Синтетические пептиды в серологической диагностике ВИЧ-инфекции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ ДКЛДЕЛ\ИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМЕНИ М. М. ШЕМЯКИНА И Ю, Л. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

УДК 577.112.5 578.825.083.3

ИВАНОВ

Вадим Сергеевич

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ В СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1993

Работа выполнена, в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчиииикова РАН.

Научный руководитель кандидат химических, наук А. Т. Кожич.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук В. А. Шибнев, кандидат химических наук Л. А. Фомина.

Ведущая организация — Институт иммунологии РАМН.

Защита состоится 6 октября 1993 г. в 10 час на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте бпоорганической химии им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « ...... 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

оццля характеристика ракоты.

Актуальность проблемы. По последним данным численность инфицированных вирусами иммунодефицита человека в мире составляет 8-10 млн. человек, в нашей стране - около 700 человек. Число людей, пораженных ВИЧ, растёт с каждым годом. Ранняя диагностика инфицированных лиц чрезвычайно важна для ограничения распространения инфекции, особенно посредством заражённых продуктов крови. Вольной промежуток времени между заражением и появлением клинических симптомов делает возможным идентификацию лиц, зараженных ВИЧ, только лабораторными методами. Наиболее распространены и удобны в осуществлении серологические тесты (выявление в крови пациентов антител к основным белкам ВИЧ>, Перспективными являются иммуноф'ермен'тные тест-системы нового поколения, в которых в качестве антигена используются синтетические пептиды. Тест-системы такого типа всё вире используются для диагностики различных заболеваний.

Цеяп я задачи ¡работы„ Целью настоящей работы был поиск пептидных антигенов (В-эгоггопов) - фрагментов белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2 для создания иииуиоферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител х ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Поставленная цель подразумевала решение следующих задач:

- предсказание вероятных В-эпитопов основных иммуногенных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2г

- синтез выбранных пептидов твёрдофазным методом?

- определение антигеяюых свойств пептидов в твёрдофаэном ИФА (ТФИФА)и подбор оптавгаяьного состава смеси пептидов для композиции тест-системыг

- разработка эффективного способа иммобилизации пептидов

для повышения чувствительности и специфичности анализа.

Данная работа проводилась в рамках Государственной научно-технической программы по борьбе с наиболее распространёнными инфекциями.

К&учт&я вопхзвш в вгезтЕРягъесквм ценность рабо'глг. Синтезировано 63 пепткда кз структурных к регуляторкых белков ВйЧ-1 и БИЧ-2, из них 55 ранее не описанных. После скрининга о ,ИОД отобраны 3 пептида для использования в антигенной композиции тест-системы.

Предложена универсальная методика иммобилизации синтетических пептидов на твёрдой фазе, позволяющая увеличить чувствительность и специфичность ИФА.

Разработана иммуноферментная тест-система на основе пептид-шк антигенов для выявления антител к 8ИЧ-1 к ВИЧ-2. Тест-система внедряется в производство на "НПО 'Вектор*.

Лу6лижа цик, По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Апробация работа. Результаты настоящего исследования долоиеин и обсуждени на 5-й конференции молодых учёных социалистических стран по биоорганичесхой химии (Пуауето, • 1988), 4-й встрече по биоорганической хиши пептидЬв (Либлице, 1989), на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига, 1990), на '6-й Международной конференции по СПИД (Сан-франциско, 1990), на 12-ом Американском пептидном симпозиуме (Бостон, 1991), на Международной конференции "Мздкцинсхая биотехнология, иммуни-зеящя и СПИД" <Ленинград, 1991), на 8-й Международной конференции по СПИД (Амстердам, 1992».

Объ&ы рвботт* Диссертация изясжеке. кг. 116 страницах, состоит из введения, трйх гягв и зызодоз, содержи- 2 рисунка,

23 таблицы, в списке литературы цитировано 164 названия главе I приведён обзор литературных данных по теме "Пептидные фрагменты вирусных белков как антигены", в главе XI содержатся результаты исследований и их обсуждение, в главе III изложены экспериментальные методы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Вирус ддамунодефицита человека относится к семейству ленти-еирусов, подсемейству ретровирусов. Вирус содержит три гена необходимом для репликации: gag, pol и en v. Однако, при анализе генома ВИЧ было найдено ещё. несколько открытых рамок считывания , ответственных за необычайнуп патогенность' вируса. Среди можно выделить ген nef, подавляющий экспрессию ви-

руса , У^ёРТКИ максимальных расхождений среди различных штаммов вируса находятся в гене env, кодирующем оболочечные белки gpiaO И gp4l.

Наиболее распространён тип вируса ВИЧ-1, другой тип, ВИЧ-2, превалирует преимущественно в Западной Африка и является менее »ирулентным. Последовательности белков обоих типов вирусов го-мадогичны на 40% менее похожи меяду собой оболочечные белки; белки р!7, р24 и р15, кодируомые геном gag, обнаруживают отдельные перекрёстные реакции.

