Биофункциональные полимерно-неорганические носители для инженерии костной ткани тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

КОРЖИКОВ Виктор Александрович

БИОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНО-НЕОРГАНИЧЕСКИЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

■ о

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

003465047

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук Теннпкова Татьяна Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Власов Геппадпй Петрович

кандидат химических наук, доцент Домпппа Нппа Семёновна

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Защита диссертации состоится « 9 » апреля 2009 года в 10.00 час. на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Инсппута высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан « 2 » марта 2009 г.

Ученый секретарь

диссертациошюго совета Д 002.229.01

кандидат физ.-мат. наук

Долотова Н. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время высокомолекулярные соединения широко используются в различных областях биологии и медицины благодаря возможности варьировать свойства материала в зависимости от состава и структуры используемых макромолекул. Разработано огромное количество полимерных биоматериалов, удовлетворяющих требованиям биосовместимости и выполняющих различные функции, в частности, имплантантов доя замены поврежденного или утраченного участка костной ткани. Особый интерес представляет использование высокомолекулярных соединений в методе инженерии костной ткани, основанном на помещении клеток, подученных из тканей пациента, на трехмерный носитель (скаффолд), где происходит образование ткани за счет роста и дифференциации клеток. Развитие данного метода продемонстрировало, что для направления процесса в сторону образования костной ткани скаффолды должны функционировать в качестве системы контролируемой доставки биологических сигналов, управляющих поведением клеток. Поэтому возникает фундаментальный интерес изучения условий прочного связывания биологических молекул (лигандов) с поверхностью скаффолда. Несмотря на интенсивные исследования различных полимерных носителей на основе синтетических полимеров (полилактид, полигликолид) и природных биополимеров (хито-зан, коллаген), к настоящему моменту не существует скаффолдов, удовлетворяющих как требованиям механической прочности, так и предоставляющих возможности биофункционализации. Кроме полимеров, в качестве каркасов для инженерии костной ткани используются макропористые керамические матрицы, обладающие достаточной механической прочностью и сходством со структурой неорганической составляющей костей.

В связи с вышесказанным, актуальной задачей представляется создание нового типа скаффолдов, сочетающих в себе керамическую и полимерную составляющие. При этом использование в качестве последней гидрофильных полимеров-носителей, ковалентно модифицированных специальными биологическими молекулами, открывает новые возможности применения полимеров в инженерии костной ткани. Подобный подход является оригинальным и не имеет описанных в литературе аналогов.

Предложенный в работе подход к созданию «интеллигентных» гибридных носителей клеток основан на идее адсорбционного покрытия трехмерной макропористой керамической матрицы биосовместимым полимером, способным к ковалентно-му связыванию биологических молекул (лигандов) без разрушения основной цепи. Биологическая полифункциональность должна обеспечиваться связыванием с полимерной составляющей конструируемого скаффолда лигандов различной специфичности. Минеральная составляющая, в данном случае, обеспечивает механическую прочность и поддержку трехмерного роста клеток, в то время как биофункционали-зированный полимерный компонент ответствен за передачу клеткам сигналов, управляющих их поведением на поверхности гибридной матрицы.

Таким образом, цслыо работы являлось создание полимерной системы, несущей биолиганды, и адсорбированной на поверхности неорганической матрицы с образованием материала, пригодного для использования в качестве скаффолдов для инженерии костной ткани, обеспечивающих интенсивную адгезию и рост клеток.

3

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

• синтез и исследование полимеров-носителей, содержащих контролируемое количество реакпионноспособных групп, способных к ковалентному связыванию биоли-гандов;

• контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями;

• получение полифункционального полимерного «вектора», содержащего биоли-ганды различных типов;

• изучение гидродинамических характеристик исходных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами различных молекулярных размеров;

• сравнительное исследование адсорбции полученных полимеров-носителей на различных неорганических материалах и выбор матрицы для создания гибридных скаффолдов;

• изучение адсорбции и десорбции синтезированных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами на выбранной неорганической матрице;

• оценка цитотоксичности полимеров-носителей и их конъюгатов с целевыми биологическими молекулами, а также исследование влияния введения различных биолигандов в полимерную составляющую гибридного скаффолда на поведение живых клегок.

В качестве методов исследования использовались свободно-радикальная полимеризация и сополимеризация, периодатное окисление а-гликолей и снятие ди-этилацетальной защиты, N-алкилирование; вискозиметрия и светорассеяние; ЯМР спектроскопия, а также спектроскопия в ИК-, УФ- и видимой областях; полиакри-ламидный гель-электрофорез, флуоресцентный и фотометрический анализ, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия; аффинная хроматография; специальные биологические методы работы с культурами клеток, а также методы обработки данных, полученных в биологических экспериментах. Научная новизна.

• Разработана новая стратегия создания биофункциональных полимерно-неорганических скаффолдов для инженерии костной ткани, заключающаяся в использовании гидрофильного полимера-носителя в качестве подвижного макромоле-кулярного спейсера, адсорбционно связанного с поверхностью неорганической макропористой подложки и модифицированного биомолекулами, способными интенсифицировать процессы адгезии и роста клеток.

• Впервые получены гидрофильные полимеры-носители на основе поливинилсаха-ридов, содержащие контролируемое количество реакпионноспособных альдегидных групп.

• Впервые проведено контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями и доказана возможность создания полифункциольналыюго полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов различной специфичности.

• Показано наличие адсорбции полученных полимеров и конъюгатов ira поверхности керамических матриц.

• Методами вискозиметрии и светорассеяния определены гидродинамические. параметры полученных конъюгатов поливинилсахаридов с лигандами различного молекулярного размера.

• На основании тестов на циготоксичность полученных полимеров в растворе и адсорбированном состоянии, а также гибридных скаффолдов, в полимерную составляющую которых были введены биомолекулы различной функциональности, показана возможность использования конъюгированных с биолигандами выбранных полимеров-носителей в качестве фактора, управляющего поведением клеток. Практическая значимость. Разработан и экспериментально апробирован технологический принцип создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани. На примере синтезированных альдегидсодержащих поливинилсахаридов показана перспективность контролируемой модификации полимеров-носителей специальными биомолекулами с возможностью получения моно-, би- и полифункциональных конъюгатов и последующем введением их путем адсорбции в состав гибридных скаффолдов для интенсификации процессов адгезии и роста клеток. Основные положения, выносимые на защиту:

• Создано первое поколение гибридных скаффолдов, включающих в себя полимер-носитель, несущий лиганды, управляющие поведением клеток.

• Путем полимераналогичных превращений, а также методом сополимеризации с защищенным альдегидным мономером, возможно контролируемое введение в поли-винилсахариды альдегидных групп.

• Разработаны условия контролируемого введения биолигандов различной функциональности и молекулярного размера в альдегид-содержащие поливинилсахариды с различной структурой реакционноспособного звена, а также условия получения полифункционального полимерного «вектора», содержащего несколько лигандов различной биологической специфичности.

• Альдегидсодержащие полимеры-носители на основе винилсахарида и их конъю-гаты с биолигандами образуют адсорбционное покрытие на поверхности минеральной матрицы, которое не обладает цитотоксичностью и оказывает положительное влияние на адгезию и рост клеток.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих симпозиумах и конференциях: 1-й и 4-й Санкт-Петербургских конференциях молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 и 2008), The young scientists and students international scientific conférence «Modem problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), International symposium «European BioPerspectives 2007» (Кёльн, Германия, 2007), International symposium «20л Meeting of the European Society for Animal Cell Technology» (Дрезден, Германия, 2007), International conférence «Baltic Polymer Symposium 2007» (Друскининкай, Литва, 2007), 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практических семинарах в Институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и в Институте технической химии Университета

Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Работа была поддержана грантами РФФИ (№ 05-03-32310) и Немецкого Научного Общества (DFG, КА 1784/4-1). Для выполнения части исследования на территории Германии автор получил персональную стипендию Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD, 1.09.2006 -28.02.2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано тринадцать печатных работ, включающих 4 статьи и 9 тезисов докладов.

Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии п интерпретации и обсуждении полученных результатов, а также в подготовке публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы. Материалы диссертации и по жены на 166 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 6] рисунком, список цитируемой литературы включает 197 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность проводимых исследований, сформулированы цели и задачи работы, определена научная новизна, охарактеризована практическая значимость полученных результатов, изложены основные положения, выносимые на защиту, а также приведена структура диссертации.

Глава 1. Литературный обзор состоит из пяти частей. В первой части описан метод тканевой инженерии, приведены литературные данные по материалам, предлагаемым для регенерации костной ткани, и проанализированы различные подходы к созданию скаффолдов. Во второй части рассмотрены методы синтеза и введения ре-акционноспособных групп в гидрофильные полимеры с целью их использования в качестве полимеров-носителей. Третья часть посвящена описанию основных закономерностей адсорбции полимеров как стадии создания гибридного материала. В четвертой части проведена оценка перспективности использования различных биомолекул (биолигандов) для управления поведением клеток на поверхности скаф-фолда. Рассмотрены химические методы ковалентного связывания аминосодержа-щих молекул с реакционноспособными гидрофильными полимерами и особенности иммобилизации белков. В пятой части приведены типы используемых клеточных культур и стадии образования костной ткани. Обзор литературы завершается постановкой задач исследования.

Глава 2. В Экспериментальной части описаны синтез и функционализация альде-гид-содержащих полимеров-носителей, методы их исследования, проведения экспериментов по адсорбции и экспериментов в культуре клеток. Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Синтез полимеров-носителей

Основной задачей синтетической части работы являлся синтез реакционноспо-собного полимсра-носителя, пригодного для создания на его основе полифункционального полимерного вектора, содержащего несколько типов биомолекул. В качестве основы для получения полимера-носителя был выбран винилсахарид - 2-деокси-Ы-метакрилоиламидо-О-глюкоза (МАГ). Наличие в его полимерах боковых сахаридных остатков позволяет предполагать проявляемое ими сродство к кдеточ-

ным мембранам. Для ковалентного введения в полимер биолигандов наиболее перспективными представляются альдегидные группы, так как они позволяют связывать аминосодержащие биологические вещества в мягких условиях без выделения нежелательных побочных продуктов. В связи с этим возникла необходимость синтеза сополимера, содержащего звенья МАГ и звенья, несущие альдегидные группы.

Существует две экспериментальные возможности получения подобных сополимеров (Рис. 1.).

Л J с=о E'<NHCI 2а

И ыо,

4снг-?-Н-сНг-Н,„

Г m -K-sb»

/-СН /-ЛОИ < Н Hi/ Ч

Vs W

снгон си2он

СН, сн,

с=0 с = 0 N. _

(И < Vй

/-с' i_.0M \J

но< н но(

Vo-J%. V

1-rVj

—j-CHj-c-j—[н,с—сн I I снг-е-|—

1 ° N ' НС.

tr °

снгон

Рис. 1. Схемы синтезов алъдегид-содержащих полимеров-носителей на основе 2-деокси-Ы-метакрилоиламидо-О-глюкозы (МАГ, I).

Реакции: 1 - синтез МАГ; 2а - гомополимеризация МАГ; 26 - периодатное окисление по-лиМАГ ([[МАГ'), За - сополимеризация МАГ с N-винилпирролидоном (BII); 36 - периодатное окисление звеньев МАГ в сополимере МАГ с ВП; 4 - сополимеризация МАГ с ди-этилацеталем акролеина (ДААк); 5а - сополимеризация МАГ с ВП и ДААк; 56 - удаление диэтилацетальной защиты. Продукты: I - МАГ; II - пМАГ; III - окисленная пМАГ; IV -сополимер МАГ с ВП (п(МАГ-со-ВП)); V - окисленный п(МАГ-со-ВП); VI - сополимер МАГ с ВП и ДААк (п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)); VII - п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) после удаления диэтилацетальной защиты с - п(МАГ-со-ВП-со-Ак).

Первый метод заключается в полимераналогичном превращении предварительно синтезированного гомополимера МАГ (пМАГ) в альдегид-содержащий сополимер путем периодатного окисления (Рис. 1, реакция 26) сахаридных звеньев. Также было проведено окисление сополимера МАГ с N-винилпирролидоном (п(МАГ-со-ВП)) (Рис. 1, реакция 36), синтезированного, исходя из предположения о положительном влиянии винилпирролидона на адсорбцию полимера на минеральной матрице. Вторым методом является сополимеризация МАГ с альдегид со держащим мономером (в нашем случае, диэтилацеталем акролеина, ДААк). Было установлено, что прямая сополимеризация МАГ с ДААк (Рис. 1, реакция 4) приводит к образованию практически гомополимера МАГ, содержащего следовые количества

ДААк. С другой стороны, известно, что ДААк и МАГ достаточно легко образуют сополимеры с N-вшшлпирролидоном. Поэтому ВП был использован в качестве ин-термедиата для введения ДААк в структуру поливинилсахарида (Рис. 1, реакция 5а).

