Синтетические пептиды, взаимодействующие с различными типами холинорецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

Хрущев Алексей Юрьевич

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ.

Специальность: 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2011

1 4 ДПР 2911

4843767

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН В.И. Цетлин, кандидат химических наук М.Н. Жмак.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Г.А. Коршунова доктор химических наук, профессор Л.Д. Румш

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова

..йС

Защита диссертации состоится 20 апреля 2011 г. в 7. часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « /г» 2011 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Нарушение работы некоторых подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) может вызывать или быть следствием ряда заболеваний, таких как мышечные дистрофии (миастении) и некоторые виды эпилепсии. Также была показана взаимосвязь между шизофренией, болезнями Альцгсймера, Паркипсона и нарушением в уровне определенных подтипов пейрональных нАХР, что диктует необходимость изучения структуры и механизмов функционирования этого класса лиганд-угтравляемых каналов. Для проведения подобных исследований необходимо иметь адекватные инструменты, которыми являются пептидные и белковые нейротоксины, выделенные из различных природных источников. Значительный вклад в понимание механизмов передачи нервного импульса был сделан в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и IO.A. Овчинникова РАН благодаря использованию нейротоксипов из ядов змей и членистоногих. В последнее время появилась задача различать особенности отдельных подтипов рецепторов, и для этого необходимо использовать более «тонкие» инструменты. Так, в случае нАХР такими инструментами являются а-конотоксины, обладающие уникальной способностью различать не только нейрональпые и мышечные типы рецепторов, но также их подтипы и даже разные участки связывания на рецепторе. а-Конотоксины - небольшие пептиды, выделенные из ядов хищных морских моллюсков Conus, содержащие 12-22 аминокислотных остатка и две дисульфидные связи. Поскольку выделение значительных количеств индивидуальных пептидных компонентов из яда моллюсков Conus является достаточно сложной задачей, а-конотоксины и их аналоги получают методами пептидного синтеза.

Цели и задачи работы. Целью настоящего исследования являлась разработка эффективных подходов к синтезу а-конотоксинов, а также получение новых биологически активных синтетических аналогов а-конотоксинов для исследований нАХР. При этом решались следующие задачи: 1. Выбор оптимальных условий замыкания дисульфидных связей; 2. Получение ряда а-конотоксинов в препаративных количествах; 3. Изучение взаимосвязи между структурой и биологической активностью а-конотоксинов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны эффективные схемы синтеза препаративных количеств природных а-конотоксинов и их аналогов. Практическая ценность разработанных методик заключается в достижении максимальных выходов реакций синтеза а-конотоксинов. Методические подходы к синтезу пептидов, содержащих две дисульфидные связи, разработанные в рамках данной диссертационной работы, могут быть использованы в синтезе не только а-конотоксинов, но и для получения других биологически активных коротких пептидов, содержащих две дисульфидные связи - таких, как апамины или эндотелины. Получены два новых аналога а-конотоксина PnIA, которые показали более высокое сродство, чем природный пептид, к а7 нАХР и к модели лиганд-связывающего домена нАХР - ацетилхолин-связывающему белку (АХСБ) А. californica. Показано, что увеличение длины первой цистеиновой петли

1

а-конотоксина MI не приводит к переключению специфичности с нАХР мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального а7 нАХР человека. С использование;« молекулярного моделирования и последующего синтеза были получены аналоги а-конотоксина PnIA, обладающие повышенной селективностью к АХСБ из А. californica. С помощью синтезированных изомеров а-конотоксина Tmil и его аналога [WlOYJImll было впервые показано наличие дополнительного участка связывания на Torpedo нАХР, отличного от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Апробация работы. Результаты настоящего исследования доложены на ряде российских и международных симпозиумов: на VI и VII Летней нейропептидной конференции Европейского нейропептидного клуба (Зальцбург 2009 и Печ 2010., соответственно), на XXI зимней молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009), на конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.-Петербург, 2009), на совещании «Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении» (Москва, 2010).

Объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, состоит из введения, 3 глав и выводов, содержит 19 рисунков, 8 таблиц, в списке литературы цитировано 181 название. В глава I приведен обзор литературных данных по исследованию никотинового ацетилхолинозого рецептора с помощью а-конотоксинов и их аналогов, а также приведены данные по химическому синтезу а-конотоксинов. В главе II содержатся результаты исследований и их обсуждение, в главе III изложены экспериментальные методы.

Обсуждение результатов.

а-Конотоксины - небольшие пептиды, содержащие 12-22 аминокислотных остатка, выделенные из морских улиток семейства Conus. Жесткость структуры этих пептидов обеспечивается двумя дисульфидными связями, соединяющими 1-3 и 2-4 остатки цистеина:

XioC'y¿X3.4C3X3,5.7(p4Xo.3

где X - любые аминокислотные остатки, в подстрочном индексе указано их возможное число, С1,2,3,4 - остатки цистеина, С-концевой остаток большинства а-конотоксинов амидирован. Задача разработки методов синтеза а-конотоксинов продиктована тем, что эти пептиды присутствуют в яде Conus в очень небольших количествах, тогда как для проведения структурно-функциональных исследований самих а-конотоксинов, a также для изучения

механизмов их взаимодействия с АХР1, требуются препаративные количества этих пептидов. С помощью химического синтеза, на основании методов молекулярного моделирования и/или эмпирического анализа последовательностей, можно получать разнообразные аналоги а-конотоксинов, которые могут превосходить природные пептиды по эффективности и/или избирательное™ действия. Химический синтез также позволяет получать аналоги, содержащие модифицированные аминокислотные остатки.

Несмотря на то, что современные методы твердофазного синтеза позволяют получать пептиды, содержащие более 100 аминокислотных остатков и с этой точки зрения синтез линейной последовательности а-конотоксинов не представляет больших трудностей, однако наличие двух дисульфидных связей в а-конотоксинах значительно усложняет синтез и требует тщательного подбора как стратегии синтеза, так и методов, применяемых на каждой стадии синтеза.

Особенности синтеза а-конотоксинов.

В синтезе а-конотоксинов используют два подхода к замыканию дисульфидных связей. Наиболее часто в литературе встречаются примеры синтеза с поэтапным замыканием дисульфидных мостиков. Особенность этого метода заключается в использовании защитных групп, удаляемых в разных условиях (ортогональных) для двух пар цистеинов (первый-третий, второй-четвертый), образующих впоследствии две дисульфидные связи. При этом для защиты тиолыгых функций первой пары остатков цистеина используют кислотолабильные группы (Ш1 -группа в случае Ртос-схемы защитных групп), которые удаляют при деблокировании пептида вместе с остальными защитными группами. После удаления защитных групп проводят замыкание первой дисульфидной связи. Вторую пару остатков цистеина защищают кислотостабильными группами (например, Аст или ©и1), которые удаляют селективными реагентами, при этом часто выбирают условия синтеза, при которых происходит одновременное образование второй дисульфидной связи. Основным недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта, составляющий не более 10% в расчете на стартовую аминокислоту. Однако, эта стратегия имеет очевидное достоинство: в результате синтеза получается индивидуальное соединение с известным расположением дисульфидных связей.

Вторым подходом, используемым при синтезе а-конотоксинов, является одновременное замыкание двух дисульфидных связей. Отличительной чертой этого метода является использование кислотолабильных защитных групп для обеих пар остатков цистеина.

Принятые сокращения: Тп - тритил-; Аст - ацетамидометил-; гВи - третбутил-; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; АХР - ацетилхолиновый рецептор; АХСБ - ацетилхолин-связывающий белок; аВ$ - а-бунгаротоксин.

В результате деблокирования образуется линейный пептид, содержащий 4 свободные сульфгидрильные группы. В результате одновременного замыкания сразу двух дисульфидных связей часто образуются 3 изомера.

При этом показано, что в случае «природных» а-конотоксинов в качестве основного продукта образуется изомер с природным расположением дисульфидов, тогда как аналоги токсинов, содержащие одну или более аминокислотных замен, часто образуют смесь изомеров, без преобладания какого-либо продукта. Это приводит к необходимости использования дополнительных методов анализа для определения порядка замыкания дисульфидных связей. Однако, главным достоинством этого метода является высокий выход целевого продукта, который составляет 30-50% в расчете на стартовую аминокислоту.

В результате выполнения данной работы были разработаны оптимальные условия получения препаративных количеств природных а-конотоксинов и их аналогов. Наибольшие выходы целевого продукта получены при синтезе с одновременным замыканием дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных tBu-групп на остатках цистеина в положениях Cys1 и Cys3 приводит к увеличению выхода а-конотоксина RglA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы расположены в положениях Cys2 и Cys4. В синтезе [Y10]ImII для удаления tBu-защитных групп и одновременного образования дисульфидной связи мы использовали трифторанетат таллия. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения часто образуются при замыкании дисульфидных связей раствором трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость высокоэффективного метода замыкания дисульфидных связей с применением трифторацетата таллия. Благодаря использованию роботизированного пептидного синтезатора в одновременном синтезе серии аналогов а-конотоксиноз удалось значительно уменьшить время синтеза, а также сделать процесс более экономичным. Это открывает новые возможности в исследовании структурно-функциональных особенностей а-конотоксинов.

Выбор последовательностей а-конотоксинов для синтеза.

Природные а-конотоксины, такие как Gl и MI, проявляют высокую избирательность к нАХР мышечного типа. Большая группа а-конотоксинов специфически блокирует нейрональные нАХР, однако, они очень редко избирательны по отношению к какому-либо определенному подтипу нейрональных АХР. Данная работа является частью структурно-функциональных исследований никотиновых рецепторов, проводимых в Отделе молекулярных основ нейросигнализации ИБХ РАН. Важным этапом является детальный анализ взаимодействия рецептора с пептидными и

белковыми нсйротоксинами. Объектами исследования являются нАХР мышечного типа из электрического органа ската Torpedo califomica, нейроналышй «7 нЛХР, нарушение деятельности которого связано с такими пейродегенеративными заболеваниями как болезнь Альнгеймера, а также а9 нАХР, антагонисты которого рассматриваются как потенциальные анальгетики. Ранее, в результате совместного проекта нашей лаборатории с Нидерландским институтом рака, была установлена кристаллическая структура комплекса аналога а-конотоксина PnlA с адетилхолин-связывающим белком (АХСБ) A. califomica. В настоящее время в нашей лаборатории продолжаются работы по исследованию взаимодействия а-конотоксинов и их аналогов с ацетилхолин-связывающими белками, которые являются моделями лиганд-связывающих доменов холинорецептора. Таким образом, задачей диссертационной работы являлась оптимизация синтеза а-конотоксинов и их аналогов, мишенями которых служат перечисленные подтипы рецепторов и АХСБ

Таблица 1. Структуры синтезированных а-конотоксинов и их аналогов.

Название пептида Аминокислотная последовательность2

а-конотоксины, блокирующие а7 нАХР.

[L'u]PnIA GCCSLPPCALNNPDYC*

[H5]PnIA GCCSflPPCAANNPDYC*

1Н'Ди]Рп1А GCCSHPPCAANNPRYC*

[^,Ь1и]Рп1А GCCSRPPCALNNPDYC*

[D7,Llü]PnIA GCCSLPÜCALNNPDYC*

[Llu,KH]PnIA GCCSLPPCALNNPKYC*

[05,Ьш]Рп1А GCCSDPPCALNNPDYC*

[R7, L'ü]PnIA GCCSLPgCALNNPDYC*

[R5,D',Llu]PnIA GC( SRl UCALNNPDYC*

[R5,L10,R14]PnIA GCCSRPPCAI ;NNPRYC*

[D5,R7,L10]PnIA GCCS0PRCACNNPDYC+

[D\R7,V10]PnIA GCCSDPRCAVNNPDYC*

[R^D^L'^R'^PnlA GCCSRPDCALNNPRYC*

[D\R',L'ü,RH]PnIA GCCSDPRCALNNPP.YC*

[Ylu]íml GCCSDPRCAYRC*

[L", D16]ArIB DECCSNPACRLNNPHDCRRR

[Su,Lll,Dlü]ArlB SDECCSNPACRLNNPHDCRRR

[(SGGG)°, L", D16]ArIB SGGGDECCSNPACRIiNNPHDC RRR '

а-конотоксины, блокирующие а9 нАХР.

Vcl.l GCCSDPRCNYDHPEIC*

[R5]Vcl.l GCCSÍIPRCNYDHPEIC*

[D'] Ve 1.1 GCCSDPßCNYDHPEIC*

[R"]Vcl.l GCCSDPRCNYRHPEIC*

[R\D']VC1.1 GCCSgPßCNYDHPEIC*

RgIA GCCSDPRCRYRCR

RgIA„3o GCCSDPRCRYRCR

а-конотоксин, блокирующий a3ß2 и аб нАХР.

[Y"]MII KGCCSNPVCHLEHSNLC*

а-конотоксины, блокирующие а7 и мышечный нАХР.

Imll ACCSDRRCRWRC*

Irnllœo ACC SDRRCRWRC *

[Y'u]ImII ACCSDRRCRYRC*

(К5,0']1тН лссяииюпъш:*

а-конотоксины, блокирующие мышечный тип нАХР.

М1 СКССНРАССЖт^С*

[ЬШ]М1 СКССНРЛС01Л'УЗС*

|ШСС8]М1(6-15) СИССШРАССКНУБС*

[ССС8]М1(6-15) (^СС!ьНРАССЖКУ8С*

[СССв, Ь|и]М1(6-15) С-ССЙНРАСОЬМУХС*

* - С-концевое амидирование.

