Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА Ирина Васильевна

АДСОРБЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ (ВИРУСОВ) НА ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ СОРБЕНТОВ МОНОЛИТНОГО ТИПА

Специальность 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003 167895

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2008

003167895

Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений Российской акаде наук.

Научный руководитель: доктор химических на

Т. Б. Теннико

Официальные оппоненты: доктор химических на

профессор В. П. Зуб

доктор химических нау профессор Л. А. Карцо

Ведущая организация: Кафедра биотехнологи

Санкт-Петербургский Государственный Технологический иистит

(Технический Университ

Защита диссертации состоится «22» мая 2008 г в 12_^часов на заседании диссертацион ного совета Д 002.229.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу 199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В.О., д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института высокомояекуляр ных соединений РАН.

Автореферат разослан « /4 20081

Ученый секретарь диссертационного совета, к. физ.-мат. наук

Н.А. Долотова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Выделение и тонкая очистка вирусов имеет огромное значение при производстве вакцин и других медицинских препаратов на их основе. Диагностика заболеваний, основанная на высокочувствительном детектировании вируса, направлена на раннее его выявление и своевременное проведение противоэпидемических мероприятий. Применяемые на практике традиционные методы выделения и детектирования вирусов, в том числе и хроматографические, как правило, демонстрируют низкую эффективность. Вероятно, причиной этому являются как физико-химические, так и биохимические особенности вирусов, а именно, их низкая диффузионная подвижность, связанная с большим размером, а также сложная многокомпонентная и достаточно лабильная структура вирусных частиц. Монолитные сорбенты, в частности, твердый макропористый сополимер 2,3-эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата) с этиленгликольдиметакрилатом (ГМА-ЭДМА), широко используются в качестве стационарных фаз при реализации различных процессов, основанных на межфазовом переносе вещества (хроматография, биоконверсия, твердофазный химический синтез). Высокая проницаемость монолитных сред, обусловленная особенностями морфологической структуры, обеспечивает специфический механизм быстрого переноса вещества, характеризуемый преобладанием конвекции над диффузией. В результате реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных дисперсных сорбентов, что позволит избежать деструкции биопродукта и, соответственно, потери его активности. Таким образом, разработка и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию вирусов, так и их достоверную идентификацию с использованием современных: полимерных материалов, в частности, монолитных сорбентов и новейших подходов диагностики вирусных инфекций с привлечением биочиповой технологии, является, несомненно, актуальной задачей.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей адсорбции крупных модельных частиц и вирусов на функциснализированной поверхности ГМА-ЭДМА монолитных фаз в динамическом формате, т. е. в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии на метакрилатных монолитах, а также в статическом формате с использованием трехмерных биочипов с аналогичной полимерной поверхностью. В практические цели исследования также входила разработка схем выделения и методов детектирования вирусов, с учетом выявленных особенностей адсорбции вирусоподобных частиц на поверхности монолитных фаз. В связи с вышесказанным, были поставлены и решались следующие задачи:

- конструирование физико-химических моделей вирусов с использованием различных материалов и методов;

- исследование особенностей адсорбционного поведения модельных наночастиц в динамических условиях различных вариантов высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ);

- построение модельной системы, имитирующей взаимодействие вирус-клетка, при участии специально сконструированных наночастиц и функционализированной поверхности монолитного сорбента;

- на примере модельных наночастиц, разработка методов биоанализа в формате биочипа, построенных на использовании монолитных полимерных слоев;

- разработка и оптимизация хроматографических схем выделения вируса гриппа из сложных биологических образцов, а также диагностической нанотест-системы для детектирования вируса гриппа непосредственно в клиническом материале.

Объектами исследования являлись физико-химические модели вирусов, полученные с использованием методов сшивки белка с помощью диальдегвда и ковалентной мо-

дификации поверхности полимерных наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки, а также вирусы гриппа.

В качестве методов исследования использовались: спектрофотометрия в УФ- и видимой областях, элементный анализ, ИК-спектроскопия, колориметрические, биохимические и биологические методы: экслюзионный, ионообменный и аффинный варианта жидкостной хроматографии; зональный и фронтальный хроматографические методы анализа; флюоресцентный и иммуноферментный методы анализа; метод твердофазной денситомет-рии (в УФ и видимой области спектра); полиакриламидный гель-электрофорез.

Научная новизна. На примере вирусоподобных синтетических частиц впервые научно обоснована возможность реализации скоростных эффективных процессов сепарации крупных биологических объектов (вирусов) с использованием ионообменного и биоаффинного вариантов жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках, отличающихся избирательностью адсорбции и энергией взаимодействия вещества с поверхностью стационарной фазы. Впервые показана возможность проведения количественного анализа вирусоподобных частиц в формате ЗВ-биочипов на основе макропористого сополимера ГМА-ЭДМА с использованием детектирующего метода твердофазной денси-тометрии. Путем выбора из широкого ряда кандидатов оптимального лиганда впервые предложен эффективный метод выделения вируса гриппа А (НШ1), основанный на псев-до-аффинном варианте хроматографии на монолитах. Впервые предложен высокочувствительный метод детектирования вирусов гриппа А и В с использованием разработанной тест-системы (биочипа).

Практическая значимость работы. Сконструированы биораспознающие системы для сепарации вирусов методом высокоэффективной псевдо-аффинной хроматографии на монолитах. Предложен метод чувствительной и эффективной диагностики вирусов гриппа А и В с использованием специально сконструированных ЗБ-биочипов (трехмерных биочипов). Таким образом, разработан и оптимизирован методологический комплекс, включающий сепарацию вирусов и их достоверную идентификацию с привлечением одного и того же ГМА-ЭДМА сорбента монолитного типа.

Основные положения, выносимые на защиту:

- физико-химические модели вирусов (вирусоподобные наночастицы) могут быть получены контролируемыми методами сшивки белка с использованием диальде-гида, а также ковалентной модификации полимерных наносфер белком и другими лигандами;

- адсорбция вирусоподобных наночастиц на функционализированной поверхности сорбента (монолита) определяется природой белка, локализованного на их поверхности;

- величина максимальной адсорбционной емкости сорбента в аффинном и ионообменном вариантах ВЭМДХ уменьшается с увеличением размера наночастиц и не зависит от скорости потока подвижной фазы;

- усложнение микроокружения на поверхности как сорбента, так и наночастиц в модельной системе, имитирующей взаимодействия «вирус-клетка», может оказывать влияние на характеристики биоспецифического связывания;

- использование различных подходов к иммобилизации лигандов при создании эффективных нсевдо-аффинных носителей демонстрирует возможность увеличения производительности хроматографических процессов, основанных на биоспецифическом взаимодейегвии вируса гриппа с адсорбционно-активными сайтами сорбента;

- методологические подходы детектирования и количественной оценки связывания, разработанные на примере вирусподобных частиц в формате непроточных ГМА-

ЭДМА слоев (биочипов), могут быть положены в основу чувствительных тест-систем для диагностики вируса гриппа. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и российских симпозиумов и конференций: 5th International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), 2nd Monolith Summer School «Application in biochroma-tography, bioconversion and solid phase synthesis» (Порто Рож, Словения, 2006), 4th International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006), The Young Scientists' ana Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), а также обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и были представлены на конкурсе молодых ученых ИВС РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, включающих 3 полнотекстовые статьи и 7 тезисов докладов.

Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы. Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 44 рисунками, список цитируемой литературы включает 209 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность темы, обозначена ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы состоит из четырех разделов В первом разделе рассмотрены различные методы конструирования модельных биосистем (частиц) на основе синтетических и природных полимеров. Во втором разделе обсуждается хроматографи-ческий метод выделения и исследования вирусов, его особенности и варианты. Третий раздел посвящен монолитным ГМА-ЭДМА сорбентам, их синтезу и морфологии, а также особенностям хроматографического разделения анализируемых веществ с их использованием. И, наконец, четвертый раздел касается практического приложения принципа комплементарно сти в двух форматах, а именно, динамическом (аффинная хроматография) и статическом (биочипы) видах разделений.

Глава 2. Результаты и обсуждение. 2.1. Конструирование моделей вирусов

Адсорбционные особенности вирусов в динамических условиях хроматографического процесса определяются, в первую очередь, их физико-химическими параметрами, а именно, размером, формой и химическим строением поверхности данных объектов. Таким образом, первой задачей данной работы являлось конструирование модельных частиц, близких к сферической форме, размером 20-120 нм и с поверхностным слоем, содержащим, подобно вирусу, «сигнальные» белки, ответственные за взаимодействие модели с функционализированной поверхностью сорбента. В качестве таких «сигнальных» биомолекул на первом этапе исследования были выбраны хорошо известные и детально изученные с точки зрения хроматографического поведения белки, а именно, соевый ингибитор трипсина, трипсин и овальбумин. Наиболее простым способом получения модельных на-ночастиц является использование белка в качестве основы для его дальнейшего укрупнения. Инструментом для создания таких частиц в нашем случае являлась реакция ковалент-

ной сшивки глобул нативного белка с использованием глутарового диальдегида (ГДА). Продукты реакции очищали от избытка ГДА и анализировали методом гель-хроматографии. С целью получения коньюгатов достаточного размера оптимизировали условия реакции сшивки белка, а именно, значения рН реакционной среды, соотношение реагентов в реакционной смеси, время реакции. Несмотря на тщательный подбор условий, продукт реакции представлял собой набор коньюгатов с различной степенью сшивки, т.е. в растворе имелась смесь образований, имеющих различный размер, а также примесь исходного белка. Согласно полученным данным, средний размер образующихся на-ночастиц соответствовал лишь минимальным размерам вирусов, а именно, 20-40 нм.

В качестве альтернативы предыдущему методу создания структурных моделей вирусов использовались полистирольные наносферы, поверхность которых может быть функционализирована различными лигандами. Ковалентную иммобилизацию белка на поверхности полимерных наносфер, содержащих реакционноспособные карбоксильные группы, проводили по известному двустадийному методу активации функциональных групп с использованием 1-гидроксибензотриазола и водорастворимого карбодиимида. Количество иммобилизованного на поверхности наносфер белка (Таблица I) определяли методом Лоури, а степень заполнения поверхности латексных частиц белком рассчитывали с использованием следующих формул: *Мтах = в'/Э, **Нтах = N7 Ы, где в' - площадь поверхности латексной частицы, Б - площадь поперечного сечения глобулы белка, К' - количество глобул белка, N - количество наночастиц. На примере овальбумина (Таблица 1), путем двукратного по сравнению с расчетным увеличения количества белка в реакционной смеси, удалось получить латексные частицы с большим покрытием поверхности.

Таблица 1

Характеристики полистирольных наночастиц (ПС), модифицированных соевым ингибитором _ трипсина (СИТР), тртосином (TP) и оаальбумином (ОВА)_____

Частица Nroax, максимальное число глобул белка, связанных с поверхностью 1 наносферы Заполнение поверхности наносфер белком, %

Теория Эксперимент

ПС-СИТР 1600 700 44

ПС-ТР 1600 1100 69

ПС-ОВА 700 300 44

700 400 56

2.2. Исследование особенностей динамической адсорбции модельных частиц методом высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ)

Скоростная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках) с различной поверхностной функциональностью являлась основным методом исследования адсорбционного поведения наночастиц, полученных двумя описанными выше методами. Использование хорошо изученных белков в качестве сигнальных при формировании вирусоподобных частиц предоставляет исключительные возможности сравнения адсорбционного поведения в динамических условиях нативных белков и крупных наночастиц на их основе.

Материал использованных в работе монолитных носителей, выполненных в форме дисков размером 12x3 мм (CIM® Disks, BIA Separations, Любляна, Словения), представляет собой жесткий макропористый сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликоль-диметакрилата (ЭДМА) (60 и 40 мол.%, соответственно), получаемый методом свободно-радикальной полимеризации в блоке. Используемые носители характеризовались следующими параметрами: средний размер пор - 1.5 мкм, удельная площадь поровой поверхности - 10-15 м2/г. общая пористость - 0.6 мл/мл сорбента, объем диска - 0.34 мл.

2.2.1. Ионообменная ВЭМДХ модельных частиц Метод зонального элюирования

С целью изучения влияния скорости потока подвижной фазы на адсорбцию крупных частиц на функционализированной поверхности монолитных сорбентов использовался метод зонального элюирования. При этом на колонку (диск) с различной скоростью потока подвижной фазы наносились фиксированные объемы растворов наночастиц, модифицированных овальбумином, определенной концентрации. Известно, что для эффективного разделения время пребывания частицы в массе сорбента (/ге[) должно значительно превышать время ее внутрипорового диффузионного движения Рассчитанное минимальное время пребывания наночастицы в слое сорбента при скорости потока 6 мл/мин соответствовало 2 секундам и превышало время внутрипоровой диффузии, составляющее всего 0.1 секунды (Таблица 2). Таким образом, даже для исследуемых крупных частиц скорость потока подвижной фазы равная 6 мл/мин удовлетворяла требованию 1т » Следовало бы ожидать, что уменьшение времени пребывания частицы в массе сорбента должно привести к пропорциональному уменьшению числа вероятных контактов частиц с адсорбционными центрами сорбента в единицу времени, что в свою очередь, вызывает снижение адсорбционной емкосги. Однако проведенные опыты показали, что уменьшение времени пребывания наночастицы в массе сорбента в шесть раз сопровождалось уменьшением адсорбционной емкости сорбента только в 3.8 раза (Таблица 2).

Таблица 2

Результаты зонального метода анализа, полученные для наносфер, модифицированных овальбумином (ПС-ОВА), в ионнообменном варианте ВЭМДХ

Скорость потока, ^преб. 1диф, Количество элюируемых ПС-ОВА,

мл/мин сек сек мг белка/мл сорбента

1 0 12 0.6 0.200 ± 0.02

3.0 4 0.2 0 085 ± 0.02

60 2 0.1 0.053 ± 0.02

Подобный результат является подтверждением теории конвекционного механизма массопереноса в высокопроницаемых пористых системах. И действительно, рассчитанное с использованием уравнения Д = v0l/3 (v0 - конвективная скорость потока и / -длина разделительного слоя) значение кажущейся диффузивности Д, равное 4х10"5 см2/сек, на три порядка превышает значение свободной диффузии в растворе латексных частиц Д = 6х10"8 см 2/сек, полученное независимым физическим методом (метод диффузии). Метод фронтального элюирования

Количественная оценка влияния скорости потока подвижной фазы на максимально возможную величину адсорбционной емкости анионообменных сорбентов осуществлялась методом фронтального элюирования. В этом варианте через сорбент (CIM DEAE Disk) пропускали растворы наночастиц, модифицированных соевым ингибитором трипсина (СИТР), различной концентрации до полного насыщения всех адсорбционных сайтов сорбента. В соответствии с законами хроматографии на монолитах, где величина адсорбции вещества не зависит от скорости потока подвижной фазы, экспериментальные изотермы, полученные при скоростях 1, 3 и 10 мл/мин, оказались практически идентичными. Соответственно, величина максимальной адсорбционной емкости диска, определяемая графически линеаризацией изотерм адсорбции в обратных координатах 1/Q - 1/С, для крупных частиц остается постоянной при разных скоростях элюции. Кроме того, в процессе экспериментов была выявлена зависимость объема пробы, наносимого до полного насыщения адсорбционных центров сорбента, от скорости потока подвижной фазы. Вероятно, некоторая доля крупных частиц, ввиду их малой диффузионной подвижности, при высоких скоростях элюции способна «проскакивать» сквозь стационарную фазу без взаимодействия с

ней, а увеличение объема наносимой пробы при возрастании скорости потока компенсирует уменьшение числа эффективных контактов.