Образование сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) (Рис. 1, продукты IV и VI) было доказано методами ЯМР спектроскопии. Наличие альдегидных ipyшi в продуктах III, V и VII (Рис. 1) было качественно подтверждено методом ИК-снсктроскошш путем идентификации полос в области 1740 - 1755 см"1.

При синтезе полимерной составляющей гибридного скаффолда необходимо обеспечить оптимальную величину ее молекулярной массы (ММ), гарантирующую, с одной стороны, адсорбцию на матрице, но, с другой, не препятствующую выводу полимера из организма при его возможной десорбции. Обычно значения ММ биологически значимых полимеров лежат в пределах 10000-30000. Для пМАГ это требование выполнялось путем подбора условий синтеза ([МАГ] = 10 масс%, [АИБН] = 5 масс%, ДМФА, выход 98%), в случае п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) учитывалось введение ДААк, которое приводит к уменьшению ММ продуктов сополимеризации.

Необходимая биофункционализация поверхности полимерно-неорганического скаффолда достигается, в первую очередь, контролируемым введением альдегидных фугш в синтезированный водорастворимый полимер. Экспериментально показано,

что увеличение концешрации перио-дата при окислении гомополимера МАГ приводит к увеличению количества генерируемых альдегидных фупп (Таблица 1). Более высокая реакционная способность МАГ приводит к тому, что сополимеры МАГ с ВП и ДААк в большей степени насыщены звеньями МАГ.

Содержание ДААк в тройных сополимерах значительно ниже, чем в исходной мономерной смеси, что может быть объяснено его способностью к деградационному переносу в процессе роста цени, приводящему к уменьшению выхода продукта и его молекулярной массы. Однако, количество введенного в сополимер ДААк, и, следовательно, альдегидных групп, можно варьировать путем изменения количества ВП в исходной реакционной смеси (Таблица 2).

Таблица 2

Сополимсртация МАГ (М,) с ВП (М2) и ДААк (М3)

№ Условия сополимеризации Характеристики сополимеров

Сополимер Соотношение мо- ! [Mi+M2 номеров, (+М3)], мол/.% масс% [АИБН], масс% от fM,+Mj(+M3)l Выход % [mi]:[m,](:[m3]) моль% ю"

5 п(МАГ-со-ВП) 50 : 50 '10 4 60 77 :23 2.40

б п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) 30 : 30 : 40 ; 40 I 39 82 : 15 : 3 2.00

7 п(МАГ-со-В11-со-ДААк) 20 : 40 : 40 40 1 31 79: 16: 5 1.75

„ 1 п(МАГ-со-ВГ1-| со-ДААк) 15:45:40 40 1 22 75: 18: 7 1.35

Таблица 1

Окисление пМАГ

№ Полимер [NaI04]:[ МАГ], | [СНО], моль : моль%

1 пМАГ 2.0 55

2 — 1.0 40

3 — 0.7 30

4 0.3 10

Таким образом, использование двух описанных подходов позволило получить новые альдегид-содержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахари-дов, со значениями ММ, удовлетворяющими требованиям к полимерам-носителям.

3.2. Биофункционалшацня полученных полимеров-носителей

Согласно предложенной стратегии получения полимсрно-неорганических скаффолдов, в его состав должен входить адсорбированный на поверхности компонент, управляющий поведением клеток (так называемый полибиофуикциональный полимерный «вектор»). Создание такого «вектора» основано на ковалентном связывании с полученными альдегид-содержащими полимерами специальных биологических молекул (биолигандов), оказывающих различное влияние на клетки.

Для повышения эффективности процесса выращивания костной ткани в лабораторных условиях существует необходимость интенсифицирования стадий прикрепления (адгезии), миграции, роста и дифференциации клеток на поверхности используемых для этой цели каркасов. В данной работе были использованы три типа биолигандов, способных оказывать влияние на перечисленные процессы, а именно: положительно заряженный поли-L-лизин в качестве фактора, повышающего неспецифическую адгезию клеток за счет электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными мембранами клеток; С/?(7/ХЯР-пентид, способствующий специфическому прикреплению клеток посредством комплементарного взаимодействия с поверхностными белками клеточных мембран; фактор роста и дифференциации клеток - костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein, BMP-2). В связи с высокой стоимостью ВМР-2, в модельных in vitro экспериментах использовали доступный аналог - рибонуклеазу А (РНКазу), обладающу ю близкими физико-химическими свойствами (значениями изоэлектрической точки и молекулярной массы).

Копъюгаты с одним лнгандом (монокопъюгаты)

Связывание GRGDSP-пентида. Схема ковалентного связывания данного лиганда с окисленной пМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) представлена на Рис. 2.

Для получения количественных данных использовали введение в пептид флуоресцентной метки. На основании полученных результатов сделан вывод о том, что данная реакция контролируется диффузией пептида к CI Ю-группам полимера.

1+ВДИ

2.1.5чперемеш-е \ 3 днагаз нг°ч

hjx -£rgdsp- co;h ccyt

1.2 ч перемеш-е 2.* nabh*

\

UN - GRGOSP—-COy/ Ciyf

hn-grg

H£ Vi, данзилкадавврин

флуоресценции

Рис. 2, Экспериментальная схема изучения процесса ковалентного связывания GRGDSP- пептида с альдегид-содержащими полимерами.

В случае окисленного гомополимера МАГ, практически полная конверсия альдегидных групп достигается при двукратном избытке пептида, тогда как для тройного сополимера тот же результат достигался только при десятикратном избытке лиганда (Таблица 3).

Таким образом, количество введенного в полимер пептидного лиганда можно легко регулировать, подбирая необходимое молярное соотношение [СН0]ПОлимер ;

[МЩпЕПТИД-

Таблица 3

Модификация нМАГ и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) 01ЮЕ>8Р пептидом

[СНО]пояимТЫН2]сясП5р , моль Конверсия СНО групп, моль%

пМАГ

1.0 75

0.5 94

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

1.0 40

0.5 50

0.2 63

0.1 93

пМАГ- 30 моль% СНО-групп, ММ 20000; п(МАГ-со-ВП-со-Ак) - 7 моль% СНО-групп, ММ 13500, Условия реакции: 0.01 М натрий-боратный буфер, рН 10.0, 25°С, 2 ч при перемешивании (550 грт). Очистка: ультрафильтрация (М\УСО: 3,000) против воды. Конверсия альдегидных групп, измеряемая количеством конъ-югированного с полимером пептида, определялась флуорометрически 355 ни, 485 им), используя значения флуоресценции данзилкадаверина.

Связывание РНКазы (ВМР-2) (Рис. 3). Доступность альдегидных групп полимеров для аминогрупп белка ограничена вследствие стерических препятствий, обусловленных структурой реагирующих макромолекул в растворе.

1.15ч перем-е 2 ди апиз

ынг ко!<х, '

5СМ

Флуоресцеин иэотиоцианат (ФИТЦ)

мл 1.2ч перем-е 1 2 *МаЭН. з диализ

конъюгат РНКаза-ФИТЦ

ни НО.С.

измерение флуоресценции

Рис. 3. Схема, использованная для изучения связывания модельного белка РНКазы с альдег ид-содержащими полимерами.

Кроме того, оба типа реагирующих макромолекул содержат в своем составе достаточное количество реакционноспособных групп (СНО и М-12), способных образовывать межмолекулярные сшивки, в том числе, с образованием нерастворимых продуктов реакции. Исходя из этого, для снижения риска межмолекулярного взаимодействия групп и увеличения конверсии РНКазы использовали избыток полимеров. а. следовательно, альдегидных групп, по отношению к белку.

Из данных Таблицы 4 очевидно, что при одинаковых массовых соотношениях большее количество РНКазы связывается с сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак), чем с окисленной пМАГ. Данный результат можно объяснить большей стерической дос-

10

тупностыо для аминогрупп белка альдегидных групп п(МАГ-со-ВП-со-Ак) по сравнению с окисленной пМАГ.

Полученные данные подтверждают возможность контролируемого введения фактора роста и дифференциации клеток ВМР-2 в состав создаваемых скаффолдов путем регулирования избытка альдегидных групп полимера по отношению к белку.

Известно, что для эффективной биофункционализации необходимо введение небольшого количества фактора клеточного роста. Поэтому создание полифункционального полимерного вектора желательно проводить постадийно, с введением в его структуру ВМР-2 на первой стадии. С одной стороны, связывание нескольких ми-белка приведет к незначительной конверсии альдегидных групп, а с другой, избыток последних при присоединении ВМР-2 на первой стадии создания смешанного конъюгата должен обеспечить наиболее полное связывание фактора роста и дифференциации клеток.

Таблица 4

Количественные характеристики ковалентного связывания РНКазы с окисленной пМАГ и сополимером п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

[полимер]: [РНКаза], масс, соотношение [СНО]:[РНКаза], ! Конверсия белка, мольн. соотношение ' моль%

окисленная пМАГ

2 33 4

5 83 7

10 166 31

20 | 337 43

п(МА Г-со-ВП-со-Ак)

2 9 13

5 23 25

10 45 37

20 93 85

пМАГ: 30 моль% СНО-групп, ММ 20000;

п(МАГ-со-ВП-со-Ак): 7 моль% СНО-групп, ММ 13 500. Условия реакции: 0.01 М натрий-боратный буфер, рН 10.0, 25°С, перемешивание в течение 2 ч. (550 грт). Очистка: диализ против воды (М\УСО: 20000). Конверсия белка определена методом флуорометрии 485 нм, 538 нм), с использованием флуоресценции ФИТЦ.

Связывание полн-Ь-лшнна. Аналогичным образом было исследовано связывание с полимерами иоли-Ь-лизина (пЛиз, ММ~ 10000). Как и в случае белка, использовали избыток полимера. Необходимо отметить, что расчет количества связанного ли-ганда в данном случае проводился на звено лизина, поскольку молекулярная масса полимерного лиганда является средней величиной. Из Таблицы 5 видно, что максимальная конверсия аминогрупп достигается в случае окисленной пМАГ, содержащей наибольшее число альдегидных групп.

С учетом мольных соотношений альдегидных групп полимеров и аминосо-держащих звеньев лизина в исходной реакционной смеси, конверсия аминогрупп, а, следовательно, и реакционная способность альдегидных групп, для обоих полимеров практически совпадают. Это можно объяснить наличием в более «рыхлой» по сравнению с белком макромолекуле пЛиз значительного количества стсрически доступных е-аминогрупп, что позволяет преодолеть диффузионные ограничения реакции с альдегидными группами полимера, имеющие меего в случае РНКазы.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при постадийном синтезе полифункционального полимерного вектора целесообразно введение пЛиз в структуру смешанного конъюгата на второй стадии процесса, после связывания полимера с РНКазой (или ВМР-2). В данном случае, достаточно большое число оставшихся после связывания белка альдегидных групп будут обеспечивать конъюгиро-вание необходимого количества пЛиз, но, вместе с этим, после образования бинарного конъюгата полимер-РПКаза-пЛиз, количество свободных альдегидных групп все еще будет достаточным для связывания СГЮОЗР-пептида.

Таблица 5

Количественные характеристики ковалентного связывания пЛиз с окисленной пМАГ и

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

[полимер] : [пЛиз], масс, соотношение [СНО] : [звено Лиз], мольн. соотношение Конверсия КГЬЬ-групп, моль%

окисленная пМАГ

5 0.85 49

10 1.70 59

20 3.39 75 _

40 6.78 82

п(МАГ-со -ВП-со-Ак)

1 . 5 0.23 23

10 0.47 29

20 0.94 64

40 1.87 68

пМАГ: 30 моль% СНО-групп, ММ 20 ООО; п(МАГ-со-ВП-оо-Ак): 7 моль% СНО-групп, ММ 13 500. Условия реакции: 0.01 М натрий-боратный буфер. рН 1 0.0, 25°С, перемешивание в течение 2 ч. (550 грт). Очистка: диализ против воды (МШСО: 3000). Конверсия белка определена методом флуорометрии Г/ч.,.- 485 им, 538 нм), с использованием флуорес-ден[(ии ФИТЦ.

«Смешанные» конъюгаты

На основании полученных данных и разработанных количественных методов для характеристики моноконъюгатов был осуществлен контролируемый количественно синтез «смешанного» конъюгата.

Процесс проводили путем постадийного введения лигандов в структуру полимерного «вектора» (Рис. 4).