а - Во всех пептидах дисульфидные связи образованы между первым и третьим, а также вторым и четвертым остатками цистенна.

Пептиды, представленные в таблице 1, являются аналогами природных а-конотоксннов Рп1А, Ус1.1, 1ш1, 1т11, RgIA, Аг1В и М1. Пептиды [Ь10]Рп1А, [Я5, Ь|0]Рп1А и [Ь10, К14]Рп1А были синтезированы в качестве контрольных образцов, поскольку в ряде работ они показали повышенное сродство к а7 подтипу нАХР. Кроме того, для доказательства влияния положительного заряда в 5 положении аналогов пептида [Ь1С]Рп1А мы синтезировали пептид р5, Ь,0]РпГЛ, содержащий замену Я5П>. Для изучения влияния положительного заряда в 5 и 14 положении на сродство а-конотоксина Рп1А к а7 подтипу нАХР были синтезированы аналоги [Н5]Рп1Л и [Н5Д14]Рп1А. Для исследования влияния знака заряда в 7 позиции мы синтезировали пептиды [Я7, Ь1и|Рп1А и [В7, Ь101Рп1А. Пептиды [Р5,О7,Ь10]Рп[Л, [О5Д7,У,0]Рп1А, [О5Д7Х10]Рп1А, Р15,Ь10Д14]Рп1А, [а5ДУ,Ь'°Д141Рп1Л, и [В5Д7,Ь10Д14]Рп1А, содержащие, кроме базовой мутации АЮЬ (или АЮУ). также аминокислотные остатки аргинина или аспарагиновой кислоты в положениях 5, 7 и 14, были синтезированы для изучения совместного влияния заряженных аминокислотных остатков на сродство к а7 подтипу нАХР и ацетилхолин-связывающим белкам.

Последовательности аналогов [О5,Ь10]Рп1А, [К7,Ь10]Рп1А, [О5Д7,Ь10]Рп1А, [П)5Д7,У|0]Рп1А и Р5Д7,Ь10Д14]Рп1А были выбраны с помощью метода молекулярного моделирования.

Остаток тирозина в пептидах [У°]МП, [У'°]1т1 и [У10]1тП мы ввели для получения соответствующих производных меченным радиоактивным изотопом иода (,251) и последующего анализа связывания их с никотиновым холинорсцептором. Пептиды Ус 1.1, 1ш11, ЯаГА и М1 представляют собой природные а-конотоксины без каких-либо модификаций. Мы провели также

синтез ribbon-изомеров (дисульфидные связи между Cysl-Cys4 и Cys2-Cys3 ) а-кокотоксинов Imll и RgIA, поскольку аминокислотная последовательность этих токсинов была получена при анализе библиотеки кДНК, полученной из мРНК, содержащейся в ядовитых железах моллюсков Conus, что не позволяет установить порядок замыкания дисульфидных связей.

Аналоги [R5]Vci.l и [Rn]Vcl.l были синтезированы для изучения влияния положительного заряда на активность а-конотоксина Vcl.l. Для исследования дополнительного отрицательного заряда мы синтезировали аналог р7] Vcl.l, содержащий «мутацию» R7D. Пептид [R5,D7]Vcl.l содержит двойную замену - отрицательный заряд в 5 позиции и положительный в 7 исходного а-конотоксина Vcl.l поменяны местами. Тот же прием мы использовали для синтеза аналога [R5,D7]ImII, заменив в природном пептиде ImIlD5HaRHR7naD.

Для изучения влияния положительного заряда в положении 10 на активность а-конотоксина MI мы синтезировали аналог [L10]MI, содержащий «мутацию» K10L. Основное отличие а-конотоксинов, селективно действующих на мышечные или нейрональные подтипы нАХР, заключается в числе аминокислотных остатков между остатками Cys2 и Cys3 (первая цистеиновая петля) Так, «мышечные» а-конотоксины, принадлежащие к 3/5-семейству (например Gl, Gil, MI, SI, SIA и др.) имеют по 3 остатка в первой цистеиновой петле, тогда как «нейрональные» а-конотоксины имеют по 4 остатка (например ¡ml, Imll, МП, PnIA, GID и др.). Для получения аналогов «мышечного» а-конотокина MI, обладающих повышенным сродством к нейрональному подтипу нАХР (а7), мы синтезировали пептиды, которые содержат добавочный остаток серина в первой цистеиновой петле (между остатком Cys4 и His5), что переводит их в число представителей 4/5-семейства а-конотоксинов. Таким образом, мы выбрали последовательности и синтезировали пептид [GRCCS]MI(6-15), а также пептиды [GCCS]MI(6-15) и [GCCS, L10]MI(6-15), в которых удалены остатки аргинина во 2 положении, а также лизин-10 заменен на лейцин, что часто встречается среди «нейрональных» токсинов, например в МП и PnIA.

Аналог [I,11, D16]ArIB был синтезирован в качестве контроля, поскольку по литературным данным известно, что он обладает наномолярным сродством к а7 подтипу нАХР. Пептид [S°, L11, D,6]ArIB содержит дополнительный N-концевой остаток серина, который был введен для дальнейшей модификации и присоединения пептида к твердому носителю, что позволит получить высокоактивный сорбент для аффинной хроматографии. Аналог [(SGGG)0, L11, D'6]ArIB содержит тетрапепткдный фрагмент Ser-Gly-Gly-Gly в N-концевой части, остаток серина был введен для его последующей модификации с образованием активированного производного пептида, необходимого для иммобилизации а-конотоксина на твердом носителе. Остаток серина отделен от основной последовательности пептида тремя остатками глицина, которые увеличивают информационную подвижность системы токсин-полимер.

Синтез а-конотоксинов.

Синтез проводили как с использованием автоматического пептидного синтезатора Эуго II для больших серий пептидов, содержащих замены различных остатков и варьирование длины первой цистеиновой петли, так и в ручном режиме для аналогов ц-конотоксинов 1т11,1^1А, Рп1А, Ус 1.1 и АгШ. Для активации защищенных аминокислот использовали 2 метода: ГНРСПШОКи-мстод для синтеза на автоматическом пептидном синтезаторе, и ТВ'ШЛ)1РЕА-метод для синтеза в ручном режиме. В реакциях конденсации использовали 3-5-кратныс избытки активированной аминокислоты.

Для окисления линейных предшественников а-конотоксинов мы использовали подход как с одновременным, так и с поэтапным замыканием дисульфидных связей. В случае одновременного замыкания дисульфидных мостиков мы провели исследование влияния состава буферной смеси на выход целевого продукта. Для сравнения использовали смесь вода-ацетонитрил в соотношении 1:1 (для поддержания р! 1=8,5 в раствор добавляли диизопропилэтиламин) и буферную смесь, содержащую 10 шМ Тп5-НС1 и 0,2 тМ ЕЭТА (рН 8,5). В стандартную процедуру замыкания Эй связей был и внесены изменения: значение рН раствора пептида было увеличено с 7.5 до 8.5.

Увеличение рН позволило сократить время реакции с 36-72 до 18-35 ч, в случае применения для окисления дисульфидных связей водно-органической смеси в качестве основного продукта синтеза получали изомер с природным расположением дисульфидных связей. Процесс окисления контролировали при помощи теста Эллмана. Полученные а-конотоксины очистили с использованием препаративной ВЭЖХ. Все синтезированные соединения были охарактеризованы при помощи аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Для сравнения эффективности вышеуказанных методик окисления ряд пептидов был синтезирован с поэтапным замыканием дисульфидов. Было исследовано влияние порядка расположения ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход целевого продукта, а также был применен метод удаления 1Ви-групп с помощью солей таллия (Ш) в трифторуксусной кислоте.

Индивидуальные особенности синтеза конкретных а-конотоксинов рассмотрены в следующих разделах.

Сравнение эффективности двух буферных смесей для замыкания дисульфидных связен в аналогах а-конотоксинов.

Окисление линейных предшественников а-конотоксинов [Н5Д14]Рп1А, [Б7,Ь10]Рп1А, [115,ЬшД14]Рп1А, [У^Я6Д7,Ь10Д14,№15]Рп1А, Р15]Ус1.1, [011СС8]М1(6-15), Р1п]Ус1.1, П15,07]Ус1.1, [У10]1т1, 1т11, |Д5,07]1тН, [Ь10]М1, [аСС8]М1(6-15), [ОССБ, Ь|0]М1(6-15) и [07]Ус1.1 проводили в 50 мл буфера, содержащего 10 мМ Тиб-НО и 0,2 мМ БЭТА при рН 8,5, при концентрации окисляемых пептидов 0,5 мг/мл. Для окисления пептидов [Н5]Рп1А, [Ь10,К14]Рп1А, [О5,Ь10]Рп1А, [Я7, Ь10]Рп1А, [115,О7Х10]Рп1А, Р5Д7,Ь|0]Рп1А, [О5Д7,У10]Рп1А, [Я5,Б7,Ь10Д14]Рп1А, М1 и 105Д7,ЬшД14]Рп1А

использовали раствор ацетонитрила в воде в объемном соотношении (1:1) и концентрации пептида 0,5 мг/мл. Контроль за реакцией осуществляли при помощи обращенофазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила. Об окончании реакции судили по тесту Эллмана. Сравнение хроматографических профилей реакционных смесей показало большую эффективность метода с использованием смеси вода-ацетонитрил. Было отмечено, что скорость замыкания дисульфидных мостиков при использовании вышеуказанных буферных смесей практически одинакова (18-35ч.), однако выход целевого продукта был больше в случае использования водно-ацетонитрильной смеси. При окислении з водно-солевом буфере всегда наблюдалось образование нескольких дисульфидных изомеров и часто в сопоставимых количествах с целевым продуктом, в то время как при окислении в водно-органической фазе наблюдали образование одного изомера.

Исследование влияния расположения ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход а-конотоксина RglA.

В настоящее время отсутствуют литературные данные по исследованию оптимального расположения ортогональных защитных групп в синтезе а-конотоксинов. В большинстве работ в равной степени указываются оба способа расположения защит - tBu-группы (либо Асгп и StBu) в положениях Cys'/Cys3, а также в положениях Cys2/Cys4. Синтез а-конотоксина RglA был проведен на полимере Ринка с использованием Fmoc-схемы защитных групп аминокислот. Реакции конденсации проводили DIC/HOBt-методом с использованием 5-кратных избытков защищенной аминокислоты, при этом среднее время конденсации составляло 3 часа. В данной работе мы исследовали влияние порядка расположения ортогональных групп на выход а-конотоксина RglA. Для этого мы синтезировали пептид RglA, в котором тиольные функции остатков цистеина большой петли (Cys2/Cvs4) имели тритильную защиту, а остатки Cys'/Cys3 защищены с помощью трет-бутильной группы, а также а-конотоксин RglA, в котором остатки цистеина большой петли были защищены трет-бутильной группой, а малой - тритильной группой. Поскольку стратегия поэтапного замыкания дисульфидных связей подразумевает на первом этапе формирование SS-мостика между остатками цистеина содержащими свободные SH-группы, то в первом случае замыкание дисульфидной связи происходит с образованием петли, состоящей из 10 аминокислотных остатков, во втором случае петля состоит из 7 аминокислотных остатков (рис. 1):

IBu s--S ^-^

G!y-Cys,-(jys3 Cys^-Arg-OH Gly-Cys, Cys3-Arg-Tyr-Arg-qys4-Arg-OH

Ser /jrg iSu_Cys2 Arg IBu

ier

Asp-Pro- Arg-Cys^-Arg-Tyr Se r-Asp-Рто

a. ,1 б.

Рисунок 1. Строение 10- (а) и 7-членной петли (б) а-конотоксина RglA.

Реакцию окисления проводили в 50% ацетогштриле, т.е. в условиях, оказавшихся оптимальными в случае синтеза с одновременным замыканием дисульфидов. Интересно, что формирование 10-членной петли проходило с выходом 75%, тогда как пептид, содержащий 7-членную петлю, получили с выходом 45%.

Для замыкания второй пары остатков цистсина использовали смесь дифенилсульфоксида с мстилтрихлорсиланом в трифторуксусной кислоте в присутствии анизола в качестве скэвенджера. Поскольку а-конотоксины представляют собой бициклические соединения, для описания этой реакции, так же удобно использовать представление о петлях, содержащих разное количество аминокислотных остатков. Так при реакции образования второй дисульфидной связи (между остатками Cys'/Cys ) происходит формирование 7-членной петли, выход этой реакции составил 28%. Тогда как замыкание второй связи между остатками Cys2/Cys4 идет через формирование 10-членной петли с выходом 21%. Идентичность полученных пептидов доказали с помощью масс-спектрометрии, а также совместным элюированием.

По результатам данной работы установлено, что максимальный выход а-конотоксина RglА достигается в случае расположения трет-бутильных групп в позициях Cys'/Cys3. При этом можно предположить, что на этапе формирования первой SS-связи высокий выход достигается благодаря меньшим конформационным напряжениям, которым подвержена 10-членная петля. Можно предположить, что более высокий выход реакции замыкания второго дисульфидного мостика между остатками Cys'/Cys3, обусловлен формированием жесткой циклической структуры, при этом остатки цистеина оказываются сближенными в пространстве, а остаток пролина в 6 положении, способствует закреплению конформации в положении близком к структуре пептида в окисленном состоянии.

Сравнение методов замыкания дисульфидных связей на примере синтеза двух изомеров а-конотоксина [Y10]ImII.

