Separation of Protein Peptides and Polynucleotides. September 5-8, -2010.-Bologna.- Book of abstracts. -P. 337.

18 Walten J.G. Microarray-basiertes Screenig von Aptameren fur analytische Methoden / J.G. Walter, M. Lübbecke, G. Zhu. E. Sinitsyna. F. Stahl, T- Scheper II DEC HE MA, . . . ____i^krcctortunrt gpntprribPr 21-23, -2U1U.

Jahrestagung der Biotecnnotogen und riuucoonci- -з- " --■

Chemie Ingenieur Technik.-2010.-V. 82, №9.-P. 1551.

19. Синицына Е.С. Микрсчипы для анализа белков и ДНК на основе гидрофильных макропористых материалов / Е.С. Синицына, Е.Г. Влах, Т.Б. Тенникова. II 6-th Saint-Petersburg Young Scientists Conference «Modern Problems of Polymenc Science». October 18-21, - 2010. - Saint-Petersburg. - Book of abstracts. - P. 102.

Бесплатно

Автореферат отпечатан в ИБС РАН. Ризография. Тираж 100 экз.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201455393

СИНИЦЫНА Екатерина Сергеевна

ПОЛИМЕРНЫЕ МОНОЛИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ БИОЧИПОВ С КОНТРОЛИРУЕМОЙ ПОРИСТОСТЬЮ И РАЗЛИЧНЫМИ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ГРУППАМИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: профессор, д. х. н. Тенникова Татьяна Борисовна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014

Список сокращений

БСЛ - бычий сывороточный альбумин ГДМА — глицерин-1,3-диметакрилат ГМА - глицидилметакрилат ГЭМА— 2-гидроксиэтилметакрилат ДГПМА — дигидроксипропилметакрилат ДНКаза I- дезоксирибонуклеаза I ДМАГТ — 4-(диметиламино)-пиридин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ - дитиотреитол ДВБ - дивинилбензол КДИ - карбодиимид

кДНК-комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота К— коэффициент изменчивости MB - муковисцидоз

НХЦБ - натрий-хлоридно-цитратный буфер ПДМС — полидиметилсилаксан ПС - полистирол

ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль СИТР- соевый ингибитор трипсина СТ - стирол

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦЭМА - 2-цианоэтилметакрилат

ЭДМА - этиленгликольдиметакрилат

X — параметр взаимодействия Флори-Хагинса

S — параметр растворимости

CF - cysticfibrosis

CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dNTP's - deoxyribonucleotide triphosphates

IgG - иммуноглобулин G

MES - 2-(ТЧ-морфолин)-этаисульфоновая кислота

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений...................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................7

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................12

1.1 Формирование сильно сшитых полимерных сеток с постоянными поровыми характеристиками....................................................................................................................12

1.2 Фазовое разделение в синтезе сшитых систем...........................................................13

1.2.1 Модели фазового разделения (макро- и микросинерезис).........................................14

1.3 Влияние процесса сшивки на формирование поровой структуры...............................17

1.3.1 Механизм формирования пор в полимерных частицах..............................................18

1.3.2 Влияние времени реакции на формирование поровой структуры полимерных частиц..........................................................:.............................................................................19

1.4 Полимерные монолиты.....................................................................................................21

1.4.1 Особенности полимеризации в массе...........................................................................22

1.5 Влияние параметров синтеза на поровую структуру полимерных монолитов...........24

1.5.1 Влияние времени полимеризации.................................................................................25

1.5.2 Температура.....................................................................................................................25

1.5.3 Влияние порообразующих агентов...............................................................................26

1.5.4 Мономеры........................................................................................................................28

1.5.4.1 Влияние сшивающего агента......................................................................................28

1.5.4.2 Функциональные мономеры.......................................................................................31

1.6 Введение в структуру твердых фаз реакционноспособных групп...............................32

1.7 Методы синтеза монолитов..............................................................................................35