Рис. 4. Экспериментальная схема получения смешанного конъюгата путем последовательного ковапентного связывания биолигандов.

Обнаруженная конверсия вводимых биомолекул на каждой стадии конъюги-рования подтвердила принципиальную возможность получения сложных конъюга-тов, содержащих лиганды различной природы и функциональности.

На первых двух стадиях в структуру полимера-носителя вводили макромоле -кулярные лиганды, а именно, РНКазу и пЛиз, реакции которых с полимерами испытывают пространственные затруднения, а также требуют избытка альдегидных групп. На последней стадии в реакционную смесь, содержащую полимер, модифицированный указанными макромолекулами, вводили избыток низкомолекулярного С1КЮ8Р-пептида.

Количественный контроль процесса смешанного конъюгирования отражен в Таблице 6.

Таблица 6

Количественные характеристики постадийного синтеза смешанного конъюгата,

содержащего РНКазу, пЛиз и (ЖОП8Р-пептид

Стадия 1 Стадия II Стадия III

[полимер]:[РНКаза], ! Конверсия масс. ! белка, 1 моль% [полимер]: [пЛиз], масс. Конверсия МНг-групп, молъ% [СНО]:[Ш2], моль. Конверсия пептида, моль%

окисленная пМАГ

20: 1 I 47 | 20: 1 | 33 2.11 39

п(МАГ-со-ВП-со-Ак)

30 : 1 58 | 30:1 | 15 0.61 | 25

Следует отметить, что при образовании «смешанного» конъюгата на каждой стадии модификация используемых полимеров биолигандами подчиняется закономерностям, полученным для моноконъюгатов. Этот факт позволяет контролируемо и воспроизводимо вводить необходимое количество лигандов в создаваемый полифункциональный полимерный «вектор» без дополнительного подбора условий для каждого случая.

3.3. Гидродинамические характеристики полимеров носителей и их коиыога-тов с лигандами различного молекулярного размера

Исследование гидродинамических характеристик полимеров-носителей и их конъюгатов с модельными лигандами различного молекулярного размера (глицин и РНКаза) оеущестааяли методами визкозиметрии, а также динамического и статического светорассеяния.

Величины гидродинамических радиусов, полученные методом вискозиметрии, свидетельствуют о том, что макромолекулы полимеров двух типов альдегидсодер-жащих полимеров на основе МАГ, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой, обладают достаточно свернутой конформацией, обусловленной, по-видимому, внутримолекулярными взаимодействиями. На основании анализа концентрационных зависимостей г|уД/с атьдегид-содержащих форм обоих типов полимеров было установлено наличие полиэлектролитного эффекта, а также, в случае окисленной пМАГ, образование ассоциатов при повышении концентрации полимера в растворе. Кроме того, поведение и структура конъюгатов полимер-глицин и иолимер-РНКаза в водных растворах существенно зависят от химической структуры полимеров, распределения альдегидных групп в полимерной цепи и количества связанного лиганда (Таблица 7).

Данные, полученные методом светорассеяния (Таблица 8), позволили сделать вывод о наличии ассоциативных структур, как в случае исходных полимеров, так и конъюгатов, вероятно, обусловленных межмолекулярными взаимодействиями звеньев МАГ. При этом введение альдегидных групп и последующее их замещение лигандами различного молекулярного размера приводит к изменению гидродинамических параметров, что является еще одним свидетельством образования конъюга-тов.

Таблица 7

Значения характеристической вязкости и рассчитанные гидродинамические параметры исходных и активированных полимеров, а также их конъюгатов с глицином и РНКазой

№ образца Название образца Растворитель [л], длт"1 Л1'1 G И"2 л"1

нм

пМАГ

1 пМАГ Na2S04, 0.1 M 0.12 4.5 11.3 3.6

1 п МАГ б/б, рН 10.0 0.15 4.9 12.1 3.9

2 окисленная пМАГ б/р-р, рН 7.0 0.11 4.4 10.9 3.5

5 пМАГ-глицин (20 %)* б/р-р, рН 7.0 0.28 6.0 14.9 4.8

6 пМАГ-глицин (100 %)* б/р-р, рН 7.0 0.40 6.7 16.8 5.4

7 пМАГ-РНКаза б/р-р, рН 7.0 0.24 5.8 14.5 4.7

8 пМАГ-РНКаза-глицин б/р-р, рН 7.0 0.22 | 5.6 14.1 4.5

п(МАГ-ВП-ДААк)

3 п(МАГ-ВП-ДААк) Na2S04,0.1 м. 0.10 3.8 9.4 3.0

4 п(МАГ-ВП-Ак) б/р-р, рН 7.0 0.10 3.8 9.4 3.0

„ п(МАГ-ВП-Ак)-глицин ! (15%)* б/р-р, рН 7.0 0.12 4.0 10.0 3.2

10 п(МАГ-ВГ1-Ак)-глицин (100%)* б/р-р, рН 7.0 0.18 4.6 11.4 3.7

11 п(МАГ-ВП-Ак)-РНКаза б/р-р, рН 7.0 0.21 5.0 12.4 4.0

12 п(МАГ-ВП-Ак)-РНКаза-глицин б/р-р, рН 7.0 0.23 5.1 12.8 4.1

*- указана степень конверсии альдегидных групп

Обозначения: б/б, рМ 10.0 - натрий-боратный буфер, рН 10.0; б/р-р, рН 7.0 - натрий-боратный буфер, рН 10.0, рН которого доведен до 7.0 добавлением борной кислоты

Таблица 8

Размеры макромолекул полимеров и конъюгатов, полученные методами статического и

Образец Растворитель Rh(U,HM 1 Яшобщ), нм Rg, нм

пМАГ б/б рН 10.0 3.9 45 33

п(МАГ-со-ВП) б/б рН 10.0 4.2 40 38

окисл. пМАГ б/р-р рН 7.0 6.2 82 70

пМАГ-глицин б/р-р рН 7.0 5.3 68 80

пМАГ-(РНКаза-глицин) б/р-р рН 7.0 7.8 122 101

Лн< 1) - гидродинамический радиус, определенный по быстрой моде; Л//(общ) - гидродинамический радиус, усредненный по обеим модам; Яа- радиус инерции.

Кроме того, оказалось возможным обозначить предпочтительные для адсорбции полимеров и конъюгатов условия. Так как при покрытии поверхности минеральной матрицы желательно получение адсорбционного слоя, обеспечивающего доступ-

14

ность сигнальных молекул для клеточных рецепторов, необходимо проводить процесс при низких концентрациях полимеров и их конъюгатов (меньше 1 г/дл), т. е. в условиях минимальной концентрации ассоциативных структур.

3.4. Адсорбция полимеров и конъюгатов

Адсорбция полимеров

Для определения возможности создания полимерно-неорганических композитов было проведено изучение адсорбции полученных полимеров на следующих минеральных носителях: гидроксиапатит (ГА), биокерамических матрицах Вю-Обз и Зропсегат. Сравнительное исследование количества адсорбированного вещества показало, что исходные полимеры адсорбируются в максимальном количестве (Рис. 5) на керамической матрице вропсегаш, который был выбран для дальнейших исследований.

Данный коммерчески доступный носитель, специально разработанный для культивирования клеток в биореакторах, представляет собой неорганическое твердое вещество на основе Хг02, допированного гидроксиапати-том.

Из кинетических кривых адсорбции исходных полимеров видно (Рис. 6), что процесс протекает достаточно быстро и достигает максимума примерно через 100 мин.

Рис. 5. Морфологическая структура керамической матрицы Бропсегат

5-

8 6 <л э~ 4 / .'

-5 V ..

V- о V 47 Ч'

----

а

у

/

- Л1МАГ-СО^Л-СО-ДААК)

—о— окисленная пМАГ (20 моль% ЯСНО])

- >- окисленная пМАГ (30 мшь% [СНО])

6"-

о

1'

Л-'*

Г

IV

' ' -л

яЛ

/=

окисленная пМАГ (20 моль% [СНО)) окисленная п№Г (30 моль%[СНОу

Рис. 6. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) исследуемых полимеров на носителе Зропсегат.

Условия адсорбции: объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Зропсегат (монолит) - 50 ± 10 мг, концентрация полимеров (а) 1 мг/мл, (б) 0.25 - 3.5 мг/мл; Время инкубации полимера с минеральным носителем в случае построения изотермы адсорбции составляло 4 часа.

Для исследованных полимеров способность к адсорбции не имела особых отличий. Вероятно, адсорбция осуществляется в основном за счет звеньев МАГ, что объясняется их способностью образовывать водородные связи с отрицательно заряженными атомами кислорода на поверхности керамики. Таким образом, дальнейшее исследование влияния введения лигандов на процесс адсорбции проводили с использованием в качестве полимера-носителя только окисленной пМА1'.

Адсорбция конъюгатов Представленные на Рис. 7 данные демонстрируют аналогию форм кинетических кривых и изотерм адсорбции конъюгатов окисленной пМАГ с макромолеку-

лярными лигандами (РНКазой и пЛиз) с формами, установленными для исходного полимера. Можно предположить, что взаимодействие этих конъюгатов с поверхностью 8ропсегат определяется структурой полимерной составляющей коныогата (пМАГ). В то же время, количество адсорбированного вещества зависит от наличия в структуре окисленной пМАГ ковалентно-связанных лигандов. Так, незначительное увеличение адсорбции пМАГ-РНКаза по сравнению с окисленной пМАГ, по всей видимости, обусловлено влиянием белка на адсорбционные характеристики коныогата.

Как и ожидалось, наибольшее количество адсорбированного вещества наблюдалось в случае коныогата пМАГ-пЛиз, что связано с положительным зарядом цепи полиаминокислоты, обуславливающим дополнительное электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью 8ропссгаш При этом на изотерме адсорбции пМАГ-пЛиз отсутствует ярко выраженное плато насыщения, что можно объяснить полимолскулярной природой адсорбции данного конъюгата.

Рис. 7. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) на Зропсегаш окисленной пМАГ и её конъюгатов с РНКазой, пЛиз и (ж СОБР-пептидом. Условия адсорбции: (а) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов - 1 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0 01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Яропсегат (монолит) - 50 ± 10 мг. (б) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов 0.25 - 3.5 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25СС; навеска Бропсегаш (монолит) - 50 1 10 мг; время инкубации растворов полимера с минеральным носителем - 4 часа.

Напротив, в случае конъюгата окисленной пМАГ с СЖСЮйР-пептидом наблюдается значительное уменьшение количества адсорбированного вещества и изменение вида зависимостей. Эти явления, вероятно, вызваны изменением макроструктуры полимера в результате связывания с низкомолекулярным лигандом и, как следствие, изменением способности к адсорбции данного конъюгата, что согласуется с результатами, полученными методами вискозиметрии и светорассеяния.

Учитывая аналогичность вида кинетической зависимости и изотермы адсорбции конъюгата пМАГ-РНКаза-пЛиз-ОГШОЗР и пМАГ-пЛиз, можно сделать вывод о том, что значительный вклад в адсорбцию «смешанного» конъюгата вносит наличие в его структуре пЛиз.

Также была исследована десорбция полимеров и конъюгатов в течение 14 суток, т. е. в течение времени, когда происходит адгезия и наиболее интенсивный рост клеток. Данные по максимальной адсорбции, определенные по плато на изотермах и

по количеству десорбированных полимеров и коныогатов, представлены в Таблице 9.

Таблица 9

Параметры адсорбции и десорбции полимеров и коныогатов окисленной пМАГ' '

Образец Омакс> мг/г Яропсегат Количество десорбированного полимера, мг/г Эропсегаш

8 суток 14 суток

окисленная пМАГ 16.5 0.2 0.3

п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) 14.1 0.3 0.5

пМАГ-пЛиз 18.2 0.3 0.4

пМАГ-РНКаза 17.0 0.2 0.3

пМАГ-ОЯООЗР 6.1 0.0 0.1

иМАГЧРНКазаНнЛиз)- (СЯСОЗР) 17.7 0.1 0.2

Очевидно, что десорбция полимеров и их конъюгатов в указанный промежуток времени незначительна, что позволило рекомендовать обсуждаемые образцы для клеточных экспериментов.

Образование адсорбционного слоя с толщиной менее 10 нм на поверхности 8ропсегат в случае окисленной пМАГ и ее конъюгата с пЛиз показано методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС).

Таким образом, результаты, полученные при исследовании адсорбции и десорбции исходных полимеров-носителей и синтезированных на их основе конъюгатов с различными лигандами, подтвердили возможность создания полимерно-неорганических материалов для инженерии костной ткани путем адсорбционного покрытия поверхности минеральной матрицы (Зропсегат) полифункциональным полимерным вектором, выполняющим к тому же роль гибкого макроспейсера, повышающего доступность для клеток сайтов биоспецифического взаимодействия.