Мы начали нашу работу в 1985 году, когда в печати только начади появляться данные по исследованию антигенной структуры ВДН» В первых работах лабораторией R.C. Gallo, Национальный институт рака, США для этого были использованы рекомбинантныа полипептиды. На следующий год увидели свет публикации J.C.G. Wang et al., R.C. Kennedy ■it al. и P.B. Петрова с соавт.,

описывающие использование синтетических пептидов для этих целей. Затем с каждым годом обнаруживались все новые В-эпитопы в структурных и регуляторных белках ВИЧ, причем часто сведения об их антигенных свойствах были противоречивы. Высокая степень мутации ВИЧ была причиной появления новых штаммов вируса, (к настоящему времени известны последовательности свыше 100 изолятов ВИЧ-1), что вносило дополнительные трудности в исследования антигенной структуры вирусов. Так как наша работа была нацелена на применение пептидов в диагностике ВИЧ-инфекции, для нас было немаловажно не только выявление иммунодоми-накткых В-эпитопов белков ВИЧ, но и исследование антигенных свойств обнаруженных нами и уже описанных эпитопов на панелях сывороток, имевшихся а СССР. Поскольку широко известно, что величина панели сывороток и её качественный состав играет ключевую роль при разработке тест-систем.

На первом этапе нашей работы был проведён компьютерный анализ первичных последовательностей структурных и регуляторных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и отобраны фрагменты для синтеза. Предполагаемые В-эпитопы были синтезированы твердофазным методом. Антигенные свойства пептидов были исследованы| в тфифа на панелях сывороток, содержащих и не. содержащих антитела к ВИЧ..В результате было отобрано несколько пептидов, обладающих наилучшими антигенными свойствами*. Но серьёзной проблемой при использовании пептидов в качестве антигенов в тфифа оказалась необходимость достаточно прочной иммобилизации пептидных антигенов баз изменения их антигенных свойств, так как от этого в существенной степени зависят основные показатели ИФА -чувствительность и специфичность. Данная задача была решена с помощью хорошо известного высокоаффшдаого взаимодействия

ч

биотина с авкдином, для чего был синтезирован ряд биотинилиро-ванных аналогов пептидов и исследована возможность их использования в ТФИФА.

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОСНОВНЫХ иммуногшшых БЕЛКОВ ВИЧ-l И ВИЧ-2 С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНЫХ

МЕТОДОВ.

Для предсказания вероятных антигенных детерминант (В-эпи-топов) в белках, кодируемых генами env, gag, pol, nef ВИЧ-1 и env ВИЧ-2, были использованы известные алгоритмы. С помощью компьютерных программ были рассчитаны профили гидрофильности, антигенности, подвижности основной цепи и вероятная вторичная структура, В хачестве кандидатов в В-эпитопы рассматривались те фрагменты белков, которым соответствовали максимальные пики профилпй, « также участки с вероятным образованием ß-изгибов. В случае оболочечных белков (др120, др41 ВИЧ-1 и др120, др40 ВИЧ-2) исключались из рассмотрения места возможного N-глихозилировання.

Нумерация в1МИНокислот в пептидах из белков ВИЧ-1 (рис. 1-4)" соответствует штамму BRU, за исключением пептидов Z-3 (2-3) и СП-29 (БЫ), в пептидах из белков ВИЧ-2 (рис. 5)*-итаиму ROD.

2. СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И ИХ БИОТИНИШРОВАЮШХ АНАЛОГОВ. Пептиды и их биотинилироваяные аналоги были синтезированы

Обозначения: Xj - Nie, Xj - а-амииомастгяная кислота, Х3 - е-ами-нокапроновая кислота, Х4 - D-A1n, Bt - биотнн. Аминокислотные замены подчёркнуты. < ■

19-35 pi7 (СП-65) 19-35* pl7 (СП-66) 51-67 pl7 (СП-69) 51-67* pl7 (СП-70) 109-123 p24 (СП-7Х) 109-123* p24 (СП-72) 224-242 p24 (СЛ-38) 224-242* p24 (СП-36) 284-299 p24 (СП-37) 284-299* p24 СП-35 351-363 p24 IU-1) 356-373 p24 (СП-40) 356-373* p24 (СП-39) 486-500 p!5 (Й-2)

IRLRPGGKKKYKLKHIV (Bt-GGG)IRLRPGGKKKYKLKHIV

LETSEGC (Acte) UQILGQLQPS (Bt-GGG)LETSEGC(Acm)RQILGQLQPS

NK SKKKAQQAAADTGM (Bt-GGG)NKSKKKAQQAAADTGM

APGQXjREPRGSDIAGTTST (Bt-GGG)APGQXxREPRGSDIAGTTST

DIRQGPKEPFRDYVDR (Bt-£3)DIRQGPKEPFRDYVDR .X2QGVGGPGHKARVL

PGHKARVLAEAJijSQVTNS (Bt-GGG) PGHKARVI/AEAXiSQVTNS LTSLRSLFGNDPSSQ

Рис. 1, Синтетические пептиды из белков, кодируемых гекоЫ 'gag ВИЧ-1.

твёрдофазным методом в автоматическом режиме. В качестве носителя использовали аминометилировакный сополимер стирола и 1% дивгаошбензола с 4-гидроксиметилфенилацетамидометильной (РАМ) якорной группировкой. Для получения пептидов с С-концевым амидом (СП-20 и СП-34) использовали л-метилбензгидриламинную смолу.

Якорные группировки вводили с- помощью 2-кратного ' избытка i-схскбейзотриазолового эфира РАМ-производиого соответствующей защищенной аминокислоты. а-Аминогруппы аминокислот защищали Вос-гру: пой. Для защиты трифунхциональных аминокислоу использовали бензилевьгй и цихлогексиловый эфиры (Asp, Glu),.