С использованием скорости потока 3 мл/мин осуществлялось исследование влияния размеров модельных наночастиц на величину максимальной адсорбционной емкости. Линеаризация полученных методом фронтального элюирования изотерм адсорбции позволила получить значения максимальной адсорбционной емкости (<Зт!К, Таблица 3).

Таблица 3

Значения максимальной адсорбционной емкости (О™-,) различных форм овальбумина (ОВА) и соевого ингибитора трипсина (СИТР) (ионообменные С1М диски)

Белок Образец И, С^тал-, СТ^ХМ'",

нм мг белка/мл сорбента глобул или частиц/мл сорбента

Нативный 2.0 28.7 ± 0.05 720011>

Конъюгат 1 8.7 7.9 ±0.03 67(|)

СИТР Конъюгат 2 15.6 2.3 ± 0.03 0.7

ПС-СИТР (44%) 42.0 0.2 ± 0.02 0.1 и»

Нативный 3.0 30.0 ±0.03 402014

Конъюгат 8.7 1.7 ±0.02 14.6«

ОВА ПС-ОВА (44%) 43.0 1.3 ±0.02 0.4 «>

ПС-ОВА (56%) 43.0 1.7 ±0.02 06 й

01 <5'™ч = 0 0'. где (3'=Ч/Ы

С> - количество десорбируемого белка (мг}, рассчитанное из данных фронтального анализа; С)' тал - количество белка (мг), рассчитанное с использованием формули (2); М - молекулярная масса белка; ЫА - число Авогадро; ~ количество белка (мг), ковалентао связанное с 1 наносферой, ч - суммарное коли-чество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе.

Согласно вычисленным значениям <Зтах, в ряду нативный белок - конъюгат белка -модифицированные белком полимерные наносферы наблюдалось естественное снижение этой величины. Подтверждением того, что адсорбция анализируемых частиц определялась ионной природой белка, может служить пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости при увеличении количества белка (овальбумина), иммобилизованного на поверхности полимерных частиц (Таблица 3). Тем не менее, даже невысокие для крупных частиц значения адсорбционной емкости монолитного сорбента, особенно в сравнении со значениями, полученными для нативных белков, превосходят емкости, зафиксированные с использованием мембранных адсорберов или сорбентов гелевого типа. Одним из возможных путей увеличения производительности монолитного сорбента может быть увеличение его объема. Действительно, при увеличении объема сорбента втрое наблюдалось практически пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости для полимерных наносфер, модифицированных оваяьбумином; при этом оперативное давление изменялось крайне незначительно, что позволяло использовать те же высокие скорости элюции, как и в случае одной сепарационной единицы. Разделение модельных смесей (градиентная анионообменная ВЭМДХ)

Абсолютная идентичность картин разделения в одинаковых условиях градиентной АО ВЭМДХ пар двух модельных белков (овальбумина и трипсина) и соответствующих модифицированных латексов (Рис. 1 а и б) подтвердила доминирующее участие белка в адсорбции сформированных частиц на ионогенной поверхности сорбента. Следует отметить, что разделение смеси ковъюгатов (Рис. 1 в) в идентичных условиях градиента оказалось затруднительным. Время выхода с колонки коньюгата овальбумина (К-ОВА) (Рис. 1 в) заметно уменьшилось по сравнению с нативным белком (Рис. 1 а), что свидетельствует об уменьшении суммарного отрицательного заряда в результате сшивки глобул.

Таким образом, доказано, что в ионообменном варианте хроматографии адсорбция наночастиц, несущих белки на внешней поверхности, определяется ионной природой бел-

ка и, как правило, подчиняется тем же законам, что и адсорбция нативных белков. Другим важным результатом, полученным в данной серии экспериментов, является подтверждение пригодности морфологии используемой монолитной стационарной фазы для реализации скоростных процессов адсорбционного разделения частиц, значительно превосходящих по

размеру исследованных ранее крупных биологических объектов, таких как белки и ДНК. » _ ® ®

•з®.

<0-

цо 05 ц> 1.5 „ до 35 зр ад (15 10 1,5 z0 £5 50 00 05 1,5 20 25 30

1(:>Щ 1(\и$ П>1М

Условия: 12x3 мм С1М® С>А диск; модельные пары: (а) ОБА (2.0 мг/мл) - ТР (3.0 мг/мл); (б) ПС-ОВА (0.1 мг бел-ка/мя) - ПС-ТР (0,1 мг белка/мл); (в) К-ОВА (0.2 мг/мл) - К-ТР (0 4 мг/мл); скорость потока подвижной фазы: 3 мл/мин; подвижная фаза: 20 мМ Трис-НО, рН 7.6 (буфер А), 1М ЫаС! в 20 чМ Трис-НС! буфере, рН 7.6 (буфер В); объем петли составлял 400 мкл; градиент 0-1 мин - 0%В, 1-1 02 мин от 0 до 10% В; 1.02-2.02 мин - 10% В; 2 022.04 мин от 10 до 20% В; 2.04-3.04 мин - 20% В; 3 04 - 3.06 мин от 20 до 100% В; 3.06 - 4 мин - 100% В, 4-4 02 мин от 100 до 0% В; 4.02-5 мин - 100% А

Рис. 1. Хроматографическое разделение методом АО ВЭМДХ на С1М С>А диске пар двух модельных белков (а), соответствующих модифицированных лэтексов (б) и пар двух конъюгатов белков (В).

2.2.2. Поведение вирусоподобных частиц в условиях биоаффинной адсорбции на поверхности монолитных фаз (ВМДАХ)

Исследование адсорбции, основанной на принципе биокомплементарного связывания в условиях сквозного потока жидкости (аффинная хроматография на монолитных фазах), является адекватным инструментом проверки способности создаваемых частиц, содержащих белок на внешней поверхности, к биокомплементарному связыванию. Наблюдаемый положительный эффект может служить доказательством сохранности третичной структуры белка, независимо от способа его укрупнения. Изучение характеристик биоаффинного связывания в ряду нативный белок -конъюгат белка — модифицированные бе яком латекеные наночастицы проводилось с использованием модельной аффинной пары соевый ингибитор трипсина - трипсин (СИТР-ТР). При этом были реализованы две возможные ситуации локализации партнеров (Рис. 2). Ковалентное связывание СИТР с поверхностью сорбента осуществлялось при высоких звачеимх рН (9-10), при которых эпоксидная группа наиболее вероятно взаимодействует с боковыми в-аминогруппами остатков лизина. Иммобилизация ТР осуществлялась с использованием водорастворимого карбодиимида через предварительное аминирование поверхности монолитного носителя. Зональное элюирование

Серия экспериментов, подобная разделениям в ионообменном варианте ВЭМДХ, была выполнена в режиме аффинной хроматографии, где исследовалось адсорбционное

^ - трипсин (^у полимерная наносфера - соевый ингибитор трипсина

Рис. 2. Варианты анализа аффинной адсорбции тюизводных СИТР И ТР.

поведение полимерных наночастиц, поверхностно-модифицированных трипсином. При этом роль аффинного партнера выполнял соевый ингибитор трипсина, иммобилизованный на поверхности монолитного сорбента. В данном варианте хроматографии шестикратное увеличение скорости потока подвижной фазы вызывало уменьшение адсорбционной емкости сорбента в 2.5 раза. Как уже обсуждалось ранее, конвекционный поток подвижной фазы сквозь проницаемый слой сорбента увеличивает эффективную диффузионную подвижность частиц, характеризуя происходящие динамические адсорбционные процессы как конвекционно-контролируемые. Именно этим объясняется возможность использования высоких скоростей элюирования в варианте более сложной адсорбции, отличающейся от ионной гораздо более низкой поверхностной концентрацией лигандов и, как следствие, меньшим числом эффективных контактов между комплементарными молекулами. Наиболее важно, что аффинная адсорбция крупных частиц в условиях потока подвижной фазы подчиняется абсолютно тем же закономерностям, наблюдаемым ранее для белков, обладающих гораздо меньшими размерами и, соответственно, большими коэффициентами внутрипоровой диффузии. Фронтальный анализ

Для количественной оценки теоретически возможной адсорбционной емкости аффинных сорбентов, С?тах, использовался метод фронтального элюирования. Как и в ионообменной хроматографии, величина С>тах уменьшалась с увеличением размера анализируемых объектов и не зависела от скорости потока подвижной фазы (Таблица 4). Как следует из Таблицы 4, заметная разница в значениях адсорбционной емкости сорбента для конъюгатов К-ТР и К-СИТР, по всей вероятности, обусловлена снижением биологической активности трипсина вследствие затрагивания ответственных за поддержание активной конформации е-аминогрупп лизина при сшивке глобул ГДА, имеющей место при щелочных значениях рН. Интересно отметить, что процесс десорбции укрупненных комплементов происходил в тех же достаточно жестких условиях, как и в случае пар, образованных индивидуальными белками (рН 2.0). Данный факт является подтверждением прочности формирующихся биокомплементарных комплексов, т. е. идентичности их констант диссоциации с константами нативных комплексов.

Таблица 4

Данные фронтального анализа, полученные для различных форм трипсина (ТР) и соевого инги-

битора трипсина (СИТР) в аффинном варианте ВЭМДХ

Лиганд рхЮ"', моль/ Комплемент <3тах,

мл сорбента мг белка/мл глобул или частиц/

сорбента мл сорбента

ТР 0.8 СИТР 0.26 ±0 02 660 <"

К-СИТР (11 = 11 бнм) 1.58 ±0.02 31

ПС-СИТР 0.40 ±0.02 1.4'ю

СИТР 1.1 ТР 0.38 ±0.02 950

К-ТР (Л = 15.6 нм) 0.09 ±0.02 0.3

ПС-ТР 0.21 ± 0.02 0.5®

"Ч'п^Оп^/О'.гдеО^/и

О та.\" максимальная адсорбционная емкость сорбента т е количество адсорбированного белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; (>" - количество белка (мг) рассчитанное с использованием формул ^ и(2); М -молекулярная масса; ЫА - число Авогадро; - количество белка (мг), коваленгно связанное с 1 наносферой; q -суммарное количество белка, иммобилизованного на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество нано-сфер в растворе

2.2.3. Моделирование взаимодействий вирус-клетка

Известно, что помимо белков-антигенов, участвующих во взаимодействии вирус-клетка, в состав оболочки вирусов входят и другие компоненты, такие как яипиды и угле-

воды, которые могут вносить дополнительный вклад в механизм адсорбционных взаимодействий вируса с поверхностью сорбента. Поэтому дальнейшие экспериментальные шаги были направлены на постепенное усложнение микроокружения белка на поверхности на-ночастиц, приближая его к составу вирусной оболочки. Основой для создания вирусоподобных частиц служили два типа полимерных карбоксилировапных наносфер на основе полистирола (ПС) и полиметилметакрилата (ПММА) размерами 63.5 и 80 нм, соответственно. В наших экспериментах с ПММАД частицами находящийся в поверхностном слое декстран имитировал олигосахаридную составляющую микроокружения. Роль моделируемого вирусного антигена выполнял белок трипсин. Фосфатидилэтаноламин (ФТЭА) и глюкозамин (ГА) были выбраны в качестве низкоспецифических лигандов, отвечающих за липидную и углеводную составляющие микроокружения белка, воссоздаваемого на поверхности синтетических наночастиц. Ковалентную иммобилизацию аминосодсржащих лигандов на поверхности наносфер, содержащих реакционноспособные карбоксильные ! группы, осуществляли согласно ранее упомянутому методу с использованием водорастворимого карбодиимида. Таким образом, были получены частицы, содержащие один или не-| сколько лигандов различной природы и специфичности.

Те же фосфолипид и углевод (ФТЭА и ГА) использовались для построения приближенной структуры наружной клеточной мембраны на поверхности ГМА-ЭДМА сорбента. Аффинный партнер трипсина, СИТР, на поверхности сорбента выполнял роль моделируемого клеточного рецептора. Концентрация выбранных аминосодержащих лигандов, иммобилизация которых осуществлялась одностадийной реакцией их ковалентного связывания I с эпоксидными группами сорбента, представлена как р в Таблице 5. Таким образом, моди-| фикацией поверхности латексных наночастиц и монолитного сорбента была получена упрощенная биокомплементарная система, представленная на Рис. 3. Использование в данной системе аффинной пары СИТР-ТР в качестве модельной взаимодействующей пары «рецептор-антиген» позволило осуществить контроль аффинного распознавания при построении модели взаимодействий «вирус - клетка».

Количественное исследование биоспецифического связывания комплементов (СИТР-ТР), выполняемое в условиях скоростной аффинной хроматографии с использованием метода фронтального элюирования, позволило оценить влияние микроокружения на адсорбционную емкость сорбента и термодинамическую устойчивость образующихся аффинных комплексов (Таблица 5). При этом сравнивались два экспериментальных случая (Рис. 3), а именно, (!) когда осуществлялась иммобилизация единственного белка, СИТР, на поверхности сорбента, и (2) когда два выбранных компонента (ФТЭА и ГА) одновременно формировали микроокружение данного белка на поверхности монолитной фазы, тем самым, приближая ее к поверхности клетки, атакуемой вирусом.

- ПММАД наносфера

? - ПС наносфера

0 - глюкозамин

Й - фосфатидилэтаноламин

(ФТЭА) О* трипсин

^ •ЧГ* ТЯ!""*';'ТЛСи ' I ЭДвКШЯИгЭ! Щ - соевый ингибитор

♦ * 4 трипсина

Рис. 3. Варианты исследования биоспепифического связывания.