3.5. Апробация полученных скаффолдов

Изучение возможности применения полученных гибридных материалов для выращивания костной ткани проводили с использованием коммерческой линии клеток - предшественников остеобластов, выделенных из свода черепа мышей (МТЗСЗ-

Е1).

Для изучения возможности использования полученных каркасов в клеточных экспериментах использовали тест на цитотоксичность, основанный на реакции восстановления бесцветной соли тетразолия (МТТ, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида) митохондриальными и цитошазматическими дегидроге-назами живых метаболически активных клеток с образованием голубых растворимых в ДМСО кристаллов формазана. Этот высокочувствительный метод, называемый МТТ-тестом, позволяет определять количество жизнеспособных клеток при взаимодействии с чужеродным материалом. Особый интерес представляют концентрационные и временные зависимости количества живых клеток, контактирующих с материалом, указывающие на степень токсичности материала или сё полное отсутствие.

В данной работе была проведена серия экспериментов, направленная на изучение цитотоксичности исходных полимеров-носителей и полученных биофункциональных скаффолдов. Кроме этого, использование МТТ-теста позволило оценить влияние покрытия поверхности Sponceram полимерными конъюгатами с биолиган-дами на адгезию н рост клеток.

Как уже было сказано выше, создаваемые гибридные скаффолды состоят из двух компонентов: минеральной матрицы и полимерной составляющей. Отсутствие цитотоксичности у Sponceram было доказано компанией-производителем (ZellWerk GmbH) и практическими исследованиями, проводимыми в Институте технической химии Университета Ганновера. Исследование альдегидных форм полученных полимеров показало значительную токсичность их растворов и полное ее отсутствие для адсорбированных форм. Более того, блокирование альдегидных групп полимеров вводимыми лигандами также приводило к получению нетоксичных растворимых продуктов.

Для изучения влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатами полимеров с биолигандами использовали так называемый «короткий» МТТ-тест, когда детектирование количества жизнеспособных клеток на полученных гибридных матрицах проводили в течение первых суток после высевания (Рис. 8, а и б).

Рис. 8. Результата «короткого» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на Бропсегат и Яропсегат, покрытом конъюгатами пМАГ (а) и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) (б) с (ЖОШР-пептидом и пЛиз в течение первых суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных па основе значений оптической плотности растворов формазана,

В случае 8ропссгат, покрытого конъюгатом пМАГ-пЛиз, наблюдается увеличение количества жизнеспособных клеток на поверхности скаффолда за счет электростатического притяжения отрицательно заряженных мембран клеток (Рис. 8, а), причем введение пЛиз увеличивает адгезию клеток только в первые 2-4 часа, а затем влияние лиганда ослабляется. Следовательно, поли-Ь-лизин оказывает влияние только на начальный этап адгезионного взаимодействия клеток с поверхностью матрицы.

В случае модификации Бропсегат конъюгатом пМА] -ОЯОВЯР, зафиксировано большее количество жизнеспособных клеток, чем в случае чистого Бропсегат. Отличие количества жизнеспособных клеток через 24 часа для конъюгатов пМАГ-

GRGDSP и пМАГ-пЛиз, по всей видимости, обусловлено различным механизмом взаимодействия клеток с лигандами.

Обсужденные закономерности адгезии клеток проявляются и при покрытии поверхности Sponceram конъюгатами на основе п(МАГ-со-ВП-со-Ак) (Рис. 8, б).

Для исследования влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатом окисленной пМАГ с GRGDSP-пептидом, а также «смешанным» коньюгатом пМАГ-пЛиз-GRGDSP на адгезию клеток был проведен эксперимент, основанный на флуоресцентном детектировании количества прикрепленных клеток (DAPI). С этой целью клетки высевали на диски Sponceram одинакового размера, предварительно помещенные внутрь силиконового кольца для фиксации клеток внутри матрицы.

Из зависимости количества прикрепленных клеток Sponceram/nMAF-GRGDSP в течение первых суток культивации видно, что адгезия клеток на поверхности гибридной матрицы протекает более интенсивно в сравнении с чистым Sponceram (Рис. 9). Этот факт аналогичен данным, полученным при использовании МТТ-теста.

Изучение «смешанного» конъюгата пМАГ-пЛиз-GRGDSP показало, что совместное использование двух лигандов оказывает большее влияние на адгезию клеток, чем в случае моноконъюгатов (Рис. 9).

время культивации

Рис. 10. Результаты «длительного» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на чистом Зропсегат и Зропсегат, покрытом конъюгатами п(МЛГ-со-ВП-со-Ак) с (}КОВ8Р-пептидом и ВМР-2 в течение тринадцати суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных на основе значении оптической плотности растворов формазана.

Целевыми лигандами, способными изменять динамику роста клеток на скаф-фолде, являются биомолекулы, специфически взаимодействующие с клетками, а именно, GRGDSP-пeптид и фактор роста ВМР-2. Поэтому было исследовано влия-

- »- Sporceism/nMAT-n/lio GRGDSP ■i -SponcsraminMAT-CRGDSP -»—Sponceram

л~

* • 3 la !? 14 15 IS w

вреия культивации, часы

Рис. 9. Результаты флуоресцентного определения количества ПАР1-меченных клеток на поверхности чистого Бропсегаш и гибридных скаффолдов через 1, 4 и 24 часа после высевания.

ние покрытия поверхности Sponceram конъюгатами этих лигандов с полимерами-носителями на жизнеспособность клеток в течение первых 13-ти суток, т. е. в период их наиболее интенсивного роста. Для этого был использован «длительный» МТТ-тест(Рис. 10).

Полученные данные на примере тройного сополимера конъюгированного с RGD-пептидом и фактором роста ВМР-2, показывают (Рис. 10), что рост клеток, начиная с третьих суток эксперимента, происходит интенсивнее на поверхности полимерно-неорганических носителей, чем на чистом Sponceram.

Приведенные закономерности свидетельствуют о положительном влиянии исследуемых гибридных носителей на адгезию и рост клеток по сравнению с чистой керамической матрицей Sponceram.

ВЫВОДЫ

1. Разработана стратегия получения полимерно-неорганических биораспознаю-щих носителей клеток, или скаффолдов, для инженерии костной ткани, основанная на адсорбционном покрытии макропористой керамической основы биосовместимыми (со)полимерами винилсахаридов, модифицированными управляющими поведением клеток биологическими молекулами (биолигандами).

2. Впервые методом свободно-радикальной полимеризации синтезирован гомологичный ряд полимеров на основе винилсахарида 2-деокси-Ы-метакрилоил-амидоглюкозы (МАГ): гомополимер, сополимер с N-винилпирролидоном и тройной сополимер с N-винилпирролидоном и диэтилацеталем акролеина, в последнем случае N-винилпирролидон выполнял роль инертного интермедиата, позволяющего вводить в структуру сополимера MAI" реакционноспособные альдегидные группы.

3. Впервые методами полимераналогичных превращений и сополимеризации с защищенной формой акролеина с дальнейшей активацией альдегида в полученном сополимере синтезированы новые альдегидсодержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахаридов, а именно, окисленная периодатом натрия поли(2-деокси-Ы-мстакрилоиламидоглюкоза) и поли([2-деокси-Ы-метакрилоиламидо-глюкоза]-со-[1-винилпирролидин-2-он]-со-[акролеин]). Показана возможность контролируемого введения альдегидных групп в полученные макромолекулярные соединения.

4. Разработаны методы контролируемого синтеза моноконъюгатов полученных полимеров с лигандами различной биологической функциональности, а именно, фактором неспецифичсской адгезии клеток макромолекулярным поли-L-лизином, фактором роста и дифференциации клеток белком ВМР-2, а также низкомолекулярным интегрин-связывающим RGD-пептидом. Экспериментально установленные закономерности реакций конъюгирования позволили предложить метод создания «смешанных» конъюгатов - би- и грифункциональных полимерных векторов, представляющих собой контролируемое сочетание двух или трех биолигандов в структуре выбранных полимеров.

5. Исследованы процессы адсорбции и десорбции полученных полимеров и их биоконъюгатов. Установлено влияние химического строения полимеров-носителей и присоединяемых биолигандов на процесс адсорбции. Показана практическая не-

обратимость адсорбции полимеров и конъюгатов, как в модельных экспериментах, так и в культуралыюй среде, используемой для роста клеток.

6. Показано, что синтезированные альдегидсодержащие полимеры на основе ви-нилсахарида в виде их биофункциональных конъюгатов значительно стимулируют прикрепление клеток к поверхности скаффолда, ускоряют их рост и образование ткани по сравнению с немодифицированной керамической основой скаффолда.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Korzhikov V. A., Diederichs S., Nazarova О. V., Vlakh Е. G., Kaspcr С., Panarin E. F., Tennikova Т. В. Water-soluble aldehyde bearing polymers of 2-deoxy-2-methcarylamido-D-glucose for bone tissue engineering // Journal of Applied Polymer Science. 2008. V. 108,1. 4. P.2386-2397.

2. Korzhikov V., Roeker S., Vlakh E., Kasper C., Tennikova T. Synthesis of multifunctional polyvinylsaccharides containing controllable amounts of biospecific and nonspecific ligands // Bioconjugates Chemistry. 2008. V. 19,1. 3. P. 617-625.

3. Коржиков В. А., Филиппов А. П., Власова E. H., Панарин E. Ф., Тенникова T. Б. Физико-химическое исследование структуры полимеров на основе 2-деокси-Ы-метакрилоиламидо-О-глюкозы и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера // Журнал Прикладной Химии. 2008. Т. 81, вып. 8. - С. 1311-1319.

4. Korzhikov V., Vlakh E., Nazarova О., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Proceedings of Baltic Polymer Symposium. 2007. P.40-44.

5. Коржиков В. А., Афанасьева Е. В., Назарова О. В. Синтез альдегид содержащих полимеров на основе N-метакрилоиламиноглюкозы // Тезисы докладов I СПб Конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». 2005. С.75.

6. Korzhikov V., Vlakh E., Panarin E., Tennikova T., Diederichs S., Roeker S., Kasper C. Construction of biofunctional polymer-mineral composites for bone tissue engineering // The Young Scientists ' and Students ' International Scientific Conference "Modem Problems of Microbiology and Biotechnology", Odessa, Ukraine. 2007. Book of Abstracts. P.93.

7. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., van Griensven M., Tennikova T., Kasper C. Development of «smart» scaffolds for bone tissue engineering // "European BioPerspectives 2007". Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.284.

8. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova Т. В., Kasper C. Water-soluble polymers for construction of composite scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // "European BioPerspectives 2007". Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.298.

9. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova Т. В., Kasper C.. New water-soluble polymers for construction of biofunctionalized scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // 2(7'' Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.270.

10. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., Tennikova T., Kasper C. Biofunctional polymer-mineral composites as scaffolds for bone tissue engineering // 2Cth Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.274.

11. Vlakh E., Kor/hikov V., Nazarova O., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Baltic Polymer Symposium 2007 (BPS 2007), Druskinikai, Lithuania. 2007. Book of Abstracts. P.75...

12.- Korzhikov V. A., Vlakh E. G., Nazarova O. V., Panarin E. F., Tennikova T. B. Synthesis, biolunctionalization and adsorption of polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucosc for bone tissue engineering // 4'h Saint-Petersburg young scientists conference "Modern problems of polymer science", Saint-Petersburg. 2008. Program and abstract book. P. 23.

13. Korzhikov V. A., Filippov A. P., Panarin E. F., Tennikova .T. B. Hydrodynamic properties of the polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose and their conjugates with small and macromolecular bioligands // 6th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polvmer Systems". Saint-Petersburg. 2008. Book of abstracts. P. 147.

Бесплатно.

Отпечатано копировально-множительным участком отдела обслуживания учебного процесса физического факультета СПбГУ. Приказ № 571/1 от 14.05.03. Подписано в печать 25.02.09 с оригинал-макета заказчика. Ф-т 30x42/4, Усл. печ. л.1. Тираж 120 экз., Заказ № 944/с. 198504, СПб, Ст. Петергоф, ул. Ульяновская, д. 3, тел. 929-43-00.

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Метод тканевой инженерии на примере восстановления костной ткани.

1.1.1. Требования к скаффолдам и материалам, используемым в инженерии костной ткани.

1.1.2. Полимерные скаффолды.

1.1.2.1. Биодеградируемые полимеры.

1.1.2.2. Методы получения скаффолдов на основе биодеградируемых полимеров.

1.1.2.3. Гидрогели.

1.1.3. Неорганические скаффолды.

