Молекулярная таксономия биоинформатика и эксперимент тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.00 ВАК РФ

Молекулярная таксономия удобна тем, что позволяет исследовать природу мелких организмов без культивации и визуального определения. Основой для развития молекулярной таксономии служит тот факт, что каждый организм содержит рибосомы. С одной стороны,ктурная РНК рибосом в достаточной степени отличается у разных видов, а с другой стороны, содержит участки, общие для всего таксона. Определение видов или групп видов бактерий с помощью специфичных олигонуклеотидов становится все более популярным. Тем не менее, этот метод также выглядит многообещающим и для других мелких организмов, классифицировать которых довольно затруднительно. Биочипы ДНК используются сегодня для анализа экспрессии генов [1, 2], секвенирования ДНК [3], скрининга [4], диагностики заболеваний [5, 6] и генотипирования [7], как правило, в клинической практике. Применение технологии биочипов для определения наличия и анализа 16S рРНК в сложных сообществах микроорганизмов может позволить определить состав сообщества, выявить патогенные микроорганизмы, а также наблюдать за происходящими процессами. Такие возможности весьма востребованы в естественных науках, а также в их прикладных аспектах [8-10]. На сегодняшний день на рынке присутствуют несколько типов биочипов, в том числе и олигонуклеотидные. Как теоретическая, так и практическая части данной работы полностью посвящены олигонуклеотидным биочипам. Две основные проблемы, обсуждаемые в этой работе: (i) поиск оптимального олигонуклеотида с желаемой специфичностью и (ii) оценка возможности практического применения найденных цепочек.

В данной работе представлен алгоритм, который направлен на выделение оптимальных олигонуклеотидов из любого набора последовательностей. Описанной программе необходимо лишь приблизительное выравнивание последовательностей. Также программа оптимизирована для работы с большими базами данных. При выборе олигонуклеотидов алгоритм учитывает расположение мисматчей в цепочках, а также осуществляет проверку на выпетливание единичного нуклеотида. Программа реализована как для ОС Linux (текстовая версия), так и для Windows (версии с текстовым и графическим интерфейсом). Правильность результатов работы программы была проверена экспериментально.

Кроме этого, в данной работе рассматривается новый подход, не связанный с применением биочипов. Он основывается на секвенировании смеси различных генов. Этот подход использует новый метод пиросеквенирования и количественно определяет состав смеси. В данной работе содержится лишь принципиальное обоснование применимости нового метода. Метод был проверен экспериментально на искусственной смеси ДНК, кодирующих рРНК.

Работа состоит из пяти глав. Первая глава посвящена биоинформатике выбора олигонуклеотида. Вторая глава описывает новый принцип использования графического интерфейса программ в применении к выбору цепочек. Третья глава в основном содержит информацию о технической стороне создания биочипов. В четвертой главе приведены результаты экспериментальной проверки олигонуклеотидов, отобранных программой. Наконец, пятая глава посвящена разработке метода, не использующего биочипы.

Выводы

При известных нуклеотидных последовательностях, секвенирование сложной, смеси видов ДНК теоретически дает возможность определить количество каждого компонента. Это было доказано практически в эксперименте по определению состава нескольких различных смесей. Данный подход применим для численного определения состава смесей мелких организмов, полученных из природных образцов.

Материалы и методы

• Как описано в разделе «Материалы и методы» главы 4, были подготовлены плазмиды вектора р2ЕгО-2, несущие последовательности рРНК.

Амплификация выполнялась в 37 циклов в объеме 30 мкл. Концентрация образца составила 0,67 нг/мкл. В качестве прямого праймера была использована последовательность 5'-0АС-СС0-ТСТ-Т0А-ААС-АС0-0-3\ В качестве обратного праймера использовался 5'-биотинилированный праймер 5'-АТС-ОАТ-ТГС-САСОТС-АОА-А-З'.

Пиросеквенирование производилось на оборудовании РБС^ 96 (Ругозециепстд АВ, Швеция) с праймером 5'-ОАА-АСА-СОО-АСС-ААО-ОАО-Т-3\ Перед секвенированием результаты ПЦР были очищены в соответствии с процедурой, описанной в руководстве по пользованию аппаратом для пиросеквенирования.

Решение системы линейных уравнений было выполнено с помощью программного пакета МаЙаЬ.