Предварительно были проведены хроматографические эксперименты, в которых участвовали монолитный сорбент, с ковалентно присоединенным СИТР, а также находя-

щиеся в подвижной фазе ПММАД и ПС частицы, модифицированные ФТЭА (68.2% заполнение поверхности) или ГА (57.1% заполнение поверхности). Результаты данных экспериментов подтвердили наличие неспецифических взаимодействий обсуждаемых лишзд-ных и сахаридных лигандов с поверхностью ГМА-ЭДМА-СИТР полимера.

Из данных Таблицы 5 очевидно, что постепенное усложнение поверхностной структуры наносфер приводило к снижению их адсорбции на поверхности сорбента, модифицированного единственным белком. Данный результат можно объяснить как стерическими факторами, так и наличием связей различной природы, способных конкурировать со специфическим взаимодействием лиганд - комплемент.

Кардинально противоположная ситуация наблюдалась в процессах адсорбции частиц с разным поверхностным составом на многокомпонентной поверхности сорбента (Таблица 5). За исключением наносфер, модифицированных только трипсином, где число адсорбированных наночастиц снижалось более чем в два раза по сравнению с адсорбцией на монолите, модифицированным единственным лигандом - СИТР, адсорбционная емкость (Ртах) с тонкой подстройкой поверхностного микроокружения белка в худшем случае практически не изменялась, а в лучшем - увеличивалась (Таблица 5).

Таблица 5

Количественные характеристики аффинного взаимодействия, полученные методом фронтального

анализа

Комплемент Заполнение поверхности наносфер лигандом, % Лиганд(ы)

СИТР СИТР-ГА-ФТЭА

Q'm^xl0°, | частиц/глобулы лиганда K'dissX 10V М Q'mavX 10°, частиц/глобулы лиганда K'fcX 10^ м

ПС-ТР 48.4 7.2 1.0 3.3 1.9

ПС-ТР-ГА 43.1/37.5 2.5 0.6 4.2 0.6

ПС-ТР-ФТЭА 45.0/36.0 2.1 0.6 3.1 0.2

ПС-ТР-ГА-ФТЭА 41.9/11.7/44.6 14 1.4 1.5 0.3

ПММАД-ТР 66.8 1.2 3.8 9.2

Обозначения: ПС - полистирольные карбоксилированные наносферы, ПММАД - полиметилметакрилатные карбоксилированные наносферы, стабилизированные декстраном, СИТР соевый ингибитор трипсина; TP - трипсин, ФТЭА • фос-фотидилэтаноламин; ГА - глюкозамин

m\'QVp, где Q= q/N mK'te-(K/Q)xl/NA

Обозначения: Q - максимальная адсорбционная емкость, количество белка (мг)., рассчитанное из результатов фронтального анализа; Q*,^ - максимальная адсорбционная емкость, рассчитанная да формулеNA - число Авогадро; Q -количество белка (мг), связанное с одной наносферой, q - суммарное количество белка (мг), связанное со всеми нано-сферами, находящимися в растворе; N - количество наносфер в растворе, р - концентрация лигандов, иммобилизованных в единице объема сорбента, К'^ - константа диссоциации аффинного комплекса, рассчитанная по формулеК -константа, найденная из линеаризованных в координатах 1/Q - 1/С изотерм адсорбции. Стандартное отклонение при линеаризации изотермы адсорбции 0.9895-0,9987 (Origin)

В случае частиц ПС-TP увеличившееся значение константы диссоциации комплекса (К'diss) показывало, что микроокружение лиганда на поверхности сорбента вносило некоторый вклад в дестабилизацию аффинного комплекса. Наличие аминосахара на поверхности частиц ПС-ТР-ГА практически никак не отразилось на величине константы диссоциации аффинного комплекса, образующегося в условиях микроокружения СИТР из трех компонентов разной природы. Вероятно, именно липидная составляющая в составе ПС-'ГР-ФТЭА и ПС-ТР-ГА-ФТЭА частиц придавала дополнительную прочность аффинному комплексу по сравнению с упрощенной формой взаимодействия. В случае частиц ПММАД-ТР полисахаридные цепи, по-видимому, ингибировали связывание вирусоподобных частиц со сложной поверхностью сорбента, поскольку значение константы диссоциации увеличилось почти в 2.5 раза (Таблица 5), хотя данное снижение прочности комплекса

не повлияло заметно на величину адсорбционной емкости. В данном случае можно говорить скорее о псевдо-аффинной адсорбции с более слабой энергией взаимодействия комплементов. Хотя полученные результаты представляют определенный научный интерес относительно комплексообразования белков, окруженных функциональными лигандами отличной специфичности, с практической точки зрения, т. е. при конструировании эффективных биораслознающих сепарационных систем, можно сделать вывод о возможности использования традиционных аффинных сорбентов с единственным иммобилизованным лигандом.

2.2,4. Разработка стратегии эффективного метода выделении и очистки вируса грип-¡¡а с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах

Полученные на ранних этапах исследования экспериментальные данные позволили далее осуществить сравнение адсорбционного поведения модельных вирусоподобных частиц с реальным вирусным объектом с использованием тех же методов и сорбентов. В качестве объекта исследования был выбран вирус гриппа. Построение модели вируса гриппа

Одна из задач, решаемых в данном экспериментальном разделе, заключалась в изучении адсорбционного комплексообразования основного антигена вируса гриппа - гемагг-лютинина (НА) - с целью его выделения из гриппозной вакцины с последующим использованием чистого продукта для построения адекватной модели данного типа вируса. Известно, что сиаловая кислота (М-ацетил-нейраминовая кислота) концевых участков олигосаха-ридных цепей гликолипидов и гликопротеинов, расположенных на поверхности клеточных мембран, служит гемагглютинин-связывающим рецептором, провоцирующим проникновение вируса в клетку. Интенсивно исследуемая в настоящее время сиалиллактоза в виде двух изомерных форм, а именно, а-2,3- и а-2,6-сиалилпроизводные лактозы, была выбрана в качестве потенциального биоспецифического лигапда.

Оптимизация методов ковалентного связывания выбранного лиганда с поверхностью ГМЛ-ЭДМА носителей

Очевидно, что стерическая доступность для взаимодействия с вирусом небольшого по размерам лиганда - сиалиллактозы, будет иной в сравнении с крупными лигандами, каковыми являются белки. Конформация сиштового производного, необходимая для специфического связывания с антигеном вируса, может претерпевать изменения в ходе иммобилизации на поверхности жесткой матрицы. Поэтому для максимально эффективного экспонирования на поверхности сорбента данного лиганда и сохранения его биологической функции использовались различные способы иммобилизации. Предварительно, в структуру сиалиллактозы методом аминирования вводились реакционноспособные аминогруппы. В результате использования всех, приведенных на Рис. 4 а-ё, подходов к иммобилизации аминопроизводного сиалиллактозы был получен ряд аффинных носителей с различным количеством лиганда на поверхности сорбента (Таблица 6).

^»«е-^г ? I \ ¡ : л { фей»,

«-СЯ:

V

А« ги £Л ^

рл*« г?и/ ^

Ч-Я

Рис. 4 а-«. Различные способы иммобилизации аффинного лиганда (СЛА) на поверхности ГМА-ЭДМА монолитного диска.

Сравнительное изучение эффективности аффинных сорбентов на примере выделении гемагглютинина из гриппозной вакцины

В качестве источника основного антигена вируса гриппа гемагглютинина использовалась вакцина Грипповак, состав которой представлял собой смесь контаминаятных и вирусных белков (общий белок - 2100 мкг/мл, овальбумии - 0.04 мкг/мл, гемагглютинин вируса А - 19.2 (Н1) и 18.8 (НЗ) мкг/мл, гемагглютинин вируса гриппа В - 25.6 мкг/мл). Для сравнения полученных ранее носителей раствор вакцины с концентрацией 1 мг белка/мл в ацетатном буфере (рН 6.0) пропускался со скоростью подвижной фазы 2 мл/мин через каждый из шести приготовленных монолитных дисков (Таблица 6) до полного насыщения адсорбционных сайтов сорбента. Элюция раствором соли, предшествующая десорбции, осуществлялась с целью удаления неспецифически адсорбированных белков вакцины. Десорбцию специфически связанного с лигандом НА проводили путем резкого изменения рН буфера в сторону щелочных или кислых значений. Было показано, что наиболее полная десорбция достигалась при использовании натрий-боратного буфера, рН 10.7, приводя к полному разрушению комплекса и высвобождению чистого искомого продукта - гемагглютинина. Данный результат подтверждался методом электрофореза в 15% полиакрила-мидном геле (ПААГЭ).

Низкая эффективность носителя (Таблица 6), напрямую модифицированного амини-рованной сиалиллактозой (Рис. 4 а) наиболее вероятно связана с обсуждаемыми ранее сте-рическими препятствиями при образовании комплекса с участием белка большого размера, каким является гемагглютинин. Этот факт указывает на то, что структурного спейсера, а именно, лактозного кольца длиной 1 им, недостаточно для обеспечения беспрепятственного взаимодействия НА с СЛА. Кроме того, при относительно невысокой концентрации привитого прямым методом низкомолекулярного лиганда велика вероятность его локализации в малых порах, недоступных для проникновения белка. В конечном счете, максимальное связывание гемагглютинина наблюдалось на сорбенте с СЛА, иммобилизованным с участием спейсера СИТР (Рис. 4 в). Носитель СИТР-С-СЛА несколько уступал предыдущему в эффективности связывания искомого белка (Таблица 6). При равной концентрации аффинного лиганда на поверхности носителей СИТР-С-СЛА и А-СИТР-СЛА (Таблица 6) величина адсорбционной емкости последнего оказалась в три раза ниже полученной на носителе СИТР-С-СЛА. Такой результат, вероятно, связан с изменением морфологии сорбента в ходе его модификации, протекающей в достаточно агрессивных условиях.

Таблица б

Концентрация лиганда сиалилпактозы и адсорбционная емкость сорбентов, полученная при

выделении гемагглютинина из гриппозной вакцины

СЛА ЦП СИТР-СЛА А-СИТР-СЛА СИТР-С-СЛА БСА-СЛА Пояи(МАГ-ВП-АК)-СЛА

р 15.7±0 8 0 8±0.05 0.6±0.05 1.4±0.1 1.4±0.1 3.5±02 5.1±0.3

<3х102 0.7±0.05 7.9±0 5 26.6±1.0 5.1±0.5 16.0±0.5 1.2±0.1 1.0±0.08

р - концентрация СЛА, мкмоль/мл сорбента; (,) - адсорбционная емкость, моль НА/моль СЛА, %, СЛА - сиалиллакто-зияамин, ЦП - церулоплазмин, СИТР-СЛА - соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, А-СИТР-СЛА - соевый ингибиюр трипсина, иммобилизованный на альдегидсодержащей поверхности сорбента и далее модифицированный сиалиллактозиламином, СИТР-С - сукцинилированный соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, БСА-СЛА - бьгчий сывороточный альбумин, модифицированный сиалиллакгозиламином, поли{МАГ-ВП-АК)-СЛА - сополимер 2-деокси-Ы-метакриламино-]>глн>козы с ЭД-винилпирролидоном и акролеином, модифицированный сиалиллактозиламином.

Невысокая адсорбционную емкость БСА- и ЦП-носителей (Таблица 6) можно объяснить эффектом экранирования большей части иммобилизованных низкомолекулярных лигандов, обусловленным большими размерами спейсериых белков. В отличие от спейсе-ров-белков, сополимер (Рис. 4 ё), имеющий в составе боковой сахаридный остаток, проявлял собственное сродство к гемагглютинину. При этом, однако, сополимер не был инертен по отношению к другим компонентам вакцины, поэтому промежуточный шаг элюирова-ния солевым буфером являлся обязательным в случае использования данного макромоле-кулярного лиганда. Таким образом, все сконструированные аффинные носители позволяли селективно выделять гемагглютинин из гриппозной вакцины. Введение промежуточного спейсера между низкомолекулярным лигандом и поверхностью жесткой полимерной матрицы продемонстрировало положительную тенденцию к увеличению адсорбционной емкости аффинных сорбентов.

Сравнительный анализ адсорбционного поведения на формируемых носителях синтетических моделей вируса гриппа и реального вируса гриппа

Очередная задача в данном экспериментальном разделе заключалась в конструировании модельных частиц, имитирующих вирус гриппа, а также сравнительном анализе адсорбционного поведения вируса гриппа и его модели с использованием наиболее эффективных биораспознающих систем (СИТР-СЛА и СИТР-С-СЛА). Сферический вирион вируса гриппа с диаметром 80-120 нм имеет снаружи двойной слой липидов, в котором закреплены три вирусных белка, большую часть из которых составляет гемагглютинин (НА). В качестве основы для конструирования модели такого вируса были выбраны полисти-

рольные монодисперсные наносферы диаметром 80 нм, содержащие на поверхности реак-ционносдасобные аминогруппы. Данные группы полимерных частиц позволили осуществить связывание с карбоксильными группами гемаггяютинина посредством их активации водорастворимым карбодиимидом. Именно такое экспонирование молекул НА на поверхности полимерных частиц, не затрагивающее сигнальный пептид бедка на Ы-конце полипептидной цепи, являлось адекватным природной локализации гемагглютинина в составе вирусной частицы. Сравнение параметров аффинного взаимодействия вируса гриппа А (НШ1) и его функциональной модели с аффинными лигандами осуществлялось с использованием количественных результатов, полученных методом фронтального элюирования (Таблица 7).

Таблица 7

Количественные данные адсорбции вируса гриппа А и его модели, полученные из результатов

фронтального анализа

Вирус г риппа А ПС-НА

Диск СИТР-С-СЛА СИТР-СЛА СИТР-СЛА

Р 1.4 0.6 0.6

Qmax 0.141 0109 0.030

QxicF" 2.0 1.6 1.9*

Титр 20 20 -

"> сг = (<5„»чхк/муо

С? - адсорбционная емкос-гь сорбента, частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формул и , Г)1Г1.., - максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка НА (мг/мл сорбента), рассчитанное из изотерм адсорбции, К - значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирисне, к общему количеству молекул белка 6 Еирише, равное 0 74; М ~ молекулярная масса белка; о - количество молей гемагглютинина на вирион;

количество белка (мг), ковалентио связанное с 1 микросферой; ц - суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех микросфер в растворе; N - количество микросфер в растворе; р - концентрация аффинного лиганяа (СЛА мкмоль/мл сорбента); Титр - количество гемагглютииируюших единиц в мл (гае/мл), полученное тестом на ге-магглютйнацию. Стандартное отклонение при трехкратном воспроизведении аффинной ВЭМДХ составило ± 7%

На данном этапе также исследовалась возможность эффективного использования тестируемых аффинных матриц для селективного выделения вируса гриппа непосредственно из-биологического материала, представляющего собой фильтрат аллантоисной жидкости куриных эмбрионов Оптимизированные хроматографические условия, используемые для выделения гемагглютинина из вакцины, были перенесены на выделение вируса гриппа и его моделей. Количественная оценка белка в десорбированных фракциях осуществлялась методом Лоури. Идентичность хроматограмм (Рис. 5) и невероятная близость значений адсорбционной емкости сорбента, выраженной в частицах на мл сорбента (Таблице 7), свидетельствует о том, что созданная модель вируса на основе латекса близка к оригиналу как по геометрическим размерам, там и по функциональным свойствам.