Синтез двух изомеров а-конотоксина [Y10]lmII (globular -дисульфидные связи между Cys2/Cys8 и CysVCys12, ribbon -дисульфидные связи между Cys2/Cys'2 и Cys3/Cys8) был осуществлен на полимере Ринка с использованием Fmoc-ехемы защитных групп аминокислот. Тиольные функции остатков Cys2/Cys8 «природного» изомера и остатки Cys2/Cys12 «ribbon» изомера защищали с помощью tBu-групп. В качестве ортогональный защиты использовали кислотолабильные Trt-группы. Для активации защищенных аминокислот применяли TBTU/DIPEA-лгетод. Окисление первой дисульфидной связи линейных предшественников проводили в 50% ацетонитриле. Для замыкания второго SS-мостика использовали раствор трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Окисление проводили в трифторуксусной кислоте при 0°С в течении 30 мин в присутствии 2 экв. анизола, который добавляли для связывания образующихся карбокатионов. После завершения реакции было обнаружено формирование сложного хроматографического профиля, однако MS-анализ реакционной смеси показал

наличие одной молекулярной массы, соответствующей целевому продукту - а-конотоксину [У10]1шИ (рис. 2):

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ¡3 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Рисунок 2. Хроматограмма а-конотоксина [Yl0]ImII и масс-спектр смеси пептидных компонентов, образовавшихся после обработки раствором соли таллия (III).

Это обстоятельство позволило предположить, что в процессе деблокирования образовалась смесь комплексных соединений ионов таллия (I и III) с молекулами пептидов [Y10]JmII и [Y10]imIIn3o, которые разрушаются в процессе регистрации масс-спектра с образованием молекулярных ионов а-конотоксинов [Y10]ImII и [Y10]ImIlH3O. Для проверки этого предположения мы провели качественную реакцию на ионы таллия с кодид ионом, который дает ярко-желтый осадок как с ионом Т13+, так и TF [17]. Однако добавление иодида калия не привело к видимым изменениям, что могло говорить, либо о высокой устойчивости комплексов, либо о неправомерности утверждения об их образовании. Поэтому мы провели предварительный кислотный гидролиз пептида соляной кислотой. После удаления избытка кислоты и добавления раствора иодида калия, наблюдали появление желтого осадка малорастворимых солей Т113 и T1I. Чтобы исключить возможное окрашивание молекулярным иодом в смесь был добавлен бензол, который экстрагирует его из водного раствора. В качестве контроля мы использовали пептид [Y10]ImII, полученный по методике с одновременным замыканием дисульфидных связей, который после кислотного гидролиза не вызвал окрашивания при добавлении раствора иодида калия.

Случаи комплексообразования были описаны в литературе, однако, практических рекомендаций по разрушению подобных комплексов не

1487

Л I_

приводится. Мы предложили использовать метод замещения лиганда (в данном случае пептида) на более сильный комплексообразователь ионов таллия. В качестве такого соединения выбрали этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), которая образует устойчивые хелатные комплексы с ионами тяжелых металлов, выступая в качестве пента- или гексадентатного лиганда. Для разрушения комплексных соединений к пептидам, содержащим одну дисульфидную связь, добавили 1 М раствор ЭДТА. Для исключения возможности дисульфидного обмена, использовали раствор с рН 4,5. Как показано на рис. 3, с течением времени наблюдалось постепенное уменьшение числа хроматографических пиков, вплоть до образования одного вещества (через 56ч.) с молекулярной массой 1485.7 Ба (расчетная молекулярная масса а-конотоксина [У10]1ш11 1485.6 Ба) время удерживания которого в дальнейшем не изменялось.

1 11 ¡д 1/ 1 2. ] 1 1, 4. 1

и п м — -

Рисунок 3. Разрушение комплексных соединений ионов таллия с пептидом [У10]1т11. Через 5 мин. после добавления ЭДТА (1), через 16 часов (2), через 32 часа (3) и через 56 часов (4).

Следует отметить, что выходы пептидов на этапе окисления трифторацетатом таллия были достаточно высокими - 73% для globular-изомера, и 60% в случае п'ЬЬоп-изомера. Это примерно в 2-3 раза превышает выходы целевого продукта по сравнению с использованием смеси дифенилсульфоксида с метилтрихлорсиланом для окисления второй дисульфидной связи а-конотоксинов И^А, Ус1.1, [У°]МП, ¡Ъ11, 016]Аг1В, [8°, Ь", 0,6]Аг1В и [(БвОС)0, Vх, В16]Аг1В (синтез этих пептидов рассмотрен в следующих разделах). Выходы £1оЬи1аг-изомера а-конотоксина [У10]Тт11 составил 15% в расчете на стартовую аминокислоту, пЬЬоп-изомера 8%.

Для наработки препаративных количеств а-конотоксина [У10]1т11 мы провели синтез с использованием одновременного замыкания дисульфидных связей. Окисление проводили в 50% ацетонитриле, что привело к образованию одного основного продукта. В результате совместного элюирования в условиях аналитической ВЭЖХ продуктов реакции одновременного замыкания дисульфидных связей с £1оЬи1аг-изомером, который был получен с использованием поэтапного замыкания дисульфидов был идентифицирован изомер с природным расположением дисульфидных мостиков. Выход а-

конотоксина [Уш]1т11, синтезированного с использованием одновременного замыкания дисульфидных связей, cocтaвfIЛ 33%.

Синтез а-конотоксинов Ус1.1, [У°|МИ, [Ьп, 016]Аг1В, [8°, Ь11, Б16]А«-1В и [(вССС)0, Ь11, 016]Аг1В.

Синтезы а-конотоксинов Ус1.1 и [У°]МП были осуществлены на полимере Ринка, а [Ь11, Б'^АгШ, [Б0, Ь11, и1о]Аг1В и [(БООС)0, Ьп, 01б]Лг1В на полимере Ванга. Для защиты функциональных групп использовали Ртос-схему. Синтез проводили с использованием поэтапного замыкания дисульфидных связей. На основании экспериментов, описанных в предыдущем разделе, выбрали оптимальный порядок расположения защитных групп остатков цистеина - Суз'/Су.ч3 содержали 1Вц-группы, а Су^1Су$А -тритильные группы. Деблокирование с одновременным отщеплением пептида от полимера проводили в одну стадию с использованием смеси трифторуксусной кислоты с анизолом, водой и этандитиолом в качестве скевенджеров. По данным аналитической обращено-фазовой ВЭЖХ содержание линейных предшественников а-конотоксинов после реакции деблокирования во всех синтезах составило более 70%

Для замыкания первой дисульфидной связи, между остатками Суь21Суъ4, использовали метод окисления кислородом воздуха в 50% растворе ацетонитрила. Для замыкания второй дисульфидной связи использовали смссь дифенилсулфоксида с метилтрихлорсиланом в трифторуксусной кислоте, содержащей анизол в качестве ловушки карбокатионов.

В заключение этого раздела необходимо отметить, что предлагаемая нами схема синтеза а-конотоксинов разрабатывалась в течение нескольких лет на примере синтеза пептидов, необходимых для наших исследований ацетилхолиновых рецепторов, и неоднократно видоизменялась, вбирая в себя черты как работ зарубежных авторов, так и наше видение оптимальных путей синтеза. В конечном итоге, основные черты нашего подхода к синтезу природных а-конотоксинов (но не их аналогов) заключаются в следующем:

1. Для защиты тиольных функций всех остатков цистеина использовать кислотолабильные защитные группы.

2. В случае получения линейного продукта высокой степени чистоты целесообразно не применять предварительную очистку, а сразу проводить реакцию замыкания дисульфидных связей.

3. Оптимальным для замыкания дисульфидных мостиков является использование смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1, при рН 8,5-9. Это позволяет уменьшить время окисления и получить целевой продукт с высоким выходом.

Можно полагать, что эта схема окажется полезной и для получения других биологически активных коротких пептидов, содержащих две дисульфидные связи - таких, как апамины или эндотелины. Эта схема в целом пригодна и для синтеза аналогов а-конотоксинов, если в распоряжении исследователей имеются возможности с помощью структурного анализа или функциональных тестов идентифицировать изомер с природным

расположением дисульфидных связей. Однако при отсутствии такой возможности оправдано использование ортогональных защит тиолыюй группы остатков цистеина и последовательное замыкание дисульфидных связей. Большим недостатком подхода, использующего ортогональные защиты, является низкий выход целевого продукта. Вследствие этого он мало подходит для синтеза препаративных количеств пептида, необходимых для проведения углубленных структурно-функциональных исследований. Поэтому нам кажется оптимальным использовать комбинацию этих подходов: для этого препаративные количества пептида следует получать с использованием одновременного замыкания дисульфидных связей, а для установления порядка расположения дисульфидных связей в полученных изомерах использовать совместное элюирование с пептидом, полученным по методу поэтапного замыкания SS-мостиков в аналитических количествах.

Исследование влияния структуры на биологическую активность а-конотоксиков и их аналогов.

Определение биологической активности аналогов а-конотокснна MI. а-Конотоксин MI принадлежит к классу токсинов, связывающихся с мышечными холинорецепторами. Общим для этого класса является наличие 3 аминокислотных остатков в первой цистеиновой петле. С другой стороны, а-конотоксины, действующие ка нейрональные нАХР (например ImíI, МП, PnlA, GID) имеют по 4 остатка в первой петле. Можно предположить, что увеличение длины первой цистеиновой петли «мышечных*) а-конотоксинов может привести к увеличению сродства полученных аналогов к нейрональным подтипам нАХР. Для удлинения первой петли мы ввели остаток сери на в положение 5 токсина MI.

Биологическую активность а-конотокеина MI и его аналогов определяли по их способности взаимодействовать с мембраносвязанным никотиновым ацетилхолиновым рецептором из электрического органа ската Torpedo californica. Для определения того, насколько увеличение длины первой цистеиновой петли повлияет на селективность пептида MI, была исследована способность взаимодействовать с нейрональным рецептором - al подтипом нАХР, трансфецированным в клетки GH4C1 (табл. 2).

Для проведения анализов без введения дополнительных модификаций в исследуемые соединения использовали метод конкурентного радиолигандного анализа, который основан на способности исследуемых аналогов подавлять связывание иодированного производного а-бунгаротоксна ([125IlBgt) с препаратами АХР2. Для этой цели было синтезировано радиоактивное производное а-бунгаротоксина с введенным в остаток Туг радиоактивным изотопом иода. В работе было использовано только моно-[1251]-иодированное производное а-бунгаротоксина.

Ингибирующая активность всех полученных аналогов а-конотоксина MI в концентрации = 0,003 мМ представлена в Табл. 2.

Таблица 2. Ингибирующая активность аналогов а-конотоксина

MI.

а-конотоксин Ингибирующая Ингибирующая

активность активность

(Torpedo californica), % (a7), %

М1 89 1

[L1U1MI 62 5

[GRCCS]MI(6-15) 73 2

[GCCS1MI(6-15) 34 1

[GCCS, L'°]MI(6-15) 20 1

Из приведенных данных видно, что наибольшую ингибирующую активность на рецепторе из Torpedo californica проявил а-конотоксин MI. Кроме того, достаточно высокую активность показал аналог с увеличенной длиной первой цистеиновой петли [GRCCS]MI(6-15). Следует отметить, что большое значение для активности имеет остаток аргинина во 2 положении, поскольку его удаление приводит к резкому падению активности пептидов [GCCS]MI(6-15) и [GCCS, L10]MI(6-15).

В тоже время а-конотоксин [GRCCS]MI(6-15), имеющий увеличенную длину первой петли, a также аналоги [GCCS]MI(6-15) и [GCCS, L,0]MI(6-15) не проявили высокого сродства к нейрональному подтипу холинорецептора. Замена остатка лизина в 10 положении а-конотоксина MI на лейцин несколько ухудшила сродство полученного аналога к холинорецептору Torpedo californica по сравнению с немодифицированным пептидом. Однако, сродство этого аналога ([L10]MI) к нейрональному подтипу холинорецептора было наибольшим среди синтезированных аналогов, хотя его активность была значительно ниже, чем у «нейрональных» а-конотоксинов.

Таким образом было показано, что увеличение длины первой цистеиновой петли не приводит к увеличению сродства соответствующих аналогов а-конотоксина MI к а7 подтипу нАХР.

Определение биологической активности аналогов а-конотоксина

PnlA.

Для изучения влияния заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков на сродство аналогов а-конотоксина PnlA к а7 подтипу нАХР, был синтезирован ряд аналогов, в которых остаток в определенном положении пептидной цепи, несущий заряд, заменяли на гидрофобный остаток, либо заменяли на противоположно заряженный остаток.

Для исследования изменения сродства к а7 нАХР мы синтезировали ряд пептидов, в которых в качестве основы была выбрана последовательность пептида [AlOLJPnlA.

Эта часть работы была выполнена совместно с д.х.н. И.Е. Кашеверовым в лаборатории лиганд-рецепторных взаимодействий

Также мы синтезировали пептиды, не несущие этой базовой мутации [АЮЬ], ко имеющие положительный заряд в 5 и 14 положениях - [Н5]Рп1А и [Н5Д14]Рп!А. Исследование их биологической активности проводили на а7 подтипе нАХР, трансфецированном в клетки ОК4С1, а также на ацетилхолин-связывающих белках из А. саИ/огпка и Ь. stagпalis.

Ингибирующая активность всех полученных аналогов а-конотоксина РгЛА в концентрации ~ 0,003 мМ представлена в Табл. 3:

Таблица 3. Ингибирующая активность аиалогов а-конотокснна

PnlA.