1.1.4. Композитные полимерно-неорганические скаффолды.

1.1.5. Получение биофункциональных гибридных скаффолдов.

1.2. Гидрофильные полимеры для биомедицинского применения.

1.2.1. Основные требования к полимерам-носителям.

1.2.2. Синтез полимеров носителей.

1.2.3. Введение реакционных групп в полимеры-носители.

1.2.4. Поливинилсахариды.

1.2.4.1. Синтез винилсахаридов.

1.2.4.2. Синтез поливинилсахаридов.

1.2.4.3. Биологические свойства поливинилсахаридов.

1.3. Адсорбция полимеров из растворов на твердых поверхностях.

1.3.1. Влияние молекулярной массы полимера на его адсорбцию.

1.3.2. Влияние растворителя на адсорбцию полимеров.

1.3.3. Влияние электростатических взаимодействий на адсорбцию полимеров.

1.3.4. Десорбция полимеров.

1.4. Функционализация гидрофильных полимеров биолигандами.

1.4.1. Регулирование взаимодействия поверхность - клетка и клеточного роста.

1.4.2. Реакции, используемые для модификации полимеров БАВ.

1.4.3. Особенности связывания белков с гидрофильными полимерами.

1.5. Культуры клеток и регенерация ткани.

1.5.1. Источники и типы клеток.

1.5.2. Культуры клеток в тканевой инженерии.

1.5.3. Стадии роста новой костной ткани.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы.

2.3.1. Синтез полимеров и их альдегидсодержащих производных.

2.3.2. Определение состава и физико-химических параметров полученных полимеров.

2.3.3. Методы исследования адсорбции полученных полимеров на неорганических матрицах.

2.3.4. Методы синтеза конъюгатов полученных полимеров с биолигандами.

2.3.5. Методы качественного и количественного детектирования образования конъюгатов и определения их гидродинамических параметров.

2.3.6. Методы исследования адсорбции и десорбции конъюгатов минеральная матрица Sponceram).

2.3.7. Получение модели клетки и изучение ее взаимодействия с GRGDSP-пептидом методом аффинной хроматографии.

2.3.8. Эксперименты с клеточными культурами.

2.3.9. Оценка погрешностей измерений.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Синтез полимеров-носителей с контролируемым содержанием альдегидных групп.

3.1.1. Синтез пМАГ и получение реакционно-способных альдегидных групп методом полимераналогичных превращений (периодатное окисление).

3.1.2. Изучение возможности введения альдегидных групп на стадии сополимеризации. Синтез сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) и получение их альдегидсодержащих производных.

3.2. Биофункционализация полученных полимеров.

3.2.1. Конъюгаты полимеров с биолигандами различной функциональности.

3.2.2. Создание полифункционального полимерного вектора.

3.3. Гидродинамические характеристики полученных полимеров и конъюгатов.

3.3.1. Изучение гидродинамических параметров методом вискозиметрии.

3.3.2. Исследование полимеров и их конъюгатовметодом светорассеяния.

3.4. Адсорбция полученных полимеров и конъюгатов.

3.4.1. Сравнительное изучение адсорбции синтезированных полимеров на различных минеральных матрицах.

3.4.2. Адсорбция и десорбция синтезированных полимеров на монолитной керамике.

3.4.3. Адсорбция и десорбция синтезированных биоконъюгатов.

3.4.4. Изучение адсорбции полимеров и конъюгатов на Sponceram методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии.

3.5. Апробация полимерно-неорганических скаффолдов для инженерии костной ткани.

3.5.1. Активность GRGDSP пептида как интегринсвязывающего лиганда.

3.5.2. Эксперименты в культуре клеток.

Выводы.

В настоящее время высокомолекулярные соединения широко используются в различных областях биологии и медицины благодаря предоставляемой ими возможности варьировать свойства материала в зависимости от состава и структуры используемых макромолекул. Разработано огромное количество полимерных биоматериалов, удовлетворяющих требованиям биосовместимости и выполняющих различные функции [1-8], в частности, имплантантов для замены поврежденного или утраченного участка костной ткани [9]. Особый интерес представляет использование высокомолекулярных соединений в методе инженерии костной ткани, основанном на помещении клеток, полученных из тканей пациента, на трехмерный носитель (скаффолд) [8], где происходит образование ткани за счет роста и дифференциации клеток [2, 4, 7]. Развитие данного метода продемонстрировало, что для направления процесса в сторону образования костной ткапи скаффолды должны функционировать в качестве системы контролируемой доставки биологических сигналов, управляющих поведением клеток [8, 11]. Поэтому возникает фундаментальный интерес изучения условий прочного связывания биологических молекул (лигандов) с поверхностью скаффолда. Несмотря на интенсивные исследования различных полимерных носителей на основе синтетических полимеров (полилактид, поли-гликолид) и природных биополимеров (хитозан, коллаген) [8], к настоящему моменту не существует скаффолдов, удовлетворяющих как требованиям механической прочности, так и предоставляющих возможности биофункционализации. Кроме полимеров, в качестве обсуждаемых каркасов для инженерии костной ткани используются макропористые керамические матрицы, обладающие достаточной механической прочностью и сходством со структурой неорганической составляющей костей.

В связи с вышесказанным, актуальной задачей представляется создание нового типа скаффолдов, сочетающих в себе керамическую и полимерную составляющие. При этом использование в качестве последней гидрофильных полимеров-носителей, ковалентно модифицированных специальными биологическими молекулами, открывает новые возможности применения полимеров в инженерии костной ткани. Подобный подход является оригинальным и не имеет описанных в литературе аналогов.

Предложенная в данной работе стратегия создания «интеллигентных» гибридных носителей клеток основана на идее адсорбционного покрытия трехмерной макропористой керамической матрицы биосовместимым полимером, способным к ковалентному связыванию биологических молекул (лигандов) без разрушения основной цепи. Биологическая полифункциональность должна обеспечиваться связыванием с полимерной составляющей конструируемого скаффолда лигандов различной специфичности. Минеральная составляющая, в данном случае, обеспечивает механическую прочность и поддержку трехмерного роста клеток, в то время как биофункционализированный полимерный компонент ответствен за передачу клеткам сигналов, управляющих их поведением на поверхности гибридной матрицы.

Таким образом, целью работы являлось создание полимерной системы, несущей био-лиганды, и адсорбированной на поверхности неорганической матрицы с образованием материала, пригодного для использования в качестве скаффолдов для инженерии костной ткани, обеспечивающих интенсивную адгезию и рост клеток.

В задачи работы входило:

• синтез и исследование полимеров-носителей, содержащих контролируемое количество реакционно-способных групп, способных к ковалентному связыванию биологически активных молекул (биолигандов);

• контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями;

• получение полифункционального полимерного «вектора», содержащего биолиган-ды различных типов;

• изучение гидродинамических характеристик исходных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами различных молекулярных размеров;

• исследование адсорбции полученных полимеров-носителей на различных неорганических материалах и выбор матрицы для создания гибридных скаффолдов;

• изучение адсорбции и десорбции синтезированных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами на выбранном неорганическом материале;

• оценка цитотоксичности полимеров-носителей и их конъюгатов с целевыми биолигандами и исследование влияния введения различных биолигандов в полимерную составляющую гибридного скаффолда на поведение живых клеток.

Возможность создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани, состоящих из неорганической составляющей и полимера-носителя, ковалентно модифицированного биологическими молекулами, обеспечивающего биофункциональность поверхности, являлась объектом исследования.

В качестве методов исследования использовались:

• метод свободно-радикальной полимеризации и сополимеризации, периодатного окисления а-гликолей и снятия диэтилацеталыюй защиты для синтеза полимеров-носителей;

• метод N-алкилирования для ковалентного связывания полимеров-носителей с био-лигандами различного молекулярного размера;

• методы ЯМР спектроскопии, а также спектроскопии в ИК-, УФ- и видимой областях для характеристики полученных полимеров-носителей;

• методы вискозиметрия и светорассеяние для изучения гидродинамических параметров полимеров-носителей и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера;

• методы ГТААГ электрофореза и ИК-спектроскопии для качественного, а также метода флуоресцентного анализа и спектроскопии в видимой области для количественного определения связывания биолигандов с полимерами-носителями;

• методы фотометрического анализа и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии для изучения адсорбции и десорбции полученных полимеров и конъюгатов;

• фронтальный метод анализа в аффинной хроматографии для количественной оценки комплементарного взаимодействия рецептора модели клетки (интегрином) с биолигандом (RGD-пептидом), иммобилизованным на поверхности сорбента, имитирующего скаффолд;

• специальные биологические методы работы с культурами клеток и построения кинетических и концентрационных зависимостей количества жизнеспособных клеток при их контакте с различными материалами.

Научная новнзна работы состоит в следующем:

• Разработана новая стратегия создания биофункциональных полимерно-неорганических скаффолдов для инженерии костной ткани, заключающаяся в использовании гидрофильного полимера-носителя в качестве подвижного спейсера, адсорбционно связанного с поверхностью неорганической макропористой подложки и модифицированного биомолекулами способными интенсифицировать процессы адгезии и роста клеток.

• Впервые получены полимеры-носители на основе поливинилсахаридов, содержащие контролируемое количество реакционно-способных альдегидных групп.

• Впервые проведено контролируемое ковалентное связывание аминосодержащих биолигандов различной функциональности (GRGDSP-пептид, поли-Ь-лизин, фактор роста и дифференциации клеток ВМР-2) с полученными полимераминосителями и доказана возможность создания полифункциольнального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов на одной полимерной цепи.

• Комплексом независимых методов доказана возможность адсорбции полученных полимеров и конъюгатов на поверхности керамических матриц.

• Методами вискозиметрии и светорассеяния определены гидродинамические параметры полученных конъюгатов поливинилсахаридов с лигандами различного молекулярного размера.

• На основании тестов на цитотоксичность полученных полимеров в растворе и адсорбированном состоянии, а также гибридных скаффолдов, в полимерную составляющую которых введены биомолекулы различной функциональности, показана возможность использования конъюгированных с биолигандами гидрофильных полимеров-носителей в качестве фактора, управляющего поведением клеток.

Практическая значимость работы. Разработан и экспериментально апробирован технологический принцип создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани. На примере синтезированных альдегидсодержащих поливинилсахаридов, показана перспективность контролируемой модификации полимеров-носителей специальными биомолекулами с получением моно-, би- и полифупкциональных конъюгатов и последующем введением их в состав гибридных скаффолдов путём адсорбции для интенсификации процессов адгезии и роста клеток.

Основные положения, выноснмые па защиту:

• Создано первое поколение гибридных скаффолдов включающих в себя полимер-носитель, несущий лиганды, обеспечивающие адгезию и рост клеток.

• Поливинилсахариды, вследствие проявляемого ими собственного неспецифического сродства к клеточным мембранам, перспективны в качестве полимерной составляющей гибридных скаффолдов;

• Путем полимераналогичных превращений, а также и методом сополимеризации с защищенным альдегидным мономером возможно контролируемое введение в поливинилсахариды альдегидных групп;

• Условия контролируемого введения биолигандов различной функциональности и молекулярного размера в альдегид-содержащие поливинилсахариды с различной структурой реакционно-способного звена, а также получения полифункционального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов;

• Выбор оптимальной керамической матрицы для создания скаффолдов обсуждаемого типа по результатам сравнительного изучения адсорбции;

• Способность полученных полимеров-носителей и их конъюгатов образовывать адсорбционное покрытие па поверхности минеральной матрицы;

• Отсутствие цитотоксичности полученных полимеров в адсорбированном виде и положительное влияние их конъюгатов с биолигандами на адгезию и рост клеток на поверхности гибридных скаффолдов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: 1-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), «European BioPerspectives 2007» (Кёльн, Германия, 2007), «20lh Meeting of the European Society for Animal Cell Technology» (Дрезден, Германия, 2007), «Baltic Polymer Symposium 2007» (Друскининкай, Литва, 2007), 4-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практических семинарах в Институте Высокомолекулярных Соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и в Институте Технической Химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Работа была поддержана грантами РФФИ (№ 05-03-32310) и Немецкого Научного Общества (DFG, КА 1784/4-1). Для выполнения части исследования на территории Германии автор получил персональную стипендию Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD, с 1.09.2006 по 28.02.2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано тринадцать печатных работ, включающих 4 полнотекстовые статьи в журналах Journal of Applied Polymer Science, Bioconju-gate Chemistry, Журнал Прикладной Химии и в Трудах Международной конференции «Baltic Polymer Symposium 2007», а также 9 тезисов устных и стендовых докладов.

Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов, Списка литературы и Приложения. Материалы диссертации изложены на 166 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 61 рисунком, список цитируемой литературы включает 197 источников.

Выводы

1. Разработана стратегия получения полимерно-неорганических биораспознающих носителей клеток, или скаффолдов, для инженерии костной ткани, основанная на адсорбционном покрытии макропористой керамической основы биосовместимыми (со)полимерами винилса-харидов, модифицированными управляющими поведением клеток биологическими молекулами (биолигандами).

2. Впервые методом свободно-радикальной полимеризации синтезирован гомологичный ряд полимеров на основе винилсахарида 2-деокси-М-метакрилоил-амидоглюкозы (МАГ): го-мополимер, сополимер с N-винилпирролидоном и тройной сополимер с N-винилпирролидоном и диэтилацеталем акролеина; в последнем случае N-винилпирролидон выполнял роль инертного интермедиата, позволяющего вводить в структуру сополимера МАГ реакционноспособные альдегидные группы.

3. Впервые методами полимераналогичных превращений и сополимеризации с защищенной формой акролеина с дальнейшей активацией альдегида в полученном сополимере синтезированы новые альдегидсодержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахари-дов, а именно, окисленная периодатом натрия поли(2-деокси-М-метакрилоиламидоглюкоза) и поли([2-деокси-К-метакрилоиламидо-глюкоза]-со-[1-винилпирролидин-2-он]-со-[акролеин]). Показана возможность контролируемого введения альдегидных групп в полученные макро-молекулярные соединения.

4. Разработаны методы контролируемого синтеза моноконъюгатов полученных полимеров с лигандами различной биологической функциональности, а именно, фактором неспецифической адгезии клеток макромолекулярным поли-Ь-лизином, фактором роста и дифференциации клеток белком ВМР-2, а также низкомолекулярным интегрин-связывающим RGD-пептидом. Экспериментально установленные закономерности реакций конъюгирования позволили предложить метод создания «смешанных» конъюгатов - би- и трифункциональных полимерных векторов, представляющих собой контролируемое сочетание двух или трех био-лигандов в структуре выбранных полимеров.

5. Исследованы процессы адсорбции и десорбции полученных полимеров и их биоконъю-гатов. Установлено влияние химического строения полимеров-носителей и присоединяемых биолигандов на процесс адсорбции. Показана практическая необратимость адсорбции полимеров и конъюгатов, как в модельных экспериментах, так и в культуральной среде, используемой для роста клеток.

6. Показано, что синтезированные альдегидсодержащие полимеры на основе винилсаха-рида в виде их биофункциональных конъюгатов значительно стимулируют прикрепление клеток к поверхности скаффолда, ускоряют их рост и образование ткани по сравнению с не-модифицированной керамической основой скаффолда.

1. Bancroft G.N., Mikos A.G. Bone tissue engineering by cell transplantation // In: Ikada Y., Oshima N. (eds.) Tissue engineering for therapeutic use. New York: Elseveir, 2001. P. 151.

2. Mistry A.S.,' Mikos A.G. Tissue Engineering Strategies for Bone Regeneration // In: Ioannis V. Yannas (ed.) Regenerative Medicine 2: clinical and preclinical applications. Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 2005. V. 94. P. 2-22.

3. Brown K.L. Cruess R.L. Bone and cartilage transplantation in orthopaedic surgery. A review // J. Bone Joint Surg. Am. 1982. V. 64. P. 270-279.

4. Enneking W.F., Eady J.L., Burchardt H. Autogenous cortical bone grafts in the reconstruction of segmental skeletal defects // Bone Joint Surg Am. 1980. V. 62. P. 1039-1058.

5. Gitelis S., Saiz P. What's new in orthopaedic surgery // J Am Coll Surg. 2002. V. 194. P. 788-791.

6. Bostrom R.D., Mikos A.D. Tissue engineering of bone // In: Atala A. Mooney D. J. (eds.) Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Berlin: Birkhauser, 1997. P. 215-234.

7. Ma P., Elisseeff J. (Eds.) Scaffolding in tissue engineering. London, New York: CRC Taylor&Francis, 2006. 638 p.

8. Штильмаи М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: Академкнига, 2006. 399 с.

9. Ma P. Biomimetic Materials for Tissue Engineering // Adv Drug Deliv Rev. 2008. V.60, №.2. P. 184-198.

10. American Academy of Orthopaedic Surgeons (2003) Facts about fractures. In: American Academy of Orthopaedic Surgeons website http://www.aaos.org/wordhtml/research/stats/factshtm.

11. Goldberg C.F., Stevenson S. Bone graft options: fact and fancy // Orthopedics. 1994. V.17. P. 809810.

12. Шехтер А.Б., Розанова И.Б. Тканевая реакция на имплантант. В книге: Биосовместимость. / Отв. ред. Севастьянов В. И. М.: Медицина, 1999. 368 с.

13. Hodneland C.D., Lee Y.-S., Min D.-H., Mrkish M. Selective immobilization of proteins to self-assembled monolayers presenting active site-directed capture ligands // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P. 5048-5052.

14. Brekke J.H., Toth J.M. Principles of Tissue Engineering Applied to Programmable Osteogenesis // J Biomed. Mater. Res. (Appl Biomater). 1998. V. 43. P. 380-398.

15. Holland T.A., Mikos A.G. Review: Biodegradable Polymeric Scaffolds. Improvements in Bone Tissue Engineering through Controlled Drug Deliveiy // Adv Biochem Engin/Biotcchnol. 2006. V. 102. P.161-185.

16. Hench L.L., Jones J.R. (Eds.) Biomaterials, artificial organs and tissue engineering. Boca Raton: CRC Press, 2005.284 р.

17. Nair L.S., Laurencin C.T. Polymers as Biomaterials for Tissue Engineering and Controlled Drug Delivery//Adv Biochem Engin/Biotechnol. 2006. V. 102. P. 47-90

18. Пхакадзе Г.А. Биодеструктируемые полимеры, Киев.: Наукова думка, 1990. 160 с.

19. Морфологические и биохимические аспекты биодеградации полимеров / под ред. Пхакадзе Г.А. Киев: Наукова думка, 1986. 152 с.

20. Гумаргалиева К.З., Заиков Т.Е., Моисеев Ю.В. Макрокинетические аспекты биосовместимости и биодеградируемости полимеров // Успехи химии. 1994. Т. 63, №10. С. 905-921.

21. Middleton J.С., Tipton A.J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices // Biomaterials. 2000. V. 21, №. 23. P. 2335-2346.

22. Gunatillake P.A., Adhikari R. Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering // European Cells and Materials. 2003. V. 5. P. 1-16.

23. Hakkarainen M. Aliphatic Polyesters: Abiotic and Biotic Degradation and Degradation Products // Advances in Polymer Science. 2002. V. 157. P. 115-134.

24. Reed A.M., Gilding D.K. Biodegradable polymers for use in surgery poly(glycolic)/poly(lactic acid) homo- and copolymers: 2 In vitro degradation // Polymer. 1979. V. 20. P. 1459-1464.

25. Bertoldi C., Zaffe D., Consolo U. Polylactide/polyglycolide copolymer in bone defect healing in humans // Biomaterials. 2008. V. 29. P. 1817-1823.

26. Freier T. Biopolyesters in Tissue Engineering Applications // Adv Polym Sci. 2006. V. 203. P. 161.

27. Yang M., Zhu S., Chen Y., Chang Z., Chen G., Gong Y„ Zhao N., Zhang X. Studies on bone marrow stromal cells affinity of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 1365-1373.

28. Heller J., Barr J., Ng S. Y., Schwach-Abdellaoui K., Gurny R. Poly(orthoesters): synthesis, characterization, properties and uses // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 1015-1039.

29. Parkar M.H., Gellynck K., Buxton P.G. Osteogenic differentiation of hMSCs in dense collagen scaffolds for bone tissue engineering // European Cells and Materials V. -2007. V. 14. P. 84.

30. Osathanon Т., Linnes M. L., Rajachar R. M., Ratner B. D., Somerman M. J., Giachelli С. M. Microporous nanofibrous fibrin-based scaffolds for bone tissue engineering // Biomaterials. -2008. V. 29,1. 30. P. 4091-4099.

31. Solchaga L.A., Dennis J.E., Goldberg V.M., Caplan A.I. Hyaluronic acid-based polymers as cell carriers for tissue-engineered repair of bone and cartilage // J. Orthop. Res. 1999. V. 17. P. 205213.

32. Zhang Y., Ni M., Zhang M.Q., Ratner B. Calcium phosphate-chitosan composite scaffolds for bone tissue engineering // Tissue. Eng. 2003. V. 9. P. 337-345. r

33. Alsberg E., Anderson K.W., Albeiruti A., Franceschi R.T., Mooney D.J. Cell-interactive alginate hydrogels for bone tissue engineering // J. Dent. Res. 2001. V. 80. P. 2025-2029.

34. Lao C., Chen C., Chen J., Chiang S., Lin Y., Chang K. Fabrication of porous biodegradable polymer scaffolds using a solvent merging/particulate leaching method // J. Biomed. Mater. Res. 2002. V. 59. P. 676-681.

35. Mikos A.G., Sarakinos G., Leite S.M., Vacanti J.P., Langer R., Laminated three-dimensional biodegradable foams for use in tissue engineering // Biomaterials. 1993. V. 14. P. 323-330.

36. Zhang R., Ma P.X. Processing of polymer scaffolds: phase separation // In: Methods of Tissue Engineering/ Eds. Atala A., Lanza R.P. San Diego.: Academic Press, 2002. P. 715-724.

37. Ma P.X., Zhang R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V. 46. P. 60-72.

38. Richardson T.P., Peters M.C., Mooney D.J. Processing of polymer scaffolds gas foaming process // In: Methods of tissue engineering. / Eds. Atala A., Lanza R.P- San Diego.: Academic Press,2002. P. 733-740.

39. Roy T.D., Simon J.L., Ricci J.L., Rekow E.D., Thompson V.P., Parsosns J.R. Perfomance of degradable composite bone repair products made via three-dimensional fabrication techniques // J. Biomed. Mater. Res. 2003. V. 66A, I. 2. P. 283-291.

40. Simon J. L., Roy T. D., Parsons J. R., Rekow E. D., Thompson V. P., Kemnitzer J., Ricci J. L. Engineered cellular response to scaffold architecture in a rabbit trephine defect // J. Biomed. Mater. Res. 2003. V. 66A. P. 275-282.

41. Taboas J.M., Maddox R.D., Krebsbach P.H., Hollister S.J. Indirect solid free form fabrication of local and global porous, biomimetic and composite 3D polymer-ceramic scaffolds // Biomaterials.2003. V. 24. P. 181-194.

42. Giordano R.A., Wu B.M., Borland S.W., Cima M.J., Sachs E.M., Cima M.J. Mechanical properties of dense polylactic acid structures fabricated by three dimansional printing // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1996. V. 8. P. 63-75.

43. Varghese S., Elisseeff J.H. Hydrogels for Musculoskeletal Tissue Engineering // Adv. Polym. Sci. 2006. V. 203. P. 95-144.

44. Lee K.Y., Mooney D.J., Hydrogels for tissue engineering // Chem. Rev. 2001. V. 101. P. 18691879.

45. Cai K.Y., Yao K.D., Cui Y.L., Lin S.B., et al. Surface modification of poly(D,L-lactic acid) with chitosan and its effects on the culture of osteoblasts in vitro // J. Biomed. Mater. Res. 2002. V. 60. P. 398-404.

46. Tan W., Krishnaraj R., Desai T.A. Evaluation of nanostructured composite collagen-chitosan matrices for tissue engineering // Tissue Engineering. 2001. V. 7. P. 203-210.

47. Chung T.W., Lu Y.F., Wang H.Y., Chen W.P., Wang S.S., Lin Y.S., Chu S.H. Growth of human endothelial cells on different concentrations of Gly-Arg-Gly-Asp grafted chitosan surface // Artif. Organs. 2003. V. 27. P. 155-161.

48. Caterson E.J., Nesti L.J., Li W.J., Danielson K.G., Albert T.J., Vaccaro A.R., Tuan R.S. Three-dimensional1 cartilage formation by bone marrow-derived cells seeded on polylactide/alginate amalgam // J. Biomed. Mater. Res. 2001. V. 57. P. 394-403.

49. Bouhadir K.H., Lee K.Y., Alsberg E., Datum K.L., Anderson K.W., Mooney D.J. Synthesis Degradation of partially oxidized alginate and its potential application for tissue engineering // Biotechnol. Prog. 2001. V. 17. P. 945-950.

50. Hench L.L., Wilson J. An introduction to bioceramics. Singapore.: World scientific, 1993. 396 p.

51. Путляев В.И. Современные биокерамические материалы // Соросовский образовательный журнал. 2004. Т. 8, №1. С. 44-50.