и

Условия• 1 - загрузка растворов вируса гриппа (а) с концентрацией 0.50 мг белка или полимерных на-носфер (б), мсдифицировашшх гемагглютинином, с концентрацией 0.03 мг белка в мл 0.05 М натрий-ацетатноз о буфера (рН 6.2) на аффинный диск, модифицированный СИТР-СЛА, 2 - элюирование неепецифически связанных компонентов образца О 4 М и 2.0 М NaCi в 0.01 М PBS буфере (рН 6.5), я 3 - десорбция вируса гриппа или модельных частиц с использованием 12.5 М натрий-боратного буфера (рН 10.7). Скорость элюции: 2 мл/мин.

° 2 4 Чы? " 12 "

Рис. 5. Хроматограммы двух образцов, вируса ирипла А (а) и его модельных частиц (б), полученные на аффинном диске, модифицированным СИТР-СЛА.

Тест на гемагглютинирующую активность подтвердил, что в десорбируемых фракциях действительно содержался вирус гриппа, а метод культивирования вируса в клетках почки собаки (Ш5СК) показал, что выделенный предложенным методом вирус сохраняет свою целостность структуры и, следовательно, биологическую активность. Важным результатом хроматографии частиц на монолитных стационарных фазах является чрезвычайно малое для аффинного варианта разделения время одного пробега (Рис. 5). Разработка метода селективного выделения вирионов вируса гриппа А с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах. Функционализация монолитных сорбентов

Как упоминалось ранее, более высоких величин адсорбционной емкости для крупных объектов можно добиться увеличением объема сорбента и удалением низкомолекулярного лиганда от поверхности полимерной матрицы Другим подходом, способным увеличить производительность хроматографического процесса, основанного на аффинных взаимодействиях, может являться подбор наиболее эффективных лигандов и оптимизация условий их иммобилизации. Попытка реализовать подобный способ увеличения продуктивности сепарационяой системы была предпринята в серии экспериментов с вирусом гриппа В данном случае были получены аффинные носители с различными вариациями иммобилизованных лигандов, проявляющих собственное специфическое сродство к вирусу гриппа. На Рис. 6 а-г представлены аффинные матрицы, полученные с использованием выбранных лигандов.

Рис. 6. Схемы модификации поверхности ГМА-ЭДМА монолигаых дисков (б) а-2,6-сиалшлактозой (СЛ), (а) а-метилтрицшсло[3.3.1Л\3,73декан-1-метанамином (ремантадин), (в) гепарином, а также (г) хитозаном и сиалиллактозиламином или сс-2,6-сиалиллактозой.

Метод зонального элюирования: скоростная псевдо-аффинная хроматография на монолитных фазах

Полученные аффинные сорбенты (Таблица 8) тестировали методом зонального элюирования. Объектом исследования являлся вирусный материал (вирус гриппа A H1N1), культивируемый в клетках почки обезьяны (VERO). Проводимые эксперименты имели целью оптимизацию условий адсорбции вируса из неочищенного биологического материала и разработки оптимального метода его десорбции. Согласно данным гемагглютинирующе-го теста, максимальная активность вируса была зафиксирована в области рН 6.0-7.0, а изменение концентрации буфера в пределах 0.05-1.0 М не оказывало влияния на его активность. Поэтому 0.05 М ацетатный буфер (рН 6.2) использовался на этапе адсорбции вируса. Для этого фиксированный объем раствора с концентрацией 1.1 мг белка/мл в 0.05 М ацетатном буфере (рН 6.2) наносился на каждый из рассматриваемых сорбентов. Вирус, адсорбированный на монолите, функционализированным гепарином, полностью десорби-ровался при использовании 0.4 М NaCl (Таблица 8) в 0.01 М PBS буфере (рН 6.5), что подтверждалось данными гемагглютинирующего теста Для других аффинных носителей, вирус был обнаружен только во фракциях, десорбированных 0.2 М NaOH. Следует отметить, что высокое значение рН буфера, используемого для десорбции, было немедленно приведено к нейтральному значению.

Таким образом, относительный анализ фракций, десорбированных с различных функционализированных поверхностей монолитных носителей по результатам теста на гемагглютинирующую активность позволил сравнить эффективность предложенных ли-гандов. Согласно представленным результатам (Таблица 8), наилучшие адсорбционные возможности продемонстрировали два аффинных носителя, содержащие в качестве лиган-дов а-2,6-сиалиллактозу, и хитозан, модифицированный а-2,6-сиалиллактозой.

Таблица 8

Характеристики аффинных матриц, использованных для выделения вируса гриппа

р ~ концентрация аффинного лиганда (имоль/мл сорбента), титр - количество ге-маплютинируюших единиц в мл (гае/мл). СЛА-сиалиллакгтозиламин, СЛ~а~2,6-сиа-лиллактоза.

Метод фронтального элюирования

Дальнейшие хроматографические эксперименты с использованием метода фронтального элюирования и оптимизированных условий адсорбции и десорбции вируса позволили количественно оценить максимальную величину адсорбционной емкости, которая может быть получена на каждой из двух выбранных аффинных матриц, модифицированных СЛ и хитозан-СЛ, соответственно. Наличие вируса в десорбируемых фракциях анализировали тестом на гемагглютинацию, а количественную оценку белка в десорбируемых фракциях осуществляли с помощью БСА-микротеста. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила определить максимальную адсорбционную емкость каждого носителя (Ршах), выраженную в мг белка/мл (Таблица 9). Величина титра определяется именно гемагглютинином вируса гриппа, который способен агглютинировать эритроциты, поэтому значение адсорбционной емкости было пересчитано в более адекватные единицы (частицы/мл сорбента). В отличие от результатов зонального анализа (Таблица 9), которые показали сходство адсорбционной активности дисков с сиалиллактозой, иммобилизованной напрямую на поверхности сорбента и через реакцию связывания с хитозаном, значе-

Лиганд Р Титр

Ремантадин 4S9M22.0 7

Хитозан 0.3±0.01 20

а-2,б-СЛ 17.0±0.5 27

Хитозан-СЛ 2.3±0.1/13.0±0.5 27

Хитозан-СЛА 1.0±005/18.5±1.0 13

Гепарин 1.6±0.05 13

ния адсорбционной емкости этих же дисков, полученные методом фронтального элюиро-вания, как и титр вируса в десорбируемых фракциях, различались в 2.5 раза (Таблица 9).

Таблица 9

Количественные данные фронтального элюирования вируса гриппа А

(" Q={(Qm„.xK)/M)/o

Q - адсорбционная емкость сорбента, количество частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формулы QmLLX - максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка (мг/мл сорбента), рассчитанное из данных фронтального анализа, К -значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирионе к общему количеству молекул белка в вирионе, равное 0.74; М - молекулярная масса белка; о - количество моль гемагглютинина на вирион. Стандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.99800.9981 (Origin).

Вероятно, в случае аффинного носителя с иммобилизованной сиалиллактозой одинаковое количество аффинных сайтов оказалось активным по отношению к вирусу гриппа вне зависимости от наносимого на носитель объема, а следовательно, количества образца. Согласно полученным данным, наибольшее количество вирионов вируса гриппа с сохранением их природной патогенности удалось выделить с использованием аффинного монолитного носителя, модифицированного последовательно хитозаном и а-2,6-сиалиллактозой.

2.2.5. Диагностика вирусов гриппа А и В с использованием ГМА-ЭДМА монолитного сорбента в виде непроточных слоев (биочипов)

Методология, основанная на процессах биологического распознавания, может быть использована в методе скоростной хроматографии на монолитах для очистки и выделения вирусов. Создание биораспознающих систем в формате непроточных слоев (биочипов), сохраняющих ту же химическую природу монолитного сополимера и геометрию его поро-вой структуры, а также природу биологических лигандов и методы их введения в структуру поверхности, предоставляет иные практические возможности (скриннинговые тесты в медицинских целях, диагностика вирусных инфекций). В условиях отсутствия потока в формате биочипа именно дизайн порового пространства полимерного носителя в случае работы с вирусами должен обеспечивать как свободное проникновение частиц внутрь трехмерного порового пространства сорбента, так и достаточную адсорбционную емкость носителя.

Создание микроаналитических слоев на основе ГМА-ЭДМА монолита

В отличие от описанного выше ГМА-ЭДМА макропористого монолита, синтезируемого методом термоинициируемой свободно-радикальной полимеризации и используемого для хроматографии, ультратонкие ГМА-ЭДМА слои получали фотополимеризацией. Оптимизация условий фотоинициируемой полимеризации позволила получить макропористые ГМА-ЭДМА сополимеры в виде трехмерных тонких слоев с морфологическими свойствами, близкими к свойствам ГМА-ЭДМА монолитных дисков.

Согласно разработанному методу, создание биочвпов на основе ГМА-ЭДМА монолитного сополимера включает в себя несколько стадий: (1) подготовка стеклянной подложки, формирование оперативной ячейки; (2) введение методом силанизации в структуру стекла двойных связей, способных участвовать в последующей сополимеризации с ГМА и ЭДМА мономерами; (3) формирование монолитного полимерного слоя методом фотоинициируемой полимеризации.

2.2.5.1. Разработка алгоритма диагностики на биочипе на примере модельных частиц

Апробацию биочипов проводили с использованием двух аффинных пар: монокло-напьные антитела против транстиретина (МАт) - транстиретин (ТТР), и соевый ингибитор трипсина (СИТР) - трипсин (TP). Для детектирования аффинных комплексов использова-

Параметры Лиганды

СЛ хитозан - СЛ

Р 17.0 13.0

Qmax 02 0.5

Q х 10"u 2.8 1 6.9

Титр 27 67

лись методы иммуноферментного и флюоресцентного анализа Введение флуоресцентной метки в молекулу белка подразумевало реакцию связывания аминогрупп белка с флюоре-скамином (ФЛ). Образование конъюгата ТР (или МАт) с пероксидазой хрена (ПХ), согласно классическому методу, осуществлялось с использованием перийодатного окисления полисахаридных цепей фермента с образованием активных альдегидные групп, способных далее вступать в реакцию с аминогруппами биологических молекул. С использованием выбранных модельных белков (ТР и ТТР) или их конъюгатов СГР-ФЛ и ТР-ПХ) были получены функционализированные наночастицы на основе полистирольных карбоксилиро-ванных наносфер размером 80 нм.

Функционализация поверхности монолитного слоя (биочипа) или проточной колонки (диска) осуществлялась одним из аффинных партеров выбранных пар (МАт против ТТР и СИТР). Метод прямой иммобилизации белков, широко используемый для модификации поверхности монолитных дисков, был перенесен на формат непроточных слоев. Для этого чип, имеющий активную часть в виде сдоя сорбента размером 25x18x0.2 мм, погружался в раствор лиганда (Таблица 10). Для иммобилизации СИТР и МАт против ТТР на поверхности макропористых монолитных сорбентов (дисков) использовали: 1. прямую одностадийную иммобилизацию СИ'ГР в статических условиях; 2. иммобилизацию МАт против ТТР с использованием однократной гидравлической подачи шприцом раствора белка в поры с последующей длительной инкубацией реакционной смеси в статических условиях. Коли-чесгво ковалентно связанного с поверхностью сорбента СИТР совпало с данными, полученными при иммобилизации того же лиганда на поверхности непроточного слоя биочипа (Таблица 10). Этот факт может являться косвенным подтверждением сходства морфологии монолитных сорбентов, полученных в процессе фото- и термополимеризации. В то же время, количество иммобилизованных МАт против ТТР на поверхности тонкого ГМА-ЭДМА слоя оказалась практически в три раза меньше такового, полученного при гидравлическом способе введения того же лиганда в норовое пространство диска Очевидно, что при статическом способе иммобилизации лиганда проникновение молекул лиганда в поры сорбента и внутрипоровое движение молекул к эпоксидным группам, локализованным на стенках пор, лимитируется медленной стадией диффузии, что приводит к потере некоторой доли связываемого лиганда

Методом скоростного фронтального анализа на монолитных ГМА-ЭДМА дисках были определены характеристики связывания иммобилизованного аффинного лиганда с нативным белком-партнером и модифицированной аналогичным белком латексной частицей. Результаты динамических экспериментов, представленые далее в Таблице 10, сравнивались с аналогичными характеристиками, полученными на биочипе с использованием специально разработанного метода С целью оптимизации процедуры анализа на чипе, а именно, оптимизации времени, необходимого для аффинного взаимодействия иммобилизованного лиганда с растворенным комплементом, проводили серию экспериментов, направленных на изучение адсорбции анализируемых веществ на поверхности модифицированного лигандом диска в статических условиях. Биоспецифическая адсорбция комплемента имела место при погружении диска с иммобилизованными МАт против ТТР на 15 и 90 минут в растворы различных концентраций ТТР или полимерных наночастиц, модифицированных ТТР. Для достижения в статических условиях величины динамической адсорбционной емкости сорбента по отношению к наночастицам потребовалось гораздо больше времени, а именно, 90 минут (Таблица 10). Этот факт можно объяснить очень медленной диффузией вирусоподобных частиц в пределах жесткого макропористого пространства в отсутствии конвективного потока

Количественный анализ образования аффинных пар СИТР-ТР и МАт-ТТР, осуществляемый на биочипе

Характеристики аффинного связывания (максимальная адсорбционная емкость и термодинамическая константа диссоциации аффинных комплексов К^та) в формате биочипа с участием нативных белков (ТТР и ТР) определялись по разработанной для этого методике и сравнивались с параметрами, полученными для наночасгиц, функционализиро-ванных теми же белками. В случае аффинной пары МАт - ТТР использовался непрямой «сэндвич» метод (ИФА), тогда как СИТР - ТР комплекс оценивался прямым методом с использованием флюоресцентного (ФЛА) и ферментного маркеров (ИФА). Процесс аффинного связывания комплементов происходил в течение 15 минут как для случая прямого, так и «сэндвич» методов. Это время было рассчитано для толщины ГМА-ЭДМА слоя в биочипе (0.2 мм), которая в 7.5 раз была меньше половины толщины монолитного диска (1.5 мм), где проникновение вещества из раствора в поровое пространство в статических условиях (в течение 90 минут, см. выше) происходит в двух направлениях, т. е. как снизу, так и сверху погруженного в раствор диска. И действительно, в формате биочипа выбранное время проникновения анализируемых веществ (белков и более крупных частиц) и реализации аффинной адсорбции оказалось достаточным, что позволило получить близкие значения адсорбционной емкости в сравнении с емкостью, детектируемой в случае использования аффинных дисков (Таблица 10).