а-конотоксин Ингибирующая активность (a7), % Ингибирующая активность (A. californica), °A Ингибирующая активность (L. stagnalis), %

[L'iPnIA 65 100 100

[Н51Рп1А 55 100 90

[H5,Rl4]PnIA 65 100 90

[R\L'°]PnIA 75 100 100

rD',Llu]PnIA 5 35 0

fL10,K14lPnIA 80 100 100

[D5,Llu]PnIA 20 85 50

[R7. Liu]PnIA 0 90 20

[R5,D7,LlulPnIA 0 50 30

[R5,L'°,R'4]PnIA 95 100 100

fD5,R',LlulPnlA 10 100 50

[D5,R',V10]PnIA 7 100 75

[R5,D7,LiU>R"1]PnIA 35 85 90

[D5;R',L'u.R'VhIA 50 100 95

Интересно, что наиболее активным из всей серии аналогов оказался пептид [R5,Li0.R14]PnIA: его сродство к а7 АХР оказалось больше, чем у описанных а-конотоксинов [L10]PnIA, [R5,L10]PnIA и [Ll0,K;4}PnIA, а с ацетилхолин-связывающими белками из A. californka и L. stagnalis этот пептид показал 100% ингибирование. По-видимому, важную роль играет остаток пролина в 7 положения, поскольку аналоги [R5,D7,L' ,R14]PnIA и [D5,R7,L10,Ri4]PnIA, в которых Pro7 заменен на аргинин или на аспарагиновую кислоту, резко снижали свою активность при взаимодействии с а7 АХР (снижение сродства к ацетилхолин-связывающим белкам было выражено слабее).

При замене остатка пролина-7, а также аспарагиновой кислоты в 14 позиции, наблюдалось значительное снижение сродства полученных аналогов а-конотоксина PnlA к а7 подтипу нАХР. Пептиды [D7,L10]PnIA, [R5,D7,L10]PnIA, [R7,L10]PnIA, [D5,R7,L10]PnIA и [D5,R7,V10]PnIA либо вообще не проявили активность, либо показали очень слабое взаимодействие с а7 АХР при концентрации 0,003 мМ; при этом первые два токсина проявили слабое сродство к обоим АХСБ, тогда как остальные обладали большим сродством к

17

белку из А. саИ/огтса. Следует отдельно упомянуть а-конотоксин [Я7, Ьш]Рп1А, который в исследуемой концентрации обладал высоким сродством к АХСБ из А. саИ/огтса, тогда как с белком из Ь. Stagnalis взаимодействовал достаточно слабо (ингибирующая активность 20%) и практически не связывался с а7 подтипом нАХР.

Влияние заряда в Ы-концевой части пептида было наглядно проиллюстрировано путем сравнения активностей а-конотоксинов и [Я5,Ь10]Рп1А. Последний обладал в несколько раз более высоким сродством к а7 подтипу нАХР и обоим ацетилхолин-связывающим белкам, по сравнению с аналогом, содержащим отрицательный заряд в пятом положении.

Было также установлено, что не только [А10Ь]-мутация приводит к появлению высокоактивных лигавдов к а7 подтипу нАХР. Так, нами были синтезированы пептиды [Н5]Рп1А и [Н5Д|4]Рп1А, содержащие соответствующие замены - [Ь5Н] и [Ь5Н, 014Я], которые обладают такой же активностью, как и описанный ранее а-конотоксин [А10Ь]Рп1А. Сродство этих аналогов к ацетилхолин-связывающим белкам было также достаточно высоким.

Исследование влияния дополнительных 1Ч-концевых аминокислотных остатков на активность [Ь11,0|6]АгШ.

Данная работа была проведена с использованием трех аналогов а-конотоксина Аг1В - [Ь11, 01б]Аг1В, [Б0, Ь11, 016]Аг1В и [(ЗСвС)0, Ь11, Б1б]Аг1В. Первый аналог был описан в литературе как мощный антагонист а7 нАХР, который связывался с мембранами мышиного гипгюкампа со сродством 1,1 нМ. Синтез этого аналога является хорошим примером того, как из «полиспецифичного» природного пептида Аг1В путем замены нескольких аминокислотных остатков зарубежными авторами были получены эффективные и высокоспецифичные к а7 нАХР лиганды - [VII [,,У1бА] Аг1В и [УПЬДЧбО] Аг1В(\УЫ1еакег Р. е! а1, 2008).

Синтез новых аналогов был осуществлен с целью их последующей иммобилизации на твердом носителе и получения сорбента для аффинной хроматографии для выделения а7 подтипа нАХР из биологического материала. Для этого нами были получены аналоги, содержащие И-концевой остаток серина, отделенный от последовательности пептида в первом случае одним, а во втором - тремя остатками глицина. Эти остатки образуют «ножку», которая, как предполагается, не вносит информационных ограничений в систему токсин-полимер. Для определения влияния дополнительных аминокислотных остатков на активность, исследовали способность полученных пептидов взаимодействовать с а7 подтипом нАХР трансфецированным в клетки СН4С1. Так 1С5о([Ь", П16]АгГО,)= 0,84 цМ, 1С50([8°, Ь11, 0,6]Аг1В)= 0,81 цМ и 1С5о([(500С)°, Ьи, 016]Аг1В)= 1,24 цМ. Показано, что добавление М-копцевых остатков не привело к снижению активности а-конотоксина [Б0, Ьи,В16]Аг1В, тогда как аналог [(ЗООО)0, Ь11, 016]Лг1В, содержащий четыре дополнительных ^концевых аминокислотных остатка, проявил сродство к а7 нАХР всего в 1,5 раза более низкое чем

исходный пептид [L11, D!6]ArIB. Высокое сродство к а7 подтипу нАХР позволит использовать эти аналоги для получения эффективного носителя для аффинной хроматографии.

•Определение сродства а-конотоксинов Vcl.l и RglA к al нАХР и АХБС in L. stagnalis.

Мы осуществили синтез природных а-конотоксинов Vcl.l и RglA, ранее описанных в ряде работ. Интерес к ним вызван их способностью подавлять нейропатическую боль на моделях in vivo, что, как предполагается, связано с их способностью эффективно взаимодействовать с а9а10 подтипом холинорецептора. Ингибирующая активность а-констоксинов Vcl.l и RglA в концентрации ~ 0,003 мМ представлена в табл. 4:

Таблица 4. Ингибирующая активность а-копотоксинов Vcl.l и RglA.______

а-коиотоксин Ингибирующая активность (а7), % Ингибирующая активност1 (L. stagnalis), %

RglA 55 45

Vcl.l 50 Не исследовано

Определение биологической активности аналогов а-конотоксинов

Imll.

Особенность а-конотоксина lmll заключается б том, что его аминокислотная последовательность, как и ряда других пептидов (BuIA, GIC, PIA, Vcl.l, PelA и Lpl.l.), была вьтедена из анализа библиотеки кДНК, полученной из мРНК, содержащейся в ядовитых железах моллюсков. Однако, этот подход не позволяет установить порядок расположения дисульфидных связей и наличие посттрансляционных модификаций. Для анализа возможной активности разных дисульфидных изомеров а-конотоксина lmll, мы синтезировали изомер с характерным для «природных» а-конотоксинов расположением дисульфидных связей (Cys'/Cys3 и Cys2/Cys4), а также изомер, содержащий другой порядок замыкания дисульфидов- Cys'/Cys4 и Cys2/Cys3.

Пептид |Y10]lmII был синтезирован для последующего иодирования и анализа прямого связывания с никотиновым холинорецептором. Проведенные опыты показали, что исследуемые пептиды обладают высоким сродством к а7 нАХР и ацетилхолин-связывающим белкам из А. ca'tifornica и L. stagnalis. Ингибирующая активность обоих изомеров а-конотоксина Imll и [Y10]ImII в концентрации ~ 0,003 мМ представлена в Табл. 5

Таблица 5. Ингибирующая активность а-конотоксинов Irall, ImII„]0 и |Y10]1mII. ___

а-конотоксин Ингибирующая активность (а7), % Ингибирующая активность (A. californica), "А Ингибирующая активность (L. stagnalis), %

Imll 95 80 90

1тПизо 93 60 70

[YluJImII 85 80 55

С использованием полученных аналогов была проведена работа, в результате которой был найден дополнительный сайт связывания на Torpedo нАХР, отличный от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов (Kasheverov et al., J.Neurochem., 2009).

Известно, что а-конотоксины взаимодействуют с сайтами связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов нАХР и АХСБ. а-Конотоксины, связывающиеся с мышечным подтипом нАХР или а7 нАХР, конкурируют с а-бунгаротоксином. Синтезированные нами а-конотоксин Imll, его «ribbon» изомер, a также аналог содержащий замену W10Y, обладают схожим сродством к al нАХР человека и мышечному подтипу нАХР. Globular- и ribbon-изомеры а-конотоксина Imll, а также аналог [W10Y]lmII вытесняли радиоактивно-меченный а-бунгаротоксин из комплекса с al нАХР, экспресированным в клеточной линии GH4C] (ICS0 17, 23 цМ и 27 цМ соответственно), а также АХСБ L. stagnalis и A. californica (1С50 2.0-9.0 цМ).

Согласно данным, полученным с помощью поверхностного плазмонного резонанса (выполнено Rucktooa Р., Амстердам), оба изомера связываются с иммобилизированными АХСБ, а также конкурируют с АХСБ за иммобилизованный а-бунгаротоксин (Kd и IC50 2.5-8.2 рМ). Токсин [1125 ]I mil (W10Y) показал специфическое связывание с нАХР из Torpedo (Kd 1.5-6.1рМ) и вытеснялся а-конотоксином Imll и его «ribbon» изомером, a также Imll(WlOY) с IC50 2.7, 2.2 и 3.1 цМ, соответственно. При этом а-кобратоксин и а-конотоксин Iml вытесняли [I125]ImII(W10Y) только при очень высоких концентрациях (IC50 более 90 цМ). Таким образом, полученные результаты показывают, что а-конотоксин Imll и его аналоги имеют дополнительный сайт связывания на Torpedo нАХР, отличный от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов.

Заключение.

Результатом данной работы является подбор оптимальных условий синтеза препаративных количеств природных а-копотоксинов и их аналогов. Показано, что наибольших выходов целевого продукта можно достичь при синтезе с одновременным замыканием дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. Однако, такой подход требует дальнейшего анализа порядка замыкания дисульфидных связей. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных iBu-групп на остатках цистеина в положениях Cys1 и Cys3 приводит к увеличению выхода и-конотоксина RgIA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы расположены в положениях Cys2 и Cys4. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения могут образовываться (в зависимости от аминокислотной последовательности) при замыкании дисульфидных связей раствором трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость этого высокоэффективного реагента.

Синтезированные соединения были исследованы в опытах по связыванию с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами двух типов -природным .мышечным нАХР из электрического органа ската Т. californica и нейрональным а7 подтипом нАХР человека, трансфецированным в клетках GH4Ci, а также ацетилхолин-связывающими белками из A. californica и L. stagnalis. Новые аналоги [Н5]Рп1А и [Н5, R!4]PnIA показали более высокое сродство, чем природный пептид, к а7 нАХР и АХСБ из A. californica. Пептиды, последовательности которых были выбраны на основании молекулярного моделирования, а именно [Ds,R7,V10]PnlA, [D5,R7,L10,R14]PnIA и особенно [D5,R7,Ll0]PnIA, имели высокую селективность к Ас-АХСБ. Влияние замен в положениях 10 и 14 конотоксинов оказалось незначительным, хотя эффект этих модификаций был очевиден в случае Ls-АХСБ. Так, аналоги [L1 ]Рп1А и [L10, R1 ]Рп1А не различаюсь по сродству к Ас-АХБС, так же, как и [D5,R7,V10]PnIA, [D5,R7,L10,R14]PnIA и p5,R7,L10]PnIA. В целом, полученные результаты подтверждают предсказательную способность построенных моделей взаимодействия пептидных лигандов и АХСБ и нх применимость в разработке веществ с заданными параметрами.

Выводы.

1. Разработаны оптимальные условия синтеза а-конотоксинов с использованием одновременного замыкания обеих дисульфидных связей при получении пренаративных количеств в сочетании с поэтапным замыканием как для проверки корректности образования дисульфидов в природных а-конотоксинах, так и для получения их аналогов.

2. Исследовано влияние расположения пар ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход конечного продукта; показана возможность использования трифторацетата таллия при замыкании дисульфидных связей для повышения выхода аналогов а-конотоксинов.

3. С использованием разработанных методик синтезированы 4 различных природных а-конотоксинов и 29 новых аналогов, в том числе с неприродным порядком замыкания дисульфидных связей.

4. Показано, что изменение размера первой цистеиновой петли в а-конотоксине MI не переключает его специфичность с никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального а7 нАХР человека. На основе а-конотоксина PnlA получены аналоги, имеющие высокое сродство к а7 нАХР, a также аналог, селективный для аце гилхолин-связывающего белка A. californica.

5. С использованием а-конотоксина Imll и его 1тНизо аналога и радиоактивного производного [W10Y]ImII показано, что на а7 нАХР эти соединения взаимодействуют с классическим центром связывания агонистов и конкурентных антагонистов, но имеют иной центр связывания на АХР Torpedo californica.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Kasheverov I.E., Zhmak M.N., Fish A., Rucktooa P., Khruschov A.Yu., Osipov A.V., Ziganshin R.H., D.D\hoedt, Bertrand D., Sixma Т.К., Smit A.B. and Tsetlin V.I. Interaction of a-conotoxin Imll and its analogs with nicotinic receptors and acetylcholine-binding proteins: additional binding sits on Torpedo receptor. J. Neurochem, 2009,111 (4), 934-944.

