Связывающие центры глициновых и ацетилхолиновых рецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Учреждение Российской Академии Наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи 4848826

Кузьмин Дмитрий Андреевич

Связывающие центры глициновых и ацетилхолиновых рецепторов

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание степени кандидата химических наук

Москва-2011

2 ИЮН 2011

4848826

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ нейросигнализации Института биоорганической химии РАН им. ак. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Научный руководитель: Д.Х.Н., профессор, член-корр. РАН В.И. Цетлин

Официальные оппоненты: дх.н., профессор, член-корр. РАН А.Г. Габибов

к.х.н. А.К. Шайтан

Ведущая организапяя; Учреждение Российской академии медицинских наук

Научный центр неврологии РАМН

Защита диссертации состоится 15 июня 2011 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Инсппуг биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «_»_2011г.

Ученый секретарь Специализированного совета Доктор физико-математических наук

Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Лиганд-активируемые ионные каналы (ЛАИК) - группа белков, ответственных за обеспечение передачи сигнала в химических синапсах высших животных. Белки группы характеризуются полимерной структурой и радиальной симметрией вокруг проводящем поры. Одно из наиболее изученных семейств ЛАИК - пентамерные лиганд-ахтивируемые ионные каналы, или Cys-петельные рецепторы (Cys-loop receptors, CLR). К ним относятся рецепторы ацетилхолина (ацетилхолиновый рецептор никотинового типа, нАХР), глицина (ингибирующий глициновый рецептор, ГР), серотонина (5-гидрокситрнптамшювый рецептор, 5НТЗР), у-аминомасляной кислоты (ГАМКР) и др. Все белки семейства характеризуются общей структурной организацией, включающей внеклеточный лнганд-связывающий, проводящий трансмембранный и регуляторный внутриклеточный домены. Связывание лиганда происходит на поверхности контакта между двумя субьедшшцами во внеклеточном домене, причем основную роль в этом процессе играет петля С, меньшую -петли Е и F (см. Рис. 1). Поверхность связывающего центра, предоставляющую петлю С, называют (+) поверхностью; комплиментарную к ней - (-) повехрностыо. При связывании лиганда происходит изменение положения петли С. Предполагалось, что при взаимодействии с агонистами петля плотно связывается с рецептором и приближается к нему, при связывании антагонистов - отдаляется от рецептора. В данной работе были обнаружены исключения из этой закономерности (см. Результаты и обсуждение).

Важной и широко используемой модельной системой является т.н. ацетилхолин-связывающий белок (АХСБ), выполняющий регуляторную функцию в холинергических синапсах брюхоногих моллюсков. Он представляет собой водорастворимый структурный гомолог внеклеточного домена нАХР и широко применяется для изучения взаимодействия Cys-петельных рецепторов с лигандами.

Ранее работа отдела молекулярной нейросигнализации ИБХ РАН строилась вокруг исследований ацетилхолинового рецептора никотинового типа (нАХР), и прежде всего -свойств его лиганд-связывающего домена. В рамках международного сотрудничества с различными институтами и университетами (Институт мозга общества Макса Планка, г. Франкфурт-на-Майне, Германия; Технический университет, г. Дармштадт, Германия; Католический университет, г. Лёвен, Бельгия; Национальный институт рака, г. Амстердам, Нидерланды) начата работа по исследованию лиганд-связывающих доменов других (глицинового, уаминомаслянного, 5-гидрокситриптаминового) рецепторов, а также их трансмембранного и внутриклеточного доменов.

Разные подтипы ацетилхолиновых и глициновых рецепторы вовлечены во многие процессы нервной деятельности организма, в том числе в координацию движений, ориентацию в пространстве, соматическую регуляцию, проведение боли, зрение и многие другие. В связи с этим они являются чрезвычайно значимой фармакологической мишенью, и получение новых, высокоафинных и селективных веществ, действующих на эти рецепторы, клинически оправдано.

Рис. 1. Представители надсемейства пентамерных лиганд-активируемых ионных каналов -(а) адетилхолиновый рецептор никотинового типа, реконструкция по электронной микрофотографии с разрешением 4.1А (РОВ Ю 2В09), (б) ингибирующий глициновый рецептор, компьютерная модель; (в) прокариотический канал ЕглМа сИгузапЖет/, рентгеновская структура с разрешением 1.8А (РОВ ГО 2УЬ0), ацетшшшин-связывающий белок Ар1уя1а саЩогтса. рентгеновская структура с разрешением 1.8А (РОВ ГО 2ВУЮ.

Однако, в связи с отсутствием точных кристаллических структур данных белков, для рационального дизайна новых соединений необходимо привлекать косвенную структурно-функциональную информацию.

В данной работе рассматриваются, во-первых, алкалоиды стрихнин и с1-т\бокурарнн, характерные высокоаффинным связыванием, но низкой специфичностью к подтипам (с1-тубокурарин) и даже типах« (стрихнин) рецепторов, и механизм их взаимодействия с АХСБ и рецепторами; во-вторых, пример рационального дизайна связывающих цешров для новых лигандов на основании структурно-функциональных данных; и, в-третьих, высокоспецифичное внутрибелковое взаимодействие, обеспечивающее сборку трансмембранного домена СуБ-петельных ионных каналов. Информация, полученная гю этим направлениям, позволит улучшить возможности рационачьного дизайна соединений, направленных на ацетилхолиновые и глициновые рецепторы, а также связывающих центров этих рецепторов для получения новых экспериментальных инструментов и биосенсоров.

Список использованных сокращений

ЛАИК - лиганд-активируемые ионные каналы; - Суз-петельные рецепторы; нАХР -ацетилхолиновый рецептор никотинового типа; ГР - ингибир^тощий глициновый рецептор; АХСБ - ацетилхолин-связывающий белок, с1-ТК - с1-тубокурарин, ДДС - додецилсульфаг натрия.

Цель исследования

Целью данной работы было, во-первых, рассмотрение свойств связывающих центров глицинового и ацетилхолинового рецепторов, находящихся во внеклеточном и трансмембранном доменах, и определение остатков, ответственных за их функционирование там, где они неизвестны; во-вторых, применение полученных структурно-функциональных данных для рационального дизайна связывающих центров для двухвалентных катионов па основе глицинового рецептора; в-третьих, изучение остатков, обеспечивающих сборку трансмембранных связывающих центров и олигомеризацию Суэ-петельных рецепторов.