Количественное определение содержания целевого компонента осуществлялось методом твердофазной деиситометрии (в УФ и видимой области спектра, соответственно) относительно калибровочной прямой построенной с использованием растворов белка или наночастиц известной концентрации. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила получить параметры аффинного связывания (Таблица 10). Неполное соответствие величин аффинного связывания (Таблица 10), полученных для пары МАт-ТТР в двух рассматриваемых форматах биоанализа (динамической режим ВЭМДАХ и биочип), можно объяснить различием схем образования аффинного комплекса, а именно прямого способа комплексообразования в проточной системе и комплексообразования с использованием «сэндвич» метода в непроточном варианте.

Таблица 10

Определение параметров связывания для модельных аффинных пар в двух форматах

Аффинная пара МАт-ТТР СИТР-ТР

Параметры ВЭМДАХ Биочип Биочип

Динамическая Статическая ИФА ВЭМДАХ ФЛА ИФА

рхЮ"", глобул белка/мл сорбента 33.0 9.0 0.7 0.7 0.6

кл55(СИТР-ТР)хЮ', М 2.0 2.5 1.0 1.1 1.0 0.6

<5'пзах(ТР)х102, глобул белка/глобулы лиганда 38 1.2(15 мин) 1.6 15.0 14.0 5.0

С"тах (ПС-ТР)х10\ частиц/глобулы лиганда 7.0 2.0 (15 мин) 6.0 (90 мин) 3.0 7.2 7.3 4.5

°' (2'ша\ ~ (Q iW М) х NA /р

(Z) 0"шч = (Q rnJ Q*yp, где Q*- q/N

Q' K - максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа, Q"msX-количество белка (мг), рассчитанное с использованием формул (1>и<2); М -молекулярная масса белка; NA - число Авогадро, Q* - количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 нансфе-рой; q - суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе, N - количество наносфер в растворе; р - концетрация аффинных лиганяов. Стандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.9745-0.9987 (Origin).

Предел чувствительности для пары МАт - ТТР составил 7.1x107 модифицированных ТТР наночастиц на спот. В случае другой аффинной пары (СИТР-ТР) при использовании

флуоресцентного маркера наблюдалось практически полное совпадение характеристи аффинного связывания, полученных в двух рассматриваемых форматах (Таблица 10). Пр дел чувствительности для этого варианта анализа составил 9.8х107 модифицированны конъюгатом ТР-ФЛ наночастиц на спот. Несколько более низкие значения данных пар метров, а именно 2.1х107 модифицированных конъюгатом ТР-ПХ наночастиц на спот, бь ли получены для этой же аффинной пары при использовании ферментной метки (Табли 1(>), что, вероятно, может быть связано со стерическими ограничениями при образовали аффинного комплекса СИТР-ТР, которые создает молекула пероксидазы хрена, сущес венно превосходящая в размерах глобулу трипсина Тем не менее, значение констан диссоциации для этой аффинной пары хорошо согласуются в проточном и непроточно форматах монолитного сорбента.

Таким образом, оптимальная поровая структура монолитного слоя в непроточн формате обеспечивает возможность эффективных аффинных взаимодействий с участие крупных объектов. Полученные данные подтверждают предположение о сходстве адсор ционного поведения наночастиц в двух сравниваемых в данном разделе форматах мои литных поверхностей. Как прямой, так и непрямой - «сэндвич» - методы анализа мо бьгть рекомендованы для применения в диагностике вирусных инфекций. 2.2.5.2. Обнаружение вирусов гриппа в биологических образцах с использование разработанной тест-системы на основе биочипов

Разработанная стратегия анализа вирусоподобных частиц в формате биочипа легла основу создания микротест-систем, предназначенных для ранней диагностики гриппа.

Предварительные эксперименты с использованием «сэндвич» метода анализа биол гических жидкостей, содержащих вирусы гриппа А или В, показали удовлетворительнь результаты. Однако с целью сокращения времени анализа использовали прямой метод д тактирования, а также оптимизировали процедуру анализа, в частности, время иммобил зации биологических образцов (вирусов). Отсутствие окрашивания зон с иммобилизова ными контрольными образцами и достаточная чувствительность (0.2 гае), достигаемая два часа иммобилизации, позволила перейти к решению более сложных задач, а именно ранней диагностики вирусов гриппа. На основе результатов анализа клинического мат риала 83 пациентов, который параллельно тестировался классическими методами диагн стики вируса гриппа, были получены следующие характеристики разработанной те системы: чувствительность - 80 и 93 %; специфичность - 61 и 83 % для вирусов А и В, с ответственно. Следует заметить, что данные, полученные на предлагаемом нами биочип соответствуют средним характеристиками известных тест-систем при значительном с кращении времени анализа. Выводы

1. Впервые получены физико-химические модели вирусов с использованием диальд гидной сшивки белка и ковалентной модификации реакционнослособной поверхн ста наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вируся оболочки.

2. Методом высокоэффективной ионообменной и аффинной хроматографии на ультр коротких монолитных колонках проведен сравнительный анализ адсорбционно поведения нативных белков (овальбумина, трипсина, соевого ингибитора трипсин транстиретина) и модельных наночастиц на их основе; показано, что адсорбция м дельных частиц определяется природой и количеством привитого лиганда.

3- Впервые сконструирована модельная система, имитирующая адсорбционное вз-модёйствие вируса с клеткой; методом скоростной аффинной хроматографии на м нолитах установлено влияние микроокружения на характеристики биоспецифич ского связывания вирусоподобных наночастиц с поверхностью сорбента.

4. Разработаны к оптимизированы оригинальные методы формирования биокомплементарной адсорбционной поверхности монолитной стационарной фазы для прямого выделения вируса гриппа из сложных биологических смесей; путем подбора наиболее эффективного лиганда, а также вариацией методов иммобилизации лиганда на поверхности сорбента предложен псевдо-аффинный скоростной вариант хромато-графического выделения вируса гриппа А из биологических образцов.

5. На примере двух модельных аффинных пар белков (моноклоналъные антитела против транстиретина-транстиретин и соевый ингибитор трипсина-трнпсин) разработан метод количественного определения вирусоподобных частиц в формате полимерных биочипов; апробирован макет биочипа, предназначенный для нанодиагносгики вирусов гриппа А и В.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. I. Kalashnikova, N. Ivanova, Т. Evseeva, A. Menshikova, Е. Viakh, Т. Tennikova. Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein-bearing particles II J. Chromatogr. A 2007. V. 1144. № l.P. 40-47.

2. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Macroporous monolithic layers as efficient 3-D rnicroarrays for quantitative detection of virus-like particles // Anal Chem. 2007. V. 79. № 14. P. 5173-5181.

3. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Development of a new strategy of influenza virus separation based on pseudo-affinity chromatography on short monolithic columns // Anal. Chem. 2008, V. 80. Ns 6. P. 2188-2198.

4. I. Kalashnikova, E. Vlakh, T.Evseeva, A. Menshikova, T. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein bearing particles, in: Book of abstracts of the 5lh International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", Saint-Petersburg, Russia, 2005, P. 116.

5. И. В. Калашникова, H. Д. Иванова, А. Ю. Меньшикова, Т. Б. Тенникова, Изучение динамической адсорбции укрупненных белковых молекул в условиях хроматографии на монолитных сорбентах, в: Сборник тезисов II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, Россия, 2006, Ч. 3, С. 89.

6. 1. Kalashnikova, N. Ivanova, Т. Evseeva, A. Menshikova, Т. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of virus-mimiking synthetic particles bearing different protein at their outer surface, in: Book of abstracts of Monolith Summer School (MSS 2006) "Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis Portoroz, Slovenia, L19, P.26.

7. 1. Kalashnikova, N. Ivanova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova, Use of microarray approach for quantitative detection of virus-like particles, Monolith Summer School (MSS 2006) "Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis", Portoroz, Slovenia, 2006, http://www.n3onoliths.com/library/pdf7posters/Kalashnikova_MSSj06.pdf.

8. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, New generation of bioanalytical rnicroarrays for quantitative detection of human virjses, in: Book of abstracts of the "International Congress on Analytical Sciences", ICAS-2006, Moscow, Russia, 2006, P. 249.

9. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, S. Ilisavsky, Development of novel approach using monolithic sorbents for quantitative isolation of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference "Modern problems of microbiology arid biotechnology", Odessa, Ukraine, 2007, P. 87.

10. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, Development of microarray approach for diagnostics of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference "Modern problems of microbiology and biotechnology", Odessa, Ukraine, 2007, P. 102.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Высокомолекулярные соединения и их разнообразие.

1.1.1. Вирусы: структура, функции, применение.

1.1.2. Конструирование модельных биосистем на основе синтетических и природных полимеров.

1.1.2.1. Формирование конъюгатов.

1.1.2.2. Липосомальные структуры.

1.1.2.3. Полимерные частицы как субстрат для конструирования модельных биосистем.

1.2. Хроматография как эффективный метод выделения и исследования вирусов.

1.2.1. Особенности хроматографии вирусов.

1.2.2. Основные типы хроматографии, используемые для разделения вирусов.

1.2.2.1. Гель-проникающая хроматография.

1.2.2.2. Ионообменная хроматография.

1.2.2.3. Аффинная и псевдо-аффинпая хроматография.

1.3. Монолитные маркопористые сорбенты и особенности хроматографического разделения с их использованием.

1.3.1. Синтез и морфология монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов.

1.3.2. Гидродинамика и массоперенос в проточных монолитах.

1.4. Практическое приложение принципа биологической комплементарности.

1.4.1. Аффинная хроматография.

1.4.1.1. Высокоэффективная аффинная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках).

1.4.1.2. Выбор аффинного лиганда.

1.4.1.3. Роль промежуточных спейсеров.

1.4.1.4. Способы ковалентного введения в структуру поверхности носителя биоаффинных лигапдов.

1.4.1.4.1. Модификация и активация и поверхностных групп сорбентов.

1.4.2. Биологические тест-системы.

1.4.2.1. Планшетные диагностикумы.

1.4.2.2. Многоканальные диагностические линейки (биочипы).

1.4.2.2.1. Материалы, используемые для создания непроточных матриц (двумерные и трехмерные биочипы).

1.4.2.2.2. Методы количественного детектирования зон анализируемых веществ.

Глава 2. Результаты и обсуждение.

2.1. Конструирование физико-химических моделей вирусов.

2.2. Исследование динамической адсорбции модельных частиц методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках.

2.2.1. Ионообменная хроматография модельных частиц.

2.2.2. Поведение вирусоподобных частиц в условиях биоаффинной адсорбции на поверхности монолитных фаз.

2.2.3. In vitro моделирование взаимодействий вирус-клетка.

2.2.4. Разработка стратегии эффективного метода выделения и очистки вируса гриппа А с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах.

2.2.5. Диагностика вирусов гриппа А и В с использованием ГМА-ЭДМА монолитного сорбента в виде непроточных слоев (биочипов).

2.2.5.1. Разработка алгоритма диагностики на чипе на примере модельных частиц.

2.2.5.2. Обнаружение вирусов гриппа в биологических образцах с использованием разработанной тест-системы на основе биочипов.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Конструирование моделей вирусов.

3.3.2. Высокоэффективная монолитная дисковая хроматография (ВЭМДХ).

3.3.2.1. Ионообменная хроматография.

3.3.2.2. Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография (ВЭМ-ДАХ).

3.3.2.2.1. Подготовка аффинных сорбентов на основе монолитных дисков.

3.3.2.2.2. ВЭМДАХ модельных вирусоподобных частиц.

3.3.2.3. Псевдо-аффинный вариант ВЭМДХ.

3.3.3. Тест-системы на основе ГМА-ЭМА непроточных слоев.

3.3.3.1. Количественный анализ содержания белка и вирусоподобных частиц в модельных растворах.

3.3.3.2. Диагностика вирусов гриппа А и В.

Выводы.

Выделение и тонкая очистка вирусов имеет огромное значение при производстве вакцин и других медицинских препаратов на их основе. Диагностика вирусных заболеваний, основанная на высокочувствительном детектировании вируса, направлена на раннее его выявление и своевременное проведение противоэпидемических мероприятий, а также позволяет расширить возможности в лечении болезней, вызванных данным патогеном.

Применяемые на практике традиционные методы (в том числе, хроматографиче-ские) выделения и детектирования вирусов, как правило, демонстрируют низкую эффективность. Вероятно, причиной этому являются как физико-химические, так и биохимические особенности вирусных частиц, а именно, их низкая диффузионная подвижность, связанная с большим размером, а также сложная мультикомпонентная и достаточно лабильная структура вирионов. Разделение вирусов на классических хроматографических колонках, упакованных дисперсным сорбентом, где вся жидкость течет сквозь межчастичное пространство, осуществляется при абсолютном доминировании диффузионного массооб-мена между подвижной и неподвижной фазами. В случае таких разделительных сред вирусные частицы путем собственной диффузии должны проникнуть из межчастичного пространства внутрь поры, где отсутствует поток подвижной фазы, и подойти к поверхности, содержащей адсорбционно-активные сайты. Процесс десорбции сопровождается тем же движением частицы, но уже в обратном направлении, т. е. из порового пространства в межчастичный поток жидкой фазы. Такой ограниченный диффузией механизм разделения увеличивает продолжительность хроматографического процесса, а вместе с этим, и вероятность потери объектом биологической активности.

Огромные возможности для решения вопросов разделения вирусов предоставляет высокоэффективная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках, ВЭМДХ). Данный метод основан на использовании в качестве стационарных фаз макропористых полимерных сорбентов монолитного типа, в частности, твердых сополимеров на основе глицидилметакршшта (2,3-эпоксипропилметакрилата) и этженгликолъдиметак-рилата (ГМА-ЭДМА). Морфологические, стерические и гидродинамические свойства данных носителей позволяют проводить процессы эффективного разделения таких крупных объектов, как макромолекулы ДНК и белки. Осуществление скоростных разделений является следствием практически полного отсутствия диффузионных ограничений нормальному межфазовому переносу вещества. Это означает, что эффективное разделение макромолекул, имеющих невысокую диффузионную подвижность, на ультракоротких монолитных колонках (дисках) становится возможным благодаря присутствию полностью сквозного внутрипорового потока жидкости, что приводит к изменению обычного диффузнойного механизма межфазового массообмена вещества на конвекционный, определяемый высокой проницаемостью для потока жидкости монолитного сорбента. При этом именно вследствие резкого увеличения проницаемости сорбента существенно увеличивается диффузионная подвижность разделяемых молекул, что, соответственно, приводит к уменьшению времени, необходимого для достижения ими локализованного на поверхности проточных каналов (пор) адсорбционного центра и, соответственно, увеличению числа вероятных контактов с функциональной поверхностью. Кроме того, малый диаметр и открытая структура проточных пор, на поверхности которых происходит адсорбционное разделение, а также практическое отсутствие пристеночного слоя стагнантной (неподвижной) жидкости, обеспечивают минимальное диффузионное сопротивление подходу вещества к стенке поры. Таким образом, реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных дисперсных сорбентов, что позволит избежать деструкции биопродукта и, соответственно, потери его активности.