2. Хрущёв А.Ю.. Жмак M.H., Кашевсров И.Е., Цетлин В.И. Синтетические аналоги а-конотоксинов в исследовании лиганд-связывающих сайтоз никотиновых рецепторов. Биологические мембраны, 2009,26(4), 333-334.

3. Koval L., Lykhmus О., Zhmak М., Khruschov A.. Tsetlin V., Magrini Е., Viola A., Chernyavsky A., Qian J., Grando S., Komisarenko S., Skok M. Differential involvement of a4(32: a7 and a9al0 nicotinic acetylcholine receptors in В lymphocyte activation in vitro. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2011,43(4), 516-524.

4. Хрущёв А.Ю.. Жмак M.H., Цетлин В.И. Оптимизация сигеза а-конотоксинов. Тезисы докладов XXI зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2009, Москва, 11.

5. Khruschov A.Yu.. Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.l. Synthetic analogues of a!fa-conotoxins in research of binding sites of nicotinic receptors, . Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 79.

6. Khruschov A.Yu.. Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Radioactive derivatives of aipha-conoioxins for studies on nicotinic acetilcholonc receptors. Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 80.

7. Khruschov A.Yu., Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Synthesis and characterization of novel alpha-conotoxin Mil and PnIA analogs. Abstracts of the 7 Joint meeting of the European neuropeptide dub and the summer neuropeptide conference, 2010, Pecs, 88.

8. Шелухина И.В., Струков А.С., Хрущёв А.Ю.. Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Никотиновые рецепторы мозга, вовлеченные в развитие нейродегенеративных и психических заболеваний. Тезисы докладов совещания «нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении», 2010, Москва, 48.

9. Патентная заявка №2011104595. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством и селективностью к ацетилхолин-связывающему белку из Apysia califomica, / Хрущев А.Ю.. Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.

10. Патентная заявка №2011104596. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством к альфа7 типу никотинового ацетилхолинового рецептора. / Хрущев А.Ю.. Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.

Подписано в печать:

09.03.2011

Заказ № 5111 Тираж - 60 экз.

Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Введение.

2. а-Конотоксины -инструменты для изучения нАХР. Особенности структуры и специфичность.

3. Особенности синтеза а-конотоксинов.

ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Походы к синтезу а-конотоксинов.

2. Выбор последовательностей природных а-конотоксинов и их аналогов.

3. Синтез а-конотоксинов.

4. Исследование взаимосвязи между структурной и биологической активностью а-конотоксинов и их аналогов. 90 Заключение

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

В настоящее время никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) - один из наиболее изученных нейрорецепторов. Он относится к большому «Gys-петельному» семейству лиганд-управляемых ионных каналов; Кроме различных подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в это семейство входят также ионотропные типы серотониновых рецепторов (5НТЗ) и рецепторы у-аминомасляной кислоты (GABA-А) и глицина (GlyR). Первые данные о пространственной^ структуре нАХР из электрического органа ската Torpedo marmorata были получены с помощью метода крио-электронной микроскопии [1]. Более детальная информация' о структуре нАХР была получена совсем недавно после установления кристаллической структуры высокого разрешения для сходных по пространственной организации бактериальных лиганд-управляемых ионных каналов [2,3]. Однако информация о пространственной структуре лиганд-связывающих участков нАХР стала доступна лишь в 2001 г, когда, был открыт, экспрессирован и кристаллизован водорастворимый ацетилхолин-связывающий белок (АХСБ) из прудовика Lymnaea stagnalis, который представляет собой пространственный, гомолог N-концевых лиганд-связывающих доменов никотиновых и всех остальных «Cys-петельных» рецепторов [4,5]. нАХР разных типов являются мишенью для веществ самой разной-природы - начиная от низкомолекулярных веществ и заканчивая пептидами и небольшими белками [6,7]. Первыми белковыми веществами, взаимодействующими с нАХР, были а-нейротоксины из яда змей, которые являются антагонистами некоторых типов холинорецепторов. Так, с помощью а-бунгаротоксина и а-кобратоксина был впервые очищен нАХР из Torpedo [8], затем нейрональный холинорецептор из мозга крысы [9] и позднее АХСБ Lymnaea stagnalis [5]. В последнее время арсенал веществ, используемых при исследовании нАХР пополнен небольшими токсическими пептидами, выделенными из яда хищных морских улиток семейства Conus — так называемыми а-конотоксинами: 'Вследствие того; что эти пептиды обладают достаточно высокой селективностью по отношению к разным подтипам нАХР, а также ввиду сравнительной простоты их, химического синтеза, число а-конотоксинов используемых, в исследовании; нАХР, в настоящее время составляет несколько со ген.

Структурно-функциональные исследования нАХР насчитывают уже несколько десятилетий [10], чему способствовало наличие: богатого природного источника этого рецепторам - электрического! органа ската Torpedo, а так же высокоактивного и; селективного блокатора этого рецептора — а-бунгаротоксина из яда Büngarus multicinctas [11]. Это позволило охарактеризовать нАХР из Torpedo как олигомерный белок с молекулярной массой 220 кДа, состоящий из 5-ти субъединиц (двух al, и по одной (31, у и 5). Установление структуры нАХР Torpedo методом крио-электронной микроскопии было результатом» доступности природного рецептора; а также огромным прогрессом в совершенствовании инструментальной базы;[12]. Из самых первых работ по исследованию структуры нАХР стало известно не только то, что рецептор состоит из 5-ти субъединиц, но и тот факт, что они располагаются^ псевдосимметрично вокруг центральной оси,, по которой проходит ионный канал.

Структура рецептора такова^ что два лиганд-связывающих участка, агонистов и конкурентных антагонистов? при этом располагаются; в; областях контакта больших N-концевых внеклеточных доменов, двух al. и, соседних, с ними у- и 8-субъединиц рецептора примерно в их средней: части (по отношению к мембранной поверхности). нАХР Torpedo относят к холинорецепторам мышечного типа (на основании фармакологических и структурных характеристик). Новый «нейрональный» тип нАХР в мозге млекопитающих был обнаружен с использованием а-бунгаротоксина [9]. Он представляет собой гомоолигомерный а7 подтип рецептора и> состоит из 5-ти одинаковых а7-субъединиц. Позднее в нервных тканях были обнаружены и другие; подтипы нАХР. К настоящему времени известно о существовании 9ти нейрональных а-субъединиц (а2-а10) и 3-х ß-субъединиц (ß2-ß4),которые могут образовывать как гомоолигомерные формы нАХР (кроме аП также и а8 и а9 подтипы), так и гетеромерные (состоящие из различных композиций а-и ß-субъединиц). В" нервных тканях наиболее часто встречаются a4ß2, a3a6ß2, а7 подтипы нейрональных нАХР.

В настоящее время» известно, что нарушение работы некоторых подтипов нАХР может вызывать или быть следствием ряда заболеваний, таких как мышечные дистрофии (миастении) [13] и некоторых видов эпилепсии [14]. Также была показана взаимосвязь между шизофренией, болезнями Альцгеймера, Паркинсона и нарушением в уровне определенных подтипов нейрональных нАХР [15].

На основании вышесказанного, очевидно, что поиск и создание новых высокоаффинных и селективных лигандов для каждого подтипа холинорецепторов, является весьма актуальной задачей. Основой, для этих исследований служат многочисленные известные соединения, взаимодействующие с разными участками нАХР,' в состав которых входят агонисты (эндогенные и экзогенные), антагонисты (конкурентные, а также неконкурентные) и разнообразные модуляторы холинергическош активности. Настоящая работа выполнена в лаборатории лиганд-рецепторных взаимодействий (Отдел молекулярных основ нейросигнализации). Деятельность отдела сосредоточена на комплексном исследовании различных нАХР посредством анализа их связывания с белковыми и пептидными антагонистами (индивидуальные компоненты ядов змей). В качестве пептидных антагонистов в нашей лаборатории исследуются а-конотоксины - небольшие пептиды, выделенные из яда хищного морского моллюска Conus, которые содержат 12-22 аминокислотных остатков и две дисульфидные связи. Эти пептиды являются высокоэффективными и специфичными лигандами к определенным подтипам нАХР и широко используются для их исследования. Важный шаг в понимании устройства лиганд-связывающих доменов холинорецепторов был сделан после открытия ацетилхолин-связывающих белков и кристаллизации их в чистом виде, а также в комплексе с агонистами и. антагонистами, в том числе и с а-конотоксинами и их аналогами. Это дало возможность определить те конформационные отличия в структуре лиганд-связывающих сайтов, которые наблюдаются при связывании агонистов и антагонистов. В» свою очередь такая информация стала основой для адекватного применения методов компьютерного моделирования и дизайна новых аналогов а-конотоксинов для их применения как в научных исследованиях, так и в медицинской практике.

Благодаря достаточно простой структуре, природные а-конотоксины, а также их аналоги получают преимущественно методами химического синтеза пептидов. Основным вопросом в синтезе а-конотоксинов остается оптимальный метод замыкания дисульфидных связей. Наличие в а-конотоксинах двух дисульфидных мостиков позволяет существовать трем дисульфидным изомерам, и как правило, только один из них проявляет активность [11-13] . Для синтеза а-конотоксинов используют как одновременное [14], так и ступенчатое замыкание дисульфидных связей [15]. Преимуществом первого подхода является отсутствие этапа промежуточной очистки и, как следствие, более высокие выходы целевого продукта ['16]. Главным недостатком является неоднозначность, в расположении дисульфидных связей. При замыкании дисульфидных связей в пептидах, имеющих последовательность природных а-конотоксинов, главный продукт обычно имеет природное расположение дисульфидных связей, тогда как в случае синтеза аналогов а-конотоксинов, содержащих замены или делеции аминокислотных остатков, часто в качестве основного продукта реакции образуются изомеры с иным расположением дисульфидов. В случае поэтапного замыкания дисульфидов (использование так называемых ортогональных защитных групп) расположение дисульфидных мостиков является детерминированным, однако недостатком метода является низкий выход, обусловленный жесткими условиями деблокирования и замыкания последней дисульфидной связи [17, 18].

Целью данной работы было получение новых активных аналогов а-конотоксинов, имеющих более высокую избирательность к определенным подтипам нАХР и ацетилхолин-связывающим белкам, а также разработка оптимальной методики синтеза препаративных количеств аналогов а-конотоксинов. В результате этой работы, на основании анализа влияния роли состава и рН реакционной смеси, а также порядка расположения ортогональных защитных групп остатков цистеина, были разработаны оптимальные условия получения препаративных количеств природных а-конотоксинов и их аналогов с требуемым порядком замыкания дисульфидных связей. На основании компьютерного моделирования, а также эмперического подхода к выбору аминокислотной последовательности были получены новые данные о влиянии одиночных, а также множественных аминокислотных замен на эффективность связывания аналогов а-конотоксинов Рп1А, 1ш11, АгГО, Ь^ГА, Ус 1.1. и МП с а7 подтипом нАХР, а также с АХСБ А. саИ/огтса и Ь. 81а%паИ$. Также были получены два новых аналога а-конотоксина Рп1А, которые показали более высокое сродство, чем природный пептид, к а7 нАХР и А. саН/огтса АХСБ.

Выводы.

1. Разработаны оптимальные условия синтеза а-конотоксинов с использованием одновременного замыкания обеих дисульфидных связей .при получении препаративных количеств в сочетании с поэтапным замыканием, как для проверки корректности образования дисульфидов в природных а-конотоксинах, так и для получения их аналогов.

2. Исследовано влияние расположения пар ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход конечного продукта; показана возможность использования трифторацетата таллия при замыкании дисульфидных связей для повышения выхода аналогов а-конотоксинов.

3. С использованием разработанных методик синтезированы 4 различных природных а-конотоксинов и 29 новых аналогов, в том числе с неприродным порядком замыкания дисульфидных связей.

4. Показано, что изменение размера первой цистеиновой петли в а-конотоксине MI не переключает его специфичность с никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального а7 нАХР человека. На основе а-конотоксина PnlA получены аналоги, имеющие высокое сродство к а7 нАХР, a также аналог, селективный для ацетилхолин-связывающего белка A. californica.

5. С использованием а-конотоксина Imll и его 1т11и30 аналога и радиоактивного производного [W10Y]ImII показано, что на а7 нАХР эти соединения взаимодействуют с классическим центром связывания агонистов и конкурентных антагонистов, но имеют иной центр связывания на АХР Torpedo californica.

Заключение.

Результатом данной работы является выбор оптимальных условий получения препаративных количеств природных а-конотоксинов и их аналогов. Показано, что наибольшие выходы целевого продукта наблюдаются при синтезе с использованием одновременного замыкания дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. Однако, такой подход требует дальнейшего анализа порядка замыкания дисульфидных связей. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных tBu-групп на остатках

1 3 цистеина в положениях Cys и Cys приводит к увеличению выхода а-конотоксина RglA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы находятся в положениях Cys2 и Cys4. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения могут образовываться при замыкании дисульфидных связей раствором i трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость этого высокоэффективного реагента.