110-123 рбб/51 (СП-45) 110-123* рбб/51 (СГТ-43) 226-239 рбб/51 (СП-50) 226-339* рбб/51 (СП-49) 322-340 рбб/51 (СЛ-48) 322-340* рбб/51 (СП-47) 380-394 рбб/51 (СП-42) 380-394* рбб/51 (СП-41) 572-569 рбб/51 (СП-46) 572-508* рбб/51 (СП-44) 580-596 рбб/51 (СП-61) 580-596* рбб/51 (СП-62) 673-690 рбб/51 (СП-67) 673-590* рбб/51 (СП-68)

líKPKXiIGGIGGFIK (Bt-GGG)WKPKSiIGGIGGFIK

PVFAIKKKDSTKWR (Bt -GGG) PVFAIKKKDSTKWR

gspaifqssjjitkilepfrk (BC-gg)gspaifqssxitkilepfrk

GLTTPDKKHQKE PPF ( Bt -GG ) GLTTPDKKHQKEPPF

YWQATWI PEWEFVNTPP (Bt-GGG)YWQATWIPEWEFVNTPP

ewefvntpplvklwyql (Bt-GGG) evjefvntpplvklwyqii iqaqpdkseselvnqixe " (Bt-GGG)iqaqpdkseselvnqiie'

Рис, 2. ÇfPfreTKVecKite пептиды из белков, кодируемых геном pol ВИЧ-1.

тозильную (Arg), бенэилоксимегильную и 2,4-динитрофенильную (His)/ бенэильную (Ser, Thr), 2,б-дихлорбензильнук (Туг), 2-хлорбензюгаксикарбонильную (Lys), ацетамидометильную и 4-метилбензильную (Суз) группы.

Для проведения реакции конденсации использовали 3-кратный по отношению к исходной концентрации аминогрупп на полимере избыток 1-оксибензотриаэоловых эфиров в DMF. Преактивация аминокислот осуществлялась в автоматическом режиме. Использование 1-оксибензотриазолового эфира биотина, который оказался более реакционно способным, чем я-нитрофениловый или N-оксисукцинимидный эфиры, пг долило провести конденсации био-

492-5X7 др!20 (СП-26) 500-517 др120 (СП-19) 502-516 др120 (СП-32) 502-516 др120 <СП-31> 505-516 9Р120 (И-3) 593гб04 др41 (СП-29) 593-604* др41 (СП-28) 584-604 др41 (И) 598-609 др41 (г-Э) 598-609 др41 (СЛ-5) 600-618 до41 (СП-7)

600-618* др41 (СП-6)

601-616 др41 (СП-15) 601-616* др41 (СП-23) 601-616* др41 <СП-25> 601-616* др41 (СП-21) 601-616* др41 (СП-27)

КгКУУКГЕРШУАРТКАКККУУОаЕКЕЛ ^ОУАРТКАКШтгСЯЕККА (С«3) АРТКАКГШУТ/ОНЕКК (ВЬ-вй)АРТКАКШ1УУОКЕКК КАКЫЩУУдКЕКК tiGIWGCSGKHIC (ВЬ-ОЗ} ЫЗШССБОКШС НХЬАУЕйУЬКВДЗи/ЗШСС (Аст).З

изшссзетидс

1Х]1МОС8СКЫС

1ШС8СК1ЛСТТАУРШАЗ 1ИС£ЗСКЫ5,ТТАУРШАЗ ШСБСНЫСТТАУРШ ЕССЗОКЫСТТАУРЕЯ £<ЗСЗХ4КЫСТГАУРЕЫ вt-чосзакысттАУРШ (вь-схзо »гесзамлстуркм

Рис. 3. Синтетические пептиды из белков, кодируемых геном ет?

ВИЧ-1.

тина.количественно в течение 90 мин. Оптимальным растворителем для этого оказался ШЗО. За полнотой протекания реакции конденсации следили с помощью качественного и количественного нингидринового теста. При необходимости непрореагировавшие аминогруппы блокировали уксусным ангидридом в присутствии диизоггропипэтиламина,

Перед отщеплением от полимера с пептидилполимера удаляли Вое-группу и 2,4-динитрофенильную защиту с гистидина.. Деблокирование пептидрв осуществляли обработкой жидким № с добав-

13-28 р27 (сп-63) 13-28* р27 (СП-64> 72-83 р27 (сп-58) 72-83* р27 (сп-57) 143-159 р27 (сп-54) 143-159* р27 (сп-53) 187-203 р27 (СП-52) 187-203* р27 (сп-51)

wptvherxi rkaepaad (в t-ggg)wptvrerxirraepaad

pqvplrpxityka (bt-gog)pqvplrpxityka

YKLVPVEPDKVEEANKG (Bt-GGG) YKLVPVEPDKVEEANKG SRLAFHHVARELHPEYG (Bt-GGG)SRLAFHHVARELHPEYG

ис. 4. Синтвгич еские пептиды из белка, кодируемого геном nef ИЧ-1.

352-365 др120 460-501 др120 387-605 др40 587-605* др40 592-605 др40 592-605 др40 592-603* др40 592-603 др40 594-612 др40 594-612* др40 594-612* др40

(сп-1.1) EVKETLAKHPRYRG (сп-10)ELGDYKLVGITPIGFAPTKEKR (сп-5 9) LQDQARLNSWGCAFF.QVCHT

(сп-60)(Bt-GGG)LQDQARLNSWGCAFRQVCHT (сп-8) LNSWGCAFRQVCHT

(сп-20) lhswgcafrqvcht-nh2

(сп-34) (Bt-GG!LNSWGCAFRQVCHT-NH2

(сп-30) LN5WGCAFRQVC

(СП-9) SWGCAFRQVCHTTVPWVND

(сп-33) (Bt-GG)SWGCAFRQVCHTTVPWVND

(сп-12) SWGSAFRQV£HTTVPWVND

ис. 5. Синтетические пептиды из белков,, кодируемых геном env ЦЧ-2.