Задачи

1. Проанализировать вычислительными методами структуры комплексоз АХСБ с алкалоидами стрихнином и й-тубокурарином. Выявить закономерности в их динамическом поведении, определить аминокислотные остатки, ответственные за афинность связывания с АХСБ. Сравнить кристаллические структуры с моделями связывания лигандов с соответствующими рецепторами (стрихнина - с ГР, (1-тубокурарина - с нАХР). Объяснить низкую селективность данных алкалоидов между подтипами рецепторов.

2. Рассмотреть правомочность использования АХСБ как модели не только для различных подтипов нАХР, но и для других типов пентамерных лиганд-активируемых ионных каналов (ГР, ГАМКР и др).

3. На основе полученных данных о функциональной роли остатков внеклеточных связывающих центров создать вариант глицинового рецептора, способный реагировать на наномолярные концентрации двухвалентных катионов.

4. При помощи вычислительных методов проанализировать вероятное взаимодействие, обеспечивающее сборку и олигомеризацию трансмембранного домена глицинового рецептора. Предсказать вероятные молекулярные детерминанты данного взаимодействия, предложить способы проверки.

5. При помощи биохимических и электрофизиологических методов проверить правильность предсказаний. Проанализировать полученные соответствия между структурными данными компьютерного моделирования и функциональными данными. Рассмотреть универсальность данного механизма для всего надсемейства.

Научная новизна работы

В работе показан механизм действия алкалоидов стрихнина и (1-тубокурарина, характеризующихся высокоафинным, но низкоселективным связыванием с ацетилхолиновым и глициновым рецепторами. На основании полученных данных о функциях консервативных остатков внеклеточного лиганд-связывающего домена проведен рациональный дизайн связывающих центров с заданной чувствительностью к двухвалентным катионам на основе а 1-глицинового рецептора, которые, возможно, найдут применение в аналитической химии и нейрофизиологии. Также на основании длительной молекулярной динамики исследованных в работе комплексов АХСБ с алкалоидами, и другими лигандами, опубликованных ранее (СеНе е1 а1., 2005, Воигпе е! а1., 2005), была получена информация о взаимосвязи направленности действия лиганда и частоты осцилляции его комплекса с белком. Данный подход можно использовать в качестве метода оценки влияния активного соединения на динамическое поведение рецептора, позволяющего предсказывать агонистическое или антагонистическое действие лигандов вычислительным путем.

Основные положения, выносящиеся на защиту

1. Впервые показано, что при связывании с ацетилхолин-связывающим белком молекулы алкалоидов могут иметь две ориентации (<1-тубокурарин) или находиться по две в одном сайте связывания (стрихнин). Низкая специфичность стрихина и (1-тубокурарина к различным подтипам рецепторов обеспечивается тем, что наибольший вклад в взаимодействие между алкалоидом и белком вносят консервативные остатки внеклеточного центра связывания (\V145, У186, С188, С189, У193 в аиетнхолинсвязывающем белке Ар^а саИ/огтса), присутствующие практически во всех рецепторах семейства.

2. На основании полученных кристаллических структур показано, что частотная характеристика колебаний лиганд-связыающего домена Суэ-петельных ионных каналов в равновесной фазе молекулярной динамики является собственным свойством рецептора и

зависит от его химической структуры. Данная характеристика меняется под воздействием связывания с лигандами, отражая изменение термодинамической температуры белка.

3. Показано, что сборка и олигомеризация Cys-петельных ионных каналов обеспечиваются сетевым взаимодействием ароматических остатков первого, третьего и четвертого альфа-спиральных фрагментов трансмембранного домена (Y228, W239, W243 из Ml; W286, F293 из МЗ и F395, F399, F402, F405, Y410 из М4 в al-глициновом рецепторе). Данное взаимодействие специфично и основано на точном распознавании поверхностей связывания.

4. Модификация ароматических остатков внеклеточного центра связывания агонистов л антагонистов глицинового рецептора придает рецептору чувствительность к двухвалентным катионам металлов в наномолярных концентрациях. Предсказаны и получены варианты белков, чувствительных к ионам цинка, меди и магния.

Научно-практическая ценность работы

В сотрудничестве с Техническим университетом г. Дармштадт (Technisches Universitat Darmstadt), ФРГ, начата работа по использованию модифицированных версий глицинового рецептора, чувствительных к незначительным концентрациям двухвалентных катионов, в качестве детекторов на биочипах для применения в аналитической химии.

Публикация н апробация работы

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Основные материалы диссертации были представлены на рабочем совещании проекта Neurocypres седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 Neurocypres, Амстердам, Нидерланды, 2008), российско-немецких симпозиумах по Cys-петельным рецепторам (Москза, 2007 и Франкфурт-на-Майне, Германия, 2008), конференциях 5Л FENS Forum (Вена, Австрия, 2006) и 7th FENS Forum (Амстердам, Нидерланды, 2010) и "Biophysical Society Annual Meeting" (США, 2010).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 52 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора о структуре, функции, специфичности и методах исследования лиганд-активируемых ионных каналов, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы; содержит 14 рисунков, 2 схемы и 3 таблицы.

Материалы и методы

1. Получение кДНК конструктов al-ГР

Материал кДНК, кодирующих а 1-субъединицу ГР с С-концевой б-His меткой производилось по описанному в литературе алгоритму (Griffon et al., 1999). Замены аминокислотных остатков в рецепторе производились при помощи набора QuickCfiange™ для сайт-направленного мутагенеза фирмы Stratagene, с использованием прай.меров, содержащих «молчащий» сайт рестрикции. Позитивные клоны определялись при помощи рестрикционного анализа и подтверждались дидеокси-секвенированием ДНК. Для получения вариантов рецептора, укороченных в разных позициях со стороны С-конца, в позиции 2I4F, 2!2R, 273Р и j25K вставлялась нуклеотидная последовательность, содержащая б-His метку, стоп-кодон и сайт рестрикции ХЪа 1. В результате образовывались фрагменты al'"2l4-His, al'"252-His, al'"275-His и al'"353-His, соответственно. Некодир)тощий 3' участок удалялся при помощи SnaB I, которая разрезает дважды: 3' от сгоп-кодона и 5' от поли-А хвоста вектора pNK.S2 (Gloor et al., 1995), с последующей лигацией. Для получения полипептида al-ГР, укороченного с N-конца, фрагмент ДНК, кодирующий остатки j41-M-421Q-6-His был амплифицирован при помощи ПЦР и клонирован в pNKS2 между сайтами ВатН I и Xba 1. В результате был получен фрагмент al34M21-His.