Синтезированные в препаративных количествах а-конотоксины были исследованы в опытах по связыванию с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами двух типов - природным рецептором мышечного типа из электрического органа ската Т. californica и нейрональным а7 человека, i трансфецированным в клетках GH4C1, а также ацетилхолин-связывающими белками из А. californica и L. stagnalis. Новые аналоги [Н5]Рп1А и [Н5, f R14]PnIA показали более высокое сродство, чем природный пептид, к а7 нАХР и АХСБ из А. californica. Пептиды, последовательности которых были выбраны на основании молекулярного моделирования - [D5,R7,V10]PnIA, [D5,R7,L1 °,R5 4]PnI А и особенно [D5,R7,LI0]PnIA, имели значительно повышенную селективность к Ас-АХСБ. Однако влияние замен в положениях 10 и 14 конотоксинов оказалось незначительно, хотя эффект этих модификаций был очевиден в случае Ls-АХСБ. Так, аналоги [L10]PnIA и [L10, R14]PnIA не различались по сродству к Ас-АХСБ так же, как и [D5,R7,V10]PnIA, [D5,R7,L1 °,R14]PnI А и [D5,R7,L10]PnIA. Эти результаты подтверждают предсказательную способность построенных моделей взаимодействия пептидных лигандов и АХСБ и их применимость в разработке веществ с заданными параметрами.

С помощью синтезированных нами изомеров а-конотоксина Imll и его аналога [W10Y]ImII было впервые показано наличие дополнительного участка связывания на Torpedo нАХР, отличного от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов.

Глава Ш. Экспериментальная часть.

Общая часть.

Реактивы.

В работе были использованы производные аминокислот фирм Fluka, Bachem, Novabiochem (Швейцария), Merck (Германия), а также следующие реактивы: а-бунгаротоксин (aBgt) и CHAPS (Sigma), хлорамин Т, Triton X-100, [125I]Na (Изотоп), трифторуксусная кислота, трифторацетат таллия (Fluka), Tris (Gerbu). Мембранные препараты АХР Torpedo californica были предоставлены проф. Ф. Хухо (Свободный Университет Берлина). а7 подтип нАХР крысы трансфецированным в клетки GH4C1.

Синтез пептидов.

Твердофазный синтез пептидов проводили с использованием 4-(2\ 4х-диметоксифенил-флуоренилметокси-аминометил)-феноксиметил-полистирольном полимере (Полимер Ринка) фирмы Bachem (содержание аминогрупп на 1 г полимера - 0,42 ммоль), алкоксибензильном сополимере стирола и 1% дивинилбензола (полимер Ванга) фирмы Vega (США) (содержание гидроксильных групп на 1 г полимера - 0,50 ммоль), 2-хлортритильный полимер (содержание гидроксильных групп на 1 г полимера - 1,7 ммоль). Для синтеза применяли следующие №-Ртос-производные аминокислот: Cys(Trt), Cys(Bul), Ser(Bul), Thr(Bul), Asp(OBut), Glu(OBul), Arg(Pbf), His(Trt), Tyr(Bu), Lys(Boc), Ala, Leu, lie, Val; Asn, Gin, Pro, Met, Trp Phe, Gly.

Методика присоединения первой аминокислоты 1.

Для присоединения, первой аминокислоты использовали метод ангидридов. Для этого 10 экв. защищенной аминокислоты растворяли в 2 мл диметилформамида и- добавляли- 5 экв. диизопропилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем добавляли к суспензии полимера в 2 мл диметилформамида. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение4 4 часов. После окончания реакции полимер отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре и,дважды промывали каждым из.следующих растворителей: спирт, хлористый метилен, диметилформамид. Затем полимер переносили в стеклянный реактор, оснащенный пористым фильтром' и трехходовым краном, в котором проводили дальнейший синтез:

Методика присоединения первой аминокислоты 2.

Для присоединения остатка пролина к 2-хлортритильному полимеру 1 экв. Бтос-Рго растворяли в 2 мл хлористого метилена и добавляли 2 экв. диизопропилэтиламина, после перемешивания раствор, добавляли к суспензии полимера в минимальном количестве того же растворителя. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 3 часов. После окончания- реакции полимер отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре и дважды промывали каждым из следующих растворителей: этиловый спирт содержащий 0,5% триизопропилэтиламина; хлористый метилен, диметилформамид. Затем полимер переносили в стеклянный реактор, оснащенный пористым фильтром и трехходовым краном, в котором проводили дальнейший синтез.

Наращивание полипептидной цепи.

Последующие этапы конденсации проводили« со следующим протоколом операций цикла синтеза:

1. ДМФА 2x3 мин;

2. 50% 4-метилпиперидин в ДМФА 15мин;

3. ДМФА 3x3 мин;

4. Диоксан-вода (2/1)- 2x3 мин;

5. ДМФА 2х3'мин;

6. Реакция конденсации 2-3 ч.

Активацию защищенной аминокислоты проводили с помощью TBTU/DIPEA или HOBT/DIPCDI-метода. В случае TBTU-метода к смеси 1 экв. аминокислоты и 1 экв. TBTU в ДМФА добавляли 2 экв. диизопропилэтиламина и после перемешивания в течение 5 мин реакционную смесь добавляли к пептидил-полимеру; в другом варианте к 1 экв. аминокислоты и 1 экв. HOBT в минимальном объеме ДМФА добавляли 1 экв. DIPCDI и через 10 мин смесь объединяли с пептидил-полимером. В реакции конденсации использовали 3-5 - кратные избытки активированной аминокислоты. После присоединения последней аминокислоты Na-защитную Fmoc-группу отщепляли 50% 4-метил-пиперидином в диметилформамиде. Далее полимер последовательно промывали: диметилформамидом, спиртом, эфиром и сушили на фильтре, подключенном к водоструйному насосу в течение 2 часов.

Метод деблокирования 1.

Деблокирование и отщепление пептидов, синтезированных на полимере Ринка и Ванга, проводили 5 мл смеси (на 200 мг пептидил-полимера) ТФА-этандитиол-вода-анизол (91:3:3:3) в присутствии Юмкл триизопропилсилана в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Продукт осаждали безводным холодным эфиром, отфильтровывали, трижды промывали эфиром, сушили на фильтре и экстрагировали 100' мл воды, раствор отфильтровывали от полимера и лиофилизировали.

Метод деблокирования 2.

Пептиды, синтезированные на 2-хлортритильном полимере, отщепляли и деблокировали 5 мл смеси (на 150 мг пептидил-полимера) ТФА-этандитиол-анизол (95:2,5:2,5) в течение 1 часа при комнатной температуре. Продукт осаждали безводным холодным эфиром и центрифугировали, затем надосадочную фракцию сливали, и осадок суспендировали в свежей порции эфира. Последовательность операций осаждения-центрифугирования повторяли 3 раза. Затем осадок сушили, экстрагировали 100 мл воды, отделяли от нерастворимого осадка центрифугированием и лиофилизировали.

Препаративная. ВЭЖХ.

Очистку пептидов осуществляли на хроматографе Gilson на колонке Phenomenex С18 (250x10 мм) в линейном градиенте ацетонитри л а от 10 % до 60% за 50 мин в 0,1% ТФА при скорости потока 4 мл/мин. Поглощение элюата регистрировали при длине волны 226 нм.

Аналитическая ВЭЖХ.

Анализ проводили на хроматографе Waters на колонке Phenomenex С18 (250x4,6 мм) в линейном градиенте ацетонитрила от 10 % до 60% за 50 мин в 0,1% ТФА при скорости потока 1 мл/мин. Поглощение элюата регистрировали при длине волны 226 нм.

Масс спектры регистрировали на масс-спектрометре Vision 2000 (Bioanalysis).

1. Синтез пептидов [H5]PnIA, [H5,R14]PnIA, [D7,L10]PnIA,

LI0,К14]PnIA, [D5,L10] PnIA, [R7, LJOJPnIA, [R5,D7,L10]PnIA, [R5,L10,R14]PnIA, [D5,R7,L10]PnIA, [D5,R7,V10]PnIA, [R5,D7,L10,R14]PnIA, PnIA[D5,R7,Ll0,R14],, [R5]Vcl.l, [D7]VcLl, [.RllJVcl.l, [R5,D7]VcLl, [YlOJImI, RgIA, Imll, [R5,D7]ImU, MI, [L10JM, [GRCCS]M(6-15), [GCCS]M(6-15), [GCCS, L10]M(6-15).

Синтез пептидов проводили на роботонизированном пептидном синтезаторе Syro II (MultiSynTech, Германия) по Fmoc/tBu схеме на полимере Fmoc-Amide-(aminomethyl)-Resin (Rink) с нагрузкой 0,48 mmol/g (PepChem РС-01-0501). Синтез проводили одновременно в 21 реакторе. Для каждого синтеза использовали по 100 мг полимера Ринка. Присоединение первой аминокислоты осуществляли методом симметричных ангидридов по методике 1. Отщепление Fmoc группы проводили 40% раствором 4-метил-пиперидина в ДМФА. Реакцию конденсации осуществляли путем in situ активации смесью ТВТиЯЛРЕА при 5-кратном избытке аминокислоты в течение 3 часов. После предварительных экспериментов нами была составлена программа оптимальная для всего ряда синтезируемых пептидов:

1. Wash with 1000 DMF

2. 500 ]il of 0,5 mol/1 amino acid derivative in DMF 250 ill of 1 mol/1 TBTU in DMF

45 jil of DIPEA

3. Coupling

4. Empty

5. Wash with 1000 |il DMF

6. 500 [i\ of 40% piperidine in DMF

7. Empty

5x2 min

20 min

5x2 min

180 min

1 min

1 min

Деблокирование пептидов с одновременным отщеплением от полимера проводили с помощью методики деблокирования 1. Затем линейные пептиды были очищены с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизированы. Окисление пептидов [Н5Д14]Рп1А, [07Х10]Рп1А, [115,Ь 10 Д14]Рп1А, [Я5]Ус1.1, [ОКСС8]М1(6-15), [Ш1]Ус1.1, [К5,07]Ус1.1, [У10]1т1, Ь^1А, 1т11, [115,07]1тП, [1Л0]М1, [ОСС8]М1(6-15), [ССС8, Ы0]М1(6-15) и [07]Ус1.1 проводили под действием кислорода воздуха, для этого 25 мг очищенного линейного пептида растворили в 50 мл буфера, содержащего 10 мМ Тиэ-НО и 0,2 мМ ЕБТА при рН 8,5. Для окисления а-конотоксинов [Н5]Рп1А, [Ь10,К14]Рп1А, [05,Ь10]Рп1А, [К7,Ь10]Рп1А, [Я5,Б7,Ы0]Рп1А, р5Д7,Ъ10]Рп1А, [05Д7,У10]Рп1А, [К5,О7,Ы0Д14]Рп1А, М1 и |Х)5Д7,Ы0Д14]Рп1А навеску по 25 мг каждого пептида растворили в 50 мл 50% ацетонитрила. Полученные растворы оставляли при перемешивании на 2 суток. Затем растворы были лиофилизированы и подвергнуты очистке с помощью препаративной ВЭЖХ. Выходы пептидов [Н5Д14]Рп1А, Р7,Ы0]Рп1А, [К5,Ы0Д14]Рп1А, [К5]Ус1.1, [ОКСС8]М1(6

15), [1Ш]Ус1.1, [Ы5Д)7]Ус1Л, [У10]1ш1, Яё1А, 1ш11, [К5,В7]1ш11, [Ы0]М1, [ОСС8]М1(6-15), [вССЗ, Ь10]М1(6-15) и [Б7]Ус1.1 указаны в таблице 8:

1. Unwin, N. (2005) J. Mol. Biol., 346, 967-989.

2. Bocquet, N., Prado de Carvalho, L., Cartaud, J., Neyton, J., Le Poupon, C., Taly, A., Grutter, T., Changeux, J.P., Corringer, P.J. (2007) Nature, 445, 116-119.

3. Hilf, R.J., Dutzler, R. (2008) Nature, 452, 375-379.

4. Smit, A.B., Syed, N.I., Schaap, D., van Minnen, J., Klumperman, J., Kits, K.S., Lodder, H., van der Schors, R.C., van Elk, R., Sorgedrager, B., Brejc, K., Sixma, T.K., Geraerts, W.P. (2001) Nature, 411, 261-268.

5. Brejc, K., van Dijk, W.J., Klaassen, R.V., Schuurmans, M., van Der Oost, J., Smit, A.B., Sixma, T.K. (2001) Nature, 411, 269-276.

6. Kasheverov, I.E., Utkin, Y.N., Tsetlin, V.l. (2009) Curr. Pharmaceut. Des., 15, 2430-2452.

7. Tsetlin, V., Utkin, Y., Kasheverov, I. (2009) Biochem. Pharmacol., 78, 720-731

8. Eldefrawi, M.E., Eldefrawi,' A.T. (1973) Arch. Biochem. Biophys., 159, 362373.

9. Salvaterra, P.M., Mahler, H.R. (1976) J. Biol. Chem., 251, 6327-6334.

10. Hucho, F., Tsetlin, V.l., Machold, J. (1996) Eur. J. Biochem., 239, 539-557.

11. Chang, C.C., Lee, C.Y. (1963) Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 144, 241-257.

12. Tierney, M.L., Unwin, N. (2000) J. Mol. Biol., 303, 185-196.

13. Vincent, A., Beeson, D., Lang, B. (2000) Eur. J. Biochem., 267, 6717-6728.

14. Steinlein, O.K. (2004) Prog. Brain Res., 145, 275-285.

15. O'Neill, M.J., Murray, T.K., Lakics, V., Visanji, N.P., Duty, S. (2002) Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord., 1, 399-411.

16. Tsetlin, V. (1999) Eur. J. Biochem., 264, 281-286.

17. Davis, J., Jones, A., Lewis, R.J. (2009) Peptides, 30, 1222-1227.

18. Terlau, H., Olivera, B.M. (2004) Physiol. Rev., 84, 41-68.

19. Armishaw, C.J., Alewood, P.F. (2005) Curr. Protein Pept. Sei., 6, 221-240.

20. Ramilo, C.A., Zafaralla, G.C., Nadasdi, L., Hammerland, L.G., Yoshikami, D., Gray, W.R., Kristipati, R. Ramachandran, J., Miljanich, G., Olivera, B.M., Cruz, L.J. (1992) Biochemistry, 31, 9919-9926.