ением л-крезола. Для деблокирования пептидов, содержащих ос-атки Суs и Trp, а также биоткчилированных пептидов испольэо-

вали смесь жидкий НР - п-крезол - п-тпокрезоп, а растворы для промывки и экстракции пептидов содержали 1% меркаптоэтанола.

Очищали пептиды с помощью обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Индивидуальность синтетических пептидов была доказана данными аминокислотного анализа, масс-спекгрометрией (методом РАВ) и аналитической обращённо-фазовой ВЭЖХ.

С целью упрощение синтеза в ряде пептидов (СП-ЗВ, СП-36, СП-40, СП-39, СП-45, СП-43, СП-48, СП-47, СП-63, СП-64, СП-58, СП-57) остатки метионина были заменены изостерическими остатками норлейцина, при атом мы учитывали, что такая замена обычно не приводит к снижению биологической активности. По таким же соображениям была произведена замена Ы-ковдеаого остатка цистеина на остаток а-аминомаслянай кислоты в пептиде И-Х. Н Ы-концевые части пептидов СП-26 и СП-18 были дополнительно введены остатки норлейцина, а пептид СП-32 был удлинён в ы-кокцевой части на последовательность Сув01уС1у. Данные изменения, практически не впияшиа на антигенные свойства пептидов, были произведены для получения хоныэгатаа о белками для иммунизации ими животных. Мы предполагали использовать антипептидные сыворотки в качестве положительных контролей в диагностической тест-системе. Эти замыслы на были осуществлены, так как указанные пептиды ив вошли в состав антигенной композиции тест-системы.

з. скрининг пептидов в качестве Антигенов в тфифа.

Для оценки споеобноети пептидов азаимодойстяоаать о сыворотками, содержащими антитела к ВИЧ-1, БИЧ-2, и сыворотками здоровых доноров (т.к. реактивности), испольаояали непрямой

твёрдофазный иммуноферментньей анализ с' пептидами в качестве антигенов.

Данная часть работы выполнялась совместно с СНИПЭП СПИД ОДНИ эпидемиологии, где была сформирована панель сывороток крови, содержащих антитела к ВЯЧ, подобраны оптимальные условия сорбции антигена на планшет, отработана методика проведения ТФИФА и проведены исшггаюм совместно разработанной тест-системы .

В ТФИФА были протестированы see 63 синтезированных пептида, из которых 55 являются оригинальными. В представленный для исследований набор входят 8 пептидов (СП-71, СП-32, СП-29, W, Z-3, СП-5, СП-7, СП-30), информация о которых появлялась в ходе нашей работы. Кроме того, появлялись публикациив который описывались пептиды, перекрывающиеся с выбранными нами (СП-65 {76], СП-38 [90], СП-15 [90], СП-54 [96)\ СП-бЗ [96], СП-58 (96], СП-54 [96], СП-52 [96], СП-59 [94]). Нас интересовали антигенные свойства всех перечисленных пептидов на имевшихся в нашем распоряжении панелях ВИЧ-1 и ВИЧ-2-положительных сывороток.

Как видно из табл. 1, пептиды из белхов, кодируемых геном $иаг„ узнавали довольно низкий процент ВИЧ-1-положительных см-юороток. Наибольшей реактивностью обладали фрагмент И-концевой части р17 СП-65 и фрагмент С-концевой части р24 СП-40. Пептид СИ-65, полностью перекрыва»35ий описанный ранее пептид 22-29,. обладает почти а 2 раза большей реактивность*), но всё-таки недостаточной для использования его в качестве антигена в ТФИФА для диагностических целей. Синтезированный нами пептид СП-38 (224-242) не обнаружил высокой реактивности, как и полностью перекрывающийся им описанный пептид 228-235. По данным

Таблица 1. Реактивность синтети ческих пептидов в ТФИФА на пане' ли сывороток, содержащих антитела К БИЧ-1.

Пептид Результат тфифа*

СП-6 5 11/82 <13,4%)

СП-6 9 7/82 (8,5%)

СП-71 6/76 (7,9%)

СП-38 4/123 (3,3%)

СП-37 10/123 (8,1%)

й-1 5/169 <3,0%)

СП-40 24/185 (13,0%)

И-2 5/130 (3,8%)

СП-4 5 17/149 (11,4%)

СП-50 25/125 (16,6%)

СП-48 .18/150 (12,0%)

СП-4 2 3/124 (2,4%)

СП-46 46/150 (30,7%)

; СП-61 5/144 (3,5%)

СП-6 7 3/82 (3,7%)

СП-26 172/250 (68,8%)

СП-18 100/216 446,5%)

СП-32 62/156 (39,7%)

и-з 13/71 (18,3%)

СП-29 * 17/55 (30,8%)

W 144/202 <71,3%)

Z-3 71/75 (94,7%)

СП-5 179/223 180,3%)

СП-? 293/313 193,3%)

12

других авторов, использовавших для тестирования пептиды, связанные с полимером, на котором происходил синтез, были получены более высокие результаты. Так пептид 226-237, входящий в состав СП-38, и пептид 109-123, аналогичный СП-71, выявляли соответственно 15 и 10 сывороток из 15 ВИЧ-положительных. Очевидно, предложенный этими авторами метод позволяет добиться большей чувствительности анализа.