Адсорбционная хроматография с использованием в качестве стационарных фаз мо-, нолитных сорбентов в настоящее время детально исследована для разделения биологически активных веществ широкого ряда молекулярных размеров (пептиды, олигонуклеоти-ды, белки, ДНК, РЫК). Однако данные о применении монолитов для реализации межфа-, зовых процессов, построенных на динамической адсорбции крупных частиц, а именно, вирусов, практически отсутствуют.

В связи с высокой стоимостью вирусного материала и его патогенными свойствами на этапе разработки экспериментальных алгоритмов хроматографической сепарации вирусов представляется целесообразным использование модельных частиц, имитирующих геометрические параметры вирусов (размер и форму), и, следовательно, диффузионные характеристики, а также адсорбционные свойства их поверхности. Разнообразие структурных свойств поверхности вирусных частиц определяет механизм их адсорбционных взаимодействий с поверхностью сорбента, сопровождающихся образованием различного типа связей, а именно, высокоспецифических (или биоаффинных), и более слабых ионных, гидрофобных, координационных. Подобные взаимодействия можно воссоздать in vitro введением в искусственно конструируемые модельные наночастицы лигандов различной природы и специфичности.

Как правило, взаимодействие вирусов с клеткой основано на принципе комплементарное™ и происходит на границе раздела фаз, когда один из аффинных партнеров располагается в мембране клетки, а второй является компонентом поверхностной оболочки вирусной частицы, находящейся в потоке биологической жидкости. Скоростная аффинная хроматография на ультракоротких монолитных колонках предоставляет исключительные возможности для моделирования и изучения in vitro процессов специфического ком-плексообразования в динамических условиях. Помимо этого, именно аффинный вариант ВЭМДХ является единственным хроматографическим типом, позволяющим осуществлять выделение продуктов высокой степени чистоты из нативных биологических жидкостей с сохранением их активности, что чрезвычайно важно для вирусов.

Следует отметить, что принцип биологической комплементарности может использоваться в двух принципиальных вариантах межфазовых разделений, а именно, в динамическом (проточном) формате аффинной хроматографии, и в статическом (непроточном) формате биологических тест-систем. Монолитный материал и методологии, разработанные для скоростной аффинной хроматографии, могут быть использованы с целью создания биораспознающих систем в формате нанобиочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, например, для диагностики вирусных заболеваний. В отличие от монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов, использующихся в ВЭМДХ, эти носители, являясь непроточными системами, сохраняют ту же физическую и химическую организацию (структуру разделительного слоя).

Таким образом, развитие и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию вирусов, так и их достоверную идентификацию-с использованием современных полимерных материалов и новейших подходов диагностики вирусных инфекций с привлечением биочиповой технологии, является, несомненно, актуальной задачей.

Целью настоящей работы являлось исследование особенностей адсорбции крупных модельных частиц и вирусов на функционализированной поверхности ГМА-ЭДМА монолитных фаз в динамическом (проточном) формате, т. е. в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии на метакрилатных монолитах, а также в статическом (непроточном) варианте с использованием трехмерных биочипов с аналогичной полимерной поверхностью. В практические цели исследования также входила разработка схем выделения и методов детектирования вирусов, с учетом выявленных особенностей их адсорбции на поверхности монолитных фаз. В связи с вышесказанным, были поставлены и решались следующие задачи: конструирование физико-химических моделей вирусов с использованием различных материалов и методов; исследование особенностей адсорбционного поведения модельных наночастиц в динамических условиях различных вариантов ВЭМДХ;

- построение модельной системы, имитирующей взаимодействие вирус-клетка, при участии специально сконструированных наночастиц и функциопализированной поверхности монолитного сорбента; на примере модельных наночастиц, разработка методов биоанализа в формате биочипа, построенных на использовании монолитных полимерных слоев; разработка и оптимизация хроматографических схем выделения вируса гриппа из сложных биологических образцов, а также диагностической нанотест-системы для детектирования вируса гриппа непосредственно в клиническом материале.

Объектами исследования являлись физико-химические модели вирусов, полученные с использованием методов сшивки белка с помощью диальдегида и ковалснтной модификации поверхности полимерных наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки, а также вирусы гриппа.

В качестве методов исследования использовались: спектрофотометрия в УФ- и видимой областях, элементный анализ, ИК-спектроскопия, колориметрические, биохимические и биологические методы; экслюзионный, ионообменный и аффинный варианты жидкостной хроматографии; зональный и фронтальный хроматографические методы анализа; флюоресцентный и иммуноферментный методы анализа: метод твердофазной ден-ситометрии (в УФ и видимой области спектра); полиакриламидный гель-электрофорез.

Научная новизна работы состоит в следующем: на примере вирусоподобных синтетических частиц впервые научно обоснована возможность реализации скоростных эффективных процессов сепарации крупных биологических объектов (вирусов) с использованием ионообменного и биоаффинного вариантов жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках, отличающихся избирательностью адсорбции и энергией взаимодействия вещества с поверхностью стационарной фазы; впервые показана возможность проведения количественного анализа вирусоподобных частиц в формате ЗБ-биочипов на основе макропористого сополимера ГМА-ЭДМА с использованием детектирующего метода твердофазной денсито-метрии; путем выбора из широкого ряда кандидатов оптимального лиганда впервые предложен эффективный метод выделения вируса гриппа A (H1N1), основанный на псевдо-аффинном варианте хроматографии на монолитах.;

- впервые предложен высокочувствительный метод детектирования вирусов гриппа А и В с использованием разработанной тест-системы (биочипа).

Практическая значимость работы. Сконструированы биораспознающие системы для сепарации вирусов методом высокоэффективной псевдо-аффинной хроматографии на монолитах. Предложен метод чувствительной и эффективной диагностики вирусов гриппа А и В с использованием специально сконструированных ЗБ-биочипов (трехмерных биочипов). Таким образом, разработан и оптимизирован методологический комплекс, включающий сепарацию вирусов и их достоверную идентификацию с привлечением одного и того же ГМА-ЭДМА сорбента монолитного типа.

Основные положения, выносимые на защиту: физико-химические модели вирусов (вирусоподобные наночастицы) могут быть получены контролируемыми методами сшивки белка с использованием диальде-гида, а также ковалентной модификации полимерных наносфер белком и другими лигандами; адсорбция вирусоподобных наночастиц на функционализированной поверхности сорбента (монолита) определяется природой белка, локализованного на их поверхности; величина максимальной адсорбционной емкости сорбента в аффинном и ионообменном вариантах ВЭМДХ уменьшается с увеличением размера наночастиц и не зависит от скорости потока подвижной фазы; усложнение микроокружения на поверхности как сорбента, так и наночастиц в модельной системе, имитирующей взаимодействия «вирус-клетка», может ока-; зывать влияние на характеристики биоспецифического связывания; использование различных подходов к иммобилизации лигандов при создании эффективных псевдо-аффинных носителей демонстрирует возможность увеличения производительности хроматографических процессов, основанных на биоспецифическом взаимодействии вируса гриппа с адсорбционно-активными сайтами сорбента; методологические подходы детектирования и количественной оценки связывания, разработанные на примере вирусподобных частиц в формате непроточных ГМА-ЭДМА слоев (биочипов), могут быть положены в основу чувствительных тест-систем для диагностики вируса гриппа.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: 5th International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), 2-ая Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах»

Санкт-Петербург, Россия, 2006), 2nd Monolith Summer School «Application in biochroma-tography, bioconversion and solid phase synthesis» (Порторож, Словения, 2006), 4th International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006), The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, включающих 3 полнотекстовые статьи, а также 7 тезисов устных и стендовых докладов.

Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 44 рисунками, список цитируемой литературы включает 209 источников.

Выводы

1. Впервые получены физико-химические модели вирусов с использованием диальде-гидной сшивки белка и ковалентной модификации реакционно-способной поверхности наносфер белками другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки.

2. Методом высокоэффективной ионообменной и аффинной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках проведен сравнительный анализ адсорбционного поведения нативных белков (овальбумина, трипсина, соевого ингибитора трипсина, транстиретина) и модельных наночастиц на их основе; показано, что адсорбция модельных частиц определяется природой и количеством привитого лиганда.

3. Впервые сконструирована модельная система, имитирующая адсорбционное взаимодействие вируса с клеткой; методом скоростной аффинной хроматографии на монолитах установлено влияние микроокружения на характеристики биоспецифического связывания вирусоподобных наночастиц с поверхностью сорбента.

4. Разработаны и оптимизированы оригинальные методы формирования биокомплементарной адсорбционной поверхности монолитной стационарной фазы для прямого выделения вируса гриппа из сложных биологических смесей; путем подбора наиболее эффективного лиганда. а также вариацией методов иммобилизации лиганда на поверхности сорбента предложен псевдо-аффинный скоростной вариант хроматох рафического выделения вируса гриппа А. из биологических образцов.

5. На примере двух модельных аффинных пар белков (моноклональные антитела против транстиретина-транстиретин и соевый ингибитор трипсипа-трипсин) разработан метод количественного определения вирусоподобных частиц в формате полимерных биочипов; апробирован макет биочипа, предназначенный для нанодиагно-стики вирусов гриппа А и В.

1. А. М. Шур. Высокомолекулярные соединения. Москва. Высшая школа. 1981. 657 с.

2. Н. А. Платэ, А. Д. Литманович, О. В. Ноа. Макромолекулярные реакции. Москва. Химия. 1977. 254 с.

3. М. В. Волькенштейн. Молекулярная биофизика. Москва. Наука. 1975. СС. 616

4. Ж.-М. Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Новосибирск. Наука. 1998. 334 с.

5. В. И. Кремянский. Структурные уровни живой материи. Теоретические и методологические проблемы. Москва. Наука. 1969. 296 с.

6. А. Г. Букринская. Вирусология. Москва. Медицина. 1986. 336 с.

7. R. J. Russell. RNA viruses as virotherapy agents // Cancer Gene Ther. 2002. V. 9. P. 961-996.

8. P. Singh, M. J. Gonzalez, M. Manchester. Viruses and their uses in nanotechnology // Drug Develop. Res. 2006. V. 67. P. 23-32.

9. M. И. Штильман. Полимеры в биологически активных системах // Соросовский образовательный э/сурнал. 1998. Т. 5. С. 48-53.

10. А. И. Мелькер, Т. В. Воробьев. Самоорганизация и образование геликоидальных структур полимеров // Физика твердого тела. 1997. Т. 39. С. 1883-1888.

11. Л. И. Валуев, Т. А. Валуева. И. Л. Валуев, Н. А. Платэ. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений // Yen. биол. химии. 2003. Т. 43. С. 307-328.

12. В. А. Кабанов. От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам // Высокомолек. соед. 2004. Т. 46. С. 759-782.

13. Е. В. Кудряшова, А. К. Гладилин, А. В. Левашов. Белки в надмолекулярных ансамблях: исследование структуры методом разрешено-временной флуоресцентной анизотропии // Yen. биол. химии. 2002. Т. 42. С. 257-268.

14. Р. В. Петров, Р. М. Хаитов. Новая отечественная тривалентная конъюгированная полимерсубъединичная вакцина Гриппол // Бюллетень «Вакцинация». 1999. Т. 5. С. 6-11.

15. Н. А. Платэ, А. Е. Васильев. Физиологически активные полимеры. Москва. Химия, 1986. 293 с.

16. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика, Москва. Мир, 1991. 556 с.

17. W. Vangrysperre, Н. Kersters-Hilderson, М. Callenst, С.К. De Bruyne. Reaction of Woodward's reagent К with D-xylose isomerases // Biochem. J. 1989. V. 260. P.163-169.

18. G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith. Immobilized Affinity Ligand Techniques. New York. Academic Press. 1992. 454 p.

19. H. Ф. Казанская, О. А. Кост, И. В. Березин. Свойства трипсина, модифицированного глутаровым альдегидом И Биоорг. химия. 1975. Т. 1. С. 1337-1344.

20. Н. П. Кузнецова, JI. Р. Гудкин, С. В. Кольцова, Р. Н. Мишаева. Особенности поликонденсации белков с глутаровым альдегидом // Высокомолек. соед. 1996. Т. 38. С. 1668-1673.

21. D. Е. Myers, F.M. Uckun, S.E. Swaim, D.A. Vallera. The effects of aromatic and aliphatic maleimide crosslinkers and anti-CD-5 ricin immunotoxins // J. Immunol. Meth. 1989. V. 121. P. 129-142.

22. Ю. А. Овчинников, Биоорганическая химия, Москва. Просвещение, 1987. СС. 816. А. П. Каплун, Л. Б. Шон, Ю.М. Краснопольский, В. И. Швец. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. С. 2-11.

23. Y. Hagiwara, H. Arima, Y. Miyamoto, F. Hirayama, K. Uekama. Preparation and pharmaceutical evaluation of liposomes entrapping salicylic acid/g-cyclodextrin conjugate // Chem. Pharm. Bull 2006. V. 54. P. 26-32.

24. M. Takanashi, K. Inafuku, T. Miyagi, H. Oku, K. Wada, T. Imura, D. Kitamoto. Efficient preparation of liposomes encapsulating food materials using lecithins by a mechano-chemical method Ц J. Oleo Sci. 2007. V. 56. P. 35-42.

25. S. Ristori, J. Oberdisse, I. Grillo, A. Donati, 0. Spallak. Structural characterization of cationic liposomes loaded with sugar-based carboranes // Biophysical J. 2005. V. 88. P. 535-547.

26. M. Amacker, 0. Engler, A. R. Kammer, S. Vadrucci, D. Oberholzer, A. Cerny, R. Zur-briggen. Peptide-loaded chimeric influenza virosomes for efficient in vivo induction of cytotoxic T cells // Int. Immunol. 2005. V. 17. P. 695-702.

27. K. Hashizaki, H. Taguchi, C. Itoh, H. Sakai, M. Abe, Y. Saito, N. Ogawa. Effects of poly(ethylene glycol) (PEG) chain length of PEG-lipid on the permeability of liposomal bilayer membranes // Chem. Pharm. Bull. 2003. V. 51. P. 815-820.

