Влияние размеров белковых макромолекул на избирательность их сорбции катионитами различных типов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

\П

! 1Г/ у

ОЧКУР Ольга Витальевна

ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ БЕЛКОВЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ НА ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ИХ СОРБЦИИ КАТИОНИТАМИ РАЗЛИЧНЫХ

ТИПОВ

Специальность 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2008 3 О Я Н 5 2009

003460485

Работа выполнена в отделе биологически активных полимеров Института высокомолекулярных соединений Российской Академии Наук.

Научный руководитель: доктор химических наук

Демин Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Бронников Сергей Васильевич

доктор химических наук Лебедев Юрий Яковлевич

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

университет

Защита диссертации состоится « П » февраля 2009 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.231.02 в Санкт-Петербургском государственном технологическом университете растительных полимеров по адресу: 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технологического университета растительных полимеров

Автореферат разослан « 26 » декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент ^ > Евдокимов А.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Различные хроматографические методы выделения и очистки биологически активных веществ (БАВ), в частности белков, имеют свои достоинства и недостатки. Наиболее экономичными и легко масштабируемыми процессами являются фронтальные процессы ионообменной хроматографии. Но по избирательности они уступают процессам аффинной хроматографии. Выделение белка с использованием одноактного ионообменного процесса может быть проведено, если целевой компонент резко отличается по своим свойствам от остальных компонентов. В противном случае приходится либо использовать каскад колонок с различными сорбентами, либо после насыщения фазы сорбента смесью различных белков с помощью промывки сорбента различными буферными растворами стараться отделить целевой белок от сопутствующих. Процесс осложняется тем, что множественные ион-ионные взаимодействия белка с ионогенными группами сорбента, дополняемые гидрофобным взаимодействием, приводят к межбелковому связыванию в фазе сорбента, что отрицательно сказывается на разделении белков. Известно, что уменьшение концентрации ионогенных групп сорбента повышает эффективность разделения. Однако, эти исследования проводили на модельных растворах, содержащих белки с близкой молекулярной массой и, соответственно, примерно одинаковыми размерами. Очевидно, что размеры белковой макромолекулы, непосредственно влияя на ее диффузию в фазе сорбента, должны оказывать и влияние на избирательность ее сорбции из многокомпонентной смеси. Чем больше размеры белка, тем больше на его поверхности групп способных к связыванию с полиэлектролитной сеткой или заряженной поверхностью. Следовательно, можно ожидать, что при определенных условиях после пропуска через колонну с сорбентом раствора смеси белков сорбент окажется насыщенным самым большим по размеру белком. Таким образом весь процесс выделения белка возможно провести всего в две стадии: сорбция до насыщения и последующая десорбция.

В связи с вышеизложенным выбранное направление исследований, а именно, исследование взаимодействия модельных белковых смесей с полимерными сорбентами с различной концентрацией ионогенных групп с целью определения влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции в многокомпонентном процессе, является актуальным как с теоретической, так и с прикладной точки зрения. Создание сорбентов с уменьшенным содержанием ионогенных групп позволит оптимизировать процессы тонкого разделения белков в хроматографическом процессе.

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 03-03-32710 и 06-03-32363)

и по планам Института высокомолекулярных соединений РАН. Кроме того, работа является победителем «Конкурса персональных грантов 2007 года для студентов и аспирантов вузов и академических институтов Санкт-Петербурга»» и программы "Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса" (УМНИК).

Цель работы: Исследование влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции гетеросетчатыми катионитами и монолитными носителями с варьируемым числом ионогенных групп для повышения эффективности разделения белков в ионообменной хроматографии.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи;

получение макропористых монолитных катионитов (сополимеров глицидилметакрилата и

этилснгликольметакрилата) с различной степенью карбоксшшрования;

исследование влияния концентрации карбоксильных групп в набухающих полиэлектролитных сетках при постоянном содержании сшивающего агента, а так же степени карбоксшшрования монолитного носителя на структуру сорбентов;

изучение процессов последовательной и совместной сорбции смесей модельных белков, различающихся своими размерами, на катионитах с различным содержанием карбоксильных групп;

создание модели укрупненного белка путем сшивания макромолекул глутаровым альдегидом, а также их прививки на частицы полистирольного латекса с целью проверки предположения об определяющей роли размеров белка в избирательности сорбции на катионитах с малым содержанием карбоксильных групп;

расчет биленгмюровских изотерм на основании данных, полученных для однокомпонентных систем, содержащих сорбент и раствор одного белка;

разделение белков плазмы крови по их молекулярным размерам на полученных ионобменных сорбентах.

Методы исследования. Для исследования структуры набухающих гетеросетчатых катионитов, макропористых монолитов и катионитов на их основе были использованы методы электронной микроскопии, динамической десорбции паров и ртутной порометрии. Для определения количества ионогенных групп и их константы диссоциации был использован метод кислотно-основного и потенциометрического титрования. Для оценки

составов белковых растворов до и после контакта с сорбентом применялись методы спектрофогометрии в УФ и видимой областях, а так же гель-электрофорез. Для количественной оценки результатов гель-электрофореза был использован метод денснтометрии.

Объектами исследования являлись 1) серия гетеросетчатых набухающих катионитов на основе сополимера метакрилоил-(3-аланина, гидроксипропилметакриламида и этилендиметакриламнда с различным содержанием ионогенных групп; макропористые монолитные носители на основе сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата, а так же серия катионитов, полученная путем их модификации.

2) модельные белки (фибриноген, бычий сывороточный альбумин, цитохром с), их смеси и плазма крови человека. Научная новизна.

1. Методами электронной микроскопии, динамической десорбции паров и ртутной порометрии показано, что изменение соотношения между ионогенными и неионогеиными звеньями сорбентов при сохранении постоянного содержания сшивающего агента для полиэлектролитных сеток, а так же степень карбоксилирования для монолитных носителей не оказывают существенного влияния на строение сорбционных материалов.

2. Изучена кинетика реакции модификации монолитных носителей карбоксильными группами и получена серия сорбентов с различной концентрацией ионогенных групп. Показано, что отсутствие диффузионных затруднений в проточных порах монолитных носителей позволяет добиться равномерного распределения карбоксильных групп на поверхности пор.

3. Показано, что при высокой концентрации ионогенных групп (0,6 мг-экв4- и выше) процессы последовательной и совместной сорбции модельных белков различного размера на карбоксильных катионитах различных типов (гетеросетчатых и монолитных) в статических и динамических условиях сопровождаются синергетическими явлениями.

4. Установлено, что уменьшение содержания ионогенных групп в фазе сорбента в 4-5 раз по сравнению с максимально достижимой (до значения 0.2-0.3 мг-экв/г) приводит к «полуконкурентной» сорбции: больший по размеру белок вытесняет меньший, тогда как обратного явления не происходит. При этом наблюдается резкое (на два порядка) увеличение избирательности сорбции большего белка.

Практическая значимость работы.

На примере полученных серий набухающих и макропористых монолитных сорбентов с различным содержанием карбоксильных групп продемонстрировано, что уменьшение полной обменной емкости сорбентов увеличивает избирательность сорбции белков большого размера из смеси. Результаты, полученные при разделении модельных смесей белков, могут быть использованы при разработке процессов разделения биологических жидкостей, например, плазмы крови.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на четырех Санкт-Петербургский конференциях молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (февраль 2005, февраль 2006, апрель 2007 и апрель 2008), на 5-м и 6-м Международном симпозиуме "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, июнь 2005 и июнь 2008), на X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва, апрель 2006), на Третьей и Четвертой Всероссийских конференциях «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» (Воронеж, октябрь 2006 и октябрь 2008), на Международной конференции "Actual problems of polymer chemistiy and physics" (Ташкент, 2006), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». (Москва, апрель 2007), на научном семинаре Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева по хроматографии (май 2007), на XI Международной конференции «Физико-химические основы ионобменных процессов - ИОНИТЫ-2007» (сентябрь 2007) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, апрель 2008).

Публикации. По теме работы имеется 18 публикаций, в том числе 5 статей. Личный вклад автора состоял в непосредственном проведении экспериментов и расчетов, анализе и обобщении результатов, в разработке модельных представлений.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. При последовательной и совместной сорбции белков различных размеров на карбоксильных катионитах, как набухающих, так и монолитного типа, при большой (до 0,6 мг-эквФ) концентрации ионогенных групп в условиях, близких к условиям максимального связывания, наблюдаются синергетические явления.

2. Уменьшение концентрации карбоксильных групп приводит к ослаблению связывания белка с полиэлектролитной сеткой или поверхностью монолитного носителя. Ослабление связывания зависит от размеров белка. Это обстоятельство позволяет резко (на

два порядка) увеличить избирательность сорбции из смеси белка большего по размеру.

3. Особенности структуры монолитных носителей дают возможность добиться большего выигрыша в избирательности сорбции по сравнению с набухающими гетеросетчатыми катионитами.

4. Структурные изменения полиэлектролитных сеток при изменении соотношения между ионогенными и неионогенными звеньями при постоянном содержании сшивающего агента, и монолитных носителей при изменении степени карбоксилирования незначительны и не влияют на характер сорбционных процессов.

5. Расчет биленгмюровских изотерм на основании данных, полученных для однокомпонентных систем (сорбент-раствор белка) дает количественное совпадение с экспериментом лишь для вытесняемого белка.