1.7.1 Полимеризация................................................................................................................35

1.7.1.1 Свободно-радикальная полимеризация.....................................................................35

1.7.1.2 Полимеризация с раскрытием цикла.........................................................................39

1.7.2 Поликонденсация............................................................................................................40

1.7.3 Получение монолитов из ранее синтезированных полимеров...................................41

1.8 Основные области применения полимерных монолитных материалов......................42

1.9 Технология микрочипов: основные принципы...............................................................43

1.9.1 Материалы, используемые для создания платформ микрочипа................................47

1.9.1.1 Двумерные носители...................................................................................................47

1.9.1.2 Трехмерные носители..................................................................................................50

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................................54

2.1 Материалы..........................................................................................................................54

2.2 Оборудование.....................................................................................................................56

2.3 Методы................................................................................................................................57

2.3.1 Получение пластин на основе стеклянной поддерживающей среды и мегакрилатного монолита.......................................................................................................57

2.3.2 Синтез ГМА-ЭДМА сополимера..................................................................................58

2.3.3 Синтез сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА.........................59

2.3.4 Модификация монолитного ГМА-ЭДМА сополимера...............................................60

2.3.4.1 Кислотный гидролиз эпоксидных групп ГМА-ЭДМА сополимера.......................60

2.3.5 Иммобилизация модельных белков на поверхности модифицированной полимерной матрицы...............................................................................................................61

2.3.5.1 Характеристики и подготовка стационарных фаз....................................................61

2.3.5.2 Иммобилизация белка.................................................................................................61

2.3.7 Применение макропористых гидрофильных полимерных материалов в чип-анализе............................................................................................................................62

2.3.7.1 Сравнительное исследование разработанных материалов с использованием модельной биокомплементарной пары белков.....................................................................62

2.3.8. Анализ белков и ДНК на повехности стеклянных пластин......................................64

2.3.8.1 Анализ белков на стеклянных чипах.........................................................................64

2.3.8.2 Анализ ДНК на стеклянных чипах.............................................................................64

2.3.9 Создание чипов для анализа ДНК на основе монолитных полимерных матриц.....65

2.3.9.1 Оптимизация процесса иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности монолитных слоев....................................................................................................................65

2.3.9.2 Оптимизация условий анализа на чипе.....................................................................66

2.3.9.3 Создание чипов для диагностики муковисцидоза....................................................67

2.3.9.4 Аптамер-содержащие микрогест-системы................................................................67

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................70

3.1 Синтез и исследование характеристик гидрофильных сополимеров ГЭМА-ГДМА, ГМА-ГДМА и ЦЭМА-ГДМА.......................................................................70

3.1.1 Выбор инициатора..........................................................................................................70

3.1.2 Время полимеризации....................................................................................................72

3.1.3 Влияние порообразующих веществ на морфологию ГЭМА-ГДМА монолита.......73

3.1.4 Синтез ГМА-ГДМА монолитов....................................................................................81

3.1.5 Макропористые монолиты на основе ЦЭМА-ГДМА сополимера............................87

3.2 Модификация ГМА-ЭДМА сополимера.........................................................................91

3.2.2 Введение в структуру ГМА-ЭДМА монолитов альдегидных,

сукцинимидкарбонатных и имидазолкарбаматных групп..................................................94

3.2.3 Иммобилизация модельного белка на поверхности модифицированных носителей..................................................................................................................................96

3.2.3.1 Зависимость емкости иммобилизации от концентрации белка в растворе...........96

3.2.3.2 Влияние рН раствора...................................................................................................97

3.2.3.3 Зависимость емкости иммобилизации от времени реакции....................................98

3.2.3.4 Зависимость емкости иммобилизации от температуры...........................................99

3.3 Апробация разработанных материалов в режиме биологического анализа в формате микрочипов.............................................................................................................................100

3.3.1 Анализ белков на поверхностях гидрофильных платформ биочипа.......................100