2. Гетерологическая экспрессия в ооцитах Xenopus laevis и тестирование физиологических свойств при помощи метода двухэлектродной фиксации потенциала Для гетерологической экспрессии рецепторов использовались ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Фолликулярная оболочка удалялась инкубацией с коллагеназой (Sigma) при 19°С в течение 20 часов. Инъекция мРНК производилась как описано в Schamlzing et al., 1991.0оциты хранились при 19°С в стерильном растворе Рингера (ORi: 90 мМ NaCl, 1 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCh и 10 мМ Hepes, рН 7.4), с добавлением гентамицина 50мг/л. Ответ та добавление глицина измерялся спустя от 1 до 3 дней после инъекции мРНК при помощи двухэлектродной фиксации потенциала с потенциалом -70 мВ как описано в (11).

3. Очистка белка и гель-электрофорез

Ооциты, инъецированные мРНК, метаболически метились при помощи инкубации с L-[3з5]метионином (> 40 ТБк/ммоль, Amersham Pharmacia) в конецетрации 100 МБк/мл (около 0.1 МБк на ооцит) в течение ночи в растворе Рингера при 19°С. Белки выделялись из экстракта ооцитов, полученнго при помощи 1% дигитонина, путем хроматографии на Ni2+-NTA агарозе (Qiagen) как описано в Nicke et al., 1998 со следующими изменениями. Связанные с колонкой белки освобождались от Ni2+-NTA агарозы неденатурирующим элюентом, состоящим из 1.0% дигитонина и 250 мМ имидазола/HCl (pH 7.6), и содержались при 0°С до электрофореза. Нативный электрофорез (BN-PAGE, Schaegger et al, 1994) производился сразу после выделения белка как описано в Nicke et al., 1998 в присутствии 0.02% кумасси синего G250. Очищенный белок помещался в

8

поддерживающий «синий» буфер с конечными концентрациями 10% глицерина, 0.2% Serva blue G, 20 мМ 6-амино-п-капроата натрия, и наносился на полнакриламидным градиентный гель (4-22% акриламида). Часть образцов перед электрофорезом обрабатывалась 100 мМ дитиотреитолом или 0.1% додецилсульфатом натрия в течение 1 часа при 37°С для получения частично диссоциированных рецепторов.

Часть экспериментов была проведена в департаменте нейрохимии Института исследования мозга общества Макса Планка, г. Франкфурт-на-Майне, Германия, пол руководством приват-доцента Бодо Лаубе и профессора Хайнриха Беца. Работа была поддержана стипендией DAAD (Германское общество академических обменов) и грантом AvH (Общество Александра фон Гумбольдта).

4. Построение выравниваний

Выравнивания последвательностей производились при помощи алгоритма CIustalW2 Европейского Института Биоинформатики (Chenna et al., 2003). Анализ выравнивании и последовательностей производился при помощи GeneDoc (Nicholas et al., 1997).

5. Моделирование белков

Модели белков строились по гомологии при помощи MODELLER 9v6 (Sali et al., 1997). Все полученные модели затем уравновешивались в GROMACS4 (Hess et al., 2008), их потенциальная энергия минимизировалась с помощью алгоритма наибольшего снижения (Woodmanetal., 1995).

6. Докинг белковых структур

Подготовка молекул к докингу производилась в UCSF Chimera. Докинги производились с помощью алгоритма AutoDock 3 с неподвижным рецептором и 32 активными торсионными углами в лиганде. Каждый кластер содержал по 20 решений, из которых отбирались пять с наибольшним разбросом энергий и подвергались экстенсивной минимизации энергии. Анализ полученных структур производился при помощи UCSF Chimera и DeepView Swiss-PDB Viewer v.3.5 (Guex et al., 1999), изображения обрабатывались в PyMol Molecular Viewer.

7. Подготовка систем к молекулярной динамике

Вычисления проводились в коробке из молекул SPC воды размером 9 им, со средним содержанием 22000 молекул. Противоионы добавлялись соответственно физиологическим условиям либо условиям кристаллизации белка, в зависимости от конкретной модели. Использовался пакет GROMACS4, силовые поля GROMOS и CHARMM27. При проведении молекулярной динамики в липидах с помощью пакета Membrane был задан участок мембраны 110x110Â из пальмигоил-олеоил-глицеролфосфатидилхолина (РОРС) с молекулыми воды, гидратирующими полярные головки липидов. Всего участок мембраны содержал 326 молекул липида и 5.529 молекул воды. Затем энергия мембраны была минимизирована при помощи 200 шагов алгоритма

9

наибольшего снижения и уравновешена в молекулярной динамике в I не для оптимизации взаимодействий липид-липид и липид-вода. Затем при помощи пакета HOLE в мембрану встраивалась минимизированная модель глицинового рецептора.

S. Молекулярная динамика в классическом приближении

Молекулярная динамика проводилась при помощи пакета GROMACS4 с силовым полем CHARMM. Длительность стандартного эксперимента составляла 50 не в условиях канонического ансамбля (NVT), потенциальной формы LJ-4 и термостата Ноуза-Гувера (КНТ). Для сокращения вычислительной сложности, все молекулы воды, находившиеся дальше 3.5А от атома белка после 50 пс расчета системы удалялись как не сольватирующие. Для определения возможных дистантных взаимодействий между сайтами связывания на ацетилхолин-связывающем белке проводилось также моделирование полных пентамеров в сольватной коробке из 38256 молекул SPC воды.

9. Комплексная молекулярная динамика (QM/MM)

Вычисления по методу QM/MM производились при помощи интегратора ChemShell и кода Turbomole. Квантовая часть системы обрабатывалась с уровнем теории B3LYP/6-31G, классическая - силовым полем CHARMM27. Во всех QM/MM вычислениях квантовой областью была только одна молекула лиганда. В ММ-регион включалась коробка с гранью а=9А и с центром на атоме Cl первого кольца молекулы d-тубокурарина. Стандартное время вычисления составляло 40 пс. Ограничение радиуса электростатических взаимодействий не использовалось. Для обработки граничной области использовались включение зарядов ММ-области в одноэлектронный гамильтониан и промежуточные атомы водорода с моделью смещения заряда. Использовались канонический ансамбль (NVT) и термостат Ноуза-Гувера (NHT).