Фрагменты продуктов гена pol характеризуются большей реактивностью, причем более высокими антигенными- свойствами ' обладают пептиды из последовательности обратной ' транскриптазы р66/р51, а основной В-эпитоп находится в •её С-когщевой области (СП-46). Пептиды СП-48, СЛ-42 и СП-67, входящие в состав трёх В-эпитопов обратной транскриптазы, оцре-

делённых с помощью рекой-бинакпшх полипептидов, по нашим данный не обладает высокой реактивностьс.

Как и следовало ожидать, пептиды из последовательностей белков, кодируемых геном есп/, выделявтея среди всех остальных пептидов высокой реактивностью. Исследование антигенной области

С-концевой части оболо-чечного гликопротеина др120 ВИЧ-1 показало, что у пептидов, представляющих данный антигенный район (СП-26, СП-18, СП-32, И-3), реактивность увешивается с удлинением пептида к N-концееой части гликопро-теина (ср. И-3 и СП-26^. Можно предположить, что самый длинный пептид СП-26 перекрывает, по крайней мере, два В-эпитопа. Наши ддЩа'в о реактивмости пептида СП-32 хорошо согласуются С литературными. Реактивность пептида И-3 (505-516! оказалась в два реза , нийе реактивности описанного рехомбинактного химерного шоцплвкса, состояявго из пептида 505-519 и р-гаяактозидазы, Др^цши авторами было показано, что пептид, идентичный И-'1 и кдаброгирозанный с бычьим сывороточным альбумином, реагирует с 19 кз 20 ВИЧ-1-лолошигельг1ых сывороток. Данное расхождение результатов можно объяснить понидекноя способность» относи-те^«ко коротких (особенно гидрофильных) пептидоа сорбярозаться ПО С их конъегатаки с белковыми носителями» Спубли-

Продолжеаяе табл. 1.

Пептид Результат ТФИФА*

СП-6 110/217 (50,7%)

СП-15 249/263 (94,7%)

СП-23 190/216 (88,0%)

СП-2 5 120/187 (64,2%! '

СП-63 14/143 (9,8%)

СИ-5 8 7/146 (4,8%)

СП-54 25/148 (16,9%)

СП-52 22/150 (И,7%},

* В числителе - число пололи-тельных результатов, в знамена-тела - общее число сывороток.

кованный пептид 495-516, являющийся укороченным аналогом СП-26

(492-517), реагировал с 48 из 50 (96%) ВИЧ-1-положительных сывороток, что близко к нашим данным, полученным на панели йэ '57 ВИЧ-1-положительных сывороток. При увеличении панели до 250 образцов процент сывороток, выявленных пептидом СП-26, снизился до 68%. Отсюда вытекает, что для статистически достоверной оценки реактивности пептидов необходимо использовать достаточно большую панель сывороток.

Существенно выше реактивность пептидов из иммунодоминант-

ного района трансмембранного .белка др41. Наибольшее число ВИЧ*

1-положительных сывороток (94,7 %) еыявлял пептид СП-15 (601616) , что превышает опубликованные результаты, полученные с • пептидом 600-616, который выявлял 7 из 10 (70 %) ВИЧ-1-положительных сывороток. Более длинный фрагмент, СП-7 (600-618), .Идентичный описанному теми же авторами, хотя и не обнаружил на ■ наией панели сывороток 100 % реактивности, но всё-таки обладал высокими антигенными свойствами.

Мы попытались оптимизировать ' структуру иммунодо. ишантного эпитопа СП-15 (рис. б), для чего синтезировали несколько его аналогов. Так для выяснения влияния на антигенные свойства

замкнутой структуры

СП-15, образующейся в результате образования дисульфидной связи между Суб6"3 и Суз609, был подучен его аналог СП-6 с

заменами

остатков

Ряе. 6. Структура иммунодоминантного

цистеина на остатки

В-эпитопа СП-15.

серина. Данная замена привела к резкому падению реактивности пептида СП-6 (до 50%), из чего можно сделать вывод, что в результате замыкания дисульфидоой саязи образуется конформация, близкая конформации В-эпитопа в нативном белке. В пептиде СП-2Э была проверена возможность замены остатков триптофана на остатки фенилаланина, поскольку обе аминокислоты явпявтся гидрофобными и имеют в боковой цепи ароматическое кольцо. В результате этой замены реактивность снизилась не намного <до 86%) , Возможно данная' замена привела к некоторому ухудшению ссрбируемости пептида СП-23, что и привело к снижению реактивности. Следующим аналогом был СП-25, в котором кроме замены аналогичной СП-23 была произведена замена Gly605 на D-Ala. Это было сделано из следующих соображений. Поскольку последовательность SerGly часто встречается в р-изгибах и в нашем случае? расположена между двумя остатками цистеина, образующими да.сульфиднуо связь, фрагмент 603-609 пептида СП-15 в растворе должен принять петлеобразную конформашш. Заменив а ней Giy60S на D-аюшокислоту (D-A.1 ч), мы рассчитывали ещё более стабилизировать эту конформацию. Но данная замена оказалась критической - реактивность СП-25 упала до 64%, очевидно, Gly605 участвует зо взаимодействии с паратопом антитела.