21. Peng, C., Tang, S., Pi, C., Liu, J.,Wang, F., Wang, L., Zhou, W., Xu, A. (2006) Peptides, 27,2174-2181.

22. Shon, K.J., Grilley, M., Jacobsen, R., Cartier, G.E., Hopkins, C., Gray, W.R., Watkins, M., Hillyard, D.R., Rivier, J., Torres, J., Yoshikami, D., Olivera, B.M. (1997) Biochemistry, 36, 9581-9587.

23. Jimenez, E.C., Olivera, B.M., Teichert, R.W. (2007) Biochemistry, 46, 87178724.

24. Teichert, R.W., Jimenez, E.C., Olivera, B.M. (2005) Biochemistry, 44, 78977902.

25. Lopez-Vera, E., Jacobsen, R.B., Ellison, M., Olivera, B.M., Teichert, R.W. (2007) Toxicon, 49, 1193-1199.

26. Ellison, M., Gao, F., Wang, H.L., Sine, S.M., Mcintosh, J.M., Olivera, B.M. (2004) Biochemistry, 43, 16019-16026.

27. Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. (2009) Успехи биологической химии, т. 49, 2009, с. 275-318.

28. Utkin, Y.N., Kobayashi, Y., Hucho, F., Tsetlin, V.I. (1994) Toxicon, 32, 11531157.

29. Kreienkamp, H.J., Sine, S.M., Maeda, R.K., Taylor, P. (1994) J. Biol. Chem., 269,8108-8114.

30. Groebe, D.R., Gray, W.R., Abramson, S.N. (1997) Biochemistry, 36, 64696474.

31. Martinez, J.S., Olivera, B.M., Gray, W.R., Craig, A.G., Groebe, D.R., Abramson, S.N., Mcintosh, J.M. (1995) Biochemistry, 34, 14519-14526.

32. Liu, L., Chew, G., Hawrot, E., Chi, C., Wang, C. (2007) Acta. Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 39, 438-444.

33. Mcintosh, J.M., Yoshikami, D., Mahe, E., Nielsen, D.B., Rivier, J.E., Gray, W.R., Olivera, B.M. (1994) J. Biol. Chem., 269, 16733-16739.

34. Broxton, N.M., Down, J.G., Gehrmarin, J., Alewood, P.F., Satchell, D.G., Livett, B.G. (1999) J. Neurochem., 72, 1656-1662.

35. Nicke, A., Samochocki, M., Loughnan, M.L., Bansal, P.S., Maelicke, A., Lewis, R.J. (2003) FEBS Lett., 554,219.223.

36. Cartier, G.E., Yoshikami, D., Gray, W.R., Luo, S., Olivera, B.M., Mcintosh, J.M. (1996) J. Biol. Chem., 271, 7522-7528.

37. Mcintosh, J.M., Gardner, S., Luo, S., Garrett, J.E., Yoshikami, D. (2000) Eur. J. Pharmacol., 393,205-208.

38. Clark, R.J., Fischer, H., Nevin, S.T., Adams, D.J., Craik, D.J. (2006) J. Biol. Chem., 281,23254-23263.

39. Dowell, C., Olivera, B.M., Garrett, J.E., Staheli, S.T., Watkins, M., Kuryatov, A., Yoshikami, D., Lindstrom, J.M., Mcintosh, J.M. (2003) J. Neurosci., 23, 84458452.

40. Talley, T.T., Olivera, B.M., Han, K.H., Christensen, S.B., Dowell, C., Tsigelny, I., Ho, K.-Y., TaylorP., Mcintosh, J.M. (2006) J. Biol. Chem., 281, 24678-24686.

41. Dutertre, S., Ulens, C., Bbttner, R., Fish, A., van Elk, R., Kendel, Y., Hopping, G., Alewood, P.F., Schroeder, C., Nicke, A., Smit, A.B., Sixma T.K., Lewis, R.J. (2007) EMBO J., 26, 3858-3867.

42. Kasheverov I.E., Khrushshev A.Y., Osipov A.V., Sixma T.K., Tsetlin V.l. (2009) JNC, 1471-1484.

43. Ellison, M., Haberlandt, C., Gomez- Casati, M.E., Watkins, M., Elgoyhen, A.B., Mcintosh, J.M., Olivera, B.M. (2006) Biochemistry, 45, 1511-1517.

44. Vincier, M., Wittenauer, S., Parker, R., Ellison, M., Olivera, B.M., Mcintosh, J.M. (2006) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103, 17880-17884.

45. Kang, T.S., Vivekanandan, S., Jois, S.D., Kini, R.M. (2005) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44, 6333-6337.

46. Almquist, R.G., Kadambi, S.R., Yasuda, D.M., Weitl, F.L., Polgar, W.E., Toll, L.R. (1989) Int. J. Pept. Protein Res., 34, 455-462.

47. Hargittai, B., Sole, N.A., Groebe, D.R., Abramson, S.N., Barany, G. (2000) J. Med. Chem., 43, 4787-4792.

48. Armishaw, C.J., Daly, N.L., Nevin, S.T., Adams, D.J., Craik, D.J., Alewood, P.F. (2006) J. Biol. Chem., 281, 14136-14143.

49. MacRaild, C.A., Illesinghe, J., van Lierop, B.J., Townsend, A.L., Chebib, M., Livett, B.G., Robinson, A .J., Norton, R.S. (2009) J. Med. Chem., 52, 755-762.

50. Robinson, A.J., van Lierop, B.J., Garland, R.D., Teoh, E., Elaridi, J., Illesinghe J.P., Roy Jackson, W. (2009) Chem. Commun. (Camb.), (28), 4293-4295.

51. Clark, R.J., Fischer, H., Dempster, L., Daly, N.L., Rosengren, K.J., Nevin, S.T., Meunier, F.A., Adams, D.J., Craik, D.J. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 102,13767-13772.

52. Jacobsen, R.B., DelaCruz, R.G., Grose, J.H., Mcintosh, J.M., Yoshikami, D., Olivera, B.M. (1999) Biochemistry, 38, 13310-13315.

53. Ellison, M., Feng, Z.P., Park, A.J., Zhang, X., Olivera, B.M., Mcintosh, J.M., Norton, R.S. (2008) J. Mol. Biol., 377, 1216-1227.

54. Halai, R., Clark, R.J., Nevin, S.T., Jensen, J.E., Adams, D.J., Craik, D.J. (2009) J. Biol. Chem., 284, 20275-20284.

55. Millard, E.L., Nevin, S.T., Loughnan, M.L., Nicke, A., Clark, R.J., Alewood, P.F., Lewis, R.J., Adams, D.J., Craik, D.J., Daly, N.L. (2009) J. Biol. Chem., 284,4944-4951.

56. Servent, D., Thanh, H.L., Antil, S., Bertrand, D., Corringer, P.J., Changeux, J.P., Menez, A. (1998) J. Physiol. (Paris), 92, 107-111.

57. Quiram, P.A., Sine, S.M. (1998) J. Biol. Chem., 273, 11007-11011.

58. Broxton, N., Miranda, L., Gehrmann, J., Down, J., Alewood, P., Livett, B. (2000) Eur. J. Pharmacol., 390, 229-236.

59. Everhart, D., Cartier, G.E., Malhotra, A., Gomes, A.V., Mcintosh, J.M., Luetje, C.W. (2004) Biochemistry, 43, 2732-2737.

60. Ellison, M., Feng, Z.P., Park, A.J., Zhang, X., Olivera, B.M., Mcintosh, J.M., Norton, R.S. (2008) J. Mol. Biol., 377, 1216-1227.

61. Sugiyama, N., Marchot, P., Kawanishi, C., Osaka, H., Molles, B., Sine, S.M., Taylor, P. (1998) Mol. Pharmacol., 53, 787-794.

62. Everhart, D., Reiller, E., Mirzoian, A., Mcintosh, J.M., Malhotra, A., Luetje, C.W. (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther., 306, 664-670.

63. Dutertre, S., Nicke, A., Lewis, R.J. (2005) J. Biol. Chem., 280, 30460-30468.

64. Sine, S.M., Kreienkamp, H.J., Bren, N., Maeda, R., Taylor, P. (1995) Neuron, 15,205-211.

65. Shiembob, D.L., Roberts, R.L., Luetje, C.W., Mcintosh, J.M. (2006) Biochemistry, 45, 11200-11207.

66. Ellison, M., Mcintosh, J.M., Olivera, B.M. (2003) J. Biol. Chem., 278, 757764.

67. Kreienkamp, Ii.J., Utkin, Y.N., Weise, C., Machold, J., Tsetlin, V.I., Hucho, F. (1992) Biochemistry, 31, 8239-8244.

68. Kasheverov, I., Rozhkova, A., Zhmak, M., Utkin, Y., Ivanov, V., Tsetlin, V.I. (2001) Eur. J. Biochem., 268, 3664-3673.

69. Kasheverov, I., Zhmak, M., Chi vilyov, E., Saez-Brionez, P., Utkin, Y., Hucho, F., Tsetlin, V. (1999) J. Recept. Signal Transduct. Res., 19, 559-571.

70. Kasheverov IE, Chiara DC, Zhmak MN, Maslennikov IV, Pashkov VS, Arseniev AS, Utkin, Y.N., Cohen, J.B., Tsetlin, .1. (2006) FEBS J., 273, 13731388.

71. Cortez, L., Marino-Buslje, C., de Jiménez Bonino, M.B., Hellman, U. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 355, 275-279.

72. Kumar, P., Meizel, S. (2005) J. Biol. Chem., 280, 25928-25935.

73. Kasheverov, I.E., Zhmak, M.N., Vulfi us, C.A., Gorbacheva, E.V., Mordvintsev, D.Y., Utkin, Y.N., van Elk, R., Smit, A.B., Tsetlin, V.I. (2006) FEBS J., 273,4470-4481.

74. Gray, W.R., Luque, F.A., Galyean, R., Atherton, E., Sheppard, R.C., Stone, B.L., Reyes, A., Alford, J., Mcintosh, M., Olivera, B.M., Cruz, L.J., Rivier, J. (1984) Biochemistry, 23, 2796-2802.

75. Whiteaker, P., Mcintosh, J.M., Luo, S., Collins, A.C., Marks, M.J. (2000) Mol. Pharmacol., 57, 913-925.

76. Cui, C., Booker, T.K., Allen, R.S., Grady, S.R., Whiteaker, P., Marks, M.J., Salminen, 0., Tritto, T., Butt, C.M., Allen, W.R., Stitzel, J.A., Mcintosh, J.M., Boulter, J., Collins, A.C., Heinemann, S.F. (2003) J. Neurosci., 23, 11045-11053.

77. Hogg, R.C., Miranda, L.P., Craik, D.J., Lewis, R.J., Alewood, P.F., Adams, D.J. (1999) J: Biol. Chem., 274, 36559-36564.

78. Armishaw, C., Jensen, A.A., Balle, T., Clark, R.J., Harps0e, K., Skonberg, C., Liljefors, T., Strom gaard, K. (2009) J. Biol. Chem., 284, 9498-9512.

79. Groebe, D.R., Gray, W.R., Abramson, S.N. (1997) Biochemistry, 36, 64696474.

80. Celie, P.H., Kasheverov, I.E., Mordvin tsev, D.Y., Hogg, R.C., van Nierop, P., van Elk, R., van Rossum- Fikkert, S.E., Zhmak, M.N., Bertrand, D., Tsetlin, V., Sixma, T.K., Smit, A.B. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 582-588.

81. Mcintosh J.M., Azam, L., Staheli, S., Dowell, C., Lindstrom, J.M., Kuryatov, A., Garrett, J.E., Marks, M.J., Whiteaker, P. (2004) Mol. Pharmacol., 65, 944-952.

82. Whiteaker, P., Christensen, S., Yoshikami, D., Dowell, C., Watkins, M., Gulyas, J., Rivier, J., Olivera, B.M., Mcintosh, J.M. (2007) Biochemistry, 46, 6628-6638.

83. Whiteaker, P., Marks, M.J., Christensen, S., Dowell, C., Collins, A.C., Mcintosh, J.M. (2008) J. Pharmacol. Exp. Ther., 325, 910-919.

84. Williams, J.A., Day, M., Heavner, J.E. (2008) Expert. Opin. Pharmacother., 9, 1575-1583.

85. Lopez-Vera, E., Aguilar, M.B., Schiavon, E., Marinzi, C., Ortiz, E., Restano Cassulini, R., Batista, C.V.F., Possani, L.D., Heimer de la Cotera, E.P., Peri, F., Becerril B., Wanke, E. (2007) FEBS J., 274, 3972-3985.

86. Blanchfi eld, J.T., Gallagher, O.P., Cros, C., Lewis, R.J., Alewood, P.F., Toth, I. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 361, 97-102.

87. Sine, S.M. (2002) J. Neurobiol., 53, 431^146.

88. Hansen, S.B., Talley, T.T., Radic, Z., Taylor, P. (2004) J. Biol. Chem., 279, 24197-24202.

89. Celie, P.H., Klaassen, R.V., van Rossum-Fikkert, S.E., van Elk, R., van Nierop, P., Smit, A.B., Sixma, T.K. (2005) J. Biol. Chem., 280, 26457-26466.

90. Celie, P.H., van Rossum-Fikkert, S.E., van Dijk, W.J., Brejc, K., Smit, A.B., Sixma, T.K. (2004) Neuron, 41, 907-914.