Результаты и обсуждение

В работе отдела достаточно давно применяется метод моделирования пространственной структуры белка и его динамического поведения дтя объяснения имеющихся экспериментальных данных о структуре и функциях аминокислотных остатков в составе как небольших пептидов (токсинов конусов и змеи), так и белков (ацетилхолинового и других рецепторов). Автор диссертационной работы начал применять этот метод в рамках исследований связывания токсинов ядов змей с ацетилхолиновым рецептором (Nlordvintsev et al., 2006). Ранее при этом использовались только методы моделирования по гомологи» (Sali et al., 1998) и докинга (Woodman et al., 2001). Однако, исследуя в коллективе с другими сотрудниками отдела взаимодействие а-конотоксина Imll с ацетилхолин-связывающим белком и различными ацетилхолиповыми рецепторами, автор столкнулся с значимым несоответствием данных, полученных этими методами, эксперименту, и сделал вывод о необходимости использования более сложных и точных вычислительных методов, прежде всего - молекулярной динамики, а в дальнейшем - и комбинированных квантово-механических методов. В работе автора метод был первоначально использован дтя исследования процессов, проходящих во внеклеточном лиганд-связывающем домене cys-петельных рецепторов, однако впоследствии удалось применить его и для исследования трансмембранного домена, его связывающих цетров, и механизмов, управляющих олигомеризацией домена и рецептора в целом.

Анализ молекулярной динамики кристаллической структуры комплексов ацетилхолин-связывающего белка Aplysia californica с алкалоидами стрихнином и d-тубокурарином

В Католическом Университете г. Лёвен, Бельгия, были получены кристаллические структуры ацетилхолин-связывающего белка Aplysia californica с двумя растительными алкалоидами нейротропного действия - стрихнином и rf-тубокурарином. Разрешение кристаллических структур составило 1.8Ä в наиболее четких участках, при этом для каждого из лигандов наблюдалось по две конформации. В данной работе был проведен анализ этих кристаллических структур различными вычислительными методами. Целью анализа было установление динамического поведения комплексов АХСБ с алкалоидами и предсказание возможных механизмов взаимодействия данных алкалоидов с их биологическими мишенями - ацетилхолиновым и глициновым рецепторами.

По данным кристаллических структур, стрихнин образует контакты с остатками (+) поверхности Y91, S144, W145, С188, С189, Y193 и (-) поверхности: Y53, Q55. Ml 14, 1116, D162, S165. Весьма схожие контакты наблюдаются для комплекса с rf-тубокураршюм: Y91, S144, W145, С188, С189, Y186, Y193 на (+) поверхности. Пять остатков из этого списка -Y91, W145, С188, С189 и Y193 являются консервативными (см. Рис. 2). Это объясняет низкую селективность стрихнина и d-тубокурарина между различными подтипами рецепторов при высокой афинности связывания. Это дает возможность предположить, что широкий спектр мишеней внутри подсемейства у данных алкалоидов вызван их способностью связываться с наиболее устойчивыми и консервативными остатками.

петля Э

Л( АСЫГ/1 -205

* ЛСЛ**, I 20\ г! ОДСМ Мл»/1 ги

0 ялгм

а ъп 224

г пАСЬЛ н%Ц-219 5 НТ1АЛ Ш/1-21$ 5 НТШ Чт/1-222

г-.чч

сус

С^Я М>/1 Л» Ы £4ДМ Ш/1 220

QANl.IMH.ICSO».

..............|'о*лои*ммат--

<5 »»ицкчпе*

...............С5 Ю«И|«ЦУ«к -

стоящ 41с*Аас*маг{*11*о|,мс|ч

й» ч

»N1 Г1»чвмн1 = м\ ЯРА! I. "К

аРАинЩот-Ач

*ЯЯЯАТО€ОТГОРА1_ _

*..«, АИР - мтог1с*4мс* г соноьй (СКОР ии Р*ОР4с*4мс*т\с АЯ$Я}АР М5РгОГ40К4МСЯТ*С

-а#яа01 I ч.г.ч' I VI I * 11 ок4.1 п---6-

У*1ТУСв4Ш С

РМГРСРТКОО РЦУ< »»гу»I ртояоя -рулу!

они г 1У0^ |ри руляогоптут»н| ОРЩ РАМ0<0УУК^4«Ч *<Е1 РУАН*ТЕ§У0УА1АЬ ОРШ рУЯ1»11ЖМ|1«И

««су руяс%и1«ят\л|э>и

ШОУ ГУ Я С** * МТ уВ| си

I Рч»*СР-РУч>Г-I PSft.Gr *УК*| I рчскСГ 'УЧИ I *с.е>*-<#.у _ i. pVdvow.iI

|1_0С-»У<У05$ТМЕУ01->'в I • 11ГУ»»1 ТШУО«У»ЯГ ммуедот * А ОСУ» СЧЧУОГ

Л«кур>|6 1СГ.-ВТМ 6 1МГ|ии Л

•<яг04« I 6 «I л

МГ- ВИ1 7 Т I 7

¡¡»нот /

(1)

А< АС «-./«* и АСШ/1-201 Я-ЛСПвГ/1-20}

яЛ( I-Л!

»2 яАСМ Ш/2 202

-2 и

1-224

г пасм т/1 219 5 -нГ 1лл-иг,-71г % шил Мм/1 222 и &**-*1/1-гг9

*}-СЬ*И\П ¿¡о Ц слллл Иг ¡ 224

петля А

петля Е

/ Iъ ' «**РО

Ь

Ч в»ОР»

Ы <

I 220

С»НС»»ЩАА1>|*' I 5 РООУ 5V Р I 5 <

ССУ»• |Н| Р1|к|**рф

_ С1*^|,ЯУ»% 1МУТШ г ЮН I SVL.It кг-гОму»! е: I V < I

РЩтд

»пнищ!»'!