52. Zhang R.Y., Ma P. Poly(alpha-hydroxyl acids) hydroxyapatite porous composites for bone tissue engineering. I. Preparation and morphology // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V. 44. P. 446-455.

53. Zhang Y., Zhang M.Q., Synthesis and characterization of macroporous chitosan/calcium phosphate composite scaffolds for tissue engineering // J. Biomed. Mater. Res. 2001. V. 55. P. 304-312.

54. Tenhuisen K.S., Martin R.I., Klimkiewicz M., Brown P. W. Formation and properties of a synthetic bone composite: hydroxyapatite-collagen // J. Biomed. Mater. Res. 1995. V. 29. P. 803810.

55. Katchalski-Katzir E., Kraemer D.M. Eupergitw C.A carrier for immobilization of enzymes of industrial potential//J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2002. V. 10. P. 157-176.

56. Macario A., Katovic A., Giordano G., Forni L., Carloni F., Filippini A., Setti L. Immobilization of Lipase on microporous and mesoporous materials: studies of the support surfaces // Stud. Surf. Sci. Catal. 2005. V. 155. P. 381-394.

57. Mann B.K., Schmedlen R.H., West J.L. Tethered TGF-beta increases extracellular matrix production of vascular smooth muscle cells // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 439-444.

58. Wong S.S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. Boca Raton.: CRC Press, 1991. 340 p.

59. Penzol G., Armisen P., Fernandez-Lafuente R., Rodes L., Guisan J. M. Use of dextrans as long and hydrophilic spacer arms to improve the performance of immobilized proteins acting on macromolecules // Biotechnol. Bioeng. 1998. V. 60. P. 518-523.

60. Ohya S., Nakayama Y., Matsuda T. Thermoresponsive artificial extracellular matrix for tissue engineering: hyaluronic acid bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) grafts // Biomacromolecules. 2001. V. 2. P. 856-863.

61. Molyneaux P. Water soluble synthetic polymers, properties and behaviour. V. 1. Boca Raton, FL.: CRC Press, 1984. 146 p.

62. Платэ H.A., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 296 с.

63. Панарин Е.Ф. Полимерные лекарства и биологически активные вещества. Итоги полувековых исследований и перспективы // Полимеры и медицина. 2005, № 1. С. 20-24.

64. Duncan R.,-Ringsdorf Н., Satchi-Fainaro R. Polymer Therapeutics: Polymers as Drugs, Drug and Protein Conjugates and Gene Delivery Systems: Past, Present and Future Opportunities // Adv. Polym. Sci. 2006. V. 192. P. 1-8.

65. Duncan R. The dawning era of polymer therapeutics // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. V. 2. P. 347360.

66. Duncan R., Kopecek J. Soluble Synthetic Polymers as Potential Drug Carriers // Advances in Polymer Science. 1984. V. 57. P. 51-101.

67. Davis K.A., Matyjaszewski K. Statistical, Gradient, Block, and Graft Copolymers by Controlled Living Radical Polymerizations // Advances in Polymer Science. 2002. V. 159. P. 1-169.

68. Kopecek J., Bazilova H. PolyN-(2-hydroxypropyl) methacrylamide] 1. Radical polimerisation and copolymerisation // Eur. Polym. J. 1973. V. 9. P. 7-14.

69. Soga O., van Nostrum C.F., Hennink W.E. Poly(N-(2-hydroxypropyl) Methacrylamide Mono/Di Lactate): A New Class of Biodegradable Polymers with Tuneable Thermosensitivity // Biomacromolecules. 2004. V. 5. P. 818-821.

70. Redi N.S. , Panarin E.F. Synthesis and study of the polymeric derivatives of levorin // Khimiko-farmatsevticheskii Zhurnal. 1978. V. 12, №. 5. P. 96-100.

71. Haaf A.S., Straub F. Polymers of N-vinylpyrrolidone: synthesis, characterization and uses // Polym. J. 1985. V. 17,1. 1. P. 143-152.

72. Zelikin A.N., Such G.K., Postma A., Caruso F. Poly(vinylpyrrolidone) for bioconjugation and surface ligand immobilization // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 2950-2953.

73. Ranucci E., Spagnoli G., Sartore L., Ferruti P. Synthesis and molecular weight characterization of low molecular weight end-functionalized poly(4-acryloylmorpholine) // Macromol. Chem. Phys. 1994. V. 195. P. 3469-3479.

74. Panarin E.F., Ivanova N.P., Belokhvostova A.T., Potapenkova L.S. Immunomodulating properties of homo- and copolymers of N-vinylamides // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2006. V. 40, №. 3.P. 141-144.

75. Solovskii M.V., Zaikina N.A., Panarin E.F., Denisov V.M., Pautov V.D., Ivanova O.G. Biological activity of polymeric derivatives of undecylenic acid // Pharmaceutical Chemistry Journal. 1997. V. 31, №. 7. P. 370-373.

76. Maeda H., Ueda M., Morinaga Т., and Matsumoto T. Conjugation of poly(styrene-co-maleic acid) derivative to the antitumor protein neocarzinostatin: pronounced improvements in pharmacological properties //J. Med. Chem. 1985. V. 28. P. 455-461.

77. Mathiowitz E. (Ed.) Encyclopedia of controlled drug delivery. New York.: Wiley, 1999. P. 786816.

78. Li Y.-Y., Zhang X.-Z., Cheng H., Kim G.-C., Cheng S.-X., Zhuo R.-X. Novel Stimuli-Responsive Micelle Self-Assembled from Y-Shaped P(UA-Y-NlPAAm) Copolymer for Drug Delivery // Biomacromolecules. 2006. V. 7. P. 2956-2960.

79. Harris J.M. (Ed.) Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications. New York.: Plenum Press, 1992. 385 p.

80. Jiang H.-L., Kim Y.-K., Arote R., Nah J.-W., Cho M.-H., et al. Chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier // Journal of Controlled Release. 2007. V. 117,1. 2. P. 273-280.

81. Kwon G.S. (Ed.) Polymeric Drug Delivery Systems. Boca Raton.: Taylor & Francis, 2005. 653 p.

82. Vilaseca L.A., Rose K., Werlen R., Meunier A., Offord R.E., Nichols C.L., Scott W.L. Protein conjugates of defined structure: synthesis and use of a new carrier molecule // Bioconjugates Chem. 1993. V. 4. P. 515-520.

83. Вирник А.Д., Хомяков К.П., Скокова И.Ф. Декстран и его производные // Успехи химии. 1975. V. 44. Р. 1280-1307.

84. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. СПб: Гиппо-крат, 1993. 264 с.

85. Boyer F.S., Greffe L., Davies G.L., Moroz О., Christiansen L. et. al. Highly efficient synthesis of beta(l-4)-oligo- and -polysaccharides using a mutant cellulase // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 5429-5437.

86. Johansson G., Joelsson M. Preparation of Cibacron Blue F3G-A-polyethylene glycol in large scale for use in affinity partitioning//Biotechnol. Bioeng. 1985. V. 27. P. 621-625.

87. Zalipsky S., Gilon C. and Zilkha A. Attachment of drugs to polyethylene glycols // Eur. Polym. J. 1983. V. 19. P. 1177-1183.

88. Khue N.V., Galin J.C. Antiinflammatorypolymer-bound steroids for topical applications I. Synthesis and characterization // J. Appl. Polym. Sci. 1985. V. 30. P. 2761-2778.

89. Monfardini C., Veronese F.M. Stabilization of Substances in Circulation // Bioconjugates Chem. 1998. V. 9. P. 418-450.

90. Ravin H.A., Seligman A.M., Fine, J. Polivinylpyrrolidone as plasma expander: studies on its excretion, distribution and metabolism //N. Engl. J. Med. 1952. V. 247,1. 24. P. 921-929.

91. Von Specht B.W., Seinfeld H., Brendel W. Polivinylpyrrolidone as a soluble carrier of proteins // Hope-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1973. V. 354. P. 1659-1660.

92. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М.: Наука, 1970. 150 с.

93. Панарин Е.Ф., Гаврилова И.И., Нестеров В.В. Синтез и свойства сополимеров винилпирролидона с диэтилацеталем акролеина // Высокомолекулярные соединения. 1978. Т. 20Б, №1. С.66-69.

94. Tennikova Т.В., Panarin E.F., Mirgorodskaya О.А., Samsonov G.V., Moskvichev B.V. Immobilization of the proteolitic enzyme terrilytin on a water-soluble polymeric matrix // Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal. 1977. V. 11, №. 7. P. 86-90.

95. Pap B.A., Макаров E.A., Юровский В.В., Мещерякова Е.А., Андронова Т.М., Иванов В.Т. Синтетические иммуногенные комплексы на основе пептида поверхностного белка вируса ящура//Биоорганическая химия. 1990. Т. 16, № 7. С. 904-915.

96. Varma A.J., Kennedy J.F., Galgali P. Synthetic polymers functionalized by carbohydrates: a review//Carbohydrate Polymers. 2004. V. 56. P. 429-445.

97. Klein J., Herzog D. Poly(vinylsaccharide)s, 2: Synthesis of some poly(vinylsaccharide)s of the amide type and investigation of their solution properties // Makromol. Chem. 1987. V. 188. P. 1217-1232.

98. Wurff G., Schmid J., Venhoff T. The synthesis of polymerizable vinyl sugars // Macromol. Chem. Phys. 1996. V. 191. P. 259-274.

99. Klein J., Blumenberg K. Poly(vinylsaccharide)s, 4: Synthesis and polymerization of 6-0-methylallylgalactose derivatives // Makromol. Chem. 1988. V. 189. P. 805 813.

100. Панарин Е.Ф., Иванова Н.П., Кевер E.E. Ферментативный синтез винилсахаридов и полимеры на их основе // Высокомолек. соед. 1998. Т. 40А, № 1. С. 15-23.

101. Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Искра Л.И, Кацнель Е.М. Углеводсодержащие винильные полимеры // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия и биология. 2001, № 2. С. 31-44.

102. Ladmiral V., Melia Е., Haddleton D. М. Synthetic glycopolymers: an overview // European Polym. J. 2004. V. 40. P. 431-449.

103. Ouchi Т., Sakamoto Y., Jokei S., Chikashita H. Synthesis of an acryloyl-type polymer pending D-glucose analog of N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine // Macromol. Chem. 1984. V. 185,1. 2. P. 255-262.

104. Klein J., Herzog D., Hajibegli A. PoIy(vinyl saccharide)s, 1. Emulsion polymerization of poly(methacryloylglucose) // Makromol. Chem. Rapid Comm. 1985. V. 6,1. 10. P. 675-678.

105. Grande D., Baskaran S,, Chaikof E. L. Synthesis of non-sulfated and sulfated glycopolymers // Polymer Prepration (ACS, Division Polymer Chemistry). 2000. V. 41,1. 1. P. 1000-1001.

106. Иванова Н.П., Панарин Е.Ф., Денисов B.M. Синтез сополимеров винилпирролидона с монозамещенными эфирами углеводов и ненасыщенных карбоновых кислот // Журнал Прикладной Химии. 1998. Т. 71., № i.e. 114-118.

107. Панарин Е.Ф., Иванова Н.П. Синтез сополимеров N-винилформамида с метакриламидоглюкозой //Журнал Прикладной Химии. 2005. Т. 78, № 8. С. 1340-1343.

108. Назарова О.В., Фомина Н.Г., Афанасьева Е.Ф., Панарин Е.Ф. Сополимеры N-метакрилоиламиноглюкозы, содержащие звенья непредельных кислот и активированных сложных эфиров //Журнал Прикладной Химии. 2003. Т.76, № 10. С. 1692-1695.

109. Павлов Г.М, Корнеева Е.В., Михайлова Н.А., Иванова Н.П., Панарин Е.Ф. Гидродинамические свойства и молекулярные характеристики полиметакрилоилглюкозамина // Высокомол. соед. сер. А. 1993. Т. 35, №10. С. 1647-1650.

110. Pavlov G.M., Ivanova N.P, Korneeva E.V., Mikhailova N.A., Panarin E.F. Molecular characteristics of poly(methacrylamido D-glucose) // J. Carbohydr. Chem. 1996. V. 15, I. 4, P. 419-433.

111. Spain S., Gibson M., Cameron N. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers // J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2007. V. 45. P. 2059-2072.

112. Bernard J., Нао X., Davis T. P., Barner-Kowollik C., Stenzel M. H. Synthesis of Various Glycopolymer Architectures via RAFT Polymerization: From Block Copolymers to Stars // Biomacromolecules. 2006. V. 7. P. 232-238.