6. Результаты, полученные для модельных смесей белков, дают возможность разделить во фронтальном хроматографическом режиме белки плазмы крови.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав основного текста, библиографии (103 источника), заключения и выводов. Работа изложена на 137 страницах текста и содержит 41 рисунок и 16 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность темы, обозначена ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования. В обзоре литературы рассматриваются особенности взаимодействия белков с сорбционными материалами, обсуждаются материалы, используемые для ионобменной хроматографии белков. Так же затрагиваются вопросы синергизма и конкуренции в процессе взаимодействия белков с полимерными сорбентами и возможности повышения селективности сорбционного процесса. Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования. Главы 3 и 4 посвящены обсуждению полученных результатов.

1. Избирательность сорбции белков на набухающих сорбентах

1.1. Влияние содержания ионогенных групп на структуру и свойства

катионнтон

1. Неизменность структуры и равномерное распределение ионогенных групп в сорбенте обеспечивались введением в реакционную смеси ионогенного (метакрилоил-р-аланина, МАА) и неиноогенного (N-(2-гидроксипропил)метакриламида, ГПМА) мономеров при постоянном содержании сшивающего агента (этилендиметакриламида, ЭДМА) (рис.1).

СП, = с — СО—N11 — ОН, — СН, — СООН (МАА)

СН, = С — СО — КН - СН, — СИ,—ГШ — со -

сн3

-С = СН2

I

СИ,

(ЗДМА)

СН2 = С — СО — ми—СН: — СН — СН, (11ШЛ)

I

СН3

011

Рис.1. Структурные формулы мономеров, использованных при синтезе сорбента.

Введение в состав реакционной смеси ГПМА, близкого по структуре к ионогенному мономеру, позволило уменьшать обменную емкость образцов за счет изменения соотношения «МАА:ГПМА», сохраняя содержание ЭДМА постоянным (20%). Таким образом, изменение обменной емкости образцов в серии за счет варьирования соотношения количеств ионогенного и неионогенного мономеров, позволило избежать увеличения гидрофобности образцов по мере снижения содержания ионогенного мономера. В результате, методом тройной соиолимеризации метакрилоил-Р-аланина (МАА), гидроксипропилметакриламида (ГПМА) и этилендиметакриламида (ЭДМА) была синтезирована серия карбоксильных катионитов на основе набухающих гетеросетчатых полимеров с обменной емкостью по малому неорганическому иону в диапазоне от 4,6 до 0.9 мг-экв/г, и для полученных образцов был определен ряд характеристик (табл.1).

Таблица 1

Некоторые характеристики сополимеров МАА, ГПМА и ЭДМА

Сорбент Мольное соотношение МАА:ГПМА Кнаб в воде Котн Удельный объем У,мл/г Емкость по На+, мг-экв/г

КМА-Э20 1:0 5,3 1,4 7,46 4,62

КМАГ-1-1-Э20 1:1 5,5 1,1 7,87 2,40

КМАГ-1-3-Э20 1:3 5,8 1,05 9,66 1,35

КМАГ-М-Э20 1:4 5,8 1,02 9,10 1,02

КМАГ-1-5-Э20 1:5 5,8 1,0 7,37 0,92

Для подтверждения этого предположения были получены электронные фотографии и исследована структура образцов синтезированных катионитов методом динамической десорбции паров.

На рис. 2 приведены электронные фотографии трех образцов сорбентов, из которых видно, что различия между образцами незначительны.

КМА-Э20

КМАГ-1-1-Э20

КМАГ-1-5-Э20

Рис.2. Электронная микросколия образцов набухающих гетеросетчатых катионитов.

1.2. Исследование процессов сорбции модельных белков на серии набухающих гетеросетчатых катионитов с различным содержанием карбоксильных групп

1.2.1.Определение оптимума рН для сорбции модельных белков

Для определений условий проведения последующих экспериментов были определены значения рН, оптимальные для сорбции модельных белков на синтезированных катионитах. Результаты представлены на рисунке 3. Для БСА и фибриногена оптимальное значение рН лежит в кислой области и составляет величину 3.8 является щелочным белком

М, мг/мл

40-

1

I ^ / \

Оптимум сорбции цитохрома с, который изоэлектрической точкой 10.05, находится в нейтральной области, тем не менее, его поглощение при рН 3,8 остается значительным поэтому для осуществления дальнейших опытов был выбран ацетатный буфер с рН=3.8.

Рис. 3. Зависимость сорбции белков от рН (сорбент КМАГ-1-3-Э20).

рн

1.2.2. Сорбция модельных белков из индивидуальных растворов

На рис. 4 представлены изотермы сорбции для белков из индивидуальных растворов на катионитах с разным содержанием ионогенных групп.

0,4

о,в

0,8

, мг/мл

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

КМА-Э20; 2 - КМАГ-1-1-Э20; 3 - КМАГ-1-3-Э20; 4 - КМАГ-1-4-Э20;

5 - КМАГ-1-5-Э20.

а б

Рис. 4. Изотермы сорбции для БСА (а) и фибриногена (б) па катионитах с различным содержанием ионогенных групп.

1.2.3. Последовательная сорбция модельных белков Для того, чтобы оценить параметр, ключевой в переходе от синергетической сорбции к конкурентной, а именно, наличие или отсутствие вытеснения одного белка другим из фазы сорбента, были проведены эксперименты по последовательной сорбции модельных белков в статических и динамических условиях. На рис. 5 представлены данные по последовательной сорбции в статических условиях для БСА и цитохрома с на сорбентах КМА-Э20 и КМАГ-1-5-Э20. Итак, в случае сорбента с наибольшим числом карбоксильных групп (рис. 5 а) вне зависимости от последовательности приведения белков в контакт с сорбентом, после добавления второго белка не происходит вытеснения первого, прочно связанного с катионитом. При этом наблюдается дополнительная сорбция первого белка, т.е. классический эффект синергизма.В другом же случае (рис. 5 б), если первым белком является БСА, то не наблюдается его вытеснения цитохромом с, тогда как после добавлении навески БСА в равновесную систему сорбент - раствор цитохрома с, альбумин в

значительной степени вытесняет цитохром с из фазы сорбента, при этом количество цитохрома с в сорбенте уменьшается более чем в два раза.

ЕЗБСА

СП Цитохром с I

М, мг/мл 7-

I ■ ! Цитохром с '

!-! ЬСА

а б

Рис. 5. Последовательная сорбция цитохрома с и БСА па КА1А-Э20 (а) и КМАГ-1-5-Э20 (б).

1,2- результаты сорбции индивидуальных белков, 3, 4 - результаты последовательной сорбцгш,в верхней части диаграммы - белок, сорбированный на втором этапе.

Уменьшение числа ионогенных групп в сорбенте ведет к уменьшению числа связей белок-сорбент, причем в первую очередь это должно отражаться на взаимодействии с сорбентом именно белков меньшего размера. Уменьшение же числа связей белка с сорбентом должно приводить к возможности замещения одного белка другим, то есть к конкуренции. Из экспериментов по последовательной сорбции белков видно, что цитохром с не способен вытеснить более крупный белок при любом содержании ионогенных групп. В то же время, будучи предварительно сорбированным он вытесняется на сорбентах с уменьшенным содержанием ионогенных групп. Такой эффект было предложено называть «полуконкурентным», или «частично конкурентным», т.е. вытеснение меньшего белка большим, но не наоборот.

1.2.4. Совместная сорбция модельных белков

Для того чтобы оценить, насколько наличие или отсутствие вытеснения одного белка другим влияет на избирательность сорбции в многокомпонентном процессе, была рассмотрена сорбция модельных белков из бинарных растворов. Состав сорбата оценивали по отношению концентрации белка большего размера к концентрации белка меньшего размера в растворах, полученных после процесса десорбции (таб. 2). Поскольку на колонку подавали растворы с равными весовыми

концентрациями белков, численно полученные значения соответствуют величинам коэффициента избирательности. Видно, что при сорбции из растворов белков до полного насыщения соотношение между количеством сорбированного цитохрома с и БСА меняется от 0.4 (для сорбента с 80 мол.% МАА) до 8.3 (сорбенты с 16 и 13,3 мол.% МАА). Это означает, что при переходе к сорбентам с меньшим числом ионогенных групп существенно повышается избирательности сорбции белков большего размера.

Таблица 2

Состав элюатов процесса сорбции из бинарного раствора

Сорбент Сбса/С^ Сфнбр/Сцит Сщл^Синсулин Сфибр/СнсА

КМА-Э20 0.4 1 1,1

КМАГ-1-1-Э20 0.6 0.9

КМАГ-1-3-Э20 1 5.5 2.5 1,9

КМАГ-1-4-Э20 8.3 6 2 2,2

КМАГ-1-5-Э20 8.3 8.3 2 11,1

Определяющее влияние именно размеров белков подтверждают результаты экспериментов по совместной сорбции цитохрома с и инсулина. Их размеры близки и уменьшение содержания ионогенных групп не приводит к существенному изменению избирательности.