(г ОМVI ■ Р00Я.010Р1 РОСЩОЮ »00*1011

г щ 11 [>**УАва1.»> »

' <1§Т ПЩГОН^ ЦЯ *

4 А|К1УР00Я.01ЭРШ|1 1 А|% I т»пс>*4о| г>Лп 4 а(Ь ( «ЮйЦГЯ Г>Рф1

В'- I». I

И I*« »

--РуоуСМ'О АVу I нос\ К Р £ УСТ СС11 Д" У V 1 ОСТ -АР? 11>5Л0ЯУУУЯ1С,С^

- -01 А УК I ТКУ1 »0« Я1

- VI 'VА1»СКУ1У^РОСС

- -1|<5 '|*4ГИУ»У*«ТС1 0ТСУД*САМУ1УТ1СС$

УО - --УС**РНI Рту* I * носI »0 Р»УТУПН«С»'

кСанрШт I -1оч* Чя 1чс-«' - ч^су-во^кцяи.чС»'

'»"Щочм 1Й I -КЧСЧ'

атСЯ I А | ;«: А1С*1«У -.19

петля В

петля Р

петля С

А. -ЛСЬЛГ/1-201 и АСШ/1 20$

»: ПА(ГМ Ут/1 24 »7 ОАСЛ* И»/; 207 у-лЛО*(-*»/1 -24 о плслв-та 224 Г-ПЛСМ-Н1/1-219

\ И1.1М НЧ1 211 5 ИТ ХАЛ 1*1/1-»} II Оу«-«1/1 219

^ С2*я ГН,1 -219 1: СЛ9АК М1/1 224 Ы-САЛАЛ-Ч'/1-720

С-|»ои§

ЗУОГ 1'в-

ОС S А У А I N f

оса----Т1»* '»

к|| II

е|УЕГ пауомрск

ОвТМТЧ^

"Л." г__

"4Й1|Ц*1 ..........ьаСЫ

«.¡СУ.

м

ТА" С» УбИСИЯ ЮИЯРАКИ гЯРАЙУМ [АЮТСРС^ 1Й1 СУ1РТГ»

§УМУУа»«Ц 0У1У5|.М» >91 I » г Г А* *». » ^мГУМЧЯ!

ОУ"Р туткяя« 1«У»'рт1 I <; я «

№ 1нии. ТУУ1ЯЯ.

.«•.......

«11Я-

1'ие. 2. Выравнивание последовательностей внеклеточного связывающего центра ацетилхолинового и глицинового рецепторов с последовательностью связывающего центра ацетихолин-связывающего белка.

Проводилось моделирование динамического поведения комплексов АХСБ с стрихнином и <3-тубокурарином. Результирующее положение лиганда сравнивалось по среднеквадратичному отклонению положения а-углеродных атомов с положением лиганда в кристаллической структуре. Система, содержащая связывающий центр АХСБ с одной или двумя молекулами стрихнина, быстро сходит к равновесию, что свидетельствует о близости полученной рентгеновской кристаллографией структуры к глобальному энергетическому минимуму. Ввод лиганда в АХСБ приводит к установлению индуцированного соответствия за время от 9 до 12 не. Суперпозиция конформаций, полученных по результатам динамики и кристаллических структур показывает незначительные различия для конформаций стрихнина (К.М50 1.6А и 1.8А, соответственно) и первой конформации с1-тубокурарина (1.4А). Для второй конформации с)-тубокурарина характерно высокое значение среднеквадратичного отклонения - 3.2А, что, возможно, объясняется недостаточно полным представлением имеющихся между белком и лигандом взаимодействий в классическом приближении молекулярной динамики ввиду алгоритмических недостатков использованного силового поля.

А ,»5144 ут5 Г

У193 У91 С188

Стрихнин, конформация 1

(З-ТК, конформация 1

Стрихнин, конформация2

Рис. 3. Ориентация молекул стрихнина и (1-тубокурарина в сайте связывания ацетилхолин-связывающего белка моллюска Лр1уз1а саИ/огтса. А - одна молекула стрихина связана с белком, Б - две молекулы стрихина связаны с белком, В - первая конформация с1-тубокурарина, Г - вторая конформация. Отмечены консервативные остатки, важные для формирования взаимодействия с лигандом.

Такое существенно различие было вызвано неспособностью классического силового поля корректно обработать формирование водородной связи остатка К141 (+) поверхности сайта связывания с молекулой ¿/-тубокурарина. Для того, чтобы более точно определить конформацию, принимаемую лигандом, была проведена молекулярная динамика в ОМ/ММ приближении с уровнем теории ОРТ и функционалом ВЗЬУР (ОСЬет/СНА11ММ27). После 40-пикосекундного вычисления среднеквадратичное отклонение от конформация, наблюдаемой в кристаллической структуре, снизилось до 1.8А, что сравнимо со значениями, определенными для остальных конформаций.

При длительных молекулярно-динамических вычислениях удается получить конформацию комплекса, соответствующую термодинамически равновесной фазе. Анализ таких конформаций дает существенно больше информации, чем анализ неуравновешенных систем;

поэтому была поставлена задача провести достаточно долгие вычисления и проанализировать равновесные фазы.

Для каждого вычисления равновесная фаза определялась статистическим методом, как описано в (Thiel et al., 2005). Затем траектория обрезалась с двух сторон вдоль оси времени на 3 не для того, чтобы избежать граничных эффектов. Энергия взаимодействия между лигандом и белком измерялась при помощи термодинамического интегрирования в одном направлении вдоль оси времени. Значения составили 12±1 кДж/моль для одной связанной молекулы стрихнина, 20±1 кДж/моль для двух, 11±1 кДж/моль для конформации 1 d-тубокурарина и 10±1 кДж/моль для конформации 2.

Также для оценки влияния связывания лиганда на колебательную активность белка проводился следующий анализ. Суммарная траектория белка в равновесной фазе, определенной статистически, подвергалась прямому Фурье-преобразованию, в результате чего выделялась первичная частотная характеристика комплекса белок-лиганд (Fc). Частотная характеристика АХСБ без лиганда - 450±15 ГГц, в то время как основная гармоника

1

А

/ / / / ' / / У

п

о 4

J>

-5

Рис. 4. Первичная частотная характеристика комплексов АХСБ с различными агонистами и антагонистами (гистограмма) в обратной корреляции с расстоянием от тела АХСБ до С-петли белка (прерывистая линия). По оси ординат частота осцилляции комплекса лиганд-белок, ГГц, и расстояние от атома кислорода а-карбонильной группы остатка \¥91 до атома серы остатка С189 как мера удаления петли С от поверхности белка. Для АХСБ без лиганда расстояние между С-петлей и белком неустойчиво в молекулярной динамике и кристаллических структурах и потому не учитывалось.