113. Панарин Е.Ф., Иванова Н.П., Белохвостова A.T., Потапенкова JI.C. Синтез и иммуномодулирующие свойства сополимеров N-винилпирролидона и винилсахаридов // Хим.-Фарм. Журнал. 2002. Т. 36, № 4. С. 19-22.

114. Панарин Е.Ф., Иванова Н.П., Белохвостова А.Т., Потапенкова JI.C. Изучение иммуностимулирующих свойств поливинилсахаридов // Иммунология. 1999, № 2. С.26-28.

115. Chytry V., Kopecek J., Leibnitz E. et al. Copolymers of 6-O-methacryloyl-D-galactose and N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide: Targeting to liver after intravenous administration to rats // New Polymeric Mat. 1987. V. 1, № 1. P. 21-28.

116. Duncan R., Kopeckova-Rejmanova P., Stroham J. et al. Anticancer agents coupled to N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers. I. Evaluation of daunomycin and puromycin conjugates in vitro//Br. J. Cancer. 1987. V. 55. P. 165-174.

117. Miura Y. Synthesis and biological application of glycopolymers // J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2007. V. 45. P. 5031-5036.

118. Холмберг К., Йёнссон Б., Кронберг Б, Линдман Б. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах. Пер. с англ. М.: Бином, 2007. - 528 с.

119. Липатов 10.С., Сергеева Л.М. Адсорбция полимеров. Киев.: Наукова думка, 1972. 195 с.

120. Скворцов A.M., Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Тенников М.Б. О соответствии поведения реальной макромолекулы и гауссовой цепи при адсорбции в порах // Высокомол. соед, сер. А. 1978. Т. 20, № 3. С. 678-685.

121. Скворцов A.M., Горбунов А.А., Жулипа Е.Б., Бирштейн Т.М. Поведение макромолекул в ограниченных объемах // Высокомол. соед. сер. А. 1978. Т. 20, № 4. С.816-824.

122. Беленький Б.Г., Вилепчик Л.З. Хроматография полимеров. М.: Химия, 1978. 344 с.

123. Chibowski S. Dependence of the adsorption behavior of polyvinyl alcohol at the polystyrene latex-solution interface on the molecular weight//J. Colloid Interface Sci. 1990. V. 134,1. 1. P. 174180.

124. Malmsten M., Lindman B. Ellipsometry studies of the adsorption of cellulose ethers // Langmuir. 1990. V. 6,1. 2. P. 357-364.

125. Fleer J. G., Cohen Stuart M. A., Scheutjens J. M. H. M., Cosgrove Т., Vincent B. Polymers at Interfaces. London.: Chapman & Hall, 1993. 502 p.

126. Laos K., Parker R., Moffat J., Wellner N., Ring S.G. The adsorption of globular proteins, bovine serum albumin and b-lactoglobulin, on poly-L-lysine-furcellaran multilayers // Carbohydr. Polym. 2006. V. 65. P. 235-242.

127. Matuszewska В., Norde W., Lyklema J. Competitive adsorption of human plasma albumin and dextran on silver iodide // J. Colloid Interface Sci. 1981. V. 84, №2. P. 403-408.

128. Chapman R.G., Ostuni E., Takayama S., Holmlin R.E., Yan L., and Whitesides G.M. Surveying for surfaces that resist the adsorption of proteins // J. Am. Chem. Soc. 2000 V. 122 - P. 83038304.

129. Mano F., Sousa A., Boesel F., Neves M., Reis L. Bioinert, biodegradable and injectable polymeric matrix composites for hard tissue replacement: state of the art and recent developments // Composites Science and Technology. 2004. V.64, №6. P. 789-817.

130. Matsumoto Т., Mooney J.D. Cell Instructive polymers // Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 2006.V. 102. P. 113-137.

131. Schmedlen R.H., Masters K.S., West J.L. Photocrosslinkable PVA hydrogels that can be modified with cell adhesion peptides for use in tissue engineering // Biomaterials 2002 - V. 23. P. 43254332.

132. Lee K.Y., Peters M.C., Anderson K.W., Mooney D.J. Controlled growth factor release from synthetic extracellular matrices //Nature. 2000. V. 408, №6815. P. 998-1000.

133. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия. 2-е изд.: Пер. с нем. М.: Мир, 2004. 469 с.

134. De Arcangelis A., Georges-Labouesse Е. lntegrin and ЕСМ functions: roles in vertebrate development // Trends Genet. 2000. V. 16. P. 389-395.

135. Hynes R.O. Integrins: bi-directional, allosteric, signaling machines // Cell. 2002. V. 110. P. 673687.

136. VandeVondele S., Voros J., Hubbell J. A. RGD-grafted poly-l-lysine-gra/i^polyethylene glycol) copolymers block non-specific protein adsorption while promoting cell adhesion // Biotechnology and Bioengineering. 2003. V. 82, №7. P. 784-790.

137. Spoerkea E.D., Stupp S.I. Synthesis of a poly(L-lysine)-calcium phosphate hybrid on titanium surfaces for enhanced bioaetivity // Biomaterials. 2005. V. 26. P. 5120-5129.

138. Werner C., Pompe Т., Salchert K. Modulating Extracellular Matrix at Interfaces of PolymericMaterials // Adv. Polym. Sci. 2006. V.203. P. 63-93.

139. Woo K.M., Chen V.J., Ma P.X. Nano-fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment// Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2003. V. 67, №2. P. 531-537.

140. Ito Y., Kajihara M., Imanishi Y. Materials for enhancing cell adhesion by immobilization of cell-adhesive peptide//J. Biomed. Mat. Res. 1991. V. 25. P. 1325-1337.

141. Mann B.K., Tsai A.T., Scott-Burden Т., West J.L. Modification of surfaces with cell adhesion peptides alters extracellular matrix deposition // Biomaterials. 1999. V. 20. P. 2281-2286.

142. Humphries M.J. The molecular basis and specificity of integrin-ligand interactions // J. Cell Biol. 1990. V. 97. P. 585-592.

143. Massia S.P., Hubell J.A. An RGD spacing of 440 nm is sufficient for integrin mediated fibroblast spreading and 140 nm for focal contact and stress fiber formation // J. Cell Biol. 1991. V. 114. P. 1089-1100.

144. Trippel S.B. Growth factors as therapeutic agents // Instr. Course Lect. 1997. V. 46. P. 473-476.

145. Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. Пер. с англ. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002. 446 с.

146. Kim J., Kim I.S., Chod Т.Н., Lee K.B. Bone regeneration using hyaluronic acid-based hydrogel with bone morphogenic protein-2 and human mesenchymal stem cells // Biomaterials. 2007. V. 28. P. 1830-1837.

147. Wozney J. M. Overview of bone morphogenetic proteins // Spine. 2002. V.27. P. S2-S8.

148. Boyne P.J., Animal studies of application of rhBMP-2 in maxillofacial reconstruction // Bone. 1996. V. 19. P. S83-S92.

149. Kuhl P.R., Griffith-Cima L.G. Tethered epidermal growth factor as paradigm for paradigm for growth factor-induced stimulation from the solid phase //Nat. Med. 1996. V. 2. P. 1022-1027.

150. Gobin A.S., West J.L. Effects of epidermal growth factor on fibroblast migration through biomimetic hydrogels // Biotech. Prog. A 2003. V.67. P. 255-259.

151. Sakiyama S.E., Hubbel J.A. Development of fibrin derivatives for controlled release of heparin-binding growth factors // J. Contr. Release. 2000. V. 65. P.389-402.

152. Kapur T.A., Shoichet M.S. Chemically bound nerve growth factor for neural tissue engineering applications // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2003. V. 14. P.383-394.

153. Платэ H.A., Литманович А.Д., Hoa O.B. Макромолекулярные реакции. M.: Химия. 1977. 254 с.

154. Власов В.В., Грачев М.А., Лаврик О.И. и др. Аффинная модификация биополимеров. Новосибирск: Наука, 1983. 241 с.

155. Kovensky J., Cirelli A.F. Chemical modification of glycosaminoglycans. Sulphation of heparan sulphate derivatives obtained by periodate oxidation/borohydride reduction // Carbohydr. Polym. 1996. V. 31. P. 211-214.

156. Tiziani S., Sussich F., Cesaro A. The kinetics of periodate oxidation of carbohydrates 2. Polymeric substrates // Carbohyd. Res. 2003. V. 338. P. 1083-1095.

157. Pasut G., Veronese F.M. Polymer-drug conjugation, recent achievements and general strategies // Progress in Polymer Science. 2007. V. 32, №8-9. P. 933-961.

158. Thordarson P., Le Droumaguet В., Velonia K. Well-defined protein-polymer conjugates— synthesis and potential applications // Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. V. 73, № 2. P. 243-254.

159. Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 2-nd edn. NY.: Alan R. Liss, 1987-672 p.

160. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимиков. Пер. с англ. М.: Мир, 1983. 263 с.

161. Freshney R.I. Use of tissue culture in predictive testing of drug sensitivity // Cancer Topics. 1978 -V.l.P. 5-7.

162. Lloyd C.W., Rees D.A., Smith C.G., Judge F.J. Mechanism of cell adhesion: early-forming junctions between aggregating fibroblasts // J. Cell Sci. 1976. V. 22. P. 671-684.

163. Troyanovsky S. M. Mechanism of cell-cell adhesion complex assembly // Current Opinion in Cell Biology. 1999. V. 11, №5. P. 561-566.

164. Luo E., Liu X., Wei S.C., Cai X.X., Hu J. Osteoblast adhesion to clodronate-hydroxyapatite composite // Applied Surface Science. 2008. V. 255, № 2. P. 308-311.

165. Buma P., Schreurs W., VerdonschotN. Skeletal tissue engineering-from in vitro studies to large animal models // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 1487-95.

166. Liu Q., Cen L., Yin S., Chen L., Liu G., Chang J., Cui L. A comparative study of proliferation and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells on akermanite and p-TCP ceramics // Biomaterials. 2008. V. 29, № 36. P. 4792-4799.

167. Lane R.F., Tripp E.J. Basic fuchsin and the preparation of Schiffs reagent // Med Lab Technol. 1971. V. 28, №1. P. 26-34.

168. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс. К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 556 с.

169. Калашникова И.В. Адсорбция биологических частиц (вирусов) на функционализированной поверхностиполимерных сорбентов монолитного типа: Дис. канд. хим. наук. СПб.: 2008. 170 с.

170. Svec F., Huber C.G. Monolith Materials. Promises, Challenges, Achievements // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 2100-2107.

171. Organization for Economic Cooperation and Development, Principles of Good Laboratory Practice. OECD Publications.: Paris, 1998. 39 p.

172. Whistler R.L. (Ed.) Methods in carbohydrate chemistiy. V. 5 // General polysacharides. NY, London: Academic Press, 1965. 463 p.

173. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.:Мир, 1965. 251 с.

174. Структурные исследования макромолекул спектроскопическими методами. Пер. с англ. / Под ред. Бучаченко A.JI. М.: Химия, 1980. 304 с.

175. Кулькова А.Е., Малькова Л.В., и др. Получение и свойства сополимеров аллиловых эфиров фтапевых и алкилакриловых кислот с метилметакрилатом // Высокомолекул. соедин. 1980. Т. 22Б, №2. С. 131-134.

176. Органические реакции. Сборник 13. Пер. с англ. / Под ред. Луценко И. Ф. М.: Мир, 1966. 490 с.

177. Vlakh E., Panarin E., Tennikova Т., Suck K., Kasper C. Development of multifunctional polymer-mineral composite materials for bone tissue engineering // J. Biomed. Mat. Res. 2005. V. 75. P. 333-341.

178. Smith J.W., Cheresh D.A. The Arg-Gly-Asp binding domain of the vitronectin receptor // J. Biol. Chem. 1988. V.263, № 35. P. 18726-18731.

179. Brinke G.,-Ruokolainen J., Ikkala O. Supramolecular materials based on hydrogen-bonded polymers//Adv. Polym. Sci. 2007. V. 207. P. 113-177.

180. Benke D., Olah A., Mohler H. Protein-chemical analysis of Bio-Oss bone substitute and evidence on its carbonate content// Biomaterials. 2001. V.22. P. 1005-1012.

181. Svec F., Tennikova T.B. Polymeric separation media for chromatography of biopolymers in a novel shape: macroporous membranes // J. Bioact. Compat. Polym. 1991. V. 6. P. 95-107.

182. Gendler E., Gendler S., Nimni E. Toxic reactions evoked by glutaraldehyde-fixed pericardium and cardiac valve tissue bioprothesis // J. Biomed. Mat. Res. 1984. V. 18. P. 727-736.