Нам не удалось получить такой высокой чувствительности при тестировании пептида W (564-604), как сообщалось Wang J.C.G. et < 1. Наши результаты схорее согласуются с результатами бо/тее поздних исследований (DOpel S.-H. et al.). Из пептидов Z-3, СП-5" H СП-29, представляющих один и тот не фрагмент белка кс> из разных штаммов ВИЧ-1, только Z-3 обладал реак-TifàKooTW», близкой х описанной, - результаты тестирования СП-5 и СП-29 были нижа. Но все яа реактивность пептида СП-5 была

почти в два раза выше, чем описано в литературе. Причиной такого разногласия, вероятно, может быть различная штаммоспеци-фичность панелей ВИЧ-1-положительных сывороток.

Ни один из синтезированных фрагментов белка р27, кодируемого геном nef, не обнаружил высокой реактивности на использовавшихся панелях, сывороток. Наши результаты свидетельствуют в пользу того, что В-эпитохш этого белка находятся вблизи его С-концевой части, что согласуется с данными Sabatier J-M. et al. Пептид СП-54 (143-159), имеющий наибольшую реактивность (16,9%) среди пептидов данного белка, перекрывается с опубликованным иммунодомшглнтным пептидом 148-161, узнававшим 11 из 17 сывороток (65%) в радиоиммунном анализе. Расхождение эультатов не- удивительно, поскольку хорошо известна более высокая чувствительность радиоиммунного анализа по сравнению с иммуноферментным. Исследования, проведенные с помощью методики PEPSCAN, показали отсутствие В-эгштопа в этом районе белка р27 (Gombert P.O. et al-).

/

Ряд авторов утверждают (Ameisen J.-C.\et al., Go.obert P.O.

ч- \

et al. ) , что антитела к белку, кодируемому геном nef, появляются до сероконверсии антител к основным структурным белкам и, таким образом, обнаружение а крови антител к этому белку позволяет проводить раннюю диагностику при заражении ВИЧ. Нащютиь, в работах (Sabatier J-M. et al.. De Ronde A. et al.) указанное утверждение ставится под сомнение. Для выяснения этого вопроса мы протестировали s ТФИФА пептиды, обнарувившие лучшие антигенные свойства, на панелях серокот <эрсии 'табл. 2). Только использование фрагментов обояочечгых глихо-протеиКов сп-26 и сп-15 позволяло обнаруживать антитела к ВИЧ-I на тех же стадиях развития заболевания, как и с помощью ком-

Таблица 2. Результаты тестировал» скитетических пептидов » ТФИФА на панелях сероконверсии.

ОЬразды Дата взя- < Синтетические пептиды Тест- ■системы *

сывоооток тия КРОВИ СП-40 СП-50 СП-46 СП-2 б СП-15 СП-54 СП-52 А В В Г я Е *

Панель 'A"

BBI-Q1 04-05-81 - - - - - - - - - - - - - -

BBI-02 08-07-81 - - - - - - - - - - - - - -

BBI-03 ?9-07-81 - - - - - - - - - - - - - +

8BI-04 19-08-81 - - - - + - - +

BBI-05 02-09-81 - - - - - + ■* + + +

ВВГ-06 09-09-81 - - - + ♦ - - + * f + + *

BBI-07 1.-09-81 - - - + - - + ■ + +

BBI-08 33-05-81 - - - - - + + +

BBX-09 14-10-81 - - + + - - + + + +

Панель "D"

BBI-40 29-04-81 - - - - - - - - - - - - - -

BBI-41 20-05-31 - - - - - - - - - - - - - -

BBI-42 17-06-81 - - - - - - - - - - - - - -

BBI-43 30-07-81 - - - + - - - + + + + +

BBI-44 06-08-81 - - - - - * + + + ч-

* flaHHLie 33am us capTK?MxaTO naHeJiei} cepotoHBepcira "A" a *0*: A - Abboc Laboratories; E -Cellular Products; B - DuPoat Caxp&ny; T - Electro-Nuclmonics Inc.; a - Genetic Systems Corp.; E -Orfcho Diagnostic Systeas Inc.; X -- Csrg&aon T«knik& Corp.

Таблица 3. Реактивность синтетических пептидов в ТФИФА на панели сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-2.

Пептид Результат ТФИФА*

СП-11 14/24 '(58,3%)

СП-10 8/20 (40,0%)

СП-5 9 12/12 (100%)

СП-30 7/7 (100%)

СП-8 24/35 (68,6%)

СП-20 26/35 (74,3%)

СП-9 13/20 (65,0%)

СП-12 32/35 (91,4%) ,

■* См. примечание к табл. 13

мерческих тест-систем первого и второго поколений. Что касается nef пептидов, то эффективность их использования для ранней диагностики по нашим данным сомнительна .