комплекса с ¿-тубокурарином была смещена влево по спектру - 212±30 ГГц. Этот сдвиг свидетельствует о снижении частоты осцилляций белкового комплекса и, как следствие, повышении его стабильности. Сопоставимый сдвиг влево характерен для комплекса АХСБ с

14

антагонистом нАХР, альфа-конотоксином Рп1А. Комплекс АХСБ с никотином, напротив, характеризуется существенным сдвигом основной гармоники вправо = 1200±550 ГГц). Частичный агонист тропизетрон, имеет значение Ес = 745±50 ГГц. Исходя из полученных данных автор предполагает наличие существенной корреляции между снижением частоты осцилляций белкового комплекса и антагонистическими свойствами лиганда, в нем связанного; обратное верно. Агонисты, таким образом, повышают частоту колебаний белка, облегчая открытие канала; антагонисты, снижая частоту колебаний, делают открытие менее вероятным. В литературе имеются экспериментальные данные, косвенно поддерживающие данное предположение. Неожиданным образом, для комплекса АХСБ со стрихнином характерно незначительное повышение частоты осцилляций (/V = 655±30 ГГц), вопреки ожидаемому сдвигу влево, т.к. стрихнин имеет антагонистическое действие. Однако данный результат хорошо согласуется с уникальным, также нехарактерным для антагонистов положением, которое принимает в данном комплексе связывающая лиганды С-петля белка.

Направленное изменение лигандной специфичности глицинового рецептора при помощи вычислительных методов и сайт-направленного мутагенеза

Таким образом, работа с ацетилхолин-связывающим белком позволила установить остатки, ответственные за высокую афинность связывания. Прочие остатки, по-видимому, ответственны за формирование селективности. Для проверки данного предположения была поставлена задача получить путем рационального дизайна (при помощи молекулярной динамики и сайт-направленного мутагенеза) на основе а1-глицинового рецептора белок, активируемый двухвалентными катионами. В норме такие катионы потенциируют действие глицина, но сами активировать канал не могут.

Рис. 5. (а) - зеленым отмечено положение иона цинка в сайте связывания ГР дикого типа, красным - в сайте связывания мутантного белка Р207Н, в котором формируются два дополнительных взаимодействия; (б) - профиль энергии связывания, на котором отмечены результаты для разных пар мутантный белок/ион.

Было выяснено, что при замене ароматических остатков внеклеточного связывающего цетнтра У203 и Р207, на гистидин, можно существенно повысить энергию связывания

15

двухвалентных катионов сайт-направленным мутагенезом: мутант рецептора Р207Н вообще не активировался глицином (ЕС50 снижена на три порядка), однако был крайне чувствителен к ионам 2п2+ и открывался ими с ЕС50 1.2 мкМ. Более того, в дальнейших экспериментах было выяснено, что мутанты У202Н и Р207Н полностью нечувствительны к ингибированию медью и даже потенциируются ей. По всей видимости, активация ионами Си2+ не происходит, поскольку размер иона не полностью соответствует положению петли С, необходимому для активации рецептора. Профиль соотношений размеров иона и энергии связывания приведен выше.

Таким образом, удалось показать предсказательную силу предложенного механизма взаимодействия между лигандами и СЬК и получить чувствительные к двухвалентным катионам варианты а 1-глицинового рецептора.

Моделирование сборки трансмембранного домена гтг/инового рецептора

Анализ выравнивания трансмембранного фрагмента М4 а 1-глицинового рецептора показывает наличие пяти консервативных остатков - 1387, D388, F399, F402, Y406, W407 и Y410 по номенклатуре а 1-субъединицы глицинового рецептора. В связи с большим количеством ароматических аминокислотных остатков, логичным было предположить наличие взаимодействия типа «молния». Для проверки предположения о функциональной важности этих остатков была поставлена задача построить модель al-гомопентамерного глицинового рецептора.

Модель была построена с использованием кристаллических структур прокариотических каналов и электронной микрофотографии нАХР, затем уравновешена в силовом поле CHARMM27 и проанализирована. Диаметр самого узкого места поры составил 5-5.5Ä, что соответствует данным химического максимального диаметра канальных блокаторов рекомбинантных al-гомопентамерных рецепторов. Из двух предсказанных (Akagi et.al., 2004) гидрофобных межсубъединичных контактов, образуемых фрагментомМ2, наблюдался в модели четко только один, между остатками Leu 218 и Тге 219 al-ГР.

Для анализа положения и функции консервативных остатков трансмембранного домена, а также для более полного анализа подвижности модели, были проведены вычисления динамики рецептора в липидном окружении в молекулярно-механическом приближении с использованием силового поля GROMACS. В начале проводились предварительные расчеты, с определением недлинных траекторий (длинной 100 пс) in vacuo, имевшие своей целью дополнительное уточнение модели; затем был проведен масштабный эксперимент по молекулярной динамике рецептора в липидах. Было показано, что позиция М4 в молекулярной модели ГАМК-А рецептора, опубликованной ранее, была искажена в виду неполного моделирования фрагмента (О'Мага et а1., 2004). Таким образом ошибка, внесенная в модель использованием структуры, опубликованной ранее, в качестве одного из шаблонов моделирования по гомологии, была устранена, а ориентация остатков М4 приведена в соответствие с профилем энергии и ранее опубликованными экспериментальными данными о доступности остатков трансмембранного фрагмента М4 растворителю. Основной целью вычисления движений рецептора в липидном бислое в

молекулярно-механическом приближении было выяснение степени подвижности трансмембранного домена и ее соответствия теоретическим предположениям, сделанным на основе анализа модели, а также получение надежного материала для исследования молекулярных детерминант взаимодействия между трансмембранным фрагментом М4 и фрагментом рецептора, содержащим внеклеточный домен и трансмембранные фрагменты М1, М2 и МЗ, при помощи докинга.

Для получения дальнейших подтверждений функциональной роли ароматических остатков трансмембранного домена М4 производился докинг модельных пептидов, соответствующих использованным в функциональных тестах точечным мутантам по фрагменту М4, к модели рецептора без фрагмента М4. Измерялись две величины - усредненная энергия связывания, определенная после докинга молкулярной динамикой в силовом поле ЙШМАСЗ (кДж/моль) и амплитуда вращательной свободы трансмембранного домена М4, измеряемая в градусах по нормали к плоскости сечения домена М4, проходящей через осевую линию рецептора. Для удобства интерпретации данных вторая величина была нормирована относительно амплитуды колебаний домена а1-ГР дикого типа. Результаты измерений показаны в таб. 2. Энергия связывания была значительно снижена в случае мутантов а1Р395А (0.10±0.04 кДж/моль), а1Р399А (0.11±0.01 кДж/моль), а1Р402А (0.12±0.01 кДж/моль), а!У406А (0.31±0.03 кДж/моль), аШ407А (0.22±0.02 кДж/моль) и а1У410 (0.31±0.04 кДж/моль) по сравнению с характерными для дикого типа (2.8±0.01 кДж/моль), что полностью соответствует данным, полученным при функциональном тестировании методом двухэлектродной фиксации потенциала. В случае мутанта а1Р396А устойчивых решений у докинга не было, а пептид был нестабилен и в молекулярной динамике не сохранял а-спиральную информацию, что свидетельствует о структурной инвариантности данного остатка. Степень вращательной свободы существенно отличалась от дикого типа лишь у трех мутантов , а1Р399А, о1У406А и а1\У407А.