91. Fruchart-Gaillard, C., Gilquin, B., Antil-Delbeke, S., Le Novere, N., Tamiya, T., Corringer, P.J., Changeux, J.P., Menez, A., Servent, D. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99, 3216-3221.

92. Dutertre, S., Lewis, R.J. (2004) Eur. J. Biochem., 271, 2327-2334.

93. Moise, L., Piserchio, A., Basus, V.J., Hawrot, E. (2002) J. Biol. Chem., 277, 12406-12417.

94. Samson, A., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J., Anglister, J. (2002) Neuron, 35,319-332.

95. Hansen, S.B., Sulzenbacher, G., Huxford, T., Marchot, P., Taylor, P., Bourne, Y. (2005) EMBO J., 24,3635-3646.

96. Bourne, Y., Talley, T.T., Hansen, S.B., Taylor, P., Marchot, P. (2005) EMBO J., 24, 1512-1522.

97. Ulens, C., Hogg, R.C., Celie, P.H., Bertrand, D., Tsetlin, V., Smit, A.B., Sixma, T.K. (2006) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103, 3615-3620.

98. Lentz T.L., Hawrot E, Donnelly-Roberts. (1984) Science; 226. 848-8.

99. Lentz TL, Hawrot E, Donnelly-Roberts D Wilson PT (1988) Adv Biochem Psychopharmacol; 55, 57-71

100. Lentz T.L., Burrage T.G, Smith A.L, Crick J, Tignor GH. (1982) Science 215182-4.

101. Lentz TL. Benson RJ, Klimowicz D, Wilson PT, Hawrot E. (1986) Brain Res; 387:211-9.

102. Donnelly-Roberts DL, Lentz TL. (1989) Pept Res: 2:221-6.

103. Donnelly-Roberts DL, Lentz TL. (1991) Brain Res MoLBrain Res; 11:10713.

104. Rustici M, Santucci A, Lozzi L, Petreni S, Spreahco A. Nen P. (1989) MolRecognit; 2:51-5.

105. Langrvin.C., Jaaro H., Tufferau C. (2002) JBG, 277, 37665-62

106. Kumar P. W, Mc Bade JL Jung KJ. (2007) Nature; 448: 39-43.

107. D.Andrey, F.Albericio, NA.Sole, M.C.Munson, M.Ferrer, G.Barany. (1994) Peptide Synthesis Protocols. P.91

108. R.G.Hiskey. (1981) The Peptides. Vol.3. P. 137

109. M.Yoshida, M.Shimokura, Y.Fyjiwara, T.Fujisaki, KAkaji, Y.Kiso. (1990) Chem. Pharm. Bull., 38, 382

110. M.C.Munson. (1993) PhD Thesis, University of Minnesota, USA.

111. M.C.Munson, C.Garcia-Echeverria, F.Albericio, G.Barany-. (1992) Org. Chem., 57, 3013

112. O.Nishinrura, C.Kitada, M.Fujino. (1978) Chem. Pharm. Bull., 26, 1576

113. Р.Г.Хиски, B.P.Pao, В.Дж.Роудс. (1976) Защитные группы в органической химии. (Под ред. Дж.МакОми). Мир, Москва,. С.224

114. Y.Han, J.Vagner, C.M.Gross, G.Banmy. (1995) In Proceedings of the 14th American Peptide Symposium. (Abstracts of Reports). Escom, Leiden,. P061.

115. M.C.Munson, G.Barany. (1993) Am. Chem. Soc, 115, P.10203

116. И.Фотаки. (1977) Химия полипептидов. Мир, Москва,. С. 72

117. G.Barany, R.B.Merrifield (1981) In The Peptides. Vol.2. (Eds E.Gross, J.Meienhofer). Academic Press, New York,. P.3

118. M.Yoshida, K.Akaji, T.Tatsumi, S.linuma, Y.Fujiwara,T.Kimura, Y.Kiso. (1990) Chem. Pharm. Bull., 38,273

119. E.A.Halinan (1991) Int. J. Pept. Protein Res., 38, 601

120. S.N.McCurdy. (1989) Pept.Res., 2,147

121. K.Alitalo, P.Partanen, A.Vaheri (1985) Synthetic Peptides in Biology and Medicine. Elseyier, Amsterdam.

122. N.Fujii, A.Otaka, S.Funakoshi, M.Nomizu, K.Akaji, H.Yajima, I.Yamamoto, K.Torizuka, K.Kitagawa, T.Akita, K.Ando, T.Kawamoto, Y.Shimonishi, T.Takao. (1986) Chem. Pharm. Bull., 34;613

123. H.Yoshizawa, A.Otaka, H.Habashita, N.Fujii. (1993) Chem. Lett 803

124. A.S.J.Stewart, C.N.C.Drey. (1990) Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1753

125. Shanlin Fu, F.A.Carver, L.A.P.Kane-Maguire. (1993) Organomet, 454.

126. H.Nishio, T.Kimura, S.Sakakibara. (1994) Tetrahedron Lett., 35, 1239.

127. H.Lamthank, H.Virelizier, D.Frayssinhes. (1995) Pept. Res., 8, 316.

128. L.Lepsa, T.Blaha, V.Cema, M.Flegeh (1996) In 24th Symposium of the European Peptide Society. (Abstracts of Reports). Perkin Division, Edinburgh,. P. 126

129. H.Lamthank, C.Roumestand, C.Depmn, A. Menez. (1993) Int. J. Pept. Protein Res., 41, 85

130. N.Fuji, A.Otaka, T.Watanabe, A.Okamachi, N.Tamamura, H.Yajima, Y.Inagaki, M.Nomizu, K.Asano.(1989) Chem. Soc, Chem Commun., 283

131. Y.Kiso, M.Yoshida, Y.Fujiwara, T.Kimura, M.Shimokura, K.Akaji. (1990) Chem. Pharm. Bull., 38. 673

132. О.С.Папсуевич, Г.И.Ауконе, С.Я.Микста, У.О.Калей. (1982) Журн. общ. хим., 52,460

133. K.Nokihara, H.Bem. (1978) J. Org. Chem., 43,4893

134. R.Eritja, J.P.Ziehler-Martin, P.A.Walker, T.D.Lee, K.Legesse, FAlbericio, B.E.Kaplan. (1987) Tetrahedron, 43, 2675

135. M.Mek, M.Honda, Y.Kazama, T.Katosh. (1994) Synthesis, 21

136. O.Rosen, S.Rubinraut, M.Fridkin. (1990) Int. J. Pept. Protein Res., 35,545

137. R.Matsueda, S.Higashida, F.Albericio, D.Andreu. (1991) In The 29th Conference on Peptide Chemistry. (Abstract of Reports). Osaka, .P.l 11

138. F.Albericio, D.Andreu, E.Giralt, C.Navalpotro, E.Pedroso, B.Ponsati, M.Ruiz-Gayo (1989) Int. J. Pept. Protein Res., 34,1241391.Mangras, J.Gostelli, E.Rapp, R.Nyfeler. (1995) Int. J. Pept. Protein Res., 45, 152

139. L.Moroder, G.Hubener, S.Goliring-Romani, W.Gohring, H.-J.Musiol, E.Wunsch. (1990) Tetrahedron, 46, 3305141." E.V.Kudryavtseva, M.V.Sidorova, M.V.Ovchinnikov, Zh.D.Bespalova, V.N.Bushuev. (1997) Int. J. Pept. Protein Res., 49, 52

140. Cui-Rong Wu, J. D. Wade, G. W. Tregear. (1988) Int. J. Pept. Protein Res., 31,47

141. R.G.Ahnquist, S.R.Kadambi, D.M.Yasuda, F.L.Weitl, W.E.Polgar, L.R.Toll. (1989) Int. J. Pept. Protein Res., 34, 455

142. D.Laly, M.K.Mahanti. (1988) Oxyd. Commun., 11,231145.. C.Haskell-Lecevano, N.D.Shenderovich, Sh.D.Sharma, G.V.Nikiforovich, Mac E. Hadley, V. J. Hruby. (1995) Med. Chem., 38, 1736

143. S.-I.Kumagay, H.Kuroda, K.Nakajima, T.X.Watanabe, T.Kimura, T.Masaki, S.Salcakibara. (1988) Int. J. Pept. Protein Res., 32, 519

144. A.Misicka, VJ.Hruby. (1994) Pol. J. Chem., 68, 893

145. F.Otaka, T.Koide, A.Shide, N.Fujii. (1991) Tetrahedron Lett., 32,1223

146. T.Koide, A.Otaka, N.Fujii. (1993) Chem. Pharm. Bull., 41, 1030

147. H.Tamamura, A.Otaka, J.Nakamura, K.Okubo, T.Koide, K.Ikeda (1995) Int. J. Pept. Protein Res., 45, 312

148. N.Fujii, A.Otaka, A.Okamachi, T.Watanabe, H.Arai, H.Tamamura, S.Funakoshi, H.Yajima. (1991) In Proceedings of the 20th European Peptide Symposium.

149. У.Шамб, Ч.Сеттерфилд, Р.Вентворс. (1958) Перекись водорода. (Под ред. А.И.Горбанева). Изд-во иностр. лит., Москва,. С.304

150. Wiley, Chichester (1983) The Chemistry of Peroxides, P. 429

151. JArroub, J.Berges, Z.Abedinzadch, J.Langlct, M.Gardes-Albert. (1994) Can. J. Chem., 72, 2094

152. М.В.Сидорова, Е.В.Кудрявцева, М.Л.Антопольский, М.Е.Пальксева, М.В.Овчинников, Ж.Д.Беспалова. (1996) Биоорг. химия, 12,273

153. Е.В.Кудрявцева. (1997) Дис. канд. хим. наук. МИТХТ, Москва,

154. S.-Y.Shin, M.Shimizu, E.Munekata. (1994) Chem. Lett., 199

155. D.L.Rabenstein, P.L.Yeo. (1994) Org. Chem., 59, 4223

156. M.W.Pennington, S.M.Festin, M.L.Maccecchini. (1991) In Proceedings of the 21st European Peptide Symposium. (Abstracts of Reports). (Eds E.Giralt, D.Andreu). Escom, Leiden,. P. 164

157. B.R.Clare, M.Pai. (1995) In Proceedings of the 14th American Peptide Symposium. (Abstracts of Reports). Escom, Leiden, P090

158. Lin Chen, G.Barany (1995) In Proceedings of the 14th American Peptide Symposium. (Abstracts of Reports). Escom, Leiden,. P 19

159. R.Drozdz, A.N.Eberle. (1995) Pept. Sei., 1, 58

160. P.Sieber, B.Kamber, B.Rinilcer, W.Rittel. (1980) Chim. Acta, 63, 2358

161. N.Fujii, A.Otaka, S.Funakoshi, K.Bessho, T.Watanabe, K.Akaji, H.Yajima. (1987) Chem. Pharm. Bull., 35,2339

162. Hung Lam Thank, G. Mourier, A. Menez, P. Fromageot. (1989) Second Forum on Peptides, Montroge,. P.229

163. E.E.Bullesbach. (1992) Kontakte (Darmstadt), 21

164. K.Akaji, T.Tatsumi, M.Yoshida, T.Kimura, Y.Fujiwara, Y.Kiso (1992) Am. Chem. Soc, 114,4137

165. T.Koide, A.Otaka, H.Suzuki, N.Fujii. (1991) Synlett, 345

166. K. Akaji, K.Fujino, T.Tatsumi, Y.Kiso. (1993) J. Am. Chem. Soc, 115, 11384

167. J.V.Castell, A.Tun-Kyi. (1979) Helv. Chim. Ada, 62, 2507

168. F.Albericio, R.P.Hammer, C.Garcia-Echeverria, M.A.Molins, J.L.Chang, M.C.Munson, M.Pons, E.Giralt, G.Barany. (1997) Int. J. Pept. Protein Res., 1233

169. K.Barlos, D.Gatos, S.Kutsogianni, G.Papaphotiou, C.Poulos, T.Tsegenidis. (1991) Int. J. Pept. Protein Res., 38, 562

170. Amit K. Galande, Ralph Weissleder, Ching-Hsuan Tung (2005) J. Comb. Chem., 7, 274.

171. Hogg R.C., Miranda L.P., Craik D.J., Lewis R.J., Alewood P.F., Adams D.J. (1999) J. Biol. Chem. 274, 36559-36564.

172. Jakubowski, J.A., Keays, D.A., Kelley, W.P., Sandall, D.W., Bingham, J.P., Livett, B.G., Gayler, K.R., Sweedler, J.V. (2004) J. Mass Spectrom., 39, 548-557.

173. Callaghan, В., Haythornthwaite, A., Berecki, G., Clark, R.J., Craik, DJ., Adams, D.J. (2008) J. Neurosci., 28, 10943-10951.

174. Жмак M.H. (2003) Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.

175. Quinton, L., Le Car, J.P., Vinh, J., Gilles, N., Chamot-Rooke, J. (2006) Toxicon, 47,715-726.

176. Millard, E.L., Nevin, S.T., Loughnan, M.L., Nicke, A., Clark, R.J., Alewood, P.F., Lewis, R.J., Adams, D.J., Craik, D.J., Daly, N.L. (2009) J. Biol. Chem., 284,4944-4951.

177. Ulens, C., Hogg, R.C., Celie, P.H., Bertrand, D., Tsetlin, V., Smit, A.B., Sixma, Т.К. (2006) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 103, 3615-3620.

178. Ellison M., Mcintosh J. M., Olivera В. M. (2003) J. Biol. Chem. 278, 757764.