Как видно из табл: 3, основной иммунодоминантный район env белков ВИЧ-2, расположен по аналогии с ВИЧ-3 в N-концевой части трансмембранного белка др40. 100-процентный результат, полученный с пептидом СП-30, полностью совпадает с приведёнными для аналогичного

данными впапп О.Ы. ее а1. пептида. При тестировании на большей панели ВИЧ-2-положительных .сывороток пептида СП-8, который дойнее СП-30 на два аминокислотных остатка, наблюдалось снижение реактивности. Замена в пептиде СП-8 С-концевого карбоксила на карбамоипьную группу (СП-20) привела к некоторому увеличению реактивностиг Пептид СП-59 (587-605) обладая высокой реактивностью, как и перекрывающийся с ним опубликованный пептид 581-603. Интересно отметить, что пептид СП-12 является аналогом пептид? СП-9, у которого два цистеиновых остатка заменены на сериновые что 'исключает образование дигульфидной связи. В результате яаццон замены реактивность аналога 'не только не снизилась, но даже

I

увеличилась, хотя в результате аналогичной замены в гомологич-

ном пептиде СП-7 из того же белка ВИЧ-1 мы получили падение реактивности у его аналога СЛ-6 почти я два раза. Очевидно, пространственные структуры гомологичных гпикопротеинов др4л ВИЧ-1 и др40 БИЧ-2 имеют некоторые отличия, и в рассматрива емом фрагменте др40 ВИЧ-2 между остатками цистеина не образуется дисульфидная связь. Мы не синтезировали пептиды из других белков ВИЧ-2 из-за малой панели ВИЧ-2-полоаитеяьних сывороток, которая на позволила бы получить статистически достоверные результаты.

При тестировании всех пептидов на панели сывороток здоровых доноров не наблюдалось неспеаифического связывания.

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННИХ ПЕПТИДОВ В ИФА.

Оин^етические пептиды, представляющие антигенные детерми-йэ|№Ы различных шгфиз-цфующих агентов, широко используются а Т4Ч'ЬА дйя обнаружения соответствующих антител. Центральной йрСЙ'ЯеНой какого Шда чнашза является иммобилизация пептидно го антигена на твёрдой фазе. Методология иммобилизации антй-грне. путем простой адсорбции На МКкрогтанпете хороио разработка. Однако, прочность связывания антигена £ пЯасТиком недостаточна и количество связанного антигена уменьяаетей в присут-сК:;|и детергентов, используемых для уменьшения неспецифической ад&ррбции во время инкубации и промывох. Происходящая в э:их уся©8иях десорбгия умекьсает чувствительность и специфичность анЭЛИза. Десорбция особекно заметка я случае небольших пептидов -(припер подобного явления обсундалп вьше) . Использование

»

пе£(|Тщов, кснъюгированкых с белховым ¡носителем, позволяет лучве закрепить пептидный антиген на твёрдой _ фаз*-* благодаря

лучшей сорбируемости белков. Но для конъюгации необходимо применение специфических химических методов, что создает определённые трудности. Для решения этих, проблем мы использовали принцип высокоаффинного связывания биотина с авидином, присоединив к Ы-концевому остатку пептида молекулу биотина. Авидин мы заменили на более доступный стрептавидин, имеющий те же связывающие свойства что и авидин, но позволяющий устранить Проблемы неспецифического связывания.

В качестве модельных пептидов мы использовали биотинилй-рованные аналоги иммунодоминантного В-эпитопа СП-15. Известно, что рецептор биотина находится на глубине 16-26 А, таким образом, при использовании 'мостика* из трёх остатков глицина (СП-27) гетероцикл биотина будет удален от Л-концевого остатка Пептида на 22 А и вся молекула пептида будет доступна для вза-.имодействия с антителом. Следует отметить, что концентрация биотинилированного пептида, используемая для иммобилизации по

крайней мере, на порядок Ниже обычно Используемой концентрации

/

не^иотинилированных пептидов. \

В, табл. 4 представлены данные сравненияЛгФИФА на основе не-биотинилированного пептида СП-15 и его биотинилированного аналога СП-27. Видно, что значения поглощения ВИЧ-1-положительных сывороток значительно выше при использовании предложенного метода иммобилизации, в то время как ВИЧ-1-отрица-телькые сыворотки имели схожие значения Поглощения в обоих случаях. В результате иммобилизации пептидов предложенным методом реакция с антителом проходит в псевдогомогекной фазе, 'что увеличивает чувствительность анализа. Это было продемонстрировано при параллельнЬм тестировании в ТФИФА пептидов

1

из разных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и их биотинияированных анало-

Таблица 4. Значения поглощения ВИЧ-1-положительных и -отрицательных сывороток в ТФИФЛ на основе пептида СП-15 и его биоти-нилироаанного аналога СП-27.

Образцы сывороток

Поглощение (492 ИМ)

сп-27

ВИЧ-1-положительные

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0

> 2,0 >2,0

-отрицательные

1

2

3

4

5

6 7

9 .10

1,209 1,773 0,633 0,271 0,922 0,957 1,140 0, 350 0,373 0,806

0,045 0,046

0,042 0,054

0,063 0,053

0,051 0,047

0,040 0,046

0,046 0 )45

0,059 0,013

0,052 0,043

0,067 0,063

0.044 0.045

гов. С помощью ТФИФА на основе биотинилированных пептидов а большинстве случаев удавалось выявить больший процент ВИЧ-положительных сывороток. Таким образом, вышеприведённые данные наглядно демонстрируют преимущества предложенного способа иммобилизации.

На основе полученных данных о реактивности пептидных антигенов из различных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2 6ЫПА подобрана композиция из трбк пептидов - двух пептидов и» белка др41 ВИЧ-1 и одного пептида из белка ар40 ВИЧ-2. Процент выявляемых с помощью этой композиции вич-положительных сывороток охазепся максимальным. Данная кок-позиция из пептидных антигенов вк^пе с пглДЯо-яенным методом иммобилизации яеглв в основу икмуно-фер^енткой диагностической тест-системы "пептест",

разработанной совместно с

ЦНИИ эпидемиологии. Сравнение разработанной тест-системы с коммерческими образцами импортных и отечественных тест-систем показали её высокую конкурентноспособность.