3.3.2 Применение макропористых монолитов для создания ДНК-чипов........................108

3.3.2.1 Оптимизация условий анализа ДНК на модельных ГМА-ЭДМА слоях.............108

3.3.2.2 Сравнение результатов анализа ДНК на макропористых и стеклянных чипах ..113

3.3.2.3 Создание тест-системы на основе монолитов для выявления мутаций

гена CFTR...............................................................................................................................115

3.3.2.4 Аптамер-содержащие микроаналитические линейки для детектирования белков......................................................................................................................................117

ВЫВОДЫ................................................................................................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................121

Приложение I: Структурные формулы используемых в работе мономеров...................139

Приложение II: Формулы для оценки эффективности разработанных тест-систем......140

БЛАГОДАРНОСТИ...............................................................................................................141

ВВЕДЕНИЕ

Методология получения макропористых полимерных материалов, заключающаяся в одностадийном синтезе сильно сшитых сополимеров в виде монолитных блоков в форме выбранного размера и дизайна (монолитные сорбенты), была разработана и предложена в начале 90-х годов прошлого века. В настоящий момент подобные системы широко используются в качестве твердых сред (неподвижной фазы) при проведении широкого ряда процессов, основанных на массообмене в условиях сквозного потока жидкости или газа (подвижной фазы). В качестве примеров можно привести жидкостную и газовую хроматографию, высокопроточные ферментные реакторы и т.д. Повышенный интерес к монолитным носителям обусловлен их эффективностью и производительностью, связанной с высокой скоростью межфазового переноса вещества, основанного на механизме конвекции, и, в связи с этим, возможностью скоростного разделения биологических объектов различного строения и размера (белки, ДНК, РНК, вирусы), а также их механической и химической устойчивостью. Вышеперечисленные характеристики позволили данным материалам занять привилегированное место в ряду традиционно используемых сорбентов, получаемых в виде частиц, однако для решения более широкого круга задач необходимость продолжения исследований в области синтеза и практического применения полимерных монолитов не теряет своей актуальности. При этом одним из наиболее важных вопросов является получение материалов с прогнозируемой поровой структурой, а именно, решение проблемы управления процессом порообразования.

Сравнительно недавно макропористые метакрилатные материалы монолитного типа были впервые предложены для использования в качестве основы при создании микрочипов, предназначенных для высокочувствительного анализа белков (protein microarrays). При сравнении с широко используемыми в данном методе биологического анализа стеклянными носителями (двумерные, или 20-чииы) было установлено, что используемые в качестве операционного слоя макропористые монолитные матрицы (трехмерные, ЗЭ-чины), имеют ряд преимуществ, позволяющих существенно повысить чувствительность анализа. Несмотря на высокую практическую значимость данной характеристики, существует ряд свойств обсуждаемых материалов, которые могут быть улучшены, например, введением в структуру полимерной матрицы групп, повышающих ее гидрофильность. Дополнительная гидрофилизация поверхности операционного слоя

микрочипа apriori приведет к улучшению условий для принятия белком необходимой для последующего биоаффинного связывания конформации, уменьшению влияния неспсцифических гидрофобных взаимодействий, а также, поскольку при работе с микрочипом используются водные растворы, к улучшению смачиваемости слоя. Также известно, что некоторые белки особенно чувствительны к микроокружению. Для этой категории анализируемых объектов создание условий, максимально приближенных к физиологическим, необходимо для предотвращения денатурации или инактивации активного центра в процессе иммобилизации на поверхности твердой фазы.

Таким образом, поиск новых макропористых полимерных материалов, позволяющих осуществлять биофункционализацию матрицы в мягких условиях и в короткие промежутки времени, является, несомненно, актуальной задачей.