28. T. JI. Рунова, А. В. Аникин, M. В. Аникин, Ю. Л. Себякин. Стабильные полимерные липосомы на основе 1,2-ди-9-(2£,4£)-гексадиенилоксикарбонилнопаноил]-5л?7-глицеро-3-фосфохолина // Биоорг. хгшия. 1996. Т. 22. С. 809-814.

29. P. A. Sivakumar, К. P. Rao. Polymerized (ethylene glycol) dimethacrylate—cholesteryl methacrylate liposomes: preparation and stability studies I I React. & Funct. Polym. 2001. V. 49. P. 179-187.

30. Л. И. Барсуков. Как собрать мембрану (солюбилизация и реконструкция мембран) // Соросовский образовательный журнал. 2004. Т. 8. С. 10-16.

31. А. А. Болдырев. Матриксная функция биологических мембран // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. С. 2-8.

32. А. Ю. Барышников, Н. А. Оборотов. Иммунолипосомы новое средство доставки лекарственных препаратов // Современная онкология. 2001. Т. 3. С. 44-48.

33. Е. В. Богданенко, Ю. В. Свиридов, А. А. Московцев, Р. И. Жданов. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46. С. 2-10.

34. J. Raedler, Е. Sackmann. Functionalization of solids by ultrathin soft polymer films and polimer/lipid film composites: modelling of cell surfaces and cell recognition processes // Cur. Opin. Solid State Mater. 1998. V. 2. P. 330-336.

35. M. Tanaka, E. Sackmann. Polymer-supported membranes as models of the cell surface // Nature 2005. V. 437. P. 656-663.

36. O. P. Tiourina, I. Radtchenko, G. B. Sukhorukov, H. Mohwald. Artificial cell based on lipid hollow microcapsules: channel reconstruction and membrane potential measurement // J. Membrane Biol. 2002. V. 190. P. 9-16.

37. G. В. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld, E. Knippel, M. Knippel, A. Budde, H. Mohwald. Layer-by-Layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles // Colloid. Surf. : Physicochem. Ang. Aspects. 1998. V. 137. P. 253.

38. H. Г. Балабушевич, Г. Б. Сухоруков, Н. И. Ларионова. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и меламин формальдегида // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. Т. 43. С. 374.

39. G. В. Sukhorukov, Е. Donath, S. Моу, A.S. Susha. Microencapsulation by means of stepwise adsorbtion of polyelectrolytes // Microencapsulation. 2000. V. 17. P. 177.

40. G. Berth, A. Voigt, H. Dautzenberg, E. Donath, H. Mohwald. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate // Biomacromolecules. 2002. V. 3. P. 579.

41. N. G. Balabushevitch, O. P. Tiorina, D. V. Volodkin, N. I. Larionova, G. B. Sukhorukov. Loading the Multilayer Dextran Sulfate/Protamine Microsized Capsules with Peroxidase // Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 1191.

42. Y. M. Lvov, G. B. Sukhorukov. Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged macromolecules // Membr. Cell. Biol. 1997. V. 11. P. 277.

43. Y. Miyazaki, S. Yakou, K. Takayama. Effect of amount of water in dispersed phase on drug release characteristics,of dextran microspheres prepared by emulsion-solvent evaporation process II Biol. Pharm.-Bull. 2007. V. 30. P. 543-546.

44. R. Dinarvand, S. Mahmoodi, E. Farboud, M. Salehi, F. Atyabi. Preparation of gelatin microspheres containing lactic acid-effect of cross-linking on drug release // Acta Pharm. 2005. V. 55. P. 57-67.

45. H. И. Прокопов, И. А. Грицкова, В. P. Черкасов, А. Е.Чалых. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований // Yen. химии 1999. Т. 65. С. 178-192.

46. J. W. Goodwin, J. Hearn, С. С. Но, R. Н. Ottewill. Studies On The Preperation And Characterisation Of Monodisperse Polystyrene Latices // Colloid. Polym. Sci. 1974. V. 252. P. 464-471.

47. С. E. Reese, S. A. Asher. Emulsifier-free emulsion polymerization produces highly charged monodisperse particles for near infrared photonic crystals // J. Colloid Interf. Sci. 2002. V. 248. P. 41-46.

48. А. В. Лебедев. Эмульсионная полимеризация и ее применение в промышленности. Москва. Химия, 1976. 240 с.

49. F. J. Gella, J. Serraa, J. Generx. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis // Pure & Appl. Chem. 1991. V. 63. P. 1131-1134.

50. A. M. Carmona-Ribeiro. Bilayer vesicles and liposomes as interface agents // Chem. Soc. Rev. 2001. V. 30. P. 241-247.

51. Б. А. Руденко. 100 лет хроматографии, Москва. Наука, 2003. СС. 738.

52. М. R. Geier, Н. Stanbro, С. R. Merril. Endotoxins in commercial vaccines // Appl.

53. Environm. Microbiol. 1978. V. 36. P. 445-449.

54. Т. B. Tennikova, B. G. Belenkii, F. Svec. High-performance membrane chromatography. A novel method of protein separation Ц J. Liq. Chomatogr. 1990. V. 13. P. 63-70.

55. F. Svec, C. G. Huber. Monolith Materials. Promises, Challenges, Achievements // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 2100-2107.i "

56. A. E. Rodrigues. Permeable packings-and perfusion chromatography in protein separation II J. Chromatogr. B. 1997. V. 699. P. 47-61.

57. A. Jungbauer. Chromatographic media for bioseparation // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1065. P. 3-12.

58. W. C. Lee. Protein separation using non-porous sorbents // J. Chromatogr. B. 1997. V. 699. P. 29-45.

59. Я. И. Яшин, А. Я. Яшин. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Состояние и перспективы // Ж. Росс. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева. 2003. Т. XLVII. С. 64-79.

60. R. Ghosh. Protein separation using membrane chromatography: opportunities and challenges II J. Chromatogr. A. 2002. V. 952. P. 13-27.

61. Т. B. Tennikova, J. Reusch. Short monolithic beds: history and introduction to the field // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1065. P. 13-17.

62. M. Barut, A. Podgornik, P. Brne, A. Strancar. Convective Interaction Media short monolithic columns: Enabling chromatographic supports for the separation and purification of large biomolecules II J. Sep. Set 2005. V. 28. P. 1876-1892.

63. B. Kalbfuss, M. Wolff, R. Morenweiser, U. Reichl. Purification of cell culture-derived human influenza A virus by size-exclusion and anion-exchange chromatography // Bio-technol. Bioeng. 2007. V. 96. P. 932-944.

64. С. C. Loa, T. L. Lin, С. C. Wu, T. A. Bryan, H. L. Thacker, T. Hooper, D. Schrader. Purification of turkey coronavirus by Sephacryl size-exclusion chromatography // J. Virol. Meth. 2002. V. 104. P. 187-194.

65. M. de las M. Segura, A. Kamen, P. Trudel, A. Gamier, A novel purification strategy for retrovirus gene therapy vectors using heparin affinity chromatography // Biotechnol. Bioeng. 2005. V. 90. P. 391-404.

66. A. R. Neurath, J. T. Stasny, B. A. Rubin, R. W. Hartzell, F. P. Wiener. Gel Filtration on Agarose in the Separation of Adeno-associated Viruses from Adenoviruses and their structural components II J. Gen. Virol. 1969 . V. 5. P. 451-454.

67. M. Ollivon, A. Walter, R. Blumenthal. Sizing and separation of liposomes, biological vesicles, and viruses by high-perfonnance liquid chromatography // Anal. Biochem. 1986. V. 152. P. 262-274.

68. S. E. Bresler, G.I. Bespalova, V. M. Kolikov , S. P. Zhdanov, E.V. Koromaldi, T. Y. Luzyanina, L.Y. Reikh. Purification of influenza viruses on wide-pore glass columns // Acta Virol. 1975. V. 19. P. 190-196.

69. M. A. Kamberoglu, S. Ozturk, M. A. Yilmaz. A simple alternative method for the purification of Citrus tristeza virus // Phytopathol. Mediterr. 2001. V. 40. P. 176-180.

70. D. Debelak, J. Fisher, S. Iuliano, D. Sesholtz, D.L. Sloane, E.M. Atkinson. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2 И J. Chromatogr. B. 2000. V. 740. P. 195-202.

71. F. Blanche, B. Cameron, A. Barbot, L. Ferrero, T. Guillemin, S. Guyot, S. Somarriba, D. Bisch. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles // Gene Ther. 2000. V. 7. P. 1055-1062.

72. B. Rotman. Uses of ion exchange resins in microbiology // Bacteriol. Rev. 1960. V. 24. P. 251-260.

73. К. S. Zerda, С. P. Gerba, К. С. Hou, S. M. Goyal. Adsorption of Viruses to Charge-Modified Silica // Appl. & Environm. Microbiol. 1985. V. 49. P. 91-95.

74. P. A. Shields, S. R. Farrah. Characterization of Virus Adsorption by Using DEAE-Sepharose and Octyl-Sepharose // Appl. & Environm. Microbiol. 2002. V. 68. P. 39653968.

75. S. Yamamoto, E. Miyagawa. Retention behavior of very large biomolecules in ion-exchange chromatography H J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 25-30.

76. V. Klyushnichenko, A. Bernier, A. Kamen, E. Harmsen. Improved high-performance liquid chromatographic method in the analysis of adenovirus particles // J. Chromatogr. B. 2001. V. 755. P. 27-36.

77. P. Kramberger, N. Petrovic, A. Strancar, M. Ravnikar. Concentration of plant viruses using monolithic chromatographic supports // J. Virol Meth. 2004. V. 120. P. 51-57.

78. K. Branovic, D. Forcic, J. Ivancic, A. Strancar, M. Barut, T. Kosutic-Gulija, R. Zgorelec, R. Mazuran. Application of short monolithic columns for improved detection of viruses // J. Virol. Meih 2003. V. 110. P. 163-171.

79. P. Gagnon. Monoliths seen to revitalize bioseparations // Genet. Eng. News. 2006. V. 26. P: 44-46.

80. P. Kramberger, M. Peterka, J. Boben, M. Ravnikar, A. Strancar. Short monolithic col-umns-A breakthrough in purification and fast quantification of tomato mosaic virus // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1144. P. 143-149.

81. Я. Туркова. Аффинная хроматография. Москва. Мир, 1980. 472 с.

82. A. Zahn, J.-P. Allain. Hepatitis С virus and hepatitis В virus bind to heparin: purification of largely IgG-free virions from infected plasma by heparin chromatography // J. General Virol. 2005. V. 86. P. 677-685.

83. N. Maheshri, J. T. Koerber, В. K. Kaspar, D. V. Schaffer. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 198-204.

84. E. Feyzi, E. Trybala, T. Bergstrom, U. Lindahl, D. Spillmann. Structural Requirement of Heparan Sulfate for Interaction with Herpes Simplex Virus Type 1 Virions and Isolated Glycoprotein СII J. Biolog. Chem. 1997. V. 272. P. 24850-24857.

85. L. Opitz, J. Salaklang, H. Biittner, U. Reichl, M.W. Wolff. Lectin-affinity chromatography for downstream processing of MDCK cell culture derived human influenza A viruses // Vaccine. 2007. V. 25. P. 939-947.

86. F. Brown, B.O. Underwood, К. H. Fantes. Purification of poliovirus by affinity chromatography II J. Med. Virol. 2005. V. 4. P. 315-319.

87. K. J. Schwab, R. De Leon, M. D. Sobsey. Immunoaffinity Concentration and Purification of Waterborne Enteric Viruses for Detection by Reverse Transcriptase PCR // Appl. & Environm. Microbiol. 1996. V. 62. P. 2086-2094.

88. J. T. Koerber, J.-H. Jang, J. H. Yu, R. S. Kane, D. V. Schaffer. Engineering Adeno-Associated Virus for One-Step Purification via Immobilized Metal Affinity Chromato-graph // Human Gene Ther. 2007. V. 18. P. 367-378.

89. A. Nitsche, A. Kurth, A. Dunkhorst; О. Panke, H. Sielaff, W. Junge, D. Muth, F. Schel-ler, W. Stocklein, C. Dahmen, G. Pauli, A. Kage. One-step selection of Vaccinia virus-binding DNA-aptamers by MonoLEX // BMC Biotechnol. 2007. V. 7. P. 48-60.

90. J. R. del Valle, R. M. del Angel. Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography using a recombinant E protein ligand // J. Virol. Meth. 2004. V. 116. P. 95-102.

91. T. Kristiansen, M. Sparrman, L. Heller. Towards a subunit influenza vaccine prepared by affinity chromatography on immobilized lectin // J. Biosci. 1983. Vol. 5. P. 149-155.

92. S. L. Williams, M. E. Eccleston, N. K.H. Slater. Affinity Capture of a Biotinylated Retrovirus on Macroporous Monolithic Adsorbents: Towards a Rapid Single-Step Purification Process I I Biotechnol. Bioeng. 2005. V. 89. P. 783-787.

93. В. В. Игнатов. Углеводузнающие белки-лектины // Соросовский образовательный журнал. 1997. V. 2. Р. 14-20.

94. K. Branovic, A. Buchacher, M. Barut, A.Strancar, D. Josic. Application of semi-industrial monolithic columns for downstream processing of clotting factor IX // J. Chromatogr. B. 2003. V. 790. P. 175-82.

95. P. Kramberger, D. Glover, A. Strancar. Application of Monolithic Columns for the Fast Separation of Nanoparticles // Amer. Biotechnol. Lab. 2003. V. 21. P. 27-28.

96. A. Podgornik, M. Barut, J. Jancar, A. Strancar, T. Tennikova,. High performance monolith chromatography of small molecules I I Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 2986-2991.

97. G. A. Platonova, Т. B. Tennikova. Affinity processes realized on high-flow-through methacrylate-based macroporous monoliths // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1065. P. 1928.

98. A. E. Rodrigues, J. C. Lopes, Z. P. Lu, J. M. Loureiro, M. M. Dias. Importance of in-traparticle convection in the performance of chromatographic processes // J. Chromatogr. 1992. V. 590. P. 93-100.

99. A. E. Rodrigues. Permeable packings and perfusion chromatography in protein separation II J. Chromatogr. B. 1997. V. 699. P. 47-61.

100. F. C. Leinweber, U. Tallarek. Chromatographic performance of monolithic and particulate stationary phases. Hydrodynamics and adsorption capacity // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1006. P. 207-228.