В • настоящее время эта тест-система под именем "ВИЧТЕСТ* внедряется в производство на НПО "Вектор", где уже выпущено несколько опытных партий этой тест-системы.

выводи

1. Твёрдофазным методом синтезировано 63 пептида из последовательностей структурных и регуляторных белков ВИЧ-1 ц ВИЧ-2, из них 55 ранее не описанных.

2. Исследованы антигенные свойства пептидов в твёрдофазном ИФА на панелях ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных сывороток и подобрана композиция из трёх пептидов, позволяющая с высокими чувствительностью и специфичностью определять антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

3. Отработана методика получения биотинилировашш>: пептидов путей.автоматического твёрдофазного синтеза.'

4. Предложен эффективный способ иммобилизации синтетических пептидов на твёрдой фазе, позволяющий увеличить чувствительность и специфичность ИФА.

5. Разработана иммуноферментная тест-система на основе пептидных антигенов для выявления антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не уступающая по чувствительности и специфичности коммерческим тест-системам.

Основные результаты диссертационной работы изложены э следующих публикациях:

1. Ййанов B.C., ЧййИИ Л.Д., Кожич А.Т., Павликов С.П., Ива-щенко М.Е. Синтетические антигены для детекции вируса иммунодефицита человека. Тезисы докладов 5 Конференции молодых учёных социалистических стран по биоорганической химии. Пущино, 1988, с. 41-42.

2. Ivanov V.S., Suvorova г.К., Tchikin L.th, Kozhich A.Т. Investigation of the antigenic etructurs of the HIV-1 gp4l immunodominant region. Abstiaets 4 Meeting on bicorgnnic chemiatry о £ peptides, bihlicfe, Czechoslovakia, 1989, p. 35.

3. Ипанов Э.С., Чикин Л.Д., Кожич А.Т., Суаоройа Э.К, Пептид, •эйпададнций способностью взаимодействовать с антителами к вирусу ишуноя«фицига человека li Mimti А.с. 15435Э7 СССР, 1')89.

4. Иванов B.C., Чикин Я.Д., Коййч А.»., Суворове З.К. гическйе пептида В диагностика йнфеКЦИИ, йЫэ&анной ВИЧ. тегШсы доклаДдй ЗсесоЬзиого симпозиума па киши иегтдаа. mm, 1990, с. i3.

5. Kozhich A., Ivanov v., Tchikift L., Suvorova 1. Bficient detection of HIV-1 and HIV-2 antibodies with synthetic ipeptideg-based EL1SA. Abstracts VI International conference on'AIDS. San Francisco, 1990, v. 3, p. 248.

6. Йванов B.C., Павликов С.П., Чикин Л.Д., Коякч А."., Сидо-роаич И.Г. Пептид в качестве антигена, связывающего атч.

••¡рта к вирусу шмунодефинига человека I тгт&г А.с. 1573Э36

. СССР, 1990.

7. \фанаи З.С.» Суворова З.К., Чихин Л.д., Хоккч А.Т. Способ т&ардофьзногс игмунофериенетого ояредаквшя антител ж вщ>у-су чеяеввха и мзчвкяый биотипом гаптия для

его осуществления: А.с. 16X2264 СССР, 1990.

8. Петров Р.В., Хаитов P.M., Иванов В.Т., Сидорович И.Г., Павликов С.П., Николаева И.А., Иващенко М.Е., Иванов B.C., Кожич А.Т., Чикин Л.Д. Выявление антител против HIV-1 й HIV- 2 с помощью синтетических антигенных детерминант. Иммунология, 1990, т. 2, с. 12-15.

S. Сидорович И.Г., Павликов С.П., Николаева И.А., Скляров П.Ю., Иванов B.C., Чикин П.Д., Кожин А.Т., Кауров О.А., Прусаков А.Н., Ульянченко С.Б. Использование синтетических пептидных антигенных детерминант для выявления антител к ВИЧ методом пассивной агглютинации латекса. Иммунология, 1990, г. 4, с. 29-30.

10. Иванов B.C., Чикин Л.Д., Суворова З.К., Кожич А.Т., Иванов В.Т. Исследование антигенной структуры вирусов иммунодефицита человека с помощью синтетических пептидов. Биоорган, химия, 1992, г. 18, Н 6, с. 7Й4-793.

11 Ivanov V.S., Tchikin L.D., Suvorova Z.K., Kozhich А.Т. Synthesis of biotinylated peptides and their application in i/nmunonietric immunoassay. In Peptides: Chemistry and biology /Ed. J.A.Smith, J.E.Rivier. Leiden: ESCOM, 1992, p. 734735.

12. Ivanov V.S., Suvorova Z.K., Tchikin L.D. Effective method for synthetic peptide immobilization. Abstracts VIII International conference on AIDS. Amsterdam, 1992, p. B193.

13. Ivanov V.S., Suvorova Z.K., Tchikin L.D., Kozhich А.Т., Ivanov V.T. Effective method for synthetic peptide ii aobi-lization that increases the sensitivity and specificity of ELISA procedures. J. Immunol. Methods, 1992, v. 153, p.229-233.