Анализ молекулярных детерминант сборки ГР при помощи сайт-направленного мутагенеза и электрофизологических методов

Для выяснения молекулярных детерминант взаимодействия между трансмембранным доменом М4 и фрагментом рецептора, содержащим внеклеточный домен и фрагменты М1-МЗ трансмембранного домена («ядром» рецептора) производился сайт-направленный мутагенез с последующим функциональным тестированием при помощи метода двухлектродной фиксации потенциала. В качестве предварительных экспериментов производился мутагенез домена М4 (остатки 392-411 а1-ГР) пакетами по 5 остатков в остаток аланина (короткий, гидрофобный, слабо липофильный) или лейцина (объемный, сильно гидрофобный, сильно липофильный) с последующим анализом степени сборки рецептора при помощи денатурирующего (с ДДС-Ыа) и нативного (с кумасси синим) электрофореза. Поскольку, по известным литературным данным, только локализованные на мембране и полностью собранные а1-гомопентамерные ГР подвергаются интернализации с мембраны с поледующим протеолитическим расщеплением на фрагменты 35 и 13 кДа (ВиеНпег е1 а1., 2001), наличие продуктов такого расщепление использовалось в качестве маркера корректной сборки и мембранной локализации мутантных рецепторов. ГР

выделялись из ооцитов по истечению 36 часов с момента инъекции и подвергались полной денатурации в ДДС-Ыа-ПАА буфере.

Д 1 | 2 3 ! 4 I 5 | 6 ; 7

663020-

|4|5[6;7j8[9l В ; | 1 j 2 | 3 j 4 i 5 j 6 i 7 [ 8

- I

14-

Alanine scan Leucine scan

ы л л ы UJ А

t Я О -п "О £ > *п о "Л z S -л < -П Z 2 ■л -< л о -п тз Ж S > *л г о "Л Z г -П -< 8 -п Z S -п -<

Щ Alanine scan Leucine scan

w е. Г- f

р Я £ "П "П 1С я ~П "П

а G)

"Л

и — -< -С

и> s о 8 а 8

Рис. 6. Анализ сборки и функциональной экспрессии пакетных мутантов а1-ГР. А. Трицин-ДДС-Ма-ПАА-электрофорез выделенных мутантных белков в полностью денатурированном состоянии. Б. Нативный электрофорез выделенных мутантных белков (422% акриламида) без дополнительной обработки или после частичной денатурации 0.1% ДДС-Ыа в течение 1ч при 37°С в отсутствие либо в присутствии 100 мМ ДТТ, как указано на рисунке.

ДДС-Ыа-трициновый электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие нативных субъединиц с массой 48 кДа, а также продуктов распада с характерными массами 35 кДа (Ы-концевой фрагмент) и 13 кДа (С-концевой фрагмент). В отличие от дикого типа, все аланиновые и лейциновые мутанты (остатки 392-396, 397-401, 402-406 и 407-411) показали начличие только полосы с массой 48 кДа, что является свидетельством нарушения сборки пентамерных рецепторов и/или поверхностной экспрессии.

В полном соответствии с данными биохимических экспериментов, функциональное тестирование при помощи метода двухэлектродной фиксации потенциала показало, что ни один из пакетных мутантов не образовывал при гетерологической экспрессии полностью функциональных рецепторов. Только конструкт с замененными остатками 407-411 формировал функциональные рецепторы, но с резко сниженными 1тах и ЕС50 для глицина (0.12±0.06 цА и 7235 ± 1156 цМ соответственно, для сравнения характеристики а1-гомопентамерного ГР дикого типа - 1тах = 6.4± 1.9 цА, ЕС50 = 218±50 цМ). На основании этих данных был сделан вывод о том, что специфическое взаимодействие между М4 и «ядром» рецептора, играющее важную роль в корректной сборке и функции рецептора, действительно имеет место быть, и его молекулярные детерминанты локализованы в области, покрытой каждым из пакетов мутаций. Для дальнейшего уточнения молекулярных детерминант этого

процесса производился сайт-направленный мутагенез остатков трансмембранного домена М4 в аланин или лейцин с последующим функциональным тестированием по методу двухэлектродной фиксации потенциала.

Рис. 7. Схема взаимодействия, стабилизирующего мембранный домен глицинового рецептора. Зеленым отмечены остатки верхнего участка взаимодействия, желтым - нижнего участка, синим - остатки, ориентированные к липидной мембране.

Для дальнейшего исследования природы взаимодействия между трансмембранным доменом М4 и «ядром» рецептора проводился точечный сайт-направленный мутагенез остатков а1 392-413. Результаты мутагенеза показаны в таб. 1. Мутант а!Р396А был нефункционален и не экспрессировался, по всей видимости ввиду структурной важности остатка Р396. Мутанты а1Р399А и а1У406А также не образовывали функциональных рецепторов. Функциональные характеристики мутантов а1Р395А (ЕС50 = 475±159 цМ, 1тах = 0.3±0.2 цА), а1Р405А (ЕС5о = 440±76 цМ, 1твх = 5.1±0.9 рА), а1Ш407А (ЕС50 = 10 5 6±358 цМ, 1тах = 0.5±0.1 рА) и а1 У410А (ЕС5о = 3521±442 цМ, 1тйх = 0.7±0.2 дА) были существенно снижены по сравнению с а 1-гомопентамерным ГР дикого типа (ЕС50 = 218±50 рМ, 1тах = 6.4± 1.6 цА), что дало возможность предположить их структурную важность для взаимодействия между трансмембранным доменом М4 и остальным рецептором.