Цель настоящей работы состояла в разработке методов синтеза новых макропористых полимерных материалов (монолитов) на основе сополимеров 2,3-эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата), 2-цианоэтилметакрилата и 2-гидроксиэтилметакрила с гидрофильным сшивающим агентом глицерин-1,3-диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА, соответственно) с контролируемой норовой структурой и заданной химической функциональностью поверхности, а также в выявлении факгоров, определяющих перспективность использования монолитов для построения микроаналитических тест-систем (микрочипов).

Достижение поставленной цели определило следующие задачи:

• синтез новых гидрофильных метакрилатных сильно сшитых сополимеров и оптимизация условий сополимеризации, а именно, выбор эффективного инициатора, подбор его концентрации, времени реакции и системы порообразующих веществ;

• изучение влияния природы низкомолекулярных и полимерных порообразующих веществ на морфологию и другие характеристики монолитных сорбентов;

• разработка способов химической модификации сополимера на основе глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА); подтверждение введения в структуру матрицы альдегидных, сукцинимидилкарбонатпых и имидазолкарбаматных групп;

• исследование факторов, оказывающих влияние на эффективность введения в структуру макропористого сополимера биоаффинных лигандов;

• изучение закономерностей анализа белков на поверхности гидрофильных макропористых монолитов.

Объектами представленного исследования являлись синтетические макропористые гидрофильные материалы на основе метакрилатных сополимеров, содержащие па поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами молекул белков и ДНК-фрагментов.

В качестве методов исследования использовались: свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация в массе (синтез сильно сшитых гидрофильных метакрилатных сополимеров); методы твердофазного ядерного магнитного резонанса (SSNMR), ИК-спектроскопии и элементного анализа (подтверждение химического строения полученных продуктов); интрузионная ртутная порометрия (определение среднего размера пор и распределения их по размерам); растровая (сканирующая) электронная микроскопия (качественная оценка поровой структуры полученных материалов); флуоресцентный анализ (оценка эффективности высокоспецифичных биологических взаимодействий на поверхности разработанных полимерных слоев). Научная новизна работы состоит в следующем:

• разработаны методы синтеза новых макропористых гидрофильных полимерных материалов (монолитов) па основе сополимеров глицидилметакрилата, 2-цианоэтилметакрилата или 2-гидроксиэтилметакрила с глицерин-1,3-диметакрилатом (ГМА-ГДМА, ЦЭМА-ГДМА и ГЭМА-ГДМА) с контролируемой поровой структурой;

• впервые исследована роль полистиролов с различной молекулярной массой как макромолекулярных порообразующих веществ в формировании морфологии монолитных продуктов (структур) и показано соответствие экспериментальных данных теории взаиморастворимости Гильдебранда;

• разработан и оптимизирован алгоритм высокочувствительного анализа ДНК на поверхности макропористых монолитных платформ микрочипа;

• показана возможность создания высокочувствительной аптамер-содержащей тест-системы на основе разработанного микрочипа.

Практическая значимость работы определяется тем, что:

• на основе данных по исследованию влияния низкомолекулярных и полимерных порогенов на поровые характеристики синтезированных монолитных сорбентов

предложены научно-практические рекомендации, позволяющие направленно контролировать морфологию монолита и получать материалы с норовой структурой, необходимой для решения конкретных аналитических задач;

• макропористые монолитные слои, закрепленные на поверхности стеклянной подложки, могут быть использованы в качестве основы как для высокочувствительного анализа белков, так и для анализа ДИК;

• по результатам разработанного анализа на определение тяжелого генетического заболевания муковисцидоза установлено, что гидрофильные макропористые материалы являются перспективными для анализа генных мутаций. Положения, выносимые на защиту:

• повышение гидрофильное™ одного мономера или сомопомеров приводит к изменению термодинамической совместимости компонентов реакционной системы, и, как следствие, оказывает существенное влияние на поровую структуру;

• введение в полимеризацнонную смесь макропорогена полистирола не приводит к изменению классической микроглобулярпой структуры синтезированных образцов;