Ранее, на примере сорбции пары инсулин - рибонуклеаза на различных сорбентах было показано, что судить на основании данных по однокомпонентным системам о процессе многокомпонентной сорбции можно лишь в случае, когда процесс протекает как конкуренция за ограниченное число сорбционных центров. В соответствии с таким представлением, в работе был проведен расчет биленгмюровских изотерм при «полуконкурентном» характере взаимовлияния белков в сорбционном процессе. Из данных рисунка 6 видно, что для цитохрома с (низкомолекулярный белок) наблюдается количественное (в пределах 5% погрешности) соответствие между экспериментально и теоретически полученными величинами. Такое совпадение указывает на то, что, во-первых, сорбция индивидуального цитохрома с хорошо описывается изотермой Ленгмюра и, во-вторых, сорбция цитохрома с при совместной сорбции с БСА происходит в соответствии с конкурентным механизмом.

М*10'

0,15-

0,10-

0,05-

0,00

■ БСАзксп

11 ^'^счет

• Цитохром С жсп

? 14игохроисрасчет

0,0 0,2

—I— 0,4

, моль/л . всАрасчет Рис. 6. Совместная

сорбция раствора БСА и цитохрома с на катионите КМЛГ-1-4-Э20.

В тоже время между экспериментально и теоретически полученными величинами концентрации БСА в сорбенте наблюдается лишь

__качественное соот-

о,б о,8 1,о 1,2 1,4 ветствие (расхождение

сю5 моль/л ПРИ больших значениях

концентраций более

25%), что указывает на то, что сорбция БСА в присутствии цитохрома с не соответствует конкурентному механизму сорбции. Это отклонение связано с тем, что БСА обладает значительно большей молекулярной массой и большей поверхностью контакта белка с сорбентом и подтверждает выдвинутое ранее представление о полуконкурентном механизме сорбции. При этом, результаты аналогичных исследований собрции этой же пары белков на катионите с большей плотностью ионогенных групп - КМАГ-1-3-Э20, демонстрируют полное отсутствие соответствия между расчетными и экспериментальными данными как для БСА, так и для цитохрома с. Такой результат указывает на то, что в данном случае процесс сорбции идет не по конкурентному или полуконкурентному механизму, а имеют место синергетические явления, что также подтверждается несоответствием изотерм сорбции белков изотермам Ленгмюра.

Несмотря на то, что был достигнут ожидаемый эффект увеличения избирательности сорбции белка при увеличении размеров белковых макромолекул, диффузионные затруднения при сорбции, неизбежные при использовании набухающих сорбентов, уменьшают величину этого эффекта. Поэтому было решено перейти к созданию аналогичной серии ионобменных сорбентов с варьируемым количеством ионогенных групп на основе монолитных носителей, для которых преобладающим является не медленный диффузионный, а быстрый конвекционный массоперенос.

2. Избирательность адсорбции белков на модифицированных монолитных носителях

2.1. Модификация поверхности ГМА-ЭГДМА сополимера

Для получения серии образцов сополимера с различным содержанием ионогенных групп было выбрано несколько направлений возможной модификации: сульфирование концентрированной серной кислотой, щелочной гидролиз сложноэфирных групп, обработка сульфитом натрия в водно-изопропаноловом растворе и гидролиз эпоксидных групп (кислотный) с последующим карбоксиметилированием. С помощью последнего из указанных методов, путем регулирования состава реакционной массы и времени реакции, удалось получить серию сополимеров с обменной емкостью в достаточно широком диапазоне - от 0.2 до 1.6 мг-экв/г. Схема реакции представлена на рис. 7. 1) Гидролиз эпоксидных групп.

\_0_СН2-СН-СН2 О

_4—Ч0 60 С 3 часа С-0-СН2-СН—СН2

ОН он

&

2) Карбоксиметшшрование.

С1СИ2СООН с-о—сн2-сн сн2 60 СКаОИ

I

он он

Рис. 7. Схемареакг;ии карбоксаметичированш ГМА-ЭГДМА сополимера.

По данным потенциометрического титрования образцов с крайними значениями обменной емкости, представленным в координатах Гендерсона-Гассельбаха были определены значения кажущихся констант ионизации рКа в зависимости от степени карбоксилирования монолитного носителя - с уменьшением обменной емкости константа ионизации падает с 6.90 до 6.80. 2.2. Сорбция модельных белков 2.2.1. Определение условий сорбции

На рис. 8 приведены зависимости сорбционной емкости карбоксилированного ГМА-ЭГДМА сополимера с обменной емкостью 0.3 мг-экв/г по использованным в работе белкам. Для исследования сорбции белков на монолитных носителях было выбрано то же значение рН, что и в случае набухающих гетеросетчатых катионитов.

М, мг/диск 5-,

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

М, мг/диск 2,01.5-

1,0-

0,5

0,0

Г'

/

I/

У

С, мг/мл

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

1,0

С, (я/мл

а б

Рис. 8. Изотермы сорбции фибриногена (1), БСЛ (2) и цитохрома с (3), построенные по данным динамической адсорбции белков на карбоксшированном диске с обменной емкостью 1.6 мг-окв/г (а) г/ 0.2 мг-экв/г (б).

На рисунке 8 приведены изотермы динамической адсорбции белков из индивидуальных растворов на поверхности карбоксилированных ГМА-ЭДМА дисков с высоким и сниженным содержанием ионогенных групп. Очевидно, что при уменьшении обменной емкости сорбентов уменьшается их адсорбционная емкость. При этом адсорбция на твердой поверхности имеет существенные отличия от аналогичного процесса с участием набухающих полиэлектролитных сеток. Так, для гибких цепей набухающих ионитов возможна некоторая «подстройка» под молекулу белка, тем самым, даже при снижении концентрации карбоксильных групп на адсорбционной поверхности сорбента, сохрааяется значительное количество контактов ионогенных групп с каждой молекулой белка. При этом общая сорбционная емкость падает. Тогда как для монолитных носителей картина иная, а именно, жесткая поверхность сорбента обусловливает уменьшение количества доступных (в том числе, доступных стерически) ионогенных групп на единицу ее площади по мере уменьшения степени модификации. Таким образом, в первую очередь, происходит снижение энергии взаимодействия белок-сорбент, а не количества адсорбированных молекул.

2.2.2. Последовательная сорбция

Для выявления наличия или отсутствия конкурентного замещения в фазе сорбента исследовали последовательную сорбцию двух белков. В парах на первом месте указан предварительно сорбированный белок, на втором -возможный вытеснитель. Вытеснение отмечено знаком «+», отсутствие вытеснения знаком «- » (табл. 3). Как было показано ранее, для ослабления взаимодействия белка с сорбентом необходимо уменьшение не только общей, но и локальной концетрации ионогенных групп.

Таблица 3.

Результаты последовательной сорбции белков в статических __условиях _

Образец Емкость, БСА- Цитохром-БСА

мг-экв/г цитохром

1 0.2 - +

2 0.8 - +

3 1.6 - -

Поэтому полученные данные (вытеснение цитохрома с при уменьшении степени карбокснлирования) косвенно подтверждают равномерность распределения карбоксильных групп на поверхности монолитного диска. Но, что самое важное, из них следует, что для сорбента с наименьшей степенью карбокснлирования снижение плотности ионогенных групп обусловливает ослабление связывания белка меньшего размера с поверхностью сорбента настолько, что становится возможным его вытеснение более крупным белком. Тогда как для белка большего размера, несущего на своей поверхности большее число заряженных групп, по-нрежнему сохраняется возможность более прочного связывания с карбоксильными группами сорбента. Аналогичные результаты были получены для пар цитохром с - фибриноген и БС А - фибриноген.

2.2.3. Совместная сорбция

Совместную адсорбцию модельных белков проводили в динамических условиях в интервале скоростей от 3 до 8 мл/мин (табл. 4).

Видно, что скорость пропускания раствора через диск не оказывает влияния на конечный результат сорбции, что, как и ожидалось, свидетельствует об отсутствии диффузионных затруднений при массопереносе. Кроме того, данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что при очень малых концентрациях раствора и соответственно неполном заполнении поверхности сорбента избирательность сорбции определяется коэффициентами распределения белков в «х индивидуальных растворах. При увеличении концентрации

избирательность сорбции БСА резко возрастает, срабатывает фактор вытеснения цитохрома с.

Таблица 4

Компонентный состав элюатов после сорбции из бинарного

СисхБСА ~ Сисхцит мг/мл Сбса/СцИТ

3 мл/мин 5 мл/мин 8 мл/мин

0.01 5 5 5

0.02 10 10 10

0.05 29 29 29

0.1 70 70 70

0.5 110 110 НО

1.0 110 110 110

"Использовали образец с минимальным количеством карбоксильных групп (0.2 мг-экв/г) и различные скорости пропускания растворов.

Результаты опытов по совместному процессу представлены в таблице 5. Состав сорбата оценивали по отношению концешрации белка большего размера к концентрации белка меньшего размера в растворах после десорбции. При этом, если в случае сорбции из растворов белков до полного насыщения поверхности карбоксилированного монолитного диска с обменной емкостью 1.6 мг-экв/мл соотношение адсорбированных белков близко к их соотношению в исходном растворе, то для карбоксилированного ГМА-ЭДМА диска с обменной емкостью 0.2 мг-экв/мл селективность сорбции белка большего размера возрастает в 75-110 раз.