Заключение

В работе установлено, что в последовательностях всех Cys-петельных лиганд-активируемых ионных каналов имеются полностью или практически полностью консервативные аминокислотные остатки, играющие важную роль в работе связывающих центров и корректной сборке этих белков. Выяснено, что алкалоиды, характеризующиеся широким спектром действия и низкой селективностью при очень высоком сродстве к рецепторам семейства, связываются именно с этими остатками, имеющимися практически во всех типах Cys-петельных рецепторов. Важным практическим результатом стала разработка алгоритма анализа влияния связывания лиганда на общую подвижность комплекса АХСБ с лигандом. При помощи данного алгоритма удалось определить, что связывание с антагонистами характеризуется снижением общей подвижности белка, и, как следствие, уменьшением вероятности стохастического открывания канала, что приводит к ингибированию действия рецептора. Связывание с агонистами, напротив, приводит к повышению частоты осилляций, снижает стабильность и повышает вероятность открытия канала. При анализе поведения и значимости консервативных остатков в трансмембранном домене лиганд-активируемых ионных каналов было выяснено, что его структура поддерживается нековалентным высокоспецифичным взаимодействием этих остатков. Эти данные подтверждаются недавно опубликованной кристаллической структурой прокариотического лиганд-активируемого ионного канала (Hilf et al., 2009).

Большинство структурных и функциональных детерминант работы Cys-петельных лиганд-активируемых ионных каналов являются консервативными. Не относятся к ним остатки, вносящие незначительные по энергии, но иногда чрезвычайно важные фармакологически изменения в структуру сайтов связывания рецепторов, приводящие к образованию субъединичной, подтиповой и тканевой специфичности рецепторов. Данный результат позволяет более полно подойти к проблеме рационального дизайна соединений, направленных на глициновый и ацетилхолиновый рецептор, и более четко ставить задачу: при необходимости получения высоких констант связывания на широком спектре подтипов какого-либо рецептора или даже на нескольких рецепторах следует ориентироваться на построение взаимодействий с консервативными остатками сайта связывания или трансмембранного домена; если же цель состоит в получении высокоселективной молекулы, необходимо строить взаимодействия с изменчивыми остатками, характерными для данного конкретного подтипа рецептора.

Выводы

1. С использованием компьютерных (алгоритмы докинга, Монте-Карло, броуновской, классической и квантовой молекулярной динамики) и экспериментальных (сайт-направленный мутагенез и электрофизиология) подходов получена новая информация о пространственном строении Cys-петельных рецепторов;

2. На основании кристаллических структур ацетилхолин-связывающих белков и их комплексов с агонистами и антагонистами проанализирована роль консервативных аминокислотных остатков в лиганд-связывающем домене и показано их влияние на формирование специфичности к лигандам;

3. При помощи анализа разработанным автором алгоритмом опубликованных кристаллических структур ацетилхолин-связывающего белка и его комплексов показало, что связывание агонистов приводит к повышению молекулярной подвижности комплексов, а антагонистов — к ограничению подвижности;

4. Показано, что при замене консервативных остатков (W207, Y210) на гистидин, специфичность глицинового рецептора смещается с активации глицином к активации двухвалентными катионами металлов;

5. Показано, что основную роль в сборке трансмембранного домена пентамерных Cys-петельных рецепторов играет специфическое взаимодействие ароматических остатков трансмембранных фрагментов М1 и МЗ (al-ГР F228, W239, W242, F243, W286, F293) с ароматическими остатками трансмембранного фрагмента М4 (al-ГР F395, F399, F402, Y406, W407, Y410); данное взаимодействие высокоспецифично и достаточно сильно для того, чтобы удерживать в связанном с фрагментами М1 и МЗ состоянии отделенный от рецептора фрагмент М4.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Brams, М.*, Pandya, A.*, Kuzmin, D., Elk, R. van, Krijnen, L., Yakel, J. L., et al. (2011). A Structural and Mutagenic Blueprint for Molecular Recognition of Strychnine and d-Tubocurarine by Different Cys-Loop Receptors. PLoSBiology, 9(3), el001034.

2. Tsetlin, V., Kuzmin, D., & Kasheverov, I. (2011). Assembly of nicotinic and other Cys-loop receptors. Journal of neurochemistry, 116(5), 734-41.

3. Haeger, S., Kuzmin, D., Detro-Dassen, S., Lang, N„ Kilb, M., Tsetlin, V., et al. (2010). An intramembrane aromatic network determines pentameric assembly of Cys-loop receptors. Nature structural & molecular biology, /7(1), 90-8.

4. Schumann T, Grudzinska J, Kuzmin D, Betz H, Laube В. Binding-site mutations in the alphal subunit of the inhibitory glycine receptor convert the inhibitory metal ion Cu2+ into a positive modulator. Neuropharmacology. 2009 Jan; 56(l):310-7.

5. Mordvintsev DY, Polyak YL, Kuzmin DA, Levtsova OV, Tourleigh YV, Utkin YN, Shaitan KV, Tsetlin VI. Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetylcholine receptors. ComputBiol Cliem. 2007 Apr; 31(2):72-81.

6. Mordvintsev, D. Y., Polyak, Y. L„ Kuzmin, D. A., Levtsova, О. V., Tourleigh, Y. V., & Kasheverov, I. E. (2006). A model for short alpha-neurotoxin bound to nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica. Journal of molecular neuroscience : MN, 30(1-2), 71-2.

Тезисы конференций

1. Dmitry Kuzmin, Silvia Detro-Dassen, Niklas Lang, Michael Kilb, Victor Tsetlin, Heinrich Betz, Bodo Laube, and Günther Schmalzing. World W Web: Cys-loop receptors are stabilized by an aromatic network of interactions. №N52010, Pages 1016-1017

2. Svenja Haeger*, Dmitry Kuzmin*, Silvia Detro-Dassen, Niklas Lang, Michael Kilb, Victor Tsetlin, Heinrich Betz, Bodo Laube, and Günther Schmalzing. Aromatic Interfaces between Transmembrane Helices M1/M4 and M3/M4 Play a Key Role in Cys-loop Receptor Assembly. BiophysJ, Volume 98, Issue 3, Supplement 1, January 2010, Pages 417a-418a.

3. V. Tsetlin, I. Kasheverov, I. Shelukina, D. Kuzmin, G. Schmalzing, B. Laube and H. Betz. Extracellular and membrane domains in structure and function of Cys-loop receptors. Journal of neurochemistry 2010 June 113(6):28-29.

Подписано в печать:

13.05.2011

Заказ № 5528 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru