Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

КРИВОШЕИН АРКАДИЙ ВИКТОРОВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ДОМЕНОВ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Torpedo californica

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории рецепции нейропептидов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии наук.

Научные руководители:

доктор химических наук, вед.н.с. Ю.Н.Уткин доктор химических наук, проф. А.С.Арсеньев

Официальные оппоненты:

докгор биологических наук П.М.Рубцов

кандидат физико-математических наук А.В.Феофанов

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 23 декабря 1998 года на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.

Автореферат разослан "23" нох£рл 1998 года.

Ученый секретарь ^ . ^у/

специализированного совета, И Л

доктор химических наук ¡1/ //В.А.Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования нейрорецепторов на молекулярном уровне с 1970-х годов являются бурно развивающейся областью физико-химической биологии. Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналы; наиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны. За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все существующие биохимические и физико-химические методы. Однако размер (-270 кДа) и сложность этого белка ограничивают как приложимость к нему многих высокоразрешающих методов (таких, как рентгеноструктурный анализ, спектроскопия ЯМР. избирательная химическая модификация), так и характер получаемой информации. Поэтому на сегодняшний день разумным компромиссом между интегративным и редукционистским подходами представляется более детальное биохимическое и физико-химическое изучение отдельных компонентов и доменов (таких, как изолированные субъединицы и достаточно протяженные фрагменты) этого рецептора; такой подход можно считать довольно плодотворным в приложении и к другим мембранным белкам.

Цель работы. Настоящая работа является частью проводимых в Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН комплексных структурно-функциональных исследований никотинового ацетилхолинового рецептора. Цель работы состояла в изучении конформации. а также структурных основ лиганд-рецепторного взаимодействия у функциональных доменов нАХР Torpedo caLíforníca. При этом решались следующие задачи: 1) характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов рецептора, разработка условий очистки и ренатурации рекомбинантных фрагментов al-209 (N-концевой внеклеточный домен) и 5313-455 ("цитоплазматическая петля" и спираль МА); 2) исследование с помощью спектроскопии КД вторичной структуры фрагментов в различных условиях; 3) изучение взаимодействия a-нейротоксинов и холинэргических лигандов с фрагментами a-субъединицы нАХР с помощью спектральных методов.

Научная новизна. Разработаны условия очистки и ренатурации рекомбинантных белков, включающих остатки 1-209 a-субъединицы или 313-455 5-субъединицы нАХР Т.calífornica. С помощью спектроскопии КД впервые даны количественные оценки содержания вторичных структур

в изолированных вне-• и внутриклеточном доменах нАХР, изучены эффекты детергентов и органических растворителей на конформацию этих рекомбинантных фрагментов. Посредством сопоставления спектральных данных для фрагментов с таковыми для интактного рецептора впервые продемонстрирована адекватность использования изолированных доменов в качестве моделей для изучения пространственной структуры нАХР. Для домена al-209 с помощью спектрофлюориметрии зарегистрированы изменения в микроокружении остатков Тгр при связывании лигандов.

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на 3-х чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино. 1996). Международном конгрессе по аналитической химии (Москва. 1997) и 16-й конференции Международного нейрохимического общества (Бостон, США, 1997).

По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных (гл. 1), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл. 2), экспериментальной части (гл. 3). выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 4&L страниц и включает Zi рисунков и JL таблиц; список литературы насчитывает М1 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Биохимическая характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Torpedo californica

Для исследования нами были использованы рекомбинантные и синтетические фрагменты, представляющие: 1) N-концевой внеклеточный домен a-субъединицы, ответственный за связывание холинэргических лигандов и инициирование открывания ионного канала (в том числе

Сокращения: МЛР - множественная линейная регрессия, МХХ -металлохелатная хроматография, HTII - нейротоксин II, a-Bgt -a-бунгаротоксин, CHAPS - 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-1--пропансульфонат, Dch-Na - дезоксихолат Na, LDA0 лаурилдиметиламин-М-оксид, MALDI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией посредством лазерной десорбции из матрицы, TFA трифторуксусная кислота, TFE -трифторэтанол

пептид, соответствующий консервативной "цистиновой петле"); 2) основной внутриклеточный домен 5-субъединицы, содержащий множественные сайты фосфорилирования и обеспечивающий таким образом пост-трансляционную регуляцию активности нАХР; 3) трансмембранные сегменты М2 и МЗ. вопрос о конформации которых активно дискутируется в литературе.

Препараты рекомбинантных белков al-209pET и al-209pQE. продуцируемых посредством гетерологичной экспрессии в Escherichia со И (векторы рЕТ22Ь(+) и pQE31. соответственно) и выделенных посредством МХХ (эта часть работы выполнена в нашей лаборатории Т.А.Алексеевыми к.х.н. А.Ф.Шевалье), практически гомогенны по данным электрофореза в SDS-ПААГ и MALDI-MS. Белок ai-209pET, полученный с использованием вектора секреции рЕТ22Ь(+), обладает молекулярной массой, на 2200 Да превышающей расчетную; как показало определение N-концевой аминокислотной последовательности. это связано с присутствием неотщепившейся лидерной последовательности.

На всех стадиях очистки/ренатурации нами проводился анализ гетерогенности/микрогетерогенности с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (офВЭЖХ) на колонках с фазой С4.

В большинстве случаев препараты белков al-209pET после выделения с помощью МХХ давали хроматографическую картину, свидетельствующую о микрогетерогенности. Однако эти препараты не содержали свободных SH-групп или содержали их в незначительном количестве; таким образом, в ходе экспрессии и/или выделения белков происходит спонтанное замыкание S-S-связей. Наблюдавшиеся в ходе хранения препаратов (4°С, до 3-х недель) изменения в хроматографических характеристиках, вероятно, связаны с медленным "перебором" вариантов дисульфидных связей. С целью изучения возможности получения препаратов белка с более высокой степенью хроматографической гомогенности нами были испробованы различные способы ренатурации фрагментов al-209. Однако ни восстановление белков в денатурирующих условиях с последующим удалением восстановителя и денатуранта, ни использование редокс-системы из восстановленного и окисленного глютатиона. ни применение метода, основанного на ренатурации в присутствии 2 мМ дитиотреитола. 2М мочевины и 20% метанола при рН 10,5. не привели к успеху: белок обычно по большей части (80-90%) преципитировался в ходе

ренатурации, причём оставшаяся в растворе часть белка по своим хроматографическим и биохимическим свойствам была аналогична исходному (спонтанно окисленному) препарату.

Более того, при обработке спонтанно окисленного белка а1-209рЦЕ белковой дисульфид-изомеразой не происходило существенного изменения хроматографического профиля и спектров КД; такая ситуация может рассматриваться как свидетельство термодинамической стабильности (и, следовательно, предполагаемой нативности) дисульфидных связей.

Т. о., учитывая вышесказанное, для дальнейших физико-химических исследований мы использовали препараты спонтанно окисленных белков а1-209, переведенные в соответствующий буфер гель-фильтрацией и имеющие хроматографический профиль без выраженной гетерогенности (см.. к примеру, рис.1). В некоторых случаях препараты белков

Объём элюции, мл

Рис.1. Аналитическая офВЭЖХ фрагмента а1-209рЕТ. Использовалась колонка Мис1еоз11 300-5 С4 МР№. Растворители: А -Н20 с 0.1% ТГА, Б - 80% СН3СН/20% Н2 0 с 0,1% ТГА; скорость потокг 0.5 мл/мин. Образец: 25 /и препарата белка в 50 мМ трис-НС1, рН 8. С (4,5 мг/мл).

разделялись на основной и минорный компоненты с помощью офВЭЮ (рис.2); для получения белка в водном буфере лиофилизированньй элюат перерастворялся в буфере с ЗОБ, после чего это" денатурирующий детергент "обменивался" на 0,5% ОсМа с помощы диализа. Изоформы белка в основной и минорной фракциях имею'

идентичные молекулярные массы (по данным электрофореза в БОБ-ПААГ и МАЮХ-МБ) и спектры триптофановой флюоресценции, поэтому в наших спектральных исследованиях мы использовали основные фракции (такие, как фракция 1 на рис.2).

I .... i ...■>..,. t , ... i . < . , i

О 20 40 60 80 .100 Объём элюции, мл

Рис.2. Препаративная офВЭЖХ рекомбинантного белка al-209pET. Использовалась колонка Nucleosll 300-7 С4. Растворители: А - Н20 с 0.1% TFA, Б - СН3СМ с 0.1% TFA; скорость потока 1 мл/мин. Образец: 1.2 мл препарата белка после МХХ (4,4 мг/мл).

Аффинная хроматография на иммобилизованных а-нейротоксинах является традиционным и высокоэффективным средством выделения нАХР из различных источников. Поэтому нами были проведены предварительные эксперименты по аффинной хроматографии рекомбинантного белка otl-209pET на HTII-агарозе. Показано, что сорбировавшаяся на носителе часть белкового препарата (примерно 20-25%. что согласуется с результатами по связыванию a-Bgt - см. ниже) может быть элюирована миллимолярными концентрациями декаметония (но не ацетилхолина). Такое сродство к этому агонисту согласуется с ранее опубликованными данными о том. что в случае изолированной a-субъединицы нАХР Torpedo и ее фрагментов декаметоний гораздо более эффективно ингибирует связывание a-Bgt. нежели карбамоилхолин (Tzartos и Changeux, 1983; Aronhelm и др.. 1988).

Гетерологично экспрессируемые белки зачастую подвержены олигомеризации. Для исследования состояния агрегации препаратов фрагментов al-209 мы использовали высокоэффективную гель-фильтрацию. В препаратах al-209pET и al-209pQE степень нековалентной агрегации сильно варьировала: в некоторых случаях присутствовали лишь мономеры и димеры. в других же проявлялись тетрамеры и более высокомолекулярные агрегаты.

Для анализа ковалентной (через межмолекулярные S-S-связи) агрегации использовалось сравнение электрофореграмм. полученных для восстановленных и невосстановленных образцов. В большинстве партий белка ковалентная агрегация отсутствовала.

Изучение равновесного связывания a-Bgt в растворе показало, что в препаратах al-209 15-30% молекул белка связывают токсин с Кд 100-200 нМ (показатели связывания варьируют для различных партий белков). Полученные величины Ка и Вмакс близки к соответствующим величинам, приведенным в литературе для синтетических и рекомбинантных фрагментов a-субъединицы. а также некоторых препаратов изолированной a-субъединицы Torpedo.

С целью более подробного сравнения лиганд-связывающих свойств домена al-209 с ранее исследованными другими фрагментами a-субъединицы, а также с изолированной a-субъединицей и интактнь» нАХР. нами для случая с al-209pQE было изучено ингибирование связывания a-Bgt декаметонием и d-тубокурарином. В эти> экспериментах были получены значения 1С50 8 мМ для декаметония i 200 дМ для d-тубокурарина. Величина 1С50 для декаметония (агониста) практически совпадает с таковой (7 мМ) у протеолитического 21 кДа-фрагмента (по-видимому, представляющего N-концевой домен) a-субъединицы нАХР T.marmorata (Tzartos и Changeux. 1984). Величин; 1С50 для d-тубокурарина (конкурентного антагониста) того же порядка, что и у различных синтетических и рекомбинантньс фрагментов a-субъединицы нАХР.

Т.о., изолированный (рекомбинантный) домен al-209 i значительной части обладает функциональными характеристикам] интактного нАХР T.californíca: это подтверждает его пригодность дл: физико-химических исследований.

Рекомбинантный фрагмент 5313-455 (исследование которог проводилось совместно с лабораторией проф. Ф.Хухо, Свободны университет Берлина) продуцировался и выделялся из клеток E.coli

использованием той же методики. что и фрагменты О1-209 (Т.А.Алексеев и к. х.н. А.Ф.Шевалье). Препарат после МХХ был практически гомогенен по данным электрофореза в БОБ-ПЛАН и МАЮ1-МБ. Этот белок растворим в буферах с умеренной концентрацией мочевины, однако при попытках убрать мочевину происходит преципитация. Нам удалось солюбилизировать фрагмент 5313-455 ступенчатым разбавлением препарата в 4М мочевине в присутствии неионного детергента ЬБАО с последующим диализом против буфера с 1% ЬБАО. Полученный препарат гомогенен по офВЭЖХ (рис.3). Успешной также оказалась очистка с помощью офВЭЖХ с последующей солюбилизацией как для фрагмента а1-209рЕТ.

0.007

о со

см <

0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0.000

80

60

40

Ш

20

О

10

70

20 30 40 50 60 Объём ЭЛЮЦИИ, МЛ

Рис.3. Аналитическая офВЭЖХ фрагмента 5313-455. Использовалась колонка Шс1еоз11 300-5 С4 МР№. Растворители: А -Н20 с 0.1% ТРА, Б - СН3 CN с 0.1% ТГА; скорость потока 1 мл/мин. Образец: 50 рш препарата белка в 20 мМ трис-НС1, рН 7.4. с 1% ЮАО (0.25 мг/мл).

Пептид 0125-145 (с Асш-защитой по тиольным группам Суэ) был синтезирован И.Л.Родионовым и дополнительно очищен нами посредством офВЭЖХ; его структура была подтверждена с помощью МАЦЛ-МБ. Пептид а236-267 (М2) с заменой Ме(;213-И1е и амидированной С-концевой карбоксильной группой был синтезирован Л.Д.Чикиным; его структура была подтверждена аминокислотным анализом и МАЫЛ-МБ. Пептид О277-301 (МЗ) был получен от проф. Дж.Б.Коэна; его структура была подтверждена масс-спектрометрически.

2. Вторичная структура фрагментов нАХР Torpedo californica по

данным спектроскопии КД

В качестве первого этапа изучения пространственной структуры изолированных доменов al-209 мы исследовали их вторичную структуру с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД); работа проводилась совместно с к.х.н. И.А.Куделиной (группа оптической спектроскопии. ИБХ). Спектроскопия КД в дальнем ультрафиолете является традиционным и хорошо разработанным методом оценки содержания вторичных структур в белках и пептидах. Однако, помимо таких преимуществ, как экспериментальная простота и большой накопленный фактический материал, этот спектральный метод имеет некоторые недостатки, мешающие количественной оценке содержания вторичных структур.

С целью получения корректных выводов о вторичной структуре мы предприняли следующие меры: 1) спектры КД анализировались с использованием семи методов, основанных на различных алгоритмах: при этом применялись пять различных наборов стандартных белков;

2) использовались как зависящие, так и не зависящие от концентрации методы: сравнение содержания вторичных структур проводилось для оценок, полученных при одинаковых диапазонах длин волн;

3) использовались два метода, включающие реперные спектры для вклада ароматических и дисульфидных хромофоров; 4) по данным спектрофотометрии, все использованные образцы были оптически однородны; для регистрации спектров КД использовались кюветы с коротким оптическим путем.

Для пептида СС125-145 в водном буфере единственная дихроичная полоса имеет максимум при -198 нм и отрицательный знак, что свидетельствует о преобладании неупорядоченной структуры; в то же время довольно низкая интенсивность этой полосы говорит также о наличии значительной доли других конформаций (таких, как p-структура) - см.рис.4, кривая 1. При переходе к буферу с 50% TFE спектр приобретает форму, характерную для белков класса "а+(5": появляется положительный эффект Коттона в области вокруг 190 нм. отрицательный максимум смещается к -204 нм. а отрицательна? амплитуда при 222 нм увеличивается в два раза (рис.4, кривая 2).

По данным анализа спектров КД пептида al25-14í концентрационно-независимой МЛР. в водном буфере у этого пептидг

CSI

5 Of-i

1 2

Рис.4. Спектры КД пептида (Х125-145: 1 - пептид в 10 мМ фосфате Na, рН 8.0; 2 -пептид в 5 мМ фосфате Na, рН 8.0, с 50% TFE.

190 200 210 220 230 240 Длина волны, нм

примерно половина остатков находятся в составе неупорядоченной структуры, а остальные - преимущественно в составе р-изгибов (табл.1). В присутствии 50% TFE содержание р-изгибов почти не меняется, а увеличение содержания а-спирали (на 20%) осуществляется за счёт соответствующего уменьшения содержания неупорядоченной структуры. По причине неопределённости в концентрации у этих препаратов мы не сочли корректным использовать для анализа данных спектров концентрационно-зависимые методы.

Согласно предсказаниям вторичной структуры (см., к примеру. Orteils, 1997), участок 125-145 а-субъединицы нАХР и других лигандоуправляемых ионных каналов (консервативная "цистиновая петля") содержит в основном p-структуру и/или нерегулярные структуры; учитывая отсутствие в нашем пептиде дисульфидной связи и низкую точность предсказательных методов, это не противоречит диапазону вторичной структуры для пептида <1125-145 в водной и водно-органической среде.

Спектры белков al-209pET (рис.5А. кривая 1) и ctl-209pQE (рис.5Б, кривая 1) в водном буфере характеризуются положительным эффектом Коттона в области 190-200 нм (с максимумом при -192 нм) и отрицательным в области 200-240 нм. причём интенсивности этих дихроичных полос примерно равны. Такой вид спектра говорит о преобладании p-структуры; однако высокая интенсивность дихроизма в довольно широкой области вокруг 215 нм свидетельствует о наличии "замаскированного" дублета с Х.иакс 208 и 222 нм, характерного для

Таблица 1

Содержание вторичных структур в рекомбинантных и синтетических фрагментах И-концевого внеклеточного домена сс-субъединицы нАХР Т. саИ/огп1са по данным спектроскопии КД

Фрагмент, буфер1/растворитель Содержание вторичных структур (%) согласно:

МЛР2-3 C0NTIN3 SELC0N24

а Р t R а Р t R а Р t R RMSD

01125-145: 10 мМ фосфат На. рН 8,0 5 мМ фосфат На. рН 8.0. с 50% TFE 9 31 0 0 38 49 53 20 5

al-209pET: 10 мМ фосфат Ма, рН 7.0 10 мМ фосфат Na. рН 8.0, с 0.5% Dch-Na 2 14 63 42 28 26 7 18 29±2 36+4 62+3 26+4 0 0 9±4 38±8 31 36 20 17 28 25 21 22 12 7

al-209pQE: 50 мМ трис-HCl, рН 8,0 10 мМ фосфат Na, рН 7.3. с 0.2% SDS 50% TFE/50% Н20 3 30 67 68 16 3 26 45 30 3 9 0 32±1 45±1 71±2 58+2 22+1 26+2 3±2 17±1 0 6+2 15±1 3+3 36 33 62 19 17 10 25 35 17 20 15 И 9 5 2

нАХР6 18 30 24 28 50±2 19+3 0 31+5

1 все буферы дополнительно содержали EDTA в концентрации 0.05-1 мМ; 2 множественная линейная регрессия по реперным спектрам, экстрагированным из набора стандартных белков Johnson'а-мл. (1990); 3 диапазон длин волн 190-240 нм; 4 диапазон длин волн 190-260 нм; 5 не определялось; 6 расчет по спектру нАХР T.californíca в 10 мМ фосфате Na. рН 7.4, с 90 мМ NaCl, 0,0625% азолектина и 0,5% холата Na. приведённому на рис.1 в статье Mlelke и Wallace'a (1988)

Рис.5. Спектры КД рекомбинантных белков al-209. A: al-209pET в 10 мМ фосфате Ма. рН 7.0 (1) и в 10 мМ фосфате Ма. рН 8.0. с 0,5% Dch-Na; Б: al-209pQE в 50 мМ трис-HCl, рН 8.0 (1), в 10 мМ фосфате Na. рН 7.3. с 0,2% SDS (2) и в 50% TFE/50% Н20 (3).

а-спиральной конформации.

Когда наши предварительные результаты были доложены на 16-й конференции Международного нейрохимического общества (см. список публикаций), появилась статья по экспрессии и КД-спектроскопическому исследованию рекомбинантного

гликозилированного белка,, соответствующего остаткам 1-210 а-субъединицы нАХР Mus msculus (West и др.. 1997); приведенный там спектр в сравнении со спектрами белков al-209pET и al-209pQE говорит о значительно меньшем содержании a-спиральной конформации в этом белке.

Спектры al-209pET не зависят от рН в диапазоне 7-8 и типа буфера, а также концентрации белка в диапазоне 0,6-4,5 мг/мл.

С целью более подробного изучения конформационных возможностей этих рекомбинантных фрагментов мы изучили влияние на спектры КД детергентов и органических растворителей. Цвиттерионный детергент CHAPS в концентрации 0.5-1% не вызывал больших изменений в спектрах КД белков al-209 (не показано). Присутствие же анионного неденатурирующего детергента Dch-Na (0,5%) приводило к

"демаскированию" перекрытых полос а-спирали при 208 и 222 нм в спектре КД ai-209pET (рис.5А. кривая 2): при этом спектр становится сходным с таковым для нАХР Т. californica, солюбилизированного в холате Na (Mlelke и Wallace, 1988). Значительно большее возмущение спектра КД вызывает анионный денатурирующий детергент SDS (0,2%) -рис.5Б. кривая 2: "голубой" сдвиг коротковолнового положительного эффекта Коттона и появление отрицательных полосы при -207 нм и "плеча" при -220 нм говорят о существенном увеличении содержания а-спиральной конформации. Ещё более выраженное преобладание а-спиральной конформации имеет место в 50% TFE (рис.5Б, кривая 3); это вполне согласуется с хорошо известным из литературы спиралеиндуцирующим эффектом этого органического растворителя.

Эти качественные оценки подтверждаются количественным анализом спектров КД рекомбинантных фрагментов al-209 (табл.1); для сравнения также приведены результаты нашего анализа для интактного нАХР Т. californica (Mlelke и Wallace. 1988). Приведены оценки, полученные с помощью методов анализа, обеспечивающих наилучшую аппроксимацию наших экспериментальных спектров.

Использование программы C0NTIN дает более высокие и значительно более однородные оценки содержания а-спирали (29-36%) для белков al-209 в водных буферах (включая случаи с неденатурирующими детергентами), нежели метод МЛР (2-14%). Оценки содержания p-структуры в этом случае близки к таковым для МЛР, в то время как р-изгибы, согласно C0NTIN, практически отсутствуют. Оцененные эффекты SDS и 50% TFE сходны с оценками по МЛР.

Программа SELC0N2 дает оценки содержания а-спиральной конформации. весьма близкие к таковым для программы C0NTIN. Оценки содержания p-структуры в 2-3 раза ниже; ранее в литературе отмечалось, что с данным набором стандартных белков программа SELC0N не очень хорошо подходит для анализа спектров КД белков с высоким содержанием p-структуры.

Резюмируя результаты анализа спектров КД различными методами, можно заключить, что рекомбинантные белки, включающие участок 1-209 a-субъединицы нАХР Г.californica, содержат 45-60% p-структуры и 30-35% a-спиральной конформации. Эта высокоупорядоченная вторичная структура является весьма стабильной по отношению к внешним воздействиям; добавочная чужеродная лидерная последовательность в случае белка al-209pET также существенно не возмущает конформацию.

Детергенты увеличивают содержание а-спиралей в белках а1-209 в следующем порядке: 303>дезоксихолат На>СНАРЗ=:буфер без детергентов. Такие эффекты детергентов вполне согласуются с данными из литературы. Спиралеобразующий потенциал белков а1-209 весьма велик: в присутствии 50% ТЕЕ дополнительно 30-40% белковой последовательности, в водном буфере входившие в состав р-структуры, приобретают а-спиральную конформацию.

Т.о., в И-концевом внеклеточном домене нАХР Т.саШогп1са (представленном рекомбинантными фрагментами а1-209) преобладает р-структура и в то же время имеется доля а-спиральной конформации, достаточная для формирования нескольких дискретных а-спиралей. Это может рассматриваться в качестве подтверждения

электронно-микроскопических данных (№Мп. 1993, 1995) о наличии во внеклеточной части каждой субъединицы нАХР Г. тагтогМа трёх а-спиралей.

Спектр КД белка 5313-455 (включающего т.н. "цитоплазматическую петлю" и амфипатическую спираль МА) в буфере с ОсЬ-Иа (рис.бА) характерен для белка, принадлежащего к классу "а+Р": имеется положительный эффект Коттона в области 190-197 нм. интенсивная отрицательная полоса с центром при -205 нм и менее выраженная отрицательная полоса с центром при -222 нм: при этом интенсивности дихроичных полос относительно невысоки. Спектр КД этого белка в буфере с неионным детергентом ЮАО аналогичен спектру в буфере с БсМа (не показано). Сравнивая спектры а1-209рЕТ (рис.5А, кривая 2) и 5313-455 (рис.бА), можно заключить, что последний белок обладает менее упорядоченной вторичной структурой. Спектры 5313-455 в 50% и 100% ТГЕ (не приведены) очень сходны со спектром а1-209р0Е в 50% ТГЕ.

Количественный анализ спектров КД (табл.2) показывает, что в водном буфере с ОсЬ-Иа рекомбинантный фрагмент 5313-455 содержит 18-26% а-спиральной конформации; МЛР не обнаруживает наличия р-структуры, однако согласно СОШН и ЗЕЬС0Я2 эта конформация присутствует в количестве 30-36%. Спиралеобразующий потенциал белка 5313-455. оцененный по содержанию а-спиралей в ТГЕ. практически равен таковому для белка а1-209р0Е.

Т.о.. нами с помощью спектроскопии КД впервые даны количественные оценки содержания вторичных структур в основном внутриклеточном домене нАХР: в рекомбинантном Фрагменте 5313-455

Рис.6. Спектры КД фрагментов, представляющих внутриклеточный трансмембранный домены.

А: 5313-455 в 10 мМ фосфате Na. pH 8.0. с 0,5% Dch-Na; Б: 0236-2( (1) и О277-301 (2) в TFE.

содержится -20% а-спиральной конформации, что достаточно д. формирования одной длинной (-33 остатка) или нескольких коротю а-спиралей. а ß-структура и/или ß-изгибы составляют 40-55%.

Мы также изучили вторичную структуру в TFE синтетичесю пептидов 0236-267(М2) и О277-301(МЗ) из последовательности это рецептора. Спектры КД приведены на рис.6Б. Для обоих спектр характерна интенсивная положительная дихроичная полоса в райо 190-200 нм (с центром -191 нм) и дублет перекрытых отрицательн полос с Хмакс -208 и -220 нм; это свидетельствует о выраженн преобладании а-спиральной конформации. Сходную форму и амплиту имеет спектр КД пептида 5М2 в TFE (01kl и др., 1990), а так спектры КД других трансмембранных пептидов в органическ растворителях и мицеллах SDS.

Результаты количественного анализа содержания вторичн структур в пептидах а236-267(М2) и a277-30l(M3) приведены в табл. для сравнения также даны оценки, полученные нами по pai-опубликованному спектру пептида 6М2. Во всех случаях расче свидетельствуют о преобладании (48-72%) а-спиральной конформащ

Таблица 2

Содержание вторичных структур в рекомбинантном фрагменте 5313-455 и синтетических фрагментах 0236-267(М2) и О277-301(МЗ) нАХР Т. caltforntca по данным спектроскопии КД

Фрагмент, буфер1/растворитель Содержание вторичных структур (%) согласно:

МЛР2 ■ 3 CONTIN3 SELC0N2*

а ß t R а ß t R а ß t R RMSD

5313-455:

10 мМ фосфат Na. pH 8.0. с 0.5% Dch-Na 26 0 36 38 19±1 36±2 18±2 27±1 18 30 27 25 11

TFE 60 6 30 4 67±3 24±4 0 8±5 58 13 20 9 1

СС236-267 (М2) В TFE6 60 0 40 0 72±1 13±1 5±1 11±1 58 13 22 7 3

5255-277(М2) В TFE7 59 0 41 0 58±3 40±3 2+5 0 51 15 20 14 9

O277-30KM3) В TFE6 48 0 37 15 67±1 22±2 0 11±2 я

как в табл. 1; 6 для расчета по программам С0ЫТ1Ы и БЕЬССШг спектры нормировались при Х=215 нм по спектру 5255-277; 7 расчет по спектру, приведенному на рис.1 в статье ОШ и др. (1990)

хотя для пептидов 6М2 и аМЗ характерна меньшая спирализованност Ранее посредством спектроскопии ЯМР было показано (Lugovskoy и др 1998). что пептид аМЗ в смеси СНС13:СН30Н(1:1) с 0,1М L1C1 содержит единственную а-спираль, тянущуюся с 279-го по 297 остаток (т.е. составляющую 76% последовательности).

Т.о.. нами с помощью спектроскопии КД продемонстрировано, ч последовательность аМ2 обладает более выраженным спиралеобразукж потенциалом, нежели последовательность аМЗ; это может име отношение к различиям в структурной роли этих трансмембранн сегментов нАХР Т.californica.

Имеется достаточно большое число работ, в которых вторичная, также третичная структура нАХР и других представителей семейст лигандоуправляемых ионных каналов предсказывалась с помои компьютерного моделирования. Нам представляется полезным сравм полученные в данном исследовании экспериментальные результаты соответствующими расчётными оценками, встречающимися в литературе

В табл.3 приведены полученные нами экспериментальные оцер вторичных структур в нАХР Т.cali fornica и его фрагментах, а та! расчетные оценки, сделанные в некоторых работах по предсказа! вторичной структуры этого рецептора.

Видно, что для изолированного домена ctl-209 с результат; предсказания a-спиралей лучше согласуются оценки. полученны< использованием программ CONTIN и SELC0N2, а с результат; предсказания р-структуры - оценки, полученные с использованием М. Наши экспериментальные данные могут служить подтверждением модел! предполагающих наличие во внеклеточных N-концевых доме: субъединиц нАХР T.californica консервативных амфипатичес антипараллельных р-листов (остатки с 87-го по 160-й).

Для участка 6313-455 предсказания вторичной структуры сил отличаются; наши экспериментальные оценки лучше согласуются результатами предсказания, сделанного Скоком с использован метода Птицына и Финкельштейна.

В случае пептидов, соответствующих трансмембранным сегмент с результатами предсказания вторичной структуры, сделанн Ortells'oM (1997), неплохо согласуются все наши оценки. В раб Скока участок a-субъединицы, соответствующий трансмембран сегментам М2 и МЗ, предсказан как состоящий в основном p-структуры (а также нерегулярных конформаций).

Таблица 3

Сопоставление экспериментально определенной и предсказанной вторичной структуры фрагментов нАХР Г.саИ/огп1са

Конформации, % (остатков)

последовательность

а Р R

al-209: эксперимент1 (МЛР) 14(35) 42(105) 44(113)

(C0NTIN) 36(91) 26(66) 38(96)

расчет FM&S (1984)2 30(63) 45(94) 25(52)

Скок (1985) 29(60) 42(88) 29(61)

Orteils (1997) 32(67) 44(91) 24(51)

5313-455: эксперимент3 (МЛР) 26(43) 0 74(121)

(C0NTIN) 19(33) 36(61) 45(70)

расчет Скок (1985) 32(46) 26(37) 42(60)

Orteils (1997) 69(99) 7(10) 24(34)

a236-267: эксперимент4 (МЛР) 60(19) 0 40(13)

(C0NTIN) 72(23) 13(4) 15(5)

расчет Orteils (1997) 63(20) 6(2) 31(10)

О277-301: эксперимент4 (МЛР) 48(12) 0 52(13)

(C0NTIN) 67(17) 22(5) 11(3)

расчет Orteils (1997) 52(13) 24(6) 24(6)

нАХР: эксперимент (МЛР) 18 30 52

(C0NTIN) 50 19 31

расчет FM&S2 (1984) 44 27 29

M&W (1988)5 26 27 47

Orteils (1997) 42 30 28

1 al-209pET в 10 мМ фосфате Na, рН 8.0. с 0,5% Dch-Na;

2 Finer-Moore и Stroud (1984); 3 5313-455 в том же буфере; 4 в TFE; 5 Mielke и Wallace (1988)

Что же касается интактного рецептора, то большинство предсказаний говорит о присутствии -40% а-спиральной конформации и -30% р-слоя. что лучше согласуется с нашими оценками, полученными по программе СОЯТШ.

Для проверки аддитивности вторичной структуры исследованных

нами фрагментов нАХР по отношению к вторичной структуре интактно рецептора мы рассчитали число остатков в той или иной конформации суммы Фрагментов а1-209рЕТ, 6313-455. 0236-267 и О277-301 и выч из полученных значений числа остатков в той или иной конформац для интактного нАХР. деленые на пять (число субьединиц в нАХР расчёты проводились согласно оценкам, представленным в табл. Разности, показанные на рис.7, свидетельствуют о том, что данн набор фрагментов удовлетворительно аппроксимирует вторичн структуру интактного рецептора (принимая во внимание отсутств вклада трансмембранных сегментов М1 и М4 и наличие в рекомбинантн фрагментах а1-209рЕТ и 6313-455 добавочных чужеродн последовательностей).

60 50 40 30 20 10 О -10 -20

о

0

1 -зо

£ -40 -50 -60 -70

а

ш

xW

ш

ш

щ

R

V77

'Ш

77-

El МЛР

CONTIN

Рис.7. Аддитивность сук

вторичных структ рекомбинантных

синтетических фрагмент

вторичной структ;

интактного ну Г. californica

3. Микроокружение остатков ароматических аминокислот рекомбинантных белках а1-209 и 6313-455

С целью более подробного изучения конформации изолирован функциональных доменов мы предприняли исследование микроокруже остатков Тгр (а также Туг) в фрагментах а1-209 и 6313-455 с помо спектрофотометрии и спектрофлюориметрии.

С целью улучшения разрешения использовались четвер производные спектров поглощения. Положение пиков, соответствую остаткам Тгр и Туг, в спектрах Фрагментов а1-209рЕТ и 6313-свидетельствует о том, что в первом из этих белков осте

ароматических аминокислот находятся в существенно более гидрофобном микроокружении, нежели во втором (спектры не приведены). В то же время сумма спектров фрагментов а1-209рЕТ и 5313-455 хорошо аппроксимирует спектр интактного мембрано-связанного нАХР (рис.8А), что свидетельствует в пользу близкого к нативному микроокружения остатков Тгр и Туг (а следовательно, и третичной структуры) в этих фрагментах.

60

50

. 40 ®

4 30

20

10

270 280 290 300 Длина волны, нм

320 340 360 380 Длина волны, нм

400

Рис.8. Спектры поглощения и испускания флюоресценции рекомбинантных фрагментов нАХР.

А - четвертые производные спектров поглощения мембрано-связанного нАХР Т.саШот1са в растворе Рингера (1) и суммы белков сс1-209рЕТ и 5313-455 в 10 мМ фосфате рН 8.0, с 0,5% БсЯ-Ма (2); Б -спектры испускания флюоресценции белка а1-209рЕТ в 10 мМ фосфате Иа. рН 8.0, с 0.5% ОсП-Иа (1) и в том же буфере с 6М СиС1.

Микроокружение остатков Тгр в фрагменте а1-209 было более подробно изучено нами с помощью флюоресцентной спектроскопии. На рис.9Б приведены спектры испускания флюоресценции рекомбинантного белка а1-209рЕТ, зарегистрированные в различных условиях. Видно, что в спектре, полученном в буфере с ОсМа (кривая 1). присутствуют два основных компонента - преобладающий с Хмакс -335 нм и менее выраженный ("плечо") с Хмакс -355 нм. Первый из этих компонентов соответствует "спрятанным" остаткам Тгр, в то время как

второй - экспонированным (Бурштейн, 1977). В присутствии 6М Gi (кривая 2) наблюдается сдвиг максимума испускания к 355 нм. х< остается заметным также и компонент при 335 нм; т.о., в э' условиях белок по большей части развернут, хотя все же сохраняв' остаточная вторичная/третичная структура.

Резюмируя, можно сказать, что наши данные о преимуществен) "спрятанности" остатков Тгр в N-концевом внеклеточном дом' а-субъединицы. полученные с помощью спектрофотометрии спектрофлюориметрии. не противоречат данным, полученным интактного нАХР Torpedo с помощью флюоресцентной спектроскопии спектроскопии комбинационного рассеяния.

4. Спектроскопическое исследование взаимодействия фрагмен N-концевого внеклеточного домена а-субъединицы с лигандами

На сегодняшний день нет полной ясности относител конформационных сдвигов в интактном нАХР. сопровождающих связыва лигандов. С помощью спектроскопии КД и спектрофлюориметрии н было изучено связывание низкомолекулярных лигандов а-нейротоксинов с фрагментами N-концевого внеклеточного дом а-субъединицы нАХР Т. calí fornica.

С помощью спектроскопии КД мы не смогли зарегистрироЕ сколько-нибудь значимых изменений во вторичной структ синтетического пептида 0125-145 при комплексообразовании с F (специфическое связывание HTII с этим пептидом было ранее пока: в нашей лаборатории). Мы также не смогли обнаружить каких-J изменений в спектрах КД рекомбинантного белка al-209pQE присутствии ацетилхолина. d-тубокурарина и a-Bgt. Это представляется удивительным в сйете того, что в большинстве рг опубликованных работ по изучению вторичной структуры интакт! НАХР низкомолекулярные лиганды, а также a-нейротоксины не вызьн статистически значимых изменений в конформации рецептора. 0д1 небольшие структурные сдвиги, конечно же, могут (и должны) ш место при связывании лигандов с внеклеточным доменом al-; Поэтому мы выполнили эксперименты по спектрофлюориметриче! детекции эффектов ацетилхолина и декаметония на микроокруж! остатков Тгр в рекомбинантном фрагменте al-209pET.

Спектры флюоресценции al-209pET в отсутствии и в присуто

лигандов показаны на рис.9. Видно, что присутствие ацетилхолина не вызывает каких-либо изменений в спектре, в то время как присутствие декаметония приводит к достоверному (~10%-ному) увеличению интенсивности флюоресценции без заметных изменений в форме спектра. Такого рода изменение спектра связано со снятием "тушения" эмиссии у некоторых остатков Тгр (Бурштейн, 1977).

70

60 ® 50

с

40

30

320 340 360 380 Длина волны, нм

Тот-факт, что декаметоний вызывает локальный конформационныи сдвиг в рекомбинантном фрагменте О1-209, а ацетилхолин - нет, не вызывает удивления в свете того, что декаметоний, но не ацетилхолин, способен вызывать десорбцию О1-209 с НТП-агарозы; достаточно высокая аффинность декаметония к этому белку подтверждена также в эксперименте по ингибированию связывания (см. выше).

В условиях, аналогичных таковым для холинэргических лигандов. нами также был изучен эффект пептидного постсинаптического токсина а-конотоксина 01: наблюдавшиеся изменения в форме спектра свидетельствуют о некотором увеличении доли экспонированных остатков Тгр (спектр не приведен).

Т. о., наши спектроскопические результаты показывают, что при связывании с декаметонием и а-конотоксином 01 рекомбинантный фрагмент 1-209 а-субъединицы нАХР Т.саШогп1са претерпевает

Рис.9. Спектры испускания флюоресценции белка

al-209pET в 10 мМ фосфате Na, pH 8.0, с 0.5% Dch-Na без лигандов (1). с 1 мМ ацетилхолином (2) и с 1 мМ декаметонием (3)

локальные конформационные сдвиги, отличающиеся по своему характер это согласуется с различными фармакологическими свойств; декаметония (агониста) и а-конотоксина (конкурента

антагониста) и служит хорошим побудительным мотивом для дальней!; структурно-функциональных исследований этого фрагмента.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы хроматографической очистки, ренатурации л характеристики рекомбинантных белков, включающих остатки 1-209 (внеклеточный лиганд-связывающий домен) а-субъединицы или 313-455 (основной внутриклеточный домен) б-субъединицы нАХР T.californtca. Полученные высокоочищенные препараты связывают а-нейротоксины и низкомолекулярные лиганды и пригодны для физико-химических исследований.

2. Посредством спектроскопии КД даны количественные оценки содержания различных вторичных структур во вне- и внутриклеточном доменах нАХР: первый из них (представленный фрагментами al-209) содержит 30-35% a-спиральной конформации и 45-60% p-структуры, в то время как второй (представленный фрагментом 5313-455) - примерно 20% a-спирали и 25-35% p-структуры.

3. С помощью спектроскопии КД и спектрофлюориметрии исследованы структурные основы взаимодействия лигандов с нАХР; показано, что участки связывания a-нейротоксинов и холинэргических лигандов включают остатки триптофана N-концевого внеклеточного домена a-субъединицы нАХР T.callfornlca.

4. Посредством сопоставления спектральных данных для фрагментов al-209, a236-267, О277-301 и 5313-455 и для интактного нАХР продемонстрирована адекватность использования рекомбинантных фрагментов al-209 и 5313-455 в качестве моделей для исследования пространственной структуры нАХР.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следуюи

публикациях:

1. Utkin Yu., Shevaller А.. Alexeev Т.. Telyakova 0.. Krlvoshf A.. Tsetlln V. Use of HPLC and mass-spectrometry í characterization of genetically produced acetylcholine recept domalns//Internatlonal Congress on Analytical Chemistry (Moscc Russia, June 15-21, 1997). Abstracts. P-24

2. Tsetlln V., Shevaller A.. Alexeev Т., Telyakova 0., Krlvoshe A., Utkln Yu.. Vincent A.. Beeson D.. Methfessel C. Purifícate of the acetylcholine receptor a-subunlt domains, expressed E.coli // J.Neurochem. 1997. Vol. 69 Suppl. S121

3. Кривошеин А. В., Куделина И. А., Алексеев Т. A., Шевалье А. <3 Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Вторичная структура фрагмент а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Torpt californica // Биоорган.химия. 1998. Т.24. N 12. С.945-947

4. Alexeev Т.. Krlvosheln A.. Shevaller A.. Kudellna I.. Telyakc 0.. Vincent A.. Utkln Yu., Hucho F., Tsetlln V. Physico-chemlc studies on the N-termlnal domain of the Torpedo acetylchol] receptor a-subunit expressed in Escherichia со Li // Europe Journal of Biochemistry (в печати)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

КРИВОШЕИН АРКАДИЙ ВИКТОРОВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ДОМЕНОВ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Torpedo californica

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных

и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук Ю.Н.Уткин,

доктор химических наук, проф. А.С.Арсеньев

Москва - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................. 4

ВВЕДЕНИЕ ............................ 6

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ...................... 8

1.1. Общие представления о структуре и функции никотинового ацетилхолинового рецептора ................... 8

1.2. Изолированные субъединицы и пептидные фрагменты как модельные системы в исследованиях структуры никотинового ацетилхолинового рецептора...........................15

1.3. Изучение пространственной структуры нАХР и его доменов/фрагментов с помощью физико-химических методов ..... 22

1.3.1. Электронная микроскопия ................. 22

1.3.2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) .... 24

1.3.3. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) 26

1.3.4. Инфракрасная (ИК-) спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) ................. 29

1.3.5. Спектроскопия кругового дихроизма (КД) ......... 37

1.3.6. Люминесцентная спектроскопия и другие оптические методы 46

1.4. Заключение........................52

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................53

2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Т .calif omica.................53

2.1.1. Подтверждение структуры и частичная характеристика синтетических пептидов ..................... 53

2.1.2. Очистка и характеристика рекомбинантных белков, включающих участки N-концевого внеклеточного домена й-субъединицы ..... 54

2.1.2.1. Подтверждение структуры ................ 54

2.1.2.2. Хроматографические и коллигативные свойства, ренатурация..........................56

2.1.2.3. Лиганд-связывающие свойства .............. 68

2.1.3. Характеристика и очистка рекомбинантного белка, включающего участок Ó313-455 ........................ 69

2.2.Вторичная структура рекомбинантных и синтетических фрагментов нАХР Torpedo californica по данным спектроскопии КД ...... 72

2.2.1. Вторичная структура фрагментов N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы......................72

2.2.2. Вторичная структура рекомбинантного белка, представляющего основной внутриклеточный домен 5-субъединицы .......... 85

2.2.3. Вторичная структура пептидов, соответствующих трансмембранным сегментам СС-субъединицы............88

2.2.4. Соотнесение вторичной структуры фрагментов нАХР с вторичной структурой интактного рецептора ................................90

2.3. Микроокружение остатков ароматических аминокислот в рекомбинантных белках СС1-209 и 6313-455 ........................95

2.4. Спектроскопическое исследование взаимодействия фрагментов N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы с лигандами. . . 100 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ....................................104

3.1. Синтетические пептиды ....................................104

3.2. Рекомбинантные белки ......................................104

3.3. Мембрано-связанный нАХР Torpedo californica ..............105

3.4. Препаративная офВЭЖХ ......................................105

3.5. Ренатурация рекомбинантных белков СС1-209 ..................105

3.6. Аффинная хроматография рекомбинантных белков GC1-209 на HTII-агарозе ..................................................106

3.7. Ренатурация рекомбинантного белка 6313-455 ................106

3.8. Определение концентрации белков и пептидов ................106

3.9. Электрофорез в SDS-ПААГ.................107

3.10. Аналитическая ВЭЖХ...................108

3.11. Масс-спектрометрия ......................................108

3.12. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 108

3.13. УФ-спектрофотометрия ....................................109

3.14. Флюоресцентная спектроскопия ............................109

3.15. Спектроскопия КД....................109

3.16. Анализ спектров КД...................110

3.17. Определение связывания лигандов с рекомбинантными белками ai-209 ............................Ill

3.18. Химикалии, расходуемые материалы и бактериальные штаммы . 112

ВЫВОДЫ............................113

БЛАГОДАРНОСТИ ..................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..............................................115

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДМСО - диметилсульфоксид

ДОВ - дисперсия оптического вращения

КД - круговой дихроизм

KP - комбинационное рассеяние

м.д. - миллионные доли

МЛР - множественная линейная регрессия

МХХ - металлохелатная хроматография

нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор

н.о. - не определялось

н.у. - не указано

HTA - нитрилотриацетат

HTII - нейротоксин II из яда Naja naja oxiana

ß-ОГ - ß-октилглюкозид

офВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ

ПААГ -полиакриламидный гель

РСА - рентгеноструктурный анализ

у.е. - условные единицы

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ACh - ацетилхолин Асш - ацетамидометил

вмакс " максимальное число участков связывания (X-Bgt - (Х-бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus Carb - карбамоилхолин

Cbt - кобротоксин из яда Naja naja atra

(X-Cbt - (Х-кобратоксин из яда Naja naja siamensis

CH - холестерин

CHAPS - 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат

CPZ - хлорпромазин

Deca - декаметоний

DEPC - диэлаидоилфосфатидилхолин

DOPA - диолеилфосфатидная кислота

DOPC - диолеоилфосфатидилхолин

DTE - дитиоэритритол

DTNB - 5,51-дитио-бис(-2-нитробензойная кислота)

DTT - дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетраацетат

EGTA - этиленгликоль-бис(£-аминоэтиловый эфир)

N,N,N 1,N!-тетраацетат Еа - эрабутоксин а из яда Laticauda semifasciata

ESI-MS - масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией

(англ. "electrospray ionization mass-spectrometry") FITC - флюоресцеинизотиоцианат GSH - восстановленный глютатион GSSG - окисленный глютатион GuCl - хлорид гуанидиния

HEPES - N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N1 -[4-бутансульфоновая кислота]

Неха - гексаметоний

I - интенсивность

1фЛ - интенсивность флюоресценции

1С50 - концентрация соединения, при которой происходит 50%-ное

ингибирование связывания лиганда Kd - равновесная константа диссоциации LDAO - лаурилдиметиламин-Ы-оксид ^-возб ~ длина волны возбуждающего света 1ИСП - длина волны испускаемого света

^макс ~ длина волны, соответствующая максимальной амплитуде мрасч ~ расчётная молекулярная масса

MALDI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией посредством лазерной десорбции из матрицы (англ. "matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry") MIR - главный иммуногенный регион (англ. "main immunogenic region") NPS - нитрофенилсульфенил PA - фосфатидная кислота PC - фосфатидилхолин PCP - фенциклидин SDS - додецилсульфат натрия Tc - время вращательной корреляции

TAPS - Ы-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновая кислота TES - Ы-трис[гидроксиметил]метил-2-аминоэтансульфоновая кислота Tet -тетракаин

TFA - трифторуксусная кислота TFE - трифторэтанол

TRITC - тетраметилродаминизотиоцианат dTc - d-тубокурарин

Тх СС - токсин (X из яда Naja nigricollis

ВВЕДЕНИЕ

Исследования нейрорецепторов на молекулярном уровне с 1970-х годов являются бурно развивающейся областью физико-химической биологии, которая вызывает большой интерес как в академическом, так и в прикладном плане.

Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналы; наиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны (см. обзоры [1-7]). За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все существующие биохимические и физико-химические методы. Однако размер (~270 кДа) и сложность (интегральный мембранный гетероолигомерный (О^Р^б) белок с различными посттрансляционными модификациями) этого белка ограничивают как приложимость к нему многих высокоразрешающих методов (таких, как РСА, спектроскопия ЯМР, избирательная химическая модификация), так и характер получаемой информации. Поэтому на сегодняшний день разумным компромиссом между интегративным и редукционистским подходами представляется более детальное биохимическое и физико-химическое изучение отдельных компонентов и доменов (таких, как изолированные субъединицы и достаточно протяжённые фрагменты) этого рецептора; такой подход можно считать довольно плодотворным в приложении и к другим мембранным белкам ( см., к примеру, [8-10]).

Целью данной диссертационной работы являлись физико-химические исследования функциональных доменов никотинового ацетилхолинового рецептора, представленных семью рекомбинантными и синтетическими фрагментами рецептора Torpedo californica, с помощью методов оптической спектроскопии. В качестве необходимой предпосылки для физико-химических (спектральных) исследований нами была проведена большая работа по очистке/ренатурации и хроматографической и биохимической характеристике этих фрагментов, что позволило получить высокоочищенные препараты с достаточно высокой концентрацией. Спектральные исследования проводились в нескольких направлениях:

1) развёрнутое КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофлюориметрическое и спектрофотометрическое

изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантных белков (Х1-209 и синтетического пептида 0С125-145, представляющих N-концевой внеклеточный (лиганд-связывающий) домен (Х-субъединицы;

2) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофотометрическое изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантного белка Ö313-455, представляющего основной внутриклеточный домен ("цитоплазматическая петля" и амфипатическая спираль МА); этот домен играет важную роль в пост-трансляционной регуляции активности рецептора;

3) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры синтетических пептидов СС236-267 (М2) и (Х277-301 (МЗ) в трифторэтаноле;

4) изучение структурных основ лиганд-рецепторного взаимодействия для изолированного домена (XI-209 с помощью спектрофлюориметрии.

Рекомбинантные фрагменты продуцировались в нашей лаборатории Т.А.Алексеевым, к.х.н. А.Ф.Шевалье и О.В.Теляковой. Исследование фрагмента Ö313-455 проводилось совместно с лабораторией проф. F.Hucho (Свободный университет Берлина, Германия). Пептид (Х125-145 был синтезирован к.х.н. И.Л.Родионовым, пептид (Х236-267 Л.Д.Чикиным; пептид (Х277-301 был любезно предоставлен проф. D.В.Cohen'ом. КД-спектроскопические и спектрофлюориметрические эксперименты были выполнены совместно с к.х.н. И.А.Куделиной .

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И ФУНКЦИИ НИКОТИНОВОГО

АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА

Синаптическая передача лежит в основе функционирования нервной системы. Как известно, по механизму передачи сигнала синапсы подразделяются на химические и электрические, а по типу передаваемого сигнала (эффекту) - на возбуждающие и тормозные. Среди химических синапсов важнейшее значение имеют холинэргические синапсы, в частности чувствительные к никотину. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Н-холинорецепторы) играют основную роль в возбуждении (деполяризации) мембран мышечных клеток, а также участвуют в передаче возбуждения (а иногда и торможения) между нейронами (в частности, во вставочных нейронах спинного мозга).

Все никотиновые ацетилхолиновые рецепторы обладают

определёнными фармакологическими свойствами, такими, как связывание агонистов (ацетилхолина и его аналогов, никотина, некоторых ониевых оснований), конкурентных (d-тубокурарина, некоторых ониевых оснований, ОС-нейротоксинов) и неконкурентных (фенциклидина, местных анестетиков) ингибиторов, и являются пентамерными интегральными мембранными белками, формирующими катион-селективный

трансмембранный ионный канал (см. обзоры [4-7]).

К началу 1980-х гг. с помощью различных химических и физико-химических методов была однозначно установлена четвертичная структура нАХР из электрического органа Torpedo: этот олигомерный белок состоит из пяти мономеров, а именно двух СС-субъединиц (кажущаяся М при электрофорезе в SDS-ПААГ 40 кДа), {3-субъединицы (48 кДа), ")(-субъединицы (60 кДа) и 6-субъединицы (65 кДа) . Все субъединицы являются гликопротеинами, и в сумме олигосахаридные структуры рецептора составляют ~20 кДа; функциональная роль гликозилирования нАХР на сегодняшний день не вполне ясна, хотя, согласно некоторым работам, дегликозилирование изменяет характер связывания (Х-нейротоксинов [11]. В мембране рецептор находится в виде ковалентных димеров, образованных посредством дисульфидных связей через остатки Cys 5-субъединиц. Помимо того, с внутриклеточной стороны с рецептором в эквимолярной пропорции ассоциирован т.н. белок 43 кДа (иначе ОС'-субъединица, -субъединица, рапсин); считается, что он опосредует группирование

молекул рецептора в мембране и обеспечивает связь с цитоскелетом. На рис.1 показана общая трёхмерная структура молекулы нАХР Torpedo, суммирующая данные, полученные на сегодняшний день с помощью различных методов.

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы мышечного типа из самых разнообразных источников имеют такую же четвертичную структуру, что и белок из Torpedo (т.к. электрогенная ткань эволюционировала из мышечной); однако рецепторы нейронов характеризуются иной субъединичной структурой: они являются пентамерами, состоящими из двух типов субъединиц (СС-субъединиц и не-СС-субъединиц) , или даже гомопентамерами.

Нуклеотидные последовательности кДНК для всех четырёх субъединиц (ОС, ß, б) нАХР из электрического органа калифорнийского гнюса Torpedo californica были определены в первой половине 1980-х гг. в лаборатории Numa [12-14]. В течение последующих полутора десятилетий были установлены нуклеотидные последовательности кДНК и генов для большого количества других нАХР. Особенности первичной структуры субъединиц позволили отнести нАХР к надсемейству лигандоуправляемых ионных каналов (рецепторов типа А). Эти особенности включают наличие в каждой субъединице высокогомологичных гидрофобных трансмембранных сегментов (обычно обозначаемых как М1-М4), внеклеточного N-концевого домена с короткой консервативной "петлёй", ограниченной дисульфидной связью, и протяженной цитоплазматической "петли" между трансмембранными сегментами МЗ и М4 (см. рис.2А).

Молекулярно-филогенетический анализ эволюционных

взаимоотношений в семействе лигандоуправляемых ионных каналов свидетельствует о том, что эти рецепторы имеют общее происхождение, а белок-"предок", возможно, был прокариотическим порообразующим белком [15].

Посредством пептидного картирования с "проявлением"

электрофореграмм (Х-нейротоксинами, химической модификации,

сайт-направленного мутагенеза, а также предсказательных,

иммунохимических и спектральных методов была установлена локализация в молекуле нАХР (особенно в СХ-субъединице нАХР Torpedo) различных функциональных доменов (рис.2Б).

При аутоиммунном заболевании Myasthenia gravis происходит выработка антител к нАХР; многочисленные иммунологические и иммунохимические эксперименты показали, что главный иммуногенный регион (MIR) локализован на участке 48-76 ОС-субъединицы (см. обзоры

Рис.1. Консенсусная модель общей пространственной структуры нАХР Torpedo (из обзора [7]).

Расположение субъединиц (в том числе (Х-субъединиц, входящих в состав высокоаффинного ((Хн) и низкоаффинного (CCL ) сайтов связывания лигандов) дано согласно результатам экспериментов по фотоаффинному мечению; электронная микроскопия даёт другое расположение (см. п/разд.1.3.1). Показаны олигосахаридные остатки, участки

фосфорилирования, трансмембранные каналообразующие сегменты М2. Обозначена топология связывания (Х-нейротоксинов.

[16,17]). Электронная микроскопия свидетельствует, что участок СС67-76 расположен на верхнем конце внеклеточного домена ОС-субъединицы.

Эксперименты по аффинной химической модификации

О (У О О

свидетельствуют в пользу того, что остатки Тгр и Туг

ОС-субъединицы участвуют в связывании агонистов/конкурентных антагонистов (см. [7]).

Многие работы свидетельствуют, что участок последовательности

1 Р Я 14?

(Х-субъединицы, ограниченный дисульфидной связью Суэ -Суэ , вовлечён в связывание (Х-нейротоксинов (в особенности "короткого" типа) и низкомолекулярных лигандов [18-20]. Однако основной

А

АСНЯ

СО

ТГ

л

САВА.Я

01уЯ

СС

-тГ

_±_±_

с с

"СГ

_±1

СС

ТГ

Рис.2. Особенности первичной и вторичной структуры нАХР как представителя лигандоуправляемых ионных каналов.

А: схематическое представление аминокислотных

последовательностей лигандоуправляемых ионных каналов (из [7]); обозначены сигнальные пептиды (ЭР), трансмембранные сегменты М1-М4, внеклеточные домены (ЕБ) и в них "цистиновые петли", характерные для лиганд-связывающих £Х-субъединиц, и сайты гликозилирования.

Б: консенсусная модель первичной и предсказанной вторичной структуры нАХР мышечного типа (из [4]): * - сайт Ы-гликозилирования, ** - заряженные остатки в сегменте М2, мутации по которым влияют на ионную проводимость, чёрные квадраты гидрофобные остатки во внеклеточном домене, пунктирные линии -вариабельные по длине последовательности, стрелки - экзон-интронные границы (в однобуквенном коде обозначен