101. К. И. Сакодынский, В. В. Бражников, С. А. Волков, В. Ю. Зельвенский, Э.С. Ганки-на, В. Д. Шатц. Аналитическая хроматография. Москва. Химия. 1993. СС. 464

102. М. В. Tennikov, N. V. Gazdina, Т. В. Tennikova, F. Svec. Effect of porous structure of macroporous polymer supports on resolution in high-performance membrane chromatography of proteins II J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 55-64.

103. N. D. Ostryanina, О. V. Il'ina, Т. B. Tennikova. Effect of experimental conditions on strong biocomplementary pairing in high performance monolithic disk affinity chromatography (HPMDAC) II J. Chromatogr. B. 2002. V. 770. P. 35-43.

104. P. Gustavsson, P. Larsson. Monolithic Polysaccharide Materials. In: F. Svec, T. Tennik-ova, Z. Deyl (Eds.). Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications. Amsterdam. Elsevier. 2003. P. 121-142.

105. E. Calleri, G. Massolini, D. Lubda, C. Temporini, F. C. Loiodice, G. Caccialanza. Evaluation of a monolithic epoxy silica support for penicillin G acylase immobilization. // J. ChromanogrA. 2004. V. 1031. P. 93-100.

106. X. Huang, S. Zhang, G. A. Schultz, J. Henion. Surface-alkylated Polystyrene Monolithic Columns for Peptide Analysis in Capillary Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometry. //Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2336-2344.

107. A. Podgornik, M. Barut, A. Strancar, D. Josic, T. Koloini. Construction of large-volume monolithic columns //Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 5693-5699.

108. M. Benes, D. Horak, F. Svec. Methacrylate-based chromatographic media // J. Sep. Sci. 2005. V. 28. P. 1855-1875.

109. A. Strancar, M. Barut, A. Podgornik, P. Koselj, D. Josic, A. Buchacher. Convective interaction media: polymer-based supports for fast separation of biomolecules H.LC-GC Int.1998. V. 11. P. 660-665.

110. F. Svec, Т. B. Tennikova. Polymeric separation media for chromatography, of biopoly-mers in a novel shape: macroporous membranes Ц J. Bioact. Compat. Polym.:1991. V. 6. P. 95-107.

111. D. C. Sherrington, P. Hodge. Syntheses and separations using functional polymers, New York. Wiley. 1989. PP. 454

112. D. S. Hage. Affinity chromatography: A review of clinical applications // Clin. Chem.1999. V. 45. P. 593-615.

113. H. Zou, Q. Luo, D. Zhou. Affinity membrane chromatography for the analysis and purification of proteins // J. Biochem. Biophys. Meth. 2001. V. 49. P. 199-240.

114. C. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, T. Tennikova. Fast isolation of protein receptors from streptococci-G by means of macroporous affinity discs // J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 65-72.

115. L. Berruex, R. Freitag, Т. B. Tennikova. Comparison of Antibody Binding to Immobilized Group Specific Affinity Ligands in High Performance Monolith Affinity Chromatography //J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. V. 24. P. 95-104.

116. R. Mallik, D. S. Hage. Affinity monolith chromatography // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1686-1704.

117. D. Josic, J. Reusch, K. Loster, O. Baum, W. Reutter. High Performance Membrane Chromatography of Serum and Plasma Membrane Proteins // J. Chromatogr. 1992. V. 590. P. 59-76.

118. N. D. Ostryanina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Multifunctional fractionation of polyclonal antibodies by immunoaffinity high-performance monolithic disk chromatography II J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 163-171.

119. JI. Ф. Мерингова, Г. Ф. Леонтьева, Т. В. Гупалова, Т. Б. Тенникова, А. А. Тотолян. Выделение и исследование рекомбинаш ного IgG-связывающего рецептора стрептококка группы G с использованием макропористых дисков // Биотехнология. 2000. Т. 4. С. 45-53.

120. G. A. Platonova, G. A. Pankova, I. E. Il'ina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Quantitative fast fractionation of pool of polyclonal antybodies by immunoaffinity membrane chromatography // J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 129-140.

121. N. Labrou, Y. D. Clonis. The affinity technology in downstream processing // J. Bio-thechol. 1994. V. 36. P. 95-119. . ,

122. J. Turkova. Bioaffinity Chromatography, in: Aboul-Enein H.Y. (Ed.) Analytical and Preparative Separation methods of Biomacromolecules. New-York. Marcel Dekker. 1999. C. 99-166.

123. Т. M. Phillips, J. M. Krum. Recycling Immunoaffinity chromatography for multiple ana-lyte analysis in biological samples // J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 55-63.

124. N. B. Tulsani, A. Kumar, M. A. Vijayalakshmi. Purification of Muscle Enzymes by Pseudoaffinity Chromatography II Prep. Biochem. Biotechnol. 1999. V. 29. P. 151-161.

125. P. C. Gunaranta, G. S. Wilson. Optimization of multienzyme flow reactors for determination of acetylcholine // Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 402-407.

126. L.-H. Chen, Y.-S. Choi, J. W. Park, J. Kwon, R.-S. Wang, T. Lee, S. H. Ryu, J. W. Park. Effect of Linker for Immobilization of Glutathione on BSA-Assembled Controlled Pore Glass Beads // Bull. Korean Chem. Soc. 2004. V. 25. P. 1366-1370.

127. I. Alvarez, С. M. Strumia, H.E. Bertorello. Preparation of adsorbents applicable to pseu-dobiospecific ligand affinity chromatography using different spacers and ligands // React. <& Fund. Polym. 1997. V. 34. P. 103-111.

128. M. Nisnevitch, M. A. Firer. The solid phase in affinity chromatography: strategies for antibody attachment // J. Biochem. Biophys. Meth. 2001. V. 49. P. 467-480.

129. R. F. Taylor. Protein Immobilization: Fundamentals and Application. New York. Marcel Dekker. 1991. 263 p.

130. K. Bencina, A. Podgornik, A. Strancar, M. Bencina. Enzyme immobilization on epoxy-and lj'-carbonyldiimidazole-activated methacrylate-based monoliths // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 811-818.

131. P. Кельнер, Ж.-М. Мерме, M. Отто, Г. М. Видмер. Аналитическая химия проблемы и подходы. Москва. Мир, 2004. 608 с.

132. Г. Фримель. Иммунологические методы. Москва. Медицина, 1987. 472 с.

133. S. Yang, R. Е. Rothman. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings // Lancet Infect. Dis. 2004. V. 4. P. 337-348.

134. К. James. Immunoserology of Infectious Diseases // Clin. Microbiol. Rev. 1990. V. 3. P. 132-152.

135. M. R. Lequin. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) // Clin. Chem. 2005. V. 251. P. 2415-2418.

136. S. Luft, K. Seme, M. Poljak. Laboratory diagnosis of human Immunodeficiency virus infection Ц Acta Dermatoven АРА. 2004. V. 13. P. 43-49.

137. Т. Т. Нго, Г. Ленхофф. Имммуноферментный анализ. Москва. Мир, 1988. 520 с.

138. Е. Handman, Н. М. Jarvis. Nitrocellulose-based assays for the detection of glycolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose // J. Immunol. Meth. 1985. V. 83. P. 113-123.

139. T. Vo-Dinh, B. Cullum. Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics. Fresenius II J. Anal. Chem. 2000. V. 366. P. 540-551.

140. J. S. Albala. Array-based proteomics: the latest chip challenge I I Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. V. 1. P. 145-152.

141. А. Д. Мирзабеков, Д. В. Прокопенко, В. Р. Чечеткин. Информа1}ионные медико-биологические технологии. Москва. ГЕОТАР-МЕД. 2002. 198 с.

142. С. S. Lee, В. G. Шт. Improvement of protein stability in protein microarrays // Biotech-nol. Lett. 2002. V. 24. P. 839-844.

143. А. Д. Мирзабеков. Биочипы в биологии и медицине XXI века // Вестник Российской Академии Наук. 2003. Т. 73. С. 412-423.

144. G. MacBeath, S. L. Schreiber. Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination // Science. 2000. V. 289. P. 1760-1763.

145. В. B. Haab, M. J. Dunham, P. O. Brown. Protein microarray for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solution // Genome Biol. 2001. V. 2. P. 0004.1-0004.13.

146. M. Nisnevitch, M. A. Firer. The solid phase in affinity chromatography: strategies for antibody attachment II J. Biochem. Biophys. Meth. 2001. V. 49. P. 467-480.

147. A. Sreekumar, M. K. Nyati, S. Varambally, T. R. Barrette, D. Ghosh, T. S. Lawrence, A. M. Chinnaiyan. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins // Cancer Res. 2001. V. 15. P. 7585-7593.

148. D. Murtinco, A. R. Lagoa, F. A. P. Garcia, M. H. Gil. Cellulose derivatives membranes as supports for immobilization of enzymes // Cellulose. 1998. V. 5. P. 299-308.

149. Л. С. Гальбрайх. Целлюлоза и ее производные // Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 11. С. 47-53.

150. Q. Xu, К. S. Lam. Protein and Chemical Microarrays-Powerful Tools for Proteomics // J. Biomed. Biotechnol. 2003. V. 5. P. 257-266.

151. H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, J. Schneider-Mergener, U. Reineke. Coherent Membrane for Parallel Microsynthesis and Screening of Bioactive Peptides // Biopolymers. 2000. V. 55. P. 188-206.

152. A. D. Mirzabekov. DNA sequencing by hybridization-a megasequencing method and a diagnostic tool // Trends Biotechnol. 1994. V. 12. P. 27-32.

153. А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, С. М. Иванов, Е. И. Дементьева, А. Д. Мирзабеков. Белковые микрочипы II ДАН. 2001. Т. 5. С. 701-704.

154. М. Yu. Slabospitskaya. Е. S. Sinitsyna. Е. G. Vlakh. Т. В. Tennikova. Bioanalytical test-systems based on polymer monolithic materials. Book of abstracts International Congress on Analytical Sciences. Moscow. 2006. P. 248

155. E. H. Рахматуллина, Т. В. Гупалова, В. Г. Палагнюк, А. А. Тотолян. Микрометод определения микроальбинурии // Биотехнология. 2005. Т. 1. С. 90-92.

156. П. С. Барбан, Р. А. Пшеничнов, А. Н. Пантюхина, И. Б. Ившина. Иммунофлюорес-центный анализ, Свердловск. УО АН СССР, 1988. 243 с.

157. A. Yu. Menshikova, Т. G. Evseeva, Yu. О. Skurkis, Т. В. Tennikova, S. S. Ivanchev. Monodisperse carboxylated polystyrene particles: synthesis, electrokinetic and adsorptive properties // Polymer. 2005. V. 46. P. 1417-1425.

158. О. H. Lowry, N. I. Posebrough, A. L. Farr, P. I. Randall, Protein measurment with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

159. И. Березин, Б. Коровин. Биологическая химия. Москва. Медицина, 1998. 704 с.

160. T. Ito. Interspecies transmission and receptor recognition of influenza A viruses // Microbiol. Immunol 2000. V. 44. P. 423-430.

161. A. Gambaryan, V. Piskarev, I.Yamskov, A. Sakharov, A. Tuzikov, N. Bovin, N. Ni-fant'ev, M. Matrosovich. Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides // FEBS Lett. 1995. V. 366. P. 57-60.

162. A. Tsuchida, K. Kobayashi, N. Matsubara, T. Muramatsu, T. Suzuki, Y. Suzuki. Simple synthesis of sialyllactose-carrying polystyrene and its bimding with influenza virus // Glycoconj. J. 1998. V. 15. P. 1047-1054.

163. P. Couvreur, C. Vauthier. Nanotechnology: Intelligent design to treat complex disease // Pharm. Res 2006. V. 23. P. 1417-1450.

164. K. Cross, L. Burleigh, D. Steinhauer. Mechanisms of cell entry by influenza virus // Expert Rev. Mol. Med. 2001. V. 6. P. 1-18.

165. J. Ramalho-Santos, M. Pedroso de Lima, The influenza virus hempgglutinin: a model protein in the study of membrane fusion // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1376. P. 147-154.

166. Matrosovich M.N. Towards the development of antimicrobial drugs acting by inhibition of pathogen attachment to host cells: a need for polyvalency. // FEBS Lett. 1989. V. 252. P. 1-4.

167. L. L. Kiessling, J. E. Gestwicki, L. E. Strong. Synthetic multivalent ligands in the exploration of cell-surface interactions // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 696-703.

168. M. F. McCown , A. Pekosz , The Influenza A Virus M2 Cytoplasmic Tail Is Required for Infectious Virus Production and Efficient Genome Packaging // J. Virol. 2005. V. 79. P. 3595-3605.

169. В. M. Блинов, С. M. Ресерчук, В. П. Мишин. Исследование молекулярных механизмов селекции штаммов вируса гриппа по признаку лекарственной устойчивости II ДАН СССР. 1991. Т. 319. С. 1480-1484.

170. P. Luther, W. Cushley, С. Holzer, U. Desselberger, J. S. Oxford. Acetylated galactosa-mine is a receptor for the influenza С virus glycoprotein //Archives of Virology. 1988. V. 101. P. 247-254.

171. S. N. Chirkov. The Antiviral Activity of Chitosan // Appl. Biochem. Microbiol. 2002. V. 38. P. 1-8.

172. S. L. Zebedee, R. A. Lamb. Influenza A virus Мг protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions // J. Virol. 1988. V. 62. P. 2762-2772.

173. M. Imai, T. Mizuno, K. Kawasaki, Membrane Fusion by Single Influenza Hemagglutinin Trimers. Kinetic evidence from image analysis of hemagglutinin-reconstituted vesicles // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 12729-12735.

174. G. N. Khimich, E. N. Rakhmatullina, M. Yu. Slabospitskaya, Т. B. Tennikova, Synthesis and Pore Structure of Monolithic Polymeric Sorbents // Russ. J. Appl. Chem. 2005. V. 78. P. 623-628.

175. P. Nakane, A. Kawada. Peroxidase-labeled antibody: A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. V. 22. P. 1084-1091.

176. V. Korzhikov, O. Nazarova, E. Vlakh, E. Panarin, S. Diederichs, C. Kasper, T. Tennikova. Water-soluble aldehyde bearing polymers of 2-deoxy-2-methacrylamido-D-glucose for bone tissue engineering // J. Appl. Polym. Sci. 2008. in press.

177. К. Наканиси. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Москва. Мир. 1965.251 с.

178. R. Ejaz, Z. Ahmed, N. Siddique, К. Naeem. Chicken meat as a source of avian influenza virus persistence and dissemination // Internat. J. Poultry Sci. 2007. V. 6. P. 871-874

179. J. Vidic, Ales Podgornik, Ales Strancar. Effect of the glass surface modification on the strength of methacrylate monolith attachment // J. Chromatogr. A. 2005. V.1065. P. 5158.