Таблица 5

Состав элюатов, определенный после сорбции из бинарных белковых растворов

Образец Емкость, мг-экв/г СВСА/С,*, Сфибр/^ЦИТ

1 0.2 110 75

2 0.8 2 1.5

3 1.6 1 1.1

2.2.4. Избирательность адсорбции как функция размеров сорбата

Хотя результаты всех предыдущих опытов говорят о преобладающем влиянии размера (а точнее, различия в размерах) белковых молекул, был предпринят ряд попыток создания модели крупной частицы -аналога цитохрома с, по размеру близкой к размеру БСА, или его

превышающей. Для этого была выбрана реакция сшивания молекул цитохрома с между собой. В качестве сшивающего агента был использован глутаровый альдегид - соединение, широко применяемое в качестве бифункционального сшивающего агента, легко вступающего в реакции конденсации с соединениями, содержащими первичные аминогруппы. С помощью данного метода были получены агломераты цитохрома с (далее -«сшитый цитохром»), а затем, с помощью гель-хроматографии отобраны фракции с молекулярной массой сравнимой, или несколько превосходящей молекулярную массу БСА.

Для полученного «сшитого цитохрома с» в паре с исходным цитохромом с, с БСА и с инсулином были проведены эксперименты по последовательной и совместной адсорбции на карбоксилированном монолитном диске с низкой обменной емкостью (0.2 мг-экв/г). Результаты последовательной сорбции приведены на диаграммах (рис. 9, рис.10 а, б). Так, для пары цитохром с - «сшитый цитохром» имеет место значительное вытеснение цитохрома с с поверхности сорбента (рис.9). Кроме того, видно, что при увеличении размеров агломерата сшитого цитохрома и приближении его к размерам БСА исчезает эффект вытеснения его альбумином из фазы сорбента (рис. 10 а), при том, что данный эффект был значительно выражен для пары исходный цитохром с - БСА (табл. 3). С другой стороны, появляется эффект вытеснения инсулина таким «сшитым» цитохромом с (рис. 10 б), тогда как в случае последовательной сорбции пары инсулин-цитохром с, т.е. белков, близких по размерам, вытеснения одного белка другим не происходило.

9. Последовательная сорбция \ого и нашивного цитохрома с. - раствор на выходе из колонки после пропускания второго белка (первый белок — нативиый цитохром с, второй белок -шитый цитохром с); 2-раствор после десорбции.

СТАРТ

<3> «бЗ»- Сиопыи .

Цитсохром

Цктохронг [ 2

Рис.

сшит I

а б

Рис. 10. Последовательная сорбция сшитого цитохрома с и (а) БСА или (б) инсулина на поверхности карбоксилированного монолита с обменной емкостью 0.3 мг-экв/г.

Таким образом, полученные результаты можно интерпретировать как подтверждение положения о преимущественном влиянии именно размера белковых макромолекул (а точнее - поверхности белковой молекулы, несущей заряд) на избирательность их сорбции ионитами со сниженным содержанием ионогенных групп.

2.2.5. Сорбция белков из плазмы крови

Смесь двух, или даже трех белков (цитохром с, БСА и фибриноген) является модельной. Тогда как возможность практического использования ионобменных сорбентов со сниженным содержанием ионогенных групп необходимо проверять и на реальных системах. В качестве такого реального объекта была выбрана плазма крови человека.

Как известно, в составе плазмы крови присутствует множество белков с молекулярной массой в диапазоне от 50 до 725 кДа, это различные факторы свертывания крови, БСА и др. К наиболее высокомолекулярным среди них относятся фибриноген-стабилизирующий фактор (фактор XIII, 320 кДа), фибриноген (ЗЗОкДа) и Альфа2-макроглобулин (725 кДа), причем фибриноген-стабилизирующий фактор в плазме содержится в количестве на два порядка меньшем, чем два других указанных белка.

Результаты опытов по сорбции белков из плазмы крови, на карбоксилированном монолитном ГМА-ЭДМА диске с обменной емкостью

0.3 мг-экв/г были оценены методом электрофореза в ПААГ. На рисунке 11 представлены результаты анализа состава раствора, полученного после десорбции белков из фазы сорбента.

Рис. 11. Результаты адсорбции белков плазмы крови на карбокстированном ГМА-ЭДМА диске с обменной емкостью 0.3 мг-экв/г. I -раствор, полученный после десорбции с диска.

Можно видеть, что после пропускания плазмы через катионит со сниженным содержанием ионогенных групп (до 0.2мг-экв/г) в фазе сорбента отсутствуют какие-либо белки с молекулярной массой ниже, чем молекулярная масса фибриногена. Это означает, что даже в том случае, если сорбируется смесь из двух-трех самых «крупных» белков, настоящий метод позволяет легко, в одну стадию во фронтальном хроматографическом режиме избавиться от большого количества сопутствующих более низкомолекулярных белков. При этом достигается концентрирование целевого компонента и за следующий цикл сорбции-десорбции можно обеспечить высокую степень его очистки.

Заключение

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что использование сорбентов с уменьшенной плотностью ионогенных групп позволяет во фронтальном режиме резко увеличить избирательность сорбции белков большого размера. Отсутствие диффузионных затруднений обеспечивает значительно больший эффект при сорбции белковых смесей карбоксильными катионитами монолитного типа по сравнению с сорбцией тех же белков набухающими гетеросетчатыми карбоксильными катионитами. В настоящее время монолитные носители используются лишь в аналитических целях, однако, бурное развитие технологии уже привело к созданию монолитных колонок, что позволит в будущем промасштабировать процессы разделения.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы процессы сорбции модельных пар белков, отличающихся молекулярными размерами, на карбоксильных катеонитах, как набухающих, так и монолитного типа. Показано, что при большой (от 0,6 мг-экв/г и выше) концентрации ионогенных групп катионита в условиях, близких к условиям максимального связывания, отсутствует вытеснение одного белка другим.

2. Впервые показано, что ослабление связывания белка с полюлектролитной сеткой или поверхностью монолитного носителя, вызванное снижением концентрации карбоксильных групп (до 0.2-0.3 мг-экв/г), зависит от размеров белка. Больший по размеру белок вытеаиет меньший, обратного вытеснения не происходит. Этот эффект «полуконкурентной» или «частшно конкурентной» сорбции позволяет увеличить избирательность сорбции из смеси белка большего но размеру.

3. Сравнение экспериментальных данных, полученных для сорбции двухкомпонентных систем (сорбент - раствор двух белков) с расчетными значениями для биленгмюровских изотерм показывает количественное совпадение только для вытесняемого белка, что подтверждает эффект «полуконкурентной» сорбции.

4. Установлено, что увеличение избирательности значительно выше при сорбции белков на карбоксилированных монолитных носителях, чем на набухающих гетеросетчатых катионитах, что связано с отсутствием диффузионных затруднений для макромолекул, а так же с жесткой структурой поверхности монолитных сорбентов.

5. Физическими методами (электронная микроскопия, ртутная порометрия и динамическая десорбция паров) установлено, что изменение содержания карбоксильных групп незначительным образом сказывается на проницаемости сорбентов для белков и, следовательно, не оказывает влияния на характер сорбционных процессов.

6. Показана возможность проведения во фронтальном хроматографическом режиме одностадийного выделения из плазмы крови белков с молекулярной массой фибриногена и выше.

Основное содержание диссертации отражено в следующих

публикациях:

1. Очкур О.В., Демин А.А. влияние концентрации ионогенных груп сорбента на избирательность сорбции цитохрома и бычьег сывороточного альбумина. //Сорбционные и хроматографически процессы. - 2006. Т.6, Вып.2. - С. 211-217.

2. А.А. Демин, А.Т. Меленевский, О.В. Очкур, Е.И. Школьнико Е.В.Сидорова, А.А. Сидоров, И. Громадкова. Взаимосвязь сорбционны свойств и структуры полимерных сеток с различным количество, ионогенных групп. // ЖФХ. -2006. Т. 9. С. 1674-1680.

3. Demin А.А., Ochkur O.V. Cation exchangers for selective sorption of Iarg proteins. // ^Chromatography В., V.849, Iss.1-2,2007, P.231-235.

4. О.В.Очкур, А.А.Демин, Т.Б.Тенникова. Избирательность сорбции белко на карбоксильных катеонитах различного строения. // Сорбционные хроматографические процессы. Т.7. Вып.6.2007, С. 946-951.

5. А.Т.Меленевский, О.В.Очкур, А.А.Демин. Влияние плотност ионогенных групп сорбента на конкурентную сорбцию белков. //ЖФХ. 2009. Т.83. №1. С. 1-4.

6. Очкур О.В., Павлова Е.Н. Особенности сорбции белков полимерным сетками с различным содержанием ионогенных групп. Тезисы 1-й Сан Петербургской конференции молодых ученых с международны участием «Современные проблемы науки о полимерах». Сан Петербург, 1-3 февраля 2005. С.55.

7. O.V. Ochkur, E.N. Pavlova, А.А. Demin. The dependence of the selectivity protein sorption on content of ionogenic groups in polymeric networks. 5 International symposium Molecular Mobility and Order in Polymer System St. Petersburg, June 20 -24,2005. P.138.

8. Очкур O.B., Шеянова А.Ю. Влияние размеров белковых макромолекул i избирательность их сорбции. Тезисы И-й Санкт-Петербургск конференции молодых ученых с международным участие «Современные проблемы науки о полимерах». Санкт-Петербург, января - 2 февраля 2006. С.37.

9. О.В.Очкур, А.А.Демин. Влияние размеров белковых макромолекул избирательность их сорбции ионитами, в Сборник тезисов Всероссийск конференции «Физико-химические процессы в конденсированн состоянии и на межфазных границах», Воронеж, 2006 г. С.864.

10. О.В.Очкур, А.А.Демин, А.Т.Меленевский. Макропористые монолита сорбенты с варьируемым содержанием ионогенных групп в Book abstracts International Conference "Actual problems of polymer chemistry a physics", Ташкент, 2006 г. C.214.

11. О.В.Очкур, Е.Н.Павлова, А.А.Демин, А.Т.Меленевский, Е.С.Никифоро Сорбция белков полимерными сетками с равномерным распределени

ионогенных групп. // X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии, Москва, Россия, 24-28 апреля, 2006. С.322.

12. Очкур О.В. Избирательность сорбции белков на карбоксильных катионитах различных типов. Третья Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах». Санкт-Петербург, 17-19 апреля 2007. Материалы конференции, с.71.

13. Очкур О.В., Демин A.A. Избирательность сорбции белков на макропористых монолитных сорбентах. В Сборнике тезисов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва, 23-27 апреля 2007. с. 167 .

14. О.В.Очкур, А.А.Демин, Т.Б.Тенникова. Избирательность сорбции белков на карбоксильных катионитах различного строения. Сборник тезисов XI Международной конференции «Иониты-2007» Воронеж. 16-20 сентября. С.76.

15. Ochkur О.V., Nikiforova E.S., Pavlova E.N. Carboxylic cation exchangers on basis of GMA-EDMA monolithic stationary phases (Structure and adsorptional properties). // Четвертая Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах». Санкт-Петербург, 14-18 апреля 2008. Материалы конференции. С.68

16. A.A. Демин, О.В.Очкур. Избирательность сорбции белков как функция их размеров и степени карбоксилирования монолитных носителей. //Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». Москва, 14-18 апреля 2008. Материалы конференции. С.27.

17. A.A. Demin, О. Ochkur, A.T.Melenevsky, E.S.Nikiforova, E.N. Pavlova. The effect of the carboxylation on the porous structure of the monolithic sorbents. 6th International symposium Molecular Mobility and Order in Polymer Systems, St. Petersburg, June 2-6,2008. P.223.

18. Демин A.A., Очкур O.B., Меленевский A.T., Павлова E.H. Масштабирование процессов фронтальной хроматографии белков на карбоксилированных монолитных носителях. II Четвертая Всероссийская конференция "Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах". Воронеж, 6-9 октября 2008. Сборник тезисов. С.61-62.

Подписано к печати 18.12.2008г. Формат 60x84/16. Объем 1.5 усл.печ.л. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ . Отпечатано в ИВС РАН с оригинал-макета заказчика. 199004, Санкт-Петербург, Большой пр., 31

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Общие принципы сорбции белков.

1.2 Взаимодействие белков с сорбционными материалами.

1.3. Материалы, используемые для ионобменной хроматографии белков.

1.3.1. Требования к сорбентам для хроматографии белков.

1.3.2. Синтез полимерных сорбционных материалов.

1.3.3. Типы высокопроницаемых сетчатых полиэлектролитов.

1.3.4. Гетеросетчатые сорбенты.

1.3.5. Целлосорбенты.

1.3.6. Монолитные носители.

1.3.7. Концентрация ионогенных групп в сорбенте.

1.4. Синергизм и конкуренция при взаимодействии белков с полимерными сорбентами.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.2. Гетеросетчатые набухающие полиэлектролиты.

2.2.1. Синтез сополимеров МАА, ГПМА и ЭДМА.

2.3. Монолитные диски.

2.3.1. Синтез макропористого сополимера ГМА-ЭГДМА.

2.3.2. Модификация монолитных дисковых сорбентов хлоруксуснои кислотои.

2.4. Методы исследования сорбентов.

2.4.1. Определение степени набухания сорбента.

2.4.2. Определение обменной емкости сорбента.

2.4.3. Определение констант ионизации.

2.4.4. Оценка пористости использованных в работе сорбентов методом ртутной порометрии.

2.4.5. Метод динамической десорбции паров.

2.5. Методы изучения сорбции белков.

2.5.1. Определение оптимальных условий сорбции модельных белков.

2.5.2. Эксперименты в статических условиях (сорбция из ограниченного объема раствора).

2.5.3.Эксперименты в динамических условиях.

2.5.3.1.Сорбция белковых растворов на гетеросетчатых набухающих полиэлектролитах. ^

2.5.3.2.Сорбция белковых растворов на карбоксилированных монолитных дисках.

2.5.4.Определение концентрации белков.

2.5.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.5.6. Окраска белков в полиакриламидном геле.

2.6. Гель-хроматография.

2.7. Модификация поверхности полистирольных латексов цитохромом

2.8.Сшивание цитохрома с глутаровым альдегидом

2.9. Выделение белков большего размера из плазмы крови.

2.10. Расчет биленгмюровских изотерм для пары цитохром с - БСА.

ГЛАВА 3. ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ СОРБЦИИ БЕЛКОВ НА

НАБУХАЮЩИХ СОРБЕНТАХ.

3.1. Влияние содержания ионогенных групп на структуру и свойства катионитов.

3.2. Оценка взаимосвязи сорбционных свойств и структуры карбоксильных гетеростечатых катионитов с различным содержанием ионогенных групп.

3.3. Исследование процессов сорбции модельных белков на серии набухающих гетеросетчатых катионитов с различным содержанием карбоксильных групп.

3.3.1 .Определение оптимума pH для сорбции модельных белков.

3.3.2. Сорбция модельных белков из индивидуальных растворов.

3.3.3. Последовательная сорбция модельных белков.

3.3.4. Совместная сорбция модельных белков.

3.3.5. Расчет биленгмюровских изотерм при «полуконкурентном» характере взаимовлияния белков в сорбционном процессе.

ГЛАВА 4. ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ СОРБЦИИ БЕЛКОВ

НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ МОНОЛИТНЫХ

НОСИТЕЛЯХ.

4.1. Модификация поверхности ГМА-ЭГДМА сополимера.

4.2. Исследование структуры катионитов на основе ГМА-ЭГДМА сополимера методами динамической десорбции воды и ртутной порометрии.

4.3. Адсорбция модельных белков.

4.3.1. Определение условий адсорбции.

4.3.2. Адсорбция модельных белков из индивидуальных растворов.

4.3.3. Последовательная адсорбция модельных белков на 106 карбоксилированных монолитных ГМА-ЭГДМА носителях

4.3.4. Совместная адсорбция модельных белков на 111 карбоксилированных монолитных ГМА-ЭГДМА носителях

4.4. Избирательность сорбции как функция размеров сорбата.

4.4.1. Модификация поверхности полистирольных латексов.

4.4.2. Влияние сшивание цитохрома на избирательность сорбции.

4.5. Сорбция белков из плазмы крови.

Различные хроматографические методы выделения и очистки биологически активных веществ (БАВ), в частности белков, имеют свои достоинства и недостатки. Наиболее экономичными и легко масштабируемыми процессами являются фронтальные процессы ионообменной хроматографии. Но по избирательности они уступают процессам аффинной хроматографии. Выделение белка с использованием одноактного ионообменного процесса может быть проведено, если целевой компонент резко отличается по своим свойствам от остальных компонентов. В противном случае приходится либо использовать каскад колонок с различными сорбентами, либо после насыщения фазы сорбента смесью различных белков с помощью промывки сорбента различными буферными растворами стараться отделить целевой белок от сопутствующих. Процесс осложняется тем, что множественные ион-ионные взаимодействия белка с ионогенными группами сорбента, дополняемые гидрофобным взаимодействием, приводят к межбелковому связыванию в фазе сорбента, что отрицательно сказывается на разделении белков. Известно, что уменьшение концентрации ионогенных групп сорбента повышает эффективность разделения. Однако, эти исследования проводили на модельных растворах, содержащих белки с близкой молекулярной массой и, соответственно, примерно одинаковыми размерами. Очевидно, что размеры белковой макромолекулы, непосредственно влияя на ее диффузию в фазе сорбента, должны оказывать и влияние на избирательность ее ' сорбции из многокомпонентной смеси. Чем больше размеры белка, тем больше на его поверхности групп способных к связыванию с полиэлектролитной сеткой или заряженной поверхностью. Следовательно, можно ожидать, что при определенных условиях после пропуска через колонну с сорбентом раствора смеси белков сорбент окажется насыщенным самым большим по размеру белком. Таким образом, весь процесс выделения белка возможно провести всего в две стадии: сорбция до насыщения и последующая десорбция.

В связи с вышеизложенным, выбранное направление исследований, а именно, исследование взаимодействия модельных белковых смесей с полимерными сорбентами с различной концентрацией ионогенных групп с целью определения влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции в многокомпонентном процессе, является актуальной задачей физической химии, как с теоретической, так и с прикладной точки зрения. Создание сорбентов с уменьшенным содержанием ионогенных групп позволит оптимизировать процессы тонкого разделения белков в хроматографическом процессе.

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 03-03-32710 и 06-03-32363) и по планам Института высокомолекулярных соединений РАН. Кроме того, работа является победителем «Конкурса персональных грантов 2007 года для студентов и аспирантов вузов и академических институтов Санкт-Петербурга»» и программы "Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса" (УМНИК).

Цель работы: Исследование влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции гетеросетчатыми катионитами и монолитными носителями с варьируемым числом ионогенных групп для повышения эффективности разделения белков в ионообменной хроматографии.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи: получение макропористых монолитных катионитов (сополимеров глицидилметакрилата и этиленгликольметакрилата) с различной степенью карбоксилирования; исследование влияния концентрации карбоксильных групп в набухающих полиэлектролитных сетках при постоянном содержании сшивающего агента, а так же степени карбоксилирования монолитного носителя на структуру сорбентов; изучение процессов последовательной и совместной сорбции смесей модельных белков, различающихся своими размерами, на катионитах с различным содержанием карбоксильных групп; создание модели укрупненного белка путем сшивания макромолекул глутаровым альдегидом, а также их прививки на частицы полистирольного латекса с целью проверки предположения об определяющей роли размеров белка в избирательности сорбции на катионитах с малым содержанием карбоксильных групп; расчет биленгмюровских изотерм на основании данных, полученных для однокомпонентных систем, содержащих сорбент и раствор одного белка;

разделение белков плазмы крови по их молекулярным размерам на полученных ионобменных сорбентах.

Методы исследования. Для исследования структуры набухающих гетеросетчатых катионитов, макропористых монолитов и катионитов на их основе были использованы методы электронной микроскопии, динамической десорбции паров и ртутной порометрии. Для определения количества ионогенных групп и их константы диссоциации был использован метод кислотно-основного и потенциометрического титрования. Для оценки составов белковых растворов до и после контакта с сорбентом применялись методы спектрофотометрии в УФ и видимой областях, а так же гель-электрофорез. Для количественной оценки результатов гель-электрофореза был использован метод денситометрии.

Объектами исследования являлись 1) серия гетеросетчатых набухающих катионитов на основе сополимера метакрилоил-р-аланина, гидроксипропилметакриламида и этилендиметакриламида с различным содержанием ионогенных групп; макропористые монолитные носители на основе сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата, а так же серия катионитов, полученная путем их модификации.

2) модельные белки (фибриноген, бычий сывороточный альбумин, цитохром с), их смеси и плазма крови человека. Научная новизна,

1. Методами электронной микроскопии, динамической десорбции паров и ртутной порометрии показано, что изменение соотношения между ионогенными и неионогенными звеньями сорбентов при сохранении постоянного содержания сшивающего агента для полиэлектролитных сеток, а так же степень карбоксилирования для монолитных носителей не оказывают существенного влияния на строение сорбционных материалов.

2. Изучена кинетика реакции модификации монолитных носителей карбоксильными группами и получена серия сорбентов с различной концентрацией ионогенных групп. Показано, что отсутствие диффузионных затруднений в проточных порах монолитных носителей позволяет добиться равномерного распределения карбоксильных групп на поверхности пор.

3. Показано, что при высокой концентрации ионогенных групп (0,6 мг-экв/г и выше) процессы последовательной и совместной сорбции модельных белков различного размера на карбоксильных катионитах различных типов (гетеросетчатых и монолитных) в статических и динамических условиях сопровождаются синергетическими явлениями.

4. Установлено, что уменьшение содержания ионогенных групп в фазе сорбента в 4-5 раз по сравнению с максимально достижимой (до значения 0.2-0.3 мг-экв/г) приводит к «полуконкурентной» сорбции: больший по размеру белок вытесняет меньший, тогда как обратного явления не происходит. При этом наблюдается резкое (на два порядка) увеличение избирательности сорбции большего белка.

Практическая значимость работы.

На примере полученных серий набухающих и макропористых монолитных сорбентов с различным содержанием карбоксильных групп продемонстрировано, что уменьшение полной обменной емкости сорбентов увеличивает избирательность сорбции белков большого размера из смеси. Результаты, полученные при разделении модельных смесей белков, могут быть использованы при разработке процессов разделения биологических жидкостей, например, плазмы крови.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. При последовательной и совместной сорбции белков различных размеров на карбоксильных катионитах, как набухающих, так и монолитного типа, при большой (до 0,6 мг-эюУг) концентрации ионогенных групп в условиях, близких к условиям максимального связывания, наблюдаются синергетические явления.

2. Уменьшение концентрации карбоксильных групп приводит к ослаблению связывания белка с полиэлектролитной сеткой или поверхностью монолитного носителя, и это ослабление связывания зависит от размеров белковых макромолекул. Это обстоятельство позволяет резко (на два порядка) увеличить избирательность сорбции из смеси белка большего по размеру.

3. Расчет биленгмюровских изотерм на основании данных, полученных для однокомпонентных систем (сорбент - раствор белка) дает количественное совпадение с экспериментом лишь для вытесняемого белка.

4. Жесткая структура монолитных носителей позволяет добиться большего выигрыша в избирательности сорбции по сравнению с набухающими гетеросетчатыми катионитами.

5. Структурные изменения полиэлектролитных сеток при изменении соотношения между ионогенными и неионогенными звеньями при постоянном содержании сшивающего агента, а также монолитных носителей при изменении степени карбоксилирования незначительны и не влияют на характер сорбционных процессов.

6. Методы, разработанные для модельных смесей белков, дают возможность разделить во фронтальном хроматографическом режиме белки плазмы крови.

Личный вклад автора состоял в непосредственном проведении экспериментов и расчетов, анализе и обобщении результатов, в разработке модельных представлений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на четырех Санкт-Петербургский конференциях молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (февраль 2005, февраль 2006, апрель 2007 и апрель 2008), на 5-м и 6-м Международном симпозиуме "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, июнь 2005 и июнь 2008), на X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва, апрель 2006), на Третьей и Четвертой Всероссийских конференциях «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» (Воронеж, октябрь 2006 и октябрь 2008), на Международной конференции "Actual problems of polymer chemistry and physics" (Ташкент, 2006), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». (Москва, апрель 2007), на научном семинаре Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева по хроматографии (май 2007), на XI Международной конференции «Физико-химические основы ионобменных процессов - ИОНИТЫ-2007» (сентябрь 2007) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, апрель 2008).

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, четырех глав основного текста, библиографии (103 источника), заключения и выводов. Работа изложена на 137 страницах текста и содержит 41 рисунок и 16 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в процессах сорбции модельных пар белков, отличающихся молекулярными размерами, на карбоксильных катионитах, как набухающих, так и монолитного типа, при большой (от 0,6 мг-экв/г и выше) концентрации ионогенных групп в условиях, близких к условиям максимального связывания, отсутствует вытеснение одного белка другим.

2. Впервые показано, что ослабление связывания белка с полиэлектролитной сеткой или поверхностью монолитного носителя, вызванное снижением концентрации карбоксильных групп (до 0.2-0.3 мг-экв/г), зависит от размеров белка. Больший по размеру белок вытесняет меньший, обратного вытеснения не происходит. Этот эффект «полуконкурентной» или «частично конкурентной» сорбции позволяет увеличить избирательность сорбции из смеси белка большего по размеру.

3. Сравнение экспериментальных данных, полученных для сорбции двухкомпонентных систем (сорбент — раствор двух белков) с расчетными значениями для биленгмюровских изотерм показывает количественное совпадение только для вытесняемого белка, что подтверждает эффект «полуконкурентной» сорбции.

4. Установлено, что увеличение избирательности значительно выше при сорбции белков на карбоксилированных монолитных носителях, чем на набухающих гетеросетчатых катионитах, что связано с отсутствием диффузионных затруднений для макромолекул, а так же с жесткой структурой поверхности монолитных сорбентов.

5. Физическими методами (электронная микроскопия, ртутная порометрия и динамическая десорбция паров) установлено, что изменение содержания карбоксильных групп незначительным образом сказывается на проницаемости сорбентов для белков и, следовательно, не оказывает влияния на характер сорбционных процессов.

6. Показана возможность проведения во фронтальном хроматографическом режиме одностадийного выделения из плазмы крови белков с молекулярной массой фибриногена и выше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что использование сорбентов с уменьшенной плотностью ионогенных групп позволяет во фронтальном режиме резко увеличить избирательность сорбции белков большого размера. Отсутствие диффузионных затруднений обеспечивает значительно больший эффект при сорбции белковых смесей карбоксильными катионитами монолитного типа по сравнению с сорбцией тех же белков набухающими гетеросетчатыми карбоксильными катионитами. В настоящее время монолитные носители используются лишь в аналитических целях, однако, бурное развитие технологии уже привело к созданию монолитных колонок, что позволит в будущем промасштабировать процессы разделения.

1. Квеситадзе Г.И., Безбородов A.M. Введение в биотехнологию. М.: Наука, 2002. 286 с.

2. Methods of Protein Analysis, Ed. by Kerese I., Akademiai Kiado, Budapest, 1984. P. 371.

3. Tennikova Т. В., Svec F. Theoretical aspects of separation using short monolithic beds. In Monolithic Materials: Preparation, Properties, and Applications, Svec F., Tennikova Т. В., Deyl. Z. (Eds.) Elsevier, Amsterdam, 2003, P. 351-372.

4. Norde W., Haynes Ch. Structures and stabilities of adsorbed proteins // J. Colloid Interface Sci. 1995. V. 87. P. 313-328.

5. Andrade J., Hlady V. et al. A domain approach to the adsorption of complex proteins: preliminary analysis and application to albumin // Croat.Chem. ACTA. 1990. V.63. P.527-538.

6. Peng Gong, Szeleifer I. Competitive adsorption of model charged proteins: the effect of total charge and charge distribution //J. Colloid Interface Sci. 2004. V.278. Iss.l. P.81-90.

7. Shen H. and Frey Douglas D. Effect of charge regulation on steric mass-action equilibrium for the ion-exchange adsorption of proteins // J. Chromatography A. 2005. V. 1079. Iss. 1-2. P. 92-104.

8. Giacomelli C., Avena M. and De Pauli C. Adsoiption of Bovine Serum Albumin onto Ti02 Particles // J. Colloid Interface Sci. 1997. V.188. P. 378-395.

9. Klose Т., Welzel P., Werner C. Protein adsorption from flowing solutions on pure and maleic acid copolymer modified glass particles // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2001. V. 51. P. 1-9.

10. Wen Y., Dubin P.L. Potentiometric studies of the interaction of bovine serum, albumin and poly (dimethyldiallylammonium chloride // Macromolecules. 1997. V.30. P.7856-7861.

11. Finette G., Baharin B., Mao O. et al. Adsorption behavior of multicomponent mixtures containing al-proteinase inhibitor with the anion exchanger, 2-(diethylaminno)ethyl-spherodex // Biotechnol. Prog. 1997. V.13. P.265-275.

12. Wang R., Zhang Y., Ma G., Su Zh. Modification of poly(glycidyI methacrilate-divinylbenzene) porous microsphers with polyethylene glycol and their adsorption property of protein // Colloids and Surfaces B. 2006. V.51. P.93-99.

13. Hunter A., Carta G. Protein adsorption on novel acrylamido-based polymeric ion-exchangers: Morphology and equilibrium adsorption // J. Chromatography A. 2000. V.897. Iss 1-2. P.65-80.

14. Hunter A., Carta G. Protein adsorption on novel acrylamido-based polymeric ion exchangers II. Adsorption rates and column behavior // J. Chromatography A. 2000. V.897. Iss. 1-2. P. 81-97.

15. Russell, S., Belcher, E.B., Carta, G. Protein Diffusion in Supported Cationic Poly(acrylamide)-Based Hydrogels // AIChE J., 2003. V. 49. P.1168.

16. Russell, S.M., Carta, G. Multicomponent Protein Adsorption in Supported Cationic Poly aery lamide Hydrogels // AIChE J. 2005. V. 51. P. 8.

17. Hunter A., Carta G. Protein adsorption on novel acrylamido-based polymeric ion exchangers. Effects of protein size on adsorption capacity and rate // J. Chromatography A. V.971. Iss.1-2. 2002. P.105-116.

18. Staby A., Jacobsen J., Hansen R., Bruus U., Holm I. Comparison of chromatographic ion-exchanger resins. Strong and weak cation-exchange resins // J. Chromatography A. 2006. V.l 118. Iss.2. P. 168-179.

19. Staby A., Sand M.-B., Hansen R., Jacobsen J., Andersen L., Gerstenberg M., Bruus U. Comparison of chromatographic ion-exchange resins. Strong cation-exchange resins // J. Chromatography A. 2004. V.1034. Iss.1-2. P.85-97.

20. Adachi T., Isobe E. Fundamental characteristics of synthetic adsorbents intended for industrial chromatographic separations // J. Chromatography A. 2004. V.1036. Iss.l. P.33-44.

21. Adachi T., Ando Sh. And Watanabe J. Characterization of synthetic adsorbents with fine particle sizes for preparative-scale chromatographic separation // J. Chromatography A. 2002. V. 944. Iss. 1-2. P.41-59.

22. Adachi T., Isobe E. Use of synthetic adsorbents in preparative normalphase liquid chromatography // J. Chromatography A. 2003. V.989. Iss. 1. P. 19-29.

23. Guerrier L., Lomas L., Boschetti E. A new general approach to purify proteins from complex mixtures // J. Chromatography A. 2007. V.1156. Iss.1-2. P.188-195.

24. Lohramann M., Sculte M., Strube J. Generic method for systematic phase selection and method development of biochromatographic process //J. Chromatography A. 2005. V.1092. Iss.l. P.89-100.

25. Dismer F. and Hubbuch J. A novel approach to characterize the binding orientation of lysozyme on ion-exchannge resins // J. Chromatography A. 2007. V.l 149. Iss.2. P.312-320.

26. Jungbauer A. Chromatographic media for bioseparation // J. Chromatography A. 2005. V. 1065 Iss.l. P.3-12.

27. Tyn M.T. and Gusek T.W. Prediction of diffusion coefficients of proteins //Biotechnol. Bioeng. 1990. V.35. P.327.

28. Hemstrom P. Hydrophilic separation materials for liquid chromatography. Umea University, Umea. 2007, P. 1-26.

29. Самсонов Г.В., Тростянская Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен: сорбция органических веществ. Л.: Химия, 1969. 335 с.

30. Samsonov G. V., Kuznetsova N.P. Crosslinked polyelectrolytes in biology //Adv. Polymer Sci. 1992. V.104. P.l -50.

31. Селеменев В.Ф., Котова Д.Л., Орос Г.Ю., Загородний А.А. Хроматография низкого давления физиологически активных веществ. С.546 569 в книге «100 лет хроматографии», М.: Наука, 2003. 740 с.

32. Коршунов М.А., Михлин B.C., Марусина С.В.,.Потопчина О.Б. Синтез и применение глицидилметакрилата (тематический обзор) М.: ЦНИИ нефтепереработки и нефтехим. пром-ти, 1979. 59с.

33. Jelinkova М., Shataeva L.K., Tischenko G.A., Svec F. Reactive polymers. 58. Polyampholytes based on macroporous copolymers of glycidil methacrylate with ethylene glycol dimethacrylate or divinylbenzene // Reactive polymers. 1989. V.ll. N 1. P.253-260.

34. Ласкорин Б.Я., Логвиненко Из.А., Зорина А.И., Сахарова Л.И., Хорош М.И. Синтез и сорбционные свойства пористого карбоксильного катионита КМ-2п на основе акрилонитрила и дивинилбензола. Из сборника Н.С. Иониты и Ионный обмен. М.: Химия, 1975. 232 с.

35. Ионообменные материалы для процессов гидрометаллургии, очистки сточных вод и водоподготовки. Справочник под ред. Ласкорина Б.Н. М.: Госкомитет по использованию атомной энергии СССР. ВНИИХТ, 1985. 207с.

36. Шатаева J1.K., Чернова И.А., Сельцер А.В., Шашков Б.В. Самсонов Г.В. Структура и сорбционные свойства регенерированного гемосорбента СКН // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. Т.20. №3. С.393-399.

37. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука, 1986. 227с.

38. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Елькин Е.Э., Карбоксильные катеониты в биологии. Л.: Наука, 1979. 286 с.

39. Spevacek J., Dusek К. Manifestation of microgel-like particles of styrene-ethylene dimethacrylate copolymers in solution in .H and 13C NMR spectra //J. Polymer Sci. 1989. V.18. N 10. P.2027-2035.

40. Ezhova N.M., Chernova I.A., Sukhanova Т.Е. Morphology variability of methacrylic acid polymer networks // 5-th Int.Symp. Molecular Mobility and order in Polymer Systems. St.Petersburg, June 20-24. 2005. P. 94.

41. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии, под ред. А.Хеншен, К.-П.Хупе, Ф.Лотшпайх, В.Вёльтер, М.: Мир, 1988. 687 с.

42. Pelzbauer Z., Forst V. The Electron-Microscopic evalution of the porosity of ion exchangers // Collect.Czechosl.Chem. Commun. 1966. V.31. P.2338-2343.

43. Лесене Й.В., Марушка A.B., Моцкайтите Б.Н. Получение целлюлозных гранул из растворов ацетилцеллюлозы // Химия древесины. 1987. №4. С.36-40.

44. Папукова К.П., Никифорова Е.С., Ежова Н.М., Самсонов Г.В. Способ получения композиционных анионитов. Патент РФ №1819272. 1993.

45. Демин А.А., Могилевская А.Д., Самсонов Г.В. особенности многокомпонентной сорбции белков катионсодержащими композитами // Журн. Физической Химии. 1996. Т.70. №11. С.2059-2062.

46. Jongbauer A. and Hahn R. In Monolithic Materials: Preparation, Properties and Applications, Svec F., Tennikova T. and Deyl Z. (Eds) Elsevier, New York, 2002. P.561.

47. T.B. Tennikova, D.Freitag, in H.Y.Aboul-Ehnen (Ed.), Analytical and Preparative Separation methods of Biomolecules, Dekker, New York, 1999. P.255.

48. Strancar A., Barut M., Podgornic A., Koselj P. Convective Interaction Media: polymer supports for fast separation of biomolecules // LC-GC Int. 1998. V.10. P. 660.

49. Tennikova T.B., Freitag R. An introduction to monolithic disks as stationary phases for high performance biochromatography (review) //

50. J. High Resol. Chromatography. 2000. V.23. P.27.

51. Tennikova Т. В., Svec F., Theoretical aspects of separation using short monolithic beds. In Monolithic Materials: Preparation, Properties, and Applications, Svec F., Tennikova Т. В., Deyl. Z. (Eds.) Elsevier, Amsterdam, 2003. P. 351-372.

52. Tennikova T.B., Freitag R. An introduction to monolithic discs as stationary phases for high performance liquid chromatography // J. High Resol. Chromatography. 2000. V.23. P.27.

53. Machman M., Azad A.R., Bailon P. // J. Chromatography A. 1992. V.597. P.155.

54. Tennikova T.B., Bleha M., Svec F., Almazova T.V., Belenkii B.G., Highperformance membrane chromatography of proteins, a novel method of protein separation//J. Chromatography A. 1991. V. 555. P.97-107.

55. Strancar A., Podgornik A., Barut M. Short Monolithic Columns as Stationary Phases for Biochromatography // Modern Advances in Chromatography, Springer Berlin/Heidelberg, ISSN 0724-6145, 2002 V. 76.

56. Pessela B.C.C., Munilla R., Betancor L., Fuentes M., Carrascosa A.V. Ionic exchange using lowly activated supports: an easy way for purifying large proteins // J. Chromatography A. 2004. V. 1034. P. 155.

57. Shen H. and Frey D.D. Effect of charge regulation on steric mass-action equilibrium for the ion-exchange adsorption of proteins // J. Chromatography A. 2005. V. 1079. P.92.

58. Hellferich F., Klein G. Multicomponent chromatography, Dekker, New York, 1970. P.328.

59. Демин А.А., Дынкина И.М. Явления синергизма в процессах сорбции инсулина и рибонуклеазы катионитами // Журн. Физической Химии. 1995. Т.69. №4. С.718-721.

60. Демин А.А., Могилевская А.Д., Самсонов Г.В. Влияние конформации белковых макромолекул на процессы многокомпонентной сорбции // Журн. Прикладной Химии. 1995. Т.68. №9. С.1453-1455.

61. Демин А.А., Могилевская А.Д., Самсонов Г.В. Изменения избирательности в процессе многокомпонентной сорбции белков // Журн. Прикладной Химии. 1996. Т.69. № 1. С.31-34.

62. Xu W. and Regnie F.E. Protein-protein interactions on weak-cation-exchange sorbent surfaces during chromatographic separations // J. Chromatography A. 1998. V.828. Iss.1-2. P.357-364.

63. Demin A.A., Mogilevskaya A.D., Samsonov G.V. Synergistic effects in the processes of protein multicomponent sorption // J. Chromatography A. 1997. V.760. P.105-115.

64. Демин A.A., Могилевская А.Д., Самсонов Г.В. Особенности многокомпонентной сорбции белков катионитосодержащими композитами. // Журн. Физической Химии. 1996. Т. 70. № 11. С. 2059.

65. Демин А.А., Папукова К.П., Никифорова Е.С, Павлова Е.Н. Влияние синергетических эффектов на процессы разделения белков ионобменной хроматографии // Журн. Прикладной Химии. 2001. Т.74. № 4. С.625-629.

66. Papukova К.Р., Nikiforova E.S., Demin А.А., Melenevsky A.T. and Chizhova E.B. Hydrophilic heteroreticular polyelectroplytes with varying content of carboxyl groups // J. Polymer Sci. 2004. V.46. N 9. P. 906-910.

67. Freitag R., Allington R.W. Modern advances in chromatography // Science. 2002. V. 176. P.64-75.

68. Плаченов Т.Г. Ртутная порометрия и ее применение для описания пористых структур адсорбентов. Из кн. Адсорбция и пористость. М.: Наука, 1976. С. 191-198.

69. Плаченов Т. Г., Колосенцев С. Д. Порометрия. JL: Химия, 1988. 176с.

70. Школьников Е.И., Елкина И.Б., Волков В.В. Пат. РФ №2141642, 1998.

71. Школьников Е.И., Волков В.В. Докл. АН. 378.№4.507. 2001.

72. Цодиков М.В., Тепляков В.В., Магсумов М.И. и др. Исследование пористости неорганических мембран методом динамической десорбции паров //Кинетика и катализ. 2005. Т. 46. № 6. С. 909-914.

73. Школьников Е.И., Родионова И.А., Солдатов А.П. и др. Взаимосвязь транспортной пористой структуры с гидродинамическойпроницаемостью неорганических мембран // Журн. Физической Химии. 2004. Т.78. №5. С. 943.

74. Грег С, Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. М.: Мир, 1984. 407 с.

75. Cano Т., Offringa N., Willson R.C. Competitive ion-exchange adsorption of proteins: Competitive isotherms with controlled competitor concentration // J.Chromatography A. 2005. V. 1079. P.l 16.

76. Меленевский A.T., Чижова Е.Б., Папукова К.П. Сорбция белков лизоцима и цитохрома с на карбоксильном катионите КМДМ-6-5 // Журн. Физической Химии. 1999. Т.73. №11. С.2068-2071.

77. Laemmli, UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P. 680-685.

78. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеоновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 с.

79. Molday R.S., Dreyer W. Immunomicrospheres: reagents for cell labeling and separation// J. Cell. Biology. 1975. V.64. P.75.

80. Shuaar R.I. //Anal. Biochem. 1984. V. 143. P.l.

81. Прокопова H., Грицкова И., Черкасов В., Чалых А. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований // Успехи химии. 1996. № 2. С.178-191.

82. Staros J.V., Wright R.W., Swingle D.M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions // Anal. Biochem. 1986. V. 156. Iss. 1. P.220-222.

83. Demin A.A. and Melenevsky A.T. Bi-Langmuir Isotherms' applicability for description of interaction of ion-exchanger sorbents with protein mixtures // J. Chromatographic Sci. 2006. V.44. P. 181-186.

84. Папукова К. П., Никифорова Е. С., Демин А. А, Меленевский А. Т., Чижова Е. Б. Гидрофильные гетеросетчатые полиэлектролиты сварьируемым содержанием карбоксильных групп // Высокомолек. соед. А. 2004. Т.46. №9. С.1488.

85. Melenevsky А.Т., Chizhova Е.В. and Papukova К.Р. The sorpion of proteins lysozime and cytochrom с on cation-exchanger CMDM—6-5 // Журн. Физической Химии. 1999. V.73. P. 1693-1696.

86. Azanova V.V., Hradil J., Svec F., Pelzbauer Z. Glycidil methacrilate-styrene-ethylene dimethacrylate terpolymers modified with strong-acid groups // Reactive Polymers. 1990. V. 12. P.247-260.

87. Kim M., Kiyohara S., Konishi, S. et al. Ring-opening reactions of poly-GMA chain grafted onto a porous membrane // J. of Membrane Sci. 1996. V.l 17. P.33-38.

88. Hradil J., and Svec F. Synthesis of Polymeric Sorbents with Carboxylic Groups by Chemical Reactions of the Copolymer Dihydroxypropyl Methacrylate-Ethylene Dimethacrylate // Reactive Polymers. 1985. 48. V. 3. P. 91-99.

89. Ostryanina N.D., Tennikova T.B. Effect of experimental conditions on strong biocomplementary pairing in high performance monolithic disk affinity chromatography // J.Chromatography B. 2002. V.770. P.35.

90. Кузнецова Н.П., Мишаева P.H., Гудкин Л.Р. Исследование олигомеризации глутарового альдегида при его конденсации с глицином // Журн. Прикладной Химии. 1999. Т. 72. Вып. 7. С.1171 -1177.

91. Мишаева Р.Н., Гудкин Л.Р., Кузнецова Н.П. Модификация каталазы глутаровым альдегидом // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. С.404-408.

92. Кузнецова Н.П., Мишаева Р.Н., Гудкин Л.Р. Олигомеризация бифункционального альдегида при взаимодействии с диполярными ионами // Журн. Прикладной Химии. 2002. Т.75. С.991-997.

93. Кузнецова Н.П., Гудкин Л.Р., Кольцова С.В., Мишаева Р.Н. // Высокомолек. соед. А. 1996. Т.38. №10. С. 1668-1673.

94. Tomono Т., Ikeda Н., Tokunaga Е. High-performance ion-exchange chromatography of plasma proteins // J.Chromatography A. 1983. V.26. P. 39-47.

95. Goheen S.C., Hilsenbeck J.L. High performance ion-exchannge chromatography and adsorption of plasma proteins // J. Chromatography A. 1998. V.824. P.135-141.

96. Andrade J.D. and Hlady V. Plasma protein adsorption: The big twelve // Annals New York Acad. Sci. 1987. V.516. P.159-171.

97. Yang G., Liu H., Zhang Y. et al. On-line simoultaneous removal of human serum albumin and enrichment of doxazosine using weak cation-exchange monolithic columns //J. Chromatography A. 2006. V.l 129. P.231-235.

98. Hagen D.F., Markell C.G. Membrane approach to solid-phase extractions //Anal. Chim. Acta 1990. V.236. P.157.

99. Theodoris Т., Papadoyanis I., Tsoukali-Papadopouloy H. // J.Liq. Chromatography. 1995. V.18. P.1993.